BR112014016846B1

BR112014016846B1 - Dispositivo para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese e método para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese

Info

Publication number: BR112014016846B1
Application number: BR112014016846-6A
Authority: BR
Inventors: Reinhold Wimberger-Friedl; Johan Lub; Pieter Jan Van Der Zaag
Original assignee: Koninklijke Philips N.V
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2020-09-29
Also published as: RU2611207C2; US20150079585A1; RU2014133184A; US10564104B2; BR112014016846A2; US20180067052A1; EP2802411B1; WO2013105025A1; EP2802411A1; JP2015503357A; JP6220348B2; BR112014016846A8; CN104053498A; CN104053498B; US9823196B2

Abstract

dispositivo para o controle óptico do sequenciamento de ácido nucleico, em particular para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese, método para o controle óptico do sequenciamento de ácido nucleico, em particular para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese, elemento do programa para o controle óptico de um sequenciamento de dna, meio legível por computador, no qual um programa de computador para o controle óptico de um sequenciamento de dna e uso de uma porção como uma porção de bloqueio no sequenciamento de dna a presente invenção refere-se ao sequenciamento de dna com ciclagem de reagente na grade de fios. a abordagem do sequenciamento sugerido com a qual se permite usar um fluido único com nenhuma etapa de lavagem. com base no forte confinamento óptico e da luz de excitação e da luz da clivagem, a reação de sequenciamento pode ser lida sem a lavagem da superfície. o sequenciamento em etapas é alcançado pelo uso de nucleotídeos com porções de bloqueio opticamente cliváveis. após a leitura, o incorporado no nucleotídeo é desbloqueado pela luz da clivagem através do mesmo substrato. isto assegura que apenas nucleotídeos ligados sejam desbloqueados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à determinação da sequência de ácido nucleico. Em particular, a presente invenção refere-se a um dispositivo para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico, um método para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de ácido nucleico, um elemento do programa, um meio legivel por computador no qual um elemento do programa é armazenado e o uso de uma porção como uma porção de bloqueio no sequenciamento de DNA.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] O sequenciamento de DNA é um campo em rápido desenvolvimento com jogadores chave tais como Illumina (usando a tecnologia Solexa), Life (usando a tecnologia Solid) e Roche Diagnostics (usando a tecnologia 454) . A desvantagem dos métodos de sequenciamento que estas empresas usam é que a informação da sequência é obtida por uma repetição de várias etapas que envolvem a substituição de e lavagem. Isto é complicado e dispendioso e gasta muitos reagentes caros. 0 número de repetições é igual ao número de nucleotídeos que são interrogados, isto é, o comprimento de leitura. Com o desejo de aumentar o comprimento de leitura, este problema se tornará mais grave no futuro. Atualmente, isto é compensado pelo sequenciamento altamente paralelo em grandes dispostos. No entanto, para aplicações clínicas este é o menos desejável. Se teria preferivelmente uma resposta mais rápida e uma menor multiplexação. Ao mesmo tempo, o custo por par de base deve cair significativamente. Visto que após cada etapa, isto é, após a incorporação do nucleotídeo, toda a superfície precisa ser lavada, todos os reagentes terminam no lixo. 0 consumo de reagente total é proporcional ao comprimento de leitura e o fator de custo dominante de sequenciamento no momento.

[003] O processo de sequenciamento de um alvo particular, tal como, por exemplo, o DNA, se torna mais complexo, visto que a reação de incorporação precisa ser seguida por uma reação de ativação e nesse ínterim etapas de lavagens cuidadosas são exigidas.

[004] Abordagens alternativas como aquelas de Pacific Biosciences são mais eficientes visto que elas seguem a incorporação de nucleotídeos no tempo real para cada molécula separadamente. Desta maneira, nenhuma lavagem é exigida. As exigências ópticas para tal sistema, por outro lado, são muito graves, visto que se precisa de sensibilidade ao fluoróforo único para 4 diferentes cores em tempo real. Isto pode apenas ser alcançado para uma área limitada visto que um campo das lentes objetivas com alta ampliação é limitado para sistemas práticos e uma forte fonte de luz a laser. Com a área limitada, apenas uma pequena seleção de uma amostra pode ser sequenciada e o risco de erros devido a leituras perdidas é alto. Os sinais fluorescentes de nucleotídeos rotulados enquanto eles são incorporados pela polimerase precisam ser discriminados daqueles do mesmo tipo de moléculas que ocorrem na mesmo posição por acaso. Isto é feito pela análise do comprimento de pulso do sinal de fluorescência.

[005] O documento WO 2006/007207 A2 revela métodos para a determinação da sequência de ácido nucleico na qual os ácidos nucleicos são fixados a uma superfície e sequencialmente expostos a deoxinucleotídeo trifosfatos tendo um rótulo opticamente detectável fixado. Após a detecção, o rótulo pode ser removido do seu nucleotídeo pela fotoclivagem. Em certas realizações, a detecção é realizada usando iluminação com onda evanescente.

[006] O documento WO 2006/044078 A2 revela exemplos de grupos de bloqueio reversíveis que são fotocliváveis. 0 documento WO 2009/060360 A2, EP 2 221 605 Al e WO 2009/107041 Al revela diferentes aplicações de sensores com uma grade de fios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Pode haver uma necessidade de prover uma determinação melhorada da sequência de um ácido nucleico. A presente invenção se adequa a esta necessidade.

[008] O objetivo da presente invenção pode ser visto para prover a determinação de uma sequência de um ácido nucleico.

[009] O objetivo da presente invenção é solucionado pelo assunto das reivindicações independentes. Outras realizações e vantagens da invenção são incorporadas nas reivindicações dependentes.

[010] Deve ser notado que as realizações descritas aqui pertencem similarmente ao método para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico, o dispositivo para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar a sequência do ácido nucleico, o elemento do programa do computador, o meio legível por computador e o uso de uma porção como uma porção de bloqueio no sequenciamento de DNA. Os efeitos dinergísticos podem surgir das diferentes combinações das realizações embora elas possam não ser descritas em detalhe.

[011] Mais adiante, deve ser notado que todas as realizações da presente invenção, referentes a um método, devem ser realizadas com a ordem das etapas como descritas, no entanto, esta pode não ser a única e essencial ordem das etapas do método. Todas as ordens e combinações diferentes das etapas do método são aqui descritas.

[012] No contexto da presente invenção, o termo "porção de bloqueio" deve ser entendido como uma porção que bloqueia uma atividade de síntese de uma enzima no caso onde a porção de bloqueio é incorporada em uma molécula na qual a enzima realiza um processo de síntese. Uma porção de bloqueio pode ser, por exemplo, uma molécula de bloqueio.

[013] No contexto da presente invenção, o termo "clivável" deve ser entendido como passível de ser clivado pela absorção da luz da clivagem de comprimento de onda ÀCL.

[014] No contexto da presente invenção, deve ser entendido que cada realização da disposição óptica revelada aqui pode ser configurada para emitir luz de excitação polarizada e luz da clivagem polarizada. Assim, um polarizador ou fontes de luz já polarizadas podem ser usados. Os detalhes serão descritos posteriormente.

[015] Além disso, o termo "luz de excitação" no contexto da presente invenção se aplica ao comprimento de onda ÀEXI, ÀEX2, ÀEX3 e ÀEX4, respectivamente.

[016] De acordo com uma realização exemplar da invenção, um dispositivo para o controle óptico de uma sequência de DNA é apresentado. Em particular, o dispositivo é configurado para controlar opticamente uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese. Altemativamente, em vez de sequenciamento por síntese, uma síntese por ligação também deve ser entendida no escopo da presente invenção. 0 dispositivo apresentado compreende um substrato para a ligação de pelo menos uma molécula sobre uma primeira superfície do substrato. 0 dispositivo ainda compreende uma disposição óptica que é configurada para direcionar a luz de excitação de pelo menos um primeiro comprimento de onda de excitação ÀEXIpara o substrato para excitar um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo que é incorporado na molécula que é ligada sobre a primeira superfície do substrato. A disposição óptica é ainda configurada para receber e detectar a luz fluorescente emitida pelo rótulo fluorescente do primeiro nucleotídeo que é incorporado na molécula ligada. Além disso, a disposição óptica é configurada para direcionar a luz da clivagem de um comprimento de onda da clivagem ÀCL, preferivelmente a luz UV, para o substrato para induzir opticamente uma reação de clivagem fotoquímica no primeiro nucleotídeo incorporado para clivar uma porção de bloqueio e o rótulo fluorescente fora do primeiro nucleotídeo incorporado. Além disso, o substrato é configurado para confinar a luz de excitação e é configurado para prover assim uma onda evanescente da luz de excitação com a primeira superfície do substrato. Além disso, o substrato é configurado para confinar a luz da clivagem, preferivelmente a luz UV e é ainda configurada para prover uma onda evanescente da luz da clivagem na primeira superfície do substrato.

[017] Aqui um dispositivo é proposto que é capaz de combinar as vantagens de dispositivos de sequenciamento conhecidos. Os dispositivos permitem a leitura fácil com base no conjunto, mas nenhum ou um número reduzido de etapas de lavagem é exigido, significando um único preenchimento do reagente para todas as leituras.

[018] Em outras palavras, um dispositivo de sequenciamento é evitado pela presente invenção, que permite realizar o sequenciamento em um único fluido e no qual nenhum ou um número reduzido de etapas de lavagem é exigido. 0 volume de reagente exigido, isto é os custos, é reduzido por um fator igual ao comprimento de leitura (50 - 100). Com base no forte confinamento da luz de excitação sobre o substrato, isto é, uma estrutura da superfície nanofotônica como uma grade de fios, a reação de sequenciamento pode ser lida sem a lavagem da superfície. 0 reflexo interno total também pode ser usado a fim de prover a onda evanescente.

