DK172582B1 - Fremgangsmåde og testkit til bestemmelse af koncentrationen af en i en biologisk væske tilstedeværende aktiv forbindelse - Google Patents
Fremgangsmåde og testkit til bestemmelse af koncentrationen af en i en biologisk væske tilstedeværende aktiv forbindelse Download PDFInfo
- Publication number
- DK172582B1 DK172582B1 DK198704060A DK406087A DK172582B1 DK 172582 B1 DK172582 B1 DK 172582B1 DK 198704060 A DK198704060 A DK 198704060A DK 406087 A DK406087 A DK 406087A DK 172582 B1 DK172582 B1 DK 172582B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- active compound
- tracer
- antibody
- free
- bound
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 74
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 title claims description 15
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 8
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims description 18
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 claims description 16
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 4
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical compound [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 claims description 4
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 claims description 4
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- -1 methylphosphinoacetyl Chemical group 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002359 drug metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/0004—Gaseous mixtures, e.g. polluted air
- G01N33/0009—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment
- G01N33/0027—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment concerning the detector
- G01N33/0036—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment concerning the detector specially adapted to detect a particular component
- G01N33/0055—Radionuclides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Combustion & Propulsion (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
1 DK 172582 B1 o
Opfindelsen angår en fremgangsmåde og et testkit til bestemmelse af koncentrationen af den frie andel af en i en biologisk væske tilstedeværende aktiv forbindelse i nærværelse af naturlige bindemidler, såsom proteiner, hvor den 5 aktive forbindelses frie og bundne andel er i ligevægt med hinanden.
Det er for de fleste fysiologisk aktive substanser kendt, at de i biologiske væsker, såsom blod, foreligger dels på fri form, dels dog også bundet til proteiner, io såsom globuliner eller albuminer. Samtidig er den frie og den bundne form af den aktive forbindelse i ligevægt med hinanden.
Nu antages det, at kun den andel af den aktive forbindelse, der ikke er bundet til proteiner, har fysilo-15 giske virkninger. Ved bindingen til proteiner tabes nemlig den aktive forbindelses evne til at reagere med dens specifikke receptor, hvilket er forudsætning for den aktive forbindelses aktivitet. Det kan også allerede vises, at visse lægemidler taber deres virkning, når de bindes til 20 albuminerne i serumet, mens deres virkning forøges ved tilsætning af substanser, der fortrænger lægemidlerne fra albuminbindingen. Der er derfor allerede udviklet en række diagnostiske fremgangsmåder, ved hvilke kun den ikke-protein-bundne andel af en aktiv forbindelse kan bestemmes.
25 Således kendes fra europæisk patentskrift nr.
26.103 en fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af den frie andel af en i en biologisk væske værende aktiv forbindelse, ved hvilken fremgangsmåde den prøve, der skal undersøges, blandes med en mærket derivat af den aktive 30 forbindelse og med et bindemiddel, der er specifikt for den aktive forbindelse, og efter omsætningen af disse reagenser måles mængden af det mærkede derivat af den aktive forbindelse, der er bundet eller ikke-bundet til det specifikke bindemiddel. Heraf kan koncentrationen af den frie 35 aktive forbindelse i den biologiske væske således beregnes.
Ved denne fremgangsmåde opnås dog kun pålidelige måleresul- DK 172582 B1 2 tater, når det mærkede derivat af den aktive forbindelse vælges således, at det praktisk taget udelukkende bindes til det specifikke bindemiddel, men ikke af de naturlige bindingsproteiner, der er til stede i den biologiske væske.
5 Dette krav kan dog i praksis i mange tilfælde ikke opfyldes tilfredsstillende.
Derfor er det også i europæisk patentansøgning nr. 155.104 blevet foreslået, at der til prøven af biologisk væske, der skal undersøges, foruden det mærkede de-10 rivat af den aktive forbindelse og det specifikke bindemiddel, desuden sættes yderligere en substans, der skal blokere bindingen af det mærkede derivat af den aktive forbindelse til de naturlige proteiner, idet substansen selv optager proteinets bindingssteder. Denne fremgangsmåde er også 15 beskrevet i tysk patentskrift nr. 3.415.818.
Også i den internationale patentansøgning nr.
