CN116068183A - 一种免疫测定方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种免疫测定方法，其包括如下步骤：S1：对含待测靶分子的待测样本进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为第一测值和第二测值；S2：计算第一测值/第二测值的比值；S3：确定待测样本中待测靶分子的浓度。采用本发明的测定方法能够解决HOOK效应样本的问题，所述方法不受检测范围限制，能够直接测得高达106ng/ml水平的高值样本浓度；重复性良好，检测速度快。

Description

一种免疫测定方法及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种免疫测定方法及其应用。
背景技术
免疫学检测是基于抗原-抗体特异性反应的原理进行的，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被测物进行显示或信号的放大，常被用于检测蛋白质、激素等微量生物活性物质。
光激化学发光法是化学发光分析技术的常用方法之一，可用于研究生物分子间的相互作用，临床上主要用于疾病的检测。该技术整合了高分子微粒技术、有机合成、蛋白质化学及临床检测等相关领域的研究。光激化学发光分析技术的技术原理为:敏化剂在激光照射下能将周围环境中的氧分子激发为单线态氧分子，单线态氧分子能够与相距200nm左右的发光组合物反应，产生一定波长的光信号；当样品中包含待测抗原或抗体时，该抗原抗体的免疫反应能够使包含敏化剂的供体颗粒与包含发光组合物的受体颗粒结合，从而产生特定波长的光信号，检测该光信号即可检测待测抗原或抗体的含量。
在抗原-抗体的剂量反应曲线中，当抗体量固定时，反应信号会随着抗原量的增加呈现出先上升后下降的现象。将反应信号随抗原剂量增加而上升的区域称为“前带”区域，反应信号随抗原剂量增加而下降的区域称为“后带”区域，前带与后带之间衔接的区域称为“等价带”。
在免疫反应中，随着抗原与抗体的比例上升其反应性呈现出先上升后下降现象，被称为“钩状效应”或“HOOK效应”。在临床上，钩状效应会导致高值样本产生错误的阴性结果，也就是“假阴性”。
目前的免疫检测方法通常是利用剂量-反应曲线的前带区域，通过待测物含量与反应信号的线性关系计算待测物的浓度。而这种检测方法有诸多缺陷，例如：
检测范围狭窄：传统的免疫检测试剂只能利用剂量反应曲线的前带区段进行检测，检测浓度范围狭窄。超出检测范围的样本需要经过稀释后检测，操作复杂、耗时长、对稀释的精度要求高；
HOOK效应：传统的免疫检测试剂因为缺少识别HOOK效应的手段，常需要临床医师结合患者临床表现采用稀释血清样本的方法来鉴别样本是否存在HOOK效应，其操作复杂、耗时长，易造成漏检。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种免疫测定方法。采用本发明的测定方法能够简便、快捷、精确地计算出待测物浓度。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一方面提供了一种免疫测定方法，其包括如下步骤：
S1：对含待测靶分子的待测样本进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为第一测值和第二测值；
S2：计算第一测值/第二测值的比值；
S3：确定待测样本中待测靶分子的浓度。
根据本发明的一些实施方式，所述两个平行的免疫反应检测中，待测靶分子的含量/特异性捕获分子的含量的比值不同；其中所述特异性捕获分子能够与待测靶分子特异性结合。
根据本发明的一些实施方式，所述两个平行的免疫反应检测中，特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量的比值更大的免疫反应的检测结果计为第一测值，另一个为第二测值。
根据本发明的一些实施方式，待测靶分子选自抗原或抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述特异性捕获分子包括与固相物质结合的第一捕获分子和标记物标记的第二捕获分子。
根据本发明的一些实施方式，所述特异性捕获分子的含量为第一捕获分子的含量、第二捕获分子的含量或者第一捕获分子与第二捕获分子的含量之和；优选为第一捕获分子的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述确定待测样本中待测靶分子的浓度的方式为将所述待测样本的第一测值/第二测值的比值代入相关性标准曲线进行计算。
