JP4307815B2 - 共焦点レーザ走査型顕微鏡装置及びそのプログラム - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型顕微鏡装置に適用される技術に関し、特に観察試料上の所望の領域についての長時間の時系列変化を観察するのに好適な技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、走査型顕微鏡装置として、光源からのレーザ光を対物レンズにより微小なスポットに絞り、このスポットによって観察試料上を走査し、観察試料からの光（例えば、透過光、反射光、又は蛍光等）をフォトマルチプライヤ等の光電変換器及びＡ／Ｄコンバータを通して電気信号に変換し、画像モニタ上に観察画像を表示する共焦点レーザ走査型顕微鏡装置が知られている。
【０００３】
従来、このような共焦点レーザ走査型顕微鏡装置は、細胞やその組織等の三次元的な構造や形能を観察する手段として広く用いられている。
また、近年においては、電動ＸＹステージや電動準焦部等も組み合わされて、細胞組織の時系列変化を解析する手段として用いられるようになってきた。
【０００４】
このような細胞組織の時系列変化の解析に係る技術については種々のものがある。例えば、特許文献１には、共焦点顕微鏡を用いて、反応の早い細胞の状態等といった試料の三次元的な時間変化を観察するのに好適な試料観察方法が提案されている。また、その他、予め試料上の複数の注目領域（観察領域）が登録され、その登録された順番に従って、一定の時間間隔毎、或いは一定の回数毎に、その注目領域の画像取得が繰り返し行われることによって、試料の時系列変化の観察が行われるものもある。
【０００５】
しかしながら、このような観察試料の時系列変化の観察は長時間に渡って行われるため、光源等といった熱を生じさせる構成や環境温度の変化等によって顕微鏡本体が高温になり、熱膨張による顕微鏡のたわみが生じて、それによって焦点位置（観察位置となるＺ方向の位置）がずれてしまい、取得した画像がぼけてしまうという問題があった。従って、観察者は、焦点位置がずれたままで画像が取得されないように、定期的に画像をチェックしたり、その焦点位置のずれに備えて待機したり、等していなければならず、観察者の負担は大きかった。
【０００６】
そこで、このような問題を解決すべく、例えば特許文献２には、鏡基にミラーを取り付けることによって、ランプハウス等から放射される赤外光を反射して、輻射熱による鏡基の加熱を防ぎ、鏡基が熱膨張されるのを防止した顕微鏡が提案されている。
【０００７】
また、例えば特許文献３には、光学顕微鏡を外気に対して遮断する容器を設け、光学顕微鏡がその容器外の温度変化の影響を受けないようにした光学顕微鏡システムが提案されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平０６−０２７３８３号公報
【特許文献２】
特開平０７−１７４９７９号公報
【特許文献３】
特開平１１−２１１９８７号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前述の特許文献２の提案によれば、鏡基の形状に応じてミラーを設けなければならず、また、前述の特許文献３の提案によれば、収納される構成に応じて容器を設けなければならない。従って、これらの提案によれば、それらの設計、製造、組立て等に係る工数の増加や製品のコストアップ等といった問題が生じてしまう。
【００１０】
また、その他、観察試料の時系列変化の観察では、観察試料上の各注目領域への移動が頻繁に行われることにより蓄積されたＺ方向の移動誤差の影響によってＺモータ（焦点位置をＺ方向に移動させるモータ）の絶対位置がずれることによっても、前述の焦点位置のずれが生じる問題があった。また、取り付けられたステージ等の重みによる顕微鏡本体のたわみによっても、焦点位置のずれが生じる問題があった。
【００１１】
本発明の課題は、上記実情に鑑み、観察試料の長時間の時系列変化を観察する際に、観察位置となるＺ方向の位置ずれを補正してボケの無い画像を取得することができる、共焦点レーザ走査型顕微鏡及びそのプログラムを提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様は、ステージに載置された観察試料上にスポット光を走査させ、該観察試料からの光を光電変換部及びＡ／Ｄ変換部により電気信号に変換して、画像モニタ上に画像情報を表示することによって観察画像を得る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置であって、焦点位置をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動させる電動準焦部と、少なくとも前記観察試料上の所望の位置及び参照点の位置に係る試料位置情報を、前記電動準焦部の位置情報によるＸＹＺの三次元情報として記憶・管理する試料位置情報管理手段と、前記参照点において前記光電変換部により得られた電気信号に基づいて前記電動準焦部のＺ位置を補正するＺ位置補正手段と、を備え、前記試料位置情報のうちＺ位置情報は、前記参照点の高さを基準位置とした相対量として前記試料位置情報管理手段によって記憶・管理される、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置である。
【００１３】
上記の構成によれば、試料位置情報のＺ位置情報は、参照点の高さ位置を基準位置とした相対量として記憶・管理されるので、たとえ電動準焦部のＺ位置にずれが生じていたとしても、参照点の高さ位置である基準位置からの相対量は変化しないので、必要に応じて参照点の高さ位置を取得し、その高さ位置に相対量を加えた位置へ移動させることによって、観察位置となるＺ 方向の位置ずれが補正され、ボケの無い画像を取得することが可能になる。また、この構成によれば、観察試料上の複数の所望の位置の時系列変化を観察する場合においても、ボケの無い画像を取得することが可能になる。
【００１４】
本発明の第二の態様は、上記第一の態様において、前記Ｚ位置補正手段は、前記参照点となる、前記観察試料の特定の表面或いは前記観察試料に固定的に配置された部材の特定の表面からの光が光電変換されて得られた電気信号に基づいて取得した前記参照点の高さである基準位置に基づいて前記電動準焦部のＺ位置を補正する、構成である。
【００１５】
この構成によれば、基準位置は、参照点である、観察試料の特定の表面或いは観察試料に固定的に配置された部材（例えばミラー部材等）の特定の表面からの光に基づいて取得される。尚、参照点は、レーザによる退色などの影響を受けず、常に同じ画像の取得が可能な特定の表面であることが望ましい。
【００１６】
本発明の第三の態様は、上記第一又は第二の態様において、前記参照点のＸＹ位置が、画像取得を行う前記所望の位置のＸＹ位置と同じである、構成である。
【００１７】
本発明の第四の態様は、ステージに載置された観察試料上にスポット光を走査させ、該観察試料からの光を光電変換部及びＡ／Ｄ変換部により電気信号に変換して、画像モニタ上に画像情報を表示することによって観察画像を得る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を制御するコンピュータに、電動準焦部をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動させる機能と、少なくとも観察試料上の所望の位置及び参照点の位置に係る試料位置情報を、前記電動準焦部の位置情報によるＸＹＺの三次元情報として記憶・管理すると共に、前記試料位置情報のＺ位置情報を、前記参照点の高さを基準位置とした相対量として記憶・管理する機能と、前記所望の位置における観察画像の取得を行う前に、前記参照点において前記光電変換部から得られる電気信号に基づいて前記参照点の高さを前記基準位置として取得し、該取得した基準位置に基づき、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能と、を実現させるためのプログラムである。
【００１８】
上記のプログラムを、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を制御するコンピュータに実行させることによって、試料位置情報のＺ位置情報が、参照点の高さを基準位置とした相対量として記憶・管理されるようになるので、たとえ電動準焦部のＺ位置にずれが生じていたとしても、参照点の高さ位置である基準位置からの相対量は変化しないので、所定のタイミング等で参照点の高さ位置を取得し、その高さ位置に相対量を加えた位置へ移動させることによって、観察位置となるＺ方向の位置ずれが補正され、ボケの無い画像を取得することが可能になる。
本発明の第五の態様は、上記第四の態様において、前記所望の位置が複数設定されている場合に、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能を、前記所望の位置のそれぞれにおける画像取得を行う前に実行する、構成である。
本発明の第六の態様は、上記第四の態様において、前記所望の位置が複数設定されている場合に、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能を、前記複数の所望の位置における画像取得の１サイクルを開始する前に実行する、構成である。
本発明の第七の態様は、上記第四の態様において、前記所望の位置が複数設定され、当該所望の位置に対して時系列的に複数回の画像取得を行う場合に、第１の所望の位置から第２の所望の位置への移動中に前記光電変換部から得られる電気信号に基づく輝度値を、前回の画像取得時における前記第１の所望の位置から前記第２の所望の位置への移動中に前記光電変換部から得られた電気信号に基づく輝度値と比較し、両者の差異が所定値以上であった場合にだけ前記電動焦準部のＺ位置を補正する機能を実行する、構成である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の第一の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の構成例を示した図である。