WO 85/00.226 forsøger man at løse problemet med bindingen af den mærkede derivat af den aktive forbindelse til de naturlige proteiner, og de deraf forårsagede målefejl.
20 i den nævnte ansøgning foreslås det, at der til den biologiske væske, der indeholder den frie aktive forbindelse, sættes et for den frie aktive forbindelse specifikt bindemiddel, en mærket derivat af den aktive forbindelse og desuden endnu et specielt bindemiddel for det mærkede derivat 25 af den aktive forbindelse. Det mærkede derivat af den aktive forbindelse (traceren) reagerer derefter såvel med det for den aktive forbindelse specifikke bindemiddel som med bindemidlet for derivatet af den aktive forbindelse, men den reagerer ikke med bindingsproteinerne, da disse har en 30 meget mindre affinitet til traceren, end det specifikke bindemiddel har til traceren.
En fremgangsmåde til bestemmelse af den samlede koncentration af en analyt, dvs. summen af fri og bundet andel, ved en ikke-homogen enzym-immunobestemmelse er beskrevet i 35 WO 81/01414. Imidlertid er høje analytkoncentrationer nødvendige til fortrængning af den enzymmærkede analyt (tracer) DK 172582 B1 3 fra antistoffet. Denne fremgangsmåde er ikke egnet til bestemmelse af det frie analytindhold.
, De ovenfor nævnte publikationer viser, at den uønskede binding af traceren til de naturlige proteiner 5 fører til en alvorlig forringelse af målenøjagtigheden ved bestemmelsen af den frie andel af en aktiv forbindelse i en biologisk væske, og at der er et behov for at løse dette problem på den enklest mulige måde. Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at løse dette problem 10 uden yderligere anvendelse af et middel, der blokerer de naturlige proteiners bindingssteder, og uden tilsætning af et specifikt bindemiddel for traceren.
Det har nu vist sig, at man nøjagtigt kan bestemme koncentrationen af den frie andel af en i en biologisk 15 væske tilstedeværende aktiv forbindelse i nærværelse af naturlige bindemidler, hvor den frie og bundne andel af den aktive forbindelse er i ligevægt med hinanden, og mængden af umærket antistof og/eller dets affinitet til den aktive forbindelse er så ringe, at ligevægten mellem fri og bundet 20 andel af aktiv forbindelse ikke påvirkes væsentligt, og hvorved a) en prøve af væsken bringes i kontakt med et umærket antistof ; b) prøven skilles fra det umærkede antistof; 25 c) det umærkede antistof inkuberes med en mærket substans (traceren), der krydsreagerer med det umærkede antistof; d) der måles den andel af traceren, der er bundet eller ikke-bundet til antistoffet, og derudfra beregnes koncentrationen af den frie andel af den aktive forbindelse, når 30 traceren har en fra molekylstrukturen af den aktive forbindelse, der skal bestemmes, afvigende molekylstruktur, der ikke er fremkaldt af mærkningen, og traceren har en betydelig større eller betydelig mindre affinitet til antistoffet end den affinitet den aktive forbindelse har.
35 Denne fremgangsmåde er især egnet til bestemmelse af den frie andel af thyroxin, triiodthyronin og af steroidhormoner i biologiske væsker.
DK 172582 B1 4
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen adskiller sig fra de i de førnævnte publikationer beskrevne bestemmelsesmetoder for det første ved, at prøven af den biologiske væske, der skal undersøges, fraskilles efter reaktionen 5 med det umærkede antistof. Dermed fjernes de generende naturlige bindingsproteiner, og de kan således ikke mere forstyrre det videre forløb af bestemmelsesmetoden, og de kan heller ikke forårsage nogen måleunøjagtigheder.
En sådan totrins-fremgangsmåde er i og for sig 10 kendt fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.936.307. Dér beskrives ligeledes en metode til bestemmelse af den frie andel af en aktiv forbindelse, idet den væskeprøve, der skal undersøges, bringes i kontakt med en umærket receptor, hvorved den frie aktive forbindelse bindes til denne.
