CN110018559B - 确定显微镜的束路径中的样品保持件的厚度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在显微镜(1)的束路径中确定样品保持件(7)的厚度(d)的方法，所述样品保持件对于照明辐射(BS)是透明的并且实施为接收样品(5)。具有第一侧面(OS)和第二侧面(US)的样品保持件布置在样品平面(4)中，并且第一侧面和第二侧面平行于样品平面(4)对准。以第一照明角将照明辐射中的至少一个束沿着第一光轴(A1)指引到对准的样品保持件上，并且捕获照明辐射中的反射分量(BSref)中的至少两个测量值或者由照明辐射引起的检测辐射(DS)中的至少两个测量值。取决于至少两个捕获的测量值，将第一和第二侧面彼此之间在Z轴(Z)的方向上的间隔确立为厚度(d)。本发明还涉及捕获图像数据的方法。

Description

确定显微镜的束路径中的样品保持件的厚度的方法
技术领域
本发明涉及确定显微镜的束路径中的样品保持件的厚度的方法。
背景技术
光片显微术的主要应用中的一个存在于以几百μm上至若干毫米的尺寸来成像例如有机体的中型样品。通常，这些样品包埋在琼脂糖中并且布置在玻璃毛细管中。出于检查样品的目的，将玻璃毛细管引入到充满水的样品室并且将具有样品的琼脂糖按压出毛细管一点。由光片照明样品。通过检测物镜，将样品中激发的并且从样品发出的荧光成像到特别是照相机的检测器上，该检测物镜垂直于光片并且因此还垂直于光片光学单元。
根据现有技术，光片显微术的显微镜1的布局(SPIM布局、单平面照明显微术)包括具有第一光轴A1的照明物镜2和具有第二光轴A2的检测物镜3(下面也称为SPIM物镜)，将第一光轴A1和第二光轴A2各自从上方相对于样品平面4以45°的角且关于彼此成直角指引到样品平面4上(见图1a)。布置在样品平面4上的样品5位于例如实施为培养皿的样品保持件7的基底。用例如水的液体8填充样品保持件7，并且在应用光片显微术期间将两个SPIM物镜2、3浸没在液体8中(未示出)。样品平面4延伸在由笛卡尔坐标系中的X轴X和Y轴Y所跨越的XY平面中。第一光轴A1和第二光轴A2延伸在由笛卡尔坐标系中的Y轴Y和Z轴Z所跨越的平面YZ中。
该方法提供了轴线方向上的高分辨的优点，因为薄光片6可以通过照明物镜2以及其它可能光学有效元件来产生。由于更高的分辨率，可以检查更小的样品5。此外，显著地降低了麻烦的背景荧光并且由此改进信噪比。
为了在诸如多孔板的标准样品容器中促进更简易的样品准备，可以维持45°配置但是具有倒置布置中的两个SPIM物镜2、3，将两个SPIM物镜2、3从下方穿过样品保持件7的透明基底指向样品平面4。在这个布置中，必须校正由样品保持件7引起的像差，通过使用特别光学元件，该样品保持件7相对于光轴A1和A2倾斜并且以盖玻片的形式出现。布置在样品平面4中的样品5穿过样品保持件7的基底被照明并且检测样品5的激发的荧光。可以使用诸如多孔板、培养皿和/或物体支撑件的样品保持件7，并且特别地在高通量筛选的情况下可以避免样品5的污染。
如果例如所谓的Alvarez板布置为照明物镜2的束路径和/或检测物镜3的束路径中的校正元件12(图1b)，则其他技术难题发生(US 3,305,294 A)。Alvarez板12以它们校正像差的方式来实施，该像差可能恰好发生在例如盖玻片的样品保持件7和相应的物镜2、3的光轴A1、A2之间设定的角的情况下。导致较差成像质量的不需要的像差已经发生在小角度偏离(例如<0.1°)的情况下。因此，例如在实验开始之前必须将盖玻片对准使得角度偏离位于可容许的公差内。此外，如果除了角以外，在物镜2、3或者可能出现的附加的透镜(例如弯月形透镜)以及盖玻片之间的距离也是可调整的，使得样品5或其将要成像的区域位于检测物镜3的像平面BE中，则是有帮助的。
