CN103091825B - 用于照明样品的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在SPIM显微术中用于照明样品的系统，包括：光源，所述光源用于产生光束；光学装置，所述光学装置用于从所述光束形成光带，特别地用于从至少一个方向对照明平面上的样品进行大体上平面照明；至少一个物镜，所述至少一个物镜具有被设计的且意欲将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至检测器的物镜光学部件，所述物镜光学部件与所述光带相互作用；且进一步包括光转向器件，所述光转向器件放置在所述物镜光学部件下游以将所述光带偏转，以使在偏转之后所述光带相对于所述物镜的光轴以非零度的角度、特别是以直角传播，和/或位于不平行于所述物镜的光轴的平面上。本发明还涉及一种在SPIM显微术中用于照明样品的方法。

Description

用于照明样品的方法和系统
技术领域
本发明涉及在SPIM显微术中用于照明样品的方法和系统。本发明还涉及显微镜，特别是扫描显微镜和/或共焦扫描显微镜，以及涉及使用该系统和实施该方法用于对样品进行显微成像的实验设备。
背景技术
上文所述的本发明所相关的选择性平面照明显微术(SPIM)技术在例如Lindek等；Journal of modern optics，1999，卷46，序号5，页843-858中有描述。
在DE 10257423A1中描述了根据SPIM方法操作的显微镜。在该显微镜中，当观测发生在垂直于照明光带的平面时，样品被窄光带照明。此时，通过两个分开的光学系统实施照明和检测，其中，两个分开的光学系统具有分开的光学部件，特别地，具有两个分开的被定向为相互垂直的物镜。光带通过照明物镜和上游的圆柱状的光学元件产生。对于图像获取，样品被移动通过相对于检测器静止的光带以使用平面检测器分层地捕获荧光和/或散射光。所获得的断层图像数据可以汇集在一个表示样品的三维图像的数据集中。为了产生尽可能窄的光带，照明物镜必须具有相应的大数值孔径。另外，照明物镜的自由工作距离必须足够大以防止与观测物镜的碰撞。在对某些样品(尤其是生物样品)进行成像时，两个物镜的垂直布置可能是不利的。例如，将球状物体以无碰撞模式放置在物镜的直角布置之下通常是不可能的。除了对于样品制备的严格要求之外，在样品中还频繁地发生不期望的成阴。
在WO 2010/012980A1所描述的改进的SPIM技术中，使用同一个物镜进行照明和检测。该物镜的入射光瞳在偏心的位置被欠照明，即，照明光束通过横向地偏离光轴的入射光瞳的一部分。物镜上游的圆柱状透镜在样品中产生光条，该光条向物镜的光轴倾斜。然后，被该光条所照明的样品区域通过物镜被成像在检测器上。但是，该器件被设计为专门用于通过光条对样品的倾斜照明而不允许用于不同的用途，且尤其不允许用于样品的逐点共焦扫描或光条的空间光强度分布的变化，特别地，不允许用于通过被定向为垂直于物镜的光轴的光条的照明。
德国专利公布DE 10 2004 034 957A1描述一种用于通过显微镜物镜进行显微观测的布置，其中，用于照明样品的光的光导设置在透镜光学部件外部的物镜外壳中。照明光最初在光导内平行于物镜光轴传播，然后撞击在小孔径的反射器上，反射器安装在物镜外壳上，且反射器在另外的成像元件的帮助下，将照明光沿着垂直于显微镜物镜的光轴的方向聚焦在样品上，从而垂直于观测方向。在此，根据SPIM原理还设置样品的平面照明。尽管使用以这种方式配置的显微镜物镜确实消除使用用于照明光的另外的物镜的需要，具有另外的光导的专门的物镜和反射器的专门设计在技术上非常复杂且价格昂贵。
发明内容
本发明的目的在于改进上文所述的在SPIM显微术中用于照明样品的方法和系统，以使平面样品照明(特别是在垂直于观测方向的平面样品照明)成为可能，当优选地允许使用许多总是存在于显微镜(特别是扫描显微镜)中的部件时，平面样品照明是快捷可调的，且是可靠的以及多用途的。
该目的通过根据权利要求1的用于照明样品的方法，以及通过根据权利要求17的用于照明样品的系统实现。本发明有利的实施例为从属权利要求的主题。
相应地，本发明提供一种在SPIM显微术中用于照明样品的方法，包括以下步骤：
a.产生光束；
b.经过与所述光束相互作用的光学装置从所述光束形成光带；
c.使所述光带通过至少一个物镜，所述物镜具有被设计的且意欲将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至检测器的物镜光学部件，所述物镜光学部件与所述光带相互作用；和
