JP2007085915A

JP2007085915A - 全反射試料照明装置及び照明方法

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Publication number: JP2007085915A
Application number: JP2005275626A
Authority: JP
Inventors: Yohei Sato; 洋平佐藤; Yutaka Kazoe; 裕嘉副
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2005-09-22
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2025-09-22
Also published as: JP4251456B2

Abstract

【課題】特別なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラスに対して対応可能かつ交換可能で、観察位置を任意に自由に変更可能で、散乱光の発生が少なく高ＳＮ比の観察が可能で、試料の操作が容易な全反射試料照明装置と方法。
【解決手段】入射プリズム３と放射プリズム４との上に滴下した屈折率整合液２５を介して共通の平面内で移動可能にスライドガラス２１を支持し、放射プリズム４を入射プリズム３に対してレーザ光１０進行方向に位置調節可能に支持し、入射プリズム３のスライドガラスの支持面３３と放射プリズム４のスライドガラスの支持面４１とが同一高さで同一面になるように設定し、レーザ光１０が入射プリズム３を経てスライドガラス２１内に入って多重全反射により導波され、放射プリズム４の支持面４１からその中に入り、放射プリズム４から外部へ放射されるようにした全反射試料照明方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、全反射試料照明装置及び照明方法に関し、特に、細胞生物分野、電気化学分野、マイクロ・ナノスケール熱流体工学分野等におけるナノスケール光学計測技術、広視野観察が可能な全反射蛍光（Total Internal Reflection Fluorescence :ＴＩＲＦ）顕微鏡等における全反射試料照明装置及び照明方法に関するものである。

ＴＩＲＦ顕微鏡法は、ナノスケールの局所励起を可能とする高ＳＮ比の観察手法である。細胞生物分野において細胞膜活性や単分子事象の観察（非特許文献１）に広く用いられる一方、電気化学分野でもコロイド粒子の電気的特性（非特許文献２）やブラウン運動（Kihm, K. D. et al., Exp. in Fluids, 37, pp.811-824, (2004)）の実験的解明に大きく貢献してきた。この手法の最大の特徴は、蛍光観察の際に、励起光源として、屈折率の異なる２物質界面での光の全反射に伴い発生するエバネッセント波を用いる点にある。図３にそのエバネッセント波の発生の様子を示すが、屈折率ｎ₁の物質１と屈折率ｎ₂の物質２の界面に、屈折率の大きい物質２側から臨界角以上で光が入射するとその界面で光は全反射されるが、界面から屈折率の小さい物質１側に指数関数的に減衰するエバネッセント波が発生する。エバネッセント波は全反射界面から数十〜数百ｎｍ程度の領域に僅かに染み出す光であるため、ＴＩＲＦ顕微鏡法においては、蛍光染色した試料とスライドガラスの界面でエバネッセント波を発生させることで、試料の極一部に限定した高ＳＮ比の蛍光観察が可能となる。

現在、市販化されて一般に多く用いられているのは、主に図４（ａ）に示すような対物レンズ式ＴＩＲＦ顕微鏡である。すなわち、倒立型にして対物レンズをスライドガラスの下方に油浸オイルを介して位置させ、その対物レンズを経てエバネッセント波発生用のレーザ光をスライドガラス下方から斜めに入射させ、スライドガラス上の試料が載置された界面近傍にエバネッセント波を発生させるものである。この配置では、対物レンズ上方の空間が自由に扱えるため操作性と利便性に優れており、また、非常に明るい蛍光画像を得ることができる。しかし、高開口数油浸対物レンズを用いるという原理上の制約により、倍率が６０倍以上の高倍率観察に制限されてしまう。