根据本发明的一些实施方式，获得所述相关性标准曲线的方法包括如下步骤：
A1：对待测靶分子含量已知的一系列不同浓度标准物质进行检测，其中对每个标准物质均进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为测值a和测值a’；优选地，所述两个平行的免疫反应检测中，特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量的比值更大的免疫反应的检测结果计为测值a；
A2：计算测值a/测值a’的比值；
A3：做测值a/测值a’的比值与标准物质浓度的相关性标准曲线。
根据本发明的一些实施方式，所述确定待测样本中待测靶分子的浓度的方式为：
当待测样本的第一测值/第二测值的比值≤临界点c时，使用反应曲线A的前带区域计算待测样本中待测靶分子的浓度；当待测样本的第一测值/第二测值的比值＞临界点c时，使用反应曲线B的后带区域计算待测样本中待测靶分子的浓度。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括如下步骤：
B1：对待测靶分子含量已知的一系列不同浓度标准物质进行检测，其中对每个标准物质均进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为测值b和测值b’；优选地，所述两个平行的免疫反应检测中，特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量的比值更大的免疫反应的检测结果计为测值b；
B2：做测值b与标准物质浓度的反应曲线A；
B3：做测值b’与标准物质浓度的反应曲线B；
B4：在反应曲线A的前带区域与反应曲线B的后带区域所对应的待测靶分子浓度重叠的部分中取一点，将该点对应的测值b/测值b’的比值记为临界点c。
本发明的第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的方法在化学发光免疫检测、酶联免疫检测和免疫比浊免疫检测中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述方法在化学发光免疫检测中应用。
根据本发明的进一步优选的实施方式，所述方法在光激化学发光免疫检测中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的方法能够解决HOOK效应问题，避免HOOK效应造成漏检，所述方法不受检测范围限制；
(2)本发明的方法直接使用经典剂量-反应曲线计算，重复性良好，测定速度快；
(3)本发明的方法检测范围大大超过常规检测方法，在检测浓度高于103ng/mL的高值样本时，无需二次稀释，能够直接测得高达106ng/mL水平的高值样本浓度。
附图说明
图1为抗原-抗体的剂量反应曲线。
图2为根据本发明的计算方法1的测定方法的原理图。
图3为根据本发明的计算方法2的测定方法的原理图。
图4为实施例2中标准物质浓度与A试剂信号和B试剂信号的反应曲线图。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
本发明基于单样本双测值方法，即对每个样本均进行两个平行的测试，两个测试中待测靶分子的含量与特异性捕获分子的含量的比例存在差异，最终产生两个不同的信号，分别为第一测值和第二测值。随着待测靶分子含量的增加，第一测值/第二测值的比值持续上升并呈现出一定的线性关系。据此原理本发明提供了以下两种计算待测靶分子浓度的方法，分别如下：
计算方法1、直接由第一测值/第二测值的比值计算待测靶分子的浓度：
如图2所示，根据第一测值/第二测值的比值与标准物质浓度的相关性标准曲线，将待测靶分子检测的第一测值/第二测值的比值代入所述曲线即可算得其浓度。
计算方法2、使用反应曲线A或者反应曲线B计算待测靶分子的浓度：
在抗原-抗体的剂量反应曲线(图1)中，当抗体量固定时，反应信号会随着抗原量的增加呈现出先上升后下降的现象。将反应信号随抗原量增加而上升的区域称为前带区域，反应信号随抗原量增加而下降的区域称为后带区域，前带与后带之间衔接的区域称为等价带。
如图3所示，反应曲线A和反应曲线B分别为根据第一测值和第二测值与标准物质浓度获得的反应曲线。在反应曲线A的前带区域与反应曲线B的后带区域存在浓度重叠的部分(如图3中虚线框中部分)，在上述浓度重叠的部分中取一点，该点对应的第一测值/第二测值的比值(如图中A/B＝15)作为临界点c。
