JPH0277649A - 生物学的流体中の物質の遊離部分の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質（または流体中に存在する他の結合性物
質）に結合した形、及び非結合の形即ち遊離の形の両方
で生物学的流体中に存在する有機物質またはリガンド（
甲状腺ホルモンまたはコルチゾルを除く）の遊離部分の
分析法に関する。それは競合反応による分析の分野に関
し、更に詳しくは血漿または血清のような生物学的流体
中の、蛋白質と結合した形のリガンドの存在下で、ホル
モン、生化学メツセンジャー、ステロイド、薬剤、薬剤
代謝産物、ポリペプチドまたは蛋白質、ビタミン、腫瘍
抗原、毒素、アルカロイド、モノ、ジまたはポリサッカ
ライドのような蛋白質に結合していない物質の濃度を測
定するのに使用する免疫検定法に関する。

従来の技術 大部分の生物学的に活性な物質は、血液の如き生物学的
流体中に遊離の形及び蛋白質に結合した形の両方で見い
だすことができる。そして最近はそれらの物質が関連す
る生理学的反応を制御するのは遊離型の濃度であり、そ
のために遊離型（または蛋白質と結合していない）と結
合型物質の両方を含む全ての濃度よりも臨床的に重要で
あると考えられている。これは、甲状椋ホルモンやコル
チゾルの場合に具体的に示されている。

結合性蛋白質の存在下における物質の遊離型または結合
型の濃度を測定するのに用いられていた古典的な方法は
、平衡透析法の使用である。これらの方法は、生物学的
流体中に遊離型と結合型の存在する大部分の物質の遊離
型の部分の濃度をかなり正確に得ることができると信じ
られており、測定の目的で使用されているが、あまりに
遅く、あまりに長くかかりすぎ、日常の臨床検査用には
実験誤差が大きすぎる。甲状腺ホルモン測定の分野では
免疫分析法に基づいた別の方法が既に開発されており、
種々の製品が市販されている。

しかし、これらは多くの操作を必要とし、時間が非常に
長くかかり、精度が悪いなどの欠点を有するばかりでな
く、遊離型を直接側れるものはなかった。

一方、バクスター・トラベノール・ラボラトリーズ・イ
ンコーホレイテッドの英国特許出願Ｍ２Ｏ３０２９０号
には遊離及び結合型の被験物質を含有する試料を非標識
受容体と接触させて遊離型の被験物質を結合させ、非標
識受容体を被験物質のラベル付同族体と接触させ、受容
体に結合したラベルの割合を測定することによって遊離
型被験物質を測定する方法が提案されている。

この方法は二工程を要するという欠点を有している。更
に重要なことは、第１工程で存在する被験物質の全てを
結合させるのに十分な非標識受容体を使用する必要があ
り、これが遊離型／結合型被験物質の平衡を乱すことで
ある。

問題点を解決するための手段 本発明は、 （ａ）生物学的流体の試料をリガンド（甲状腺ホルモン
及びコルチゾルを除く）のラベル付誘導体及びリガンド
に対する特定バインダーと混合し、（ｂ）遊離リガンド
、そのラベル付誘導体及び特定バインダーの間で反応を
行なわせ、 （ｃ）必要ならば、特定バインダーに結合したリガンド
及びそのラベル付誘導体の部分を結合しなかった部分か
ら分離し、 （ｄ）特定バインダーに結合している、または結合して
いないリガンドのラベル付誘導体の量を測定し、 （ｅ）上記測定を生物学的流体中の遊離リガンドの濃度
の測定に使用する、 ことによってリガンドの結合した部分及び遊離部分が相
互に平衡しており、一種以上の天然バインダーに結合し
たリガンドも含有する生物学的流体中に存在するリガン
ドの遊離部分の濃度を測定する方法において、リガンド
のラベル付誘導体が添加した特定バインダーに対して結
合するが、天然バインダーに対しては全く結合しないか
あるいはリガンド自体の結合よりも非常に弱く結合する
ように選択し、特定バインダーをリガンドの結合型と遊
離型の平衡を実質的に乱すには不十分な量で使用するこ
とを特徴とする方法を提供する。

リガンドは一般にホルモン（甲状腺ホルモンを除く）、
生化学メツセンジャー、ステロイド（コルチゾルを除く
）、薬剤、薬剤代謝産物、ポリペプチド、蛋白質、カテ
コールアミン、ビタミン、腫瘍抗厘、毒素、アルカロイ
ドまたはモノ、ジあるいはポリサッカライドである。

特定バインダーは一般に測定すべきリガンドに対する抗
体、またはかかる抗体を基にした試薬、または可能なら
ば適当な生物学的材料から分離した天然蛋白質バインダ
ーである。

リガンドのラベル付き誘導体は、特定バインダーに対す
る結合能力を保持しつつ、天然リガンドバインダーに対
する結合を阻止するよう化学的に変成しておく。例えば
、リガンドのラベル付き誘導体は、天然リガンドバイン
ダーに対し全く結合してはならないか、あるいはリガン
ド自体を結合するよりも非常に強くなく結合するべきで
ある。

大部分の天然に存在するバインダーのそれぞれに対する
ラベル付き誘導体の親和定数は、天然バインダーに対す
るリガンドの親和定数の好ましくは１０％未満、理想的
には０％に近いべきである。

特定バインダーに対するリガンドのラベル付き誘導体の
結合強度は、特定バインダーに対するリガンドの結合強
度と適当に匹敵すると良い。しかしながら、この比較は
臨界的なものではなくかなりな変動が許容されるが、や
はり許容できる分析結果を与えるものでなければならな
い。このリガンドのラベル付き誘導体は、添加した特定
バインダーに対するよりも生物学的試料中の天然リガン
ドバインダーに対し非常に強くなく結合すること（ある
いは全く結合しないこと）が必須の要件である。

しかし、生物学的試料中の少量の天然りガントバインダ
ーの弱く結合する成分に対するリガンドのラベル付き誘
導体の結合は必ずしもこの方法の価値を減するものでは
ない。

ラベル付き誘導体は天然の結合性蛋白質に対し著しい結
合をしないので、特定バインダーとの反応において遊離
リガンドとの競合反応に実質的に全部を利用できる。従
って、特定バインダーの低濃度の使用を可能にし、しか
も満足できる用量反応曲線を得ることができる。特定バ
インダーの低濃度の使用は、系中の天然蛋白質バインダ
ーから著しいリガンド除去をもたらさないので有利であ
る。

同時にこの誘導体はまた物理的マーカー例えば放射性原
子（または原子群）、発蛍光団、光発色団、酵素または
化学発光基をそれに結合させるか、含有する。放射能標
識を使用するときはヨウ素１２５が好適な同位体である
。しかし、その他のものも当業者には容易に思いつくで
あろう。

工程（ｃ）における、特定バインダーに結合したリガン
ド及びそのラベル付き誘導体の結合していない部分から
の分離は、通常の方法、例えば化学的沈澱とそれに続く
遠心分離によって行うことができる。あるいは固体支持
体、例えばポリスチレンビーズまたは遠心分離可能なポ
リスチレンラテックス上の反応媒体中に特定バインダー
を導入することが好都合である。あるいは特定バインダ
ーを反応容器の内壁上の被覆の形で設けても良い。

ラベルが例えば酵素または発蛍光分子である場合の如き
ある種の技術では、非結合ラベル付きリガンドから結合
ラベル付きリガンドを分離する必要はない。しかしなが
ら放射能標識を利用する場合には分離が必要である。

従来の放射線免疫検定法においては、リガンドのための
特定バインダー（例えば抗体）はりガンド及びそのラベ
ル付き部分の全部と反応するのに不十分な量で存在させ
る。従って、−見、本発明においては特定バインダーは
リガンド及びそのラベル付き誘導体の全部と反応するの
に不十分な量で存在させなければならないと思われるが
、そうではない。若干のラベル付き誘導体は試料中の天
然リガンドバインダーに結合し、また若干の遊離リガン
ドは特定バインダーによって除去されるので、それ以上
のリガンドは天然バインダーから除去される。初めから
存在する遊離リガンド及びそのラベル付き誘導体の全部
と反応するのに要する量より多くの特定バインダーの量
を使用することが有利である。遊離であろうと天然バイ
ンダーに結合していようと存在するリガンドの全部とそ
のラベル付き誘導体の合計と反応する特定バインダーの
量によって上限が決まることは明らかであるが、これは
実際の使用にとって役に立つ指標にはならい。

