ES2204141T3 - Analisis de muestra. - Google Patents

Abstract

Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, en el cual el elemento activo contiene parte de una especie que interacciona periódicamente con un motivo desactivador y es así desactivado mediante un mecanismo de desactivación estática, y se miden los períodos durante los cuales la especie es activa y el período durante el cual la especie es inactiva.

Description

Análisis de muestra.

Esta invención trata sobre un método y un aparato para el análisis de una muestra y, en particular, aunque no de forma exclusiva, al análisis por fluorescencia.

El análisis por fluorescencia es una importante herramienta instrumental tanto para químicos como para biólogos, y es de particular interés para los investigadores en el campo farmacéutico.

Uno de los métodos conocidos para el análisis de la fluorescencia consiste en excitar una muestra de unos cuantos centenares de fluoroforos con un pulso intenso de luz provinente de un láser. Se mide la intensidad de la fluorescencia emitida por la muestra después de un determinado lapso de tiempo. La muestra se excita de nuevo, y se mide la intensidad de la fluorescencia emitida por la muestra después de un lapso de tiempo distinto. Se hacen una serie de medidas después a diferentes lapsos de tiempo, y se representa la intensidad de fluorescencia en función de os períodos de tiempo, para obtener de esta manera una distribución de la intensidad de fluorescencia respecto el tiempo.

Puede obtenerse el tiempo de vida del estado superior característico de los fluoroforos que contiene la muestra a partir del gradiente de la distribución de la intensidad (por ejemplo, ajustando una curva de caída exponencial a la distribución).

Se conocen varios métodos para medir los tiempos de vida característicos de los fluoroforos, y en todos ellos necesita medirse el desplazamiento de fase o demodulación de la señal detectada comparada con una señal de excitación (ver por ejemplo JR Lacowitz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York & London). Sin embargo, los métodos existentes requieren procesos de promediado relativamente largos, que no son apropiados para los métodos modernos de tratamiento de alta velocidad de múltiples mediciones (por ejemplo en técnicas de rastreo de alta eficacia o de formación de imágenes.

Otra limitación adicional del método anterior consiste en que requiere una muestra de varios cientos de fluoroforos y una alta intensidad de iluminación. Una muestra del orden de 100 fluoroforos no proporcionará una señal suficiente con respecto al ruido para permitir la medida de la fluorescencia. Así pues, este método no puede utilizarse para medir los efectos causados por un único fluoróforo o por una muestra que contiene un pequeño número de fluoroforos, o por una muestra que se extingue ópticamente de forma rápida. Además, el método requiere la utilización de fuentes de un láser de pulsos y detectores de puerta para medir los parámetros temporales de fluorescencia, como la velocidad de disminución.

Se puede utilizar otra técnica adicional, conocida como espectroscopía de fluctuación para determinar los coeficientes de difusión de las partículas en un fluído. La espectroscopía de fluctuación consiste en iluminar un volumen determinado de fluído, en el cual las partículas se difundirán dentro y fuera de él, y detectar la luz dispersada por las partículas cuando están dentro del volumen especificado. La autocorrelación de la luz dispersada detectada consigo misma rendirá una frecuencia característica que es función de la razón de difusión de las partículas del fluído. La espectroscopía de fluctuación puede utilizarse para determinar el coeficiente de difusión medio de partícula y, así pues, puede utilizarse para determinar el tamaño de partícula.

En WO96/27798 se describe una técnica conocida como espectroscopía de correlación de fluorescencia, que puede considerarse como una variante de la espectroscopía de fluctuación. Esta técnica se utiliza cuando hay otras partículas dispersantes en el fluído que no se necesita que contribuyan a la señal detectada. Las partículas de interés están diseñadas para emitir fluorescencia, y la luz emitida por fluorescencia se separa espectralmente de la luz dispersada de tal manera que sólo se mide la difusión producida por las partículas de interés. La espectroscopía de correlación de fluorescencia permite la determinación del coeficiente de difusión, pero no permite la medición de tiempos de vida de fluorescencia. En JP-A-61 277060 se describe un método para la determinación de la concentración de antígeno en un especimen a partir de la medida del tiempo de relajación y una curva de calibración.

Uno de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar un método y un aparato para el análisis de muestras que supere o mitigue los anteriores inconvenientes.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un método de análisis para la determinación del tiempo de ciclo característico de una muestra, que consiste en la excitación de los elementos activos en la muestra con una intensidad suficiente como para que al menos algunos de los elementos activos se exciten de nuevo a un estado excitado básicamente de forma inmediata después de la relajación al estado fundamental, la detección de los cuantos emitidos por los elementos activos en la muestra para obtener una señal detectada, y el análisis de la señal detectada para derivar el tiempo de ciclo característico, en el cual el número de elementos activos en la muestra y la intensidad de la excitación son tales que los cuantos se detectan en un haz en el que los cuantos son distinguibles individualmente.

El tiempo de ciclo característico se define como el tiempo invertido por un elemento activo en volver al estado fundamental después de la excitación a un estado excitado. El término "básicamente de forma inmediata" quiere decir un período de tiempo menor que el tiempo transcurrido después de la excitación del elemento activo desde el estado fundamental hasta que el elemento activo vuelve al estado fundamental.

En consecuencia, el análisis de la señal detectada implica correlacionar la señal detectada consigo misma. En este contexto, la correlación implica realizar una transformada de Fourier, utilizando un etalon Fabry-Perot, o cualquier otro sistema de procesado de la señal apropiado. Por ejemplo, un corriente de señal que contiene al menos 100 cuantos detectados se correlaciona consigo misma (autocorrelación) utilizando la siguiente ecuación;

G_{12}(u)=\sum N_{1}(t)N_{2}(t+\tau)

para determinar la frecuencia en la corriente de señal.

El método puede incluír además una calibración para determinar el retraso promedio de al menos algunos elementos activos entre la relajación al estado fundamental y la subsiguiente re-excitación. Ello no es necesario cuando la intensidad de excitación es suficiente para que el retraso promedio sea despreciable.

La invención es ventajosa porque maximiza la señal emitida por los elementos activos de la muestra, ya que los elementos activos están hechos para circular principalmente de manera contínua, y proporcionar así una serie de cuantos (los elementos activos son saturados adecuadamente). Utilizando la presente invención puede hacerse una medición muy rápida del tiempo de ciclo característico. Por ejemplo, puede obtenerse una precisión del 1% en un período que corresponda a menos de (100 x el tiempo de ciclo característico)^{2}. Esto se asemeja a las mediciones de tiempo de vida de fluorescencia convencionales en los cuales se envía un pulso de luz y los detectores se disparan y deben ser restaurados para cada una de las series de mediciones para medir el tiempo de vida. Por ejemplo, el método anterior conocido como recuento de fotones individuales correlacionado temporalmente generalmente requiere una duración del experimento de unos pocos minutos.

Una diferencia importante entre la invención y las técnicas anteriores es que la invención no requiere la medición de la fase de excitación. En las técnicas anteriores de medición de tiempos de vida de fluorescencia característicos, se excita una muestra utilizando un pulso de luz, y se mide el tiempo transcurrido después de la iluminación hasta que se emite un fotón de fluorescencia. Para hacer esto deber medirse la fase relativa de la excitación y la emisión. Ello requiere circuitos electrónicos de alta velocidad complejos y caros. Por el contrario, en el método correspondiente a la presente invención no se requiere ninguna información relativa a la fase o a la medición del tiempo de la excitación. El tiempo de ciclo característico de los fluoroforos puede medirse monitorizando directamente la muestra, y no hay necesidad de monitorizar la fuente de excitación.

La invención, cuando se utiliza para medir un tiempo de ciclo característico de un fluoroforo utilizando iluminación láser, puede parecerse superficialmente a la espectroscopía de correlación de fluorescencia. Sin embargo, hay importantes diferencias entre la invención y la espectroscopía de correlación de fluorescencia. La espectroscopía de correlación de fluorescencia se utiliza para determinar coeficientes de difusión de partículas, y la señal experimental detectada es causada por partículas que se difunden dentro y fuera de un área iluminada, teniendo la difusión típicamente una escala de tiempo del orden de milisegundos. La iluminación se mantiene a una baja intensidad para evitar la desactivación de los fluoroforos, y debe estabilizarse a una intensidad fija para evitar la introducción de errores experimentales debido a fluctuaciones de la intensidad. Por el contrario, esta invención mide los tiempos de vida característicos de la muestra de fluoroforos iluminando la muestra a alta intensidad de tal manera que circule fundamentalmente de forma contínua y emita una serie de fotones. Por ejemplo puede hacerse una medición del tiempo de vida característico, que es típicamente del orden de nanosegundos, con una precisión del 1% en una escala de tiempo correspondiente a menos de (100 x tiempo de ciclo característico)^{2}. Ya que la medición puede hacerse en un período de tiempo tan pequeño, la desactivación de la muestra, que ocurrirá en tiempos mucho más largos, no afecta la medición. Además, haciendo una serie de mediciones puede ser posible medir el efecto de la extinción. No hay ningún requerimiento para mantener la intensidad de la iluminación estabilizada en un valor particular, mientras que la intensidad sea suficiente para hacer que los fluoroforos de la muestra circulen contínuamente.

Preferentemente, el método comprende además la selección del número de elementos activos y la intensidad de excitación para maximizar la razón de señal/ruido de la señal detectada.

La detección de los cuantos puede estar correlacionada con la detección de otra propiedad de la muestra. La propiedad puede proporcionar una señal analógica que se detecta cuando se eleva por encima de un predeterminado valor de corte. Una señal detectada puede ser autocorrelacionada o presentar correlación cruzada frente una señal de prueba o una máscara digital, o puede correlacionarse frente una señal detectada de una muestra de referencia.

El tiempo de ciclo característico de la muestra puede modificarse mediante una alteración apropiada del entorno de los elementos activos, por procedimientos que incluyen los medios químicos o físicos, y se determinan las características modificadas del tiempo de ciclo.

Convenientemente, al menos algunos de los elementos activos tiene un nivel excitado, un nivel superior de una transición de emisión y un nivel inferior de transición de emisión, y emite cuantos detectables después de la relajación desde el nivel superior de la transición de emisión al nivel inferior de la transición de la emisión, donde el tiempo de vida del nivel inferior de la transición de la emisión u otro nivel de energía que tenga una energía menor que el nivel inferior de la transición de la emisión está influído por la modificación del entorno de los elementos activos, y se determina su efecto.

Convenientemente, al menos parte de los elementos activos están unidos a un sustrato mediante un miembro que permite un movimiento vibracional del elemento activo, donde el tiempo de vida del nivel inferior de transición de emisión u otro nivel de energía tiene una energía más baja que el nivel inferior de transición de emisión puede ser alterado por la modificación del entorno electrónico del elemento activo.

Apropiadamente, la modificación del entorno electrónico está afectada por la presencia de al menos un motivo modificador que sea capaz de influenciar el entorno electrónico del elemento activo.

Apropiadamente, el cambio en el tiempo de ciclo es debido a la transferencia de energía al motivo modificador desde el niver inferior de la transición de emisión u otro nivel de energía que tenga una energía menor que el nivel inferior de emisión.

Apropiadamente, el tiempo de ciclo se modifica mediante cambios en la conformación del elemento activo en relación al motivo modificador.

Apropiadamente, cada elemento activo contiene parte de una sonda, que se mueve entre distintos entornos dieléctricos, incluyendo aquellos que ocurren en una molécula o su solvente, donde el tiempo de ciclo característico de la sonda se ve afectado por las escalas temporales del movimiento del elemento activo entre distintos entornos dieléctricos, viéndose afectado el movimiento por modificaciones entre las cuales se incluyen al menos una de los siguientes:

a)

Alteración del tamaño global de la sonda;

b)

Alteración de la distancia entre el elemento activo y el resto de la sonda;

c)

Alteración de la rigidez de una molécula espaciadora entre el elemento activo y el resto de la sonda;

d)

Modificación de la sonda o parte de ella con motivos hidrofílicos, polares, cargados o hidrofóbicos.

Apropiadamente, el elemento activo contiene parte de una especie que interactúa periódicamente con un motivo modificador, y se miden los periodos durante los cuales las especies interactúan con el motivo modificador y los períodos durante los cuales las especies no interactúan con el motivo modificador.

Apropiadamente, elemento activo contiene parte de una especia que periódicamente interactúa con un motivo desactivador y es así desactivado por un mecanismo de desactivación estático, y se miden los períodos durante los cuales la especie es activa y el período durante el cual la especie está inactiva.

Apropiadamente, el período de la interacción periódica está influenciado por una modificación apropiada de una propiedad de la especie o del motivo modificador o del motivo desactivador.

Apropiadamente, la modificación comprende el cambio de la longitud de una molécula espaciadora sobre el cual está ubicado el elemento activo, o de la longitud de la molécula espaciadora sobre la cual está ubicado el motivo modificador o el motivo desactivador.

