CN102830488A - 扫描显微镜和用于光显微成像物体的方法 - Google Patents
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Abstract
扫描显微镜（100，200，300，400，500）包括用于发射照明光束（12）的光源（20，61，64），用于在待成像的物体（36）中产生长形的照明焦点（16，84）的照明光学器件（10），和扫描装置（33），用于通过改变入射方向使照明焦点（16，84）在待成像的物体（36）的待照明的目标区域上运动，照明光束（12）在该入射方向上射到照明光学器件（10）的入射光瞳（14）上。扫描装置（33）为了使照明焦点（16，84）相对照明光学器件（10）的光轴（O1）斜置使照明光束（12）定向在照明光学器件（10）的入射光瞳（14）的从光瞳中心偏移出的部分区域上并且为了使照明焦点（16，84）在待照明的目标区域上运动使照明光束（36）的入射方向在该部分区域中改变。设有一个与照明光学器件（10）在空间上分开的观察物镜（38），该观察物镜以其光轴（O3）基本上垂直于被照明的目标区域地及相对照明光学器件（10）的光轴（O1）成一锐角（α）地设置。
Description
技术领域
本发明涉及扫描显微镜，具有用于发射照明光束的光源、用于在待成像物体中产生纵向照明焦点的照明光学器件和用于通过改变射入方向使照明焦点在待成像物体的待照明目标区域上运动的扫描装置，照明光束沿入射方向射到照明光学器件的入射光瞳中。
背景技术
由现有技术公开了一些扫描显微镜，这些扫描显微镜例如使用在荧光显微技术中，以便用激光激发用于发射荧光射束的色素，荧光射束随后被检测器检测，用于成像待检查的物体。在这种显微技术领域上，尤其使用共焦扫描显微镜，这种显微镜与标准显微镜的不同之处在于在特定的时间点并不照亮整个物体，而是产生一个通常受衍射限制的光斑，借助该光斑逐点扫描物体。由检测器在各个物体点上检测到的光信号随后被汇聚为物体的一幅整体图像。
这样的共焦显微镜通常具有一个所谓的点扫描器作为扫描装置，该点扫描器将从光源发出的照明光束偏转到照明光学器件的入射光瞳中。照明光学器件将入射到其入射光瞳中的照明光束变换为聚焦的光分布，该光分布在下文中称为照明焦点。照明焦点的形状和大小取决于照明光学器件的光学特性、尤其是数值孔径。如果照明光束在中心及垂直地、也就是说沿着光轴射到照明光学器件的入射光瞳中时，照明光学器件产生一个长形的照明焦点，其横向于光轴的伸展小于沿着光轴的伸展。照明焦点为了扫描物体而横向于光轴地运动，其方式是，点扫描器例如通过一个可运动的镜装置改变入射角，在入射角的这种情况下照明光束射到照明光学器件的入射光瞳中。
为了借助共焦显微镜进行三维成像，物体必须被以上述说明的方式点状地扫描。由于这样比较浪费，则在近些年来建议了一种在文献中称为SPIM（Selective Plane Illumination Microscopy，选择性平面照明显微术）的显微方法。该方法借助一个照明物镜和一个观察物镜工作，所述物镜彼此呈90度角地布置。该照明物镜与一个设置在它前面的柱面透镜配合作用产生近似平面的照明光分布，所述光分布沿着照明物镜的光轴穿透过（durchsetzen）物体。这样的光分布通常也称为光片或光盘。物体的被这种光片照亮的目标区域通过观察物镜成像在一个检测面、例如一个CCD上，该观察物镜的光轴垂直于该光片延伸。如果物体运动通过该光片，则可用该装置拍摄物体的分层图像。为了产生尽可能薄的光片，照明物镜必须具有相应高的数值孔径，其中，照明物镜的自由工作间距必须相应地大，以便避免与观察物镜相碰撞。照明物镜的数值孔径相应地定义光片的厚度及由此定义沿着观察物镜的光轴的光学分辨率。
在WO2010/012980 A1中说明的修改后的SPIM方法中实现了用于同一物镜的照明和检测。为此，物镜的入射光瞳被偏心地局部照明（unterleuchtet），也就是说，照明光束穿过入射光瞳的横向于光轴偏移的一部分。一个设置在物镜前面的柱面透镜在物体中产生一个照亮的光片，该光片相对物镜的光轴倾斜地设置。由该光片照亮的目标区域随后重新被物镜成像。
前面所说明的装置均借助柱面透镜工作，以便达到物镜所希望的倾斜照明。但是，使用这样的柱面透镜具有缺点。所述装置仅被设计用于借助光片倾斜照明，而不能够用于任何偏离于此的应用情况，例如点状的共焦扫描。还值得期待的是，产生用于倾斜照明的光片的光强的空间分布可变化。而这借助柱面透镜是不可能的。
此外，更多的文献可参阅A.H.Voie et al.:“Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning:three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens”，Journal of Microscopy 170，229-236（1993）；J.Huisken,J.Swoger，F.Del Bene，J.Wittbold,E.H.K.Stelzer:“Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy”，Science 305，1007（2004）；F.Fahrbach,A.Rohrbach:“Microscopy with nondiffracting beams”，FOM，2009，Krakau；C.Dunsby:“Optically sectioned imaging by oblique plane mirror microscopy”，Optics Express Vol.16，25（2008）；DE 10 2005 027 077 A1;DE 44 16 558 C2;US 5 952 668;WO 2006/127692 A2;DE 10 2006 021 317 B3;WO 2008/128434 A1;US 2009/01354342 A1;DE 10 2008 024 568 A1;US 2008/0032414 A1。
在用照明物镜和单独的观察物镜工作的方法中，这两个物镜通常彼此以90度的角度布置。这种照明物镜和观察物镜彼此垂直的物镜布置可在成像特定的生物物体时是不利的。例如通常在这样直角的物镜布置情况下无碰撞地定位球形物体。这样的球形物体例如在研究老鼠或家鼠眼睛中的组织培养时被投入应用。在此，在常规的物镜直角布置时通常会出现由于邻近组织造成的遮暗。
发明内容
本发明的任务是，对前文所述类型的扫描显微镜进行改进，使得在复杂的几何关系情况下也可无碰撞地光显微成像。
本发明这样解决了该任务，即，扫描装置为了使照明焦点相对照明光学器件的光轴斜置使照明光束定向在照明光学器件的入射光瞳的从光瞳中心偏移出的部分区域上并且为了使照明焦点在待照明的目标区域上运动使照明光束的入射方向在该部分区域中改变，并且设有一个与照明光学器件在空间上分开的观察物镜，该观察物镜被设置成其光轴基本上垂直于被照明的目标区域且相对照明光学器件的光轴成一锐角。
本发明首先规定了，用照明光束对照明光学器件的入射光瞳进行偏心地局部照明，其方式是，照明光束在入射光瞳的从光瞳中心偏移出的部分区域上通过。入射光瞳的局部照明、也就是说使照明光束并不穿透入射光瞳的整个面积由此不利用完整孔径的措施不仅在纵向方向上而且在横向方向上引起（一开始为长形的）照明焦点的扩宽。由于照明光束还偏心地射到入射光瞳上，则照明焦点相对照明光学器件的光轴倾斜地设置。