【００２０】
同図において、共焦点レーザ走査型顕微鏡本体１（以下、単に顕微鏡本体１という）には、コンピュータ２が接続されている。また、このコンピュータ２には、操作パネル３、レーザ装置４、及び画像モニタ５が接続されている。
顕微鏡本体１において、レーザ装置４から入射されたレーザ光は、励起用ダイクロイックミラー１０１で反射され、走査ユニット１０２に入射される。走査ユニット１０２は、Ｘ軸方向走査用のガルバノメータミラーとＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーとを有し、レーザ装置４からのレーザ光をコンピュータ２からの走査制御信号に基づいてＸＹ走査すると共に、Ｘ軸方向走査による１ラインの走査毎に走査制御終了信号をコンピュータ２に出力する。
【００２１】
また、走査ユニット１０２によってＸＹ軸方向に走査されたレーザ光は、レボルバ１０３に取り付けられた対物レンズ１０４を介して、ステージ１０５上に載置された観察試料１０６上にスポット光として照射される。このスポット光による観察試料１０６からの光、例えば反射光又は観察試料１０６から発生した蛍光は、入射光路に戻され、励起用ダイクロイックミラー１０１を透過してダイクロイックミラー１０７によって反射され、レンズ１０８により集光される。このレンズ１０８による集光位置にはコンフォーカルアパーチャ１０９が配置され、共焦点光学系が形成されている。このコンフォーカルアパーチャ１０９を通過した光は、更にバリアフィルタ１１０により波長が限定され、観察者が期待する波長の光だけが、フォトマルチプライヤなどの光電変換器１１１に入力されるようになっている。また、光電変換器１１１に入力された光は、アナログ電気信号に変換され、更にコンピュータ２においてＡ／Ｄ入力ＣＨ２ｂによってデジタル電気信号に変換されてメモリ２ｃに記憶され、画像情報として画像モニタ５に出力されるようになっている。
【００２２】
このような構成において、ステージ１０５は、コンピュータ２の制御の基にＸＹ方向に移動可能な電動ステージである。また、レボルバ１０３或いはステージ１０５は、コンピュータ２の制御の基に不図示のＺモータによってＺ方向に移動可能な電動準焦部である。これらの構成により、コンピュータ２の制御によって対物レンズ１０４の焦点位置をＸＹＺ方向に移動させることが可能になる。
【００２３】
また、操作パネル３は、キーボードの他、トラックボール、ジョイスティック、或いはマウス等のポインティングデバイスを有しており、観察者の指示によりコンピュータ２に対し、レーザ光の走査開始指示信号、画像入力指示信号、及び光電変換器１１１に対する感度の調整指示信号、等といった各種の指示信号を出力可能に構成されている。
【００２４】
また、コンピュータ２は、前述のＡ／Ｄ入力ＣＨ２ｂ及びメモリ２ｃの他、計算・処理部（ＣＰＵ）２ａ、不図示の内部メモリに記憶されているプログラム２ｄ、及び後述する観察試料１０６上の注目領域や参照領域の位置情報（試料位置情報）及びＺ方向の基準位置（Ｚｒ）に関する情報等が記憶（登録）される不図示のメモリ等を備えており、本レーザ走査型顕微鏡装置全体の動作を制御するものである。例えば、操作パネル３からの走査開始指示信号が入力されると、対応する走査制御信号を走査ユニット１０２へ出力し、また光電変換器１１１からの観察試料１０６に応じたアナログ電気信号が入力されると、それをデジタル電気信号（デジタルデータ）に変換してメモリ２ｃに転送する。また、メモリ２ｃに転送されたデジタルデータに基づく画像や操作メニュー等を画像モニタ５に表示する。また、操作パネル３から入力された感度調整指示信号に応じて、光電変換器１１１に対する印加電圧（ＨＶ値）、ゲイン値、及びオフセット値等の設定を行う、等といった制御処理を行う。
【００２５】
このような、操作パネル３からの各種の指示信号に応じた走査ユニット１０２の制御、レーザ光源装置４から顕微鏡本体１へのレーザ入射の制御、及びメモリ２ｃに転送されたデジタルデータの画像モニタ５への出力制御、等といったコンピュータ２によって行われる本レーザ走査型顕微鏡装置の各種の制御は、計算・処理部２ａがプログラム２ｄを読み出し実行することによって実現されるものである。
【００２６】
次に、このような構成のレーザ走査型顕微鏡装置において、観察試料１０６上の複数の注目領域（観察領域，測定領域）の時系列変化を観察する際に行われる画像取得処理について説明する。
図２は、本実施形態において画像取得が行われる、観察試料１０６上の４つの注目領域等の一例を示した図である。
【００２７】
同図において、観察試料１０６は、スライドガラス１０６ａ上にサンプル１０６ｂが載せられ、そのサンプル１０６ｂ上にカバーガラス１０６ｃが載せられて構成されている。
このような観察試料１０６上の２−１、２−２、２−３、２−４の４つの領域は、本画像取得処理において後に注目領域として登録される領域である。また、２−Ｒの領域は、本画像取得処理において後に参照領域として登録される領域である。尚、参照領域とは、観察試料１０６上内であってレーザによる退色などの影響を受けず、常に同じ画像の取得が可能な注目領域以外の領域のことをいう。例えば、反射光を十分に得るために、観察試料１０６上にミラー部材を固定的に配置して、そのミラー部材上の所定領域を参照領域としても良い。
【００２８】
本実施形態では、このような観察試料１０６上の２−１、２−２、２−３、２−４の４つの注目領域の時系列変化を観察する際に行われる画像取得処理を例に説明する。
本画像取得処理では、まず、前述の参照領域２−Ｒの登録が行われる。すなわち、参照領域２−Ｒに係る位置情報（三次元情報，ＸＹＺ座標情報）が、対応する電動準焦部の位置情報として登録される。尚、本実施形態では、スライドガラス１０６ａ上の表面が参照領域２−Ｒとして登録されるものであるが、カバーガラス１０６ｃ上の表面等が参照領域とし登録されるものであっても良い。
【００２９】
続いて、電動準焦部が、前述の参照領域２−Ｒに係る位置情報に基づいて、観察試料１０６の参照領域２−Ｒ上に移動され、その参照領域２−Ｒ上において、レーザによる反射光等が観察されながら電動準焦部（レボルバ１０３或いはステージ１０５）がＸＹＺ方向に移動される等して、参照領域２−Ｒの各点において、輝度情報（輝度値）とＺ方向の位置（Ｚ位置）との関係（以下、Ｉ−Ｚカーブという）が求められ、そのＩ−Ｚカーブのピーク値にあたるＺ位置が求められる。そして、その各点において求められたピーク値にあたるＺ位置の平均値が、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）として登録される。尚、このＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を次のようにして求めても良い。例えば、Ｉ−Ｚカーブを求めるときに、参照領域２−ＲのＸ−Ｙ平面内の各点の輝度情報をＺ位置ごとに平均化することにより、参照領域全体としてのひとつのＩ−Ｚカーブを求め、ここからピーク値を算出してＺ方向の基準位置（Ｚｒ）とするようにしても良い。
【００３０】
図３は、前述の参照領域２−Ｒの各点においてピーク値にあたるＺ位置を取得するための処理の一例を示したフローチャートである。
同図において、まず、Ｓ３０１では、参照領域２−Ｒ上の測定開始点となる点の測定開始位置へ電動準焦部が移動される。例えば、このときに電動準焦部は１００μｍ程度、観察試料１０６から離れた位置へ移動される。尚、このＺ方向の測定開始位置は、対物レンズ１０４の作動距離（ＷＤ：ワークディスタンス）等を考慮して適宜設定されることが望ましい。
【００３１】
Ｓ３０２では、参照領域２−ＲにおけるＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を求めるために、所定のゲイン値、オフセット値、及びコンフォーカルアパーチャ径等が設定される。
Ｓ３０３では、バリアフィルタ１１０が空フィルタに切り替えられる（セットされる）。バリアフィルタ１１０は、コンフォーカルアパーチャ１０９を通った光の波長の中から、観察に適した波長の光のみを抽出するために使用されるものであるが、本ステップのように、これが空フィルタに切り替えられることによって、より多くの光が光電変換器１１１に入力されるようになり、輝度変化の検出が容易になる。
【００３２】
Ｓ３０４では、輝度値の計測が開始される。
Ｓ３０５では、実際に、現在の電動準焦部のＺ位置における輝度値の計測が行われ、そのＺ位置における輝度値が取得される。
Ｓ３０６では、前ステップの輝度値の計測において、光電変換器１１１のＰＭＴオーバーが検出されたか否か、すなわち、光電変換器１１１に入力された光がその光電変換器１１１の受光容量を超えたか否かが判定され、その判定結果がＹｅｓの場合にはＳ３１１へ処理が進み、Ｎｏの場合にはＳ３０７へ処理が進む。
【００３３】
Ｓ３０７では、計測が一次停止される。
Ｓ３０８では、Ｓ３０２で設定されたゲイン値が更に下げられる。これにより、ＰＭＴオーバーが防止される。尚、ゲイン値の変わりにＨＶ値を更に下げるようにしても良い。
【００３４】
Ｓ３０９では、計測位置となる電動準焦部のＺ位置が、数単位移動ステップ分（例えば数μｍ程度）、戻される。
Ｓ３１０では、計測再開命令が発せられて計測が再開され、Ｓ３０５へ処理が戻る。
【００３５】
Ｓ３１１では、現在の測定位置が測定終了位置であるか否かが判定され、その判定結果がＹｅｓの場合にはＳ３１２へ処理が進み、Ｎｏの場合にはＳ３１３へ処理が進む。
Ｓ３１２では、電動準焦部が単位移動ステップ分移動されることによって次の計測位置（Ｚ位置）へ移動され、Ｓ３０５へ処理が戻る。
【００３６】
Ｓ３１３では、計測が終了する。