Apropiadamente, la modificación comprende el cambio de la flexibilidad de la molécula espaciadora sobre la cual está ubicado el elemento activo, o la flexibilidad de la molécula espaciadora sobre la cual está ubicado el motivo modificador o el motivo desactivador.

Apropiadamente, la modificación comprende la adición de un motivo modificador a la molécula espaciadora sobre la cual está ubicado el elemento activo, o a la molécula espaciadora sobre la cual está ubicado el motivo modificador o el motivo desactivador.

Apropiadamente, el elemento activo está unido a través de una molécula espaciadora a un lugar de unión, y la modificación resulta de una interacción con el lugar de unión.

Apropiadamente, la modificación resulta de la restricción de un movimiento periódico de la molécula espaciadora sobre la cual está ubicado el elemento activo, o la molécula espaciadora sobre la cual está ubicado el motivo modificador o el motivo desactivador.

Apropiadamente, el elemento activo está unido a través de una molécula espaciadora a un lugar de unión, y la modificación resulta de la interacción con un motivo modificador unido al lugar de unión.

Apropiadamente, el elemento activo está unido a través de una primera molécula espaciadora a un primer lugar de unión, y un motivo modificador o un motivo desactivador está unido a través de una segunda molécula espaciadora, en el cual la separación entre el primer y el segundo lugares de unión determina la periodicidad de la interacción entre el elemento activo y el motivo modificador o el motivo desactivador.

La unión puede ser a sondas truncadas de ADN/ARN, a DNA/RNA complementario. La invención puede utilizarse para monitorizar la unión de un ligando (por ejemplo un fármaco, una hormona, etc) a una proteína (por ejemplo un anticuerpo, un receptor, o un mimético sintético, bien directa o indirectamente (competitivamente).

Apropiadamente, el primer y segundo elementos interaccionan periódicamente para formar el elemento activo, y se miden el período durante el cual interaccionan el primer y el segundo elemento para formar el elemento activo y el período durante el cual el primer y el segundo elemento no interaccionan para formar el elemento activo.

Cualquiera de las modificaciones de la interacción entre un elemento activo y un motivo modificador o un motivo desactivador descritas anteriormente pueden aplicarse a la formación periódica de un elemento activo a través de la interacción del primer y el segundo elemento. Esto puede hacerse reemplazando el elemento activo con el primer elemento, y reemplazando el motivo modificador o el motivo desactivador con el segundo elemento.

El elemento activo formado por el primer y el segundo elemento puede ser una especie de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.

El elemento activo formado por el primer y segundo elementos puede ser un excímer o un excíplex.

Apropiadamente, la sección eficaz de excitación del estado fundamental de un elemento activo se hace variar periódicamente, y se mide el período de variación.

Apropiadamente, el elemento activo emite fotones de fluorescencia que interaccionan con una solución en la cual se mantienen los elementos activos, y el efecto de la solución se monitoriza modulando las propiedades de la solución.

Apropiadamente, el método comprende además la excitación de los elementos activos utilizando un pulso de excitación y la determinación del tiempo transcurrido entre la excitación y la emisión de cuantos desde el elemento activo, y la resta de este tiempo del tiempo de ciclo característico.

Cualquiera de las anteriores modificaciones puede utilizarse para producir especies activas con un tiempo de ciclo característico para ser utilizados como marcador, por ejemplo una sonda de ADN o un ensayo de unión de ligando utilizando anticuerpos o receptores.

La invención puede utilizarse para monitorizar cambios conformacionales (por ejemplo de una proteína) como cambios de distancia/yuxtaposición. La invención puede utilizarse para identificar residuos unidos a un polímero (por ejemplo, síntesis combinatoria de péptidos u oligonucleótidos u oligosacáridos).

Las fluctuaciones en la producción de fotones que resultan de los procesos de absorción periódicos y relajaciones asociadas causado por fotones a través de fluctuaciones mecánicas puede medirse de acuerdo con la invención.

La excitación de la muestra puede producirse mediante otras formas de energía (por ejemplo fluorescencia de rayos X). La excitación de la muestra puede producirse a través de una reacción química (por ejemplo, quimioluminiscencia) o puede comportar otras formas de energía (por ejemplo, fosforescencia). La excitación química puede incluír un catalizador, que puede ser un enzima (por ejemplo bioluminiscencia producida por ATP y NADH).

La invención puede utilizarse para buscar compuestos químicos, nuevos fármacos, productos agroquímicos, contaminación alimentaria, ADN, ARN, bacterias, virus o sub-productos, indicando la presencia o la actividad de estas entidades. Está búsqueda puede llevarse a cabo en serie o en paralelo.

Los elementos activos pueden tener un estado de excitación superior, un estado de excitación inferior y un estado fundamental, y emitir cuantos detectables después de la relajación del estado excitado al estado excitado inferior, un método que además comprende la excitación de segundos elementos a un estado excitado tal que los segundos elementos transfieren energía de excitación a los elementos activos, excitando así los elementos activos al estado superior de excitación.

La utilización de un segundo elemento es ventajoso porque el segundo elemento actúa como tampón, almacenando excitación, y pasando la excitación al elemento activo en un momento posterior. Esto es particularmente ventajoso cuando la muestra está excitada por un pulso de excitación o una excitación que fluctúa en intensidad. El tampón suavizará las ondulaciones propias de una señal eléctrica.

Apropiadamente, se proporcionan muchos elementos secundarios para cada elemento activo.

La detección de los cuantos puede estar correlacionada con la detección de otra propiedad de la muestra.

Los cuantos pueden ser fotones. Los elementos activos pueden ser fluoroforos.

La muestra puede contener menos de 100 elementos activos. La muestra puede contener menos de 10 elementos activos.

El tiempo de ciclo característico puede estar en el rango de 10-100 ns. El método puede utilizarse como método de análisis de materiales biológicos, de materiales de ensayo o como método multi-ensayo de materiales biológicos.

De acuerdo a un segundo aspecto de la invención, se proporciona un aparato de análisis para la determinación del tiempo de ciclo característico de los elementos activos en una muestra, comprendiendo métodos para la excitación de elementos activos en la muestra con suficiente intensidad para que al menos algunos de los elementos activos sean excitados de nuevo a un estado excitado esencialmente de forma inmediata después de la relajación a un estado fundamental, métodos para la detección de cuantos emitidos por la muestra para obtener una señal detectada, el estudio de métodos para el análisis de la señal detectada para derivar el tiempo de ciclo característico, donde el número de los elementos activos de la muestra y la intensidad de la excitación son tales que los cuantos se detectan en una corriente en la cual los cuantos individuales son distinguibles los unos de los otros.

A continuación se describirán algunos ejemplos de realización específicos de la invención mediante ejemplos, haciendo referencia a los dibujos que se adjuntan, en los cuales:

La Figura 1 es una representación esquemática de un aparato de detección de fluorescencia de acuerdo con la invención;

La Figura 2 es una serie de gráficos que ilustra el funcionamiento de la invención para un número muy pequeño de fluoroforos;

La Figura 3 es una serie de gráficos que ilustran el funcionamiento de la invención para un número muy grande de fluoroforos;

La Figura 4 es una ilustración esquemática de los estados de energía de un fluoroforo;

La Figura 5 es una ilustración esquemática de los estados de energía de un fluoroforo y los estados de energía de una molécula;

La Figura 6 es una ilustración esquemática de los estados de energía de las especies activas;

La Figura 7 es una ilustración esquemática de diversas configuraciones de especies activas, junto con un gráfico que ilustra la desactivación;

La Figura 8 es una ilustración esquemática de diversas configuraciones de especies activas;

La Figura 9 es una ilustración esquemática de diversas configuraciones de especies activas;

La Figura 10 es una ilustración esquemática de diversas configuraciones de especies activas;

La Figura 11 es una ilustración esquemática de diversas configuraciones de especies activas;

La Figura 12 es una ilustración esquemática de diversas configuraciones de especies activas;

En referencia en primer lugar a la Figura 1, un aparato de detección de fluorescencia contiene una muestra 1 y un láser 2 que está dispuesto para iluminar la muestra 1 con un rayo continuo de luz. El detector 3 puede estar equipado con un filtro (que no se muestra) para prevenir la detección de la luz emitida por el láser 2. Un autocorrelador 4 correlaciona la señal detectada para dar una correlación, y el procesador 5 procesa la salida del detector para medir el tiempo de vida característico de los fluoroforos que contienen la muestra I. La operación del procesador 5 se describe más adelante. La salida del procesador 5 y/o el autocorrelador 4 pueden mostrarse en un monitor 6.

La Figura 2 ilustra el principio de operación de la invención. La Figura 2a representa el resultado de iluminar un único fluoroforo con un rayo contínuo de luz de alta intensidad. Un fotón del rayo de alta intensidad excitará al fluoroforo a un estado excitado, y después del tiempo característico del fluoroforo, el fluoroforo emitirá un fotón (i.e. se hará fluorescente). Después de la emisión del fotón el fluoroforo se relajará a un estado energético inferior, y posteriormente se relajará al estado fundamental. Ya que el fluoroforo está siendo iluminado por un rayo contínuo de fotones provinentes de láser, una vez ha vuelto al estado fundamental se excitará de nuevo inmediatamente a su estado excitado. El fluoroforo emitirá de nuevo un fotón después del tiempo característico. Así pues, el fluoroforo emitirá una serie de fotones, estando cada fotón separado del fotón anterior por el mismo período de tiempo, tal como se ilustra en la Figura 2a. La separación de los fotones corresponde al tiempo invertido por el fluoroforo para volver al estado fundamental después de la excitación desde el estado fundamental. Este período es el tiempo de ciclo característico del fluoroforo.

En la Figura 2a, las señales correspondientes a cada emisión de fotón se muestran como igualmente espaciados. De hecho, el tiempo de ciclo característico no será constante, sino que irá variando alrededor de una media. Tales variaciones se tienen en cuenta mediante el proceso de auto-correlación descrito anteriormente. Así pues, para los propósitos de ilustración sólo las Figuras 2a a 2c se han preparado bajo la asunción que el tiempo de ciclo característico del fluoroforo es constante.

El gráfico mostrado en la Figura 2a ilustra un escenario ideal en el cual la muestra contiene un sólo fluoroforo, en el que se detectan todos los fotones emitidos por el fluoroforo, en el que el fluoroforo se excitada inmediatamente cuando decae a su estado no excitado, en el que el fluoroforo no puede excitarse nuevamente cuando está en su estado excitado, y en el que no se detecta ninguna luz provinente del láser 2.

La Figura 2b ilustra un segundo escenario, en el cual la muestra contiene dos fluoroforos de un sólo tipo, y en el cual todavía se aplican todas las otras asunciones dadas anteriormente. En este caso, cada fluoroforo emitirá una serie de fotones tal como se ha explicado anteriormente. Se puede estimar el tiempo de ciclo característico del fluoroforo a partir de la separación de los fotones en cada serie, ya que la autocorrelación de la distribución de fotones proporcionará un fuerte pico a una frecuencia que corresponde al tiempo de ciclo característico del fluoroforo.

La Figura 2c ilustra un tercer caso que corresponde al que se muestra en la Figura 2b, excepto que no se detectan todos los fotones emitidos por el fluoroforo. Aunque no se detectan todos los fotones emitidos, el número detectado es suficiente para que una autocorrelación de la señal de la Figura 2c proporcione un pico a la frecuencia que corresponde al tiempo de ciclo característico del fluoroforo, y, además, aparecerá otro pico a dos veces esa frecuencia, un pico a tres veces esa frecuencia, y así sucesivamente.

Así pues, no es necesario que cada fotón emitido por la muestra de fluoroforos sea detectado, sino que todo lo que se requiere es que el número de fotones detectado sea suficiente para obtener una autocorrelación de la señal detectada para medir picos mesurables a múltiplos de la frecuencia que corresponde al tiempo de ciclo característico de los fluoroforos.

Hay un límite superior al número de fluoroforos que pueden incluírse en una muestra. Si por ejemplo una muestra contuviera más de 100 fluoroforos, y el detector detectara todos los fotones emitidos por los fluoroforos, entonces el número de fotones sería tan grande que la señal detectada podría borrarse y sería difícil obtener cualquier información a partir de la señal.

Como se ha dicho anteriormente, en un escenario ideal únicamente se evaluaría un sólo fluoroforo. De todas formas, en la práctica no se mantendrán las asunciones hechas para el escenario ideal. Por ejemplo, no se detectarán todos los fotones emitidos por el fluoroforo. Además, no todos los fluoroforos incluídos en la muestra serán activos. Para maximizar la razón de la señal con respecto al ruido de la señal detectada, puede seleccionarse una combinación óptima del tamaño de la muestra y la intensidad de la iluminación de láser. La selección dependerá de la configuración óptica específica utilizada, y se verá influenciada, por ejemplo, por la eficiencia de la detección de fotones y la eficiencia cuántica de la muestra de fluoroforo. Así, el número de fluoroforos a utilizar se determina experimentalmente maximizando la razón de señal con respecto al ruido de la señal detectada para unas determinadas condiciones experimentales. El nivel de señal ideal corresponderá esencialmente a la observación de un solo fluoroforo en el escenario ideal tal como se ha descrito anteriormente, aunque esto en realidad involucrará la detección de un porcentaje de la emisión de entre aproximadamente 5-50 fluoroforos.