15 Herefter fjernes væskeprøven, og den umærkede receptor inkuberes med en mærket derivat af den aktive forbindelse, hvorefter den på receptoren bundne mængde af det mærkede reagens måles. Denne fremgangsmåde har dog den store ulempe, at der i det første trin skal anvendes så store mængder 20 umærket receptor, at den samlede mængde af den frie aktive forbindelse faktisk bliver bundet. Da den frie aktive forbindelse og den til proteiner bundne aktive forbindelse dog er i ligevægt med hinanden, forstyrres ligevægten ved binding af den frie aktive forbindelse til receptoren, og yderligere 25 aktiv forbindelse frigives fra den til proteiner bundne form. Derved måles ved denne metode for store koncentrationer af den frie aktive forbindelse.
Det er derfor et kendetegn ved den foreliggende opfindelse, at det umærkede antistof anvendes i en så ringe 30 mængde, at det ikke mærkbart kan påvirke ligevægten mellem den frie og den til protein bundne aktive forbindelse. Af samme grund må affiniteten af det umærkede antistof til den aktive forbindelse kun være ringe. Hverken den samlede mængde af fri aktiv forbindelse må være bundet til det 35 umærkede antistof, eller samtlige frie bindingssteder af det umærkede antistof må være optaget.
O
DK 172582 B1 5
Et egnet umærket antistof til bestemmelsesmetoden vælges hensigtsmæssigt blandt polyklonale eller monoklonale antistoffer, og dets affinitet til den aktive forbindelse bestemmes i nogle få rutinemæssige for-forsøg. Efter at 5 have skilt den væskeprøve, der skal undersøges, fra det umærkede antistof, inkuberes dette derefter med en mærket substans (traceren), der krydsreagerer hermed. Traceren mærkes enten med et radioaktivt atom, såsom iod-125, eller med en fluorescerende eller kemiluminescent forbindelse.
10 Ligeledes er det også muligt at mærke med et enzym eller en lyschromophor.
Det er vigtigt, at traceren har en molekylestruktur, der afviger fra den aktive forbindelse, der skal bestemmes. Anvendes en med iod-125 mærket thyroxin som tracer 15 ved bestemmelsen af thyroxin ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fås den i figur 1 viste meget flade standardkurve, af hvilken éntydige måleresultater ikke mere kan aflæses. Kurven viser de måleværdier, der fås efter 1 times inkubation af en serumprøve med et stigende indhold af fri 20 thyroxin med et thyroxin-antistof, hvorefter serumprøven skilles fra, og der inkuberes én gang til i 1 time i nærværelse af iod-125-thyroxin som tracer.
Som vist i figur 2, forbedres dette utilfredsstillende forløb af standardkurven heller ikke ved variation af 25 prøverumfanget ved ellers samme målebetingelser. De med 50 /ul, 100 ^il og 200 ^μΐ fremkomne standardkurver har et for fladt forløb i de for målingen vigtige områder.
Mens der ved de i figur 2 viste målinger anbringes en antistofkoncentration på 20 ni på den indre overflade af 30 et testrør, viser figur 3 det samme forsøg, når antistofmængden er forøget til 80 ni pr. undersøgelse. Heller ikke dette fører til et stejlere kurveforløb i det for målingen vigtige område.
Figur 4 viser de måleværdier, der fås ved en gen-35 tagelse af de i figur 1 viste målinger under anvendelse af tracere med forskellig radioaktivitet. Traceraktiviteten
O
DK 172582 B1 6 udgør 0,04 ^uCi og 0,02 yuCi. Standardkurvens oplysningsværdi forbedres ikke herved.
Anvendes der dog til bestemmelse af thyroxin ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen et derivat af thyroxin, 5 der er modificeret ved aminogruppen, ved carboxygruppen eller på et andet sted i molekylet, fås de i figur 5-8 viste standardkurver, ved hvilke hver antistof-bunden tracer-mængde refererer éntydigt til en bestemt thyroxinkoncentra-tion. De til bestemmelse af thyroxin og triiodthyronin 10 egnede tracere, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er beskrevet i tysk patentansøgning nr.
P 3.600.365.4.