Ｓ３１４では、取得された各Ｚ位置における輝度値の中からピーク値が取得されて、そのピーク値にあたるＺ位置が取得される。但し、Ｓ３０６の処理においてＰＭＴオーバーが検出されたときには、最後にＰＭＴオーバーが検出された以降に取得された輝度値の中からピーク値が取得され、そのピーク値にあたるＺ位置が取得される。そして、本フローが終了する。
【００３７】
以上、本フローが実行されることによって、測定開始位置から測定終了位置までの単位移動ステップ毎の各Ｚ位置における輝度値が取得され、その各Ｚ位置における輝度値に基づいて、ピーク値にあたるＺ位置が取得される。
図４は、そのようにして取得された各Ｚ位置における輝度値の関係を示したＩ−Ｚカーブの一例を示した図である。同図において、縦軸は輝度値（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、横軸はＺ位置（Ｚ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示している。
【００３８】
同図に示した例においては、各Ｚ位置における輝度値の中からピーク値にあたるＺ位置として、Ｚｐが取得されるようになる。
このようにして、参照領域２−Ｒ上の各点について、ピーク値にあたるＺ位置が求められると、その各点についてのピーク値にあたるＺ位置の平均値が求められ、その平均値がＺ方向の基準位置（Ｚｒ）として登録される。
【００３９】
尚、本実施形態では、二次元領域である参照領域２−Ｒの各点からＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を求めるようにしているが、例えば、その参照領域２−Ｒを、二次元領域としてではなく、一次元領域として或いは一点として、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）を求めるようにしても良い。このようにすることで、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得に係る処理を、より短時間で行うことができる。また、注目領域についても二次元領域としてではなく、一次元領域として或いは一点としても良い。
【００４０】
続いて、観察試料１０６上の複数の注目領域２−１乃至２−４（図２参照）が登録される。すなわち、各注目領域の位置情報（三次元情報，ＸＹＺ座標情報）が、対応する電動準焦部の位置情報として登録される。但し、登録された各注目領域の位置情報のうちＺ座標情報については、参照領域２−Ｒにおいて取得されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ）からの相対量（相対距離）（Ｌ１、Ｌ２、・・・）として登録される。例えば、所定の注目領域のＺ座標情報がＺであるときに、登録される相対量Ｌは、Ｚ−Ｚｒになる。そして、以降、注目領域において電動準焦部がＺ方向へ移動されるときには、そのときに登録されている、Ｚ方向の基準位置Ｚｒ＋相対量Ｌに応じて、電動準焦部が移動されるようになる。
【００４１】
このようにして、参照領域２−Ｒの位置情報、参照領域において取得されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ）、及び注目領域２−１乃至２−４の位置情報が登録されると、実際に注目領域２−１乃至２−４の時系列変化の観察に係る画像取得処理が開始される。
【００４２】
この処理では、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４の順に、登録されている各注目領域の三次元情報に基づいて、対応するＸＹＺ座標位置へ電動準焦部が移動されながら、各注目領域での画像が取得される、等といった処理を１つのサイクルとして、これが所定サイクル繰り返し行われる。尚、前述したように、各注目領域上のＺ位置への移動は、既に登録されている、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）と各注目領域の位置情報のうちのＺ座標情報（相対量）（Ｌ１、Ｌ２、・・・）とによって求められる位置（Ｚｒ＋Ｌ１、Ｚｒ＋Ｌ２、・・・）へ移動されることによって行われる。
【００４３】
但し、この処理においては、所定サイクル毎のように定期的に、電動準焦部が参照領域２−Ｒへ移動され、前述のＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が求められたときと同じ計測条件（レーザ強度、光電変換器１１１のＨＶ値、ゲイン値、オフセット値、コンフォーカルアパーチャ径など）が設定された後に、再び、前述の処理と同様にしてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が求められ、既に登録されているＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が、新たに求められたＺ方向の基準位置（Ｚｒ´）に置き換えられる。すなわち、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新される。そして、以降の各注目領域上のＺ位置への移動は、新たに更新されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ´）と各注目領域の位置情報のうちのＺ座標情報（相対量）（Ｌ１、Ｌ２、・・・）とによって求められる位置（Ｚｒ´＋Ｌ１、Ｚｒ´＋Ｌ２、・・・）へ移動されることによって行われるようになる。
【００４４】
例えば、１サイクル毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われる場合には、図２の矢印１乃至５に示したように、参照領域２−Ｒ、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４、参照領域２−Ｒ、といった具合に、電動準焦部が移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新及び各注目領域の画像が取得されるようになる。
【００４５】
或いは、２サイクル毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われる場合には、参照領域２−Ｒ、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４、２−１、２−２、２−３、２−４、参照領域２−Ｒ、といった具合に、電動準焦部が移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新及び各注目領域の画像が取得されるようになる。
【００４６】
尚、参照領域２−Ｒの各点についてＩ−Ｚカーブを求める際の計測開始位置は、例えばＷＤ／１０程度、観察試料１０６寄りが好ましい。
以上、第一の実施の形態によれば、観察試料１０６上の注目領域の時系列変化を観察する際の画像取得処理において、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）が定期的に更新され、その更新されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ）とその基準位置（Ｚｒ）からの相対量（Ｌ）とに基づいて、電動準焦部が各注目領域上のＺ位置へ移動されるようになるので、電動準焦部がＺ方向に移動されることによって蓄積される移動誤差（Ｚモータの絶対位置のずれ）や、環境温度の変化による顕微鏡本体１のたわみや、ステージ１０５等の重みによる顕微鏡本体１のたわみ、等によって生じる、各注目領域におけるＺ位置の位置ずれ（焦点位置のずれ）が補正されるようになり、焦点の合っていない画像が取得されるのを防止することができる。また、そのために新たな部品を設ける必要がないので、機種に依存することなく簡易に構成することが可能になる。
【００４７】
尚、本実施形態では、観察試料１０６上の複数（４つ）の注目領域における画像を時系列に取得するものであったが、例えば、観察試料１０６上の一つの注目領域のみの画像を時系列に取得するものであっても良い。
また、本実施形態においては、前述のように所定サイクル毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新されるものであったが、例えば、図５に示したように、各注目領域への移動毎に、参照領域２−Ｒヘ電動準焦部を移動させてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を更新させるようにしても良い。すなわち、同図の矢印１乃至８に示したように、まず参照領域２−Ｒから注目領域２−１移動されて画像の取得が行われ、続いて参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新され、続いて注目領域２−２へ移動されて画像の取得が行われ、続いて参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新され、等といった具合に各注目領域への移動毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新されるものであっても良い。これにより、全ての注目領域に対して、精度良く、Ｚ位置の位置ずれを補正して、焦点の合っていない画像が取得されるのを防止することができる。尚、このような処理は、例えば、各注目領域間において所定の待機時間が設定されていた場合、すなわち、各注目領域間において一の注目領域の画像取得が行われてから次の注目領域の画像取得が行われるまでの間に所定の待機時間が設けられていた場合に好適な処理である。但し、この場合の所定の待機時間は、電動準焦部が一の注目領域から参照領域２−Ｒへ移動され、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得・更新が行われ、参照領域２−Ｒから次の注目領域へ移動されるまでの間に要する時間以上であることが望ましい。