以此方式扩宽及倾斜设置的照明焦点可被用于构成顺序地照亮目标区域的光片。为此使用扫描装置，该扫描装置负责用于照明光束在照明光学器件的入射光瞳中相应的扫描运动。该扫描运动相应于照明光学器件绕倾斜点的倾斜，该倾斜点位于入射光瞳的区域中。这意味着，在数学意义上显然不是光线、而是一束光束的照明光束（至少近似地）位置固定地保持在入射光瞳的区域中，而它在与入射光瞳相隔一段距离地（在扫描装置的方向上）类似地进行相对于平行光轴设置的参考方向的摆动运动。照明光束的倾斜或摆动运动将照明光学器件转换为倾斜设置的照明焦点横向于光轴的相应运动。照明焦点在物体中的运动的实际大小取决于照明光学器件的具体构造。但是重要的是，照明光束的由扫描装置引起的倾斜根据本发明被应用于使照明焦点在物体的目标区域内运动及由此类似地构造一个照明该目标区域的光片。
与现有技术公开的、为了产生光片借助柱面透镜工作的技术方案的区别在于，在根据本发明的扫描显微镜中，光片借助扫描装置连续地构造，其中，照明焦点在扫描周期内在目标区域上运动。为此，其中扫描装置运行的扫描周期被这样短地调节，使得它明显地低于光检测器通过照明光学器件成像目标区域的检测周期。光检测器，例如平面检测器、CCD、CMOS、APD-阵列或类似物相应地在时间上“看到”运动的照明焦点及由此在空间上并不可分辨出。确切地说，它看到的是光片形式的、空间上相关联的光分布。
由于在常规的共焦扫描显微镜中并未设置一个使照明光束运动的扫描装置，因此本发明能够特别有效地产生照明光片。尤其是，基本上可设置同一显微镜构造用于不同的应用情况。因此，为了实现根据本发明的借助光片进行对物体的倾斜照明的方案，仅仅需要在一个本身标准构造的共焦扫描显微镜中提供用于照明光学器件的入射光瞳的偏心局部照明。这例如可借助一个光学元件实现，该光学元件被设在照明光束的光路中。若扫描显微镜接着要再用点状的照明装置工作，则光学元件仅须再次离开照明光束的光路。
根据本发明的扫描显微镜能够实现拍摄物体的高分辨率的截面图。为此，物体被用光片逐步地扫描。这种扫描例如这样实现，即，物体沿着或横向于照明光学器件的光轴相对照明光学器件运动。
根据本发明设有一个与照明光学器件在空间上分开的观察物镜，该观察物镜的光轴基本上垂直于由运动的照明焦点产生的光片并且同时相对照明光学器件的光轴呈锐角地布置。锐角在此指的是一个角，该角小于在常规布置中设置的90度的角。该锐角也给出了由照明光学器件的光轴确定的照明轴线与由观察物镜的光轴确定的观察轴线之间的角度。该角度的值可与现有的具体配置相关地、尤其是与待检测物体的形状相关地选择。优选地，锐角处于20至80度的角度范围内，其中在该范围内优选50度的值。
根据本发明的倾斜设置的、进行扫描运动的照明焦点定义了一个倾斜设置的物体平面，该平面由观察物镜成像。在此，观察物镜被这样地定向，使得其光轴垂直于该物体平面地延伸。本发明在此能够实现物体平面的特别简单的定向，其方式是，照明光束根据所期望的定向在入射到照明光学器件中时从光瞳中心偏移出。照明光束从光瞳中心偏移得越远，照明焦点就越强，由此由运动的照明焦点定义的物体平面相对照明光学器件的光轴被倾斜地设置。
优选使用具有相对大的自由工作间距（例如大于1mm）的物镜系统作为照明光学器件及观察物镜。可以使用干式物镜或利用水或其它液体作为浸入介质的浸入物镜用于照明和观察。
优选地，扫描装置改变照明光束的入射方向，用于在相对照明光学器件的光轴平行偏移的入射平面内产生由运动的照明焦点形成的、相对照明光学器件的光轴倾斜设置的光片。观察物镜在此被设置成其光轴垂直于产生的光片。假设照明光学器件的入射光瞳被构造为圆形的，之前所述的入射平面在投射到入射光瞳上的俯视图中形成一条直线，该直线将由光瞳边缘定义的圆按照割线的形式在两个彼此不同的点上切割，而并不与该圆的中心点相交。在之前定义的俯视图中，照明光束随后沿着该割线进行倾斜运动。照明光学器件将该倾斜运动转换为照明焦点沿着一条直线的相应运动，该直线平行于之前所述的割线地延伸。以此方式，所期望的、用于照明目标区域的光片被以简单的方式产生。
在进一步的有利构型中，扫描装置包括一个控制单元以及一个与该控制单元耦联的、用于改变光片的倾斜位置的第一调节单元和一个与该控制单元耦联的、用于运动观察物镜的第二调节单元。该控制单元在此彼此相一致地控制两个调节单元，使得观察物镜以其光轴垂直于被第一调节单元调节的光片地保持定向。该构型能够实现光片以及由该光片定义的物体平面的可变的倾斜调节。此外，控制单元通过两个调节单元的适当控制负责用于跟踪观察物镜，以便确保观察物镜在物体平面上的垂直定向。
在一个可能构型中，照明光学器件沿着垂直于其光轴的调节方向可运动地导向。此外，在该构型中第一调节单元包括一个驱动装置，该驱动装置使用于改变光片的倾斜位置的照明光学器件沿着该调节方向运动。当照明光学器件垂直于其光轴地运动时，则照明光束穿过的入射光瞳的部分区域可远离光瞳中心或运动到光瞳中心，以便加强或减弱照明焦点的倾斜位置。
在一个替换的实施形式中，第一调节单元包括一个在照明光束的光路中设置在光源与照明光学器件之间的、沿着横向于照明光学器件的光轴的调节方向运动地导向的光学偏移元件和一个驱动装置，通过该偏移元件照明光束的入射平面平行于照明光学器件的光轴地偏移，该驱动装置为了改变光片的倾斜位置使该偏移元件沿着调节方向运动。在此，该偏移元件可借助该驱动装置直线地、例如垂直于照明光学器件的光轴地运动，但也是沿着一个弯曲的轨迹运动，例如绕着一个摆动轴线摆动。此外，该驱动装置可这样构造，使得该偏移元件可完全从照明光束的光路中离开。在此情况下可使用根据本发明的扫描显微镜如常规的共焦扫描显微镜，这种显微镜规定了物体的点状照明。
该光学的偏移元件例如是一个透明的、平行平面的或锥形的板，该板引起照明光束从照明光学器件的入射光瞳的中心所期望的偏移。
在一个进一步的替换实施形式中，第一调节单元包括一个设置在照明光学器件的入射光瞳的区域中的光阑和一个驱动装置，该光阑具有一个部分地透过照明光束的光阑孔并且可沿着垂直于照明光学器件的光轴的调节方向运动地导向，该驱动装置为了改变光片的倾斜位置使光阑沿着调节方向运动。光阑孔的大小确定入射到照明光学器件中的照明光束的有效射束直径。优选地，光阑孔的大小是可变的，使得通过调节光阑孔可改变照明焦点的尺寸。光阑孔越小，则照明焦点越强地扩宽。
根据本发明的照明光学器件的入射光瞳的偏心的局部照明也可以与前面所说明的不同的方式来实现。例如可考虑，照明光束在其光路上在扫描装置前平行于照明光学器件的光轴地偏移并且使其射束直径根据所期望的局部照明而减小。照明光束的平行偏移例如可通过设置倾斜放置的玻璃板实现。如果扫描装置如在常规共焦扫描显微镜通常的情况下包含一个可运动的镜装置，则前述平行偏移可用于使照明光束射到该镜装置的反射点上，该反射点相对一个照明光束在常规的共焦应用中射到镜装置上的反射点存在偏移。这种已经在扫描装置中实现的偏移随后引起了照明光束在照明光学器件的入射光瞳中的所期望的偏心。
优选地，根据本发明的扫描显微镜包括一个图像传感器，该传感器与观察物镜一起构成一个检测单元，该检测单元可借助第二调节单元运动。在该构型中，图像传感器被与观察物镜一起跟踪，从而确保了图像传感器与观察物镜始终彼此对准。
在一个特别优选的构型中，照明光束由一个激发光束和一个受激发光束汇聚成，这些光束在入射到扫描装置之前彼此重叠。照明光学器件从激发光束中产生激发焦点及从受激发光束中产生受激发焦点，所述焦点与照明焦点相重叠。在荧光显微镜的领域中，这样一个受激发光束例如可根据所谓的STED方法用于使光显微成像的空间分辨率提高超过衍射极限。在STED方法中，用于标记物体的各个区域的荧光色素通过受激发光束以其本身已知的方式有目的地受激发及由此仿佛被关闭，以便提高分辨能力。在根据本发明的扫描显微镜中，由于使用STED方法照明焦点的有效性可通过将受激发光束重叠激发光束而适用于分辨率提高及由此使得出的光片更薄地形成。当受激发光束在到达扫描装置之前已经重叠了激发光束，则这两个彼此重叠的光束通过扫描装置同时被倾斜到照明光学器件的入射光瞳中。
