JPS6344168A - 生物学的液体中における遊離の活性化合物を測定するための方法およびテストキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、タンパク質のような天然の結合剤の存在下に
生物学的液体中に存在し、遊離フラクションおよび結合
フラクションが相互に平衡状態にある活性化合物の遊離
フラクション濃度を測定するための方法およびテストキ
ットに関する。

大抵の生理学的て活性ガ化合物は血液のよう々生物学的
液体中において一部は遊離の形態でそして一部はグロブ
リンまたはアルブミンのようなタンパク質に結合して存
在することは知られている。その際、活性化合物の遊離
形態と結合された形態とは相互に平衡状態にある。

目下のところ、タンパク質に結合していない活性化合物
フラクションのみが生理活性を示すと考えられている。

何故外ら、タンパク質に結合することにより、その活性
化合物の活性にとっての前提条件であるその特異的か受
容体との反応能力が活性化合物から失われるからでちる
。

ある演の医薬はそれらが血清中のアルブミンと結合した
場合はその活性を失うが、一方それらをアルブミン結合
から脱離させる物質を添加することＫよりそれらの活性
が高められることもすでに示すことができた。それゆえ
タンパク質に結合していない活性化合物フラクションの
みを測定できる多数の診断法がすでに開発されている。

すなわち、ヨーロッパ特許第２６１０３号の記載から生
物学的液体中に存在する活性化合物の遊離フラクション
濃度を測定する方法が知られている。その方法によれば
、検査すべき試料を活性化合物の標識された誘導体およ
び活性化合物にとって特異的な結合剤と混合し、そして
これら試薬の反応後特異的な結合剤に結合するかまたは
結合しなかった活性化合物の標識された誘導体の量を測
定している。これから生物学的液体中における遊離の活
性化合物濃度が計算されうる。しかしながら実際上特異
的な結合剤とのみ結合するが、生物学的液体中に存在す
る天然の結合タンパク質とは結合しない標識きれた活性
化合物誘導体を選択した場合にのみこの方法で信頼しつ
る測定結果が得られうる。しかし実月にあたり多くの場
合にこの要件が満たされ得かい。

それゆえヨーロッパ特許出願第１５５，１０４号には、
検査すべき生物学的液体の試料に活性化合物の標識され
た誘導体および特異的な結合剤の他に、タンパク質の結
合部位を占拠することにより活性化合物の標識された誘
導体が天然のタンパク質に結合するのを遮断することが
意図されるもう一つの物質を添加することもすでに提案
されている。この方法は西ドイツ特許第３．４１５．８
１８号にも記載されている。

国際特許出願Ｗ○８５１０　Ｏ２２６号も標識された活
性化合物誘導体が天然のタンパク質に結合しそれによυ
惹起される過誤を測定する問題？解決することを試みて
いる。そこでは、遊離の活性化合物を含有する生物学的
液体に遊離の活性化合物にとって特異的力結合剤、標識
された活性化合物誘導体およびその他にさらにこの標識
された活性化合物誘導体にとって特異的な結合剤を添加
することが提案さり、ている。標識された活性化合物誘
導体（トレーサ−）は次に活性化合物自体に対する特異
的な結合剤とのみならず活性化合物誘導体に対する結合
剤とも反応するが、結合タン・ξり質とは反応しない、
何故ならこのものはトレーナ−に対し、トレーサーに対
する特異的な結合剤よりもはるかに低い親和性しか有し
ていないからである。

前記した刊行物には、天然のタンパク質へのトレーサー
の望ましからぬ結合は生物学的液体中における活性化合
物の遊離７−）クションの測定において測定精度の重大
な妨害を招来すること、およびこの問題をできるだけ簡
単な方法で解決する必要が存在することが示される。そ
れゆえ本発明は天然のタンパク質の結合部位を遮断する
薬剤を付加的に使用することなくそしてまたトレーサー
に対する特異的な結合剤も添加することなくこの問題を
解決することを目的とする。