d.通过所述物镜光学部件下游的光转向器件将所述光带偏转，以使在偏转之后所述光带相对于所述物镜的光轴以非零度的角度、特别是直角传播，且优选地被聚焦在所述样品上以照明所述样品。
进一步地，本发明提供一种系统，包括：
a.光源，所述光源用于产生光束；
b.光学装置，所述光学装置用于从所述光束形成光带，特别地用于从至少一个方向对照明平面上的样品进行大体上平面照明；
c.至少一个物镜，所述至少一个物镜具有被设计的且意欲将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至检测器的物镜光学部件，所述物镜光学部件与所述光带相互作用；和
d.光转向器件，所述光转向器件放置在所述物镜光学部件下游以将所述光带偏转，以使在偏转之后所述光带相对于所述物镜的光轴以非零度的角度、特别是以直角传播，和/或位于不平行于所述物镜的光轴的平面上。
根据本发明，发现使用不具有在显微镜外壳内部的另外的光学部件、照明光经过物镜光学部件随后相对于物镜的光轴以非零度的角度、特别是以直角通过光转向器件可聚焦至样品上的本质上常规的显微镜物镜，可以实现根据SPIM方法的样品照明，特别是在垂直于观测方向的平面上的平面照明。
根据本发明，使用显微术中惯常的和已知的光源(例如CW激光或脉冲激光)产生照明样品的光束。
在本发明有利的实施例中，根据该创造性的方法和系统的用于形成光带的光学装置可以具有能够在照明平面上移动光束的光束偏转器，且优选地，以这种速度移动以使，实际上，在照明平面上存在光带，和/或设置用于检测从样品和下游的显微镜的分析器发出的光的检测器不能够从连续光带中辨别出该照明，和/或所获取的图像数据与在通过连续光带照明的情况下得到的数据不同或者基本不同。
可以使用通过光束偏转器产生的光束的枢转运动，特别是，在样品内移动焦点，从而从特定的方向为样品的平面照明产生聚焦的光带。这可以通过，例如，光束偏转器以足够的速度将光束在物镜的上游来回倾斜实现，以使作为结果的聚焦的光带在一段时间的平均的振动在样品内的照明平面上带来盘状或者平面的光分布。
光束偏转器优选地将光束偏转以使得在物镜的入射光瞳的区域中的倾斜点保持近似地静止，而在光束偏转器的方向上离入射光瞳一段距离处，光束相对于平行于光轴的参考方向进行枢转运动。光束的该枢转运动通过物镜和下游的光转向器件被转化为光束的焦点的相应的运动，通过物镜产生该焦点(除其他事物之外)。对于显微术，优选地将样品放置在该焦点中。焦点的实际大小和焦点在样品上的运动的幅度取决于物镜光学部件的具体设计以及可能取决于可以使用在光路中的另外的光学元件。
在特别适合的以及技术上易于实施的实施例中，光束偏转器具有至少一个旋转反射镜和/或倾斜反射镜(优选地为检流计反射镜)，和/或旋转棱镜和/或可移动的透镜和/或声光偏转器。光束偏转器可以为，特别地，为可用的扫描显微镜或者共焦扫描显微镜的光束偏转器。
在本发明的另一个实施例中，除了光束偏转器之外或者替代光束偏转器，，还可以设置圆柱形的光学元件作为用于形成光带的光学装置。
在本发明的另一个有利的实施例中，光带的形状和/或位置和/或定向通过如上所述的光学装置和/或物镜和/或光转向器件被调整或可被调整。
可以通过光束偏转器调整枢转运动以调整光带的位置和/或定向。光带的形状，特别是光带宽带可以通过，例如，对枢转运动选择不同的振动幅度而被调整。
在一个特别的实施例中，光束的和/或光带的和/或检测光的光学路径相互匹配，以使光带具有在待观测样品中的位置处的焦点，且从样品中的该位置发出的检测光具有在检测器上的检测焦点。
检测器优选地位于与检测平面对应的平面上。检测平面的位置和定向基本取决于物体的类型、定向和位置，检测器的位置以及可能存在于检测器和物镜之间的另外的光学部件的位置。光带被优选地定位和定向，以使在偏转之后光带位于检测平面。
当照明和检测均通过物镜时，需要指出的是，从物镜光瞳至焦点的光带的光路通常比检测光的光路长，检测光从被光带的焦点照明的样品区域发出，直接经过物镜直接到达物镜光瞳。这尤其是因为偏转。路径长度的差异可以被补偿，例如，当光束不是作为平行光束而是作为发散光束到达物镜时。可以通过仅作用在光束上而不作用在检测光上的另外的光学部件实现发散。可选地，路径长度的差异当然也可以通过相应地加长检测光束路径而被补偿。上述两种方法的组合当然也是可能的。
根据独立于光带想法的单独的创造性想法，可以不是通过带状方式，而是通过线状方式照明样品，特别是当光束不进行任何枢转运动时。在这种情况下，也可以使用光束偏转器通过被聚焦的光束，可以说，以扫描的方式顺次照明样品。但是，与常规的扫描显微镜或者共焦扫描显微镜不同的是，光束相对于物镜的光轴具有非零度的角度。