当待测样本的第一测值/第二测值的比值≤临界点c时，使用反应曲线A的前带区域计算其浓度。
当待测样本的第一测值/第二测值的比值＞临界点c时，使用反应曲线B的后带区域计算其浓度。
对应于上述计算方法1，本发明提供的免疫测定方法具体包括如下步骤：
首先通过包含如下步骤的方法获得测值a/测值a’的比值与标准物质浓度的相关性标准曲线：
A1：对待测靶分子含量已知的一系列不同浓度标准物质进行检测，其中对每个标准物质均进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为测值a和测值a’；
A2：计算测值a/测值a’的比值；
A3：根据已知的一系列不同浓度标准物质的测值a和测值a’，做测值a/测值a’的比值与标准物质浓度的相关性标准曲线。
整个测试流程中，可以设定特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量比值更大的测值为测值a，另一个为a’；反之亦可。
然后，通过包含如下步骤的方法确定待测样本中待测靶分子的浓度：
S1：对含待测靶分子的待测样本进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为第一测值和第二测值；免疫反应检测中，所述特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量比值更大的测值计为第一测值，另一个为第二测值；
S2：计算待测样本的第一测值/第二测值的比值；
S3：将所述待测样本的第一测值/第二测值的比值代入所述相关性标准曲线进行计算，来确定待测样本中待测靶分子的浓度。
整个测试流程中，可以设定特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量比值更大的测值为第一测值，另一个为第二测值；反之亦可。
对应于上述计算方法2，本发明提供的免疫测定方法具体包括如下步骤：
首先通过包含如下步骤的方法获得反应曲线A、反应曲线B以及临界点c：
B1：对待测靶分子含量已知的一系列不同浓度标准物质进行检测，其中对每个标准物质均进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为测值b和测值b’；
B2：根据已知的一系列不同浓度标准物质的测值b，做测值b与标准物质浓度的反应曲线A；
B3：根据已知的一系列不同浓度标准物质的测值b’，做测值b’与标准物质浓度的反应曲线B；
B4：在反应曲线A的前带区域与反应曲线B的后带区域存在浓度重叠的部分(如图3中虚线框中部分)，在上述浓度重叠的部分中取一点，将该点对应的测值b和测值b’的比值记为临界点c。
整个测试流程中，可以设定特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量比值更大的测值为测值b，另一个为b’；反之亦可。
然后，通过包含如下步骤的方法确定待测样本中待测靶分子的浓度：
S1：对含待测靶分子的待测样本进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为第一测值和第二测值；免疫反应检测中，特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量比值更大的测值计为第一测值，另一个为第二测值；
S2：计算待测样本的第一测值/第二测值的比值；
S3：当所述待测样本的第一测值/第二测值的比值≤c时，使用反应曲线A的前带区域计算样本浓度；当待测样本的第一测值/第二测值的比值＞c时，使用反应曲线B的后带区域计算样本浓度。
整个测试流程中，可以设定特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量比值更大的测值为第一测值，另一个为第二测值；反之亦可。
根据本发明的一些实施方式，所述两次平行的免疫反应检测中，特异性的捕获分子的含量/待测靶分子的含量比值存在差异，可以参考但不限于如下方式达到此目的：
Figure BDA0003332208950000071
本发明所述的待测靶分子指任何可以用免疫方式检测的无机或有机分子，包括任何目标生物物质。代表所述待测靶分子的实例是细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、激素、药物物质、生物碱、甾族化合物、维生素、氨基酸和糖。