优选地，受激发焦点具有空间上的光强分布，该光强分布在一个平面中具有最小值及在该平面的两侧分别具有一个最大值，在该平面中由激发焦点和受激发焦点汇聚成的照明焦点运动用于产生光片。而在常规的STED-方法的应用中，受激发焦点在横截面中具有环形形状，之前所述的实施形式设有受激发焦点，该焦点在横截面中（在照明焦点运动产生光片的平面的上方及下方）具有两个强度最大值及在这些最大值之间具有一个最小值。在此，该强度横截面轮廓优选被构造成以两个相同大小的最大值对称并以一个位于其间的零位置作为最小值。
该有利的构型利用了这样的情况，即STED-激发在照明焦点在其中运动以产生光片的平面内不是必须的，甚至是不希望的。在根据本发明的技术方案中应当产生一个尽可能大面积的且同时尽可能薄的光片，以便可拍摄空间上高分辨率的光学截面图。在此，光片的面积通过运动的照明焦点的长度定义，而片厚由横向于照明焦点在其中运动的平面的照明焦点的伸展确定。之前说明的受激发焦点恰恰被这样形成，使得它仅在焦点横向伸展方向上、而并不在焦点长度伸展方向上降低激发焦点的激发有效性。
可考虑为根据本发明扫描显微镜装配一个元件，该元件用于在扫描周期内改变照明光束的强度，在该扫描周期期间照明焦点在该时间范围上运动。该构型利用照明目标区域的光片被扩展连续地通过运动的照明焦点的情况。由此，可实现目标区域的调制的或结构化的照明。为此，在照明焦点扫描目标区域的扫描周期内改变照明光束的强度。由此，照明光束的强度在扫描周期内的每个任意时间点上及由此在目标区域的每个任意位置上可根据期望调节。例如可使用声光可调谐的滤光器（AOTF）、声光调制器（AOM）或电光调制器（EOM）作为在扫描周期内改变照明光束的强度的元件。
根据本发明的另一个方案，规定了具有权利要求13特征的、用于光显微成像物体的方法。
根据本发明的方法可有利地在定位显微镜中使用。通过配量照明确保可检测单个分子。通过质心确定检测到的光子，可确定使用荧光色素的地方。
根据本发明的方法可特别有利地用于成像球形生物物体，例如大鼠或小鼠眼睛中的培养组织。
附图说明
本发明在下述根据附图详细说明。其中示出了：
图1a在常规共焦扫描显微镜中使用的、为了产生照明焦点而完全照亮照明光学器件的入射光瞳的示意图；
图1b在图1a中示出的照明焦点的俯视图；
图2a在常规共焦扫描显微镜中使用的、通过倾斜入射到照明光学器件的入射光瞳中的照明光束进行扫描的示意图；
图2b在图2a中示出的照明焦点的俯视图；
图3a根据本发明的、用照明光束对照明光学器件的入射光瞳的局部照明的示意图；
图3b在图3a中示出的照明焦点的俯视图；
图4a根据本发明的、通过倾斜局部照明照明光学器件的入射光瞳的照明光束进行扫描的示意图；
图4b在图4a中示出的照明焦点的运动序列的示意图；
图5作为第一实施例的共焦扫描显微镜；
图6通过在图5中示出的照明光学器件的移动斜置照明焦点的示意图；
图7观察物镜定向在斜置的照明焦点上的示意图；
图8作为第二实施例的共焦扫描显微镜；
图9作为第三实施例的共焦扫描显微镜；
图10作为第四实施例的共焦扫描显微镜；
图11在根据图10的扫描显微镜中设置的、用于斜置照明焦点的光阑板的示意图；
图12作为第五实施例的按照STED方法工作的共焦扫描显微镜；
图13a激发焦点与受激发焦点重叠的示意图；
图13b在图13a中示出的激发焦点和受激发焦点的俯视图。
具体实施方式
在下面结合图1至4首先说明了根据本发明的偏心的光瞳局部照明的原理。特别是解释了，照明光学器件10如何从射到照明光学器件10的入射光瞳14上的照明光束12中以本发明的方式产生照明焦点16。在此指出，之前所述附图是纯粹的示意图，这些示意图应仅仅用于简化对发明的理解。
在图1a中首先示意性地示出了对于常规共焦的、点状扫描典型的情况，其中，由照明光束12形成的光束利用照明光学器件10的完整孔径，也就是说，穿过照明光学器件10的入射光瞳14的整个面积。在图1a中照明光学器件10的光轴用O1表示。照明光束12在图1a示出的情况下平行于照明光学器件10的光轴O1定向。照明光学器件10产生照明焦点16形式的聚焦的光分布，该照明焦点沿着光轴O1的伸展大于横向于光轴O1的伸展。
在后续的说明中，分别结合一个坐标系，该坐标系的x轴在附图平面中水平地及其z轴在附图平面中垂直地定向，而y轴从附图平面中指向外。在这种定义中，入射光瞳14平行于x-y平面地设置，而光轴O1平行于z轴地延伸。
图1b示出了在沿光轴O1的观察方向的俯视图中的照明焦点16。在常规布置中，照明焦点16在俯视图中为圆形。
图2a示出了照明焦点16的位置在照明光束12被在照明光学器件10的入射光瞳14中倾斜时如何改变。在此，对于在图2a中示出的情况假设，由照明光束12构成的照射光束的主射束在入射平面中倾斜，该入射平面平行于x-z平面。此外，照明光束12还应总是穿透过入射光瞳12的整个面积，也就是说完全地照亮入射光瞳14。
照明光束12在入射平面中这样倾斜，使得它将其入射方向相对光轴O1改变。入射方向的改变由照明光学器件10转换为照明焦点16横向于光轴O1的移动。在图2a中示出的情况中这种运动沿着x轴发生。由于照明光束12还总是穿透过入射光瞳14的整个面积，照明焦点16的纵向延伸保持平行于光轴O1地定向。这也在图2b中示出的俯视图中示出，其中照明焦点16分别总是为圆形的。
在图3a中示出了根据本发明的照明光学器件10的入射光瞳14的局部照明。如图3a中可见，照明光束12仅仅穿透过入射光瞳14的部分区域，其中该部分区域被偏心地设置，也就是说横向于光轴O1地从光瞳中心偏移。照明光束12在入射光瞳14中的偏心导致照明焦点16被相对光轴O1斜置。这也可由根据图3b的俯视图中可见，其中，照明焦点16不再为圆形，而是在x轴方向上长于在y轴方向上。通过对入射光瞳14的局部照明此外引起了照明焦点16的扩宽，也就是说，照明焦点16整体上大于在完全照亮入射光瞳14的情况。
在图4a中示出了偏心地局部照明入射光瞳14的照明光束12在入射光瞳14中倾斜的情况。在此，对于图4a中示出的情况应假设，形成照明光束12的照射光束的主射束在于光轴O1平行的入射平面中倾斜，该平面平行于y-z平面。这意味着，该照明光束12在图4a中从附图平面倾斜出及倾斜到该平面中。照明光束12的倾斜通过照明光学器件10在转换为斜置的照明焦点16沿着y轴的相应移动。因此，照明焦点16在图4a中从该附图平面中移动出及移动到该平面中。这在图4b的示图中被再一次示出。
在图4b中示出的照明焦点16的运动序列清楚地说明了如何通过照明焦点16的运动在扫描周期内构成光片18。这里，之前所述的扫描周期为在其中照明光束12进行一次完整的倾斜运动的时间。扫描周期短于检测时间，在该检测时间内，在图4a和4b中未示出的光检测器工作以生成图像，也就是检测运动的照明焦点。这意味着，光检测器在时间上及由此在空间上不分辨地检测运动的照明焦点16。相反，它检测光片18形式的连贯的或连续的光分布。
图5示出了示意图中的作为第一实施例的共焦扫描显微镜。扫描显微镜100被这样构造，按照图3和4中草拟的照明原理来工作。在此要指出的是，在图5的示意图中删除了扫描显微镜100的一些组件，这些组件对于理解发明的技术方案并不是重要的。