从由McGorty等人的出版物(2015：用于常规安装的样品的顶部开口的选择性平面照明显微镜(Open-top selective plane illumination microscope forconventionally mounted specimens)，光学快报23：16142-16153)获悉校正由盖玻片引起的显微镜的像差的可能性。倒置的SPIM显微镜具有以下效果的水棱镜：部分地补偿由于穿过盖玻片的检测光的倾斜通道发生的像差。
至今尚未公开的DE 10 2016 212 019描述了一种在显微镜的束路径中定位样品保持件的可能的方法。在本文所公开的方法中，照明辐射的反射分量用于捕获样品保持件的当前的实际位置以及实际相对位置。
除了样品保持件的定位的方式以外，像差还可能由样品保持件的实际厚度与标称厚度的偏离而引起。商用的盖玻片以及培养皿、多孔板和相似的样品保持件的基底(下文归入为样品保持件)具有玻璃或材料厚度的在标称厚度周围的可允许的变化。因此，例如在具有厚度#1.5的盖玻片情况下的厚度范围指定为160-190μm，而厚度#1指定为130-160μm。因此，例如如果校正元件设计为或设定至175μm的标称厚度，则特别是在高数值孔径时，在照明辐射的例如穿过需要倒置配置的样品保持件的倾斜通道的范围内，具有160μm的厚度的盖玻片或基底(例如玻璃基底)导致相当大的像差。
在此的问题是样品保持件的基底或盖玻片的厚度事先是未知的，需要确立先验的以及因此技术性的方案并且设定当前厚度以及可选的自适应的校正元件的所需的校正参数。
发明内容
本发明基于提出一种确定显微镜的束路径中的样品保持件的厚度的方法的目的。
该目的通过以下方法实现。一种方法，用于在显微镜的束路径中确定样品保持件的厚度，所述样品保持件对于照明辐射是透明的并且实施为接收样品，所述方法包括以下步骤：
A：在样品平面中布置所述样品保持件，所述样品保持件具有第一界面和第二界面，其中所述样品平面位于由笛卡尔坐标系中的X轴和Y轴跨越的XY平面中，
B：将所述第一界面和所述第二界面平行于所述样品平面对准，
C：以照明角将所述照明辐射中的至少一个束沿着第一光轴指引到对准的样品保持件上，
D：捕获所述照明辐射中的反射分量中的至少两个测量值或者由所述照明辐射引起的检测辐射中的至少两个测量值，
E：取决于至少两个捕获的测量值，将所述第一界面和第二界面彼此之间在所述Z轴的方向上的间隔确立为厚度。
下文指定有利的配置。
在一个实施例中，布置在所述照明辐射的束路径中、所述反射分量的束路径中和/或所述检测辐射的束路径中的光学有效校正元件被致动，该致动取决于在相应的束路径中设定所确立的厚度及其相对位置。
在一个实施例中，通过所述照明辐射在所述样品平面中产生光片。
在一个实施例中，步骤C中，所述第一光轴和垂直于所述XY平面的参考轴线之间的所述照明角不等于零，步骤D中，通过检测器，在预期的相对位置，将从所述样品保持件的第一侧面或者从所述样品保持件的第二侧面反射的所述照明辐射中的反射分量捕获作为第一测量值，并且随后在垂直于所述XY平面指引的所述Z轴的方向上移位所述样品保持件，直到通过所述检测器，在预期的相对位置，将相应的另一个界面的反射分量捕获作为第二测量值，以及步骤E中，基于所述第一测量值和第二测量值确立所述Z轴的方向上的位移路径，所述位移路径是必需的，以在所述预期的相对位置捕获所述第一界面和第二界面的反射分量，以及确立所述厚度。