平衡４右、特定バインダーとその他の間でのラベル付き
リガンド誘導体の分布は、存在する天然バインダー及び
特定バインダーの量、リガンド及びそのラベル付き誘導
体に対するそれらの親和定数、及び存在するリガンド及
びそのラベル付き誘導体の量によって決まることは明ら
かである。特定バインダーと結合するラベル付きリガン
ド誘導体の量及び他の関連データから遊離リガンドの量
を計算することは理論上可能であるかも知れないが、実
際的な方法ではなく、放射線免疫検定法の標準的な方法
、即ち、「用量反応曲線」または「標準曲線」によらな
ければならない。この方法においては、この方法で必要
な測定範囲にわたる既知量（例えば平衡透析法によって
測定された）の遊離リガンドを含む多数の標準血清が、
測定される。

結果をグラフにプロットし、未知試料を曲線から読み取
る。試料、特定バインダー及びラベル付き抗原誘導体の
実際に用いる量は所望の分析範囲で適切な傾きを持った
用量反応曲線（従って適切な分析感度）が得られるよう
に最適条件を選ぶ。この分析を最適化する操作は放射線
免疫検定法及び関連の操作法を実施する人々にとっては
慣れていることである。

しかしながら、使用する量が多くなればなる程遊離リガ
ンドと天然バインダーに結合したリガンドの間の平衡の
位置がますます変化する、即ち、遊離リガンドの濃度が
平衡時にますます変化するので遊離リガンド分析に使用
する特定バインダーの量には制限がある。平衡状態が未
知試料及び標準試料の両方で同様に変化する等四におい
ては用量反応曲線を使用することによってこの変化を補
正しうる。しかし、標準血清と患者試料とでは必然的に
異なった量の天然バインダーを有するので（遊離リガン
ド分析を価値あるものとする種々の患者血清には異なる
量の天然バインダーがある）、天然バインダー（天然バ
インダー上にある全リガンドという点で）から離れるリ
ガンド分画は出来る限り小さくするべきである。しかし
、天然バインダーから離れるリガンド分画の許容範囲は
、個々の試験において臨床家によって要求される精度、
通常遊離状態で存在するリガンドの割合、天然バインダ
ーの濃度に関して患者試料に於いて経験される変動、な
どによるので一般原則を決めることはできない。それは
臨床用の放射線免疫検定法において常に存在する測定の
目的に対して最適の分析法としようとする問題である。

以上のように、必要以上に結合−遊離リガント平衡を乱
すことなく、適切な傾きを持った用量反応曲線を得、出
来る限り少ない量の特定バインダーを使用することが望
ましい。

血漿中の遊離コルチゾル、ステロイド、プロゲステロン
、エストラジオール及びテストステロン濃度の測定のた
めの分析特に放射線免疫検定法は、本発明の原理を用い
て実施することができる。以下にコルチゾルの分析につ
いて述べる。

コルチゾルは大部分が二種の天然に産する結合性蛋白質
コルチコステロイド結合性グロブリン（これはＣＢＧま
たはトランスコルチンとしても知られている）及び血清
アルブミンに結合して人間の血流中を運ばれる。健常人
のコルチゾルの約９２％はこれら二種の血漿蛋白質に結
合しており、その大部分はＣＢＧに結合している。この
特定分析のためのトレーサーを合成するにあたっては、
ＣＢＧへのトレーサーの結合が０であること、あるいは
分析に当たって加えられた特定バインダーへのトレーサ
ーの結合よりも非常に少ないことが重要である。しかし
、遊離チロキシンの測定の場合はど厳重な規制は必要で
はない。はんのわずかな割合のコルチゾルがアルブミン
と結合すると考えられており、アルブミンの多くの空の
位置が、それらに結合したコルチゾルを有する位置の数
に比して非常に大°であるからである。これは実質的な
量のトレーサーが結合しているコルチゾルの置換をする
ことなく血清アルブミンに結合できることを意味してい
る。