På grund af sin ændrede kemiske struktur har traceren en større eller mindre affinitet til antistoffet end 15 den aktive forbindelse. Det er i almindelighed fordelagtigt at vælge en tracer, der har en større affinitet til antistoffet end den aktive forbindelse. Er koncentrationen af den frie aktive forbindelse, der skal bestemmes, imidlertid meget lille, foretrækkes en tracer med en betydelig 20 mindre affinitet til antistoffet end den aktive forbindelse, fordi den i meget lille koncentration forekommende aktive forbindelse kun optager få af antistoffets bindingssteder, hvilket næppe kunne erkendes, når der derefter tilsættes en tracer med stor affinitet. Man kunne derfor få det ind-25 tryk, at der overhovedet ikke er nogen fri aktiv forbindelse til stede. Derimod kan et upåklageligt måleresultat altid opnås, når der anvendes en tracer med ringere affinitet.
I princippet er alle de substanser anvendelige 30 som tracer, der har en anden affinitet til antistoffet end den aktive forbindelse, der skal bestemmes, men med hvilken traceren konkurrerer om antistoffets frie bindingssteder i en krydsreaktion. Derfor kan også antiidiotype-antistof-fer anvendes som antistoffer, der bindes til de ved frem-35 gangsmåden ifølge opfindelsen anvendte antistoffer. En bestemmelse opbygget efter dette princip er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 106.615.
O
DK 172582 B1 7
For totrins-fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det således karakteristisk, at den aktive forbindelse, der skal bestemmes, og traceren adskiller sig med hensyn til deres affinitet overfor antistoffet. Derimod er det karak-5 teristisk for de éttrins-bestemmelsesmetoder, som eksempelvis kendes fra europæisk patentskrift nr. 26.103, at den aktive forbindelse, der skal bestemmes, og traceren har forskellige affiniteter overfor bindingsproteinerne.
Hermed er der stillet en bestemmelsesmetode til 10 rådighed, ved hvilken man undgår de fejlmuligheder, der er knyttet til alle enkelttrins-fremgangsmåder til bestemmelse af den frieandel af en aktiv forbindelse i en biologisk væske på grund af tilstedeværelsen af naturlige bindingsproteiner. Den udmærker sig derfor ved meget præcise måle-15 værdier, og de fremkommer ved anvendelse af kun to reagenser.
Et til gennemførelse af bestemmelsesmetoden ifølge opfindelsen egnet testkit indeholder således et umærket antistof, der reagerer med den aktive forbindelse, der skal bestemmes, hvor dets mængde og/eller affinitet til den ak-20 tive forbindelse er så ringe, atdet ikke påvirker ligevægten mellem den frie og bundne andel af den aktive forbindelse væsentlig, samt desuden en tracer, der har en væsentlig større eller mindre affinitet til antistoffet end den aktive forbindelse. Et sådant testkit kan være sammen-25 sat således, at det tillader bestemmelse af den frie andel af et vilkårligt hormon, en steroid, et lægemiddel, en læge-middelmetabolit, et polypeptid, et vitamin, et tumorantigen, et toksin eller en alkaloid. Bestemmelsen af den frie andel af thyroxin, triiodthyronin og et steroidhormon foretrækkes 30 især.
Især egnede som tracerforbindelser til den kvantitative påvisning af thyroxin i biologiske væsker ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har de følgende forbindelser vist sig at være: 35
O
DK 172582 B1 8 (1) 3,3',5,5'-tetraiodthyroeddikesyre (fig. 5) (2) 3,5-diiod-4-(3,5-diiod-4-oxyphenyl)-benzensulfonsyre (fig. 6) (3) N-(methylphosphinoacetyl)-3,3’,5,5’-tetraiodthyrosin 5 (fig. 7) (4) N-(£ -aminocaproyl)-3,3',5,5'-tetraiodthyrosin (fig. 8).
Generel arbejdsforskrift til bestemmelse af fri thyroxin ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
I testrør, der er belagte med T4-antistoffer (20 ng antistof pr. testrør), bringes 200 ^j1 af en standard fortyndingsrække (humansera med stigende indhold af fri thyroxin) og 1000 yul puffer i kontakt i en halv time under omrystning.
Efter fordelingen af reaktionsopløsningen sættes 1000 yul tracer (aktiviteten er ca. 60.000 impulser pr. minut) til det forinkuberede testrør. Det inkuberes i 1 time, hvorefter den ikke-bundne tracer skilles fra og 20 måles i en ^-tæller.
Resultaterne er illustreret i figur 5-8.