[019] O sequenciamento em etapas é alcançado pelo uso de nucleotídeos com grupos de bloqueio opticamente cliváveis. Após a leitura, o nucleotídeo incorporado é desbloqueado pela luz da clivagem como, por exemplo, radiação UV através do mesmo substrato nanofotônico. Isto assegura que somente nucleotídeos ligados sejam desbloqueados. 0 custo e a velocidade de sequenciamento de DNA são fortemente relacionados ao consumo de reagente. A velocidade e a complexidade das estações de trabalho, instrumentos e cartuchos de sequenciamento são amplamente determinadas pela necessidade de manuseamento de fluido para a repetição da reação e etapas de lavagem. Ambos os aspectos são melhorados pela presente invenção levando a uma exemplificação dramática e redução de custo de sequenciamento.

[020] Como será explicado em detalhes a seguir, a disposição óptica também pode ser configurada para direcionar a luz de excitação de um primeiro, e um segundo e um terceiro e um quarto comprimento de onda de excitação ÀEXI, ÀEX2, ÀEX3 e ÀEx4, para o substrato para excitar um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo incorporado na molécula ligada sobre a primeira superfície do substrato. Dessa forma, pode ser assegurado que, por exemplo, quatro diferentes nucleotídeos, como, por exemplo, Adenina (A) e Guanina (G) e Timina (T) e Citosina (C) , possam ser distinguidos, quando o respectivo nucleotídeo usa um rótulo fluorescente específico e diferenciado. No entanto, se desejado, também apenas um ou dois ou três dos quatro comprimentos de onda de excitação ÀExi, ÀEx2, ÀEx3 e ÀEX4 descritos acima podem ser direcionados pelo dispositivo em direção ao substrato para excitar a molécula, isto é, o rótulo fluorescente de um nucleotídeo que é incorporado na molécula ligada. Os detalhes a cerca dos quatro sistemas de cor, nos quais quatro diferentes rótulos fluorescentes para os nucleotídeos A, G, C, e T descritos acima são usados, serão explicados a seguir em mais detalhes com relação às figuras 1 e 2 a seguir. A molécula ligada deve ser um fragmento de DNA e pode ser entendida como o ácido nucleico cuja sequência de nucleotídeos é determinada pela presente invenção.

[021] Além disso, um técnico no assunto de sequenciamento ou sequenciamento de DNA é consciente do fato de que os comprimentos de onda ÀExi, ÀEX2, ÀEx3 e ÀEx4 são escolhidos em combinação com os quatro rótulos fluorescentes usados para, por exemplo, os nucleotídeos A, G, C, e T. em outras palavras, os comprimentos de ondas são escolhidos tais que os rótulos fluorescentes usados, podem ser opticamente excitados pela luz de excitação estimada. Além disso, o comprimento de onda ÀCL é escolhido tal que a reação de divagem desejada dos nucleotídeos usados pode ser opticamente causada pela irradiação da dita luz da divagem.

[022] Como uma realização exemplar, o seguinte comprimento de onda pode ser usado, embora o técnico no assunto possa ser parte do comprimento de onda descrito explicitamente. Os comprimentos de onda de excitação poderíamos ser escolhidos com base no que vem a seguir: os espaçamentos ópticos dos comprimentos de onda de excitação sobre o espectro visível e de acordo com os espectros de absorção dos corantes mais comumente usados, por exemplo, FAM, HEX, Cy3 Cy5, Alexa Fluor 700 ou Atto700 ou similar. Os comprimentos de onda de excitação também podem ser ajustados quanto à disponibilidade de fontes de luz como, por exemplo, fontes de luz a laser no estado sólido com, por exemplo, 405, 532, 633 e 780 nm. No entanto, a invenção não é limitada aos ditos comprimentos de onda de excitação. A emissão máxima do respectivo corante pode ser escolhida tal que nenhuma sobreposição com o comprimento de onda de excitação da vizinhança ocorre. Além disso, a luz da divagem, preferivelmente a luz UV, pode ser na faixa de 250 - 400 nm, preferivelmente 300 - 370 nm. No entanto, a invenção não é limitada aos ditos comprimentos de onda de excitação.

[023] Deve ser notado que a molécula que é ligada na primeira superfície do substrato pode, por exemplo, ser um fragmento de DNA, DNA, RNA, mRNA ou outro ácido nucleico. Além disso, também uma enzima, que será descrita aqui posteriormente, pode ser ligada à primeira superfície do substrato. No contexto da presente invenção, o termo "ligado" deve ser entendido como o estado no qual o elemento é imobilizado na primeira superfície do substrato.

[024] Em adição, o substrato prove pontos que podem ser cobertos com clones de moléculas idênticas, a fim de aumentar o sinal óptico, que é recebido pela detecção da fluorescência. Portanto, um substrato pode ser provido como um disposto de tais pontos com respectivamente diferentes clones, tal que o rendimento do sequenciamento é aumentado.

[025] Em outras palavras, o dispositivo da presente invenção apresentado acima permite um processo de sequenciamento óptico com base no conjunto sem as etapas de lavagem, tal que o processo total de determinação de uma sequência de um ácido nucleico por síntese pode ser realizado em uma única solução sobre o substrato. As etapas do processo podem ser controladas opticamente. 0 processo de desbloqueio, que deve ser entendido na presente invenção como ativação, do nucleotídeo incorporado pode ser realizado pela irradiação de uma superfície seletiva, radiação evanescente da luz da clivagem. Preferivelmente, tal irradiação é realizada com a luz UV. 0 processo é descrito coo o direcionamento da luz da clivagem de um comprimento de onda da clivagem ÀCL para o substrato para induzir opticamente a reação de clivagem fotoquímica no primeiro nucleotídeo incorporado. Portanto, o dispositivo apresentado é configurado para clivar apenas o rótulo fluorescente fora do primeiro nucleotídeo incorporado pela irradiação do substrato com uma onda evanescente da luz da clivagem. Assim, somente os nucleotídeos incorporados serão desbloqueados, ativados ou clivados devido à localização do campo evanescente da luz da clivagem. A mesma iluminação do campo evanescente é usada pelo dispositivo apresentado para a leitura da fluorescência da base incorporada ou nucleotídeos contra a base dos rótulos fluorescentes na solução. A localização do campo óptico da luz de excitação, que compreende pelo menos o primeiro comprimento de onda de excitação ÀEXI,é alcançada pelo campo evanescente da dita luz de excitação.

[026] Por exemplo, a onda evanescente da luz da clivagem e a onda evanescente da luz de excitação podem ser geradas pelo substrato do dispositivo apresentado pela provisão de uma grade de fios. Isto pode permitir o uso de um feixe focado de alta intensidade tal que a foto-óptica ocorre em uma alta taxa em uma área muito limitada muito próxima à superfície. A disposição óptica pode compreender os respectivos elementos ópticos para a excitação e detecção de fluorescência, isto é, a leitura e respectivos elementos ópticos para o desbloqueio, isto é, a ativação, em uma única unidade de disposição óptica ou também pode ser compreendida em elementos fisicamente diferenciados.

[027] Além disso, a respectiva fonte de luz de excitação pode ser compreendida pela disposição óptica. Além disso, a fonte de luz para a emissão da luz da clivagem pode ser compreendida pela disposição óptica. A iluminação para a clivagem, isto é, o desbloqueio e a leitura, isto é, a excitação e detecção de fluorescência, podem ocorrer opcionalmente através das mesmas lentes. No entanto, se desejado, também duas configurações ópticas diferentes para o desbloqueio e a leitura podem ser apresentadas.

[028] O campo da onda evanescente usado na presente invenção decai exponencialmente com a distância da primeira superfície, com um comprimento de decomposição dependendo do índice de refração complexo do material, por exemplo, metal, da grade de fios e aquele do meio entre os fios, sob a condição que a abertura entre os fios de metal é menor do que a resolução óptica no comprimento de onda pertinente. Por exemplo, a abertura pode ser de 7 0 nm que é bem abaixo daquele limite também para a luz UV. 0 comprimento de decomposição é estimado como 16,8 nm (vide abaixo), o que significa que o campo diminuiu para 1/e da intensidade irradiada naquela distância da interface do fio de metal e do substrato. Isto pode ser levemente diferente da primeira superfície devido à subcorrosão da primeira superfície entre os fios.

[029] Em outras palavras, o dispositivo apresentado provê uma irradiação da luz da clivagem seletiva para a superfície e uma superfície de irradiação da luz de excitação. 0 substrato pode ser configurado como uma estrutura da superfície nanofotônica, tal que os confinamentos ópticos descritos acima da luz de excitação e da luz da clivagem e adicionalmente as ondas evanescentes da luz da clivagem e luz de excitação são gerados. A combinação inter alia, a luz de excitação, isto é, a óptica da leitura e a luz da divagem permitem uma reação em etapas iterativa para determinar a sequência de ácido nucleico por síntese. Isto tem o benefício de que as etapas de lavagem podem ser omitidas. Subsequentemente, as etapas e ciclos descritos acima os quais são realizados com o dispositivo apresentado, podem ser repetidos muitas vezes para permitir uma incorporação em etapas de um ou mais nucleotídeos adicionais na molécula ligada e depois disso leitura, o dito nucleotídeo tendo sido incorporado ou não como descrito acima.

[030] O dispositivo pode ser ainda configurado para alcançar os dados que descrevem as diferenças dos ácidos nucleicos que foram incorporados na molécula ligada com base na ação opticamente em etapas que é controlada opticamente pelo dispositivo.

[031] Além disso, o substrato pode ser lido de um polímero, por exemplo, poli-(ciclo-)olefina, poli-carbonato, poliéster ou PMMA. Da mesma forma, metal e semicondutores podem ser usados.