在一个实施例中，限定图像质量测量，修改所述校正元件中的至少一个的实际的定位方式，捕获所述图像质量测量的测量值，其分配到选择的实际的定位方式中的每一个，所述图像质量测量的当前值各基于所述图像质量测量的测量值来确立，以及选择所述至少一个校正元件的实际的定位方式，其中出现所述图像质量测量的期望值。
在一个实施例中，所述测量值使用对比度、锐度测量、信噪比、信号强度和点扩散函数的参数的所述图像质量测量中的至少一个。
在一个实施例中，使用包含分离的点状的荧光源的样品，并且基于多个所述点状的荧光源的检测辐射捕获所述图像质量测量的至少两个测量值。
在一个实施例中，基于捕获的图像的空间频率空间的分析，借助于将所述捕获的图像的空间频率分量通过阈值细分成组，以及包含在相应的组中的空间频率分量的最大值或最小值用作锐度测量，确立所述锐度测量。
在一个实施例中，借助于选择的峰态的低值或最小值，基于捕获的图像的空间频率谱(所述峰态)的第四中心矩的分析，确立所述锐度测量。
在一个实施例中，使用具有自重构束或无衍射束的辐射作为照明辐射。
一种方法，用于捕获布置在显微镜的样品平面中的样品的图像数据，所述方法包括上述步骤A至E，其中通过照明辐射在所述样品中引起检测辐射并且将所述检测辐射捕获。
一种确定在显微镜的束路径中的样品保持件的厚度的方法，所述样品保持件对于照明辐射是透明的并且实施为接收样品，该方法包括下面提出的步骤。
步骤A涉及将具有第一界面和第二界面的样品保持件布置在样品平面中。样品平面位于由笛卡尔坐标系中的X轴和Y轴所跨越的XY平面中。
步骤B中，将第一界面和第二界面与样品平面平行地对准或调整。
步骤C中，将照明辐射的至少一个束沿着第一光轴(照明轴线)以照明角指引到调整的样品保持件上。
步骤D涉及捕获照明辐射中的反射分量中的至少两个测量值或者由照明辐射引起的检测辐射中的至少两个测量值。
随后，步骤E中，取决于至少两个捕获的测量值，将第一和第二侧面的Z轴方向上相对于彼此的一个间隔确立为厚度。
除非明确指定不同的含义，在本说明书中同义地使用术语样品保持件、样品保持件的基底和盖玻片。
检测辐射应该理解为在样品处反射的照明辐射和/或由样品中照明辐射引起的辐射，特别是激发的荧光辐射。作为示例，第一和第二界面是样品保持件的侧面并且下文还称为第一侧面和第二侧面。
在根据本发明的方法中，使用测量信号，其值受样品保持件的厚度显著地影响。关于样品保持件的厚度所确立的信息可以有利地用于采取束路径中所需的校正并且例如用于降低像差。因此，布置在照明辐射的束路径中、反射分量的束路径中和/或检测辐射的束路径中的光学有效校正元件可以被致动，取决于在相应的束路径中设定所确立的厚度及其相对位置和光学校正效果。
以控制的方式彼此之间可移位的Alvarez板(还称为Alvarez操纵器)是校正元件的示例，所以Alvarez板彼此之间正确设定的光学效果可以降低或者甚至补偿物镜，照明辐射、检测辐射的波长和/或样品保持件的具体组合的像差。此外或作为其的替代，以控制的方式可形变的反射镜(可形变的反射镜)、可致动的反射镜或微反射镜阵列(数字反射镜装置)和/或光调制器(空间光调制器，SLM)可以用作校正元件。
用于在其配置中的一个中执行根据本发明的方法的光学布置(特别是倒置的光片布置)例如在照明辐射的束路径中可选地具有校正元件。该校正元件(其还可以由多个部分元件构成，例如由两个Alvarez板构成)可以设计用于像差的静态校正。在检测辐射的束路径中，校正元件设计成关于其光学效果是以控制的方式可修改的，所以通过适当致动该校正元件可以影响发生的像差，特别是减小发生的像差。各种束路径中的校正元件可以是等同的或者甚至相同的。可致动的校正元件并且其组合的光学效果导致像差的减小还可以出现在照明辐射和检测辐射的束路径中。
