CN115097617A - 一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统 - Google Patents

一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，包括：像面探测器、成像管镜、550nm长通滤波片、空气物镜、平面芯片、532nm激发光光源。其中平面芯片由承载样品的盖玻片、控制光流的多层介质薄膜及提供大入射波矢的散射层组成。将未准直的激光光束入射到二氧化钛散射层上，散射光入射到平面芯片中的光子晶体，由光子晶体对入射的散射光的角度进行筛选，使大角度的光入射到盖玻片，激发其表面附近的荧光分子。被激发的荧光由空气物镜收集，经过550nm长通滤波片有效滤去激发光束，从而显微镜系统只收集荧光信号。本发明首次利用多层介质薄膜的带隙结构来实现全内反射荧光的激发，提高了荧光成像质量。

Description

一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统
技术领域
本发明属于全内反射荧光成像领域，特别涉及一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统。
背景技术
显微技术是人们了解微观世界最直接的手段，光学显微技术将微观世界图像直接呈现在我们眼前，是所有显微技术中最直观也是最常用的一种显微技术。全内反射荧光显微术是利用光束从光密介质入射到光疏介质时，入射角大于临界角会在界面产生沿界面法向方向场强指数衰减的倏逝场，其局限在表面倏逝场作为激发荧光分子团的光源，激发临近表面荧光团，实现高信噪比的荧光成像。上述主要显微术在实际应用中具有很大的局限性，其存在的问题为：
1、体积大。传统的全内反射荧光显微镜需要借助较大的体积的棱镜和高数值孔径的油镜物镜来提高较大的传播波矢，实现在界面处产生圈内反射，增加了成像系统的体积。
2、操作复杂。由于全内反射的产生对入射光的角度要求较高，使其在基于棱镜和油镜物镜的全内反射荧光显微镜系统对入射激发光束的准直要求性很高。
3、成像质量差。传统单向照明的全内反射荧光显微镜，由于荧光样品的散射作用，将表面的倏逝波散射转化为传播波，使荧光成像存在伪影，降低荧光成像质量。对激发光束为激光的系统，由于激光的强干涉性，入射光束常有干涉条纹，造成荧光激发的不均匀性。
4、成像视野小。基于大数值孔径物镜激发全内反射的荧光显微镜，由于物镜的倍数高，成像视场小，在研究荧光标记追踪时受限于视场。
发明内容
本发明的目的是克服传统全内反射荧光显微术操作繁杂，非均匀成像，体积大的不足，提出了一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，其借助散射层的均匀散射和多层介质薄膜对传播波矢的选择，实现多层介质薄膜满足全内反射的传播波矢通过，入射到盖玻片上，在盖玻片和空气表面产生全内反射的倏逝场，激发临近界面的荧光分子团，实现了高信噪比，均匀激发荧光分子的荧光成像。
本发明实现上述的目的所采用的技术方案如下：
一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，包括像面探测器、成像管镜、550nm长通滤波片、空气物镜、平面芯片和532nm激发光光源；所述平面芯片由盖玻片、多层介质薄膜及散射层通过折射率匹配油黏附组成；其中，所述的532nm激发光光源发出激发波长为532nm的光束，激发光束入射到平面芯片中的散射层后被均匀散射形成散射光，入射到所述多层介质薄膜中，角度小于全内反射角的散射光的传播波矢被反射到散射层中，角度大于全内反射角的散射光的传播波矢穿过所述多层介质薄膜入射到所述盖玻片上，在空气和盖玻片的界面上产生指数衰减的倏逝场，激发所述盖玻片承载的荧光样品，激发产生的荧光信号被空气物镜收集，再经过所述550nm长通滤波片，滤去荧光样品散射的激发光束，所述荧光信号经过成像管镜最终成像在所述像面探测器上。
进一步地，所述的532nm激发光光源所发出的光不经过准直器件而入射到平面芯片。
进一步地，所述多层介质薄膜由SiO 2 和Si 3 N 4 纳米薄膜组成，共15对。