今、 ａ）液体の試料を未標識抗体と接触させ、ｂ）その試料
を未標識抗体から分離し、Ｃ）未標識抗体を、標識され
た物質（トレーサー）とインキュベーションしてその抗
体と交叉反応させ、そして ｄ）抗体に結合するかまたは結合したかったトレーサー
の量を測定して、その値から活性化合物の遊離フラクシ
ョン濃度を計算する、ことにより天然の結合剤の存在下
に生物学的液体中に存在し、遊離フラクションと結合フ
ラクションが相互に平衡状態にある活性化合物の遊離フ
ラクション濃度を測定するにあたυ、もし未標識抗体の
量および／または活性化合物に対するその親和性が非常
に小さくて、それユエソれらが活性化合物の遊離フラク
ションと結合フラクションとの間の平衡に実質的に影響
せずかつトレーサーの抗体に対する親和性が活性化合物
それ自体の親和性より相当に高いかまたは相当に低いな
らば精密な測定が行われうることか見出された。

この方法は生物学的液体中におけるチロキシン、トリヨ
ードチロニンおよびステロイドホルモンの遊離フラクシ
ョンの測定に特に適する。

本発明による方法は、検査すべき生物学的液体の試料を
未標識抗体との反応後に分離する点でまず第１に前記刊
行物に記載の測定法とは相異する。このようにして、妨
害性の天然の結合タンパク質が除去されて、それ以後の
測定経過を最早や妨げることはなくまた何ら測定過誤を
惹起することもない。

かかる二段階法は西１・゛イン特許公開公報第２．９３
６．３０７号公報から知られている。そこＫは同様に、
検査すべき液体試料を未標識受容体と接触させてそれに
遊離の活性化合物を結合させることによる活性化合物の
遊離フラク７ヨ／の測定法が記載されている。次に液体
試料を除去しそして未標識受容体を標識された活性化合
物誘導体とインキュイージョンし、次に受容体に結合す
るかまたは結合し力かった標識試薬量を測定する。しか
しながら、この方法は第一段階で大量の未標識受容体が
使用されるので、事実上すべての遊離の活性化合物が結
合されるという大きな欠点を有する。しかし遊ｒ二の活
性化合物およびタンパク質に結合した活性化合物は相互
に平衡状態にあるので、遊離の活性化合物が受容体に結
合することによシその平衡が乱されそして活性化合物が
タン・ξり質に結合した形態から慣例により遊離される
。その結果、この方法により測定される遊離の活性化合
物９度が過度に高くなる。

それゆえ、未標識抗体が少景しか使用さハ、ず従ってそ
れが遊離の活性化介物とタン・々りｆＭＫ結合した活性
化合物との間の平衡に顕著には影響し得ないことが本発
明の特徴である。同じ理由で活性化合物に対する未標識
抗体の親和性はほんの少しであればよい。遊離の活性化
合物すべてが未標識抗体に結合する必要も、未標識抗体
のすべての遊離の結合部位が占拠される必要もない。

この測定法に適当な未標識抗体は好都合にはポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体から力る群から選択
され、そして活性化合物に対するその親和性は少数のル
ーチン予備試験により測定される。検査すべき液体試料
を未標識抗体から分離したのち、この抗体と交叉結合す
る標識された物質（トレーサー）とインキュベーション
する。トレーサーは放射性原子例えば１−１２５を用い
てまたは蛍光性または化学ルミネセンス化合物を用いて
標識される。配素または光発色間を用いる標識化も可能
である。

トレーサーが測定すべき活性化合物とは異なる分子構造
を有することが重要である。もし、例えば本発明方法江
従いチロキシンを測定するのにトレーサーとしてｌ−１
２５で標識されたチロキシンを用いる場合は、第１図に
示される非常に平坦な標準曲線が得られ、このものから
は明白な測定結果を読みとることができ力いであろう。

この曲線は漸増量の遊離チロキシンを含有する血清試料
をチロキシン抗体と１時間インキュベーションし、血清
試料を分離しそしてトレーサーとしてｌ−１２５−チロ
キシンの存在下に１時間第２回目のインキュイージョン
を行うことにより得られる測定値を示す。

第２図に示されるように、ぴ準曲線のこの不満定力形状
は同じ測定条件の下に試料量を変えることＫよっては改
良できない。５０μ９．１００μ２および２００μ２を
用いて得られる標準曲線は測定にとって重要な範囲にお
いて不当に平坦力形状しか示さない。

第２図に示される測定においては２０ｎＱの抗体量が小
試験管の内部表面に適用されたが、第３図は１試験当り
抗体量を８０ｎ区に高めて同じ試験を行ったものを示す
。これも測定上ｉ要々範１ｆｆｌにおいて傾斜のある形
状をした曲線が生成されない。