在该方法的其它配置中，将形式为光片的照明辐射指引到样品保持件上并且在样品平面中产生光片。如果要检查的样品出现在样品平面中，由光片照明该样品并且可以捕获样品的照明的区域的对应的像。
因此，可以使用不同照明辐射以便于例如执行根据本发明的方法的不同部分步骤。光片可以产生为静态光片或动态光片，正如本领域技术人员从现有技术所获悉的。
提供照明辐射并且将其指引到样品保持件上作为独立射线(束)中的至少一个束。所谓的高斯束是照明辐射的典型形式。
在根据本发明的方法的其它配置中，具有自重构束或非衍射束的辐射可以用作照明辐射，并且它可以实施为例如贝塞尔束、Mathieu束、sinc3束、晶格光片、相干贝塞尔束、分段贝塞尔束或者艾里束的形式并且可以被指引到样品保持件上。
根据具有椭圆坐标的赫姆霍兹方程，Mathieu束可以被认为是传播不变的光场(Gutierrez-Vega,J.C.et al,2001:光学Mathieu束的实验演示(Experimentaldemonstration of optical Mathieu beams)；光学通信195:35–40)。
偏离于高斯束的束形式，例如sinc3束，具有特别适合于分析锐度和/或对比度的图像质量测量的本征结构化，如下面进一步所描述的。
特别是在展示了很大程度上均匀的荧光发射的样品的区域中，受结构化的束形式的影响所结构化的光片自身可以用作测试晶格。作为示例，基于这样的晶格可以最大化对比度。为此，用结构化的光片照明样品，其中施加到样品的结构化的照明辐射的不同强度相应地导致或可以导致样品中结构化的荧光激发。通过适当的检测器将以结构化方式激发的荧光辐射的信号捕获为检测辐射，并且将最大信号强度确立并且储存为Imax以及将最小信号强度确立并且储存为Imin。晶格结构的调制深度可以由关系Imax-Imin/Imax+Imin来分析。然而，同样地可以将下文所描述的图像质量标准应用到该测试结构。
基于至少两个测量值间接地确立样品保持件的厚度。一种选项在于评估照明辐射的反射分量(反射)。
通常在界面(例如在样品保持件的上侧面和下侧面)处反射照明辐射的分量。在这些界面处的反射实现有取决于介质(玻璃浸没剂、玻璃样品)之间的折射率中的差异并且取决于入射角的反射率，例如在各个情况下总计近似3％。在此，照明辐射的反射分量通常实质上完全地位于检测NA(检测物镜的数值孔径)内。其结果是，可以将反射分量大部分地成像在光学连接到检测物镜的检测器上。该反射分量现在可以用于确立样品保持件的厚度(例如其基底的厚度)，该样品保持件对照明辐射和反射分量是透明的。为了检测该反射分量，必要时可以移除位于束路径中的荧光显微术的发射滤光器。
为此，根据本发明的方法的有利配置中，步骤C中照明辐射中的至少一个束可以沿着第一光轴(照明轴线)以一照明角转向到对准的样品保持件上，第一光轴和垂直于XY平面的参考轴线之间的照明角不等于零。因此，将照明角倾斜地指引到样品保持件处，例如在45°或60°的照明角处。步骤D中，在预期的相对位置通过检测器将从样品保持件的第一侧面反射或从样品保持件的第二侧面反射的照明辐射的反射分量捕获作为第一测量值。随后，将样品保持件在与XY平面垂直指引的Z轴的方向上移位，直到在预期的相对位置通过检测器将相应另一侧面的反射分量捕获作为第二测量值。例如，Z轴方向上的位移路径应该被理解为在样品保持件以及照明物镜和/或检测物镜之间的相对位置中的变化。因此，位移路径还可以由照明物镜、检测物镜和/或检测器的移动来实现并且还由样品保持件、照明物镜、检测物镜和/或检测器的组合移动来实现。
在样品保持件采用预料的或期望的定位方式时，达到预期的相对位置。可以设定预期的相对位置的可容许公差。