进一步地，所述散射层由二氧化钛颗粒旋涂在干净的盖玻片上制备而成。
本发明技术方案的原理为：通过增加散射层将入射光转化为均匀的、具有较大的传播波矢的光束入射到多层介质薄膜上。通过设置多层介质薄膜的折射率和膜厚，来选择透射的传播波矢入射到盖玻片上，在盖玻片和空气表面产生全内反射，在表面产生均匀、各个方向传播的倏逝场，并激发表面荧光分子团。荧光信号被宽视场的成像系统接受，其中550nm长通滤波片滤去激发光，最终在像面探测器上的到均匀、无伪影、高信噪比的全内反射荧光成像。
本发明和现在有成像技术相比的优势为：
1、无伪影：本发明的散射层为入射光束提供均匀的散射，使入射到多层介质薄膜的散射光具有各个方向的传播波矢，在盖玻片表面有各个方向传播的倏逝场，荧光分子团被均匀激发，伪影效应被削弱，使得成像分辨率有效提高。
2、宽视场成像：本发明的盖玻片和空气界面上的倏逝场由平面芯片大小和入射光斑大小决定，理论上倏逝场可以存在于整个平面芯片上，实现宽视场成像。
3、装置简单：本发明的显微镜系统由普通的正置显微镜和平面芯片及光源组成，无机械运动器件来消除伪影，且对入射光的准直性和均匀性要求低，便于非专业人员操作。
4、集成性高：本发明激发的全内反射是由平面芯片实现，平面芯片厚度在几个毫米范围里，相比传统使用棱镜和油镜物镜激发全内反射缩小了体积，实现集成化。
5、高空间分辨率：由于本发明的散射层散射是各个方向均匀的，在玻璃和空气界面对应有各个方向传播倏逝场，均匀照射荧光样品，提高成像分辨率。
综上所述，本发明的目的是为了克服传统表面波成像显微镜信噪比低、时间和空间分辨率差、工作环境单一且成本高的不足，提出了一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统。该系统的成像质量良好，可以实时观测，结构可靠性高，重复性高，利用了高速旋转照明和表面波的物镜激发，配合设计的多种表面波基片，实现了紧邻基片表面样品的高信噪比和高分辨率的表面波显微成像。
附图说明
图1为本发明一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统的结构示意图；
图2为本发明的平面芯片原理示意图；
图3a和图3b为利用本发明的基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统获得的纳米纤维（直径为1μm）和纳米颗粒（直径约为2μm）的全内反射荧光成像，其中，图3a为利用该系统获得的直径约为1μm纳米纤维的全内反射荧光成像，图3b为利用该系统获得的直径约为2 μm纳米颗粒的全内反射荧光成像。
图中，1为像面探测器；2为成像管镜；3为550nm长通滤波片；4为空气物镜；5为平面芯片；6为532nm激发光光源；7为盖玻片；8为多层介质薄膜；9为散射层。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述。
如图1、图2所示，本发明的一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，包括像面探测器1、成像管镜2、550nm长通滤波片3、空气物镜4、平面芯片5、532nm激发光光源6。如图2所示，平面芯片5由承载荧光样品的盖玻片7、控制光流的多层介质薄膜8及提供大入射波矢的散射层9采用折射率匹配油黏附在一起组成的。其中盖玻片7的表面因全内反射产生倏逝场，均匀的激发临近表面的荧光分子团。
所述的532nm激发光光源6发出激发波长为532nm的光束，激发光束入射到平面芯片5中的散射层9后被均匀散射，产生更大的传播波矢，入射到多层介质薄膜8中。散射的激发光束在多层介质薄膜8的光流筛选中，小于全内反射角的传播波矢被反射到散射层9中，满足全内反射条件的传播波矢穿过多层介质薄膜8入射到盖玻片7上，在空气和盖玻片7的界面上产生指数衰减的倏逝场，激发荧光样品。激发产生的荧光信号被空气物镜4收集，再经过550nm长通滤波片3，滤去荧光样品散射的激发光束。荧光信号经过成像管镜2最终成像在像面探测器1上，实现无伪影、均匀照明、高信噪比的全内反射荧光显微镜系统。
所述550nm长通滤波片3将激发光束阻挡，只允许荧光信号通过，提高荧光成像信噪比。所述荧光信号经过550nm长通滤波片3，滤去散射的激发光束，经过成像管镜2，成像于像面探测器1上，得到均匀激发的荧光信号和高信噪比的荧光成像。所述空气物镜4包括各种数值孔径和放大倍数不同的空气物镜，结合成像管镜2和像面探测器1可以得到宽视场的全内反射荧光显微镜系统。例如，数值孔径为0.6，放大倍数为40倍的空气物镜4与成像管镜2及像面探测器1提供大视场的荧光信号成像。所述的532nm激发光光源6所发出的光不需要经过任何准直器件入射到平面芯片5而在其表面产生全内反射。
所述多层介质薄膜8对散射光的传播波矢进行筛选，使满足产生空气/玻璃界面的全内反射的传播波矢入射到盖玻片7上，产生全内反射，在空气/玻璃界面有各个方位传播的倏逝波，均匀激发在盖玻片7表面的荧光分子，实现无伪影照明。具体地，所述多层介质薄膜8阻挡小于全内反射角的散射光，控制角度大于全内反射角的散射光入射到空气和盖玻片7的界面，产生全内反射。
所述多层介质薄膜8控制光流，通过加工高低折射率交替的多层纳米薄膜，操控不同光波矢的透射和反射让大于全内反射的波矢通过，在盖玻片7产生全内反射，通过改变各层的折射率和厚度可以设置出支持不同波长、不同折射率环境和不同穿透深度的平面芯片5作为激发荧光的基底。所述多层介质薄膜8是由SiO 2 和Si 3 N 4 纳米薄膜组成，共15对。其中多层介质薄膜8是Si 3 N 4 与SiO 2 的介质交替层组成，操控满足产生全内反射条件的波矢通过。
其中散射层9是由尺寸为60nm的二氧化钛颗粒旋涂在干净的盖玻片7上制备的，二氧化钛颗粒形成的薄膜约为2μm，使入射激发光束均匀散射，且提供了大角度的传播波矢入射到多层介质薄膜8中。
所述成像管镜2、空气物镜4、像面探测器1、550nm长通滤波片3及平面芯片5组成大视场的荧光显微镜系统。
如图3a，图3b所示，其为利用本发明的基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统对纳米纤维（直径为1μm）和纳米颗粒（直径约为2μm）的全内反射荧光成像，其中图3a是利用该系统对直径为1μm左右的纳米纤维进行荧光成像，纳米线交叉处断掉证明了全内反射激发荧光，且图像具有高对比度的成像系统。图3b是对2μm的荧光小球成像，相比于传统单向照明荧光成像系统，该系统没有伪影效果，成像质量显著提高。
本发明未详细阐述的部分属于本领域公知技术。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，其特征在于：包括像面探测器（1）、成像管镜（2）、550nm长通滤波片（3）、空气物镜（4）、平面芯片（5）和532nm激发光光源（6）；所述平面芯片（5）由盖玻片（7）、多层介质薄膜（8）及散射层（9）通过折射率匹配油黏附组成；其中，所述的532nm激发光光源（6）发出激发波长为532nm的光束，激发光束入射到平面芯片（5）中的散射层（9）后被均匀散射形成散射光，入射到所述多层介质薄膜（8）中，角度小于全内反射角的散射光的传播波矢被反射到散射层（9）中，角度大于全内反射角的散射光的传播波矢穿过所述多层介质薄膜（8）入射到所述盖玻片（7）上，在空气和盖玻片（7）的界面上产生指数衰减的倏逝场，激发所述盖玻片（7）承载的荧光样品，激发产生的荧光信号被空气物镜（4）收集，再经过所述550nm长通滤波片（3），滤去荧光样品散射的激发光束，所述荧光信号经过成像管镜（2）最终成像在所述像面探测器（1）上。
2.根据权利要求1所述的一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，其特征在于：所述的532nm激发光光源（6）所发出的光不经过准直器件而入射到平面芯片（5）。
3.根据权利要求1所述的一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，其特征在于：所述多层介质薄膜（8）由 SiO 2 和Si 3 N 4 纳米薄膜组成，共15对。
4.根据权利要求1所述的一种基于平面芯片的全内反射荧光显微镜系统，其特征在于：所述散射层（9）由二氧化钛颗粒旋涂在干净的盖玻片（7）上制备而成。
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