[032] De acordo com outra realização exemplar da invenção, o dispositivo ainda compreende a molécula que é ligada à primeira superfície do substrato. 0 dispositivo ainda compreende uma solução com uma pluralidade de nucleotídeos e uma enzima. Nela, os nucleotídeos compreendem respectivamente a porção de bloqueio. A porção de bloqueio é configurada para bloquear a atividade de síntese da enzima quando a respectiva porção é incorporada na molécula ligada à primeira superfície do dispositivo.

[033] Se desejado, a porção de bloqueio compreende o rótulo fluorescente. No entanto, a porção de bloqueio e o rótulo fluorescente podem ser incorporados ou posicionados no primeiro nucleotídeo em diferentes posições. Elas podem ser clivadas em um único processo de clivagem ou em diferentes processos de clivagem. Isto vale para toda realização da presente invenção.

[034] A realização apresentada aqui provê a vantagem de que a reação de incorporação para em si mesmo devido à porção de bloqueio compreendida. Por exemplo, o impedimento estérico pode ser usado pela porção de bloqueio para bloquear a atividade de síntese da enzima. Isto permite fazer uma leitura local da reação que está ocorrendo em muitos pontos simultaneamente. Na técnica anterior, a ação de enzimas usadas em uma amostra no dispositivo não pode ser sincronizada. No entanto, a presente invenção permite a incorporação de nucleotídeos, que podem ser feitos vantajosamente etapa por etapa com uma leitura após cada etapa. A vantagem é alcançada pelo uso das porções de bloqueio descritas acima, que podem estar bloqueando os nucleotídeos, que bloqueiam a atividade da enzima após o nucleotídeo ser incorporado. 0 desbloqueio ativo é exigido para continuar com a incorporação do próximo nucleotídeo, o qual a presente invenção permite pela disposição óptica que é configurada para direcionar a luz da divagem para clivar a porção de bloqueio. A porção de bloqueio pode compreender o rótulo fluorescente.

[035] Como realizações exemplares, as porções de bloqueio podem ser incorporadas como terminador reversível bloqueado 3' ou como terminador reversível desbloqueado 3' como descrito e definido em "Sequencing technologies, the next generation" by Michael L. Metzker, Nature Review Genetics 11 (2010) 31-46.Nele, também denominado "desbloqueado", o dito terminador reversível desbloqueado 3' das porções de bloqueio pode ser usado como bloqueando uma atividade de uma enzima. Os Terminadores reversíveis podem ser entendidos como ligantes fixados à unidade de nucleotídeo/ribose que interrompe a incorporação de qualquer subsequente nucleotídeo após a incorporação. Eles são reversíveis quando, mediante a clivagem por meios químicos ou fotoquímicos, este processo pode ser inacabado e a polimerase pode ser incorporada no próximo nucleotídeo. Além disso, o terminador reversível bloqueado 3' de Metzker et al pode ser emendado, por exemplo, quimicamente, para torná-lo fotoclivável. A seguir, a fotoclivagem com a luz da clivagem pode ser realizada por meio da presente invenção. Em adição, outros complexos podem ser usados como porções de bloqueio em combinação com a respectiva enzima como será descrito posteriormente. 0 Técnico no assunto sabe qual combinação de enzima e porção de bloqueio leva ao efeito desejado de bloqueio da atividade de síntese da enzima.

[036] A terminologia usada aqui referente às ditas porções de bloqueio está em linha com e adaptada à revelação do dito artigo. A dita segunda classe de porção tem uma vantagem adicional como é o caso da posição 3' da unidade de ribose que é desbloqueada e a incorporação do próximo nucleotídeo é evitado pelo grupo a granel que contém o rótulo fluorescente ligado à porção de pareamento de base na posição 5' da unidade de ribose. Esta pode ser coletada da seguinte figura 6 e sua descrição. A propagação do oligômero de nucleotídeo é evitada desde que este grupo esteja fixado. No entanto, a incorporação do próximo nucleotídeo é permitida após a remoção do grupo a granel. A presente invenção provê tal remoção pela indução de uma reação de divagem fotoquímica. Mais vantajosamente, a presente invenção usa tal reação de divagem somente muito próxima à superfície na qual a molécula está ligada, devido ao fato de que uma onda evanescente da luz da clivagem é gerada.

[037] Em adição à seguinte descrição, os detalhes sobre as figuras 6, 8 e 10 devem ser levados em consideração nos quais as porções de bloqueio com rótulo fluorescente compreendido são reveladas.

[038] De acordo com outra realização exemplar da presente invenção, a porção de bloqueio é um terminador reversível desbloqueado 3' fotoclivável.

[039] De acordo com outra realização exemplar, a porção de bloqueio é escolhida do grupo compreendendo um derivado de nitrofeniletilo, análogo de 5-metil-(2-(2- nitrofenil)propil)carbonato-dUTP, análogo de 5-metil(2-oxo- 1,2-difeniletil)carbonato-dUTP e quaisquer combinações dos mesmos.

[040] De acordo com outra realização exemplar, o substrato é configurado como uma grade de fios para a luz de excitação e para a luz da clivagem.

[041] A grade de fios pode compreender um padrão de fios de metal em, por exemplo, um substrato de vidro. 0 espaçamento entre os fios age como uma guia de onda de placa revestida de metal, na qual a principal contribuição vem de dois modos fundamentais. Por exemplo, para a luz de excitação polarizada TE incidente sobre os fios do substrato da presente invenção, o modo resultante entre os fios é o modo evanescente, tendo um comprimento de decomposição exemplar de 16,8 nanômetros para À = 630 nanômetro. Nele assume-se que os fios do substrato são preenchidos com um meio tendo um índice de refração de água, n = 1,33. Para a luz polarizada TE, o modo resultante para uma grade de fios é chamada de um modo de propagação, tendo um comprimento de decomposição de 1,2 pm neste exemplo. Por exemplo, a altura do fio pode ser de 60 nanômetros em um exemplo. Nele o modo polarizado TM é transmitido com uma perda de luz da ordem de 10% ou menos, enquanto o modo polarizado TE está caindo evanescentemente.

[042] Uma maneira diferente de entender a grade de fios é pensar, por exemplo, em fios de alumínio como metais que refletem a luz de excitação com polarização paralela aos fios (polarização TE) e que transmitem a polarização ortogonal aos fios (polarização TM). A transmissão máxima de luz polarizada TE pode ser maior do que 95%. 0 campo evanescente no caso de luz de excitação TE incidente é descrito em ambas as figuras 3a e 3b. A luz de excitação e a luz da clivagem irradiada pela disposição óptica da presente invenção podem ser de tal polarização nesta e cada outra realização da presente invenção.

[043] Um técnico no assunto deriva inequivocamente das descrições apresentadas acima que os parâmetros geométricos da grade de fios usada devem ser adaptados à luz de excitação e à luz da clivagem que é irradiada pela disposição óptica. Por exemplo, a condição que a abertura da grade do fio entre os fios deve ser menor do que a resolução óptica no comprimento de onda pertinente, isto é, abertura << resolução óptica ~ À/2 NA. No contexto das seguintes figuras, as aberturas são denominadas aberturas tipo fenda.

[044] O uso do substrato da grade de fios do dispositivo apresentado provê um extremo confinamento óptico. Em combinação com uma rápida clivagem fotoquímica, que é usada para desacoplar a assim chamada porção de bloqueio no nucleotídeo para evitar a continuação da incorporação do próximo nucleotídeo, as vantagens indicadas são realizadas. 0 uso da grade de fios tem a vantagem adicional de ser amplamente independente do ângulo em incidência. Portanto, ela pode ser usada em combinação com feixes focados para alcançar uma alta intensidade localmente enquanto mantendo o resto no escuro. Em outras palavras, a grade de fios permite excitar e ser sensível a apenas aquelas moléculas, por exemplo, os fragmentos de DNA, que são muito próximos à superfície no campo evanescente e assim nenhuma detecção ou efeito sobre qualquer nucleotídeo do rótulo fora do campo evanescente é causada. Por exemplo, o campo evanescente pode alongar cerca de 20 nanômetros da primeira superfície do substrato. Este pode ser o caso para ambas a luz de excitação e a luz da divagem.

[045] Um substrato da grade de fios compreende uma segunda superfície oposta à primeira superfície e a disposição óptica é configurada para irradiar a segunda superfície do substrato com a luz de excitação e a luz da divagem. Em outras palavras, os substratos na disposição óptica são posicionados em relação uns aos outros, tal que a luz da divagem e a luz de excitação sejam diretamente direcionadas em direção à segunda superfície do substrato. Isto pode ser visto como uma radiação do substrato de retrocesso. Na superfície frontal, na primeira superfície, a estrutura regular do fio é apresentada pela grade de fios. Entre o fio de metal regular, isto é, nos espaços entre a grade de fios, a molécula, por exemplo, os fragmentos de DNA, é ligada ou imobilizada.

[046] O termo "luz de excitação" no contexto da presente invenção se aplica ao comprimento de onda ÀEXI, ÀEX2, ÀEX3 e ÀEX4, respectivamente. Consequentemente, para todos os quatro comprimentos de onda de excitação, o substrato assegura que o confinamento e a criação de uma onda evanescente da respectiva luz sejam gerados. Se desejado, mais ou menos fontes de luz e/ou rótulos fluorescentes podem ser usados sem se afastar da presente invenção.

[047] De acordo com outra realização exemplar da invenção, a reação de clivagem leva um tempo tuivagem, que depende de uma intensidade da luz da clivagem irradiada. Além disso, a incorporação de um segundo nucleotídeo na molécula ligada leva um tempo t incorporação. 0 dispositivo apresentado aqui compreende uma disposição óptica que é configurada e ajustada para prover a luz da clivagem irradiada com uma intensidade tal que tclivagem < tincorporação .

[048] A fotoclivagem deve apenas ocorrer naquelas moléculas que já são incorporadas e ligadas à superfície. A reação no volume levaria a reagentes desbloqueados que poderiam ser incorporados sem perceber e desta maneira introduzir erros nos resultados do sequenciamento. Portanto, é valioso apenas iluminar localmente por um curto período tornar a reação de clivagem rápida em comparação à taxa de incorporação de nucleotídeos pela enzima. 0 princípio prático da enzima e da porção de bloqueio já foi descrito acima. Aquela revelação se aplica dentro da realização exemplar descrita aqui. As realizações apresentadas permitem a sincronização da incorporação dos próximos nucleotídeos e asseguram que o sinal fluorescente detectado seja altamente confiável.

[049] O fato de que a luz da clivagem está em um modo evanescente com respeito ao substrato provê a vantagem que uma repetida exposição não leva a rótulos fluorescentes na solução os quais são alvejados e os quais perdem sua função. Em outras palavras, a realização apresentada evita tal alvejamento e perda de função de rótulos fluorescentes na solução.

[050] Para uma sincronização melhorada da incorporação de vários nucleotídeos em várias moléculas ligadas, a etapa de desbloqueio com a luz da clivagem deve ser realizada tão rápido quanto possível, isto é, com a mais alta intensidade da luz da clivagem possível. Isto pode ser alcançado ao focar a luz da clivagem, preferivelmente a luz UV, com uma lente e a varredura da superfície pela movimentação das lentes ou do substrato. A etapa de desbloqueio pode ser realizada após a leitura da etapa de sequenciamento. Esta leitura pode ser realizada pela varredura de um feixe ou etapa de foco e varredura com iluminação de campo. Também pode ser possível incorporar a luz da clivagem como um único clarão de, por exemplo, luz UV para a superfície total. Em vista da taxa de reação para a incorporação da base para a reação de sequenciamento, o tempo da iluminação da luz da clivagem local deve ser, por exemplo, abaixo de 1 minuto.

[051] De acordo com outra realização exemplar, o substrato compreende várias posições de ligação adjacentes para a ligação de moléculas para a primeira superfície ao longo da primeira direção. 0 dispositivo é ainda configurado para realizar uma varredura óptica pela movimentação do substrato e a disposição óptica relativa um ao outro ao longo da primeira direção. Além disso, o dispositivo é configurado para realizar a varredura óptica tal que cada posição de ligação é primeiramente irradiada com a luz de excitação de pelo menos o primeiro comprimento de onda ÀEXIe subsequentemente e em segundo lugar é irradiada com a luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL em um movimento ao longo da primeira direção.

[052] Em outras palavras, um acoplamento da luz da clivagem e da luz de excitação é apresentado que provê benefício adicional de leitura simultânea dos sinais fluorescentes e uso da reação de clivagem, tal que outros nucleotídeos possam ser incorporados. Isto é feito em um modo de varredura que pode prover alta intensidade local da radiação eletromgnética usada sem ter a necessidade de fonte de luz com alta energia. Nesta disposição, os feixes de luz focados da luz da clivagem e da luz de excitação são úteis. Nele a etapa de desbloqueio pode ser realizada após a leitura da etapa de sequenciamento. Em uma realização preferida, a leitura-varredura pode ser acoplada à varredura de desbloqueio pela integração de ambos os feixes de luz em um único acionador. Além disso, se desejado, mesmo uma única lente pode ser usada alinhando os dois feixes de luz. Duas lentes alternativas podem ser integradas em um único estágio ou dois estágios separados podem operar sincronamente. Isto também pode ser implementado em uma abordagem de leitura por varredura em uma etapa, na qual a etapa de clivagem também é realizada em uma etapa e modo de varredura pela irradiação da mesma região como a fonte de luz de excitação.

[053] Se desejado, o dispositivo apresentado é configurado para formar tal varredura óptica em um movimento contínuo ao longo do substrato. Nele uma varredura continua repetida é permitida. Assim, o dispositivo é configurado para primeiramente ler o primeiro nucleotídeo que é incorporado na molécula, por exemplo, um fragmento de DNA ou não e em segundo lugar é configurado para causar a reação de clivagem fotoquímica no nucleotídeo de leitura anterior no caso de ser incorporado na molécula.

[054] De acordo com outra realização exemplar da invenção, um método para o controle óptico do sequenciamento de DNA, em particular para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de ácido nucleico por síntese é apresentado. 0 método compreende uma etapa de provisão de um substrato com uma molécula ligado sobre uma primeira superfície do substrato, irradiação do substrato com a luz de excitação de pelo menos um primeiro comprimento de onda de excitação ÀExi por uma disposição óptica e dessa forma excitação óptica de um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo que é incorporado na molécula ligada sobre o substrato. 0 método ainda compreende uma etapa de confinamento da luz de excitação pelo substrato, dessa forma, provisão de uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato da primeira superfície do substrato. Como uma etapa adicional, o método define o recebimento e a detecção da fluorescência do rótulo fluorescente excitado do primeiro nucleotídeo incorporado pela disposição óptica. Além disso, a irradiação do substrato com a luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL, preferivelmente luz UV, pela disposição óptica e, dessa forma, a indução óptica de uma reação de clivagem fotoquímica no primeiro nucleotídeo incorporado é ainda compreendida. Um método ainda define uma etapa de confinamento da luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL pelo substrato, dessa forma, provisão de uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato.

[055] A porção de bloqueio e os rótulos fluorescentes podem ser clivados simultaneamente, por exemplo, no caso da porção de bloqueio compreender o rótulo fluorescente ou também pode ser clivado em diferentes etapas.

[056] Em outras palavras, o método apresentado provê uma irradiação seletiva da superfície da luz de excitação e da irradiação seletiva da superfície da luz da clivagem. Consequentemente, o método apresentado assegura que apenas o rótulo fluorescente incorporado nos nucleotídeos que são incorporados nas moléculas ligadas à primeira superfície do substrato, sejam opticamente excitados para emitir um sinal fluorescente. Tal sinal fluorescente de apenas o rótulo fluorescente que fecha a primeira superfície é então detectado pela disposição óptica. Isto intensifica a qualidade do sinal de fluorescência recebido e detectado. Adicionalmente, o método apresentado assegura que apenas rótulos fluorescentes sejam clivados fora dos nucleotídeos, que são incorporados nas moléculas ligadas à primeira superfície do substrato. Aqui, uma degradação da solução ou de uma porção compreendida nela, cuja solução é compreendida pelo dispositivo, pode ser evitada. Em outras palavras, a concentração eficaz dos nucleotídeos que podem ser usados para o processo de síntese não é intencionalmente diminuída.

[057] Assim, o método apresentado evita que os rótulos fluorescentes na solução sejam alvejados e percam sua função. Isto pode ainda reduzir os custos de um processo de determinação de uma sequência de um ácido nucleico como, por exemplo, um sequenciamento de DNA.

[058] De acordo com outra realização exemplar da invenção, um elemento do programa para o controle óptico de um sequenciamento de DNA, em particular para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese, que, ao ser executado por um processo, pode ser adaptado para realizar a irradiação de um substrato com a luz de excitação de pelo menos um primeiro comprimento de onda de excitação ÀExi por uma disposição óptica e, dessa forma, excitação óptica de um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo que é incorporado em uma molécula ligada sobre uma primeira superfície do substrato, confinamento da luz de excitação pelo substrato, dessa forma, provisão de uma onda evanescente da luz de excitação pelo substrato na primeira superfície do substrato, recebimento e detecção da fluorescência do rótulo fluorescente excitado do primeiro nucleotídeo incorporado pela disposição óptica, irradiação do substrato com a luz da clivagem de um comprimento de onda da clivagem ÀCL, preferivelmente a luz UV, pela disposição óptica e, dessa forma, indução óptica de uma reação de clivagem fotoquímica no primeiro nucleotídeo incorporado e o confinamento da luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL pelo substrato, dessa forma, provisão de uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato, é apresentada.

[059] De acordo com outra realização exemplar da invenção, um meio legível por computador, no qual um programa de computador para o controle óptico de um sequenciamento de DNA, em particular para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese é armazenado, o qual, ao ser executado por um processador, é adaptado para realizar a irradiação de um substrato com a luz de excitação de pelo menos um primeiro comprimento de onda de excitação ÀExi por uma disposição óptica e, dessa forma, excitação óptica de um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo que é incorporado em uma molécula ligada sobre uma primeira superfície do substrato, o confinamento da luz de excitação pelo substrato, dessa forma, a provisão de uma onda evanescente da luz de excitação pelo substrato na primeira superfície do substrato, o recebimento e detecção da fluorescência do rótulo fluorescente excitado do primeiro nucleotídeo incorporado pela disposição óptica, irradiação do substrato com a luz da clivagem de um comprimento de onda da clivagem ÀCL, preferivelmente a luz UV, pela disposição óptica e, dessa forma, indução óptica de uma reação de clivagem fotoquímica no primeiro nucleotídeo incorporado, e confinamento da luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL pelo substrato, dessa forma, provisão de uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato, é apresentada.

[060] O elemento do programa do computador pode ser parte de um programa de computador, mas ele também pode ser um programa inteiro em si. Por exemplo, o elemento do programa do computador pode ser usado para atualizar um programa de computador já existente para chegar à presente invenção. 0 meio legível por computador pode ser visto como um meio de armazenamento, tal como, por exemplo, um cartão USB, um CD, um DVD, um blue ray, um dispositivo de armazenamento de dados, um disco rígido ou qualquer outro meio, sobre o qual um elemento do programa como descrito acima pode ser armazenado.

[061] Pode ser visto como uma essência da invenção prover uma nova abordagem para a determinação de uma sequência de ácido nucleico. Assim, o sequenciamento pode ser realizado em um fluido único e no qual nenhuma etapa de lavagem é exigida. Com base no forte confinamento primeiramente da luz de excitação e em segundo lugar a luz da clivagem devido a um substrato correspondentemente configurado como, por exemplo, grade de fios, a reação de sequenciamento pode ser leitura sem lavagem da superfície. 0 sequenciamento em etapas é alcançado pelo uso de nucleotídeos com porções de bloqueio opticamente cliváveis, que são fixadas aos nucleotídeos na solução, que devem ser incorporadas nas moléculas que são ligadas à superfície do substrato. Após a leitura com a luz de excitação, que usa a fluorescência, os nucleotídeos embutidos ou incorporados são desbloqueados pela irradiação de luz da clivagem através do mesmo substrato. Isto assegura que somente nucleotídeos ligados sejam desbloqueados. Em outras palavras, o método e dispositivo da presente invenção são configurados para a incorporação em etapas ou opticamente induzida de nucleotídeos com uma sequência, que corresponde a uma sequência de nucleotídeos da molécula ligada. Além disso, o método e o dispositivo são configurados para ler em etapas e opticamente e determinar a sequência de nucleotídeos que são incorporados na molécula ligada. Além disso, o método e o dispositivo da presente invenção são configurados para fundamentar a determinação da sequência dos nucleotídeos incorporados na luz de fluorescência recebida e detectada respectiva emitida pelo rótulo fluorescente dos respectivos nucleotídeos incorporados.

[062] De acordo com outra realização exemplar, o uso de uma porção como uma porção de bloqueio no sequenciamento de DNA é apresentado em que a porção é escolhida do grupo compreendendo um derivado de nitrofeniletilo, análogo de 5- metil(2 -(2-nitrofenil)propil) carbonato-dUTP, análogo de 5- metil(2-oxo-1,2-difeniletil) carbonato-dUTP e qualquer combinação dos mesmos.

[063] O uso dos análogos de 5-metil(2-(2- nitrofenil)propil) carbonato-dUTP da porção de bloqueio no dispositivo do sequenciamento de DNA tem duas vantagens. Primeiramente, ele dá resíduos definidos menos reativos após a clivagem fotoquímica resultando em um processo mais claro. Em segundo lugar, ele tem uma alta taxa de reação. Comparado a outras moléculas fotocliváveis, as novas moléculas são derivadas da porção nitrofeniletilo que leva a fotoprodutos derivados de nitrobenzeno que são muito mais estáveis do que os compostos nitros gerados por fotoquímica das moléculas derivadas de nitrofenilmetila. Ainda mais, a geração de CO2 é uma força motriz e lava para aumentar eficientemente a velocidade de reação fotoquímica. Outra vantagem do uso de ditas porções de bloqueio no sequenciamento de DNA é demonstrada pelo fato de que a reação é concluída em intensidade da luz da clivagem muito baixa. Isto significa que a quantidade de energia necessária por ponto pode ser reduzida no dispositivo do sequenciamento de DNA. Os exemplos numerais serão dados posteriormente no context da figura 7 e figura 9.

[064] Estas e outras características da invenção tornar-se-ão aparentes de e são elucidados com referência às realizações descritas a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[065] As realizações exemplares da invenção serão descritas nos seguintes desenhos.

[066] A figura 1 mostra esquematicamente um dispositivo de acordo com uma realização exemplar da invenção.

[067] A figura 2 mostra esquematicamente um dispositivo de acordo com uma realização exemplar da invenção.

[068] As figuras 3a e 3b mostram esquematicamente um substrato que cria uma onda evanescente na região da molécula ligada usada em uma realização exemplar da presente invenção.

[069] A figura 4 mostra esquematicamente um dispositivo de acordo com uma realização exemplar da invenção.

[070] A figura 5 mostra um fluxograma de um método de acordo com uma realização exemplar da invenção.

[071] A figura 6 mostra esquematicamente duas porções de bloqueio.

[072] A figura 7 mostra esquematicamente um gráfico do curso de tempo de taxas de clivagem fotoquímica.

[073] A figura 8 mostra esquematicamente um processo de clivagem fotoquímico.

[074] A figura 9 mostra esquematicamente gráficos de fototransformação.

[075] A figura 10 mostra um processo de clivagem fotoquímico de análogos de 5-metil(2-oxo-l,2-difeniletil) carbonato-dUTP usados em uma realização exemplar da presente invenção.

[076] Em princípio, partes similares ou idênticas são providas com os mesmos símbolos de referência nas figuras.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES

[077] A figura 1 descreve um dispositivo 100 para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese. 0 dispositivo compreende um substrato 101 para a ligação de pelo menos uma molécula 102 na primeira superfície 103 do substrato. A molécula 102 que é ligada na primeira ou na superfície frontal 103 do substrato 101 pode, por exemplo, ser um fragmento de um DNA. Além disso, a disposição óptica 104 é mostrada na figura 1. A figura 1 mostra esquematicamente que a disposição óptica é configurada para direcionar a luz de excitação 110, por exemplo, do primeiro comprimento de onda de excitação ÀEXI para o substrato. Além disso, quarto diferentes nucleotídeos são esquematicamente mostrados e são descritos com sinais de referência 109, 116, 117 e 118. Por exemplo, um primeiro nucleotídeo 109 é mostrado como Timina, T. 0 nucleotídeo 109 compreende uma porção de bloqueio 119. Além disso, a porção de bloqueio 119 compreende o primeiro rótulo fluorescente 105. Em uma maneira análoga, o segundo nucleotídeo 116 é descrito esquematicamente na figura 1, da qual pode ser concluído que também uma porção de bloqueio 119 e o segundo rótulo fluorescente 106 é compreendido. 0 terceiro nucleotídeo 117 compreende também uma porção de bloqueio e um terceiro rótulo fluorescente 107. Adicionalmente, o quarto nucleotídeo 118 é descrito esquematicamente que compreende também uma porção de bloqueio e um quarto rótulo fluorescente 108. No entanto, a amostra 114 pode compreender uma pluralidade muito maior de tais nucleotídeos e nucleotídeos 109, 116, 117 e 118 são mostrados aqui meramente como uma descrição simbólica. Além disso, a figura 1 mostra uma solução 114 na qual os nucleotídeos e a enzima 115 são compreendidos. No caso de um dos quatro nucleotídeos mostrados ser incorporado na molécula ligada 102, o dispositivo apresentado 100 provê as seguintes vantagens. A disposição óptica é configurada para receber e detectar a luz de fluorescência emitida pelo rótulo fluorescente do primeiro nucleotídeo incorporado na molécula ligada 102.

[078] Como pode ser concluído da figura 1, a disposição óptica é configurada para direcionar a luz da clivagem 112 de comprimento de onda da clivagem ÀCL para o substrato. Isto permite induzir opticamente uma reação de clivagem fotoquímica no primeiro nucleotídeo incorporado para clivar a respectiva onda de fluorescência do primeiro nucleotídeo incorporado. Além disso, o substrato 101 é configurado para confinar a luz de excitação tal que uma onda evanescente da luz de excitação na primeira superfície do substrato é criada. Além disso, o substrato é configurado para confinar também a luz da clivagem tal que uma onda evanescente da luz da clivagem como a primeira superfície do substrato é criada. Isto também pode ser visto nas figuras 3a e 3b. Na realização da figura 1, o substrato é configurado como uma grade de fios 113 para a luz de excitação 110 e para a luz da clivagem 112. Portanto, a grade de fios 113 compreende um padrão regular, como, por exemplo, uma estrutura de fio de metal regular. Como pode ser concluído da figura 1, as aberturas tipo fenda são providas entre os padrões regulares, nos quais as aberturas das moléculas ligadas 102 são imobilizadas na primeira superfície 103 do substrato 101. Além disso, a figura 1 descreve uma unidade de processamento 120 que compreende um meio legível por computador 121 sobre o qual um elemento do programa do computador 122 é armazenado. 0 dito elemento do programa 122 é adaptado para instruir a unidade de processamento 120 para ainda instruir o dispositivo 100 para realizar o método descrito abaixo e acima para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese. 0 dispositivo 100 da figura 1 é configurado para induzir em etapas e opticamente a incorporação de nucleotídeos 109, 116, 117, 119 com uma sequência, que é complementar à sequência de nucleotídeos da molécula ligada 102. No caso da molécula 102 ser um fragmento de DNA, os nucleotídeos compreendidos pela amostra 114 são incorporados na molécula 102 em uma sequência que corresponde à sequência de nucleotídeo da molécula 102.

[079] O dispositivo é ainda configurado para fundamentar a determinação da sequência dos nucleotídeos incorporados na luz de fluorescência de resposta recebida e detectada emitida pelo rótulo fluorescente do respectivo nucleotídeo incorporado. Portanto, o dispositivo apresentado 100 da figura 1 assegura primeiramente que somente os nucleotídeos sejam de leitura pela luz de excitação 110, cujos nucleotídeos são incorporados na molécula ligada 102 pelo uso de uma onda evanescente da luz de excitação. Em segundo lugar, o dispositivo 100 da figura 1 assegura que somente os nucleotídeos ligados sejam desbloqueados pela luz da clivagem que evita o desbloqueio de nucleotídeos que ainda não estão contidos, isto é, incorporados pela molécula 102. Consequentemente, o sinal de fluorescência detectado 100 pode ser visto como a luz 111 que é altamente confiável para a determinação da sequência dos ácidos nucleicos.

[080] Consequentemente, o custo e a velocidade do sequenciamento de DNA realizado com o dispositivo 100 da figura 1 são ambos melhorados. Menos fluido é necessário visto que nenhuma etapa de lavagem é necessária. 0 dispositivo da figura 1 mostra uma simplificação e redução de custo de sequenciamento. 0 dispositivo apresentado 100 da figura 1 permite uma nova combinação de processo ao permitir uma leitura fácil com base no conjunto sem qualquer etapa de lavagem, significando um preenchimento com reagente único para todas as leituras. As porções de bloqueio usadas dentro dos nucleotídeos exemplares 109, 116, 117, 118 podem, por exemplo, ser um terminador reversível desbloqueado 3' fotoclivável. No entanto, também outras porções de bloqueio, usando, por exemplo, o impedimento estérico, pode ser usado para alcançar os efeitos desejados e descritos acima.

[081] Além disso, a disposição óptica 104 como mostrada na figura 1 pode ser configurada para prover a luz da clivagem irradiada com uma intensidade tal que o tempo da reação de clivagem tciivagem é menor do que o tempo que ela leva para incorporar o segundo nucleotídeo na molécula 102. Visto que o tempo da reação de clivagem tciivagem depende da intensidade da luz da clivagem irradiada, a figura 1 pode prover uma combinação selecionada de nucleotídeos com uma porção de bloqueio específica e uma configuração da disposição óptica referente à intensidade da luz da clivagem. Em outras palavras, a intensidade da luz da clivagem do dispositivo da figura 1 é adaptada tal que para a combinação usada de nucleotídeos e porções de bloqueio o tempo da reação de Clivagem tclivagem O menor dO que tincorporação .

[082] Se desejado, adicional ou alternativamente, a seguinte configuração do dispositivo 100 pode ser provida para o usuário. A residência pode ser vista como um tempo de residência médio e no ponto da luz da clivagem de um não nucleotídeo incorporado. Uma disposição óptica pode ainda ser configurada para prover a luz da clivagem irradiada com uma intensidade tal que tciivagem é menor do que tresidence. Consequentemente, nenhuma degradação de nucleotídeos livres e não ligados devido a uma reação de clivagem indesejada acontecer. Assim, pela configuração do dispositivo tal que tciivagem é menor do que tresidence a probabilidade de que um não nucleotídeo incorporado seja afetado pela clivagem é reduzida ou eliminada. Em outras palavras, para evitar as reações de clivagem no volume, o tempo de residência médio das moléculas no campo evanescente da grade de fios deve ser menor ou muito menor do que o tempo de reação exigido para a clivagem na intensidade pertinente. Com uma profundidade do campo evanescente da ordem de 25 nm ou menos e um coeficiente de difusão do nucleotídeo da ordem de le-10 m2/s, o tempo que ele leva para a molécula difundir em e fora do campo evanescente pode ser estimado como: (5e-8m)2/le-10 = 25 microssegundos. Dependendo do tempo de iluminação exigido para o desbloqueio das moléculas ligadas, a probabilidade de dano pode ser derivada. Assume-se um tempo de iluminação de 0,1 s, este seria de 1:4000, com um tempo de iluminação de 10 ms seria de 1:400, etc.

[083] Da mesma forma, do dano total é proporcional à fração de volume no campo evanescente sobre o volume total da solução reagente. Com uma altura de câmara de 100 pm a razão é 1:4000. Isto significa que no pior caso de dano, todas as moléculas no campo evanescente apenas 0,025% das moléculas será danificado. Com um comprimento de leitura de 100 finalmente 2,5 % das moléculas em solução seriam danificadas (pior caso) o que é ainda aceitável de um ponto de vista do sequenciamento.

[084] A seguir, a informação para o uso do dispositivo da figura 1, assim como os dispositivos 100 das figuras 2 e 4 é provida. Para uma sincronização melhorada, a etapa de desbloqueio deve ser realizada tão rápido quanto possível, isto é, com a maior intensidade possível. Isto pode ser conseguido ao focar a luz UV com uma lente e escanear a superfície pelo movimento da lente ou do substrato. A etapa de desbloqueio é realizada após a leitura da etapa de sequenciamento. Esta leitura pode ser realizada pela varredura de um feixe focado ou etapa e varredura com iluminação de campo. Em uma realização preferida, a verredura da leitura pode ser acoplada à varredura de desbloqueio pela integração de ambos os feixes de luz em um único acionador, possivelmente ainda em uma única lente ao alinhar os feixes de luz. Altemativamente, duas lentes podem ser integradas em um único estágio ou dois estágios separados podem parar sincronamente. Isto também pode ser implementado em uma abordagem de leitura da varredura e em uma etapa, na qual a etapa de UV também é realizada em um modo de varredura e em uma etapa pela iluminação do mesmo campo como o leitor. A realização preferida dependerá da fonte de luz UV disponível e sua energia. Pode-se também prever um único clarão de UV para a superfície total se energia suficiente estiver disponível e/ou a área da superfície de sequenciamento é limitada. Em vista da taxa de reação para a incorporação da base para a reação de sequenciamento, o tempo de iluminação UV local deve estar abaixo de 1 minuto.

[085] A figura 2 mostra um dispositivo 100 que é configurado para controlar opticamente uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese. Similar à figura 1, um substrato da grade de fios 113 é mostrado no qual uma pluralidade de moléculas 102 é imobilizada, isto é, são ligadas. Como pode ser visto da figura 2, um padrão regular 214 provê aberturas tipo fenda 215 nas quais as moléculas 202 são ligadas sobre a primeira superfície 203. 0 substrato compreende várias posições de ligação adjacentes 209, 210, 211 e 212 para a ligação de moléculas para a primeira superfície ao longo da primeira direção 213. As ditas posições de ligação podem ser vistas como pontos que podem ser cobertos com clones de moléculas idênticas, tal que o sinal óptico, que é gerado, pode ser aumentado. 0 substrato 101 então provê um disposto de tais pontos, isto é, de tais posições de ligação, com respectivamente diferentes clones. Isto pode intensificar o rendimento. Ambos os dispositivos 100 das figuras 1 e 2 permitem um sequenciamento de DNA com apenas um líquido, dessa forma, evitando a necessidade de prover etapas de lavagem nas quais o líquido da solução é alterado. Além disso, a disposição óptica 104 compreende cinco diferentes fontes de luz 201 a 205. As fontes de luz 201 para 204 podem ser vistas como fontes de luz de excitação a fim de prover quatro diferentes comprimentos de onda de excitação ÀExi para ÀEX4 como descrito anteriormente. A fonte de luz 205 provê luz da clivagem com um comprimento de onda ÀCL. Por exemplo, a fonte de luz 205 pode emitir a luz UV. 0 numeral de referência 206 descreve simbolicamente um dispositivo comutador que permite que a disposição óptica 104 comute entre os cinco comprimentos de ondas ÀEXIa ÀEX4 e ÀCL. Além disso, a luz emitida por pelo menos uma das ditas fontes de luz 201 para 205 é direcionada ao filtro de polarização 200. Além disso, um espelho dicrônico 207 é mostrado os qual transmite a luz emitida das fontes de luz 201 para 205 em direção ao substrato 101. Após um rótulo fluorescente ter sido excitado por uma onda evanescente da luz de excitação (pelo menos um dentre os comprimentos de ondas ÀEXIa ÀEX4) , os fótons de fluorescência emitidos pelo rótulo ou rótulos fluorescentes são direcionados ao espelho dicrônico 207 e são direcionados ao detector de fluorescência 208. Como pode ser visto da figura 2, a disposição óptica 104 pode ser escaneada ao longo da direção 213. Consequentemente, o dispositivo 100 da figura 2 é configurado para realizar uma varredura óptica ao mover o substrato 101 e a disposição óptica 104 em relação um ao outro ao longo da primeira direção 213. Consequentemente, o dispositivo permite realizar a varredura óptica tal que cada posição de ligação é primeiramente irradiada com a luz de excitação e subsequentemente e em segundo lugar é irradiada a luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem em um movimento ao longo da primeira direção 213. A etapa de desbloqueio, usando a luz da clivagem, pode assim ser realizada após a leitura da fluorescência dos nucleotídeos excitados incorporados.

[086] As figuras 3a e 3b mostram um substrato 101 que é incorporado como uma grade de fios 113. 0 padrão regular 214, que pode ser incorporado como uma estrutura de fio de metal regular provê quatro aberturas tipo fenda 215, nas quais as moléculas 112 são imolizadas. Como simbolizado pela seta, a luz de excitação 110 e a luz da clivagem 112 é direcionada ao substrato em direção à segunda superfície do substrato. A segunda superfície é oposta à primeira superfície 103 na qual as moléculas são ligadas. Consequentemente, a grade de fios é iluminada a partir de trás. Além disso, as figuras 3a e 3b mostram que vários nucleotídeos não ligados 109 estão presentes na solução que pode posteriormente ser incorporada na molécula 102 ligada sobre a primeira superfície. As figuras 3a e 3b descrevem a onda evanescente 300 entre as estruturas de metal com dimensões menores do que a resolução óptica no comprimento de onda do feixe de luz. A onda evanescente é descrita pela figura 3b por gradação de brilho que corresponde ao campo da gradação de intensidade. A figura 3b mostra a resistência do campo eletromagnético para uma grade de fios iluminada com a luz polarizada TE. 0 alto brilho indica uma alta intensidade e um baixo brilho indica uma baixa intensidade. 0 substrato apresentado aqui pode ser usado exemplarmente nos dispositivos das figuras 1 e 2 assim como no dispositivo da figura 4. No entanto, deve ser notado que o confinamento da superfície pelas ondas evanescentes pode ser alcançado de outras maneiras, que o técnico no assunto conhece.

[087] O reflexo interno total também pode ser usado a fim de prover a onda evanescente nesta ou em qualquer outra realização da invenção.

[088] A figura 4 mostra um dispositivo 100 para escanear continuamente o substrato 101. 0 dispositivo 100 provê uma disposição óptica 104 com uma fonte de luz 400 para a emissão da luz de excitação. Por meio de um filtro de cor 401 que pode ser girado, diferentes comprimentos de onda de excitação podem ser providos. Adicionalmente, uma fonte da luz de divagem 402 é provida. Os elementos de condução de luz 403, 404 são apresentados a fim de direcionar a luz para os respectivos elementos ópticos 405, 406. Como pode ser visto, lentes separadas e canais ópticos são usados para luz de excitação e para a luz da divagem. No entanto, se desejado, eles também podem ser combinados com os caminhos ópticos de3 ambas as fontes de luz. A disposição óptica 104 mostrada na figura 4 permite um movimento relativo entre o substrato 101 e a disposição óptica 104 na direção de 407.

[089] A figura 4 também pode compreender um espelho dicrônico configurado para transmitir a luz de excitação e é configurado para refletir a luz fluorescente emitida pelos rótulos fluorescentes usados. Além disso, o substrato pode ser configurado para transmitir apenas uma primeira polarização da luz e é configurado para refletir uma segunda polarização da luz que é polarizada perpendicular à primeira polarização. 0 filtro de polarização é configurado para transmitir apenas a primeira polarização da luz. 0 dispositivo da figura 4 é configurado para gerar dados que descrevem as sequências dos ácidos nucleicos que foram incorporados na molécula ligada com base na ação opticamente em etapas que é controlada opticamente pelo dispositivo.

[090] A figura 5 mostra um fluxograma de um método para o controle óptico de uma reação em etapas iterativa para determinar uma sequência de um ácido nucleico por síntese. 0 método compreende uma etapa de provisão de um substrato com uma molécula ligada sobre uma primeira superfície do substrato na etapa SI. Pela irradiação do substrato com a luz de excitação de pelo menos o primeiro comprimento de onda de excitação ÀExi por uma disposição óptica e, dessa forma, excitação óptica de um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo que é incorporado na molécula ligada sobre o substrato, é mostrada com a etapa S2. Além disso, a etapa S3 descreve uma etapa de confinamento da luz de excitação pelo substrato, dessa forma, provisão de uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato. 0 recebimento e a detecção da fluorescência do rótulo fluorescente excitado do primeiro nucleotídeo incorporado pela disposição óptica são apresentados pela etapa S4. A etapa S5 de irradiação do substrato com a luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL, preferivelmente a luz UV, pela disposição óptica e, dessa forma, indução óptica de uma reação de clivagem fotoquímica no primeiro nucleotídeo incorporado, é descrita com a etapa S5. Além disso, na etapa S6 o confinamento da luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL pelo substrato, dessa forma, a provisão da onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato é provida.

[091] Pela repetição das etapas SI a S6 do método apresentado, permite-se ao usuário determinar a sequência de ácido nucleico que foi incorporada na molécula ligada à primeira superfície do substrato. Consequentemente, após as etapas SI a S6, o usuário pode realizar, se desejado, as seguintes etapas. A incorporação de um segundo nucleotídeo na molécula ligada na primeira superfície do substrato; a seguir o bloqueio de uma atividade de uma enzima pelo segundo nucleotídeo após sua incorporação da molécula. A irradiação do substrato com a luz de excitação pela disposição óptica e, dessa forma, excitação óptica do rótulo fluorescente do segundo nucleotídeo incorporado pode ser realizada da mesma forma. 0 confinamento da luz de excitação pelo substrato, dessa forma, provendo a onda evanescente da luz de excitação pelo substrato na primeira superfície do substrato é uma etapa adicional deste ciclo secundário. A etapa de recebimento e detecção da fluorescência do rótulo fluorescente excitado do segundo nucleotídeo incorporado pode a seguir ser realizado. A irradiação do substrato com a luz da clivagem, preferivelmente a luz UV, pela disposição óptica e, dessa forma, opticamente e o uso de uma reação de clivagem fotoquímica no segundo nucleotídeo incorporado pode ser realizada da mesma forma. Como outra etapa para o confinamento da luz da clivagem pelo substrato, dessa forma, a provisão de uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato é apresentada.

[092] A figura 6 mostra porções de bloqueio de "Sequencing technologies, the next generation" by Michael L. Metzker, Nature Genetics 11 (2010) 31.Primeiramente, pelo uso de terminadores reversíveis bloqueados 3' e em segundo lugar pelo uso de terminadores reversíveis desbloqueados 3'. A segunda classe é muito interessante visto que neste caso a posição 3' da unidade de ribose é desbloqueada e a incorporação do próximo nucleotídeo é evitada pelo grupo volumoso que também contém o rótulo fluorescente fixado à porção de pareamento de base na posição 5' da unidade de ribose como pode ser visto na figura 6.

[093] A presente invenção pode usar a tecnologia da grade de fios e a etapa de desbloqueio é feita com, por exemplo, luz polarizada UV de 365 nm. Consequentemente, após esta etapa de desbloqueio o próximo nucleotídeo rotulado é incorporado e detectado pela varredura da grade de fios usando a luz polarizada tal que apenas os nucleotídeos rotulados no fragmento de DNA na superfície são detectados. Após isto ser feito, novamente pela provisão de uma etapa de desbloqueio usando a luz UV o próximo nucleotídeo rotulado pode ser incorporado em e detectado etc. Para este processo funcionar, pode ser necessário: 1. Um terminador reversível desbloqueado 3' fotoclivável, como co as variantes bloqueadas 3', a remoção dos grupos de bloqueio 3 (-N3 ou -CH2) tem que ser feita na fase 2. A fotorreação de clivagem deve ser mais rápida do que a incorporação de novos nucleotídeos pela polimerase. Os assim chamados terminadores desbloqueados OH 3' inventados por Metzker et al, a saber: 2-nitrobenzil alquilado HOMedU trifosfatos pode ser lento para este propósito em comparação a porções de bloqueio apresentadas posteriormente, vide a figura 8 a 10.

[094] A figura 7 mostra um gráfico do curso de tempo de taxas de clivagem fotoquímica de dU.I - dU.V incorporados no complexo de iniciador q rotulado com BODIPI- FL/oligoTemplate-4 usando o terminador polimerase. A figura 7 é tomada de V.A. Litosh, W. Wu, B.P. Stupi, J. Wang, S.E. Morris, M.N. Hersh, e M.L. Metzker, "Improved nucleotide selectivity and termination of 3'-OH unblocked terminators by molecular tuning of 2-nitrobenzyl alkilated HOMedU triphosfates", Nucl. Acids Res, Vol 36, issue 6, 2011, E39. Como pode ser visto claramente desta figura 7, a escala de tempo na qual o efeito de fotoclivagem ocorre está nas ordens de 10s. Ou como concluído por estes autores: "All 5-(2- nitrobenzyoxy)methyl-dUTP analogues were photo-chemically cleaved to 100% efficiency within 60s at 365 nm UV light exposure with an intensity of ~ 0,7W/cm2 in azide solution". Importantemente, estes autores também descobriram que o terminador polimerase continuou a mostrar boa atividade mesmo após ser exposto a 365 nm de luz UV por 150 min com intensidades de até lW/cm2.

[095] No entanto, esta química de fotoclivagem é mais lenta em relação ao que foi descoberto com as diferentes porções de bloqueio que foram usadas. A presente abordagem deve melhorar a reação de não ciclagem proposta aqui. Observe que as intensidades de luz necessárias na química por Metzker et al é lW/cm2 que translada para 10nW/(pm)2. Foi usada uma química usando uma porção como uma porção de bloqueio no sequenciamento de DNA, em que a porção é um derivado de nitrofeniletilo. Por exemplo, os análogos de 5-metil(2-(2- nitrofenil)propil) carbonato-dUTP, que têm duas vantagens: Primeiramente, ele dá resíduos definidos, menos reativos após a clivagem fotoquímica resultando em um processo mais claro. Em segundo lugar, ele tem uma taxa de reação maior como foi determinado independentemente (vide a figura 9).

[096] Em comparação às moléculas fotocliváveis descritas por Metzger, as novas moléculas são derivados da porção nitrofeniletilo que levam aos fotoprodutos derivados de nitrobenzene que são muito mais estáveis do que os compostos nitro gerados pela fotoquímica das moléculas de nitrofenilmetila derivadas de Metzger. Mais ainda, a geração de C02 é uma força motriz e limpa para aumentar eficientemente a velocidade da reação fotoquímica. Outra vantagem da presente química é demonstrada pelo fato de que a reação de divagem fotoquímica do composto 101 que é um ponto de vista fotoquímico muito similar à molécula da figura 8, se completa dentro de 30 minutos usando uma lâmpada PL10 em 10 cm que produz 4 mW/cm2. 0 composto 101 é descrito na figura 9 no fundo. Da mesma forma para dos dados vide a figura 9. Assim a reação é concluída mais lentamente que o exemplo dos compostos da referência citada acima, mas na intensidade 250x menor. Isto significa que a quantidade de energia necessária por ponto é 50 vezes mais lenta.

[097] A figura 9 mostra a eficiência da fototransformação sob 365 nm de luz do composto 101 (presentes dados). Observe que os espectros mudam após lh de espectro de absorção UV azul a rosa. B) o gráfico de evolução da reação fotoquímica pelo aumento do pico espectral a 319nm como uma função da excitação a 365 nm. Observe que estes dados em etanol mostram que a evolução está completa após 30 min. (e para 80% completo após 20 min) pela excitação com uma lâmpada PL10 a 10 cm que é equivalente a uma energia de 4 mW/cm2.

[098] Uma alternativa possível para os compostos nitro são os "análogos de 5-metil(2-oxo-l,2-difeniletil) carbonato-dUTP" mostrados na figura 10 que exibem também uma eficiente clivagem fotoquímica. Eles também podem ser usados como uma porção de bloqueio em qualquer realização da presente invenção, se desejado.

[099] Além disso, o seguinte composto pode ser usado como porção de bloqueio de acordo com a presente invenção:

[0100] As seguintes variações também podem ser usadas como porção de bloqueio de acordo com a presente invenção: o composto 1 com: X= O(CH2)nZ com n= número inteiro de 1 até 18 ou X = 0 (C2H4O) nCH2Z com n=número inteiro de 1 até 20 com Z=H ou um ligante conectado a uma porção fluorescente e 1= (CH2)nA com n= número inteiro de 0 até 18 ou I = 0(CH2)nA com n= número inteiro de 1 até 18 ou 0(C2H4O)nCH2A com n= número inteiro de 1 até 20 com A=H ou um ligante conectado a uma porção fluorescente, em tal combinação que pelo menos um dos grupos A ou Z tem um ligante conectado a uma porção fluorescente.

[0101] Além disso, o seguinte composto pode ser usado como porção de bloqueio de acordo com a presente invenção:

[0102] Sendo X e I independentemente (CH2)nZ com n= número inteiro de 1 até 18 ou (C2H4O)nCH2Z com n= número inteiro de 1 até 20 com Z=H ou um ligante conectado a uma porção fluorescente em tal combinação que pelo menos um dos grupos X ou Y tem um grupo Z que tem um ligante conectado a uma porção fluorescente.

[0103] Outras variações às realizações reveladas podem ser entendidas e efetuadas pelos técnicos no assunto na prática da invenção reivindicada, a partir do estudo dos desenhos, da descrição e das reivindicações em anexo. Nas reivindicações, a palavra "compreendendo" não exclui outros elementos ou etapas e o artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui uma pluralidade. Um processador único ou outra unidade pode cumprir as funções de vários itens ou etapas recitados nas reivindicações. 0 mero fato de que certas medidas são recitadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes não indica que uma combinação destas medidas não pode ser usada com vantagem. Um programa de computador pode ser armazenado/distribuído em um meio adequado tal como um meio de armazenamento óptico ou um meio no estado sólido fornecido com ou como parte de outro hardware, mas também pode ser distribuído em outras formas, tais como por meio da Internet ou outros sistemas de telecomunicação com fio ou sem fio. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser construídos como limitando o escopo das reivindicações.

Claims

1. DISPOSITIVO PARA O CONTROLE ÓPTICO DE UMA REAÇÃO EM ETAPAS ITERATIVA PARA DETERMINAR UMA SEQUÊNCIA DE UM ÁCIDO NUCLEICO POR SÍNTESE, sendo o dispositivo caracterizado por compreender: - um substrato para a ligação de pelo menos uma molécula sobre uma primeira superfície do substrato; - uma disposição óptica, em que a disposição óptica é configurada para emitir a luz da clivagem de um comprimento de onda da clivagem ÀCL, em que a luz de clivagem é luz polarizada, em que a disposição óptica é configurada para direcionar luz de excitação de pelo menos um primeiro comprimento de onda de excitação ÀExi para o substrato para excitar um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo, em que o primeiro nucleotídeo é incorporado na incorporado na molécula ligada sobre a primeira superfície do substrato, em que a disposição óptica é configurada para receber e detectar a luz fluorescente emitida pelo rótulo fluorescente do primeiro nucleotídeo; em que a disposição óptica é configurada para direcionar a luz da clivagem de um comprimento de onda da clivagem ÀCL para o substrato para induzir opticamente uma reação de clivagem no primeiro nucleotídeo para clivar uma porção de bloqueio e o rótulo fluorescente fora do primeiro nucleotídeo, em que o substrato é configurado para confinar a luz de excitação, em que o substrato é configurado para prover uma onda evanescente da luz da excitação na primeira superfície do substrato, em que o substrato é configurado para confinar a luz de clivagem, em que o substrato é configurado para prover uma onda evanescente da luz da clivagem na primeira superfície do substrato, em que a onda evanescente da luz de clivagem induz a reação de divagem, e em que o substrato compreende uma grade de fios incluindo fios que são opacos.

2. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma solução com uma pluralidade de nucleotídeos e uma enzima, em que os nucleotídeos respectivamente compreendem uma porção de bloqueio, em que a porção de bloqueio é configurada para bloquear a atividade sintética da enzima quando o respectivo nucleotídeo é incorporado na molécula ligada, à primeira superfície.

3. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela porção de bloqueio ser um terminador reversível não bloqueado 3' fotoclivável.

4. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela porção de bloqueio ser escolhida do grupo compreendendo um derivado de nitrofeniletilo, análogo de 5- metil(2-(2-nitrofenil)propil) carbonato-dUTP, análogo de 5- metil(2-oxo-l,2-difeniletil) carbonato-dUTP e qualquer combinação dos mesmos.

5. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela reação de divagem levar um tempo tclivagem, em que o tempo da reação de clivagem tciivagem depende da intensidade da luz da clivagem irradiada, em que a incorporação de um segundo nucleotídeo na molécula ligada leva um tempo tincorporação e; em que a disposição óptica é configurada para prover a luz da clivagem irradiada com uma intensidade tal que tclivagem < tincorporação .

6. DISPOSITIVO, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo substrato compreender várias posições de ligação adjacentes para a ligação de moléculas à primeira superfície ao longo de uma primeira direção, em que o dispositivo é configurado para realizar uma varredura óptica implementando um movimento relativo entre o substrato e a disposição ótica ao longo da primeira direção, e em que o dispositivo é configurado para realizar a varredura óptica tal que cada posição de ligação é primeiramente irradiada com a luz de excitação de pelo menos o primeiro comprimento de onda ÀExi e, subsequentemente, e em segundo lugar irradiada com a luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL em um movimento ao longo da primeira direção.

7. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dispositivo ser configurado para induzir opticamente e em etapas a incorporação de nucleotídeos com uma sequência, que é complementar a uma sequência de nucleotídeos da molécula ligada, em que o dispositivo é configurado para ler opticamente e em etapas e determinar a sequência de nucleotídeos que é incorporada na molécula ligada e; em que o dispositivo é configurado para fundamentar a determinação da sequência dos nucleotídeos incorporados na respectiva luz fluorescente recebida e detectada emitida pelo rótulo fluorescente do respectivo nucleotídeo incorporado.

8. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela grade de fios formar aberturas do tipo fenda, em que cada uma das aberturas do tipo fenda tem um tamanho menor que ÀCL/2NA, e em que NA é a abertura numérica da respectiva abertura.

9. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela grade de fios formar uma pluralidade de aberturas e em que a pelo menos uma molécula é disposta dentro de pelo menos uma das ditas aberturas durante a reação de clivagem.

10. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela pluralidade de aberturas serem aberturas do tipo fenda, em que cada uma das aberturas do tipo fenda tem um tamanho que é menor que ÀCL/2NA, e em que NA é a abertura numérica da respectiva abertura de tipo fenda.

11. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela grade de fios ser configurada para refletir a luz de clivagem e transmitir luz tendo uma polarização que é diferente de uma polarização da luz de clivagem.

12. MÉTODO PARA 0 CONTROLE ÓPTICO DE UMA REAÇÃO EM ETAPAS ITERATIVA PARA DETERMINAR UMA SEQUÊNCIA DE UM ÁCIDO NUCLEICO POR SÍNTESE, o método caracterizado por compreender as etapas de: - provisão de um substrato com uma molécula ligada sobre uma primeira superfície do substrato, - irradiação do substrato com a luz de excitação de pelo menos um primeiro comprimento de onda de excitação ÀEXI por uma disposição óptica e, dessa forma, excitação óptica de um rótulo fluorescente de um primeiro nucleotídeo, em que o primeiro nucletídeo é incorporado na molécula ligada sobre o substrato, - confinamento da luz de excitação pelo substrato, dessa forma, provendo uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato, - recebimento e detecção da fluorescência do rótulo fluorescente excitado do primeiro nucleotídeo pela disposição óptica, - irradiação do substrato com a luz da clivagem de um comprimento de onda da clivagem ÀCL, pela disposição óptica e, dessa forma, indução óptica de uma reação de clivagem no primeiro nucleotídeo, em que a luz de clivagem é luz polarizada, e - confinamento da luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL pelo substrato, dessa forma, provendo uma onda evanescente da luz da clivagem pelo substrato na primeira superfície do substrato, em que a onda evanescente da luz de clivagem induz a reação de divagem e em que o substrato compreende uma grade de fios incluindo fios que são opacos.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender as etapas: -provisão de uma solução com uma pluralidade de nucleotídeos e uma enzima, em que os nucleotídeos compreendem respectivamente uma porção de bloqueio que compreende o rótulo fluorescente, o bloqueio de uma atividade de síntese da enzima pela porção de bloqueio quando o respectivo nucleotídeo é incorporado na molécula ligada à primeira superfície, e em que a etapa de induzir uma reação de clivagem é realizada tal que a porção de bloqueio compreendendo o rótulo fluorescente é clivada fora do nucleotídeo incorporado.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela porção de bloqueio ser escolhida do grupo compreendendo um derivado de nitrofeniletilo, análogo de 5- metil(2-(2-nitrofenil)propil) carbonato-dUTP, análogo de 5- metil(2-oxo-1,2-difeniletil) carbonato-dUTP e qualquer combinação dos mesmos.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo substrato compreender várias posições de ligação da molécula adjacente nas quais uma molécula é respectivamente ligada à primeira superfície com uma primeira direção; - o método adicionalmente compreendendo as etapas de: realização de uma varredura óptica implementando uma movimentação relativa entre o substrato e da disposição óptica ao longo de uma primeira direção, e realização da varredura óptica tal que cada molécula ligada é primeiramente irradiada com a luz de excitação de pelo menos o primeiro comprimento de onda de excitação ÀExi e subsequentemente irradiada com a luz da clivagem do comprimento de onda da clivagem ÀCL em um movimento ao longo da primeira direção.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela reação de clivagem levar um tempo tciivagem, em que o tempo da reação de clivagem tciivagem depende da intensidade da luz da clivagem irradiada, o método compreendendo adicionalmente a etapa de: incorporação de um segundo nucleotídeo na molécula de DNA ligada, em que a incorporação leva um tempo tincorporação; e seleção da intensidade da luz da clivagem irradiada na disposição optica tal que a tciivagem <tincorporação.