ＣＢＧに対するコルチゾル及びそれらの誘導体の結合に
ついての重要な論文に次のものがある。

（ａ　）　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｋｙ
ｓｉｃｓ　Ａｃｔａ、第４９５巻（１９７７年）第３１
２頁〜第３２３頁（ｂ　）　Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ、第６０巻（１９７５年）第３６４頁〜第３６８
頁 （ｃ　）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｂｓｍ　＆　Ｂｉｏｐ
ｋ７ｓ、第１８０巻（１９７７年）第１４０頁〜第１４
５頁（ｄ　）Ｖｅｓｔｓｉ、Ａｋｓｄ、Ｎａｖｕｋ、Ｂ
５５ＲＳｅｒ、！［ｈｉｍ、Ｎａｖａｋ。

第２巻（１９７８年）第１２２頁〜第１２４頁。

これらの文献から、ＣＢＧへのコルチゾルの結合は、Ｃ
ＢＧの分子の中の開裂中に入るようにＡ及びＢ環を介し
て起こることが明らかである。ＣＢＧへのプロゲステロ
ンの結合についても同様である。

Ａ及びＢ環から遠い極性基を有するステロイド核上での
置換はＣＢＧへの誘導体の結合に殆ど効果を有しないと
考えられる。一方、Ａｏ及びＢ環での、またはその近く
での適当な嵩高基または極性基の付加または置換はＣＢ
Ｇへの誘導体の結合を阻止する。

血清アルブミンへのコルチゾル及びその誘導体の結合に
関しては米国特許第４０６９３０５号が重要である。こ
の特許にはコルチゾルのＡ環の３位へのカルボキシメチ
ルオキシム架橋を介して極性基ヒスタミンを結合させる
ことによって作った誘導体はコルチゾル自身よりも血清
アルブミンに対し非常に強くなく結合することが報告さ
れている。

コルチゾルに対して特異な抗血清は、牛血清アルブミン
の如き大きな蛋白質に対し脂肪族架橋を介して結合した
コルチゾルを抗原として咥じる。

原則的には架橋基はステロイド分子のほとんどいずれの
炭素原子対しても結合できるのであるが、３．６及び２
１位が都合上及び特異性のため最も有利である。例外的
なＨ−３ラベル付きコルチゾルでは、コルチダル免疫分
析用トレーサーはステロイド分子に対し脂肪族架橋を介
してマーカー基を結合することによって合成される。マ
ーカー基はステロイドに結合したときｌ−１２５でラベ
ル付することかできる。ヒスタミンまたはチロシンメチ
ルエステル部分であることができる。あるいはマーカー
基は酵素、発蛍光団、光発色団または化学発光基である
ことができる。ステロイドへマーカー基を結合させる必
要性と、嵩高基または極性基などの基を結合することに
よってトレーサーのＣＢＧ及びアルブミンとの結合を疎
外する必要性及びステロイド骨格のＡまたはＢ環、好ま
しくは３−または６−位に脂肪族架橋を介して物理的マ
ーカーとして作用する必要性とを組み合わせることは都
合が良い。この方法で合成したトレーサーは、コルチゾ
ルと結合するＣＢＧ及びアルブミンとの結合率はＯまた
は非常に低い。

遊離コルチゾル分析に好適なトレーサーは、例えば次の
方法によって合成することができる。

（１）ｏ−カルボキシ−メチル−オキシム基、またはカ
ルボキシエチルチオ−エーテル基、またはヘミスクシネ
ート、またはへミツマレートまたはへミアジペートまた
はへミグルタネートまたはへミッタレートからなる架橋
を介してヒスタミンまたはチロシン誘導体を３または６
位に結合させる、（２）このように結合したマーカー基
を１−１２５で標識する。