一方、プリズムを介してレーザを入射する図４（ｂ）に示すようなプリズム式ＴＩＲＦ顕微鏡も広く用いられている。この場合は、試料を２枚のスライドガラス間に挟み、上方のスライドガラス上にプリズムを載せて、そのプリズムを経てエバネッセント波発生用のレーザ光を上方のスライドガラスの上方に斜めに入射させ、そのスライドガラスの試料と接する界面近傍にエバネッセント波を発生させるものである。この配置では、レーザ光を効率的に入射できることから高ＳＮ比の観察が可能であり、倍率の制約がないため低倍率観察も容易である。しかしながら、対物レンズ上方の空間が塞がれてしまい、試料の操作性や標本の自由度が著しく乏しい。

上述したように、現状では、例えば実験の過程で様々な試薬を混入して細胞が示す反応を複数の個体で同時に比較するといったニーズをＴＩＲＦ顕微鏡が満たしているとは言い難い。試料の操作性と標本の自由度に優れ、他の光学観察手法との併用が容易でかつ低倍率観察を可能とするＴＩＲＦ顕微鏡システムの開発が期待されている。

過去の研究では、図５（ａ）に示すように、入射プリズムと放射プリズムをスライドガラス下面に接着して、入射プリズムからスライドガラス内にレーザ光を導入してスライドガラス内で多重全反射させ、その多重全反射の際にスライドガラス上面近傍にエバネッセント波を発生させて試料を励起し、多重全反射で導波されたレーザ光を放射プリズムを経て外へ出す方式が非特許文献３で提案され、また、図５（ｂ）に示すように、スライドガラスの端を加工して傾斜端面としてこの傾斜端面からスライドガラス内にレーザ光を導入してスライドガラス内で多重全反射させ、その多重全反射の際にスライドガラス上面近傍にエバネッセント波を発生させて試料を励起し、多重全反射で導波されたレーザ光を傾斜端面に対向す端面から外へ出す方式が非特許文献４で提案されている。これらの方式は、標本上方の空間が自由であり低倍率観察も容易であるが、スライドガラス厚が制限されていて薄いため（前者は０．１７ｍｍ、後者は０．２ｍｍ）、多重全反射回数が多くなり、全反射による散乱光の発生、導波光の減衰、試料の蛍光退色が起きやすく、ＳＮ比が低下するという問題がある。さらに、レーザ光の入射位置と放射位置が固定されており、レーザ光の光路調整が難しく、また、試料観察位置の変更には、対物レンズの移動が必要であり、標本操作が容易でない。さらに、標本毎にプリズムをスライドガラスに接着したり、スライドガラスに加工を施す必要があることから、手間がかかり、汎用性も低い。
Axelrod, D., Traffic, Vol.2, pp.764-774, (2001) Prieve, D. C. and Frej, N. A., Langmuir, 6, pp.396-403, (1990) Conibear, P. B. and Bagshaw, C. R., Journal of Microscopy, Vol. 200, Pt 3, pp.218-229, (2000) Teruel, M. N. and Meyer, T., Science, Vol. 295, pp.1910-1912, (2002)

本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、特別なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラスに対して対応可能かつ交換可能であり、スライドガラス上の観察位置を任意に自由に変更可能で、散乱光の発生が少なく高ＳＮ比の観察が可能で、しかも、試料の操作が容易な全反射試料照明装置及び照明方法を提供することである。

上記目的を達成する本発明の全反射試料照明装置は、スライドガラス内での多重全反射により導波されるレーザ光によって少なくとも前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置において、
前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムはレーザ光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されることを特徴とするものである。

この場合に、前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持されている前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節する位置調節機構を備えていることが望ましい。

また、本発明の全反射試料照明方法は、スライドガラス内での多重全反射により導波されるレーザ光によって少なくとも前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明方法において、
入射プリズムと放射プリズムとの上に滴下した屈折率整合液を介して共通の平面内で移動可能に前記スライドガラスを支持し、
前記放射プリズムを前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に支持し、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とが、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように設定し、
前記レーザ光が、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるようにしたことを特徴とする方法である。

この場合に、前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持されている前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節することが望ましい。

本発明は、以上のような全反射試料照明装置を用いている顕微鏡、計測装置を含むものであり、さらに、以上のような全反射試料照明方法を用いている顕微鏡法、計測方法を含むものである。