步骤E中，基于第一和第二测量值确立Z轴的方向上的位移路径，所述位移路径是必需的，以在预期的相对位置捕获第一和第二面的反射分量。基于第一和第二测量值确立厚度。如果样品保持件的材料具有与位于例如照明物镜和样品保持件之间的介质的不同折射率，则位移路径不对应于样品保持件的厚度。
为了如果已知位移路径则确立样品保持件的厚度，可以捕获照明角和已经由样品保持件的材料折射的照明辐射的角。如果应用角度函数(三角函数)并且如果考虑位移路径，则可以计算出样品保持件的厚度。
在方法的其它配置中，限定图像质量测量，图像质量测量用作设定校正元件中的至少一个的标准。过程中，校正元件中的至少一个的当前实际的定位方式逐步或连续地进行修改。图像质量测量的测量值分配到校正元件中的至少一个的选择的实际的定位方式中的每一个并且储存该测量值，在关联的实际定位方式的情况下已经捕获所述测量值。图像质量测量的当前值各基于图像质量测量的测量值来确立。如果图像质量测量的这些当前值可用于评估，则选择至少一个校正元件中的实际的定位方式，在所述实际定位方式的情况下获得期望的图像质量测量，即图像质量测量的期望值。选择的实际的定位方式可以设定为未来预期的定位方式。
优选地，已经将表格或数学关系(函数)确立为参考并且以反复可调用的方式储存。该参考允许将图像质量测量的值分配到样品保持件的相应厚度。
出于执行该方法的目的，可以使用对比度、锐度测量、信噪比、信号强度和点扩散函数的参数或其组合的图像质量测量中的至少一个的测量值。
每个样品保持件的厚度必须单独校正，所以在此不适于使用诸如光栅、USAF图表等测试样品。然而，在根据本发明的方法的其他配置中，可以使用包含分离的点状的荧光源的样品。图像质量测量的至少两个测量值基于点状荧光源中的至少一些的检测辐射来捕获并且用于确立样品保持件的厚度。分离的点状荧光源不会重叠。作为示例，可以将分离的荧光纳米球(所谓的“珠”)引入到样品中，以便于仅使用非常明亮的纳米球来进行样品无关的图像质量分析。如果纳米球包含在样品中，则这些近似为点的物体的认知还允许分析成像光学单元的点扩散函数(PSF)，例如以便于最小化点扩散函数的FWHM(半极大处全宽度)。
对比度可以用作图像质量测量。通过
Figure GDA0003498682560000081
限定单独、隔离的物体相对于均匀的背景的对比度，其中ΔS是相对于(均匀的)背景信号S的信号的增加或减少。然而，该定义不适用于自动确定事先未知的任何样品的局部图像对比度。
计算出图像中的或ROI(感兴趣区域)中的每一个像素处的对比度的对比度定义因此是更适合的。此外，在傅里叶变换的图像中仅考虑某些空间频率范围，因此可以更好地隔离信号、背景和噪声(Peli,Eli.(1990)，“复杂图像中的对比度(Contrast in compleximages)”美国光学学会杂志A,7:2032-2040)。
每个像素和每个频带k中的对比度因此呈现为
Figure GDA0003498682560000082
其中Bk(x,y)是频带k的带通滤波的图像，并且
Figure GDA0003498682560000083
包含小于该频带的能量。可以基于傅里叶空间中的典型的显微术图像来适当地设定边界，使得然后例如通过图像或ROI内的ck(x,y)的平均值，度量(metric)是可用的，所述度量能够通过调整自适应的校正元件2而最大化。
在该方法的其它可能配置中，确立所述锐度测量，其基于捕获的图像的空间频率空间的分析，借助于将捕获的图像的空间频率分量例如通过阈值细分成两个组，以及包含在相应的组中的空间频率分量的最大值或最小值用作锐度测量(例如De,Kanjar,andV.Masilamani.“频域中模糊图像的图像锐度测量(Image sharpness measure forblurred images in frequency domain)”,能源工程,64(2013):149-158)。