扫描显微镜100构成一个共焦荧光显微镜，该显微镜具有激光光源20，该光源发射照明光束12。照明光束12的波长被这样选择，使得在应用显微方法中使用的荧光色素通过照明光束12被激发用于发出荧光射束。
照明光束12射到一个镜子22上，该镜子将照明光束12定向在图中纯示意性示出的电镀镜装置24上。该电镀镜装置24用于这样地偏转照明光束12，使得其进行在图4a中示出的扫描运动。为此，电镀镜装置24借助于在图5中未详细示出的镜驱动装置相应地运动。接着，照明光束12通过扫描透镜26和镜筒透镜28射入并最终射到照明光学器件10上。
沿着其照明光束12射到照明光学器件10上的光轴在图5中用O2表示。光轴O2平行地偏移于照明光学器件10的从中心穿透过入射光瞳14的光轴O1。此外，射入照明光学器件10中的照明光束12并不完全照亮入射光瞳。这意味着，照明光束12仅穿透过入射光瞳14的部分区域及由此并不利用照明光学器件10的整个孔径。入射光瞳14的局部照明由光阑29引起，该光阑相应地修剪由激光光源20发射出的照明光束12的横截面。光阑29在图5中示出的实施例中设置在镜子22的前面。但是，它也可被设置在照明光束12的光路中的其它位置上。光阑29的光阑孔可被可变地调节，由此，射到照明光学器件10的入射光瞳14上的照明光束12的横截面以及入射光瞳14的局部照明可任意地变化。
为了能够可变地调节被照明光束穿透过的入射光瞳14的偏心区域，照明光学器件10在图5中用双箭头A示出的调节方向上被可运动地导向。调节方向A垂直于照明光学器件10的光轴O1。
一个与照明光学器件10耦联的第一驱动装置30用于使照明光学器件10沿着调节方向A运动。该驱动装置30通过一个控制单元32控制。
图5中示出的组件24，26，28，30和32是一个总体上用33表示的扫描装置的部件，该扫描装置用于使照明光束12在照明光学器件10的入射光瞳14中如其在图4a和4b中示出的那样倾斜。扫描装置33与照明光学器件10配合作用产生光片18，该光片照亮一个设置在物体支座34上的物体36的待成像的目标区域。
扫描显微镜100此外具有一个观察物镜38，该物镜这样地在样品36上定向，使得其在图5中用O3表示的光轴垂直地竖立在光片18上。由于光片18相对照明光学器件10的光轴O1倾斜，观察物镜38的光轴O3和照明光学器件10的光轴O1围成一个锐角α，该锐角小于90度。在图5中示出的实施例中该角α为大约60度。
观察物镜38通过一个镜筒透镜40将物体36的借助光片18照亮的目标区域成像到光敏传感器42上。在此，观察物镜38的光轴O3垂直于该光检测器42的光接收面44。观察物镜38、镜筒透镜40和光检测器42构成一个检测单元46，该检测单元可借助于一个垂直于O3定向的第二驱动装置47在光片16上摆动，如在图5中通过双箭头B示出的那样。第二驱动装置47同样通过控制单元32控制。
控制单元32控制两个驱动装置30和47，使得包含观察物镜38的检测单元46在照明光学器件10沿着调节方向A移动时通过在摆动方向B上的摆动被这样地跟踪，使得接收物镜38以其光轴O3保持垂直地定向在位置可变的光片18上。照明光学器件10沿着调节方向A的移动和检测单元46在摆动方向B上的摆动通过控制单元32被这样地彼此协调，使得始终保持观察物镜38在光片18上的直角定向。
在图6的示意图中示出了，在图5中示出的实施例中照明光学器件10垂直于光轴O1的移动如何造成照明焦点16的可变的斜置。在图6的左侧部分附图中所示，当照明光束12射到照明光学器件10的入射光瞳14中心上时，长形的照明焦点16沿着光轴O1定向。如果照明光学器件10垂直于其光轴O1地移动，使得照明光束12从光瞳中心移动到光瞳边缘，则照明焦点16相对光轴O1增大倾斜地设置。这更清楚地说明了，可如何通过照明光学器件10的移动改变由照明焦点16产生的光片18的定向。
在图7中再一次示出了，观察物镜38如何被定向到由照明光学器件10产生的照明焦点16上。则观察物镜38的光轴O3垂直于照明焦点16的纵向伸展地延伸。此外，在图7中再一次表明，如何通过照明光束12在照明光学器件10的入射光瞳14中的倾斜从运动的照明焦点16中产生光片18。
图8示出了作为第二实施例的扫描显微镜200。扫描显微镜200的那些与图5中示出的扫描显微镜100的组件相一致的组件设有在图5中使用的参考标记并且在下面不再说明。
根据图8的实施例与图5中示出的实施例的区别在于，代替观察光学器件10，可在摆动方向C上摆动地导向一个透明的平面平行的板50、例如玻璃板，以便调节照明光束12在照明光学器件10的入射光瞳14中的偏心入射。该平面平行的板50设置在镜筒透镜28与入射光瞳14之间的照明光束12的光路中。它相对照明光学器件10的光轴O1倾斜地定向。由此，照明光束12在穿透该平面平行的板50时具有平行偏移，该偏移可使该照明光束偏心地入射到照明光学器件10的入射光瞳14中。
照明光束12的平行偏移可变化，其方式是，驱动装置30在摆动方向C上倾斜该平面平行的板50，该板可绕一个垂直于图8的附图平面延伸的摆动轴线51摆动地支承。
图9示出了作为第三实施例的扫描显微镜300。该扫描显微镜300相对图8中示出的显微镜200被如下修改，使得该平面平行的板50被替换为一个透明的、锥形的板60。当照明光束入射穿过该锥形的板60时，该锥形的板60也引起照明光束12的偏移。驱动装置30在该实施例中并不使该锥形的板60垂直于照明光学器件10的光轴O1、而是沿着一个调节方向D地运动，该调节方向相对光轴O1倾斜。
图10示出了作为第四实施例的扫描显微镜400。该实施例与图8中示出的实施例的区别在于，为了实现照明光束12偏心地入射到入射光瞳14中而代替平面平行的板50地设有一个可沿着调节方向A运动地导向的光阑板52。该光阑板52具有一个可变的光阑孔54，该孔使照明光束12在穿透过光阑孔54时这样地修剪其横截面，使得实现了入射光瞳14所希望的局部照明。由于光阑孔54可被任意地调节，则在图10中示出的实施例中也可放弃在之前的实施例中设置的光阑元件29。
在图11中再次示意性示出了光阑板52的作用方式。当驱动装置30使光阑板52垂直于照明光学器件10的光轴O1移动时，照明光束12的、穿透过光阑孔54的部分从光瞳中心偏移出。如果照明光束12的穿透部分从光瞳中心移动到光瞳边缘，则照明焦点16相对光轴O1增大倾斜地设置。
在图11中示出了由于与入射光瞳14相距一定间距而较简单地示出的光阑板54。但是由此指出，光阑板54优选尽可能近地设置在入射光瞳14旁，以便不会不利地影响照明光束12在入射光瞳14中的设置用于运动照明焦点16的倾斜运动。
图12示出了作为第五实施例的扫描显微镜。该扫描显微镜500与图5中示出的实施例相比被如下修改，该显微镜被这样设计，即，使用本身已知的STED-方法实现超过衍射极限的空间分辨率。在此需指出的是，这种变化不仅仅对于图5中示出的实施例、而且对于所有其它的实施例都是可能的。
扫描显微镜500包括一个激发光源61，该光源发射激发光束62，该光束的波长被这样选择，使得使用的荧光色素被激发用于输出荧光射束。此外，扫描显微镜500包括一个受激发光源64，该光源发射受激发光束66，该受激发光束以进一步在下面说明的方式与激发射束62相重叠并且其波长被这样选择，使得被激发光束62照亮的荧光色素通过受激发射而受激发及由此似乎被关闭。由受激发光源64发出的受激发光束66穿透过一个相板68，该相板用于调节受激发光束66的期望的强度包络。
激发光束62穿透过一个光阑70并且射到一个镜子72上，该镜子朝着分束器74的方向反射激发光束62。分束器74被这样构造，使得在它反射穿透过相板68和另一光阑76的受激发光束66期间，它允许激发光束62透过。以此方式，激发光束62和其强度包络受相板68影响的受激发光束66彼此重叠。这两个彼此重叠的光束62和66形成照明光束12。
在图13a和13b中示出了，激发光束62和受激发光束66形成照明光束12的重叠如何造成所应用的显微方法的分辨能力的提高。
在照明射束12在此由激发光束62和受激发光束66重叠构成之后，照明光学器件10产生一个激发焦点80以及一个受激发焦点82，这些焦点以其重叠得出在图13a和13b中用84表示的照明焦点。在此，在图13a和13b中示出的激发焦点80的形状相应于在图3和4中示出的照明焦点16的形状。
在图13b中，激发焦点80、受激发焦点82和得出的照明焦点84在一个平行于x-z平面的截面中示出。如由此示图中清楚可见，受激发焦点82具有空间的光强分布，在该光强分布中光强在一个平面内等于零，在该平面内由激发焦点80和受激发焦点82汇聚成的照明焦点84在其中运动，而该光强分布在该平面的两侧均具有最大值。前述平面在图13b中用86表示。它平行于一个平面，该平面包含y轴并且其与x-z平面的交叉线与x轴形成一个角度。该角度与使用的照明光学器件10的最大张开角以及照明光束12的扩宽以及偏心相关。
当激发焦点80在该运动平面86的上方及下方与受激发焦点82重叠时，激发焦点80的激发有效性从运动平面86之上及之下降下来。激发焦点80的有效激发部分在图13b中被用阴影示出。
在图13b中，激发焦点62仿佛沿通过线88示出的方向收缩。该收缩方向88垂直地竖立在运动平面86上。激发焦点80与受激发焦点82的重叠引起了有效激发的光片似乎被变薄，由此提高了空间分辨率。
参考标号表
10 照明光学器件
12 照明光束
14 入射光瞳
16 照明焦点
18 光片
20 激光光源
22 镜子
24 镜装置
26 扫描透镜
28 镜筒透镜
30 驱动装置
32 控制单元
34 物体支座
36 物体
38 观察物镜
40 镜筒透镜
42 光检测器
44 光接收面
46 检测单元
47 驱动装置
50 平面平行的板
51 摆动轴线
52 光阑板
54 光阑孔
60 锥形板
61 激发光源
62 激发光束
64 受激发光源
66 受激发光束
68 相板
70 光阑
72 镜子
74 分束器
76 光阑
80 激发焦点
82 受激发焦点
84 照明焦点
86 运动平面
88 收缩方向
Claims (18)
1.扫描显微镜（100，200，300，400，500），具有：
用于发射照明光束（12）的光源（20，61，64），
用于在待成像的物体（36）中产生长形的照明焦点（16，84）的照明光学器件（10），和
扫描装置（33），用于使照明焦点（16，84）在待成像的物体（36）的待照明的目标区域上通过改变入射方向而运动，照明光束（12）在该入射方向上射到照明光学器件（10）的入射光瞳（14）上，
其特征在于，
扫描装置（33）为了使照明焦点（16，84）相对照明光学器件（10）的光轴（O1）斜置使照明光束（12）定向在照明光学器件（10）的入射光瞳（14）的从光瞳中心偏移出的部分区域上并且为了使照明焦点（16，84）在待照明的目标区域上运动使照明光束（12）的入射方向在该部分区域中改变，并且设有一个与照明光学器件（10）在空间上分开的观察物镜（38），该观察物镜被设置成其光轴（O3）基本上垂直于被照明的目标区域且相对照明光学器件（10）的光轴（O1）成一锐角（α）。
2.根据权利要求1所述的扫描显微镜（100，200，300，400，500），其特征在于，
扫描装置（33）在入射平面内改变照明光束（12）的入射方向，以产生由运动的照明焦点（16，84）形成的、相对照明光学器件（10）的光轴（O1）斜置的光片（18），该入射平面相对照明光学器件（10）的光轴（O1）平行偏移，并且
观察物镜（38）以其光轴（O3）垂直于该光片（18）地设置。
3.根据权利要求2所述的扫描显微镜（100，200，300，400，500），其特征在于，
扫描装置（33）包括控制单元（32）以及与该控制单元（32）耦联的、用于改变光片（18）的倾斜位置的第一调节单元（30，50，52，60）和与该控制单元（32）耦联的、用于运动观察物镜（38）的第二调节单元（47），并且
该控制单元（32）使所述两个调节单元（30，50，52，60；47）彼此相协调地控制，使得观察物镜（38）保持定向为其光轴（O3）垂直于由第一调节单元（30，50，52，60）调节的光片（18）。
4.根据权利要求3所述的扫描显微镜（100），其特征在于，
照明光学器件（10）沿着一个垂直于其光轴（O1）的调节方向（A）被运动地导向，并且，
第一调节单元包括驱动装置（30），该驱动装置使照明光学器件（10）沿着调节方向（A）运动以改变光片（18）的倾斜位置。
5.根据权利要求3所述的扫描显微镜（200，300），其特征在于，第一调节单元包括：
在照明光束（12）的光路中设置在光源（20）与照明光学器件（10）之间的、可沿着横向于照明光学器件（10）的光轴（O1）的调节方向（A，C，D）运动地导向的光学偏移元件（50，60），通过该光学偏移元件，照明光束（12）的入射平面平行于照明光学器件（10）的光轴（O1）地偏移，和
驱动装置（30），该驱动装置使偏移元件（50，60）沿着调节方向（A，C，D）运动以改变光片（18）的倾斜位置。
6.根据权利要求5所述的扫描显微镜（200，300），其特征在于，光学偏移元件是一个透明的、平面平行的或锥形的板（50，60）。
7.根据权利要求2至6中之一所述的扫描显微镜（400），其特征在于，第一调节单元包括：
设置在照明光学器件（10）的入射光瞳（14）的区域中的光阑（52），该光阑具有部分地穿透过照明光束（12）的光阑孔（54）并且可沿着垂直于照明光学器件（10）的光轴（O1）运动地导向，和
驱动装置（30），该驱动装置使该光阑（52）沿着调节方向（A）运动以改变光片（18）的倾斜位置。
8.根据权利要求3至7中之一所述的扫描显微镜（100，200，300，400，500），其特征在于光检测器（42），该光检测器与观察物镜（38）构成检测单元（46），该检测单元可借助第二调节单元（47）运动。
9.根据前述权利要求之一所述的扫描显微镜（100，200，300，400，500），其特征在于，扫描装置（33）具有镜装置（24）和镜驱动装置，该镜装置将由光源（20，61，64）发射的照明光束（12）反射到入射光瞳（14）从光瞳中心偏移出的部分区域中，该镜装置可通过该镜驱动装置运动以改变照明光束（12）的入射方向。
10.根据权利要求2至9中之一所述的扫描显微镜（100，200，300，400，500），其特征在于，
照明光学器件（10）的入射光瞳（14）的由照明光束（12）穿透过的部分区域占入射光瞳（14）的整个面积的约0.1%至50%，及
入射平面相对照明光学器件（10）的光轴（O1）的平行偏移为入射光瞳（14）的半径的约4%至96%。
11.根据前述权利要求之一所述的扫描显微镜（500），其特征在于，
照明光束（12）由激发光束（62）和受激发光束（66）汇聚成，这些光束在入射到扫描装置（33）之前彼此重叠，并且
照明光学器件（10）从激发光束（62）中产生激发焦点（80）及从受激发光束（66）中产生受激发焦点（82），这些焦点彼此重叠为照明焦点（84）。
12.根据权利要求11所述的扫描显微镜（500），其特征在于，受激发焦点（82）具有空间上的光强分布，该光强分布在一个平面（86）中具有最小值及在该平面（86）的两侧分别具有最大值，由激发焦点（80）和受激发焦点（82）汇聚成的照明焦点（84）在该平面中运动用于产生光片（18）。
13.用于光显微成像物体（36）的方法，具有以下步骤：
发射照明光束（12），
借助照明光学器件（10）在待成像的物体（36）中产生一个长形的照明焦点（16，84），
通过改变入射方向使照明焦点（16，84）在物体（36）的待照明的目标区域上运动，照明光束（12）沿着该入射方向射到照明光学器件（10）的入射光瞳（14）中，
其特征在于，
为了相对照明光学器件（10）的光轴（O1）斜置照明焦点（16，84），照明光束（12）被定向在入射光瞳（14）的从光瞳中心偏移出的部分区域上，并且为了使照明焦点（16，84）在待照明的目标区域上运动而在该部分区域内改变照明光束（12）的入射方向，并且
用倾斜设置的照明焦点（16，84）照明的目标区域通过一个与照明光学器件（10）在空间上分开的观察物镜（38）成像，该观察物镜被设置成其光轴（O3）基本上垂直于被照明的目标区域并且与照明光学器件（10）的光轴（O1）成一锐角（α）。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，为了产生由运动的照明焦点（16，84）构成的光片（18），照明光束（12）的入射方向被在一个入射平面内改变，该入射平面相对照明光学器件（10）的光轴（O1）平行地偏移，并且
观察物镜（38）的光轴（O3）垂直于该光片（18）地设置。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，改变光片（18）的倾斜位置及与光片（18）的倾斜位置的改变相一致地移动观察物镜（38），使得该观察物镜（38）保持定向为其光轴（O3）垂直于被调节的光片（18）。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，观察物镜（38）与一个光检测器（42）共同地运动。
17.根据权利要求14至16中之一所述的方法，其特征在于，
照明光束（12）由激发光束（62）和受激发光束（66）汇聚而成，并且
从激发光束（62）中产生激发焦点（80）及从受激发光束（66）中产生受激发焦点（82），这些焦点彼此重叠成照明焦点（84）。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，受激发焦点（82）的空间强度分布这样地调节，使得它在一个平面（86）中具有最小值及在该平面（86）的两侧分别具有最大值，在该平面中，移动由激发焦点（80）和受激发焦点（82）汇聚成的照明焦点（84）以产生光片（18）。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105122093A (zh) * | 2013-03-08 | 2015-12-02 | 法玛科技顾问股份有限公司 | 棱镜及应用此棱镜的光学检测系统 |
| CN105359025A (zh) * | 2013-07-10 | 2016-02-24 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 用于光片显微技术的设备 |
| CN105765438A (zh) * | 2013-11-25 | 2016-07-13 | 欧洲分子生物学实验室 | 用于使样本成像的光学布置 |
| CN108292034A (zh) * | 2015-10-09 | 2018-07-17 | 徕卡显微系统复合显微镜有限公司 | 用于利用结构化的光片照射检查试样的方法和设备 |
| CN108885336A (zh) * | 2016-04-08 | 2018-11-23 | 徕卡显微系统复合显微镜有限公司 | 用于研究样品的方法和显微镜 |
| CN110799878A (zh) * | 2017-06-23 | 2020-02-14 | 莱卡微系统Cms有限责任公司 | 具有光片显微的功能单元的显微系统 |
| CN111983795A (zh) * | 2019-05-24 | 2020-11-24 | 阿贝里奥仪器有限责任公司 | 用于监测显微镜的聚焦状态的方法和装置 |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102009044986A1 (de) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Mikroskop |
| DE102012218920A1 (de) * | 2012-10-17 | 2014-04-17 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Vorrichtung zur Beleuchtung einer Probe |
| DE102012110077A1 (de) * | 2012-10-23 | 2014-06-26 | Karlsruher Institut für Technologie | Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl in Form einer Lichtscheibe |
| DE102013213781A1 (de) * | 2013-03-20 | 2014-09-25 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren und optische Anordnung zum Manipulieren und Abbilden einer mikroskopischen Probe |
| EP3605183A1 (en) * | 2013-05-10 | 2020-02-05 | European Molecular Biology Laboratory | Microscope for selective plane illumination microscopy |
| DE102013012182A1 (de) * | 2013-07-22 | 2015-01-22 | Hans-Ulrich Dodt | Modulares Mikroskopobjektiv für Immersionsmedium |
| FR3010194B1 (fr) * | 2013-08-28 | 2017-10-27 | Imagine Optic | Systeme et methode de microscopie par eclairage par la tranche |
| DE102014102215A1 (de) | 2014-02-20 | 2015-08-20 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Lichtblattmikroskopie |
| WO2015157769A1 (en) * | 2014-04-11 | 2015-10-15 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Scanning imaging for encoded psf identification and light field imaging |
| DE102014118025B4 (de) * | 2014-12-05 | 2024-03-28 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Vorrichtung zur Lichtblattmikroskopie |