【００４８】
また、本実施形態の変形例として次のような形態も考えられる。例えば、注目領域が一点の場合、すなわち、観察点がＸＹ平面上で一箇所だけの場合には、その観察点と同じＸＹ座標の位置であってピントをスライドガラス１０６ａ表面（又はカバーガラス１０６ｃ表面）に併せた位置を参照点として使用する。この場合には、ステージをＸＹ方向に動かすことなく、電動準焦部だけによって参照点に移動して基準位置（高さ）を取得し（スライドガラス１０６ａ又はカバーガラス１０６ｃに合焦したところを基準高さにする）、ここからの相対高さとして実際に観察する焦点位置を登録する。
【００４９】
次に、本発明の第二の実施の形態について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置は、図３に示した、参照領域２−Ｒの各点においてピーク値にあたるＺ位置を取得するための処理が、第一の実施の形態と異なる。
【００５０】
すなわち、第二の実施の形態では、図３のＳ３０６の分岐処理において、ＰＭＴオーバーが発生したと判定されたときには、そのときの計測位置が、ピーク値にあたるＺ位置として取得されるものである。
従って、ＰＭＴオーバーが発生した場合には、計測開始位置から計測終了位置までの各Ｚ位置の輝度値が全て取得されることなく、ピーク値にあたるＺ位置が取得されるようになるので、より短時間でピーク値にあたるＺ位置の取得が可能になる。
【００５１】
尚、本実施形態において、ＰＭＴオーバーが発生しなかった場合には、図３に示した通り、Ｓ３１１以降の処理が行われる。
以上、第二の実施の形態によれば、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得に係る処理を、より短時間で行うことが可能になる。
【００５２】
次に、本発明の第三の実施の形態について説明する。
本実施形態は、各注目領域間において電動準焦部が一の注目領域から次の注目領域へ移動されるまでの間に行われる処理が、第一の実施の形態と異なる。
すなわち、第三の実施の形態では、各注目領域間において一の注目領域から次の注目領域へのＸＹＺ方向の移動軌跡上において、レーザがポイント照射されて輝度値が取得されながら移動される。但し、その輝度値が取得される毎に、その輝度値と前回（１サイクル前或いは数サイクル前など）に同じ位置で取得された輝度値との差が所定値以上であるか否かが判定され、それが所定値以上であると判定されたときには、Ｚ位置に位置ずれが生じていると判断され、一旦、参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得・更新が行われ、再び移動元へ戻って処理が継続される、等といった具合に処理が行われる。また、前述のＺ方向の移動軌跡を決定するＺ座標情報は、注目領域の位置情報のＺ座標情報と同様に、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）からの相対量として登録されており、その登録されている相対量＋Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）に応じて、電動準焦部の注目領域間のＺ方向の移動が行われる。尚、この移動軌跡を決定するＸＹＺ座標情報は、前述の注目領域の位置情報等が記憶されているメモリに記憶されている。
【００５３】
以上のような処理は、例えば次のようにして行われる。
始めにＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が登録された後、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４、２−１といった具合に電動準焦部が移動されて、各注目領域での画像取得や各注目領域間での輝度値取得が行われる。尚、この１サイクル目においては、まだ前回の輝度値が取得されていないので、前述の判定は行われない。続いて、２サイクル目以降は、注目領域２−２、２−３、２−４、２−１、２−２、・・・といった具合に電動準焦部が移動されて、各注目領域での画像取得や各注目領域間での輝度値取得及びその判定が行われる。ここで、その判定において、取得された輝度値と前回に取得された輝度値との差が所定値以上であると判定されたときには、一旦、電動準焦部が参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得・更新が行われる。そして再び移動元（輝度値の差が所定値以上であると判定された位置）へ戻って前述の処理が繰り返し行なわれる。
【００５４】
このように、本実施形態においては、始めに参照領域２−ＲにおいてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が登録された後においては、前述の輝度値の差が所定値以上と判定される毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われるようになる。
尚、本実施形態において、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）を求める処理は、第二の実施の形態に係る処理によって求めるものであっても良い。
【００５５】
以上、第三の実施の形態によれば、各注目領域間の移動中において、取得された輝度値が前回取得された輝度値に対して所定値以上の差が生じていた場合、すなわち、取得された輝度値が前回と相違する場合にのみ、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われるので、実際にＺ位置の補正が必要なときにだけＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われるようになり、処理を効率的に行わすことが可能になる。
【００５６】
特に、本実施形態に係る処理は、ウェルプレート等のような、各注目領域間がレーザ照射などの影響を受けずに常に一定の画像を提供する容器などを用いた場合に好適である。
以上、本発明の共焦点レーザ走査型顕微鏡装置及びそのプログラムについて詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良及び変更を行っても良いのはもちろんである。
【００５７】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、観察試料の長時間の時系列変化を観察する際の画像取得処理において生じる、環境温度の変化やステージ等の重みによる顕微鏡本体のたわみや、電動準焦部のＺ方向の移動により蓄積された移動誤差（Ｚモータの絶対位置のずれ）等による、電動照準部のＺ位置のずれを補正することが可能になり、ボケの無い画像を取得することが可能になる。また、そのために新たな部品を設ける必要がないので、機種に依存することなく簡易に構成することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の構成例を示した図である。
【図２】観察試料上の４つの注目領域等の一例を示した図である。
【図３】参照領域２−Ｒの各点においてピーク値にあたるＺ位置を取得するための処理の一例を示したフローチャートである。
【図４】各Ｚ位置における輝度値の関係を示したＩ−Ｚカーブの一例を示した図である。
【図５】第一の実施の形態の変形例を説明するための図である。
【符号の説明】
１ 共焦点レーザ走査型顕微鏡本体
２ コンピュータ
２ａ 計算・処理部
２ｂ Ａ／Ｄ入力ＣＨ
２ｃ メモリ
２ｄ プログラム
３ 操作パネル
４ レーザ装置
５ 画像モニタ
１０１ 励起用ダイクロイックミラー
１０２ 走査ユニット
１０３ レボルバ
１０４ 対物レンズ
１０５ ステージ
１０６ 観察試料
１０６ａ スライドガラス
１０６ｂ サンプル
１０６ｃ カバーガラス
１０７ ダイクロイックミラー
１０８ レンズ
１０９ コンフォーカルアパーチャ
１１０ バリアフィルタ
１１１ 光電変換器
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型顕微鏡装置に適用される技術に関し、特に観察試料上の所望の領域についての長時間の時系列変化を観察するのに好適な技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、走査型顕微鏡装置として、光源からのレーザ光を対物レンズにより微小なスポットに絞り、このスポットによって観察試料上を走査し、観察試料からの光（例えば、透過光、反射光、又は蛍光等）をフォトマルチプライヤ等の光電変換器及びＡ／Ｄコンバータを通して電気信号に変換し、画像モニタ上に観察画像を表示する共焦点レーザ走査型顕微鏡装置が知られている。
【０００３】
従来、このような共焦点レーザ走査型顕微鏡装置は、細胞やその組織等の三次元的な構造や形能を観察する手段として広く用いられている。
また、近年においては、電動ＸＹステージや電動準焦部等も組み合わされて、細胞組織の時系列変化を解析する手段として用いられるようになってきた。
【０００４】
このような細胞組織の時系列変化の解析に係る技術については種々のものがある。例えば、特許文献１には、共焦点顕微鏡を用いて、反応の早い細胞の状態等といった試料の三次元的な時間変化を観察するのに好適な試料観察方法が提案されている。また、その他、予め試料上の複数の注目領域（観察領域）が登録され、その登録された順番に従って、一定の時間間隔毎、或いは一定の回数毎に、その注目領域の画像取得が繰り返し行われることによって、試料の時系列変化の観察が行われるものもある。
【０００５】