另外，可以通过使用光束欠照明物镜的入射光瞳下而有利地改变光带的形状。为此，光束未经过入射光瞳的整个区域，因此未使用物镜的全部孔径。该欠照明中导致光束的焦点在纵向和横向均被扩大。
而且，光束偏转器可以被用于，例如，将光束引导至位于入射光瞳上不同的(特别是偏离中心的)位置。通过这种方式，实现物镜下游的光带的各个被聚焦的光束的定向以及因此在样品中的光带的各个光束的定向根据本发明有利的实施例变化。
在本发明的实施例中，物镜光学部件分别通过光带与光束相互作用，而物镜光学部件进一步被设计和意欲将从样品发出的检测光直接或间接地传送到检测器(例如CCD照相机(电荷耦合设备))。
在本发明另一个有利的实施例中，另外的物镜和/或聚光器光学部件可以替换地用于将从样品发出的检测光直接地或间接地传送至检测器。为此，另外的物镜和/或聚光器光学部件可以沿着物镜光轴与物镜相对布置，样品位于另外的物镜和/或聚光器光学部件与物镜之间。
根据本发明，光转向器件设置在物镜光学部件的下游以将光带偏转，以使在偏转之后光带相对于物镜的光轴以非零度的角度、特别是直角传播，且优选地被聚焦在样品上以照明样品。
在本发明另一个有利的实施例中，光转向器件被固定地紧固至物镜和/或另外的物镜和/或聚光器光学部件。特别地，光转向器件被保持至上述的部件，以使光转向器件在弹性构件特别是弹簧的力下相对于所述物镜的光轴以除90度之外的角度可移动。
用于紧固光转向器件的连接物可以是带螺纹的连接物，带螺纹的连接物在技术上特别易于实行。为此，物镜的头部(即物镜面向样品的端部)可以具有与物镜的光轴同轴形成的且与光转向器件上相应的内螺纹啮合的外螺纹。
沿着这些线索，设想出进一步有利的实施例，其中，再为光转向器件设置可释放的，优选为人工可释放的连接装置，以使光转向器件可以作为改型(retrofit)部件被固定地紧固至物镜和/或其他常规物镜。这也允许替换为不同设计的光转向器件。
可选地，光转向器件的至少一个部件可以与物镜的部件或另外的物镜的部件或聚光器光学部件的部件一体制造。
在本发明一个有利的实施例中，将光带偏转的光转向器件具有至少一个至少部分反射的表面。为此，反射的表面可以形成为例如平面镜的一部分。
进一步地，为了防止在样品中发生的成阴，通过光转向器件和/或用于形成光带的光学装置，通过来自至少两个方向的光带照明样品，光带优选地从至少两个方向中的每个被聚焦在样品中的单个焦点区。这是可以实现的，例如，因为光转向器件具有两个对置的镜子，以及因为光束偏转器将光带关于物镜轴对称地(可选地以两个不同的角度)、特别是以例如1kHz的频率量级倾斜，以使通过在两个相对侧的两面镜子照明样品。在这个过程中，用于形成光带的振动频率显著高于运动方向改变的频率。
在本发明另一个实施例中，样品可以通过来自平面的所有方向的光带被放射状地照明或者可照明。在此，光带也从该平面的每个方向被聚焦在样品中的单个焦点区。为此，可以配置光转向器件以使反射的表面至少部分地形成在圆锥体的内侧上。另外，通过光束偏转器相对于物镜的光轴沿着环形的路径引导光带，以使随时间平均地得到来自所有侧的样品的放射状照明。
在开始描述的SPIM方法有利地允许空间上延展的样品的三维成像。该成像方法基于分层样品检测，然后从二维层析图像重构三维形状。为了捕获各个图像的目的，如果样品相对于物镜和光转向器件，尤其是沿着物镜的光轴被移动或可移动，该成像方法尤为有利。另外，还可以形成样品相对于物镜和光转向器件，尤其是关于物镜的光轴被旋转或可旋转的设置。样品的旋转也使得实现从多个方向照明成为可能。
进一步地，提供设置用于将样品放置在或可放置在光学介质中，特别是浸没介质。这可以用于提高光学分辨率，用于观测被液态溶液包围的活体细胞或者组织，和/或用于通过避免折射系数的改变而抑制对比度降低的反射。可能的浸没介质的示例包括水、硅油或甘油。
特别地当使用这样的光学介质时，如果样品被放置在或可放置在样品腔中，则是有利的。可选地，可以提供毛细管用于样品的定位。
有利地样品被放置在或可放置在基座上，以防止样品和/或支撑样品的器件与光转向器件和/或物镜碰撞。尤其是当光转向器件配置用于如前所述的横向环绕样品时，基座的使用允许将样品定位到特别接近物镜光学部件以提高光学分辨率。
当使用光学介质，特别是浸没介质时，可以提供本发明的另一个实施例，将物镜设计为浸没物镜，且另外，将物镜和/或光转向器件浸渍在样品腔和/或光学介质中。
可以提供本发明的进一步的实施例，将多个样品以矩阵形式布置，使用本发明的系统和/或方法对这些样品依次地或周期性重复地进行显微观测。为此，可以将样品例如放置在载玻片上，例如，嵌入在琼脂或水中，然后依次地扫描。在这点上，当位置相对于物镜和/或光转向器件将被改变时，可以提供设置以降低样品支撑。当运动至新位置时，将样品返回至接近物镜和光转向器件。
在本发明另一个特别有利的实施例中，根据STED(stimulated emissiondepletion，受激发耗尽)显微术的原理，光带可以被叠加在激发光束和/或激发光带上或者与激发光束和/或激发光带可叠加以提高光学分辨率。STED显微术的原理，例如在S.Hell等的Stimulated Emission Depletion Fluorescence Microscopy，Optics Letters.19，No.11，1994，pp.780-782中被描述，通常用于提高超越衍射极限的光学显微图像的空间分辨率。在这个过程中，用于标识样品的各个区域的荧光染色剂被选择性的耗尽，且因此，可以说，通过激发光束和/或激发光带被关闭，以使这些各个区域在检测中将不会发出任何荧光。相应地，可以将激发光束称为“关闭光束”，以及可以将激发光带称为“关闭光带”。
在用于照明样品的方法和系统中，可以采用STED方法以使发出荧光的样品区域比被光带照明的样品区域小。在一个有利的实施例中，所获得的效果是作为结果的光带被更窄或者更平地形成。
提高分辨率的另一个途径是使用RESOLFT技术。该技术使用特殊的染色剂，通过暴露于合适的光中，该染色剂可以被选择性的转化为不再发出任何检测光的状态。通过将被光带照明的样品区域的一部分选择性地暴露于合适的光中，有可能减小发出检测光的区域，且因此提高分辨率。
为此，特别优选地将光带和激发光束或激发光带叠加，以使它们聚焦在样品的公共区域。当常规地使用STED方法时，激发光束的焦点在截面图上是环形的，可以说，类似于TEM01*Laguerre-Gauss模型。相比之下，在此描述的本发明的实施例提供的激发光束的焦点具有在截面图上有对称地位于通过光带产生的照明平面之上和之下的两个强度极大值以及位于所述极大值之间的光带的焦点处的极小值。可以说，该极小值类似于TEM01*Laguerre-Gauss模型。可以使用例如相移板产生这种光模型。通过这种方式，实现仅在垂直于照明平面的聚焦的横向延展的方向上，而不在聚焦的纵向延展的方向上，减小可以发出检测光的发射体积。总而言之，这导致大表面区域的非常窄的发射体积，使得获取具有高空间分辨率的样品的截面图像成为可能。
从参考附图的示例性的实施例的以下描述中可以推导出本发明的其它目的、优势、特征和可能的应用。在这种情况下，所有的被描述的和/或被说明的特征，独立的或者以任何有用的在权利要求或者在该特征之前的权利要求中不管以何种方式进行的组合，构成本发明的主题。
附图说明
图1a为示意图，其中，用于产生聚焦的物镜的入射光瞳被完全照明；
图1b、1c为说明当进入物镜的入射光瞳的光束被倾斜时所得到的效果的示意图；
图2a为示意图，其中，用于产生聚焦的物镜的入射光瞳被欠照明；
图2b、2c为说明当对物镜的入射光瞳欠照明的光束被倾斜时所得到的效果的示意图；
图3a为说明用于产生聚焦的物镜的入射光瞳的偏心式欠照明的示意图；
图3b、3c为说明当对物镜的入射光瞳在偏心位置欠照明的光束被倾斜时所得到的效果的示意图；
图4为用于实施本发明的用于在SPIM显微术中照明样品的方法的本发明的系统的可能的实施例的示意图；
图5为用于实施本发明的用于在SPIM显微术中照明样品的方法的本发明的系统的另一个可能的实施例的示意图；该实施例具有除了图4所示的实施例之外的圆柱形的光学元件；
图6为示出用于实施本发明的方法的根据本发明的系统的第三实施例的光转向器件和物镜的示意图；
图7为用于实施本发明的用于在SPIM显微术中照明样品的方法的本发明的系统的第四实施例的示意图；该实施例除了其它事物之外优选地使用另外的物镜。
标号列表：
1光束
1.1光束的焦点
2光带
3(用于形成光带的)光学装置
4物镜
4.1(物镜的)入射光瞳
4.2(物镜的)光学部件
5光转向器件
5.1平面镜
5.2(指示光带的偏转的)直角箭头
5.3反射表面
5.4圆锥体的内侧
5.5可释放的连接物
5.6内螺纹
5.7外螺纹
6光束偏转器
6.1倾斜镜
7样品
8光源
9另外的透镜光学部件
10检测光
11检测器
12分束器
13圆柱形的光学元件
14样品腔
15光学介质
16基座
17另外的物镜
18聚光器光学部件
19盖玻片
O1物镜的光轴
A1入射在物镜上的方向
具体实施方式
不同的光瞳照明选择的原理将参考图1a-1c、2a-2c和3a-3c首先被描述。在此需要注意的是，这些图完全是示意性的且仅意欲方便理解本发明。在以下的解释中，对坐标系设置参考，其中，x轴定向为在纸平面上的水平方向，z轴定向为纸平面上的垂直方向，y轴指向纸平面外。
图1a示出物镜4的入射光瞳4.1被光束1完全照明的情况。光束1平行于物镜4(z轴)的光轴O1传播且垂直进入物镜4的入射光瞳4.1(x-y平面)。物镜4以光束的焦点1.1的形式产生被聚焦的光的分布，焦点1.1沿着光轴O1比横向于光轴O1具有更大的延展。
图1b和1c说明当光束1在物镜4的入射光瞳4.1中相对于光轴O1倾斜时焦点1.1的位置如何改变，但是仍然完全照明入射光瞳4.1。由倾斜导致的光束1的入射方向A1的改变通过物镜4的光学部件4.2转化为焦点1.1的横向于光轴O1的运动。由于光束1经过物镜4的整个入射光瞳4.1，焦点1.1保持定向以使焦点1.1的纵向延展平行于光轴O1。
图2a说明物镜4的入射光瞳4.1的欠照明。可知，光束1仅经过物镜4的入射光瞳4.1的一部分。入射光瞳4.1的欠照明造成焦点1.1的加宽，即，焦点1.1整体上比当照明全部入射光瞳4.1时更大。
图2b和2c示出对入射光瞳4.1欠照明的光束1中心地经过入射光瞳4.1且在入射光瞳4.1被倾斜的情况。考虑参考在先的图给出的解释，整体结果是被加宽的焦点1.1被向外移动。在这一点上，离光轴O1的距离越大，光束1相对于光轴O1的倾斜越多。
在图3a-3c中，对物镜4的入射光瞳4.1欠照明的光束(除了被偏心设置之外)即，从光轴O1横向地偏离。光束1在入射光瞳4.1中的该偏心位置导致焦点1.1相对于光轴O1倾斜。这可以是有用的，例如，将光带2以相对于光轴O1的不同角度引导至样品。
图4以示意的方式示出用于实施本发明的用于在SPIM显微术中照明样品的方法的本发明的系统的可能的实施例。为此，该系统具有用于产生光束1的光源8。在此示出的示例性的实施例中，光源为发射具有例如532nm的波长的CW激光光束的固态激光器。
该系统进一步具有光束偏转器6，光束偏转器6以在开始描述的方式从光束1形成光带2，光束偏转器6还造成光束1或形成的光带2在物镜4的入射光瞳4.1中相对于光轴O1被倾斜。在本示例性的实施例中，这通过使用两个倾斜镜6.1作为光束偏转器的本质部分而得以实现。这些倾斜镜6.1中的每一个通过最大20度的角度范围可倾斜。沿着两个空间方向的倾斜运动通过电磁螺线管产生，每个电磁螺线管用于一个所述方向。在本示例性的实施例中，除了其它事物之外，螺线管使得倾斜镜6.1在两个方向之间以12KHz的最大带宽进行振动倾斜运动。总的说来，这使得，第一形成光带2成为可能，第二将光带2或者光束1以不同的角度和在不同的位置引导至物镜4的入射光瞳4.1成为可能。
作为光束偏转器6的替代，或者除了光束偏转器6之外，系统还可以具有用于形成光带2的圆柱形的光学元件13。图5示出具有布置在光束偏转器6的上游的圆柱形的光学元件13的本发明实施例。当使用圆柱形的光学元件时，省略整个或者至少部分光束偏转器也是可以想象的。
在图4和图5所示的两个实施例中，另外的透镜光学系统9设置在物镜4的上游的另外的光学路径中。另外的透镜光学系统9与物镜4的光学部件4.2合作形成光带2的焦点2.1。接着通过光转向器件将光带2偏转至样品7。进行该偏转以使在偏转之后光带2相对于物镜的光轴O1以非零度的角度、特别是如这里所示的直角传播，且被聚焦在样品7上以照明样品7。光带2与物镜4的光学部件4.2相互作用，这对本发明是必不可少的。进一步地，物镜4的光学部件4.2也被设计且意欲将从样品7发出的检测光直接地或间接地传送至检测器11。为此，在本发明示例性的实施例中，在光学路径中设置分束器12以将从样品7发出的检测光10引导至检测器11(例如如此所示的CCD相机)。
进一步从图4和图5可知，光转向器件5具有两个用于偏转光带的平面镜5，如直角箭头5.2在这里所指示的。这两面镜子相对于物镜4的光轴O1对称地相对设置且均对所使用的波长有反射性。通过使用两个相对的镜子5.1，可以有利地从两个方向照明样品7以避免成阴。为此，如开始所描述的，光束偏转器6可选地通过两面镜子5.1将光带2引导至样品7用于样品7的平面照明。设置镜子5.1以使光带2从两个方向被聚焦或可聚焦在单个焦点区2.1中。
可选地，从平面的所有方向放射状地照明样品。为此，在本发明另一个实施例中，光转向器件5具有设置在圆锥5.4内侧上的反射表面5.3，如图6所示。当光束偏转器6沿着相对于光轴O1的圆形路径将光带2引导至物镜4的入射光瞳4.1中，然后随时间平均地获得从照明平面的所有方向对样品的平面照明。
特别有利的是，光转向器件5可以通过人工可释放的连接物5.5被固定地紧固至物镜4的外罩4.3。为此，在如图6所示的本发明实施例中，圆锥形的光转向器件5设置有内螺纹5.6，内螺纹5.6允许通过物镜4的外罩4.3上的相应的外螺纹5.7将光转向器件拧入物镜4。可选地，通过这种方式物镜4可以很容易地被改型以用于为SPIM方法合适地配置的光转向器件5。
图7示出本发明的另一个实施例，其中，样品7设置在填充有光学介质15的样品腔14中，另外，样品7设置在基座16上，以使样品7可以接近物镜4的高分辨率光学部件4.2。特别地，这允许将样品7以无碰撞模式定位在光转向器件5的两面镜子5.1之间，如图7所示。在此为浸没物镜的形式的物镜4和光转向器件5均被浸渍在光学介质15中，且因此也在样品腔14中。在本示例中，使用甘油作为光学介质15。但是，也可以使用水、硅油或其它浸没介质。
从图7可以进一步可知，除了物镜4，另外的物镜17或者聚光器光学部件18也可以用于检测目的，即，用于将从样品7发出的检测光10直接地或间接地传送至检测器11。在此所示的示例性的实施例中，另外的物镜17设置在相对于物镜4的样品7之下且沿着物镜4的光轴O1定向。而且，如图7所示，可以在样品7和另外的物镜17之间设置盖玻片19，另外的物镜17的光学部件被校准用于通过盖玻片19观测。

Claims (32)

1.一种在SPIM显微术中用于照明至少一个样品的方法，包括以下步骤：
a.产生光束；
b.通过与所述光束相互作用的光学装置从所述光束形成光带；
c.使所述光带经过至少一个具有物镜光学部件的物镜，所述物镜光学部件与所述光带相互作用；
d.所述物镜光学部件被设计以将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至检测器，或
使用另外的物镜和/或聚光器光学部件用于将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至所述检测器；
e.通过光转向器件将所述光带偏转，以使在偏转之后所述光带相对于所述物镜的光轴以非零度的角度或直角传播，以照明所述样品；
f.所述光转向器件被布置在所述物镜光学部件的光学下游；和
g.从所述样品发出的、被传送至所述检测器的检测光不与所述光转向器件相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在偏转之后所述光带被聚焦在所述样品上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，
a.用于形成所述光带的所述光学装置具有至少一个光束偏转器，和/或
b.用于形成所述光带的所述光学装置具有至少一个光束偏转器，所述至少一个光束偏转器为扫描显微镜或者共焦扫描显微镜的光束偏转器的形式，和/或
c.光束偏转器具有至少一个旋转反射镜和/或倾斜反射镜和/或旋转棱镜和/或可移动的透镜和/或声光偏转器。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，用于形成所述光带的所述光学装置具有至少一个圆柱形的光学元件。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，
a.所述光带的形状和/或位置和/或定向被调整，和/或
b.所述光带的形状和/或位置和/或定向通过用于形成所述光带的所述光学装置和/或所述物镜和/或所述光转向器件被调整。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，
a.所述物镜为浸没物镜，和/或
b.所述物镜为浸没物镜，且浸渍在填充有包围所述样品的光学介质的样品腔或者样品容器中，和/或
c.将待照明样品放置在填充有包围所述样品的光学介质的样品腔或者样品容器中，且将所述光转向器件浸渍在所述光学介质中或者放置在所述介质中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中使用所述物镜用于照明所述样品和/或用于将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至所述检测器。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，
a.所述光转向器件被固定地紧固至所述物镜和/或所述另外的物镜和/或所述聚光器光学部件，和/或
b.所述光转向器件被保持至所述物镜和/或所述另外的物镜和/或所述聚光器光学部件，以使所述光转向器件在弹性构件的力下相对于所述物镜的光轴以除90度之外的角度可移动，和/或
c.所述光转向器件设置有至少一个连接装置，以使所述光转向器件作为改型部件被固定地紧固和/或固定地可紧固至所述物镜和/或所述另外的物镜和/或所述聚光器光学部件。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光转向器件的至少一个部件与所述物镜的部件或所述另外的物镜的部件或所述聚光器光学部件的部件一体制造。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，
a.用于将所述光带偏转的所述光转向器件具有至少一个至少部分反射的表面，和/或
b.用于将所述光带偏转的所述光转向器件具有至少一个至少部分反射的表面，所述反射的表面形成为平面镜的一部分或者至少部分地形成在圆锥体的内侧上。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，
a.通过来自至少两个方向的所述光带照明所述样品，所述光带从所述至少两个方向中的每个被聚焦在所述样品中的单个焦点区，和/或
b.通过来自平面的所有方向的所述光带放射状地照明所述样品，所述光带从所述平面的每个方向被聚焦在所述样品中的单个焦点区，和/或
c.通过改变入射方向或通过所述光转向器件和/或用于形成所述光带的所述光学装置，从至少两个方向照明所述样品，和/或
d.通过旋转入射方向或通过所述光转向器件和/或用于形成所述光带的所述光学装置，通过来自平面的所有方向的所述光带放射状地照明所述样品。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，用于所述SPIM显微术或用于在SPIM显微术过程中对所述样品的不同层进行成像，所述样品
a.相对于所述物镜和所述光转向器件移动和/或旋转，和/或
b.放置在光学介质中或浸没介质中，和/或
c.放置在样品腔中，和/或
d.放置在毛细管中，和/或
e.放置在基座上，和/或
f.放置在填充有包围所述样品的光学介质的样品腔中。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述光束和/或所述光带和/或所述检测光的光学路径相互匹配，以使所述光带具有在待观测样品中的位置处的焦点，且从所述样品中的所述位置发出的所述检测光具有在所述检测器上的检测焦点。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，为了补偿所述光束的光程和所述检测光的光程之间的光程长度的差异，
a.所述光束作为发散光束被引导至所述物镜，和/或
b.所述光束被仅作用在所述光束上而不作用在所述检测光上的另外的光学部件所影响，和/或
c.所述检测光束路径被加长。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，
a.将所述物镜和/或所述光转向器件浸渍在所述样品腔和/或所述光学介质中，和/或
b.将所述物镜和/或所述光转向器件放置在所述样品腔和/或所述光学介质中。
16.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，
a.所述光带与至少一个激发光束和/或激发光带叠加以根据受激发射耗尽显微术的原理提高光学分辨率，以使为了产生图像的待检测光所来自的样品区域比被所述光带照明的样品区域小；和/或
b.所述光带与至少一个激发光带叠加以根据受激发射耗尽显微术的原理提高光学分辨率，所述光带与所述激发光带部分地相互重叠且相互平行地定向。
17.一种显微术方法，其中，
a.依照根据权利要求1至16中任一项所述的方法照明样品，和/或
b.将多个样品一起布置在显微镜载台和/或载玻片上，且对所述多个样品一个接一个进行显微镜观察，每个样品依照根据权利要求1至16中任一项所述的方法被照明。
18.一种在SPIM显微术中用于照明样品的系统或用于执行根据权利要求1至16中任一项所述的方法的系统，包括：
a.光源，所述光源用于产生光束；
b.光学装置，所述光学装置用于从所述光束形成光带，或用于从至少一个方向对照明平面上的样品进行大体上平面照明；
c.至少一个具有物镜光学部件的物镜，所述物镜光学部件与所述光带相互作用；
d.所述物镜光学部件被设计以将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至检测器，或
使用另外的物镜和/或聚光器光学部件用于将从所述样品发出的检测光直接地或间接地传送至所述检测器；
e.光转向器件，所述光转向器件放置在所述物镜光学部件的光学下游以将所述光带偏转，以使在偏转之后所述光带相对于所述物镜的光轴以非零度的角度或直角传播，和/或位于不平行于所述物镜的光轴的平面上；和
f.从所述样品发出的、被传送至所述检测器的检测光不与所述光转向器件相互作用。
19.根据权利要求18所述的系统，其中，
a.用于形成所述光带的所述光学装置具有至少一个光束偏转器，和/或
b.用于形成所述光带的所述光学装置具有至少一个光束偏转器，所述至少一个光束偏转器为扫描显微镜或者共焦扫描显微镜的光束偏转器的形式，和/或
c.用于形成所述光带的所述光学装置具有至少一个光束偏转器，所述至少一个光束偏转器具有至少一个旋转反射镜和/或倾斜反射镜和/或旋转棱镜和/或可移动的透镜和/或声光偏转器。
20.根据权利要求18所述的系统，其中，用于形成所述光带的所述光学装置具有至少一个圆柱形的光学元件。
21.根据权利要求18所述的系统，其中，
a.所述光带的形状和/或位置和/或定向是可调整的，和/或
b.所述光带的形状和/或位置和/或定向是通过用于形成所述光带的所述光学装置和/或所述物镜和/或所述光转向器件可调整的。
22.根据权利要求18所述的系统，其中，
a.所述物镜为浸没物镜，和/或
b.所述物镜为浸没物镜，且所述物镜被设计以被浸渍在填充有包围待照明样品的光学介质的样品腔或者样品容器中。
23.根据权利要求18所述的系统，其中，
a.所述光转向器件被固定地可紧固和/或固定地紧固至所述物镜和/或所述另外的物镜和/或所述聚光器光学部件，和/或
b.所述光转向器件被保持至所述物镜和/或所述另外的物镜和/或所述聚光器光学部件，以使所述光转向器件在弹性构件的力下相对于所述物镜的光轴以除90度之外的角度可移动，和/或
c.所述光转向器件设置有连接装置，以使所述光转向器件作为改型部分被固定地可紧固至所述物镜和/或所述另外的物镜。
24.根据权利要求18所述的系统，其中，所述光转向器件的至少一个部件与所述物镜的部件或所述另外的物镜的部件或所述聚光器光学部件的部件一体制造。
25.根据权利要求18所述的系统，其中，
a.用于将所述光带偏转的所述光转向器件具有至少一个至少部分反射的表面，和/或
b.用于将所述光带偏转的所述光转向器件具有至少一个至少部分反射的表面，所述反射的表面形成为平面镜的一部分，和/或
c.用于将所述光带偏转的所述光转向器件具有至少一个至少部分反射的表面，所述反射的表面至少部分地形成在圆锥体的内侧上。
26.根据权利要求18至25任一项所述的系统，其中，所述样品
a.通过来自至少两个方向的所述光带可被照明，所述光带从所述至少两个方向中的每个可被聚焦在所述样品中的单个焦点区，和/或
b.通过来自平面的所有方向的所述光带可被放射状地照明，所述光带从所述平面的每个方向可被聚焦在所述样品中的单个焦点区，和/或
c.通过改变入射方向或通过所述光转向器件和/或用于形成所述光带的所述光学装置，从至少两个方向可被照明，和/或
d.通过旋转入射方向或通过所述光转向器件和/或用于形成所述光带的所述光学装置，通过来自平面的所有方向的所述光带可被放射状地照明。
27.根据权利要求18至25任一项所述的系统，其中，所述光束和/或所述光带和/或所述检测光的光学路径相互匹配，以使所述光带具有在待观测样品中的位置处的焦点，且从所述样品中的所述位置发出的所述检测光具有在所述检测器上的检测焦点。
28.根据权利要求18至25任一项所述的系统，其中，为了补偿所述光束的光程和所述检测光的光程之间的光程长度的差异，
a.所述光束作为发散光束被入射在所述物镜上，和/或
b.所述光束通过仅作用在所述光束上而不作用在所述检测光上的另外的光学部件，和/或
c.所述系统具有加长的检测光束路径。
29.根据权利要求18至25任一项所述的系统，其中，
a.所述光带与至少一个激发光束和/或激发光带叠加以根据受激发射耗尽显微术的原理提高光学分辨率，以使为了产生图像的待检测光所来自的样品区域比被所述光带照明的样品区域小；和/或
b.所述光带与至少一个激发光带叠加以根据受激发射耗尽显微术的原理提高光学分辨率，所述光带与所述激发光带部分地相互重叠且相互平行地定向。
30.一种显微镜，具有根据权利要求18至29任一项所述的用于照明的系统和/或执行根据权利要求1至16任一项所述的方法。
31.根据权利要求30所述的显微镜，其中所述显微镜为扫描显微镜和/或共焦扫描显微镜和/或用于对样品进行显微成像的实验设备。
32.根据权利要求30或31所述的显微镜，其中用于SPIM显微术，
a.器件被设置用于相对于所述物镜和所述光转向器件移动和/或旋转样品，和/或
b.所述样品可被放置在光学介质中或浸没介质中，和/或
c.用于一个或多个样品的样品腔或毛细管或样品杯被设置，和/或
d.至少一个基座被设置，样品可被放置和/或被放置在所述至少一个基座上。
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