第４図は異々る放射能を有するトレーサーを使用して第
１図に示される測定を反復した場合に得られる測定曲線
を示す。トレ−サー活性は０．０４μＣ１および０．０
２μＣ１であった。この場合もより意味のある標準曲線
は得られなかった。

しかしながらもし本発明によるチロキシンの測定法にお
いて分子のアミン基が、カルボキシル基か、または他の
部位で修飾されたチロキシン誘導体を使用する々らば第
５〜８図に示されるように、抗体に結合した各トレーサ
ー量に対し特定のチロキシン濃度が明瞭に割尚てられう
る標準曲線が得られる。本発明による方法に使用されう
る、チロキシンおよびトリヨーｒチロニ二。

二ン測定用の適当なトレーサーは酉ドイツ特許出願ｐ１
６０［１３６５，４号に記載されている。

トレーサーは化学構造が変化されているので抗体に対す
るその親和性は活性化合物それ自体の親和性よシも高い
かまたは低い。一般に、抗体に対し活性化合物それ自体
より大きい親和性を有するトレーサーを選択するのが好
都合である。しかしながらもし測定すべき遊離の活性化
合物の濃度が非常に低い場合は、抗体に対する親和性が
活性化合物のそれよりかなり少ないトレーサーを選択す
るのが好ましい。というのは活性化合物が非常に低濃度
でしか存在しない場合は抗体の結合部位７５：少ししか
占拠されず、これは次に親和性の商いトレーサーが添加
されるとほとんど識別できまい。従ってこれは遊離の活
性化合物が何ら存在しないかの如き印象を与える。これ
に対し親和性の低いトレーサーを用いる場合は満足でき
る測定結果が常圧得られる。

原則的には抗体に対し測定すべき活性化合物のそれとは
異なる親和性を有するが、交叉反応において抗体の遊離
の結合部位に対し活性化合物と競合するすべての物質が
トレーサーとして用いられうる。それゆえに本発明によ
る方法に用いられる抗体に結合する抗イデイオタイプ抗
体も抗体として使用されうる。この原理に基づく検定法
はヨーロツ・ゼ特許出願第１０６，６１５号に記載され
ている。

本発明による二段階方法では、測定すべき活性化合物の
抗体に対する親和性とトレーサーの抗体に対する親和性
とが相異することが明白な特徴である。これに対し、例
えばヨーロツ／ζ特許第２６１０３号から知られるよう
に、一段階測定法では測定すべき活性化合物とトレーサ
ーとの結合タンパク質に対する親和性が相異することが
明らかな特徴である。

従って、天然の結合タン・ぞり質が存在するゆえに生物
学的液体中における活性化合物の遊離フラクションのす
べての一段階測定法において固有の過誤の可能性が回避
されつる測定法が得られる。それゆえこの方法は非常に
正確な測定値が得られかつ２種の試薬しか必要としない
ことを４＋徴とする。

本発明による測定法を実施するのに適したテストキット
は、 測定すべき活性化合物と反応する未標識抗体であって、
その未標識抗体の量および／または活性化合物に対する
その親和性が非常に小さいので、それが活性化合物の遊
離フラクショ〉と結合フラクションとの間の平衡に実質
的に影響しない未標識抗体、およびその他：・こ抗体に
対し活性化合物自体の親和性より相轟に高いかまたは低
い親和性を有するトレーサ−を含有する。かかるテスト
キットは、任意の所望のホルモン、ステロイド、医薬、
医薬代謝産物、ポリペプチド、ビタミン、ｊ庫傷抗原、
毒素また；・まアルカロイドの遊離フラクションの１１
１１１１　定ができるようＫ　阻み立てられうる。チロ
キシン、トリヨードチロニンオ？よびステロイドホルモ
ンの遊離フラクションの測定が特に好ましい。

本発明方法による生物学的液体中のチロキシンの定量的
検出には以下のものがトレーサー化合物として特に適当
であることが判った。

（１）　　３．３’、５．５’−テトラヨードチロシン
（第５図）。

（２）　　３．５−ンヨード−４−（３，５−ショート
−４−オキンフェニル）−ヘンゼンスルホ゛ン酸（第６
図）、 （３ＣＮ−（メチルホスフィノアセチル）　−３，３’
；５．５′−テトラヨードチロシン（第７図）および （４）Ｎ−（ε−アミノカプロイル）　−３，３’、５
．５’−テトラヨードチロシン（第８図）。