しかしながら、このような観察試料の時系列変化の観察は長時間に渡って行われるため、光源等といった熱を生じさせる構成や環境温度の変化等によって顕微鏡本体が高温になり、熱膨張による顕微鏡のたわみが生じて、それによって焦点位置（観察位置となるＺ方向の位置）がずれてしまい、取得した画像がぼけてしまうという問題があった。従って、観察者は、焦点位置がずれたままで画像が取得されないように、定期的に画像をチェックしたり、その焦点位置のずれに備えて待機したり、等していなければならず、観察者の負担は大きかった。
【０００６】
そこで、このような問題を解決すべく、例えば特許文献２には、鏡基にミラーを取り付けることによって、ランプハウス等から放射される赤外光を反射して、輻射熱による鏡基の加熱を防ぎ、鏡基が熱膨張されるのを防止した顕微鏡が提案されている。
【０００７】
また、例えば特許文献３には、光学顕微鏡を外気に対して遮断する容器を設け、光学顕微鏡がその容器外の温度変化の影響を受けないようにした光学顕微鏡システムが提案されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平０６−０２７３８３号公報
【特許文献２】
特開平０７−１７４９７９号公報
【特許文献３】
特開平１１−２１１９８７号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前述の特許文献２の提案によれば、鏡基の形状に応じてミラーを設けなければならず、また、前述の特許文献３の提案によれば、収納される構成に応じて容器を設けなければならない。従って、これらの提案によれば、それらの設計、製造、組立て等に係る工数の増加や製品のコストアップ等といった問題が生じてしまう。
【００１０】
また、その他、観察試料の時系列変化の観察では、観察試料上の各注目領域への移動が頻繁に行われることにより蓄積されたＺ方向の移動誤差の影響によってＺモータ（焦点位置をＺ方向に移動させるモータ）の絶対位置がずれることによっても、前述の焦点位置のずれが生じる問題があった。また、取り付けられたステージ等の重みによる顕微鏡本体のたわみによっても、焦点位置のずれが生じる問題があった。
【００１１】
本発明の課題は、上記実情に鑑み、観察試料の長時間の時系列変化を観察する際に、観察位置となるＺ方向の位置ずれを補正してボケの無い画像を取得することができる、共焦点レーザ走査型顕微鏡及びそのプログラムを提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様は、ステージに載置された観察試料上にスポット光を走査させ、該観察試料からの光を光電変換部及びＡ／Ｄ変換部により電気信号に変換して、画像モニタ上に画像情報を表示することによって観察画像を得る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置であって、焦点位置をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動させる電動準焦部と、少なくとも前記観察試料上の所望の位置及び参照点の位置に係る試料位置情報を、前記電動準焦部の位置情報によるＸＹＺの三次元情報として記憶・管理する試料位置情報管理手段と、前記参照点において前記光電変換部により得られた電気信号に基づいて前記電動準焦部のＺ位置を補正するＺ位置補正手段と、を備え、前記試料位置情報のうちＺ位置情報は、前記参照点の高さを基準位置とした相対量として前記試料位置情報管理手段によって記憶・管理される、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置である。
【００１３】
上記の構成によれば、試料位置情報のＺ位置情報は、参照点の高さ位置を基準位置とした相対量として記憶・管理されるので、たとえ電動準焦部のＺ位置にずれが生じていたとしても、参照点の高さ位置である基準位置からの相対量は変化しないので、必要に応じて参照点の高さ位置を取得し、その高さ位置に相対量を加えた位置へ移動させることによって、観察位置となるＺ 方向の位置ずれが補正され、ボケの無い画像を取得することが可能になる。また、この構成によれば、観察試料上の複数の所望の位置の時系列変化を観察する場合においても、ボケの無い画像を取得することが可能になる。
【００１４】
本発明の第二の態様は、上記第一の態様において、前記Ｚ位置補正手段は、前記参照点となる、前記観察試料の特定の表面或いは前記観察試料に固定的に配置された部材の特定の表面からの光が光電変換されて得られた電気信号に基づいて取得した前記参照点の高さである基準位置に基づいて前記電動準焦部のＺ位置を補正する、構成である。
【００１５】
この構成によれば、基準位置は、参照点である、観察試料の特定の表面或いは観察試料に固定的に配置された部材（例えばミラー部材等）の特定の表面からの光に基づいて取得される。尚、参照点は、レーザによる退色などの影響を受けず、常に同じ画像の取得が可能な特定の表面であることが望ましい。
【００１６】
本発明の第三の態様は、上記第一又は第二の態様において、前記参照点のＸＹ位置が、画像取得を行う前記所望の位置のＸＹ位置と同じである、構成である。
【００１７】
本発明の第四の態様は、ステージに載置された観察試料上にスポット光を走査させ、該観察試料からの光を光電変換部及びＡ／Ｄ変換部により電気信号に変換して、画像モニタ上に画像情報を表示することによって観察画像を得る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を制御するコンピュータに、電動準焦部をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動させる機能と、少なくとも観察試料上の所望の位置及び参照点の位置に係る試料位置情報を、前記電動準焦部の位置情報によるＸＹＺの三次元情報として記憶・管理すると共に、前記試料位置情報のＺ位置情報を、前記参照点の高さを基準位置とした相対量として記憶・管理する機能と、前記所望の位置における観察画像の取得を行う前に、前記参照点において前記光電変換部から得られる電気信号に基づいて前記参照点の高さを前記基準位置として取得し、該取得した基準位置に基づき、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能と、を実現させるためのプログラムである。
【００１８】
上記のプログラムを、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を制御するコンピュータに実行させることによって、試料位置情報のＺ位置情報が、参照点の高さを基準位置とした相対量として記憶・管理されるようになるので、たとえ電動準焦部のＺ位置にずれが生じていたとしても、参照点の高さ位置である基準位置からの相対量は変化しないので、所定のタイミング等で参照点の高さ位置を取得し、その高さ位置に相対量を加えた位置へ移動させることによって、観察位置となるＺ方向の位置ずれが補正され、ボケの無い画像を取得することが可能になる。
本発明の第五の態様は、上記第四の態様において、前記所望の位置が複数設定されている場合に、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能を、前記所望の位置のそれぞれにおける画像取得を行う前に実行する、構成である。
本発明の第六の態様は、上記第四の態様において、前記所望の位置が複数設定されている場合に、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能を、前記複数の所望の位置における画像取得の１サイクルを開始する前に実行する、構成である。
本発明の第七の態様は、上記第四の態様において、前記所望の位置が複数設定され、当該所望の位置に対して時系列的に複数回の画像取得を行う場合に、第１の所望の位置から第２の所望の位置への移動中に前記光電変換部から得られる電気信号に基づく輝度値を、前回の画像取得時における前記第１の所望の位置から前記第２の所望の位置への移動中に前記光電変換部から得られた電気信号に基づく輝度値と比較し、両者の差異が所定値以上であった場合にだけ前記電動焦準部のＺ位置を補正する機能を実行する、構成である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の第一の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の構成例を示した図である。
【００２０】
同図において、共焦点レーザ走査型顕微鏡本体１（以下、単に顕微鏡本体１という）には、コンピュータ２が接続されている。また、このコンピュータ２には、操作パネル３、レーザ装置４、及び画像モニタ５が接続されている。
顕微鏡本体１において、レーザ装置４から入射されたレーザ光は、励起用ダイクロイックミラー１０１で反射され、走査ユニット１０２に入射される。走査ユニット１０２は、Ｘ軸方向走査用のガルバノメータミラーとＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーとを有し、レーザ装置４からのレーザ光をコンピュータ２からの走査制御信号に基づいてＸＹ走査すると共に、Ｘ軸方向走査による１ラインの走査毎に走査制御終了信号をコンピュータ２に出力する。
【００２１】
また、走査ユニット１０２によってＸＹ軸方向に走査されたレーザ光は、レボルバ１０３に取り付けられた対物レンズ１０４を介して、ステージ１０５上に載置された観察試料１０６上にスポット光として照射される。このスポット光による観察試料１０６からの光、例えば反射光又は観察試料１０６から発生した蛍光は、入射光路に戻され、励起用ダイクロイックミラー１０１を透過してダイクロイックミラー１０７によって反射され、レンズ１０８により集光される。このレンズ１０８による集光位置にはコンフォーカルアパーチャ１０９が配置され、共焦点光学系が形成されている。このコンフォーカルアパーチャ１０９を通過した光は、更にバリアフィルタ１１０により波長が限定され、観察者が期待する波長の光だけが、フォトマルチプライヤなどの光電変換器１１１に入力されるようになっている。また、光電変換器１１１に入力された光は、アナログ電気信号に変換され、更にコンピュータ２においてＡ／Ｄ入力ＣＨ２ｂによってデジタル電気信号に変換されてメモリ２ｃに記憶され、画像情報として画像モニタ５に出力されるようになっている。
【００２２】
このような構成において、ステージ１０５は、コンピュータ２の制御の基にＸＹ方向に移動可能な電動ステージである。また、レボルバ１０３或いはステージ１０５は、コンピュータ２の制御の基に不図示のＺモータによってＺ方向に移動可能な電動準焦部である。これらの構成により、コンピュータ２の制御によって対物レンズ１０４の焦点位置をＸＹＺ方向に移動させることが可能になる。
【００２３】
また、操作パネル３は、キーボードの他、トラックボール、ジョイスティック、或いはマウス等のポインティングデバイスを有しており、観察者の指示によりコンピュータ２に対し、レーザ光の走査開始指示信号、画像入力指示信号、及び光電変換器１１１に対する感度の調整指示信号、等といった各種の指示信号を出力可能に構成されている。
【００２４】
また、コンピュータ２は、前述のＡ／Ｄ入力ＣＨ２ｂ及びメモリ２ｃの他、計算・処理部（ＣＰＵ）２ａ、不図示の内部メモリに記憶されているプログラム２ｄ、及び後述する観察試料１０６上の注目領域や参照領域の位置情報（試料位置情報）及びＺ方向の基準位置（Ｚｒ）に関する情報等が記憶（登録）される不図示のメモリ等を備えており、本レーザ走査型顕微鏡装置全体の動作を制御するものである。例えば、操作パネル３からの走査開始指示信号が入力されると、対応する走査制御信号を走査ユニット１０２へ出力し、また光電変換器１１１からの観察試料１０６に応じたアナログ電気信号が入力されると、それをデジタル電気信号（デジタルデータ）に変換してメモリ２ｃに転送する。また、メモリ２ｃに転送されたデジタルデータに基づく画像や操作メニュー等を画像モニタ５に表示する。また、操作パネル３から入力された感度調整指示信号に応じて、光電変換器１１１に対する印加電圧（ＨＶ値）、ゲイン値、及びオフセット値等の設定を行う、等といった制御処理を行う。
【００２５】
このような、操作パネル３からの各種の指示信号に応じた走査ユニット１０２の制御、レーザ光源装置４から顕微鏡本体１へのレーザ入射の制御、及びメモリ２ｃに転送されたデジタルデータの画像モニタ５への出力制御、等といったコンピュータ２によって行われる本レーザ走査型顕微鏡装置の各種の制御は、計算・処理部２ａがプログラム２ｄを読み出し実行することによって実現されるものである。
【００２６】
次に、このような構成のレーザ走査型顕微鏡装置において、観察試料１０６上の複数の注目領域（観察領域，測定領域）の時系列変化を観察する際に行われる画像取得処理について説明する。
図２は、本実施形態において画像取得が行われる、観察試料１０６上の４つの注目領域等の一例を示した図である。
【００２７】
同図において、観察試料１０６は、スライドガラス１０６ａ上にサンプル１０６ｂが載せられ、そのサンプル１０６ｂ上にカバーガラス１０６ｃが載せられて構成されている。
このような観察試料１０６上の２−１、２−２、２−３、２−４の４つの領域は、本画像取得処理において後に注目領域として登録される領域である。また、２−Ｒの領域は、本画像取得処理において後に参照領域として登録される領域である。尚、参照領域とは、観察試料１０６上内であってレーザによる退色などの影響を受けず、常に同じ画像の取得が可能な注目領域以外の領域のことをいう。例えば、反射光を十分に得るために、観察試料１０６上にミラー部材を固定的に配置して、そのミラー部材上の所定領域を参照領域としても良い。
【００２８】
本実施形態では、このような観察試料１０６上の２−１、２−２、２−３、２−４の４つの注目領域の時系列変化を観察する際に行われる画像取得処理を例に説明する。
本画像取得処理では、まず、前述の参照領域２−Ｒの登録が行われる。すなわち、参照領域２−Ｒに係る位置情報（三次元情報，ＸＹＺ座標情報）が、対応する電動準焦部の位置情報として登録される。尚、本実施形態では、スライドガラス１０６ａ上の表面が参照領域２−Ｒとして登録されるものであるが、カバーガラス１０６ｃ上の表面等が参照領域とし登録されるものであっても良い。
【００２９】
続いて、電動準焦部が、前述の参照領域２−Ｒに係る位置情報に基づいて、観察試料１０６の参照領域２−Ｒ上に移動され、その参照領域２−Ｒ上において、レーザによる反射光等が観察されながら電動準焦部（レボルバ１０３或いはステージ１０５）がＸＹＺ方向に移動される等して、参照領域２−Ｒの各点において、輝度情報（輝度値）とＺ方向の位置（Ｚ位置）との関係（以下、Ｉ−Ｚカーブという）が求められ、そのＩ−Ｚカーブのピーク値にあたるＺ位置が求められる。そして、その各点において求められたピーク値にあたるＺ位置の平均値が、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）として登録される。尚、このＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を次のようにして求めても良い。例えば、Ｉ−Ｚカーブを求めるときに、参照領域２−ＲのＸ−Ｙ平面内の各点の輝度情報をＺ位置ごとに平均化することにより、参照領域全体としてのひとつのＩ−Ｚカーブを求め、ここからピーク値を算出してＺ方向の基準位置（Ｚｒ）とするようにしても良い。
【００３０】
図３は、前述の参照領域２−Ｒの各点においてピーク値にあたるＺ位置を取得するための処理の一例を示したフローチャートである。
同図において、まず、Ｓ３０１では、参照領域２−Ｒ上の測定開始点となる点の測定開始位置へ電動準焦部が移動される。例えば、このときに電動準焦部は１００μｍ程度、観察試料１０６から離れた位置へ移動される。尚、このＺ方向の測定開始位置は、対物レンズ１０４の作動距離（ＷＤ：ワークディスタンス）等を考慮して適宜設定されることが望ましい。
【００３１】
Ｓ３０２では、参照領域２−ＲにおけるＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を求めるために、所定のゲイン値、オフセット値、及びコンフォーカルアパーチャ径等が設定される。
Ｓ３０３では、バリアフィルタ１１０が空フィルタに切り替えられる（セットされる）。バリアフィルタ１１０は、コンフォーカルアパーチャ１０９を通った光の波長の中から、観察に適した波長の光のみを抽出するために使用されるものであるが、本ステップのように、これが空フィルタに切り替えられることによって、より多くの光が光電変換器１１１に入力されるようになり、輝度変化の検出が容易になる。
【００３２】
Ｓ３０４では、輝度値の計測が開始される。
Ｓ３０５では、実際に、現在の電動準焦部のＺ位置における輝度値の計測が行われ、そのＺ位置における輝度値が取得される。
Ｓ３０６では、前ステップの輝度値の計測において、光電変換器１１１のＰＭＴオーバーが検出されたか否か、すなわち、光電変換器１１１に入力された光がその光電変換器１１１の受光容量を超えたか否かが判定され、その判定結果がＹｅｓの場合にはＳ３１１へ処理が進み、Ｎｏの場合にはＳ３０７へ処理が進む。
【００３３】
Ｓ３０７では、計測が一次停止される。
Ｓ３０８では、Ｓ３０２で設定されたゲイン値が更に下げられる。これにより、ＰＭＴオーバーが防止される。尚、ゲイン値の変わりにＨＶ値を更に下げるようにしても良い。
【００３４】
Ｓ３０９では、計測位置となる電動準焦部のＺ位置が、数単位移動ステップ分（例えば数μｍ程度）、戻される。
Ｓ３１０では、計測再開命令が発せられて計測が再開され、Ｓ３０５へ処理が戻る。
【００３５】
Ｓ３１１では、現在の測定位置が測定終了位置であるか否かが判定され、その判定結果がＹｅｓの場合にはＳ３１２へ処理が進み、Ｎｏの場合にはＳ３１３へ処理が進む。
Ｓ３１２では、電動準焦部が単位移動ステップ分移動されることによって次の計測位置（Ｚ位置）へ移動され、Ｓ３０５へ処理が戻る。
【００３６】
Ｓ３１３では、計測が終了する。
Ｓ３１４では、取得された各Ｚ位置における輝度値の中からピーク値が取得されて、そのピーク値にあたるＺ位置が取得される。但し、Ｓ３０６の処理においてＰＭＴオーバーが検出されたときには、最後にＰＭＴオーバーが検出された以降に取得された輝度値の中からピーク値が取得され、そのピーク値にあたるＺ位置が取得される。そして、本フローが終了する。
【００３７】
以上、本フローが実行されることによって、測定開始位置から測定終了位置までの単位移動ステップ毎の各Ｚ位置における輝度値が取得され、その各Ｚ位置における輝度値に基づいて、ピーク値にあたるＺ位置が取得される。
図４は、そのようにして取得された各Ｚ位置における輝度値の関係を示したＩ−Ｚカーブの一例を示した図である。同図において、縦軸は輝度値（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）、横軸はＺ位置（Ｚ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示している。
【００３８】
同図に示した例においては、各Ｚ位置における輝度値の中からピーク値にあたるＺ位置として、Ｚｐが取得されるようになる。
このようにして、参照領域２−Ｒ上の各点について、ピーク値にあたるＺ位置が求められると、その各点についてのピーク値にあたるＺ位置の平均値が求められ、その平均値がＺ方向の基準位置（Ｚｒ）として登録される。
【００３９】
尚、本実施形態では、二次元領域である参照領域２−Ｒの各点からＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を求めるようにしているが、例えば、その参照領域２−Ｒを、二次元領域としてではなく、一次元領域として或いは一点として、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）を求めるようにしても良い。このようにすることで、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得に係る処理を、より短時間で行うことができる。また、注目領域についても二次元領域としてではなく、一次元領域として或いは一点としても良い。
【００４０】
続いて、観察試料１０６上の複数の注目領域２−１乃至２−４（図２参照）が登録される。すなわち、各注目領域の位置情報（三次元情報，ＸＹＺ座標情報）が、対応する電動準焦部の位置情報として登録される。但し、登録された各注目領域の位置情報のうちＺ座標情報については、参照領域２−Ｒにおいて取得されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ）からの相対量（相対距離）（Ｌ１、Ｌ２、・・・）として登録される。例えば、所定の注目領域のＺ座標情報がＺであるときに、登録される相対量Ｌは、Ｚ−Ｚｒになる。そして、以降、注目領域において電動準焦部がＺ方向へ移動されるときには、そのときに登録されている、Ｚ方向の基準位置Ｚｒ＋相対量Ｌに応じて、電動準焦部が移動されるようになる。
【００４１】
このようにして、参照領域２−Ｒの位置情報、参照領域において取得されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ）、及び注目領域２−１乃至２−４の位置情報が登録されると、実際に注目領域２−１乃至２−４の時系列変化の観察に係る画像取得処理が開始される。
【００４２】
この処理では、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４の順に、登録されている各注目領域の三次元情報に基づいて、対応するＸＹＺ座標位置へ電動準焦部が移動されながら、各注目領域での画像が取得される、等といった処理を１つのサイクルとして、これが所定サイクル繰り返し行われる。尚、前述したように、各注目領域上のＺ位置への移動は、既に登録されている、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）と各注目領域の位置情報のうちのＺ座標情報（相対量）（Ｌ１、Ｌ２、・・・）とによって求められる位置（Ｚｒ＋Ｌ１、Ｚｒ＋Ｌ２、・・・）へ移動されることによって行われる。
【００４３】
但し、この処理においては、所定サイクル毎のように定期的に、電動準焦部が参照領域２−Ｒへ移動され、前述のＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が求められたときと同じ計測条件（レーザ強度、光電変換器１１１のＨＶ値、ゲイン値、オフセット値、コンフォーカルアパーチャ径など）が設定された後に、再び、前述の処理と同様にしてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が求められ、既に登録されているＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が、新たに求められたＺ方向の基準位置（Ｚｒ´）に置き換えられる。すなわち、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新される。そして、以降の各注目領域上のＺ位置への移動は、新たに更新されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ´）と各注目領域の位置情報のうちのＺ座標情報（相対量）（Ｌ１、Ｌ２、・・・）とによって求められる位置（Ｚｒ´＋Ｌ１、Ｚｒ´＋Ｌ２、・・・）へ移動されることによって行われるようになる。
【００４４】
例えば、１サイクル毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われる場合には、図２の矢印１乃至５に示したように、参照領域２−Ｒ、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４、参照領域２−Ｒ、といった具合に、電動準焦部が移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新及び各注目領域の画像が取得されるようになる。
【００４５】
或いは、２サイクル毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われる場合には、参照領域２−Ｒ、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４、２−１、２−２、２−３、２−４、参照領域２−Ｒ、といった具合に、電動準焦部が移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新及び各注目領域の画像が取得されるようになる。
【００４６】
尚、参照領域２−Ｒの各点についてＩ−Ｚカーブを求める際の計測開始位置は、例えばＷＤ／１０程度、観察試料１０６寄りが好ましい。
以上、第一の実施の形態によれば、観察試料１０６上の注目領域の時系列変化を観察する際の画像取得処理において、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）が定期的に更新され、その更新されたＺ方向の基準位置（Ｚｒ）とその基準位置（Ｚｒ）からの相対量（Ｌ）とに基づいて、電動準焦部が各注目領域上のＺ位置へ移動されるようになるので、電動準焦部がＺ方向に移動されることによって蓄積される移動誤差（Ｚモータの絶対位置のずれ）や、環境温度の変化による顕微鏡本体１のたわみや、ステージ１０５等の重みによる顕微鏡本体１のたわみ、等によって生じる、各注目領域におけるＺ位置の位置ずれ（焦点位置のずれ）が補正されるようになり、焦点の合っていない画像が取得されるのを防止することができる。また、そのために新たな部品を設ける必要がないので、機種に依存することなく簡易に構成することが可能になる。
【００４７】
尚、本実施形態では、観察試料１０６上の複数（４つ）の注目領域における画像を時系列に取得するものであったが、例えば、観察試料１０６上の一つの注目領域のみの画像を時系列に取得するものであっても良い。
また、本実施形態においては、前述のように所定サイクル毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新されるものであったが、例えば、図５に示したように、各注目領域への移動毎に、参照領域２−Ｒヘ電動準焦部を移動させてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）を更新させるようにしても良い。すなわち、同図の矢印１乃至８に示したように、まず参照領域２−Ｒから注目領域２−１移動されて画像の取得が行われ、続いて参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新され、続いて注目領域２−２へ移動されて画像の取得が行われ、続いて参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新され、等といった具合に各注目領域への移動毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が更新されるものであっても良い。これにより、全ての注目領域に対して、精度良く、Ｚ位置の位置ずれを補正して、焦点の合っていない画像が取得されるのを防止することができる。尚、このような処理は、例えば、各注目領域間において所定の待機時間が設定されていた場合、すなわち、各注目領域間において一の注目領域の画像取得が行われてから次の注目領域の画像取得が行われるまでの間に所定の待機時間が設けられていた場合に好適な処理である。但し、この場合の所定の待機時間は、電動準焦部が一の注目領域から参照領域２−Ｒへ移動され、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得・更新が行われ、参照領域２−Ｒから次の注目領域へ移動されるまでの間に要する時間以上であることが望ましい。
【００４８】
また、本実施形態の変形例として次のような形態も考えられる。例えば、注目領域が一点の場合、すなわち、観察点がＸＹ平面上で一箇所だけの場合には、その観察点と同じＸＹ座標の位置であってピントをスライドガラス１０６ａ表面（又はカバーガラス１０６ｃ表面）に併せた位置を参照点として使用する。この場合には、ステージをＸＹ方向に動かすことなく、電動準焦部だけによって参照点に移動して基準位置（高さ）を取得し（スライドガラス１０６ａ又はカバーガラス１０６ｃに合焦したところを基準高さにする）、ここからの相対高さとして実際に観察する焦点位置を登録する。
【００４９】
次に、本発明の第二の実施の形態について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡装置は、図３に示した、参照領域２−Ｒの各点においてピーク値にあたるＺ位置を取得するための処理が、第一の実施の形態と異なる。
【００５０】
すなわち、第二の実施の形態では、図３のＳ３０６の分岐処理において、ＰＭＴオーバーが発生したと判定されたときには、そのときの計測位置が、ピーク値にあたるＺ位置として取得されるものである。
従って、ＰＭＴオーバーが発生した場合には、計測開始位置から計測終了位置までの各Ｚ位置の輝度値が全て取得されることなく、ピーク値にあたるＺ位置が取得されるようになるので、より短時間でピーク値にあたるＺ位置の取得が可能になる。
【００５１】
尚、本実施形態において、ＰＭＴオーバーが発生しなかった場合には、図３に示した通り、Ｓ３１１以降の処理が行われる。
以上、第二の実施の形態によれば、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得に係る処理を、より短時間で行うことが可能になる。
【００５２】
次に、本発明の第三の実施の形態について説明する。