25 30 35
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af den frie andel af en i en biologisk væske tilstedeværende ' aktiv forbindelse i nærværelse af naturlige bindemidler, 5 hvor den frie og den bundne andel af den aktive forbindelse er i ligevægt med hinanden, og mængden af det umærkede antistof og/eller dets affinitet til den aktive forbindelse er så ringe, at ligevægten mellem fri og bundet andel af aktiv forbindelse ikke påvirkes væsentligt, og hvorved 10 a) en prøve af væsken bringes i kontakt med et umærket antistof; b) prøven skilles fra det umærkede antistof; c) det umærkede antistof inkuberes med en mærket substans (traceren), der krydsreagerer med det umærkede antistof; 15 d) der måles den andel af traceren, der er bundet eller ikke-bundet til antistoffet, og derudfra beregnes koncentrationen af den frie andel af den aktive forbindelse, kendetegnet ved, at traceren har en fra molekylstrukturen af den aktive forbindelse, der skal bestemmes, af-20 vigende molekylstruktur, der ikke er fremkaldt af mærkningen, og traceren har en betydelig større eller betydelig mindre affinitet til antistoffet end den affinitet den aktive forbindelse har.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-25 net ved, at den frie andel af den aktive forbindelse, der skal bestemmes, er thyroxin, triiodthyronin eller et-s teroidhormon.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at det umærkede antistof er et polyklonalt el- 30 ler monoklonalt antistof.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at traceren er mærket med et radioaktivt atom, en fluorescerende eller kemiluminescerende gruppe, et enzym eller en lyschromophor.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg ne t ved, at der til bestemmelse af den frie andel af thyroxin eller triiodthyronin som tracer anvendes et de DK 172582 B1 10 rivat af thyroxin eller triiodthyronin, der er modificeret ved aminogruppen, ved carboxygruppen eller på et andet sted i molekylet.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg net ved, at mærkningen af traceren udføres ved hjælp af radioaktivt iod-125.
7. Testkit til bestemmelse af koncentrationen af den frie andel af en i en biologisk væske værende aktiv 10 forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at traceren har en fra molekylstrukturen af den aktive forbindelse, der skal bestemmes, afvigende molekylstruktur, der ikke er fremkaldt af mærkningen, og at traceren har en betydelig større eller betydelig mindre affinitet til anti-15 stoffet end den affinitet den aktive forbindelse har.
8. Testkit ifølge krav 7, kéndet'egnet ved, at den aktive forbindelse, der skal bestemmes, er thyroxin, triiodthyronin eller et steroidhormon.
9. Testkit ifølge krav 7,kendetegnet 20 ved, at det umærkede antistof er anbragt på den indre overflade af et testrør.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3626468 | 1986-08-05 | ||
| DE19863626468 DE3626468A1 (de) | 1986-08-05 | 1986-08-05 | Verfahren und testkit zur bestimmung freier wirkstoffe in biologischen fluessigkeiten |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK406087D0 DK406087D0 (da) | 1987-08-04 |
| DK406087A DK406087A (da) | 1988-02-06 |
| DK172582B1 true DK172582B1 (da) | 1999-02-08 |
Family
ID=6306719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198704060A DK172582B1 (da) | 1986-08-05 | 1987-08-04 | Fremgangsmåde og testkit til bestemmelse af koncentrationen af en i en biologisk væske tilstedeværende aktiv forbindelse |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5714336A (da) |
| EP (1) | EP0257352B1 (da) |
| JP (1) | JPH0743375B2 (da) |
| AT (1) | ATE77149T1 (da) |
| CA (1) | CA1304680C (da) |
| DE (2) | DE3626468A1 (da) |
| DK (1) | DK172582B1 (da) |
| ES (1) | ES2033266T3 (da) |
| NO (1) | NO169979C (da) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3624464A1 (de) * | 1986-07-19 | 1988-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis eines analyten sowie hierfuer geeignetes mittel |
| EP1230349B1 (en) | 1999-11-18 | 2007-06-13 | Dendreon Corporation | Nucleic acids encoding endotheliases, endotheliases and uses thereof |
| US6638977B1 (en) * | 1999-11-19 | 2003-10-28 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists |
| WO2001036351A2 (en) | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists related applications |
| US7700341B2 (en) | 2000-02-03 | 2010-04-20 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon |
| WO2002072786A2 (en) | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Corvas International, Inc. | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 7, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| KR20040011480A (ko) | 2001-03-22 | 2004-02-05 | 덴드레온 샌 디에고 엘엘씨 | 세린 프로테아제 ｃｖｓｐ14를 암호화하는 핵산 분자,암호화된 폴리펩티드 및 이에 근거한 방법 |
| NZ527971A (en) | 2001-03-27 | 2006-03-31 | Dendreon Corp | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 9, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| US7160577B2 (en) * | 2002-05-02 | 2007-01-09 | Micron Technology, Inc. | Methods for atomic-layer deposition of aluminum oxides in integrated circuits |
| US7589029B2 (en) * | 2002-05-02 | 2009-09-15 | Micron Technology, Inc. | Atomic layer deposition and conversion |
| US7084078B2 (en) * | 2002-08-29 | 2006-08-01 | Micron Technology, Inc. | Atomic layer deposited lanthanide doped TiOx dielectric films |
| US7588988B2 (en) | 2004-08-31 | 2009-09-15 | Micron Technology, Inc. | Method of forming apparatus having oxide films formed using atomic layer deposition |
| US7662729B2 (en) * | 2005-04-28 | 2010-02-16 | Micron Technology, Inc. | Atomic layer deposition of a ruthenium layer to a lanthanide oxide dielectric layer |
| US7572695B2 (en) * | 2005-05-27 | 2009-08-11 | Micron Technology, Inc. | Hafnium titanium oxide films |
| US7927948B2 (en) | 2005-07-20 | 2011-04-19 | Micron Technology, Inc. | Devices with nanocrystals and methods of formation |
| US7575978B2 (en) * | 2005-08-04 | 2009-08-18 | Micron Technology, Inc. | Method for making conductive nanoparticle charge storage element |
| US7410910B2 (en) | 2005-08-31 | 2008-08-12 | Micron Technology, Inc. | Lanthanum aluminum oxynitride dielectric films |
| US7763511B2 (en) * | 2006-12-29 | 2010-07-27 | Intel Corporation | Dielectric barrier for nanocrystals |
| US8367506B2 (en) * | 2007-06-04 | 2013-02-05 | Micron Technology, Inc. | High-k dielectrics with gold nano-particles |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3928553A (en) * | 1972-03-23 | 1975-12-23 | Univ New York | Radioimmunoassay method for triiodothyronine and thyroxine |
| US4292296A (en) * | 1978-09-12 | 1981-09-29 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Diagnostic method |
| US4366143A (en) * | 1979-09-24 | 1982-12-28 | Amersham International Public Limited Company | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| JPS56501583A (da) * | 1979-11-19 | 1981-10-29 | ||
| US4391795A (en) * | 1980-03-21 | 1983-07-05 | Becton Dickinson And Company | Assay for free thyroid hormone |
| US4426453A (en) * | 1980-09-18 | 1984-01-17 | Amersham International Limited | Derivatives of iodothyronine compounds and their use in an assay for the free iodothyronine compounds |
| DE3122019C2 (de) * | 1981-06-03 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines automatisierten kontinuierlichen Enzymimmunotestes |
| US5304498A (en) * | 1982-03-19 | 1994-04-19 | Ekins Roger Philip | Method and composition for free ligand assay |
| DE3380125D1 (en) * | 1982-03-22 | 1989-08-03 | Amersham Int Plc | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| EP0134215B1 (en) * | 1982-08-27 | 1989-10-25 | EKINS, Roger Philip | Measurement of analyte concentration |
| ZA837119B (en) * | 1982-10-07 | 1984-12-24 | Amersham Int Plc | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| GB8317124D0 (en) * | 1983-06-23 | 1983-07-27 | Ekins R P | Free ligand assay |
| GB8404843D0 (en) * | 1984-02-24 | 1984-03-28 | Amersham Int Plc | Free analyte assay |
| US4711855A (en) * | 1985-02-05 | 1987-12-08 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Derivatives of 3,5,3-triiodothyronine |
| DE3600365A1 (de) * | 1986-01-09 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Neue thyroninderivate |
| GB8800419D0 (en) * | 1988-01-08 | 1988-02-10 | Amersham Int Plc | Method for measuring free fraction of ligands in biological fluids |
-
1986