| JP6671725B2 (ja) * | 2014-12-23 | 2020-03-25 | グローバル・ライフ・サイエンシズ・ソリューションズ・ユーエスエー・エルエルシー | 選択的平面照明顕微鏡法機器 |
| DE102015209756A1 (de) * | 2015-05-28 | 2016-12-01 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Anordnung und Verfahren zur Lichtblattmikroskopie |
| DE102016011227C5 (de) | 2016-09-19 | 2020-04-09 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Mikroskopsystem und Verfahren zur Abbildung einer Probe unter Verwendung eines Mikroskopsystems |
| WO2018089839A1 (en) | 2016-11-10 | 2018-05-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Rapid high-resolution imaging methods for large samples |
| US11092793B2 (en) | 2017-11-30 | 2021-08-17 | Fondazione Istituto Italiano Di Tecnologia | Method of lightening at least one biological sample, three-dimensional high resolution depletion microscopy method and corresponding microscope |
| JP7207860B2 (ja) * | 2018-04-09 | 2023-01-18 | 浜松ホトニクス株式会社 | 試料観察装置 |
| CN111208634B (zh) * | 2020-01-18 | 2022-02-08 | 哈尔滨工业大学 | 基于频谱合成的超分辨全内反射显微成像装置和方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1349093A (zh) * | 2001-10-26 | 2002-05-15 | 清华大学 | 多功能分子雷达 |
| CN1511248A (zh) * | 2001-02-28 | 2004-07-07 | ���ְ�˹��ѧ��ҵ��ʽ���� | 共焦点显微镜、光学式高度测定方法及自动聚焦方法 |
| CN101403680A (zh) * | 2008-11-12 | 2009-04-08 | 中国科学院上海光学精密机械研究所 | 针尖扫描式原子力显微镜的光束跟踪装置 |
| WO2010012980A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Imperial Innovations Limited | Optical arrangement for oblique plane microscopy |
| US20110031414A1 (en) * | 2008-04-11 | 2011-02-10 | Helmut Lippert | Device for microscopy having selective illumination of a plane |
| DE102009044987A1 (de) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Mikroskop |
| CN102053047A (zh) * | 2010-11-12 | 2011-05-11 | 北京理工大学 | 可兼顾分辨力和量程的激光差动共焦theta扫描检测方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4416558C2 (de) | 1994-02-01 | 1997-09-04 | Hell Stefan | Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| US5952668A (en) | 1994-07-15 | 1999-09-14 | Baer; Stephen C. | Resolution in microscopy and microlithography |
| GB0200938D0 (en) * | 2002-01-16 | 2002-03-06 | Solexa Ltd | Prism design for scanning applications |
| DE102005027077C5 (de) | 2004-11-04 | 2021-01-28 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Lichtscheibenmikroskop |
| WO2006058187A2 (en) | 2004-11-23 | 2006-06-01 | Robert Eric Betzig | Optical lattice microscopy |
| DE102005007756B4 (de) * | 2005-02-16 | 2022-09-29 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Scanmikroskop |
| EP3203235A1 (en) | 2005-05-23 | 2017-08-09 | Harald F. Hess | Optical microscopy with phototransformable optical labels |
| DE102006021317B3 (de) | 2006-05-06 | 2007-10-11 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verfahren und Fluoreszenzlichtmikroskop zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe |
| US7776613B2 (en) | 2006-08-07 | 2010-08-17 | President And Fellows Of Harvard College | Sub-diffraction image resolution and other imaging techniques |
| DE102007015063B4 (de) * | 2007-03-29 | 2019-10-17 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Optische Anordnung zum Erzeugen eines Lichtblattes |
| US8059336B2 (en) * | 2007-05-04 | 2011-11-15 | Aperio Technologies, Inc. | Rapid microscope scanner for volume image acquisition |
| DE102007045897A1 (de) * | 2007-09-26 | 2009-04-09 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe |
| DE102008024568A1 (de) | 2008-05-21 | 2009-12-03 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer interessierenden Struktur einer Probe |
| US8711211B2 (en) * | 2010-06-14 | 2014-04-29 | Howard Hughes Medical Institute | Bessel beam plane illumination microscope |
| DE102010042351B4 (de) * | 2010-10-12 | 2014-02-13 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Mikroskopbeleuchtungssystem, Mikroskop und Verfahren zur schrägen Auflichtbeleuchtung |
-
2011
- 2011-06-14 DE DE102011051042.7A patent/DE102011051042B4/de not_active Expired - Fee Related
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2012
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- 2012-06-13 US US13/495,091 patent/US8472113B2/en active Active
- 2012-06-14 CN CN201210199225.5A patent/CN102830488B/zh active Active
- 2012-06-14 EP EP12171939.7A patent/EP2535754B1/de active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1511248A (zh) * | 2001-02-28 | 2004-07-07 | ���ְ�˹��ѧ��ҵ��ʽ���� | 共焦点显微镜、光学式高度测定方法及自动聚焦方法 |
| CN1349093A (zh) * | 2001-10-26 | 2002-05-15 | 清华大学 | 多功能分子雷达 |
| US20110031414A1 (en) * | 2008-04-11 | 2011-02-10 | Helmut Lippert | Device for microscopy having selective illumination of a plane |
| WO2010012980A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Imperial Innovations Limited | Optical arrangement for oblique plane microscopy |
| CN101403680A (zh) * | 2008-11-12 | 2009-04-08 | 中国科学院上海光学精密机械研究所 | 针尖扫描式原子力显微镜的光束跟踪装置 |
| DE102009044987A1 (de) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Mikroskop |
| CN102053047A (zh) * | 2010-11-12 | 2011-05-11 | 北京理工大学 | 可兼顾分辨力和量程的激光差动共焦theta扫描检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MIKE FRIEDRICH, ET AL: "sted-spim:stimulated emission depletion improves sheet illumination microscopy resolution", 《BIOPHYSICAL JOURNAL》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105122093A (zh) * | 2013-03-08 | 2015-12-02 | 法玛科技顾问股份有限公司 | 棱镜及应用此棱镜的光学检测系统 |
| CN105359025A (zh) * | 2013-07-10 | 2016-02-24 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 用于光片显微技术的设备 |
| CN105765438A (zh) * | 2013-11-25 | 2016-07-13 | 欧洲分子生物学实验室 | 用于使样本成像的光学布置 |
| US10983320B2 (en) | 2013-11-25 | 2021-04-20 | European Molecular Biology Laboratory | Optical arrangement for imaging a sample |
| CN108292034A (zh) * | 2015-10-09 | 2018-07-17 | 徕卡显微系统复合显微镜有限公司 | 用于利用结构化的光片照射检查试样的方法和设备 |
| CN108885336A (zh) * | 2016-04-08 | 2018-11-23 | 徕卡显微系统复合显微镜有限公司 | 用于研究样品的方法和显微镜 |
| CN108885336B (zh) * | 2016-04-08 | 2021-12-14 | 徕卡显微系统复合显微镜有限公司 | 用于研究样品的方法和显微镜 |
| CN110799878A (zh) * | 2017-06-23 | 2020-02-14 | 莱卡微系统Cms有限责任公司 | 具有光片显微的功能单元的显微系统 |
| US11314072B2 (en) | 2017-06-23 | 2022-04-26 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Microscope system with light sheet microscopy functional unit |
| CN111983795A (zh) * | 2019-05-24 | 2020-11-24 | 阿贝里奥仪器有限责任公司 | 用于监测显微镜的聚焦状态的方法和装置 |
| CN111983795B (zh) * | 2019-05-24 | 2024-05-14 | 阿贝里奥仪器有限责任公司 | 用于监测显微镜的聚焦状态的方法和装置 |
Also Published As
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