La Figura 3 ilustra el funcionamiento de la invención cerca de su límite superior (en términos de intensidad de luz detectada). Si se utiliza un aparato como el de la Figura 1 para detectar fotones emitidos por una muestra de un gran número de fluoroforos, por ejemplo 50, puede detectarse una señal como la que se muestra en la Figura 3a. Más que detectar fotones individuales separados por retrasos temporales, el número de fluoroforos es tal que la intensidad de la luz fluorescente detectada nunca cae a cero. Aunque la señal detectada parece aleatoria, a partir de lo anterior se entenderá que la autocorrelación de la señal proporcionará una serie de picos que son múltiplos de una frecuencia que corresponde al tiempo de ciclo característico del fluoroforo, permitiendo así la caracterización del fluoroforo. Esto se ilustra adicionalmente en referencia a la Figura 3b, donde de nuevo la señal detectada parece aleatoria. Asumiendo que la muestra de la cual se derivan los símbolos de las Figuras 3a y 3b incluyen el mismo número de fluoroforos, la señal mostrada en la Figura 3b corresponde al fluoroforo con un tiempo de ciclo característico que es diez veces el del tiempo de ciclo característico mostrado en la señal de la Figura 3a. Aunque las Figuras 3a y 3b parecen señales aleatorias, es evidente a partir del número de veces que la señal cruza su valor medio que el tiempo de ciclo característico de la muestra detectado en la Figura 3b es menor que el de la muestra detectada en la Figura 3a.

El ejemplo de realización descrito anteriormente asume que la intensidad de la luz incidente en una muestra es suficiente para que una vez que un determinado fluoroforo haya vuelto a su estado fundamental se excite de forma inmediata a un estado excitado. Este es el montaje experimental óptimo, ya que una señal detectada bajo estas condiciones será función sólo del tiempo de ciclo característico del fluoroforo. Si se utiliza una menor intensidad de luz incidente, la separación de los fotones emitidos desde un determinado fluoroforo sería función del tiempo de ciclo característico del fluoroforo y del tiempo transcurrido entre los fotones que colisionan con el fluoroforo. La razón de colisiones de fotones será constante para una determinada intensidad del láser y un determinado montaje experimental, y el efecto de una intensidad de luz incidente menor que la óptima puede eliminarse del tiempo de ciclo medido a través de una calibración apropiada para obtener un tiempo de ciclo característico.

El láser que se muestra en la Figura 1 se está dispuesto para iluminar una muestra con un rayo continuo de luz. Esta es una disposición ventajosa, ya que los láseres de onda contínua son baratos y de fácil disponibilidad. De todas formas, se entiende que la muestra se iluminará utilizando pulsos de luz. Por ejemplo, una luz que tenga una separación entre pulsos de orden menor que el tiempo de ciclo característico de los fluoroforos de la muestra. Si la separación entre pulsos fuera mayor, la cantidad de tiempo que cada fluoroforo permanecería en un estado no excitado introduciría ruido en la señal detectada hasta tal extremo que la medición del tiempo de vida del fluoroforo se vería comprometida.

Una muestra de fluoroforos puede iluminarse con pulsos que tengan una duración mucho mayor que el tiempo de ciclo característico de los fluoroforos que componen la muestra. Por ejemplo, puede utilizarse un pulso de 10 microsegundos producido por un láser de Q-conmutado para medir tiempo de ciclo característicos de fluoroforos del orden de 1 nanosegundo. Ello es posible porque el pulso es 10000 veces más largo que el tiempo de ciclo, y de esta forma se emitirán suficientes fotones durante un determinado pulso de excitación para obtener la medición del tiempo de ciclo característico.

Si la duración de un pulso de excitación es igual a (100\times\tau)^{2} donde \tau es el tiempo de ciclo característico de un fluoroforo a medir, ello permitirá un nivel de señal a ruido máximo posible del orden del uno por ciento. La duración del pulso debe ser al menos un orden de magnitud mayor que el tiempo de ciclo característico a medir, para que pueda proporcionar una medición útil.

La medición del tiempo de ciclo característico de un fluoroforo utilizando un solo pulso contrasta con el análisis de fluorescencia convencional, en el cual se necesitan varios millares de pulsos de iluminación para medir el tiempo de vida característico del fluoroforo.

El tiempo de ciclo característico de un fluoroforo puede derivarse a partir de la señal detectada de diversas maneras, incluyendo la utilización de analizadores de señal, de correladores analógicos, de correlación de almacenamiento o de software o de transformadas de Fourier.

La invención puede utilizarse para estudiar la eficiencia cuántica de los fluoroforos. La eficiencia cuántica es la medición del número de fotones emitidos por el fluoroforo en relación al número de fotones "absorbidos" por ese fluoroforo.

Generalmente, un fotón, después de ser absorbido por un fluoroforo, excitará al fluoroforo a un estado desde el cual se relajará a un estado inferior mediante la emisión de un fotón (fluorescencia). De todas formas, algunos estados excitados del fluoroforo no permitirán la emisión de un fotón, y la excitación deberá disiparse de alguna otra manera, por ejemplo como calor, Un estado excitado "no fluorescente" puede o no ser capaz de ser excitado a un estado excitado "fluorescente" mediante la absorción de otro fotón. Los aparatos de detección de fluorescencia de las técnicas anteriores conocidas requieren una muestra de muchos fluoroforos, y por ello no es posible realizar un estudio completo de la eficiencia cuántica de un tipo determinado de fluoroforo, ya que el efecto de la excitación a estados "no fluorescentes" se promedia para todos los fluoroforos de la muestra. La invención permite el estudio de la muestra que contiene un pequeño número de fluoroforos, permitiendo así una investigación más detallada de los estados "no fluorescentes".

La Figura 4 muestra esquemáticamente los estados de energía de un único fluoroforo. El fluoroforo parte de un estado fundamental 7, se excita a un nivel superior de una emisión de transición 8 mediante una energía provinente de una fuente externa, y decae desde el nivel superior de la transición de emisión 8 a un estado de la transición de emisión 9, emitiendo simultáneamente un fotón. El fluoroforo decae entonces desde el nivel inferior de la transición de emisión 9 de vuelta el estado fundamental 7.

En una medición convencional del tiempo de vida de fluorescencia se utiliza un pulso de láser incidente para excitar un fluoroforo (en una población) desde el estado fundamental 7 al estado superior de la transición de emisión 8, y se mide el tiempo transcurrido hasta que el fluoroforo emite un fotón. El período de tiempo medido es el tiempo desde la excitación desde el estado fundamental 7 hasta que tiene lugar la transición de emisión. La presente invención permite la detección de una serie de fotones emitido por un fluoroforo que es excitado continuamente de tal forma que de hecho no consume tiempo en el estado fundamental 7. El tiempo de ciclo característico medido utilizando en la invención es la suma de los tiempos de vida del estado superior de la transición de emisión 8 y del nivel inferior de transición de la emisión 9. Ya que el tiempo de vida del nivel inferior de la transición de emisión 9 no está incluído en el período medido utilizando la detección de fluorescencia convencional, puede determinarse el tiempo de vida de este nivel inferior 9 restando el tiempo de vida medido utilizando la detección de fluorescencia convencional del tiempo de ciclo característico medido utilizando esta invención.

El tiempo de vida del nivel inferior de la transición de emisión 9 podría medirse por ejemplo utilizando un láser configurado para producir radiación de pulsos, permitiendo así la medición de la fluorescencia de modo convencional, y configurándolo entonces para producir luz continua de tal manera que el tiempo de ciclo característico del fluoroforo pueda medirse utilizando el método de acuerdo con esta invención. El aparato de detección puede configurarse para sustraen automáticamente el tiempo de vida característico del fluoroforo medido de forma convencional del tiempo de ciclo característico, para proporcionar una medición del tiempo de vida del nivel inferior de la transición de emisión 9. En algunos casos puede conocerse el tiempo de vida de fluorescencia de un fluoruro medido de forma convencional, en cuyo caso el tiempo de vida del nivel inferior de la transición de emisión 9 puede determinarse sustrayendo el tiempo de vida conocido a partir del tiempo de ciclo.

Es ventajoso mantener el fluoroforo de la Figura 4 en un ciclo de excitación esencialmente continuo. El efecto de tener una razón de excitación del fluoroforo desde el estado fundamental menor que la óptima se verá incluído en el tiempo de ciclo característico medido, y reducirá la precisión de la medición del tiempo de ciclo. Este efecto puede reducirse utilizando calibración experimental.

La Figura 5 ilustra un método propicio para proporcionar la excitación continua requerida. La muestra que contiene un fluoroforo X contiene también la molécula Z. La molécula Z se excita mediante la iluminación incidente desde un estado fundamental 10 a un nivel excitado 11. El fluoroforo X se excita a un estado superior de transición de emisión 12 por colisión con la molécula Z, se relaja a través de emisión radiactiva a un nivel inferior de la transición de emisión 13, y se relaja entonces al estado fundamental 10 (el estado fundamental 10 es común para X y Z). El nivel excitado 11 de la molécula Z tiene un tiempo de vida más largo que el nivel superior de la transición de emisión 12 del fluoroforo X. La molécula Z actúa pues como tampón, almacenando energía en un nivel excitado 11, antes de transferir energía al fluoroforo X. La utilización de la molécula Z es análogo al condensador en un circuito eléctrico que almacena energía eléctrica y la libera al circuito a lo largo del tiempo. De forma ocasional, el fluoroforo X puede excitarse directamente al nivel superior de la transición de emisión 12 mediante la iluminación, tal como se muestra en la Figura 5.

Deberían suministrarse numerosas moléculas Z para cada fluoroforo X, para asegurar que haya un gran número moléculas excitadas Z para interaccionar con el fluoroforo X y excitarlo al al nivel superior de la transición de emisión 12 una vez ha caído al estado fundamental 10. La molécula Z debe tener un tiempo de vida del nivel excitado 11 mayor que el tiempo de separación interpulso si esta configuración del sistema pretende ser utilizada para evitar la ondulación causado por la iluminación de pulsos.

Cuando se proporciona un gran número de moléculas Z para cada fluoroforo X, la mayoría de la iluminación excitará a las moléculas Z, en lugar de excitar directamente a los fluoroforos X. Si los fluoroforos X fueran excitados directamente por la iluminación entonces habría una probabilidad significativa de que dos fotones de excitación fueran absorbidos por un fluoroforo X en un corto lapso de tiempo, de tal manera que el fluoroforo se excitaría a un nivel de energía muy alto. En lugar de esto, la iluminación proporciona una cantidad de energía finita a las moléculas Z, y por lo tanto éstas no pueden excitar a los fluoroforos X a estados muy altos. El uso de moléculas Z tal como se ilustra en la Figura 5 reduce así la probabilidad de sobre-excitar un fluoroforo X y que éste se desactive.

Un ejemplo de excitación del fluoroforo X a través de una molécula Z es la técnica FRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia), en la cual un primer fluoroforo transfiere energía a través de interacción de tipo dipolo-dipolo a un segundo fluoroforo. El mecanismo FRET se describe a continuación en detalle. Para que el mecanismo FRET actúe como tampón, se requiere un gran número de moléculas donadoras (el primer fluoroforo) para cada molécula aceptora (el segundo fluoroforo). Se puede construir una estructura siguiendo un patrón de lisina, empezando con un aceptor y colocando donadores en el resto de la estructura.

Cuando un fluoroforo tiene un estado (o estados) de energía significativamente por debajo del nivel inferior de una transición de emisión, o por encima del nivel superior de una transición de emisión, puede generarse un considerable calentamiento localizado durante el decaimiento de esos niveles de energía. El calentamiento localizado puede generar cierto número de fotones de baja energía, que puede aparecer como una señal análoga. El efecto de este calentamiento puede medirse de diversas formas, por ejemplo mediante la medición directa de la temperatura, mediante la medición de la diferencia de presión local, y la medición del cambio en el índice de refracción. El método de acuerdo con la invención puede modificarse de tal manera que un evento sólo se registre si se detecta un fotón y el estado del calentamiento localizado está por encima de un estado predeterminado. De forma alternativa, puede llevarse a cabo un correlación cruzada entre la corriente de llegada de fotones que se detecta y la temperatura localizada (para ello la temperatura localizada debe representarse mediante un número digital). La combinación de una señal analógica con una señal detectada de acuerdo con la invención puede utilizarse en cualquier otra aplicación que sea apropiada. Además, se entiende que las fluctuaciones en la salida de fotones que resulten de los procesos de absorción periódica y de las relajaciones asociadas provocadas por fotones a través de fluctuaciones mecánicas puede medirse de acuerdo con la invención.

Los fotones emitidos por una muestra de fluoroforos que se excitan de acuerdo con la invención puede considerarse hasta cierto punto como coherentes. Esta luz de fluorescencia coherente puede mezclarse con luz coherente de una segunda fuente (por ejemplo la fuente de excitación, que puede ser un láser) para proporcionar una señal pulsante. La señal pulsante es útil porque tendrá una frecuencia menor que la frecuencia que corresponde al tiempo de ciclo de los fluoroforos que contiene la muestra. Si una porción de la señal de excitación se dirige a un detector junto con la señal de emisión, los pulsos se verán en el detector, con una frecuencia que corresponde a la diferencia entre las frecuencias los pulsos de excitación y el tiempo de ciclo característico.

En una configuración alternativa la primera y segunda fuente de luz coherente pueden ser un primer y segundo tipo de fluoroforos en una única muestra. Idealmente, la utilización de frecuencias pulsantes está preparada para detectar pequeños cambios en el tiempo de ciclo característico de un fluoroforo. Por ejempo, una muestra puede contener un solo tipo de fluoroforo con un único tiempo de ciclo característico de 100 ms. Si las propiedades de la mitad de esa muestra se modifican ligeramente de tal forma que para cambiar ligeramente el tiempo de ciclo característico de esa mitad de la muestra a 95 ns, entonces se detectará la frecuencia del pulso de 500 kHz indicativo del cambio del tiempo de ciclo.

La invención permite la medición de tiempos de ciclo característicos de especies quimioluminiscentes (es decir, especies que son excitadas químicamente, y emiten fotones durante la relajación a un estado inferior). En este caso, el tiempo de vida medido corresponde a la renovación de un catalizador (que puede ser un enzima), más que al decaimiento de un fluoroforo. Cuando se suministran cantidades suficientes de catalizador o de enzima, un especie quimioluminiscente puede emplear muy poco o prácticamente ningún tiempo en el estado fundamental, pero circulará continuamente a un estado superior de una transición de emisión y emitirá fotones separados por un período correspondiente al tiempo empleado por las especies a excitar desde un estado fundamental a un estado superior de transición de la emisión y se relajará de nuevo al estado fundamental. De forma similar, la invención también permite la medición de tiempos de vida de especies bioluminiscentes.

Los tiempos de vida de especies quimioluminiscentes y bioluminscentes no pueden medirse fácilmente utilizando las técnicas convencionales de medición del tiempo de vida de fluorescencia. Ello se debe a que las técnicas convencionales requieren que la excitación de las especies ocurra en un momento conocido, de tal manera que pueda medirse el tiempo hasta la emisión del fotón que sigue a esa excitación. No puede conseguirse fácilmente la excitación de muestras quimioluminiscentes y bioluminiscentes a un tiempo específico y predeterminado.

Un ejemplo de ensayo de quimioluminiscencia promovido por enzima es el ensayo para el trifosfato de adenosina (ATP), que indica la presencia de bacterias viables. Se añade el enzima luciferasa a la muestra a ensayar junto con el sustrato luciferina.

La luciferina se activa en presencia de ATP, y la luciferina activada produce una señal luminiscente en presencia de oxígeno:

Luciferina + ATP + O_{2} (en presencia de luciferasa + Mg^{++}) oxiluciferina + AMP + Ppi + CO_{2} + fotón (560 nm).

El método de acuerdo con la invención medirá la señal temporal dependiente del retraso promedio entre el contacto ATP/luciferina, el retraso promedio entre el contacto O_{2}/luciferina, el tiempo requerido para la renovación de la catálisis de la luciferasa (de hecho, el tiempo de vida del enzima), y el tiempo de vida del estado superior de la luciferina en presencia de oxígeno. La escala temporal del retraso de los dos contactos puede modificarse por la cantidad presente de cada especie. Esto se diferencia del tiempo de renovación y el tiempo de vida del estado superior que son tiempos de vida característicos y son pues independientes de las cantidades presentes de cada especie.

En la quimioluminiscencia, el tiempo de ciclo característico medido utilizando el método de detección contínuo tal como se ha descrito anteriormente puede incluír una reacción química debida a la interacción de un catalizador con uno de los productos, que cambia a una nueva forma y emite un fotón, apartándose entonces del catalizador y permitiéndole empezar una nueva interacción.

La invención puede utilizarse para hacer mediciones de fluorescencia de flujo detenido. Las mediciones de flujo detenido se utilizan para medir interacciones entre una sonda fluorescente y una muestra que tienen lugar en una escala de tiempo rápida. Una sonda fluorescente se excita de forma continua, evitando la necesidad de sincronizar la excitación con la mezcla de la sonda y la muestra. El método es ventajoso porque evita problemas de sincronización, y tiene la ventaja adicional de que el período de tiempo sobre el cual puede monitorizarse la interacción es ilimitado.

En referencia a la Figura 4, el tiempo de ciclo característico de un fluoroforo puede modificarse alterando el tiempo de vida del nivel superior de la transición de emisión 8 o el tiempo de vida desde el nivel inferior de la transición de emisión 9.

La Figura 6 es una ilustración esquemática de una especie activa más compleja que el fluoroforo sencillo ilustrado en la Figura 4. Las especies activas que se muestran en la Figura 6 incluyen el estado fundamental 14, y el grupo de niveles excitados 15. Los niveles excitados 15 poseen un estado excitado que se amplía a un grupo de niveles poco espaciados por un efecto como el ensanchamiento vibracional. Una vez la especie activa ha sido excitada a uno de los niveles excitados 15, puede relajarse a uno de los niveles menos energéticos de los niveles excitados 15.

La especie activa decaerá desde el grupo de niveles excitados 15 a un estado superior de transmisión de emisión 16. La especie activa decaerá entonces a través de emisión radiactiva a un nivel inferior de transmisión de emisión 17. Los niveles adicionales 18, con una energía ligeramente menor que los niveles inferiores de transmisión de emisión 17, reciben el nombre de niveles post emisión 18. Las especies activas pueden relajarse a uno o más de estos niveles post-emisión 18, antes de decaer al nivel fundamental 19.

El nivel fundamental 19 se muestra como distinto del estado fundamental 14 para representar, por ejemplo, un cambio conformacional de las especies activas. Las especies activas pueden ser tales que deban estar en una configuración conformacional específica, antes de que puedan ser excitadas a los niveles excitados 15. Después de la relajación desde los niveles post-emisión 18 al nivel fundamental 19, la especies activa no se halla en la configuración conformacional requerida, y por lo tanto no puede ser excitada. Siguiendo el cambio conformacional de la especie activa, representada por la flecha 20 que conecta el nivel fundamental 19 con el estado fundamental 14, las especies activas pueden entonces excitarse.

Los términos nivel fundamental 19 y nivel fundamental 14 se utilizan para distinguir entre distintas configuraciones conformacionales. Los cambios conformacionles de las especies activas pueden ocurrir si las especies activas están formadas por dos partes. Otros cambios pueden incluír cambios periódicos de la probabilidad de una excitación del estado fundamental 14 que ocurra, por ejemplo, debido al movimiento cíclico de un fluoroforo hacia y lejos de un motivo desactivador (el fluoroforo y el motivo desactivador conjuntamente forman las especie activas). Ello corresponde a una variación periódica de la sección eficaz de la excitación de las especies activas, y no se representa en la Figura 6.

Cada uno de los niveles 14-19 mostrados en la Figura 6 tienen un tiempo de vida determinado. Algunos de los tiempos de vida pueden ser mucho más largos que otros, dependiendo de la naturaleza de las especies activas. El tiempo de ciclo característico de las especies activas es el tiempo transcurrido entre la excitación de la especie activa desde el estado fundamental 14 hasta la siguiente excitación de la especie activa desde el mismo estado fundamental 14.

El tiempo de vida característico puede modificarse mediante la alteración del tiempo de vida de cualquiera de los niveles mencionados anteriormente. Ello difiere de los tiempos de vida característicos medidos de forma convencional de una especie activa, que incluyen sólo los tiempos de vida de los niveles excitados 15 y el nivel superior de la transición de emisión 16. La medición del tiempo de ciclo característico proporciona de esta manera una flexibilidad mucho mayor en relación a la modificación las características temporales de una especie activa. Las modificaciones resultarán en general en un incremento del tiempo de ciclo característico de la especie activa.

El tiempo de vida del nivel inferior de la transición de emisión 17, y los tiempos de vida de los niveles post-emisión 18 pueden modificarse de diversas formas. Estas formas incluyen cambios en el entorno local, cambios en la temperatura, el pH, la presión, la fuerza iónica de la solución que contiene la especie activa, o la aplicación de un campo magnético o eléctrico. Los tiempos de vida pueden modificarse también mediante cambios en la conformación de la especie activa. En el presente estado de la técnica se conocen muchos métodos para modificar los tiempos de vida de los niveles excitados 15 y el nivel superior de la transición de emisión 16. Estos métodos pueden utilizarse también para modificar el tiempo de vida del nivel inferior de la transición de emisión 17, y los tiempos de vida de los niveles post-emisión 18.

El tiempo de vida de los niveles de post-emisión 18 puede ser una combinación de muchos tiempos de vida, por ejemplo de disipación por radiación electromagnética, vibración, rotación o por tiempo de vida desactivado o por transición a través de otro elemento.

Durante la medición del tiempo de ciclo característico de una especie activa, puede haber un retraso entre la relajación de la especie activa al estado fundamental 14 y la consiguiente excitación desde el estado fundamental 14. Este retraso puede ser debido a que la intensidad de la excitación sea menor que la óptima. Sin embargo, el retraso se registrará como parte del tiempo de ciclo característico de esa especie activa. El efecto de este retraso puede eliminarse de la medición del tiempo de ciclo característico mediante calibración experimental. El retraso puede deberse por ejemplo a una variación periódica de la sección eficaz de la excitación del estado fundamental 14. De nuevo, este retraso queda incluído en la medición del tiempo de ciclo característico. Este retraso no podrá eliminarse mediante calibración experimental, ya que es una propiedad de la especie activa.

Tal como se ha mencionado anteriormente, para obtener una medición del tiempo de ciclo característico con sentido, el tiempo durante el cual una especie activa está en el estado fundamental 14 debe ser menor que la suma de los tiempos de vida de los otros niveles 15-18 (o 15-19 si la especie activa incluye un estado fundamental 19 tal como se ha descrito anteriormente). Si la sección eficaz de la excitación del estado fundamental 14 se ve afectada por la presencia de una sustancia de interés, entonces el tiempo de vida del estado fundamental 14 se verá modificado cuando la sustancia esté presente. Ello proporcionará un cambio del tiempo de ciclo característico, que puede ser detectado. Así pues, el tiempo de vida del estado fundamental puede usarse como ensayo de trazador. En general, cualquier efecto que modifique el tiempo de vida del estado fundamental 14 puede monitorizarse utilizando el método de acuerdo con la invención, a condición de que el tiempo de vida del estado fundamental 14 antes y después de la modificación sea menor o igual que la suma de los tiempos de vida de los niveles 15-18 (o 15-19).

La especie activa puede ser un solo fluoroforo. De forma alternativa, la especie activa puede comprender una combinación de varios elementos, por ejemplo un fluoroforo, un motivo desactivador, y un elemento adicional que los una. En otras palabras, un fluoroforo es la parte de la especie activa que genera un fotón, pero el conjunto de motivos (especies químicas, partículas, etc...) que en su conjunto produce el tiempo de ciclo característico de interés recibe el nombre de especie activa. El tiempo de ciclo característico de la "especie activa" puede diferir del que corresponde a un fluoroforo sencillo. El tiempo de ciclo característico puede estar influenciado por ejemplo por un motivo desactivador.

Un motivo desactivador puede prepararse para proporcionar desactivación de diversas formas distintas. Por ejemplo, en el modo llamado desactivación estática pueden combinarse un fluoroforo y un motivo desactivador para formar un complejo (molécula) inactivo, que no puede excitarse de forma que emita un fotón. En referencia a la Figura 6, el complejo inactivo permanece en el estado fundamental 19 y no puede ser excitado. Cuando el complejo se rompe, entonces el fluoroforo puede ser excitado. La periodicidad del proceso de complejación/descomplejación puede medirse de acuerdo con la invención, tal como se describe más adelante.

Un motivo desactivador puede colocarse cerca de un fluoroforo de tal manera que periódicamente se acerque y aleje del fluoroforo. La probabilidad de que el motivo desactivador y el fluoroforo se combinen para formar un complejo inactivo será característica de la configuración del fluoroforo y el motivo desactivador. Después de la formación del complejo inactivo, el complejo inactivo se separará de nuevo en sus constituyentes, es decir el fluoroforo y el motivo desactivador, después de un tiempo característico adicional.