另外，在该方法的其它配置中，可以借助于选择峰态的低值或最小值，基于捕获的图像的空间频率谱(峰态、四阶中心矩)的第四中心矩的分析，确立锐度测量。(例如，在Zhang,Nien Fan,et al.“扫描电子显微镜中的图像锐度测量Part III(Image sharpnessmeasurement in the scanning electron microscope—Part III)”扫描21.4(1999):246-252)。
为了实现发生的像差的高补偿，要测量的样品的图像有利地用于对应的图像质量测量的迭代分析并且随后调整自适应的(多个)校正元件。
无论如何，可能的是，要迭代检查的参数空间太大或者系统不能朝着全局最小值进行迭代优化——例如样品保持件7的最优倾斜和最优聚焦位置——并且保持在替代的局部最小值。因此，如果图像质量测量评估的方法以与该方法的上述配置中的一个的组合来执行，则是有利的。在此，例如通过如上所描述的方法中的一个，最初近似地设定样品保持件7的倾斜和Z轴Z的方向上的实际位置。随后，通过图像质量评估来执行精细的调整。该方法不适用于常规的显微镜系统。
除了对要迭代地测试的可能的参数空间的限制以外还出现其它优点：如果盖玻片厚度被确定并且由光片反射来补偿，自适应的元件可以可选地通过图像质量测量的迭代最大化还能够补偿由样品引入的其它像差。
根据本发明的方法可以是捕获图像数据的方法的部分。在此，布置在显微镜的样品空间中的样品的图像数据可以借助于通过照明辐射在样品中引起并且被捕获的检测辐射来接收。这样的方法包括上文列出的步骤A至E，以确定样品保持件的厚度。
在该方法的有利配置中使用实施为倒置显微镜的显微镜。倒置显微镜包括具有第一光轴的照明物镜，其中第一光轴穿透由X轴和正交于X轴的Y轴所跨越的样品平面。此外，具有第二光轴的检测物镜(实施为检测来自样品平面的光)出现，其中照明物镜和检测物镜以关于彼此以及关于第一光轴和第二光轴在样品平面中交叉并且包含其间实质上直角的样品平面的方式来对准。第一光轴和第二光轴各自包含关于第三轴线不为零的角，该第三轴线在Z轴的方向上正交指向样品平面并且用作参考轴线。上面指定的配置特别地适用于光片显微术。
下面以示例的方式描述根据本发明的方法。下面，实际相对位置和预期的相对位置指代检测器上(特别是检测器的检测表面上)的反射分量的图像的相对位置。
步骤A和B中，将样品保持件布置并且对准在样品平面中。可以以手动或者自动的方式执行对准。照明辐射的和/或辅助辐射(例如仅用于对准过程的辐射)的已经反射的分量可以用于对准的目的，并且因此步骤C可以合并到对准样品保持件的过程中。为此，例如已经具有对照明辐射透明的第一侧面和第二侧面的基底的样品保持件在Z轴方向上移位，直到由基底的第一侧面(例如上侧)反射的照明辐射的分量由检测器所捕获。样品保持件和检测器之间的相对位置优选地关于彼此设定，使得捕获的分量的实际相对位置近似于检测器上的预期的相对位置。预期的相对位置有利地集中在检测器表面上，以便于最大程度上避免当调整预期的相对位置时反射分量的实际相对位置在检测器表面的外面。
作为示例，基底可以是例如由玻璃或塑料制成的盘的基底。具有其第一和第二侧面的盖玻片是上述意义内的基底也是可能的。基底的材料对(多个)照明辐射的充足的透明度并且在此当作界面的第一侧面和第二侧面在此是十分重要的，在该第一侧面和第二侧面处可以实现照明辐射的折射和/或反射。