以上の本発明によると、特別なスライドガラスを用いることになく任意のスライドガラスに対して対応可能かつ交換可能であり、スライドガラス上の観察位置を任意に自由に変更可能で、散乱光の発生が少なく高ＳＮ比の観察が可能で、しかも、試料の操作が容易な全反射試料照明装置及び照明方法を提供することができる。

以下に、本発明の全反射試料照明装置とその装置に用いる照明方法を実施例に基づいて説明する。図１は、本発明の全反射試料照明装置の１実施例の垂直断面図であり、図２はその平面図である。この全反射試料照明装置は、試料載置台１を備えており、その中心に開口２が設けらており、開口２に面して試料載置台１には入射プリズム３が固定されている。また、開口２を挟んで入射プリズム３に面して放射プリズム４が入射プリズム３との間隔を調節可能に移動台５に取り付けられている。この移動台５は位置調節ネジ６により試料載置台１に対して入射プリズム３方向に移動調節可能に構成されている。そして、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１とは、移動台５の位置に係わらずに同一高さで同一面になるように、入射プリズム３と放射プリズム４の形状と移動台５の移動機構が構成されている。

そして、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１との上に、試料Ｓを支持するスライドガラス、この例ではスライドガラスチェンバー２０が透過面３３と透過面４１上に滴下した油浸オイル２５を介して自由に載せられる。

ここで、入射プリズム３は、レーザ１１からのエバネッセント波発生用のレーザ光１０を入射させるための透過面３１と、入射したレーザ光１０を反射する反射面３２と、反射面３２で反射されたレーザ光１０を射出する透過面３３とを有する反射プリズム形状のものであり、放射プリズム４は、スライドガラスチェンバー２０の底面のスライドガラス２１中を多重全反射により導波されたレーザ光１０をスライドガラス２１の外へ導く透過面４１と、透過面４１から入射したレーザ光１０を外へ放射する透過面４２とを有する透過プリズム形状のものである。

また、試料載置台１の上面には、Ｘ−Ｙステージ５０を介してスライドガラス把持機構５５が設けられており、この例では、パッド５６を介してスライドガラス把持機構５５がその挟む方向に働く弾性によりスライドガラスチェンバー２０を支持しており、Ｘ−Ｙステージ５０のＸ方向位置調節ネジ５１によりスライドガラスチェンバー２０をレーザ光１０の入射方向に平行なＸ方向に移動調節可能としており、また、Ｘ−Ｙステージ５０のＹ方向位置調節ネジ５２によりスライドガラスチェンバー２０をレーザ光１０の入射方向と直角なＹ方向に移動調節可能としている。

このような構成であるので、入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１の上に油浸オイル２５を介して載せるスライドガラスチェンバー２０あるいはスライドガラス２１を別の種類又は規格のものに交換しても、エバネッセント波発生用のレーザ光１０の入射位置は何ら調節する必要がない。したがって、その光源であるレーザ１１の位置も調節する必要がない。ただし、スライドガラス２１の厚みが異なることにより、スライドガラス２１の下面での反射位置が変化するので、位置調節ネジ６を調節して移動台５をＸ方向に移動させることで、放射プリズム４の位置を最適にして散乱光が発生しないようにすることができる。

そして、Ｘ−Ｙステージ５０のＸ方向位置調節ネジ５１とＹ方向位置調節ネジ５２を調節してスライドガラス把持機構５５を入射プリズム３の透過面３３と放射プリズム４の透過面４１とが形成するＸ−Ｙ平面内で任意に調節してスライドガラスチェンバー２０の面内位置を任意に調節することにより、試料載置台１中心の開口２に面している顕微鏡対物レンズ６１の光軸に対して直交方向の観察位置を調節することができる。

以上の実施例に基づいて説明した本発明の全反射試料照明装置とその装置に用いる照明方法は、スライドガラス２１内でレーザ光１０を多重全反射させる点では、図５（ａ）、（ｂ）で示した従来の多重全反射の方式のものと共通しているが、スライドガラス２１として通常の厚さ０．１７〜０．２ｍｍより厚いスライドガラスを用いることで、多重全反射の回数を最小限に抑えることができ、蛍光観察の際のＳＮ比の低下を防ぐことができる。上記実施例では、スライドガラス２１の試料Ｓが載っている上面での全反射回数は４回で、そのためエバネッセント波Ｅｖで照明される領域は、図２に示す飛び飛びの４か所となっている。

また、放射プリズム４の位置を最適に調節して多重全反射後にスライドガラス２１から出ていくレーザ光１０に基づく散乱光を発生しないようにすることができる。

そして、上からの試料の操作が容易で、他の光学観察手法との併用及び高ＳＮ比の低倍率観察が可能となる。標本容器には、上記実施例のような細胞培養用スライドガラスチェンバー２０も使用可能であり、スライドガラスに加工も一切不要であることから、汎用性も高い。

また、Ｘ−Ｙステージ５０の位置調節機構を介してスライドガラス２１上の観察位置を任意に自由に高速で変更可能であるので、スライドガラス２１の面内に位置する多くの細胞等の試料を高速で切り換えて観察することが可能となる。

細胞を用いた本発明の全反射試料照明装置及び照明方法の検証実験を行った。図１〜図２のように、蛍光顕微鏡に組み込んだ２つのプリズム（入射プリズム３、放射プリズム４) の透過面３３、４１に厚さが１ｍｍ程度のスライドガラス２１を有する標本（市販のスライドガラスチェンバー２０) を油浸オイル２５により吸着させた。次に、入射プリズム３からレーザ光１０を入射させてスライドガラス２１内で多重全反射させ、ガラス２１表面にエバネッセント波Ｅｖを発生させた。このとき放射プリズム４の位置を調節してレーザ光の放射光路を確保し、バックグラウンド光の強度を最小限に抑えている。入射プリズム３から数えて２〜４番目のエバネッセント波Ｅｖを用いることで、高いＳＮ比が実現され、最終的には標本内のスライドガラス２１表面に培養した複数の細胞や生体高分子の低倍率同時観察が可能であることが示された。

以上において、入射プリズム３と放射プリズム４の形状は図１に示したような形状のものに限定されず種々の反射プリズム形状のものや透過プリズム形状のものが使用可能である。要は何れのプリズム３、４も、スライドガラス支持面と透過面３３、４１を兼ねる平面を有することであり、レーザ光１０の入射方向、放射方向に応じて形状を決めればよい。

また、スライドガラスチェンバー２０あるいはスライドガラス２１の把持機構及びそのＸ−Ｙ移動調節機構も図２に示したような構成のものに限定されず種々の把持機構、移動調節機構を用いることが可能である。

以上の本発明の全反射試料照明装置とその装置に用いる照明方法を用いると、複数の細胞や生体高分子に関連したナノスケールの事象を低倍率で同時に観察することが可能である。また、標本容器には市販されている細胞培養用のスライドガラスチェンバーを使用することができることから、汎用性は高い。

また、前述したように、これまでもＴＩＲＦ顕微鏡法は電気化学分野の現象解明に貢献してきた。本発明の全反射試料照明装置とその装置に用いる照明方法は低倍率での計測が可能であることから、コロイド粒子のブラウン運動や界面動電現象といった局所的な電気化学だけなく、粘性、拡散、対流といった流体的な要素が複雑に絡み合った現象の包括的な解明に絶大な効果を発揮すると考えられる。これはすなわち、マイクロ・ナノスケールの流動現象を取り扱うマイクロ・ナノスケール熱流体工学そのものに他ならない。よって、ＤＮＡ分析や食品診断といった機能の集約化を目的とするマイクロ・ナノスケール流体デバイスの発展に大きく貢献すると考えられる。

また、本発明の全反射試料照明装置及び照明方法は、前述したように、試料の操作性と標本の自由度に優れ、他の光学観察手法との併用が容易で、かつ、低倍率観察を可能とするＴＩＲＦ顕微鏡システムを構成することができる。

また、電気化学及びマイクロ熱流体工学分野においては、流路の壁近傍におけるイオンやコロイド粒子に関連した複雑なマイクロ・ナノスケール流動現象の実験的解明に大きく貢献すると考えられ、バイオＭＥＭＳ技術の発展につながると予想される。

本発明の全反射試料照明装置の１実施例の垂直断面図である。図１の全反射試料照明装置の平面図である。ＴＩＲＦ顕微鏡法におけるエバネッセント波の発生の様子を示す図である。市販の対物レンズ式ＴＩＲＦ顕微鏡とプリズム式ＴＩＲＦ顕微鏡におけるエバネッセント波発生原理を示す図である。従来提案されているスライドガラス内で多重全反射させてエバネッセント波を発生させる方式を示す図である。

符号の説明

Ｓ…試料
１…試料載置台
２…開口
３…入射プリズム
４…放射プリズム
５…移動台
６…位置調節ネジ
１０…エバネッセント波発生用のレーザ光
１１…レーザ
２０…スライドガラスチェンバー
２１…スライドガラス
２５…油浸オイル
３１…入射プリズムの透過面
３２…入射プリズムの反射面
３３…入射プリズムの透過面
４１…放射プリズムの透過面
４２…放射プリズムの透過面
５０…Ｘ−Ｙステージ
５１…Ｘ方向位置調節ネジ
５２…Ｙ方向位置調節ネジ
５５…スライドガラス把持機構
５６…パッド
６１…顕微鏡対物レンズ

Claims

スライドガラス内での多重全反射により導波されるレーザ光によって少なくとも前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明装置において、
前記スライドガラスを滴下した屈折率整合液を介してその面内で移動可能に支持する入射プリズムと放射プリズムとを備え、
前記入射プリズムはレーザ光源に対して固定され、前記放射プリズムは前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に配置されており、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とは、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように配置され、
前記レーザ光は、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されることを特徴とする全反射試料照明装置。
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持されている前記スライドガラスを把持して、前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節する位置調節機構を備えていることを特徴とする請求項１記載の全反射試料照明装置。
スライドガラス内での多重全反射により導波されるレーザ光によって少なくとも前記スライドガラスの上面にエバネッセント波を発生させ、前記スライドガラスの上面に位置する試料をそのエバネッセント波で照明する全反射試料照明方法において、
入射プリズムと放射プリズムとの上に滴下した屈折率整合液を介して共通の平面内で移動可能に前記スライドガラスを支持し、
前記放射プリズムを前記入射プリズムに対して前記レーザ光進行方向に位置調節可能に支持し、
前記入射プリズムの前記スライドガラスの支持面と、前記放射プリズムの前記スライドガラスの支持面とが、前記放射プリズムの調節位置に係わらずに同一高さで同一面になるように設定し、
前記レーザ光が、前記入射プリズムを経て前記支持面から出てその上に滴下されている前記屈折率整合液を介してその上に支持されている前記スライドガラス内に入って多重全反射により導波され、前記放射プリズムの前記支持面の上に滴下されている前記屈折率整合液を介して前記放射プリズムの前記支持面から前記放射プリズム内に入り、前記放射プリズムから外部へ放射されるようにしたことを特徴とする全反射試料照明方法。
前記入射プリズムと前記放射プリズムとの上に支持されている前記スライドガラスをその面に沿った２次元方向に位置調節することを特徴とする請求項３記載の全反射試料照明方法。
請求項１又は２記載の全反射試料照明装置を用いていることを特徴する顕微鏡。
請求項１又は２記載の全反射試料照明装置を用いていることを特徴する計測装置。
請求項３又は４記載の全反射試料照明方法を用いていることを特徴する顕微鏡法。
請求項３又は４記載の全反射試料照明方法を用いていることを特徴する計測方法。