La invención puede utilizarse para medir los periodos en los cuales el fluoroforo es activo, y los periodos durante los cuales el fluoroforo es inactivo debido al efecto del motivo desactivador. Ya que el fluoroforo se excita contínuamente, emitirá una serie de fotones de fluorescencia separados por el tiempo de ciclo característico del fluoroforo. El fluoroforo continuará emitiendo fotones hasta que se forme un complejo inactivo con el motivo desactivador. No se emitirán más fotones hasta que el complejo inactivo se separe de nuevo en sus constituyentes. Una correlación, u otra transformación apropiada de los fotones detectados rendirá componentes indicativos del período durante el cual los fotones se emitieron y los períodos durante los cuales no se emitieron fotones.

Cuando se considera un fluoroforo sencillo, es ostensible que no sería posible medir los períodos durante los cuales el fluoroforo era activo, o los períodos durante los cuales el fluoroforo era inactivo utilizando mediciones de tiempo de vida de fluorescencia convencionales. Ello sucede porque sucesivos pulsos de excitación utilizados en las mediciones convencionales están ampliamente espaciados en el tiempo. La medición convencional sólo es capaz de medir una única cantidad, que es el tiempo transcurrido entre la excitación desde el estado fundamental de un fluoroforo hasta la emisión de un fotón de fluorescencia.

Una configuración a través de la cual se podría conseguir una desactivación estática se ilustra esquemáticamente en la Figura 7a. Un fluoroforo 21a se une mediante una molécula espaciadora flexible 22a a un motivo de unión 23a (estos elementos tomados en conjunto pueden describirse como una sonda). El motivo de unión 23a se configura de manera que se una a un lugar de unión predeterminado 24a en una molécula predeterminada. La línea curva situada encima del fluoroforo 21a representa el movimiento periódico del fluoroforo 21a a través del doblamiento de la molécula espaciadora 22a.

Un motivo desactivador 25a se une al lugar de unión 24a. La probabilidad del fluoroforo 21a y el motivo desactivador 25a se combinen para formar un complejo inactivo incrementa cuando el fluoroforo 21a se acerca al motivo desactivador 25a. Cuando el complejo inactivo se forma (resultados no mostrados), éste existirá durante un tiempo característico, después del cual el fluoroforo 21a no se seguirá viendo influenciado por el motivo desactivador 25a y se verá de nuevo libre para moverse periódicamente debido a la flexibilidad de la molécula espaciadora 22a.

En una segunda forma conocida de desactivación, conocida como desactivación por colisión, un fluoroforo que ha sido excitado a un nivel superior de una transición de emisión (es decir, el nivel 16 en la Figura 6) colisiona con un motivo desactivador. Después de la colisión con el motivo desactivador se transfiere energía desde el fluoroforo al motivo desactivador, y así el fluoroforo se relaja al estado fundamental (nivel 14 en la Figura 6) sin la emisión de un fotón. Se evita que el fluoroforo se excite a un nivel superior de una transición de emisión (nivel 16 en la Figura 6) cuando el fluoroforo es adyacente al motivo desactivador, ya que el fluoroforo se relajará nuevamente de forma inmediata al estado fundamental con el motivo desactivador. El motivo desactivador puede ser una segunda forma de fluoroforo que no es activo (energía que se transfiere mediante una interacción dipolo-dipolo).

Es importante distinguir entre desactivación por colisión (también conocida como desactivación dinámica), en la cual un fluoroforo se hace volver a su estado fundamental sin emisión de un fotón, y la desactivación estática, en la cual se forma un complejo entre un fluoroforo y un motivo desactivador que evita que el fluoroforo retorne a su estado fundamental.

Utilizando la invención puede medirse la razón a la cual ocurre la desactivación por colisión. La desactivación por colisión puede disponerse para que ocurra con una configuración del fluoroforo 21a y el motivo desactivador 25a que se muestran en la Figura 7a. La configuración es la misma que se ha descrito anteriormente en relación a la desactivación estática, siendo la principal diferencia que el motivo desactivador 25a se escoge de tal manera que no formará una molécula con el fluoroforo 21a. El fluoroforo 21a se mueve periódicamente mientras la molécula espaciadora 22a se dobla, y de esta manera el fluoroforo 21a se acerca y aleja del motivo desactivador 25a. Cuando el fluoroforo 21a está suficientemente cerca al motivo desactivador 25a, se transfiere energía del fluoroforo 21a al motivo desactivador 25a, y el fluoroforo se relaja al estado fundamental sin emitir un fotón.

Mediante la invención puede medirse la razón de ocurrencia de colisiones desactivantes. Por ejemplo, si el tiempo de ciclo característico del fluoroforo 21a es corto comparado con el periodo de oscilación del fluoroforo 21a en la molécula espaciadora 22a, el fluoroforo 21a puede emitir por ejemplo nueve fotones de fluorescencia antes de que ocurra la colisión. Así pues, el fluoroforo 21a emitirá una serie de fotones regularmente espaciados, faltando cada décimo fotón de la serie. Los fotones se detectan de acuerdo con la invención, y se transforman utilizando correlación u otra transformación apropiada. Los datos transformados incluirán una señal representativa de la razón de ocurrencia de desactivación por colisión.

La razón de ocurrencia de desactivación por colisión puede medirse utilizando la invención, incluso cuando la eficiencia de la detección de fotones no es suficiente para detectar cada uno de los fotones emitidos por el fluoroforo. Ello es debido a que los fotones no detectados debido a limitaciones experimentales estarán distribuidos aleatoriamente, mientras que las desactivaciones por colisión proporcionarán intervalos regularmente espaciados en la serie de fotones, intervalos que proporcionarán una señal característica cuando se transformen los datos de detección.

La técnica anterior para medir tiempos de vida de fluorescencia, no es capaz de medir la razón de ocurrencia de desactivación por colisión cuando se considera un sólo fluoroforo. No proporciona ningún mecanismo para medir realmente el periodo durante el cual el fluoroforo es capaz de emitir fotones, o el período durante el cual el fluoroforo está desactivado.

Existe otra forma adicional de desactivación relacionada con la desactivación por colisión. En este caso, el fluoroforo y el motivo desactivador no chocan realmente (es decir, se aproximan lo suficiente para que tenga lugar una transferencia de energía), sino que simplemente se aproximan lo suficiente para que el motivo desactivador tenga un efecto en las energías y los tiempos de vida de los niveles del fluoroforo (14-18 en la Figura 6). Las técnicas anteriores para medir tiempos de vida de fluorescencia son capaces de medir el efecto del motivo desactivador en los tiempos de vida de los niveles excitados 15 y el nivel superior de la transición de emisión 16. La invención es ventajosa porque mide el efecto del motivo desactivador en los tiempos de vida de todos los niveles del fluoroforo (14-18).

Cuando se considera la Figura 7a, es evidente que si la molécula espaciadora 22a fuera rígida, entonces el efecto del motivo desactivador 25a sería constante, y no sería dinámico (es decir, no cambiaría periódicamente). En esta situación el tiempo de vida característico del fluoroforo 21a medido utilizando técnicas anteriores aparecería como exponencial. Sin embargo, si la molécula espaciadora fuera flexible ( o más larga) de tal manera que la interacción con el motivo desactivador 25a fuera periódica, entonces el tiempo de vida característico medido mediante técnicas anteriores ya no sería una exponencial simple. A medida que la interacción entre el fluoroforo 21a y el motivo 25a se hace más compleja, las técnicas anteriores no son capaces de hacer mediciones con sentido del tiempo de vida característico. Por el contrario, la invención proporciona un análisis microscópico, que permite ver las relajaciones individuales de los fluoroforos.

Una forma de desactivación apreciada ocurre cuando el medio en el cual se halla el fluoroforo es suficientemente turbio u ópticamente denso como para reducir la señal fluorescente de los fluoroforos. Si se aplica una modulación a la parte real o imaginaria del índice de refracción del medio entonces la invención puede utilizarse para detectar esta modulación.

El fluoroforo puede interactuar con un motivo modificador que no sea un motivo desactivador. Por ejemplo, se puede transferir energía desde un nivel más bajo de transición de emisión (nivel 17 en la Figura 6) durante la colisión con una de las partes. Ello tendrá el efecto de retornar el fluoroforo desde el estado fundamental (nivel 14 en la Figura 6) más rápidamente que como habría sido el caso en ausencia del motivo modificador, acortando así el tiempo de ciclo característico del fluoroforo.

El tiempo de ciclo característico del fluoroforo se verá afectado por el entorno dieléctrico en el cual se encuentra. Por ejemplo, en referencia a las Figuras 7a-c, la extensión en la cual el fluoroforo 21a-c se prolonga fuera del lugar de unió afectará su tiempo de ciclo característico, como resultado de las fuerzas dieléctricas dentro y fuera del lugar de unión. La molécula espaciadora 22a-c puede contraerse y alargarse (movimiento vibracional típico) y ello puede causar una variación periódica del tiempo de ciclo característico del fluoroforo 21a-c.

La mayoría de los fluoroforos se autodesactivarán cuando se presenten en concentraciones altas, como por ejemplo ocurre con la fluoresceína. Se puede formular una estructura que aproxime un número suficiente de tales fluoroforos para que ocurra dicha autodesactivación. La autodesactivación puede ocurrir entre fluoroforos próximos, por ejemplo fluoresceína y calceína, o entre fluoroforos distintos. La utilización más común de la técnica es en sondas Molecular Beacon, por ejemplo tal como se describe en S.Tyagi y F.R. Kramer, Nature Biotechnology, 1996, 14, 303, D.P. Brau y F.R. Kramer, Nature Biotechnology, 1998, 16, 49 y L.G. Kostrikis et al, Science, 279, 1228. Normalmente la sonda Molecular Beacon contiene un fluoroforo cerca de un desactivador, de tal manera que cuando la sonda interacciona con la molécula diana, el fluoroforo y el desactivador se separan y como resultado de ello incrementa la emisión de fluorescencia.

La forma de la estructura que se dispone para juntar un número suficiente de tales fluoroforos de tal forma que ocurra la autodesactivación puede configurarse para permitir la modulación de la autodesactivación, que puede medirse utilizando la invención.

La utilización de motivos desactivadores es suficientemente conocida, y se conocen muchos motivos desactivadores en esta técnica. Algunos gases funcionan como desactivadores: en particular el oxígeno molecular (de numerosos fluoroforos, por ejemplo perileno, bromuro de etidio), pero también xenón, óxido nitroso y nitrometano. Estos gases desactivadores normalmente no se unirían a los ensamblajes fluoroforo-desactivador, pero puede utilizarse la unión del gas o de estructuras intercalantes (por ejemplo en el caso de perfluorocarbonos de oxígeno) para modular el nivel de oxígeno en la vecindad de muchos fluoroforos. En el caso de gases moleculares libres, puede medirse la frecuencia de colisión entre el fluoroforo y las moléculas de gas utilizando la invención, mientras sólo puede medirse un desplazamiento promedio del tiempo de vida convencional a medida que la dispersión de la población decae.

Las aminas aromáticas y alifáticas son desactivadores eficaces de la mayoría de fluoroforos no sustituídos. Por ejemplo, la fluorescencia del antraceno se desactiva en proximidad de un motivo dietilanilina, siendo el mecanismo desactivador una transferencia de carga durante la formación de un complejo, en el cual el estado excitado del fluoroforo acepta un electrón de la amina. En disolventes no polares, el complejo formado puede ser fluorescente. Cuando el disolvente es polar la emisión de fotones de fluorescencia desde el complejo es mucho menos probable.

Otros motivos desactivadores que facilitarían la desactivación por colisión incluyen peróxido de hidrógeno y motivos peróxido (que a menudo resultan también de efectos de decoloración), acrilamidas, triptófano, N-acetil-L-triptofanamida, bromatos, ioduros, nitróxidos, olefinas e hidrocarburos saturados impedidos estéricamente. Por ejemplo, el alfa-cianonaftaleno es desactivado por diversas olefinas, normalmente formando un excíplex no fluorescente. Los halógenos (cloroformo,tricloroetanol, bromobenceno, cloruro metil-mercúrico) actúan como desactivadores por colisión, y sus modificaciones con más de un átomo de cloro actúan normalmente como desactivadores. La desactivación provocada por modificaciones importantes halogenadas puede resultar en un cruzamiento intersistema a un estado triplete excitado, promovido por acoplamiento spin-órbita de un fluoroforo (singulete) excitado y halógeno. Como la emisión desde un estado triplete es lenta, normalmente es desactivada por muchos otros procesos.

El indol, carbazol y sus derivados son sensibles a la desactivación por hidrocarburos clorados, y por eliminadores de electrones (iones de histidina, cisteína, fumarato, cobre, plomo, cadmio y magnesio), que incluyen la donación de un electrón desde el fluoroforo al desactivador. El indol, triptofano y sus derivados son desactivados por iones de succimida, dicloroacetamida, hidrocloruro de piridinio, hidrocloruro de imidazolio, metionina, europio, plata y cesio.

Las sales de purinas, pirimidinas, N-etil nitrociamida, N-alquil piridinio y picolinio son desactivadores. Por ejemplo, la flavina y la nictonamida reducida son desactivadas por motivos de adenina, y el 10-metilacridinio es desactivado por guanosina-5-

\hbox{monofosfato.}

En referencia a la Figura 7, se muestran distintas configuraciones mediante las cuales puede modificarse la razón a la cual el fluoroforo y el motivo desactivador se acercan el uno al otro. En cada una de las Figuras 7a-g se representa el fluoroforo mediante un disco 21a-g y el motivo desactivador se representa mediante una elipse 25a-g, 26g. Las moléculas flexibles que actúan como espaciadores 22b-g, los motivos enlazantes 23b-g y los lugares de unión 24b-g se representan de la misma manera que en la Figura 7a.

Las Figuras 7a-c representan el alargamiento de la molécula flexible que actúa como espaciador 22a-c. A medida la molécula espaciadora que se alarga, se incrementará el período entre las interacciones sucesivas del fluoroforo 21a-c y el motivo desactivador 25a-c. La molécula espaciadora puede incluír también un motivo modificador que puede afectar además al entorno dieléctrico del lugar de unión y en consecuencia el tiempo de ciclo característico del fluoroforo. Las Figuras 7(d)-(e) muestran un posible efecto de un motivo modificador 26e sobre la configuración del fluoroforo 21e en el lugar de unión 24e. En este caso el motivo modificador fuerza al fluoroforo 21e a acercarse al motivo desactivador 25e, reduciendo así el período entre interacciones sucesivas del fluoroforo 21e y el motivo desactivador
25c.

Las Figuras 7(f)-(g) ilustran el caso en el cual un fluoroforo 21f,g está unido directamente al lugar de unión 24f,g y en el cual una molécula sonda contiene un motivo desactivador 25f,g unido mediante una molécula espaciadora flexible 22f,g y un motivo enlazante 23f,g al lugar de unión 24f,g. El período entre interacciones sucesivas del fluoroforo 21f,g y el motivo desactivador 25f,g se ve influenciado, como antes, por la longitud de la molécula espaciadora flexible 22f,g. La molécula espaciadora flexible 22g puede poseer un motivo modificador 26g unido.

Las estructuras mostradas esquemáticamente en la Figura 7 pueden crearse utilizando los fluoroforos y los motivos desactivadores mencionados anteriormente. Es bien conocido que muchos fluoroforos se facilitan provistos con grupos modificables químicamente de tal manera que su unión rinde de forma directa armazones estructurales (una lista completa de fluoroforos asequibles comercialmente se describe en el catálogo publicado por Molecular Probes Inc., 4849 Pitchford Avenue, OR, 97402-9165 USA). La modelización molecular y la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) son técnicas bien conocidas que se emplean para diseñar tales estructuras.

El sistema que se ilustra en la Figura 7 puede representar la unión de un fármaco a una proteína o péptido que contenga aminoácidos fluorescentes en el lugar de unión. Un ejemplo de este tipo lo proporciona la secuencia peptídica VCDWWGWGIC, conocido como mimetizador de la unión de fármacos por la proteína promotora de eflujo de fármacos glicoproteína P, que puede crearse como una secuencia lineal o ciclada, cuya fluorescencia natural de triptófano es desactivada por un amplio espectro de fármacos (Doxorubicin, Vinblastine, Digoxin, Novobiocin, Diazepar, Melphalan).

La Figura 7h es un gráfico que ilustra la unión a una secuencia peptídica VCDWWGWGIC 10-mero (49.1 \muM, 2.9 ml) en 0.1 M Tris pH 7.5, excitado a 280 nm sin doxorubicina (el grado de desactivación se normaliza a 999.99). Se muestra la valoración de la doxorubicina a razón estequiométrica del péptido : doxorubcina en secuencia a partir de la segunda traza superior hasta la traza inferior como sigue: 1: 0,1 (917.99); 1 : 0.2 (835.53); 1 : 0.3 (769.34); 1 : 0.4 (704.25); 1 : 0.5 (633.91); 1 : 0.6 (594.31); 1 : 0.7 (547.73); 1 : 0.8 (498.54); 1 : 0.9 (457.96); 1 : 1 (415.96); 1 : 1.1 (390.24). El número entre paréntesis, después de cada valoración, es la intensidad relativa del pico a 359.25 nm, que indica el grado de desactivación.

La unión de otros compuestos xenobióticos (típicamente hidrocarburos planos aromáticos) al lugar de unión de receptores hidrocarbonados aromáticos puede medirse de forma similar. De forma alternativa, puede medirse la unión de un compuesto fluorescente (por ejemplo doxorubicina) mediante su desactivación al unirse a tal lugar de unión mediante motivos desactivadores presentes en tales lugares. De forma similar, cuando el motivo de unión no es ni un desactivador ni un fluoroforo, el motivo de unión puede estar unido al fluoroforo o al desactivador, de tal manera que el agente de unión modificado compite con otro agente de unión produciendo así una señal medible de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo la última configuración puede utilizarse para medir la unión de un ligando a un anticuerpo. Las personas con experiencia en la técnica entenderán que, de acuerdo con esta invención, puede realizarse la medición de la unión a un rango de ligandos o sustratos a proteínas y enzimas de forma similar.

Utilizando estructuras peptídicas pueden obtenerse diferentes distancias de proximidad de un fluoroforo y un motivo desactivador. Ello puede ser tan simple como formar análogos de cisteína de los fluoroforos y acercar los pares de fluoroforos (o fluoroforo-motivo desactivador) hasta la formación de un puente disulfuro de cisteína. También pueden utilizarse oligopéptidos de ácido poliglutámico, uniendo los motivos que interactúan a las cadenas laterales a las distancias deseadas. Unidades repetidas de residuos N5-(2-hidroxietil) -L-glutamina con n entre 3 y 9 pueden utilizarse también para separar unidades que interactúan en una cadena polipeptídica flexible en disolventes fluídos, proporcionando distancias variables entre los extremos a medida que la cadena se relaja en el fluído. De forma alternativa, se pueden formar estructuras helicoidales rígidas utilizando residuos de (L-prolina)n, separando las estructuras que interactúan por 1.2 nm (n=1) hasta 4.6 (nm) (n=2). Los fluoroforos o motivos desactivadores pueden estar unidos a tales esqueletos a través de cadenas espaciadoras de diversas longitudes, típicamente hidrocarburos de longitudes desde C4 hasta C16. Los hidrocarburos saturados forman cadenas flexibles, mientras que puede obtenerse una mayor rigidez y/o orientación mediante el uso de cadenas insaturadas cis y trans. Pueden utilizarse las cadenas laterales en el esqueleto hidrocarbonado para crear grados de unión relativos o impedimento estérico entre las cadenas (por ejemplo, aromático, carboxil, amino, nitro, cloro).

Los fluoroforos y motivos desactivadores mencionados anteriormente, junto con los entramados estructurales mencionados anteriormente, pueden utilizarse también para construir las configuraciones que se ilustran en las Figuras 8 y 9.

La Figura 8 ilustra un segundo método mediante el cual puede modificarse el período entre interacciones sucesivas entre un fluoroforo y un motivo desactivador. En referencia a la Figura 8a, un fluoroforo 30a está unido a través de una molécula espaciadora semiflexible 31a. Un motivo desactivador 32a está unido en el extremo opuesto de la molécula espaciadora 31a. El fluoroforo 30a y el motivo desactivador 32a se acercan y alejan periódicamente el uno del otro a medida que el brazo espaciador 31a se flexiona. La desactivación, ya sea desactivación estática o desactivación por colisión, ocurrirá cuando el fluoroforo 30a y el motivo desactivador 32a estén lo suficientemente cerca.

En las Figuras 8(a)-(c) se muestra un fluoroforo 30a-c adyacente a tres motivos desactivadores distintos, respectivamente 32a-c. En cada caso, el fluoroforo 30a-c y el motivo desactivador 32a-c tienen brazos espaciadores de la misma longitud. Sin embargo, los mismos motivos desactivadores 32 tienen propiedades distintas. Por ejemplo, en el caso de desactivación estática, el período característico durante el cual el fluoroforo y el motivo desactivador forman un complejo puede alterarse utilizando un motivo desactivador distinto.

En las Figuras 8(d)-(f) el fluoroforo 30d-f está separado del motivo desactivador 32d-f por moléculas espaciadoras 31d-f de distintas longitudes. A medida que la longitud de las moléculas espaciadoras 31d-f se reduce, el tiempo entre interacciones sucesivas entre el fluoroforo 30d-f y el motivo desactivador 32d-f se reduce de manera correspondiente.

En las Figuras 8(g)-(i) se hace variar la flexibilidad de esa parte de la molécula espaciadora 31g-i junto con el motivo desactivador 32g-i, afectando la acción de desactivación del motivo desactivador 32g-i. A medida que se incrementa la flexibilidad de las moléculas espaciadoras 31d-f, el tiempo entre interacciones sucesivas entre el fluoroforo 30d-f y el motivo desactivador 32d-f aumenta de forma correspondiente. Cuando la flexibilidad de la molécula espaciadora es baja, por ejemplo tal como se muestra en la Figura 8g, la molécula espaciadora 31g puede configurarse para asegurar que el fluoroforo 30d-f y el motivo desactivador 32d-f se aproximan lo suficiente el uno al otro para que interaccionen del modo requerido. También puede alterarse la conformación de la molécula espaciadora (es decir, su configuración en reposo).

El las Figuras 8(j)-(l), se hacer variar tanto la longitud como la flexibilidad de los brazos espaciadores 31j-l. En la Figura 8j el fluoroforo 30j y el motivo desactivador 32j se mantienen separados por una distancia intermedia, y tienen una flexibilidad intermedia, tal como se ilustra mediante la longitud de las curvas situadas encima del fluoroforo 30j y el motivo desactivador 32j. Por el contrario, en la Figura 8k el fluroforo 30k y el motivo desactivador 32k se mantienen juntos con una mayor rigidez. Esta modificación de la separación y el movimiento del fluoroforo 30k y el motivo desactivador 32k reducirá el período entre interacciones sucesivas entre el fluoroforo 30k y el motivo desactivador 32k. La Figura 81 muestra un fluoroforo 30l y un motivo desactivador 32l que se mantienen a una separación mayor y con una mayor flexibilidad que la que se muestra en la Figura 8j. Ello incrementará el período entre interacciones sucesivas del fluoroforo 30l y el motivo desactivador 32l.

En las Figuras 8(m)-(o) se proporcionan motivos adicionales 33m,o,34m-o sobre las moléculas espaciadoras 31m-o. El efecto de los motivos adicionales depende de sus propiedades, que son bien conocidas en la técnica, incluyendo por ejemplo el impedimento estérico.

Después de la unión a una molécula diana, la interacción entre un fluoroforo y un motivo desactivador pueden verse influenciada por la interacción entre el lugar de unión y el fluoroforo y el motivo desactivador, conjuntamente o por separado.

En la Figura 9 se muestra como la interacción entre un fluoroforo, que está unido por una molécula espaciadora a un motivo de unión, se ve alterada al unirse a un lugar de unión molecular. Como ejemplo típico de ello, pueden pre-ensamblarse un triptófano y un desactivador xenobiótico (por ejemplo un fármaco) con un espaciador apropiado, de tal manera que cuando el fármaco se une a un lugar de unión xenobiótico (por ejemplo un fármaco) la restricción del ensamblaje de la sonda o la especie activa durante la unión se altera provocando un período de desactivación distinto comparado con el ensamblaje no unido. De esta manera puede medirse la proporción de ensamblaje unido y no unido.

En referencia primero a la Figura 9a, en el caso anterior y en general, un fluoroforo 40a está unido a través de una primera molécula espaciadora flexible 41a a un motivo de unión 42a. Un motivo desactivador 43a está unido a través de una segunda molécula espaciadora flexible 44a al motivo de unión 42a. El fluoroforo 40a y el motivo desactivador 43 a se mueven de forma periódica, debido a la flexibilidad de las moléculas espaciadoras 41a, 44a.

El ensamblaje entero que se muestra en la Figura 9a puede considerarse como una sonda. La Figura 9b muestra la sonda 40a-44a colocada en el lugar de unión en una molécula diana 45b. La molécula diana interacciona con el motivo desactivador 43a, modificando sus propiedades. Por ejemplo, en el caso de desactivación estática, puede modificarse el período sobre el cual el fluoroforo 40a permanece unido al motivo desactivador 43a mediante el lugar de unión 45b.

Las Figuras 9c-d representan una configuración en la cual un fluoroforo 40c unido a una primera molécula espaciadora 41d interacciona con un lugar de unión 45d, modificando así las propiedades del fluoroforo. La modificación puede ser simplemente un cambio de la energía o de los tiempos de vida de algunos de los niveles de energía del fluoroforo (niveles 14-18 en la Figura 6).