本发明所述的特异性捕获分子指能够由于分子之间的相互吸引作用而分子键合到另一分子(待测靶分子)上的分子。所述特异性捕获分子的实例包括，但不限于，蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和有机小分子。所述特异性捕获分子是指能够识别并结合特定待测靶分子而非任意靶分子的捕获分子。
根据本发明的一些实施方式，所述待测靶分子选自抗原或抗体。根据本发明的一些实施方式，所述抗原指具有免疫原性的任意物质。包括但不限于具有免疫原性的上述靶分子的实例中列举的物质。根据本发明的一些实施方式，所述特异性捕获分子选自特异性结合对的一个成员，如抗体，而待测靶分子为该特异性结合对的另一成员，如其配对的抗原。术语“抗体”在本文中以最广义使用，并明确涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段(例如Fab区、Fc区、单链抗体)。
根据本发明的一些实施方式，免疫反应检测中采用的所述特异性捕获分子包括固相物质结合的第一捕获分子和标记物标记的第二捕获分子。所述第一捕获分子和第二捕获分子可以相同也可以不同，可以是同种或不同种捕获分子，但均能够特异性结合待测靶分子。
根据本发明的一些实施方式，所述第一捕获分子结合的固相物质选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施例中，所述第一捕获分子发光微球结合，其含有发光基团，能够迅速吸收单线态氧，然后发射出一定波长(如500-615nm)的光。
本发明所述的“标准物质”是指所含待测靶分子含量已知或者能够对其所含的待测靶分子进行定量测定赋值的待测靶分子溶液。
本发明还提供了一种如本发明所述的测定方法在化学发光免疫检测、酶联免疫检测、免疫比浊免疫检测中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述方法在化学发光免疫检测中应用。
根据本发明的进一步优选的实施方式，所述方法在光激化学发光免疫检测中应用。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面通过以AFP项目为例的具体实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，也叫胎儿甲种球蛋白，属于白蛋白家族。在原发性肝癌(PLC)患者血清中的AFP(甲胎蛋白)值高低悬殊极大，正常值与病理值极差可以达到7个数量级。有文献报道，用IEMA直接测定一名原发性肝癌患者原血清AFP浓度为29ng/mL，然而将血清标本做一系列稀释后测定并计算出AFP实际浓度为5.9×106ng/mL。可见，常规技术中对于AFP的检测仍有很大的缺陷。
实施例1：常规方法检测AFP样本
测试样本(收集自临床血清样本)：
样本1：阴性血清样本(真实测值约5ng/mL)
样本2：低值阳性血清样本(真实测值约100ng/mL)
样本3：强阳性血清样本(真实测值约2×106ng/mL)
所采用的试剂盒为科美博阳诊断技术(上海)有限公司生产的甲胎蛋白(AFP)检测试剂盒(化学发光法)(批号：L2001)，其主要组分为：
试剂1：包被AFP抗体的发光微粒；
试剂2：生物素标记的AFP抗体。
测试方法：
1.向反应孔中分别添加25μl待测样本，25μl试剂1，25μl试剂2，37℃温育15min；
2.向反应孔中添加175μl光激化学发光分析系统通用溶液(供体试剂)，37℃温育10min，使用
Figure BDA0003332208950000091
分析仪进行读数。
检测结果如表1所示。
表1
初测值 测值ng/mL
样本1 7.41
样本2 109.43
样本3 11.79
表1所示的结果为常规试剂直接检测的结果，样本3测值仅为11.79ng/mL，若不结合临床表现则极易将其误判为弱阳性样本。在已知样本3为强阳性样本的情况下，使用稀释液将其50倍稀释后重新检测，其检测结果如表2所示。
表2
50倍稀释 测值ng/mL
稀释样本 >1000
如上，50倍稀释后的样本3测值>1000ng/mL，可以确定其为HOOK样本，且依然不能得到具体的测值。将稀释后的样本再次使用稀释液稀释50倍后，测值如下表3所示。
表3
2500倍稀释 测值ng/mL
稀释样本 849.51
如上，2500倍稀释后的样本测值为849.51ng/mL，经反算可得样本3的真实浓度约为2.12×106ng/mL。
实施例2：本发明的方法检测AFP样本
测试标准物质：浓度范围为0ng/mL-4×106ng/mL的纯化AFP抗原溶液
测试样本(收集自临床血清样本)：
样本1：阴性(真实测值约5ng/mL)
样本2：低值阳性(真实测值约100ng/mL)
样本3：强阳性(真实测值约2×106ng/mL)
所采用的试剂盒的主要组分：
试剂A：包被AFP抗体的发光微粒(浓度100μg/mL)，生物素标记的AFP抗体(浓度2μg/mL)；
试剂B：包被AFP抗体的发光微粒(浓度20μg/mL)，生物素标记的AFP抗体(浓度0.4μg/mL)。
测试方法：
两个反应孔为同一样本测试组，不同样本测试组重复下列加液步骤1和2：
1.向反应孔1中分别添加10μl待测样本，25μl试剂A；
2.向反应孔2中分别添加10μl待测样本，25μl试剂B；
3.各反应孔同时37℃温育15min；
4.向各反应孔中分别添加175μl光激化学发光分析系统通用溶液(供体试剂)，37℃温育10min，使用
Figure BDA0003332208950000111
分析仪进行读数。
按照上述测试方法对梯度稀释的AFP标准物质(编号1-20)进行检测，检测结果如表4所示。
根据表4数值分别做标准物质浓度与A试剂信号和B试剂信号的反应曲线A和反应曲线B，如图4；可见标准物质1-11对应的为反应曲线A的前带区域，标准物质9-20对应的为反应曲线B的后带区域，因此，反应曲线A的前带区域与反应曲线B的后带区域存在的浓度重叠的部分为标准物质9-11的浓度范围，其对应的A/B信号比值为15.05-24.31，取其中间一点A/B信号比＝19作为临界点。
根据表4数值做A/B信号比值与标准物质浓度的相关性标准曲线。
将上述标准物质测试结果存入
Figure BDA0003332208950000112
分析仪。
按照上述测试方法对三组样本进行测试，检测结果如表5所示。计算方法1为调用相关性标准曲线所得测试结果，计算方法2为调用临界点所得测试结果。
表4
Figure BDA0003332208950000113
Figure BDA0003332208950000121
表5
Figure BDA0003332208950000122
由表5所示的结果可以看出，采用本发明的检测方法能够避免HOOK效应带来的样本测值偏低的问题，可以直接得到高达2×106ng/mL的检测结果。所述方法不受检测范围限制，且两种计算方式均可行。
实施例3：超高值样本测值精密度验证
所采用的试剂盒的主要组分：
试剂A：包被AFP抗体的发光微粒(浓度100μg/mL)，生物素标记的AFP抗体(浓度2μg/mL)；
试剂B：包被AFP抗体的发光微粒(浓度20μg/mL)，生物素标记的AFP抗体(浓度0.4μg/mL)。
测试方法：
两个反应孔为同一样本测试组，不同样本测试组重复下列加液步骤1和2：
1.向反应孔1中分别添加10μl待测样本，25μl试剂A；
2.向反应孔2中分别添加10μl待测样本，25μl试剂B；
3.各反应孔同时37℃温育15min；
4.向各反应孔中分别添加175μl光激化学发光分析系统通用溶液(供体试剂)，37℃温育10min，使用
Figure BDA0003332208950000123
分析仪进行读数。
测试结果如下表6所示(使用本发明计算方法1计算)。
表6
Figure BDA0003332208950000131
根据表6的结果可以看出，采用本发明的测定方法，三例高值样本的测值重复10次测定CV均在10％范围内，表明其精密度结果良好。
实施例4：检测速度测试
测定方法A(现有技术的测定方法)：
所采用的试剂盒为科美博阳诊断技术(上海)有限公司生产的甲胎蛋白(AFP)检测试剂盒(化学发光法)(批号：L2001)，其主要组分为：
试剂1：包被AFP抗体的发光微粒；
试剂2：生物素标记的AFP抗体。
测试方法：
1.向反应孔中分别添加25μl待测样本，25μl试剂1，25μl试剂2，37℃温育15min；
2.向反应孔中添加175μl光激化学发光分析系统通用溶液(供体试剂)，37℃温育10min，使用
Figure BDA0003332208950000132
分析仪进行读数。
测定方法B(本发明的测定方法)：
所采用的试剂盒的主要组分：
试剂A：包被AFP抗体的发光微粒(浓度100μg/mL)，生物素标记的AFP抗体(浓度2μg/mL)；
试剂B：包被AFP抗体的发光微粒(浓度20μg/mL)，生物素标记的AFP抗体(浓度0.4μg/mL)。
测试方法：
两个反应孔为同一样本测试组，不同样本测试组重复下列加液步骤1和2：
1.向反应孔1中分别添加10μl待测样本，25μl试剂A；
2.向反应孔2中分别添加10μl待测样本，25μl试剂B；
3.各反应孔同时37℃温育15min；
4.向各反应孔中分别添加175μl光激化学发光分析系统通用溶液，37℃温育10min，使用