このようにして合成しＩ；トレーサーは特定コルチゾル
抗血清に強く結合し、ＣＢＧ及びアルブミンと結合しい
ないかあるいは殆ど結合しないことが重要である。この
特性はトレーサーと構造的に同族体である抗原に対して
生じた抗血清を用いることによって容易に達成すること
ができる。例えば、ヒスタミン−３−カルボキシーメチ
ル−オキシムーコルチゾルーｌ−１２５）レーサーに好
適な抗血清は、抗体を生じさせる抗原として牛血清アル
ブミン−３−カルポキシーメチルーオキシムーコルチゾ
ルを用いることによって得ることができる。しかし、調
和した同族のトレーサー−抗原対を用いることは必須で
はない。ある場合には異質のトレーサー−抗原対を使用
しても良い。例えば、２１−ヘミサクシネートーコルチ
ゾルを牛血清アルブミンと共役させて生じさせた抗血清
は遊離コルチゾル放射線免疫検定法において使用するこ
とのできるヒスタミン−３−カルポキシーメチルーオキ
シムーコルチゾル−１−１２５）レーサーと十分な親和
力を有する。

コルチゾルについて説明した上記の原理は、他′のステ
ロイド、プロゲステロン、エストラジオール及びテスト
ステロンにも適用することができるのは既に述べたとお
りである。プロゲステロンはコルチゾルはコルチゾルと
同様にＣＢＧにそのＡ環及びＢ環を介して結合すること
が良く知られている。同様に性ホルモンであるテストス
テロン及びエストラジオールは蛋白質結合グロブリン（
ＳＨＢＧ）に強く結合し、この結合はＡ環及びＢ環を介
していると信じられている。興味ある文献には次のもの
がある。

（ａ　）　５ｔｅｒｏｉｄｓ　　第２７巻（１９７６年
）第４９７頁〜第５０７頁、 （ｂ　）　Ｅａｄｏｃｒｉｍｏｌ　　第９４巻（１９７
４年）第６２７頁、 （ｃ　）　５ｔｅｒｏｉｄｓ　　第２１巻（１９７３年
）第２４９頁。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）生物学的流体の試料をリガンド（甲状腺ホ
   ルモン及びコルチゾルを除く）のラベル付誘導体及びリ
   ガンドに対する特定バインダーと混合し、 （ｂ）遊離リガンド、そのラベル付誘導体及び特定バイ
   ンダーの間で反応を行なわせ、 （ｃ）必要ならば、特定バインダーに結合したリガンド
   及びそのラベル付誘導体の部分を結合しなかった部分か
   ら分離し、 （ｄ）特定バインダーに結合している、または結合して
   いないリガンドのラベル付誘導体の量を測定し、 （ｅ）上記測定を生物学的流体中の遊離リガンドの濃度
   の測定に使用する、 ことによってリガンドの結合した部分及び遊離部分が相
   互に平衡しており、一種以上の天然バインダーに結合し
   たリガンドも含有する生物学的流体中に存在するリガン
   ドの遊離部分の濃度を測定する方法において、リガンド
   のラベル付誘導体が添加した特定バインダーに対して結
   合するが、天然バインダーに対しては全く結合しないか
   あるいはリガンド自体の結合よりも非常に弱く結合する
   ように選択し、特定バインダーをリガンドの結合型と遊
   離型の平衡を実質的に乱すには不十分な量で使用するこ
   とを特徴とする方法。
2. （２）リガンドがホルモン（甲状腺ホルモンを除く）、
   生化学メッセンジャー、ステロイド（コルチゾルを除く
   ）、薬剤、薬剤代謝産物、ポリペプチド、蛋白質、カテ
   コールアミン、ビタミン、腫瘍抗原、毒素、アルカロイ
   ドまたはモノ、ジあるいはポリサッカライドである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）リガンドがプロゲステロン、発情物質またはテス
   トステロンである特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）特定バインダーがリガンドに対する抗体またはか
   かる抗体を基にした試薬である特許請求の範囲第１項か
   ら第３項のいずれか１項に記載の方法。
5. （５）リガンドのラベル付誘導体が放射性原子、発蛍光
   団、光発色団、酵素または化学発光体をそれに結合して
   いる特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に
   記載の方法。
6. （６）リガンドをプロゲステロン、エストラジオール及
   びテストステロンから選択し、リガンドのラベル付誘導
   体をそのＡ環またはＢ環でまたはその近くで少なくとも
   一つの嵩高基または極性基の付加または置換によって変
   性した特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項
   記載の方法。