Las Figuras 9c-f ilustran como el rango del movimiento de un motivo desactivador 43c,e unido a una segunda molécula espaciadora 44c,e puede verse afectado por el lugar de unión 45d,f. En los ejemplos que se ilustran el período entre interacciones sucesivas entre el fluoroforo 40c,e y el motivo desactivador 43c,e se ve reducido.

La Figura 9g muestra un fluoroforo 40g unido por una primera molécula espaciadora 41g a un primer motivo de unión 46g, y un motivo desactivador 43g unido por una segunda molécula espaciadora 44g a un segundo motivo de unión 47g. Se suministra una molécula diana 48g con un primer y segundo lugar de unión espaciados de tal manera que cuando los motivos de unión 46g,47g están situados en los lugares de unión, el fluoroforo 40g y el motivo desactivador 43g se encuentran a una separación predeterminada. El cambio en el espaciado de los lugares de unión alterará el período entre interacciones sucesivas entre el fluoroforo 40g y el motivo desactivador 43g.

En la Figura 9h, una primera sonda contiene un fluoroforo 40h unido a través de una primera molécula espaciadora flexible 41h a un motivo de unión 42h, y a un motivo desactivador 43h unido a a través de una segunda molécula espaciadora flexible 44h a un motivo de unión 42h. El motivo de unión 42h de la primera sonda está constituido para que se coloque primero en un lugar de unión en una molécula diana 49h. Se proporcionan una segunda y tercera sondas con configuraciones similares a la primera sonda pero con diferentes motivos de unión 50h, 51h dispuestos para situarse en el segundo y tercer lugares de unión el la molécula diana 49h. El primer motivo desactivador 43h interactuará de forma periódica con un fluoroforo 52h que contiene parte de la segunda sonda. Un segundo motivo desactivador 53h que contiene parte de la segunda sonda interactuará con un tercer fluoroforo que contiene parte de la tercera sonda. De esta manera las tres sondas tal como se muestran en la Figura 9h proporcionarán una señal de fluorescencia que es dependiente de cada una de las tres sondas localizadas en sus respectivos lugares de unión. Esta aproximación es útil en secuenciación, cuando las señales correspondientes a los componentes ensamblados pueden organizarse para proporcionar una señal que indique la localización y las clases de vecinos.

Los ensamblajes mostrados en las Figuras 8g,h pueden proporcionar medios para identificar que residuos han sido ensamblados uno cerca de otro durante los procesos de síntesis combinatoria. En técnicas anteriores éstos tienen que ser separados y analizados, mientras que utilizando esta invención puede identificarse la proximidad de residuos marcados con diferentes fluoroforos y desactivadores.

La Transferencia de Energía de Resonancia por Fluorescencia (FRET) hace referencia a una configuración de dos fluoroforos de tal manera que la energía del primero de los fluoroforos (el donador) es absorbida por el segundo de los fluoroforos (el aceptor). El mecanismo a través del cual tiene lugar la transferencia de energía es principalmente el resultado de interacciones dipolo-dipolo, la llamada transferencia de energía sin radiación, que no comporta la aparición de un fotón, aunque también puede medirse la transferencia basada en radiación de acuerdo con la invención. Para que la transferencia sea resonante, la energía del aceptor debería ser ligeramente menor que la energía del donador. Es decir, la razón de la transferencia de energía depende de la extensión del solapamiento del espectro de emisión del donador y del espectro de absorción del aceptor. En la terminología utilizada en esta descripción las especies activas son los dos fluoroforos cuando están lo suficientemente cerca para que ocurra el FRET. En otras palabras, los niveles de energía mostrados en la Figura 6 describen los dos fluoroforos sólo cuando están lo suficientemente cerca para que ocurra el FRET.

Los dos fluoroforos que contienen una especie activa de FRET pueden configurarse para que se acerquen periódicamente, uniéndolos a una molécula espaciadora configurada de forma apropiada. Se muestra un ejemplo de tal configuración en la Figura 10a, donde un primer fluoroforo 60a y un segundo fluoroforo 61a están separados por una molécula espaciadora 62a, y se configuran para que oscilen de tal manera que se acerquen periódicamente lo suficiente para que ocurra el FRET.

La invención permite la medición del período durante el cual los fluoroforos están lo suficientemente cerca para que ocurra el FRET (las especies activas pueden emitir numerosos fotones durante este periodo si el tiempo de ciclo de la especie activa es lo suficientemente rápida). Cuando se separan los fluoroforos, la especie activa no emitirá fotones (la especie activa de FRET no existe en ese momento). Utilizando la invención, el tiempo durante el cual la especia activa emite fotones y el tiempo durante el cual la especie activa no emite fotones se percibirán como dos componentes separados de datos.

A diferencia de la invención, los métodos anteriores de medición de fluorescencia no son capaces de monitorizar el ciclo descrito anteriormente. El FRET solo se observará si los fluoroforos están lo suficientemente cercanos cuando ocurra la excitación. Las técnicas anteriores no son capaces de determinar el período entre formaciones sucesivas de especies activas de FRET por dos fluoroforos.

Cuando los fluoroforos están espaciados, cada fluoroforo puede absorber y emitir fotones como una especie activa de propio derecho. Cuando se hacen las mediciones utilizando la invención, estos fotones pueden ser reconocidos a partir de sus separación (es decir, el tiempo de ciclo característico de los fluoroforos).

La Figura 10 ilustra diversas configuraciones a través de las cuales puede modificarse el tiempo transcurrido entre las formaciones sucesivas de especies activas FRET por dos fluoroforos. En las Figuras 10a-c se modifica la longitud de la molécula espaciadora 62a-c que conecta los dos fluoroforos 60a-c, 61a-c. Ello cambiará el período entre formaciones sucesivas de especies activas, de forma que una molécula espaciadora más larga 62a-c proporciona un período más largo.

También puede modificarse la flexibilidad de la molécula espaciadora, como muestran las Figuras 10d-f. Nuevamente, ello cambiará el período entre formaciones sucesivas de las especies activas, de forma que una molécula espaciadora más flexible 62d-f proporciona un período más largo.

En las Figuras 10g-i se añaden motivos modificadores 63g-h a la molécula espaciadora 62g-i. De nuevo, ello afectará al período entre formaciones sucesivas de las especies activas, se forma que el efecto vendrá determinado por las propiedades del motivo modificante 63g-h.

Se pueden suministrar dos fluoroforos que posean motivos de unión, de forma que cada uno de ellos una a un motivo configurado para unirse a un lugar de unión predeterminado en una molécula predeterminada. En este caso, los dos lugares de unión están situados a una separación predeterminada que se escoge de tal manera que los dos fluoroforos estarán separados por una distancia que proporcione una especie activa FRET con las propiedades deseadas. Por ejemplo, en las Figuras 10j-i el primer y segundo fluoroforos 60j,61j están unidos a través de una primera y segunda molécula espaciadora 64j,65j a un primer y segundo motivo de unión 66j,67j. Los motivos de unión están configurados para colocarse en los lugares de unión de una molécula diana 68j con una separación que proporciona una especie activa FRET que posee las propiedades deseadas.

En las Figuras 10k,l se incrementa la separación de los lugares de unión, cosa que resulta en un correspondiente incremento del período entre las formaciones sucesivas de las especies activas FRET. Las Figuras 10m-o ilustran cambios en la flexibilidad de las moléculas espaciadoras 64m-o, 65m-o a las cuales están unidos los fluoroforos. Las Figuras 10p-r ilustran el efecto de añadir motivos modificantes 66p-r a las moléculas espaciadoras.

Volviendo de nuevo a la Figura 11a, el primer y segundo fluoroforos 70a, 71a constituyen una especie activa FRET. Cada uno de los fluoroforos está unido a través de una molécula espaciadora 72a, 73a a un motivo de unión 74a, 75a. Cada motivo de unión 74a, 75a también está provisto de un motivo desactivador 76a, 77a unido mediante una molécula espaciadora 78a, 79a al motivo de unión 74a, 75a. Los motivos de unión están configurados para que se unan a los lugares de unión en una molécula diana 80 que están espaciados de tal manera que los fluoroforos 71a, 72a formarán periódicamente una especie activa FRET que posea las propiedades deseadas. Los motivos desactivadores 76a, 77a se escogen de tal manera que modifiquen la interacción de forma que resulte la formación de las especies activas FRET.

Un ejemplo típico que utiliza FRET sería el acoplamiento o el marcaje con ácido. 5-[2-(yodoacetil)aminoetil]-5-aminonaftalen-1-sulfónico (1,5 IAEDANS) y yodoacetamidafluoresceína de moléculas proteicas para la investigación de cambios en la distancia de separación de cargas en la conformación de la proteína, o regioespecíficamente a una cadena peptídica de diferentes longitudes (por ejemplo utilizando la estructura de prolina mostrada anteriormente para obtener distancias de separación definidas) para obtener separaciones distintas. Otro ejemplo, que se ilustra en la Figura 10j-r, consiste en unir los fluorofororos donador y aceptor mediante sondas de ADN a posiciones adyacentes a regiones complementarias en ADN de cadena sencilla, de acuerdo con procedimientos bien conocidos, que a menudo se conocen como sonda de ADN partida (split DNA probe). De acuerdo con la invención puede medirse entonces el grado de unión adyacente y complementariedad de la sonda partida y la diana de ADN.

La Figura 12b corresponde a la Figura 11a, excepto que sólo uno de los fluoroforos 70b, 71b posee un motivo desactivador 77b.

La Figura 11c corresponde a la Figura 11b, excepto que la molécula diana 80c está configurada para restringir el movimiento de los fluoroforos 70c, 71c y el motivo desactivador 77c.

En la Figura 12 se forma una especia activa FRET mediante un primer y segundo fluoroforos 90a, 91a. Cada uno de los fluoroforos está unido mediante una molécula espaciadora 92a, 93a a un motivo de unión 94a, 95a. Los motivos de unión están configurados para unirse a los lugares de unión el una molécula diana 96a que están espaciados de tal manera que los fluoroforos 91a, 92a formarán periódicamente especies activas FRET con las propiedades deseadas. La forma de la molécula diana 96a es tal que el primer y segundo fluoroforos 90a, 91a interaccionan con la molécula diana 96a, modificando las propiedades de la especie activa FRET. En la Figura 12a, el período entre formaciones sucesivas de la especie activa FRET cambiará mediante la interacción con la molécula diana 96a.

La Figura 12b corresponde a la Figura 12a excepto en que un motivo modificante 97b está unido a una de las moléculas espaciadoras 92b. El motivo modificante 97b interacciona con la molécula diana 96b, y reduce el período de movimiento de la molécula espaciadora 92b. El período entre formaciones sucesivas de las especies activas FRET se ve reducido de forma correspondiente.

La Figura 12c corresponde a la Figura 12b excepto que un motivo modificador 97c, 98c está unido a cada una de las moléculas espaciadoras 92c, 93c. Los motivos modificadores 97c, 98c interaccionan con la molécula diana 96c, y reducen el período de movimiento de las moléculas espaciadoras 92c, 93c. El período entre formaciones sucesivas de las especies activas FRET se ve reducido de forma correspondiente.

Algunos ejemplos típicos de pares donador-aceptor son los que siguen: fluoresceína-tetrametilrodamina, IAEDANS-fluoresceína, y EDANDS-DABCYL. Estos y otros pares donador-aceptor se pueden adquirir a través de Molecular Probes Inc. 4849 Pitchford Avenue, OR, 97402-9165 USA, y se describen en el catálogo publicado por esta compañía. Las estructuras anteriores pueden realizarse utilizando pares donador-aceptor conocidos, junto con los armazones estructurales mencionados anteriormente.

La formación de estructuras excímer o excíplex entre uno o más motivos para dar un fluoroforo es conocida en el campo de la técnica, por ejemplo dímeros de pireno y pireno-DMA. Las moléculas que se combinan para formar una estructura excímer/excíplex pueden ser fluoroforos por propio derecho. Cuando este es el caso, la formación de un excímer o un excíplex resulta en un corrimiento al rojo (corrimiento de Stokes) de la luz fluorescente emitida (como se observa en la transferencia de energía resonante por fluorescencia (FRET)). Los excímers y excíplexes muestran normalmente una mayor especificidad que las moléculas FRET cuando se utilizan como sondas biológicas. Como con otros compuestos fluorescentes, generalmente se conocen los tiempos de vida característicos de los excímers y excíplexs, y pueden influenciarse de la misma manera, por ejemplo alterando el entorno dieléctrico.

El período entre interacciones sucesivas entre excímer y excíplex puede modificarse mediante cualquiera de los siguientes métodos: alteración de la longitud de una o las dos moléculas espaciadoras a las cuales están unidos el eximer o el excíplex; alteración de la flexibilidad de una o ambas moléculas espaciadoras a las cuales están unidas el excímer o el excíplex están unidas; modificación de la sonda o una de sus partes con motivos hidrofílicos, polares, cargados o hidrofóbicos; y modificación de uno de los motivos excímer por excíplex.