Figure BDA0003332208950000141
分析仪进行读数。
检测结果如下表7所示。
表7
Figure BDA0003332208950000142
根据表7的测试结果显示，不论是测试首样本时长还是测试所有样本总时长，采用本发明的测定方法用时均小于等于现有技术用时，特别是单个检测项目的首样本耗时明显快于现有技术的测试速度。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种免疫测定方法，其包括如下步骤：
S1：对含待测靶分子的待测样本进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为第一测值和第二测值；
S2：计算第一测值/第二测值的比值；
S3：确定待测样本中待测靶分子的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两个平行的免疫反应检测中，待测靶分子的含量/特异性捕获分子的含量的比值不同；其中所述特异性捕获分子能够与待测靶分子特异性结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述两个平行的免疫反应检测中，特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量的比值更大的免疫反应的检测结果计为第一测值，另一个为第二测值。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测靶分子选自抗原或抗体；和/或
所述特异性捕获分子包括与固相物质结合的第一捕获分子和标记物标记的第二捕获分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述特异性捕获分子的含量为第一捕获分子的含量、第二捕获分子的含量或者第一捕获分子与第二捕获分子的含量之和；优选为第一捕获分子的含量。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述确定待测样本中待测靶分子的浓度的方式为将所述待测样本的第一测值/第二测值的比值代入相关性标准曲线进行计算。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，获得所述相关性标准曲线的方法包括如下步骤：
A1：对待测靶分子含量已知的一系列不同浓度标准物质进行检测，其中对每个标准物质均进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为测值a和测值a’；优选地，所述两个平行的免疫反应检测中，特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量的比值更大的免疫反应的检测结果计为测值a；
A2：计算测值a/测值a’的比值；
A3：做测值a/测值a’的比值与标准物质浓度的相关性标准曲线。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述确定待测样本中待测靶分子的浓度的方式为：
当待测样本的第一测值/第二测值的比值≤临界点c时，使用反应曲线A的前带区域计算待测样本中待测靶分子的浓度；当待测样本的第一测值/第二测值的比值＞临界点c时，使用反应曲线B的后带区域计算待测样本中待测靶分子的浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
B1：对待测靶分子含量已知的一系列不同浓度标准物质进行检测，其中对每个标准物质均进行两个平行的免疫反应检测，记录两个平行的免疫反应的检测结果，分别计为测值b和测值b’；优选地，所述两个平行的免疫反应检测中，特异性捕获分子的含量/待测靶分子的含量的比值更大的免疫反应的检测结果计为测值b；
B2：做测值b与标准物质浓度的反应曲线A；
B3：做测值b’与标准物质浓度的反应曲线B；
B4：在反应曲线A的前带区域与反应曲线B的后带区域所对应的标准物质浓度重叠的部分中取一点，将该点对应的测值b/测值b’的比值记为临界点c。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述的方法在化学发光免疫检测、酶联免疫检测和免疫比浊免疫检测中的应用；优选在化学发光免疫检测中的应用；进一步优选在光激化学发光免疫检测中的应用。
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