本実施形態は、各注目領域間において電動準焦部が一の注目領域から次の注目領域へ移動されるまでの間に行われる処理が、第一の実施の形態と異なる。
すなわち、第三の実施の形態では、各注目領域間において一の注目領域から次の注目領域へのＸＹＺ方向の移動軌跡上において、レーザがポイント照射されて輝度値が取得されながら移動される。但し、その輝度値が取得される毎に、その輝度値と前回（１サイクル前或いは数サイクル前など）に同じ位置で取得された輝度値との差が所定値以上であるか否かが判定され、それが所定値以上であると判定されたときには、Ｚ位置に位置ずれが生じていると判断され、一旦、参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得・更新が行われ、再び移動元へ戻って処理が継続される、等といった具合に処理が行われる。また、前述のＺ方向の移動軌跡を決定するＺ座標情報は、注目領域の位置情報のＺ座標情報と同様に、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）からの相対量として登録されており、その登録されている相対量＋Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）に応じて、電動準焦部の注目領域間のＺ方向の移動が行われる。尚、この移動軌跡を決定するＸＹＺ座標情報は、前述の注目領域の位置情報等が記憶されているメモリに記憶されている。
【００５３】
以上のような処理は、例えば次のようにして行われる。
始めにＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が登録された後、注目領域２−１、２−２、２−３、２−４、２−１といった具合に電動準焦部が移動されて、各注目領域での画像取得や各注目領域間での輝度値取得が行われる。尚、この１サイクル目においては、まだ前回の輝度値が取得されていないので、前述の判定は行われない。続いて、２サイクル目以降は、注目領域２−２、２−３、２−４、２−１、２−２、・・・といった具合に電動準焦部が移動されて、各注目領域での画像取得や各注目領域間での輝度値取得及びその判定が行われる。ここで、その判定において、取得された輝度値と前回に取得された輝度値との差が所定値以上であると判定されたときには、一旦、電動準焦部が参照領域２−Ｒへ移動されてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の取得・更新が行われる。そして再び移動元（輝度値の差が所定値以上であると判定された位置）へ戻って前述の処理が繰り返し行なわれる。
【００５４】
このように、本実施形態においては、始めに参照領域２−ＲにおいてＺ方向の基準位置（Ｚｒ）が登録された後においては、前述の輝度値の差が所定値以上と判定される毎にＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われるようになる。
尚、本実施形態において、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）を求める処理は、第二の実施の形態に係る処理によって求めるものであっても良い。
【００５５】
以上、第三の実施の形態によれば、各注目領域間の移動中において、取得された輝度値が前回取得された輝度値に対して所定値以上の差が生じていた場合、すなわち、取得された輝度値が前回と相違する場合にのみ、Ｚ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われるので、実際にＺ位置の補正が必要なときにだけＺ方向の基準位置（Ｚｒ）の更新が行われるようになり、処理を効率的に行わすことが可能になる。
【００５６】
特に、本実施形態に係る処理は、ウェルプレート等のような、各注目領域間がレーザ照射などの影響を受けずに常に一定の画像を提供する容器などを用いた場合に好適である。
以上、本発明の共焦点レーザ走査型顕微鏡装置及びそのプログラムについて詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良及び変更を行っても良いのはもちろんである。
【００５７】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、観察試料の長時間の時系列変化を観察する際の画像取得処理において生じる、環境温度の変化やステージ等の重みによる顕微鏡本体のたわみや、電動準焦部のＺ方向の移動により蓄積された移動誤差（Ｚモータの絶対位置のずれ）等による、電動照準部のＺ位置のずれを補正することが可能になり、ボケの無い画像を取得することが可能になる。また、そのために新たな部品を設ける必要がないので、機種に依存することなく簡易に構成することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一の実施の形態に係る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置の構成例を示した図である。
【図２】観察試料上の４つの注目領域等の一例を示した図である。
【図３】参照領域２−Ｒの各点においてピーク値にあたるＺ位置を取得するための処理の一例を示したフローチャートである。
【図４】各Ｚ位置における輝度値の関係を示したＩ−Ｚカーブの一例を示した図である。
【図５】第一の実施の形態の変形例を説明するための図である。
【符号の説明】
１ 共焦点レーザ走査型顕微鏡本体
２ コンピュータ
２ａ 計算・処理部
２ｂ Ａ／Ｄ入力ＣＨ
２ｃ メモリ
２ｄ プログラム
３ 操作パネル
４ レーザ装置
５ 画像モニタ
１０１ 励起用ダイクロイックミラー
１０２ 走査ユニット
１０３ レボルバ
１０４ 対物レンズ
１０５ ステージ
１０６ 観察試料
１０６ａ スライドガラス
１０６ｂ サンプル
１０６ｃ カバーガラス
１０７ ダイクロイックミラー
１０８ レンズ
１０９ コンフォーカルアパーチャ
１１０ バリアフィルタ
１１１ 光電変換器
Claims (7)
- ステージに載置された観察試料上にスポット光を走査させ、該観察試料からの光を光電変換部及びＡ／Ｄ変換部により電気信号に変換して、画像モニタ上に画像情報を表示することによって観察画像を得る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置であって、
焦点位置をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動させる電動準焦部と、
少なくとも前記観察試料上の所望の位置及び参照点の位置に係る試料位置情報を、前記電動準焦部の位置情報によるＸＹＺの三次元情報として記憶・管理する試料位置情報管理手段と、
前記参照点において前記光電変換部により得られた電気信号に基づいて前記電動準焦部のＺ位置を補正するＺ位置補正手段と、
を備え、
前記試料位置情報のうちＺ位置情報は、前記参照点の高さを基準位置とした相対量として前記試料位置情報管理手段によって記憶・管理される、
ことを特徴とする共焦点レーザ走査型顕微鏡装置。 - 前記Ｚ位置補正手段は、前記参照点となる、前記観察試料の特定の表面或いは前記観察試料に固定的に配置された部材の特定の表面からの光が光電変換されて得られた電気信号に基づいて取得した前記参照点の高さである基準位置に基づいて前記電動準焦部のＺ位置を補正する、
ことを特徴とする請求項１記載の共焦点レーザ走査型顕微鏡装置。 - 前記参照点のＸＹ位置が、画像取得を行う前記所望の位置のＸＹ位置と同じである、
ことを特徴とする請求項１又は２記載の共焦点レーザ走査型顕微鏡装置。 - ステージに載置された観察試料上にスポット光を走査させ、該観察試料からの光を光電変換部及びＡ／Ｄ変換部により電気信号に変換して、画像モニタ上に画像情報を表示することによって観察画像を得る共焦点レーザ走査型顕微鏡装置を制御するコンピュータに、
電動準焦部をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動させる機能と、
少なくとも観察試料上の所望の位置及び参照点の位置に係る試料位置情報を、前記電動準焦部の位置情報によるＸＹＺの三次元情報として記憶・管理すると共に、前記試料位置情報のＺ位置情報を、前記参照点の高さを基準位置とした相対量として記憶・管理する機能と、
前記所望の位置における観察画像の取得を行う前に、前記参照点において前記光電変換部から得られる電気信号に基づいて前記参照点の高さを前記基準位置として取得し、該取得した基準位置に基づき、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能と、
を実現させるためのプログラム。 - 前記所望の位置が複数設定されている場合に、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能を、前記所望の位置のそれぞれにおける画像取得を行う前に実行する、
ことを特徴とする請求項４記載のプログラム。 - 前記所望の位置が複数設定されている場合に、前記電動準焦部のＺ位置を補正する機能を、前記複数の所望の位置における画像取得の１サイクルを開始する前に実行する、
ことを特徴とする請求項４記載のプログラム。 - 前記所望の位置が複数設定され、当該所望の位置に対して時系列的に複数回の画像取得を行う場合に、第１の所望の位置から第２の所望の位置への移動中に前記光電変換部から得られる電気信号に基づく輝度値を、前回の画像取得時における前記第１の所望の位置から前記第２の所望の位置への移動中に前記光電変換部から得られた電気信号に基づく輝度値と比較し、両者の差異が所定値以上であった場合にだけ前記電動焦準部のＺ位置を補正する機能を実行する、
ことを特徴とする請求項４記載のプログラム。
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