La modificación de la interacción entre las moléculas asociadas en la formación del excímer o excíplex permite manipular en período entre interacciones sucesivas. La modificación de la interacción también puede cambiar los tiempos de vida de las moléculas de excímer o excíplex. El período entre interacciones sucesivas del excímer o excíplex también estará afectado por la unión de las moléculas constituyentes a la molécula diana.

Las configuraciones que se ilustran en las Figuras 10 a 12 y descritas en términos de especies activas FRET funcionarán de la misma manera para modificar las propiedades de excímers o excíplexs.

El pireno y el perileno y sus numerosos derivados son apropiados para ser ensamblados en pares que interactúen. Por ejemplo, ácido 1-pireno-acético y su éster succinimidilo, ácido 1-pireno butanoico, 1-pireno butanol, ácido N-(1-pireno-butanoil)cisteico y su éster succinimidilo, ácido 1-pirenocarboxilico, ácido 1-pireno-decanoico, ácido 1-pireno hexanoico, N-(1-pireno)-yodoacetamida, N-(1-pireno)maleimida, 1-pireno-metilamina.

Se pueden formar pares excíplex de diversas formas a partir de perileno, pireno, N,N-dimetilanilina, y entre tiocianima y naranja de acridina.

Aunque la descripción anterior se ha centrado principalmente en la fluorescencia, la invención puede utilizarse para medir fosforescencia o luminiscencia. Los componentes y estructuras que se requieren para generar y/o modificar las emisiones de fosforescencia o luminiscencia serán claras para aquellos con experiencia en la técnica a la luz de la descripción anterior.

Aunque la descripción anterior ha discutido la generación de luz de fluorescencia a partir de estructuras que incluyen un fluoroforo y un motivo desactivador u otro motivo configurado para interaccionar con el fluoroforo, será evidente que pueden obtenerse efectos similares sin dichas estructuras a través de la difusión de fluoroforos y motivos modificantes en una disolución. En el caso de desactivación por colisión, el volumen de fluoroforos y la distancia que viajan entre colisiones con los motivos desactivadores afectará la intensidad de fluorescencia medida. En el caso de fluoroforos que tengan largos tiempos de vida característicos, la difusión puede darse a distancias considerables, produciendo generalmente más desactivación para una concentración de desactivador un y coeficiente de difusión determinados. En el caso de fluoroforos que tengan tiempos de vida más cortos, sólo se verá el mismo grado de desactivación si la concentración de motivos desactivadores es mayor o bien la razón de difusión es mayor.

Un fluoroforo puede encontrarse en una disolución que contenga un tampón configurado para que interactúe con el fluoroforo. En este caso las especies activas son, de hecho, la suma del fluoroforo y la parte del tampón con el cual está interactuando.

Se entiende que el tiempo de ciclo característico de un fluoroforo también puede cambiarse mediante la modificación física de una propiedad del fluoroforo, por ejemplo mediante la modificación de la energía electromagnética, magnética, acústica o térmica. Algunas de estas modificaciones se han descrito anteriormente. Otras modificaciones apropiadas serán obvias para aquellos con experiencia en la técnica.

Los tiempo de ciclos característicos de ciertos compuestos apropiados pueden modificarse mediante radiación ultrasónica. El compuesto debe escogerse de tal forma que la radiación ultrasónica modifique las interacciones mecánicas y termo-mecánicas de cada uno y entre ellos. Un ejemplo de tales moléculas es el estilbeno. La absorción periódica de energía por tal molécula modificará el tiempo de ciclo característico de la emisión de fluorescencia, mediante la creación de de un cambio periódico localizado en la energía térmica y polarizando así de forma característica la interacción entre el fluoroforo y la molécula. De forma similar, de acuerdo con la invención pueden utilizarse campos eléctricos para modificar la interacción entre especies activas, por ejemplo como puede hacerse acoplando las especies activas a ensamblajes de cristal líquido.

Aunque los ejemplos de realización específicos de la invención descritos anteriormente se refieren a la excitación continua de una muestra utilizando luz incidente o un catalizador, la invención no pretende limitarse a estos tipos de excitación, e incluye otros tipos de excitación apropiados, por ejemplo radiación alfa, radiación beta, adición química, vibración, campos eléctricos o campos magnéticos. La luz incidente puede ser proporcionada por diodos emisores de luz (LED), diodos superluminiscentes, lámparas térmicas o lámparas espectrales.

Aunque los ejemplos específicos de la invención descritos anteriormente se refieren a la emisión y detección de fotones, la invención puede aplicarse a la emisión y detección de cualquier tipo de cuanto apropiado, por ejemplo electrones, neutrones o fotones. En algunas aplicaciones puede ser posible establecer un valor de corte a través del cual una señal analógica pueda ser convertida en cuantos, permitiendo así utilizar la invención.

Claims (29)

1. Un método de análisis para la determinación del tiempo de ciclo característico de una muestra, donde el método comprende la excitación de elementos activos en la muestra con una intensidad suficiente para que al menos algunos de los elementos activos se re-exciten a un estado excitado de forma esencialmente inmediata después de la relajación a un estado fundamental, la detección de cuantos emitidos por los elementos activos en la muestra para obtener una señal detectada, y el análisis de la señal detectada para derivar el tiempo de ciclo característico, donde el número de elementos activos en la muestra y la intensidad de la excitación son tales que los cuantos son detectados en una corriente en la cual cada cuanto individual es distinguible de los otros.

2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en la cual el análisis de la señal detectada incluye la correlación de la señal detectada consigo misma.

3. Un método de acuerdo con las Reivindicaciones 1 ó 2, en el cual el tiempo de ciclo característico de la muestra se modifica mediante una modificación apropiada del entorno de los elementos activos, por medios que incluyen medios químicos o físicos, y se determina el tiempo de ciclo característico modificado.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en el cual al menos algunos de los elementos activos tienen un nivel excitado, un nivel superior de una transición de emisión y un nivel inferior de transición de emisión, y emiten cuantos detectables al relajarse desde el nivel superior de transición de emisión al nivel inferior de transición de emisión, en el cual el tiempo de vida del nivel inferior de la transición de emisión o otros niveles de energía que tenga menor energía que el nivel inferior de la transición de emisión está influenciado por la modificación del entorno de los elementos activos, y se determina este efecto.

5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 4, en la cual al menos algunos de los elementos activos están unidos a un sustrato mediante un miembro que permite movimiento vibracional del elemento activo en el cual el tiempo de vida del nivel inferior de la transición de la emisión u otro nivel de energía que tenga menor energía que el nivel inferior de la transición de emisión, puede ser alterado mediante la modificación del entorno electrónico del elemento activo.

6. Un método de acuerdo con la Reivindicación 5, en la cual la modificación del entorno electrónico está afectado por la presencia de al menos un motivo modificador que es capaz de influenciar el entorno electrónico del elemento activo.

7. Un método de acuerdo con la Reivindicación 6, en el cual el cambio en el tiempo de ciclo se debe a la transferencia de la energía al motivo modificador desde el nivel inferior de la transición de emisión u otro nivel de energía que tenga una energía menor que el nivel inferior de emisión.

8. Un método de acuerdo con la Reivindicación 3, en el cual el tiempo de ciclo se modifica mediante cambios en la conformación del elemento activo con relación al motivo modificante.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, en el cual cada elemento activo contiene parte de una sonda, en el cual la sonda se mueve entre distintos entornos dieléctricos, incluyendo aquellos que ocurren en una molécula o su solvente, donde el tiempo de ciclo característico de la sonda se ve afectado por las escalas temporales del movimiento del elemento activo entre distintos entornos dieléctricos, estando el movimiento afectado por al menos una de las siguientes modificaciones:

e.

Alteración del tamaño global de la sonda;

f.

Alteración de la distancia entre el elemento activo y el resto de la sonda;

g.

Alteración de la rigidez de una molécula espaciadora entre el elemento activo y el resto de la sonda; o

h.

Modificación de la sonda o una de sus partes con motivos hidrofílicos, polares, cargados o hidrofóbicos.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, en el cual el elemento activo contiene parte de una especie que interacciona periódicamente con un motivo modificante, y se miden los períodos durante los cuales la especie interacciona con el motivo modificante y los períodos durante los cuales la especie no interacciona con el motivo modificante.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, en el cual el elemento activo contiene parte de una especie que interacciona periódicamente con un motivo desactivador y es así desactivado mediante un mecanismo de desactivación estática, y se miden los períodos durante los cuales la especie es activa y el período durante el cual la especie es inactiva.

12. Un método de acuerdo con el cual cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, en el cual el elemento activo contiene parte de una especie que interacciona periódicamente con un motivo desactivador y es así desactivado mediante un mecanismo de desactivación por colisión, y se miden los períodos durante los cuales la especie es activa y les períodos durante los cuales la especie es inactiva.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 12, en el cual el período de la interacción periódica está influenciado por una modificación apropiada de una propiedad de las especies o el motivo modificante o el motivo desactivador.

14. Un método de acuerdo con la Reivindicación 13, en el cual la modificación comprende el cambio de la longitud de una molécula espaciadora sobre la cual el elemento activo está situado, o la longitud de la molécula espaciadora sobre la cual está situado el motivo modificador o el motivo desactivador.

15. Un método de acuerdo con la Reivindicación 13 ó 14, en el cual la modificación comprende el cambio de la flexibilidad de una molécula espaciadora sobre la cual está situado el elemento activo, o la flexibilidad de la molécula espaciadora sobre la cual está situado el motivo modificador o motivo desactivador.

16. Un método de acuerdo con el cual cualquiera de las Reivindicaciones 13 a 15, en el cual la modificación comprende la adición de un motivo modificador a una molécula espaciadora sobre la cual está situado el elemento activo, o a una molécula espaciadora sobre la cual están situados el motivo modificador o el motivo desactivador.

17. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 13 a 16, en el cual el elemento activo está unido al lugar de unión a través de una molécula espaciadora, y la modificación resulta de una interacción con el lugar de unión.

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 13 a 17, en el cual la modificación resulta de la restricción del movimiento períodico de la molécula espaciadora sobre la cual está situado el elemento activo, o la molécula espaciadora sobre la cual están situados el motivo modificante o el motivo desactivador.

19. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 13 a 18, en el cual el elemento activo está unido al lugar de unión a través de una molécula espaciadora, y la modificación resulta de la interacción con un motivo modificador unido al lugar de unión

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 13 a 19, en el cual el elemento activo está unido a través de una primera molécula espaciadora a un primer lugar de unión, y un motivo modificador o motivo desactivador está unido a través de una segunda molécula espaciadora a un segundo lugar de unión, donde la separación entre el primer y segundo lugares de unión determina la periodicidad de la interacción entre el elemento activo y el motivo modificador o el motivo desactivador.

21. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, en el cual el primer y segundo elementos que interaccionan periódicamente para formar un elemento activo, y se mide el período durante el cual interaccionan el primer y segundo elemento para formar el elemento activo y el período durante el cual en primer y segundo elementos no interaccionan para formar el elemento activo.

22. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21, en el cual el elemento activo es una especie de transferencia de energía de resonancia por fluorescencia.

23. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21, en el cual el elemento activo es un excímer o un excíplex.

24. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en el cual se hace variar periódicamente la sección eficaz de la excitación de un estado fundamental de un elemento activo, y se mide el período de variación.

25. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en el cual el elemento activo emite fotones de fluorescencia que interaccionan con una solución en la cual se encuentran los elementos activos, y se monitoriza el efecto de la solución mediante la modulación de las propiedades de la solución.

26. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, que además comprende la excitación de los elementos activos utilizando un pulso de excitación y determinando el tiempo transcurrido entre la excitación y la emisión de cuantos desde los elementos activos, y la sustracción de ese tiempo del tiempo de ciclo característico.

27. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 20, en el cual la excitación de la muestra se realiza mediante una reacción química.

28. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en el cual los elementos activos tienen un estado excitado superior, un estado excitado inferior y un estado fundamental, y emiten cuantos detectables al relajarse desde el estado excitado superior al estado excitado inferior, comprendiendo el método además la excitación de segundos elementos a un estado excitado de tal manera que los segundos elementos transfieren energía de excitación de los elementos activos, excitando así los elementos activos al estado excitado superior.

29. Un aparato de análisis para la determinación del tiempo de ciclo característico de los elementos activos en una muestra, que comprende métodos para la excitación de elementos activos en la muestra con una intensidad suficiente para que al menos algunos de los elementos activos se re-exciten a un estado excitado de manera esencialmente inmediata después de la relajación a un estado fundamental, los medios para la detección de cuantos emitidos por la muestra para obtener una señal detectada, los métodos de análisis para analizar la señal detectada para derivar el tiempo de ciclo característico, donde el número de elementos activos en la muestra y la intensidad de la excitación son tales que los cuantos se detectan en un flujo en el cual los cuantos individuales son distinguibles los unos de los otros.