本発明方法による遊離チロキシン測定のための一般的操
作法 Ｔ−４抗体で被覆した小試、験管（試験管１個轟り抗体
２０ｎＰ）中で漂準系列物（漸増量の遊離チロキシンを
含有するヒト血清）２００μρと緩衝液１０００μ２　
とを振盪下に３０分間接旭させる。

反応溶液を注ぎ出したのち、トレーサー（活性度、毎分
約６０，０００パルス）１０００パを予備インキュベー
ションした試験管に加える。この混合物を１時間インキ
ュベーションし、結合しなかったトレーサーを分離しセ
してｒ−計数器で測定する。

その結果を第５〜８図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はｌ−１２５で標識されたチロキシンをトレーサ
ーとして用いてチロキシンをｉ１１定した８合に得られ
る標準曲線を示す。 第２図は試料量を変動嘔せて第１図におけると同じ測定
をした場合の標準曲線を示す。 第２図に示される測定においては２０ｎＱの抗体量が小
試験管の内部表面に適用されたが、第３図は１試験当り
抗体量を８０ｎＱに高めて同じ試験を行ったものを示す
。 第４図は異なる放射能を有するトレーサーを使用して第
１図に示される測定を行った場合に得られる測定値を示
す。 ヒト血清中の種々の濃度の遊離チロキシンを測定する場
合に修飾されたチロキシン誘導体をトレーサーとして用
いて本発明方法により得られる曲線を第５〜８図に示す
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）液体試料を未標識抗体と接触させ、ｂ）その試
   料を未標識抗体から分離し、 ｃ）未標識抗体を、標識された物質（トレーサー）とイ
   ンキユベーシヨンしてその抗体 と交叉反応させそして ｄ）抗体に結合するかまたは結合しなかつたトレーサー
   の量を測定して、その値から活 性化合物の遊離フラクシヨン濃度を計算す る ことにより、天然の結合剤の存在下に生物学的液体中に
   存在し、遊離フラクシヨンと結合フラクシヨンが相互に
   平衡状態にある活性化合物の遊離フラクシヨン濃度を測
   定するにあたり、 未標識抗体の量および／または活性化合物に対するその
   親和性が非常に小さいので、それらが活性化合物の遊離
   フラクシヨンと結合フラクシヨンとの間の平衡に実質的
   に影響せずかつトレーサーの抗体に対する親和性が活性
   化合物それ自体の親和性より相当に高いかまたは相当に
   低いことを特徴とする方法。 ２）その遊離フラクシヨンを測定されるべき活性化合物
   がチロキシン、トリヨードチロニンまたはステロイドホ
   ルモンであることからなる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３）未標識抗体がポリクローナル抗体またはモノクロー
   ナル抗体であることからなる特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４）トレーサーが放射性原子、蛍光性または化学ルミネ
   センス基、酵素または光発色団で標識されていることか
   らなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）チロキシンまたはトリヨードチロニンの遊離フラク
   シヨンを測定するのに使用されるトレーサーがチロキシ
   ンまたはトリヨードチロニンのアミノ基、カルボキシ基
   または分子の他の位置が修飾されている誘導体であるこ
   とからなる特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６）トレーサーがＩ−１２５で標識されていることから
   なる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７）ａ）測定すべき活性化合物と反応する未標識抗体で
   あつて、その未標識抗体の量および／または活性化合物
   に対するその親和性が非常に小さいので、それが活性化
   合物の遊離フラクシヨンと結合フラクシヨンとの間の平
   衡に実質的に影響しない未標識抗体、および ｂ）抗体に対し活性化合物それ自体より相当に高いかま
   たは低い親和性を有するトレーサー、 を含有することからなる、特許請求の範囲第１項記載の
   生物学的液体中に存在する活性化合物の遊離フラクシヨ
   ン濃度を測定するためのテストキット。 ８）測定すべき活性化合物がチロキシン、トリヨードチ
   ロニンまたはステロイドホルモ ンであることからなる特許請求の範囲第７ 項記載のテストキット。 ９）未標識抗体を小試験管の内部表面上に適用すること
   からなる特許請求の範囲第７項記載のテストキット。