可以借助于确立实际的相对位置从预期的相对位置的角度偏离来检查基底的第一侧面关于X轴的倾斜的存在。如果在此确定了大于可容许的角度偏离的角度偏离，则样品保持件绕X轴旋转直到角度偏离最小化。可选地，可以确立优选的旋转方向以补偿倾斜，以便于例如通过最短旋转路径补偿角度偏离。随后，检查Z轴方向上的预期的位置从实际的位置的偏离的发生。如果不容许的偏离发生，则可选的重复上述的方法。在这些过程已经完成之后，样品保持件平行于X轴对准。
可选地，借助于样品保持件在Y轴的方向上移位并且由检测器上捕获的反射分量的移动确定与Y轴的方向的偏离，在其它对准过程中检查Y轴的方向上的第一侧面的对准。如果捕获的反射分量的的移动，即实际相对位置的移动发生，则样品保持件绕X轴旋转直到没有更多移动发生或者直到移动位于可容许的公差限制内。
方法的步骤D中，将调整的样品保持件从第一(预期的)定位方式移位，其中在Z轴的方向上，在第一预期的相对位置捕获由第一侧面反射的分量直到捕获的反射分量的图像达到第二预期的相对位置，其中捕获从基底的第二侧面(例如下侧)反射的分量。确立Z轴的方向上第一和第二侧面彼此之间的实际间隔，这取决于Z轴的方向上的位移路径，其行进在第一预期的相对位置和第二预期的相对位置之间。所确立的间隔因此对应于基底的厚度。
可以计算出距离或基底的厚度。在示例性实施例的上下文中下面指定计算可选项。
通过检测器、例如通过例如包括CCD或CMOS芯片的照相机或者通过四象限二极管来捕获反射分量。
有利地，根据本发明的方法还可以适用于具有(多个)束路径的垂直对准的显微镜。尽管在这样的常规布置中的像差更小，这些像差然而对于具有大数值孔径的现代物镜(特别是水浸没的物镜或TIRF(全内反射荧光显微术)物镜)的成像质量更加重要。
附图说明
下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明。附图中：
图1a示出了根据现有技术具有样品平面上方以45°布置的照明物镜和检测物镜并且具有样品平面下方的宽场物镜的显微镜的示意图；
图1b示出了根据现有技术具有样品平面下方以倒置的45°布置的照明物镜和检测物镜并且具有样品平面上方的宽场物镜的显微镜的示意图；
图2示出了具有Alvarez板和弯月形透镜的实施为用于光片显微术的显微镜的一个示例性实施例的示意图；
图3示出了倒置光片显微镜的一个示例性实施例的示意图；
图4示出了检测器表面上照明辐射的反射分量的预期的相对位置和实际相对位置的示意图；
图5示出了确定样品保持件的厚度的原理的示意图；
图6示出了在样品保持件的未知厚度的情况下作为不同调整的校正元件的函数的锐度测量的示意图；以及
图7示出了根据本发明的方法的一个配置的流程图。
具体实施方式
在现有技术的示例和本发明的示例性实施例的以下示意图中，相同的参考标记表示相同的技术元件。
从现有技术已知如图1a中示意性描绘的正置的显微镜1，其包括照明物镜2、检测物镜3和可选地宽场物镜20。光片6通过照明物镜2沿着第一光轴A1来产生或者是可产生的，所述光片可用于检查布置在样品平面4中的样品5。检测物镜3具有第二光轴A2，沿着该第二光轴A2可以捕获来自样品平面4的光。第一光轴A1和第二光轴A2彼此正交对准，并且各自包含与用作参考平面的样品平面4成45°的角。
宽场物镜20具有第三光轴A3，该第三光轴正交地指向样品平面4并且用作参考轴线B。第一至第三光轴A1至A3相交在样品5中的光片6的范围的区域中。此外，第一光轴A1包含与参考轴线B的第一角α1，并且第二光轴A2包含与参考轴线B成90°-α1的第二角α2，例如分别为45°。
将样品5保持在样品保持件7中，该样品保持件7位于样品台11上并且用液体8填充。
图1b示意性示出了具有倒置布置的照明物镜2和检测物镜3的显微镜1，其中照明物镜2和检测物镜3布置在样品平面4的下方并且宽场物镜20布置在样品平面4的上方。再次，角α1和α2各为45°。
