CN110352373A - Tirf显微术的布置、显微镜和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及TIRF显微术的布置(1),其包括具有照明物镜(2)的照明光学单元以通过照明束路径在样品平面(4)的样品区域中照明位于样品承载件(7)上的样品(5),其中照明物镜(2)的光轴(A1)与样品平面(4)的法线(B)形成不为零的照明角(α1),将样品承载件(7)关于该样品平面(4)取向。检测束路径中具有检测物镜(3)的检测光学单元形成所述检测物镜的光轴(A2)和样品平面(4)的法线(B)之间的不为零的检测角(α2)。根据本发明,转换元件(10)出现在样品承载件(7)和物镜(2、3)之间,所述转换元件布置在照明束路径(BS)中和检测束路径(DS)中。转换元件(10)配置为校正由于要检测的辐射和/或照明样品(5)的辐射通过具有不同折射率的介质而出现的像差。将照明束路径以适合于在样品平面(4)处产生照明辐射(BS)的全内反射的照明角(α1)指引到样品平面(4)的样品区域中。本发明附加地涉及包括TIRF显微术的布置(1)的显微镜(0),及TIRF显微术的方法。
Description
本发明涉及一种根据独立权利要求1的前序部分的全内反射显微术(TIRF显微术)的布置,特别是TIRF光片显微术的布置。另外,本发明涉及使用TIRF显微术的布置、显微镜和方法。
在全内反射显微术(还称为TIRF显微术(全内反射荧光显微术))中,例如在样品的近表面层和表面处,倏逝场被产生并用于观察结构和过程。为此,将倏逝照明(还称为TIRF场,倏逝波或倏逝场)耦合到样品的至少一个区域中。出于产生倏逝场的目的,利用如下事实:尽管在界面处发生照明辐射(光)的全内反射,但光比界面更深地穿透到超过界面的介质中(例如到样品中),并且在那里迅速衰减。作为示例,例如可以使用光波导的倏逝场,或者在诸如盖玻片的光学界面处的全内反射所得到的倏逝场。
如果样品包含了由倏逝场的光(照明辐射)可激发以发射检测辐射(例如荧光)的分子,则这些分子可以被激发以在倏逝场的区域中发射检测辐射。检测辐射可以通过适当的检测器来捕获和评估。
根据现有技术,光片显微术的显微镜0的布局(SPIM布局、单平面照明显微术,图1a和1b)包括具有第一光轴A1的照明物镜2和具有第二光轴A2的检测物镜3(下面也称为SPIM物镜),将照明物镜2和检测物镜3各自从上方关于样品平面4以45°的角α1或α2且关于彼此成直角指引到样品平面4上(参见图1a)。该方法提供了轴线方向上的高分辨的优点,因为薄光片6(同样参见图1b)可以通过照明物镜2在像平面BE中产生。由于更高的分辨率,因此可以检查更小的样品5。此外,显著地降低了麻烦的背景荧光并且由此改进了信噪比。在图1a和1b中,光片6沿着像平面BE延伸到绘图的平面中,也就是说读者看到光片6的端部侧。
布置在样品平面4中所提供的样品区域中的样品5位于例如实施为培养皿的样品保持件7的基底上,该样品平面4还用作参考平面。用例如水的介质8填充样品保持件7,并且在应用光片显微术期间将两个SPIM物镜2、3浸没在介质8中(未示出)。样品平面4延伸在由笛卡尔坐标系(以略透视的方式说明)的由X轴X和Y轴Y所跨越的平面XY中。第一光轴A1和第二光轴A2延伸在由笛卡尔坐标系的Y轴Y和Z轴Z所跨越的平面YZ中。
为了促进在诸如多孔板的标准样品容器中更简易的样品准备,可以维持45°配置但是具有的两个SPIM物镜2、3(特别是其光轴A1、A2)在倒置布置中从下方穿过样品保持件7的透明基底指引到样品平面4中。图1b示意性示出了根据现有技术的具有倒置布置的照明物镜2和检测物镜3的显微镜0,其中照明物镜2和检测物镜3布置在样品平面4下方。再次,角α1和α2各为45°。