- 1986-08-05 DE DE19863626468 patent/DE3626468A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-08-01 ES ES198787111139T patent/ES2033266T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-01 DE DE8787111139T patent/DE3779704D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-01 AT AT87111139T patent/ATE77149T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-08-01 EP EP87111139A patent/EP0257352B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-04 JP JP62193870A patent/JPH0743375B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-04 CA CA000543624A patent/CA1304680C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-04 NO NO873258A patent/NO169979C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-08-04 DK DK198704060A patent/DK172582B1/da not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-05-18 US US07/884,874 patent/US5714336A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-06-14 US US08/075,832 patent/US6103486A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0257352B1 (de) | 1992-06-10 |
| ES2033266T3 (es) | 1993-03-16 |
| JPH0743375B2 (ja) | 1995-05-15 |
| US5714336A (en) | 1998-02-03 |
| JPS6344168A (ja) | 1988-02-25 |
| NO169979C (no) | 1992-08-26 |
| DK406087A (da) | 1988-02-06 |
| NO169979B (no) | 1992-05-18 |
| DE3779704D1 (de) | 1992-07-16 |
| EP0257352A1 (de) | 1988-03-02 |
| NO873258D0 (no) | 1987-08-04 |
| NO873258L (no) | 1988-02-08 |
| DE3626468A1 (de) | 1988-02-11 |
| CA1304680C (en) | 1992-07-07 |
| ATE77149T1 (de) | 1992-06-15 |
| US6103486A (en) | 2000-08-15 |
| DK406087D0 (da) | 1987-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK172582B1 (da) | Fremgangsmåde og testkit til bestemmelse af koncentrationen af en i en biologisk væske tilstedeværende aktiv forbindelse | |
| DK172587B1 (da) | Fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af en analyt, analytisk anordning samt prøvesæt til brug ved fremgangsmåde | |
| CHOPRA et al. | Serum free thyroxine in thyroidal and nonthyroidal illnesses: a comparison of measurements by radioimmunoassay, equilibrium dialysis, and free thyroxine index | |
| US4366143A (en) | Assay for the free portion of substances in biological fluids | |
| US5599720A (en) | Measurement of analyte concentration | |
| Chopra et al. | Serum thyroid hormone binding inhibitor in nonthyroidal illnesses | |
| John et al. | Concentrations of free thyroxin and free triiodothyronine in serum of patients with thyroxin-and triiodothyronine-binding autoantibodies | |
| US5814461A (en) | Method for the determination of anti-TSH receptor autoantibodies | |
| CHOPRA et al. | Competitive ligand-binding assay for measurement of thyronine-binding globulin (TBG) | |
| JPS63305249A (ja) | ヒトの体液中の抗体の測定法及び対照試薬 | |
| Fukushita et al. | A case of macro-TSH consisting of IgA-bound TSH | |
| Ito et al. | Enzyme immunoassay of free thyroxin in serum. | |
| Voshall et al. | Effect of albumin on serum digoxin radioimmunoassays | |
| Ritter et al. | Endogenous antibodies that interfere with Thyroxine fluorescence polarization assay but not with radioimmunoassay or EMIT | |
| Merry et al. | The quantification of C3 fragments on erythrocytes: estimation of C3 fragments on normal cells, acquired haemolytic anaemia cases and correlation with agglutination of sensitized cells | |
| Spencer et al. | Thyroid testing for the new millenium | |
| EP0318491A1 (en) | Determination of analyte concentration using two labelling markers | |
| CN110308290A (zh) | 卡马西平化学发光检测试剂盒及其制备方法 | |
| JPH0772149A (ja) | 肝癌又は肝硬変の診断薬及び診断法 | |
| JPH08297123A (ja) | 蛋白質の免疫学的測定法とその方法の実施のためのキット | |
| US4271141A (en) | Radioimmunological method of determining the thyroid function by an in vitro test in blood serum | |
| US4312854A (en) | Immunoassay for thyroid stimulating hormone employing florisil adsorbent as separating agent | |
| JPH10221341A (ja) | 体液中の遊離リガンドの測定方法 | |
| Tsutsumi et al. | A new radioimmunoassay of free thyroxine using 125I-labelled thyroxine—protein complex uninfluenced by albumin and thyroxine-binding globulin | |
| Laurberg | A sensitive radioimmunoassay for measurements of 3, 3'-diiodothyronine in unextracted serum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |