JP5400499B2

JP5400499B2 - 焦点検出装置

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Publication number: JP5400499B2
Application number: JP2009154025A
Authority: JP
Inventors: 尊己芝崎
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2029-06-29
Also published as: JP2011008189A

Description

本発明は、焦点検出装置に関し、特に顕微観察装置において、マイクロプレートやスライドガラスなどの透明基板の所望の表面に焦点合わせを自動的に行うための焦点検出装置に関するものである。

バイオテクノロジーの分野においては、様々な条件下での種々の生細胞の反応を明らかにするため、多数の細胞を対象とした統計解析結果を用いることが頻繁に行われている。このような目的のため、従来、フローサイトメーターと呼ばれる装置が使用されてきたが、近年、顕微観察によって多数の細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得るという手法が用いられるようになってきている。

ところで、このように様々な条件下での生細胞の反応を試験するためには、培養液組成や温湿度などの培養環境条件を制御した多数の容器の中で培養された非常に多くの生細胞を解析対象とする必要があるので、一般にマイクロプレートなどの容器を使用して試験を実施することが行われている。

このため、細胞画像を取得する顕微観察装置としては、マイクロプレートなどの容器の下方より観察する倒立顕微鏡型の光学配置を採用し、さらに視野位置変更、焦点合わせ、撮像などの画像取得にかかわる一連の動作を自動化したものが望まれる。そして、このように顕微観察装置を自動化する場合には、特に焦点合わせの自動化方式が重要である。

一般的に、焦点合わせの自動化方式には、大別して対象物（被写体）に赤外線などの焦点検出用照明光を照射し、その反射光の光量などを検出することにより焦点を検出するアクティブ方式と、レンズで捉えた画像を利用して焦点を検出するパッシブ方式の２つの方式が存在する。

しかるに、様々な条件下での種々の生細胞の反応を明らかにすることを目的として細胞画像を取得する顕微観察装置においては、非常に多くの画像を取得する必要があるため、迅速な動作速度を有するアクティブ方式の焦点合わせ方式が採用されることが多い。このようなアクティブ方式の焦点検出装置においては、高い焦点合わせ精度を実現するために焦点検出用照明光束径を対物レンズの瞳径に一致させるのが一般的であり、このようなアクティブ方式を採用した焦点検出装置として、例えば特許文献１に記載のものがある。

アクティブ方式の焦点検出装置において高い精度で焦点合わせを行うためには、対物レンズの瞳径に焦点検出用照明光束径を一致させることが必要であるが、一方で、対物レンズの瞳径は対物レンズごとに様々であるため、焦点検出用照明光束径を瞳径の大きな低倍率の対物レンズに合わせて最適化すると、瞳径の小さな高倍率の対物レンズに切り換えた場合に焦点検出用照明光束が対物レンズの瞳によってケラレるため、光量不足となって焦点検出を行うことが困難になりやすい。

一方、焦点検出用照明光束の径を瞳径の小さな高倍率の対物レンズに合わせて最適化すると、瞳径の大きな対物レンズに切り換えた場合に実質上、焦点検出装置の被写界深度が深くなって焦点検出の精度が悪化する。したがって、対物レンズごとに焦点検出用照明光の光束径を最適化する必要がある。

しかるに、特許文献１には、焦点検出用照明光としてレーザを採用し、レーザ光源と対物レンズとの間に、ＮＤフィルタと径の異なる開口絞りを組み合わせた絞りフィルタ組み立て体を備え、レーザ光源のパワーを一定にしたままで、ＮＤフィルタを介してレーザ光量を調節するとともに、開口絞りを選択してレーザ光束径を対物レンズの瞳の径に合わせるようにした構成が開示されている。

さらに、アクティブ方式を採用した焦点検出装置を用いてマイクロプレートの底面のような透明基板の一方の面に焦点を合わせる場合には、他方の面からの反射光も光検出器で検出されてノイズとなって焦点の検出に悪影響を及ぼすという問題がある。

このため本件出願人は先に、お互いに対向した状態で配置された傾斜面を有し、且つ、該傾斜面の間隔を調節可能な２つの光学部材からなる光束入射位置調節手段により、該２つの光学部材の傾斜面の間隔を調節することで、対物レンズの瞳位置における焦点検出用光束の入射位置を対物レンズの瞳径に応じた瞳内の所定位置に調節して対物レンズに入射させることによって、焦点検出用光束の径を対物レンズの瞳径に合わせて最適化でき、しかも、瞳径の大きな対物レンズに切り換えた場合でも、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出し、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことが可能な焦点検出装置を開発し特許出願（特願２００８−３２００１１号）した。

特開２００７−１６３７３８号公報

上記本件出願人が特許出願したものは、発明の主目的は達成されていて性能的にも基本的には満足できるものであった。しかし、特に装置組み立て時に次のような不都合があることもわかった。
すなわち、上記特許出願した焦点検出装置のように、お互いに対向した状態で配置された傾斜面の間隔を調整することによって対物レンズの瞳へのレーザ光束入射位置を調節することによって最適化する場合、該傾斜面を正確に平行に調整することが必要である。このとき複数の傾斜面の角度を同時に調整する作業が必要になるが、上記装置においては、傾斜面を有する光学部材へのレーザ光束の入射及び出射角度を、お互いに独立して調整することができるような構成となっていないため、必要な精度に調整して組み立てることが場合によっては難しいという課題があった。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、瞳径の異なる対物レンズに切り換えても、レーザ光を調光することなく、レーザ光束の径を対物レンズの瞳径に合わせて最適化でき、しかも、瞳径の大きな対物レンズに切り換えたときでも、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことが可能であり、更に組み立てが容易な焦点検出装置を提供することを目的としている。

上記の目的を達成するために、本発明による焦点検出装置は、焦点検出用光束を対物レンズを介して試料面に投射して焦点合わせを行う焦点検出装置であって、前記対物レンズの瞳位置における前記焦点検出用光束の入射位置を該対物レンズの瞳径に応じた該瞳内の所定位置に調節可能な光束入射位置調節手段を備え、該光束入射位置調節手段は、少なくとも２つの反射鏡を含み、前記光束入射位置調節手段が、前記焦点検出用光束を光軸に対称に分離し、前記２つの反射鏡は、前記焦点検出用光束の光軸を中心として対称な位置に配置されており、前記光束入射位置調節手段が、前記２つの反射鏡の間隔を、前記光軸を中心とした対称な位置を保ったまま調整することによって、該分離した２つの光束の間隔を調整することを特徴としている。

また、本発明の焦点検出装置においては、前記光束入射位置調節手段が、前記２つの反射鏡の間隔を調整することによって、前記焦点検出用光束を光軸に直角な方向にシフトさせるのが好ましい。

また、本発明の焦点検出装置においては、前記２つの反射鏡は、それぞれが個別に光軸に直角な方向に移動させることができるのが好ましい。

また、本発明の焦点検出装置においては、前記焦点検出装置は、前記対物レンズと、透明基板に対し合焦信号を生成するための照明光を発し前記対物レンズを通して照射する点光源と、前記照明光の光束のうちの該照明光の光軸に沿う第１の仮想平面で２分割したときに一方の領域を通る光束を遮光する遮光部材と、前記透明基板で反射された光の光軸に沿う第２の仮想平面を挟んで対称に配置された２つの受光部を有する光検出器とを備え、前記２つの受光部を介してそれぞれ検出された前記透明基板からの反射光の光量に基づいて、前記透明基板の第１又は第２の表面に前記対物レンズの焦点合わせを行い、前記光束入射位置調節手段は、前記透明基板における第１又は第２の表面のうち一方の表面近傍に前記対物レンズの焦点が位置するときに、該一方の表面からの反射光が前記２つの受光部に入射するとともに、他方の表面からの反射光が前記第２の仮想平面で分割したときの一方の領域における当該領域に配置された受光部を外れた領域を通るような該対物レンズの瞳内の所定位置に、該対物レンズの瞳位置における前記焦点検出用光束の入射位置が調節可能に構成されているのが好ましい。

本発明の焦点検出装置によれば、瞳径の異なる対物レンズに切り換えても、レーザ光を調光することなく、レーザ光束の径を対物レンズの瞳径に合わせて最適化でき、しかも、瞳径の大きな対物レンズに切り換えたときに、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことが可能である。さらに、２つの独立した反射鏡により光束入射位置調節手段を構成しているので、分割した焦点検出用光束の進行方向の調節が容易になるという効果を有する。

本発明の焦点検出装置を備えた顕微観察装置の概略構成を示す説明図である。本発明の焦点検出装置を説明するものであり、（ａ）は焦点検出装置の概略構成図であり、（ｂ）は対物レンズの瞳とそこへ入射するレーザ光束の位置関係を示す図である。また、（ｃ）は、このときの焦点検出装置の右側面図である。さらに（ｄ）は、透明基板の目的表面ではない面からの反射光の光路の概略図である。（ｄ）では、説明のため、片側の光束に関する光路のみを示してある。図２（ａ）の焦点検出装置において、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面で反射された光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光の、２つの受光部との位置関係を示す説明図である。本発明の焦点検出装置において、被検物を観察する対物レンズを変更した場合に対物レンズに合わせて調整を完了した状態を説明するものであり、（ａ）は焦点検出装置の概略構成図であり、（ｂ）は対物レンズの瞳とそこへ入射するレーザ光束の位置関係を示す図である。また、（ｃ）は、このときの焦点検出装置の右側面図である。焦点検出装置における２分割フォトディテクターによって検出される光量変化の１例を示すグラフである。図５のデータに基づいて行った評価関数計算値の一例を示すグラフである。

次に、本発明の焦点検出装置の実施形態を、図１に示す本発明の焦点検出装置を備えた顕微観察装置と、図２に示す本発明の焦点検出装置の概略構成図に基づいて説明する。
図１に示す顕微観察装置は、顕微鏡本体１と、落射照明装置２と、本発明の焦点検出装置３とから構成されている。

顕微鏡本体１は、被検物４を載置するＸＹステージ５を備えている。ＸＹステージ５の下方には、対物レンズ６と、ハーフミラー７，２０と、結像レンズ８と、ＣＣＤカメラ９とを備えている。ＸＹステージ５は、水平面内（紙面に対して垂直な平面内）を移動可能に構成されている。対物レンズ６は、駆動部１０を介して対物レンズ６の光軸方向に移動可能に構成されている。

試料面となる被検物４は、公知の複数ウェルを有するポリスチレン等の光透過性部材で製作されたマイクロプレート４ａを容器として使用し、培養液４ｂ中で培養された細胞をマイクロプレート４ａの底面部４ａ１の表面４ａ１１に公知の技術によって固定化したものである。なお、被検物４に用いる細胞は、さらに解析する項目に応じて適切な方法によって染色された細胞であってもかまわない。また、使用する容器として、ここではプラスチック製のものを例示したが、底面にガラスを貼り付けたガラスボトムプレートでもかまわない。なお、本出願において透明基板とは、光透過性部材で製作さているマイクロプレート４ａの底面部４ａ１のような箇所をいう。そして、この底面図４ａ１の一方の表面を第１の表面、他方の表面を第２の表面と称している。

落射照明装置２は、ＸＹステージ５の下方に備えられ、光源１１と、集光レンズ１２からなる。光源１１はＬＥＤで構成されている。

焦点検出装置３は、対物レンズ６と、ハーフミラー７と、焦点検出ユニット３’とを有している。焦点検出ユニット３’は、顕微鏡本体１におけるハーフミラー７の反射光路上に配置され、λ／４板１５と、偏光ビームスプリッタ１４と、偏光ビームスプリッタ１４の透過光路上に配置された、焦点検出用光源１７と、コリメートレンズ１８と、遮光部材１６と、反射鏡２１ａ及び反射鏡２１ｂが光軸Ｘ１を中心として対称な位置に配置され、さらに図示しない駆動手段により、２つの反射鏡２１ａ及び２１ｂの間隔が調整できるようにした光束入射位置調節手段２１と、偏光ビームスプリッタ１４の反射光路上に配置された結像レンズ１３と、光検出器１９とを備えている。

焦点合わせ用の焦点検出用光源１７は、レーザダイオードで構成されていて、被検物４の透明基板（マイクロプレート４ａの底面部４ａ１）に対して焦点合わせ信号を生成するための照明光を発するようになっている。

コリメートレンズ１８は、焦点検出用光源からの光を平行光束に変換する。

遮光部材１６は、焦点検出用光源１７から発せられた照明光の光束のうち、光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面（図１及び図２で光軸Ｘ１を含む紙面と平行な平面）で２分割したときの一方の領域を通る光束を遮光することが可能な形状及び大きさに形成されている。本実施形態では、遮光部材１６は矩形状に形成されている。なお、この一方の領域の光束を遮光することができればどのような形状でもよい。

偏光ビームスプリッタ１４は、入射光のうちＳ偏光又はＰ偏光のいずれか一方の直線偏光成分を透過し、他方の直線偏光成分を反射する。

λ／４板１５は、偏光ビームスプリッタ１４の透過光路上に配置されており、偏光ビームスプリッタ１４からの一方の直線偏光を円偏光に変換し、また、対物レンズ６からの円偏光を他方の直線偏光に変換する。

光検出器１９は、２分割フォトダイオードで構成されている。２分割フォトダイオードは、２つの受光部１９ａ、１９ｂを有している。２つの受光部１９ａ、１９ｂは、光軸Ｘ２に沿う第２の仮想平面（図１及び図２で光軸Ｘ２を含む紙面と平行な平面）を挟んで対称に配置されている。

光束入射位置調整手段２１は、第１の反射鏡２１ａと、第２の反射鏡２１ｂとで構成されており、光軸Ｘ１に直角な方向に図示しない駆動手段によってお互いの間隔を調整できるようになっている。そして、２つの反射鏡の間隔を調整することにより、対物レンズ６の瞳２２の位置における焦点検出用光束の入射位置を対物レンズ６の瞳２２の径に応じた瞳２２内の所定位置に調節することができるようになっている。

次に、上記した本発明の焦点検出装置３を備えた顕微観察装置１における焦点検出方法について説明する。
本実施形態の焦点検出装置３を備えた顕微観察装置１では、まず、落射照明装置２の光源１１である白色ＬＥＤから射出された光が、集光レンズ１２、ハーフミラー２０、ハーフミラー７、対物レンズ６を介してＸＹステージ５に載置された被検物４を照明する。このときの被検物４からの光は、対物レンズ６、ハーフミラー７、ハーフミラー２０、結像レンズ８を経由してＣＣＤカメラ９へ導かれる。これにより、ＣＣＤカメラ９を介して被検物４を撮像することができる。

また、焦点検出装置３では、レーザダイオード１７から射出された光が、コリメートレンズ１８によって平行光束に変換された後、その一部が遮光部材１６を介して遮光される。一方、遮光部材１６によって遮光されることなく通り抜けた光は、反射鏡２１ａ、２１ｂによって２つの光束に分割された後、偏光ビームスプリッタ１４、λ／４板１５、ハーフミラー７、対物レンズ６を経由して、被検物４へ導かれる。このときの被検物４からの焦点検出用光束の反射光は、対物レンズ６、ハーフミラー７、λ／４板１５、偏光ビームスプリッタ１４結像レンズ１３を経由して、光検出器１９側に導かれる。

ここで、焦点検出装置３において、マイクロプレート４ａの底面部４ａ１からの反射光が光検出器１９へ入射する状態は、底面部４ａ１の２つの表面位置と対物レンズ６の焦点位置との関係において次のようになっている。

マイクロプレート４ａの底面部４ａ１における培養液４ｂ及び細胞と接する側の表面４ａ１１に対物レンズ６の焦点を合わせる場合（以下、対物レンズ６の焦点を合わせる表面を「目的表面」と称す。また、こちらを第１の表面とする。）において、目的表面４ａ１１近傍に対物レンズ６の焦点が位置するとき、焦点検出装置３は図２に示す光路を辿る。

すなわち、レーザダイオード１７から発してマイクロプレート４ａの底面部４ａ１で反射された光のうち、目的表面４ａ１１で反射された光は、対物レンズ６を透過した後、光検出器１９である２分割フォトディテクター１９上の結像点に結像する。一方、目的表面４ａ１１に対向する表面４ａ１２（第２の表面）で反射された光は、図２（ｄ）に示すように、目的表面４ａ１１からの反射光の結像点よりも遠い位置で結像する。

したがって、図３に示すように、目的表面４ａ１１で反射された光は、ほぼ点に近い状態に集光して２分割フォトディテクター１９に入射し、２分割フォトディテクター１９の双方の受光部１９ａ，１９ｂで均等な光量が検出される。一方、目的表面４ａ１１に対向する表面４ａ１２で反射された光は、結像しない状態で２分割フォトディテクター１９側に向かうが、そのすべてが、２分割フォトディテクター１９から外れた位置を通る。

このようにして、被検物４の目的表面４ａ１１からの反射光だけを受光した２分割フォトディテクター１９は、前記反射光の光量情報を捉え、焦点合わせ信号として不図示の制御部へ出力する。そして、この制御部はこの焦点合わせ信号に基づき、（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）なる評価関数を計算する。

焦点検出装置３における２分割フォトディテクター１９によって検出される光量変化の一例を図５のグラフに示す。また、図６に図５のデータに基づいて行った評価関数計算値の一例をグラフに示す。図６のグラフにおいて、横軸は被検物４と対物レンズの相対距離、縦軸は焦点合わせ評価値である。焦点合わせは、この評価関数値が０となるように駆動部１０を介して対物レンズ６を上下させる。評価関数計算値が０となる位置に対物レンズ６が移動したときに対物レンズ６の焦点が被検物４の目的表面４ａ１１に位置し合焦が達成される。これにより、ある一つの対物レンズについての焦点合わせは完了する。なお、この焦点合わせの原理は基本的には従来行われているものと同じである。

次に、被検物を別の倍率で観察、撮像するために対物レンズが交換された場合の焦点検出について説明する。
例えば、図４に示すように観察倍率を大きくするために対物レンズ６よりも大きな倍率の対物レンズ６’に交換した場合、倍率の大きな対物レンズは一般に瞳径が小さいので、光束入射位置調節手段２１によって反射鏡２１ａと反射鏡２１ｂの間隔を調節して狭くすることによって、焦点検出用光束が交換された対物レンズ６’の瞳２２’の径に応じた瞳２２’内の所定位置に入射するように調節される。一方で、倍率の小さな対物レンズを使用する場合には、反射鏡２１ａと反射鏡２１ｂの間隔を広くすることによって、対物レンズの瞳径に応じた所定位置に入射するように調整する。
なお、この調整は対物レンズに対応させて自動的に行われるようにしてもよく、あるいは手動で行ってもよい。そして、反射鏡２１ａと反射鏡２１ｂからの焦点検出光束がそれぞれ調節されたならば、上記した焦点合わせを行い対物レンズ６’を移動させ、対物レンズ６’の焦点が被検物４の目的表面４ａ１１に位置し合焦が達成されるようにする。

このように本実施形態の焦点検出装置によれば、焦点検出用光源１７から発した光は、遮光手段１６を介してサンプル容器底面部４ａ１に照射され、目的としない側の表面からの反射光が排除されるので、焦点検出用光源１７から発せられて目的表面４ａ１１からの反射する光だけを、光検出器１７で検出できる。このため、この目的としない側の表面からの反射光が外乱光として、焦点合わせ信号に悪影響を及ぼすことなく、高精度な焦点合わせを行うことができるようになる。

さらに、光束位置調節手段を独立した２枚の反射鏡によって、焦点検出用光束を２つの光束に分割しているため、分割する各々の光束の反射光路をそれぞれ独立して調整できることとなる。

本発明の焦点検出装置は、例えば、自動化した顕微観察装置を用いて多数の細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得ることが求められる分野に有用である。

１顕微鏡本体
２落射照明装置
３焦点検出装置
３’ 焦点検出用ユニット
４被検物
４ａマイクロプレート
４ｂ培養液
４ａ１底面部
４ａ１１表面部、目的表面
４ａ１２対向する表面
５ＸＹステージ
６対物レンズ
６’ 大きな倍率の対物レンズ
７ハーフミラー
８結像レンズ
９ＣＣＤカメラ
１０駆動部
１１光源
１２集光レンズ
１３結像レンズ
１４偏光ビームスプリッタ
１５ λ／４板
１６遮光部材
１７焦点検出用光源、レーザダイオード
１８コリメートレンズ
１９光検出器、２分割フォトダイオード
１９ａ受光部
１９ｂ受光部
２０ハーフミラー
２１光束入射位置調節手段
２１ａ反射鏡
２１ｂ反射鏡
２２対物レンズの入射瞳、瞳
２２’ 大きな対物レンズの瞳

Claims

焦点検出用光束を対物レンズを介して試料面に投射して焦点合わせを行う焦点検出装置であって、
前記対物レンズの瞳位置における前記焦点検出用光束の入射位置を該対物レンズの瞳径に応じた該瞳内の所定位置に調節可能な光束入射位置調節手段を備え、該光束入射位置調節手段は、少なくとも２つの反射鏡を含み、
前記光束入射位置調節手段が、前記焦点検出用光束を光軸に対称に分離し、
前記２つの反射鏡は、前記焦点検出用光束の光軸を中心として対称な位置に配置されており、
前記光束入射位置調節手段が、前記２つの反射鏡の間隔を、前記光軸を中心とした対称な位置を保ったまま調整することによって、該分離した２つの光束の間隔を調整することを特徴とした焦点検出装置。
前記光束入射位置調節手段が、前記２つの反射鏡の間隔を調整することによって、前記焦点検出用光束を光軸に直角な方向にシフトさせることを特徴とする請求項１に記載の焦点検出装置。
前記２つの反射鏡は、それぞれが個別に光軸に直角な方向に移動させることができることを特徴とする請求項１記載の焦点検出装置。
前記焦点検出装置は、前記対物レンズと、透明基板に対し合焦信号を生成するための照明光を発し前記対物レンズを通して照射する点光源と、前記照明光の光束のうちの該照明光の光軸に沿う第１の仮想平面で２分割したときに一方の領域を通る光束を遮光する遮光部材と、前記透明基板で反射された光の光軸に沿う第２の仮想平面を挟んで対称に配置された２つの受光部を有する光検出器とを備え、前記２つの受光部を介してそれぞれ検出された前記透明基板からの反射光の光量に基づいて、前記透明基板の第１又は第２の表面に前記対物レンズの焦点合わせを行い、
前記光束入射位置調節手段は、前記透明基板における第１又は第２の表面のうち一方の表面近傍に前記対物レンズの焦点が位置するときに、該一方の表面からの反射光が前記２つの受光部に入射するとともに、他方の表面からの反射光が前記第２の仮想平面で分割したときの一方の領域における当該領域に配置された受光部を外れた領域を通るような該対物レンズの瞳内の所定位置に、該対物レンズの瞳位置における前記焦点検出用光束の入射位置が調節可能に構成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の焦点検出装置。