在这个布置中,必须通过使用特别的光学元件来校正由样品保持件7引起的像差,该样品保持件7关于光轴A1和A2倾斜并且以盖玻片的形式出现。穿过样品保持件7的基底照明布置在样品平面4中的样品5,并且样品5的激发的荧光被检测。可以使用诸如多孔板、培养皿和/或物体支撑件的样品保持件7,并且特别地在高通量筛选的情况下可以避免样品5的污染。
DE 10 2013 112 600 A1已经公开了一种虚拟中继器,其用作校正在穿过物体承载件的射线的倾斜通道的情况下发生的误差。因为虚拟中继器具有>1.2的高数值孔径,显著的成像像差可能由于在光学系统内小的偏差而发生,该小偏差可能随实验不同而变化。这些偏差可能基于尤其盖玻片厚度的变化、温度的变化、折射率差异、盖玻片的倾斜或盖玻片的楔形误差。
从由McGorty等人的出版物(2015:用于常规安装的样品的顶部开口的选择性平面照明显微镜(Open-top selective plane illumination microscope forconventionally mounted specimens),光学快报23:16142-16153)获悉校正由盖玻片引起的显微镜的像差的其他可能性。倒置的SPIM显微镜具有以下效果的水棱镜:部分地补偿由于穿过盖玻片的检测光的倾斜通道发生的像差。
本发明基于以下目的,指定TIRF显微术的新型布置和新型显微镜,及其用途。
该目的通过如权利要求1所主张的TIRF显微术的布置来实现。在TIRF显微术的显微镜及其用途的方面,该目的分别由权利要求7和8的特征来实现。在方法的方面,该目的通过权利要求9的特征来实现。有利的配置和发展例是从属权利要求的主题。
布置包括具有照明物镜的照明光学单元以经由照明束路径在样品区域中照明位于样品承载件上的样品,其中照明物镜的光轴包含与参考平面的法线成不为零的角(照明角),样品承载件关于该参考平面对齐。此外,在检测束路径中出现具有检测物镜的检测光学单元。检测物镜的光轴包含与参考平面的法线成不为零的角(检测角)。
根据本发明,转换元件出现在样品承载体和两个物镜之间,所述转换元件布置在照明束路径中和检测束路径二者中。转换元件实施为校正由于要检测的辐射(特别是光)和/或照明样品的辐射穿过具有不同折射率的介质的通道而出现的像差。以适合于在样品平面处产生照明辐射的全内反射的照明角,将照明束路径指引到样品平面的样品区域中。
参考平面的法线与照明物镜和检测物镜的光轴有利地位于相同平面中。在其他可能的实施例中,参考平面的法线与照明物镜的光轴位于一个平面中,而检测物镜的光轴不在该平面中。
照明束路径还适用于,如果照明辐射以轻微发散方式传播并经受全内反射,或者如果至少照明辐射的分量在样品平面处经受全内反射,则在样品平面处产生照明辐射的全内反射。
在还称为参考平面的样品平面中,样品布置在因此提供的区域(样品区域)中或者样品可以布置在那里。
如果没有其他任何明确的描述,TIRF照明可以实现为点状、线形形状、环形形状或平面的方式,或者实现在具有可自由选择的形式的照明区域之上。
因为本发明有利地构建在当前已经可用的布置或显微镜上,诸如Alvarez板的照明校正元件或检测校正元件可以出现在照明束路径中和/或检测束路径中。为了简化描述,如果描述涉及照明校正元件或检测校正元件或两者,则这些照明校正元件和/或检测校正元件在下文中还被称为一个或多个校正元件。
在使用TIRF显微术的布置和/或TIRF显微术的显微镜期间,将可用的校正元件从相应的束路径移除(例如枢转出或移出),或者将可用的校正元件光学上去激活,例如转移到零点位置中。
在布置的有利实施例中,浸没介质出现在转换元件和样品承载件之间,所述浸没介质的光学折射率等于转换元件和/或样品承载件的光学折射率。这样的浸没介质导致降低或避免照明辐射的转换的不利效果并且出现穿过具有不同折射率的检测辐射。因此,由于照明辐射和检测辐射的倾斜通道(特别是穿过样品承载件)而发生的像差被避免或至少显著地降低。在照明辐射和/或检测辐射在样品承载件面向样品的侧面和样品之间的转换的期间而发生的像差是不明显的,因为由于TIRF照明的倏逝场的低穿透深度因而样品的像被记录在样品承载件和样品的转换附近。
作为示例,转换元件和样品承载件可以由玻璃构成。浸没介质的折射率对应于玻璃的折射率,特别是在布置的常规使用条件下,例如在15和35°C之间的温度处。在此,在折射率之间的偏差不超过0.1、优选地不超过0.05被认为是彼此相等。
具有与转换元件和/或样品承载件的折射率相等的光学折射率的浸没介质是例如油、油混合物、含油混合物或具有适当光学性质以及对照明辐射和检测辐射足够透明度的适当液体。
在一个可能的实施例中,转换元件是弯月形透镜,其中如上所述的浸没介质出现在所述弯月形透镜和样品承载件之间。
弯月形透镜是具有向相同侧弯曲的两个透镜面的透镜。有利地,两个透镜表面具有相同的中心点。弯月形透镜的两个透镜表面可以位于各具有不同折射率的不同介质(例如浸没介质和/或空气)中。关于虚拟中继器,弯月形透镜是有利的,因为它能够更容易且更成本有效地被制造。
在其他实施例中,转换元件实施为虚拟中继器或实施为浸没室。为了使用TIRF显微术的布置,浸没室用浸没介质填充。
虚拟中继器被认为意味着在样品侧上产生样品的放大虚像的透镜。使用显微镜物镜将该像成像在相机上。附加地,虚拟中继器的一侧或两侧具有非球面形式,因此可以补偿倾斜盖玻片通道的像差。
虚拟中继器配置为,使得由于照明辐射和/或检测辐射的倾斜通道而发生像差的校正通过虚拟中继器的内侧的适当设计来实现。内侧是虚拟中继器面向样品承载件的一面或侧面。
出于使用具有弯月形透镜或具有虚拟中继器作为转换元件的布置的目的,物镜可以实施为干燥物镜。
如果浸没室用作转换元件,则物镜实施为浸没物镜。
布置可以包含具有至少一个层的分离层系统,该至少一个层由具有预先确定厚度的预先确定材料制成。例如盖玻片的至少一个层将样品位于其中的介质从照明物镜和检测物镜中分离出,或从弯月形透镜或从虚拟中继器中分离出。相应地,出于照明和检测目的,至少在可接近照明物镜和检测物镜的区域中,通过平行于参考平面对齐的基底,使分离层系统与介质和/或浸没介质接触。介质和浸没介质通过分离层系统彼此分离。
为了实现TIRF光片显微术的布置,用于照明目的的辐射(照明辐射)形成到光片中并且被指引到样品区域中。在替代的实施例中,借助于例如将照明辐射的束在平面中移动,通过照明辐射在样品区域中产生光片(动态光片)。
在有利的实施例中,照明物镜的光轴和光片位于包含与参考平面的法线成不为零的照明角的平面中。在平面(像平面)中延伸的光片的法线,优选地延伸在由照明物镜的光轴和参考平面的法线跨越的平面中。有利地,检测物镜的光轴同样延伸在该平面中。该实施例允许平坦的结构。因此,光片的平面穿透参考平面并且光片的法线与参考平面相交。
在其他可能的实施例中,参考平面的法线位于与照明物镜的光轴及光片或像平面相同的平面中。光片的法线正交于照明物镜的光轴、参考平面的法线以及光片或像平面所在的平面延伸。检测物镜的光轴被指引在平面上,以便于从像平面捕获图像数据。
根据本发明的布置特别地可用于具有穿过样品保持件(例如盖玻片或诸如培养皿基底的光学透明层的形式)的照明和检测辐射的倾斜通道的倒置光片显微镜中。该布置有利地可用于通过TIRF显微术,例如TIRF光片显微术成像样品的区域。在此,该布置可以是显微镜的部分。
为了实行TIRF显微术,在样品平面的样品区域中照明位于样品承载件上的样品的照明辐射经由照明束路径被指引到样品。在此,照明物镜的光轴包含与样品平面的法线成不为零的照明角,所述样品承载件关于所述样品平面对齐。检测辐射沿着检测束路径被捕获,检测束路径的光轴包含与样品平面的法线成不为零的检测角。照明辐射和检测辐射经由布置在照明束路径和检测束路径两者中的转换元件辐射进或由布置在照明束路径和检测束路径两者中的转换元件来捕获,其中转换元件实施为校正像差,所述像差由于要检测的辐射和/或照明样品的辐射通过具有不同折射率的介质的通道而出现。以适合于在样品平面处产生照明辐射的全内反射的照明角,将照明束路径指引到样品平面的样品区域中。由于计算或通过连续设定不同照明角和由相应照明角所获得的效果,可以选择照明角。在计算期间,采用的物镜、转换元件、可用的或可选择的浸没介质、样品承载件以及(在适用的情况下)样品的光学数据有利地被纳入考虑并且例如并到计算中。
下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明。附图中:
图1a示出了根据现有技术的光片显微镜的布置的示意图,
图1b示出了根据现有技术的光片显微镜的倒置布置的示意图,
图2示出了根据本发明的TIRF光片显微镜的布置的第一示例性实施例的示意图,
图3示出了根据本发明的TIRF光片显微镜的布置的第二示例性实施例的示意图,
图4示出了根据本发明的TIRF光片显微镜的布置中具有0.4的数值孔径的照明物镜的孔径角和具有1.0的数值孔径的检测物镜的孔径角的示意图;以及
图5示出了根据本发明的TIRF光片显微镜的布置的第三示例性实施例的示意图。
示意性说明示例性实施例。将相同的附图标记提供给相同的技术元件。
本说明书的背景部分中已经更加详细地解释了图1a和1b。
以下示例性实施例以基于倒置的显微镜0的示例性方式示出,并且在其他实施例中还可以实施为正置的显微镜0。
除了关于样品或参考平面4倾斜地对齐的照明物镜2以及同样地关于参考平面4倾斜地对齐的检测物镜3以外,共享的转换元件10(图2)展示为根据本发明的显微术(特别是光片显微术)的布置的必要元件。
图2示出了实施为用于TIRF光片显微术(仅指示出)的倒置的显微镜0的布置1的示例性实施例,其具有校正元件2KE、3KE和弯月形透镜10.1的形式的转换元件10。在垂直于参考平面4的法线B与第一光轴A1和第二光轴A2之间夹角α1和α2分别各为60°和30°(参见图4)。在各个情况下,Alvarez操纵器12的两个Alvarez板布置在照明辐射BS的束路径中和检测辐射DS的束路径中,以作为自适应的校正元件2KE、3KE。当使用TIRF光片显微术的布置1时,从相应的束路径中移除校正元件2KE、3KE。弯月形透镜10.1辅助照明辐射BS从空气到浸没介质18中再到介质8中的转换,以及辅助检测辐射DS从介质8到浸没介质18再到空气中的转换。浸没介质18的光学折射率等于弯月形透镜10.1的光学折射率和样品承载件7的光学折射率。
将样品保持件7保持在样品台11上。通过没有更详细地示出的驱动器,在由X轴X和Y轴Y跨越的XY平面中以控制的方式可调整样品台11自身。
通过在这种情况下实施为压电驱动器的物镜驱动器14,分别沿着第一光轴A1和沿着第二光轴A2以控制的方式可各自调整照明物镜2和检测物镜3。
照明辐射BS由激光器模块15提供并且通过束成形单元16来成形。例如,束成形单元16是通过其形成(例如准直)所提供的照明辐射BS的光学单元。
扫描仪17出现在束成形单元16的下游,成形的照明辐射BS通过所述扫描仪在两个方向上以控制的方式是可偏转的。
在扫描仪17的下游,照明物镜2布置在第一光轴A1上。由扫描仪17偏转的照明辐射BS到达照明物镜2,并且由该照明物镜2将该照明辐射BS成形和/或聚焦。由通过扫描仪17适度偏转照明辐射BS,在样品5所在的样品区域中产生光片6。
将来自样品5和来自样品区域的检测辐射DS沿着第二光轴A2指引到检测器19上并且能够由所述检测器捕获。
出于致动样品台11,物镜驱动器14,校正元件2KE、3KE,激光器模块15,束成形16,扫描仪17和/或检测器19的目的而存在控制单元13,所述控制单元以适合于数据传输的连接来联接到要致动的元件(仅指示出)。
在其他实施例中,控制单元13附加地配置为捕获、储存和/或评估测量值。显微镜0的其他元件和单元通过控制单元13可以是可致动的,和/或可以由此获得并且评估测量值。
出于说明目的,下面使用具有相互正交轴线的两个坐标系。第一坐标系是具有X轴X、Y轴Y和Z轴Z的整个布置的坐标系。理想地,样品保持件7(特别是其基底)与由X轴X和Y轴Y跨越的XY平面平行地对齐。第二坐标系是具有X轴X、y轴y’和z轴z’的检测器19的坐标系。例如对从像平面BE到检测器19上的图像进行成像的坐标为X和y’。在两个坐标系中,X轴X以正交方式指引到附图绘图的平面。另外两个轴线Y和y’以及Z和z’分别可以通过绕X轴X的旋转而彼此重叠。
样品保持件7的基底表示具有由具有预先确定厚度的预先确定材料构成的至少一个层的分离层系统,以将样品5所在的介质8从照明物镜2、检测物镜3和从弯月形透镜10.1分离出。通过平行于样品平面4对齐的基底,分离层系统至少在可接近照明物镜2和检测物镜3的区域中与浸没介质18接触,分别为了照明和检测目的。
在具有照明校正元件2KE和/或检测校正元件3KE的显微镜0和/或布置1的其他可能实施例中,这些被设定为使得不会由此引起光学校正效应。
在布置1的第二示例性实施例中没有出现照明校正元件2KE和检测校正元件3KE(图3)。
转换元件实施为虚拟中继器10.2。后者配置为,使得由于照明辐射BS和/或检测辐射DS的倾斜通道而发生的像差的校正由虚拟中继器10.2的内侧的适当设计来实现。内侧是虚拟中继器10.2面向样品承载件7的一面或侧面。
为了可视化照明条件,图4对于根据本发明的显微镜0的布置1图示了具有0.4的第一数值孔径NA1的照明物镜2和具有1.0的第二数值孔径NA2的检测物镜3的孔径角。
在此,由照明物镜2发射的照明辐射BS覆盖从-40°到-80°的角度范围。照明物镜2的第一光轴A1以-60°的照明角α1指引到样品平面4。
检测物镜3的数值孔径NA2是1.0。检测物镜3的第二光轴A2以30°的角α2延伸。检测辐射DS覆盖从-19°到-79°的角度范围。
基于示例性地假设样品5的折射率为n1=1.33和浸没介质18的折射率为n2=1.50,全内反射角θ获得如下:
θ=sin-1(n1/n2)=62°
因此,从-62°到-80°的角度范围通过照明物镜2可用于TIRF照明。负号从在图4中选择的角度标记中出现,该角度标记从如垂线所示的0°的法线B出发。
以-62°的照明角度α1指引到样品保持件7的充当界面且面向样品5的侧面的照明束在界面处经受全内反射,其中倏逝场9(示意性且以放大的方式示出)传播到样品5中。如果可检测的辐射(例如荧光辐射)由倏逝场9在样品5中被激发,所述辐射可以被捕获为检测辐射DS。
在根据本发明的布置1的第三实施例中,转换元件10实施为浸没室10.3的形式(图5)。物镜2、3实施为浸没物镜。在短语的适当含义内的转换元件10由浸没室10.3的上壁形成。为了发展校正效应,浸没室10.3用浸没介质18来填充,该浸没介质18的折射率如上所述等于样品承载件7和物镜2、3的折射率。
附图标记
0 显微镜
1 布置
2 照明物镜
2KE 照明校正元件
3 检测物镜
3KE 检测校正元件
4 样品平面(=参考平面)
5 样品
6 光片
7 样品保持件
8 介质
9 倏逝场
10 转换元件
10.1 弯月形透镜
10.2 虚拟中继器
10.3 浸没室
11 样品台
12 Alvarez操纵器
13 控制单元
14 物镜驱动器
15 激光器模块
16 束成形
17 XY-扫描仪
18 浸没介质
19 检测器
A1 第一光轴(照明物镜2的光轴)
A2 第二光轴(检测物镜3的光轴)
α1 角/照明角
α2 角/检测角
θ 全内反射角
B 法线
BE 像平面
BS 照明辐射
DS 检测辐射
NA1 第一数值孔径
NA2 第二数值孔径
Claims (9)
1.一种TIRF显微术的布置(1),包括:
-照明光学单元,所述照明光学单元具有照明物镜(2),所述照明物镜(2)经由照明束路径在样品平面(4)的样品区域中照明位于样品承载件(7)上的样品(5),其中
所述照明物镜(2)的光轴(A1)包含与所述样品平面(4)的法线(B)成不为零的照明角(α1),所述样品承载件(7)关于所述样品平面(4)对齐,
-具有检测束路径中的检测物镜(3)的检测光学单元,所述检测物镜(3)的光轴(A2)包含与所述样品平面(4)的法线(B)成不为零的检测角(α2),
其特征在于,
-转换元件(10)出现在所述样品承载件(7)和所述物镜(2、3)之间,所述转换元件布置在所述照明束路径中和所述检测束路径二者中;
-所述转换元件(10)实施为校正像差,所述像差由于要检测的辐射和/或照明所述样品(5)的辐射通过具有不同折射率的介质的通道而出现;并且
-以适合于在所述样品平面(4)处产生所述照明辐射(BS)的全内反射的照明角(α1),将所述照明束路径指引到所述样品平面(4)的样品区域中。
2.根据权利要求1所述的布置(1),其特征在于,在所述转换元件(10)和所述样品承载件(7)之间出现浸没介质(18),所述浸没介质的折射率等于所述转换元件(10)和/或所述样品承载件(7)的折射率。
3.根据权利要求2所述的布置(1),其特征在于,所述转换元件(10)是弯月形透镜(10.1)。
4.根据权利要求1或2所述的布置(1),其特征在于,所述转换元件(10)是虚拟中继器(10.2)或浸没室(10.3)。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的布置(1),其特征在于,出于照明目的所使用的辐射形成到光片(6)中并且被指引到所述样品区域中。
6.根据权利要求5所述的布置(1),其特征在于,所述照明物镜(2)和所述光片(6)的光轴(A1)位于包含与所述样品平面(4)的法线(B)成不为零的照明角(α1)的平面中。
7.一种显微镜(0),所述显微镜(0)包括如前述权利要求中任一项所述的布置(1)。
8.一种根据权利要求1至6中任一项所述的布置的用途或者根据权利要求7所述的显微镜(0)的用途,用于通过TIRF显微术成像所述样品(5)的区域。
9.一种TIRF显微术的方法,其中,
-将在样品平面(4)的样品区域中照明位于样品承载件(7)上的样品(5)的照明辐射(BS)经由照明束路径指引到所述样品(5),其中所述照明物镜(2)的光轴(A1)包含与所述样品平面(4)的法线(B)成不为零的照明角(α1),所述样品承载件(7)关于所述样品平面(4)对齐;
-沿着检测束路径捕获检测辐射(DS),所述检测束路径的光轴(A2)包含与所述样品平面(4)的法线(B)成不为零的检测角(α2),
-所述照明辐射(BS)和所述检测辐射(DS)通过布置在所述照明束路径和所述检测束路径两者中的转换元件(10)辐射进或通过布置在所述照明束路径和所述检测束路径两者中的转换元件(10)来捕获,其中所述转换元件(10)实施为校正像差,所述像差由于要检测的辐射和/或照明所述样品(5)的辐射通过具有不同折射率的介质的通道而出现;以及
-以适合于在所述样品平面(4)处产生所述照明辐射(BS)的全内反射的照明角(α1),将所述照明束路径指引到所述样品平面(4)的样品区域中。
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