以下示例性实施例以基于倒置的显微镜1的示例性方式示出并且在其他实施例中还可以实施为正置的显微镜1。
图2示出了实施为用于光片显微术并且包括形式为Alvarez板的校正元件12和弯月形透镜10的倒置的显微镜1的示例性实施例。角α1和α2各为45°。校正元件12用于校正像差，该像差本质上可能由于照明辐射BS穿过样品保持件7的倾斜通道而发生。可选的弯月形透镜10辅助照明辐射BS从空气到浸没介质18中再到液体8中的输送，以及辅助检测辐射DS从液体8到浸没介质18再到空气中的输送。
将样品保持件7保持在样品台11上。通过没有更详细地示出的驱动器，在由X轴X和Y轴Y跨越的XY平面中以控制的方式可调整样品台11自身。
通过在这种情况下实施为压电驱动器的物镜驱动器14，分别沿着第一光轴A1和沿着第二光轴A2以控制的方式可各自调整照明物镜2和检测物镜3。
照明辐射BS由激光器模块15提供并且通过束成形单元16来成形。例如，束成形16是通过其将所提供的照明辐射BS准直的光学单元。
扫描仪17存在在束成形单元16的下游，通过所述扫描仪(XY扫描仪)在两个方向上以控制的方式可偏转成形的照明辐射BS。
在扫描仪17的下游，照明物镜2布置在第一光轴A1上。由扫描仪17偏转的照明辐射BS到达照明物镜2，并且由该照明物镜2将该照明辐射BS成形和/或聚焦。
将检测辐射DS沿着第二光轴A2指引到检测器9上并且能够由所述检测器捕获。
出于致动样品台11、压电驱动器14、校正元件12、激光器模块15、束成形16、扫描仪17和/或检测器9的目的，存在控制单元13，所述控制单元以适合于数据传输的连接来联接到将要致动的元件。
在其他实施例中，控制单元13附加地配置为捕获、储存和/或评估测量值。显微镜1的其他元件和单元通过控制单元13可以是可致动的，和/或可以由此获得并且评估测量值。
出于说明的目的，下面使用具有相互正交轴线的两个坐标系。第一坐标系是具有X轴X、Y轴Y和Z轴Z的整个布置的坐标系。理想地，样品保持件7(特别是其基底)与由X轴X和Y轴Y跨越的XY平面平行地对准。第二坐标系是具有X轴X、y轴y’和z轴z’的检测器9的坐标系。例如从像平面BE到检测器9的检测器表面9.1(参见图4)上的像的成像具有坐标X和y’。X轴X在两个坐标系中是相同的并且以正交方式指向附图绘图的平面。另外两个轴线Y和y’以及Z和z’分别可以通过绕X轴X的旋转而彼此重叠。
以下的示例性实施例以示例性方式基于倒置的光片显微镜，其中照明物镜2的第一光轴A1包含关于参考轴线B成60°的角α1并且检测物镜3的第二光轴A2包含30°的角α2(图3)。为了改进说明的清楚性，没有在所有附图中示出可选的弯月形透镜10。此外，对于例如形式为盖玻片的样品保持件7或样品保持件7的基底，以示例性方式假设n＝1.52的折射率，并且对于水为浸没介质18，以示例性方式假设n＝1.33的折射率(参见图2)。光片6在像平面BE中产生或是可产生的。
图4中，俯视图中示出检测器表面9.1，而侧视图中示出样品保持件7和光片6。从相对于彼此旋转的这些视图中得出具有轴线X、y’和z’的检测器9的坐标系的所示的取向。
为了调整样品保持件7，步骤1中将该样品保持件7在Z轴Z的方向上移位，直到捕获从第一侧面OS(从所示的示例性实施例的上侧)反射的照明辐射的分量BSref。在此，作出假设的是，将像平面BE固定。样品保持件7和检测器9彼此之间的相对位置改变，使得照明辐射的分量BSref(捕获为图像60)的实际的相对位置接近于检测器9的检测器表面9.1上的图像60的预期的相对位置(图4)。
当光片6的横截面的图像60中心地位于检测器表面9.1上时，优化地调整样品保持件7在Z轴Z的方向上的实际位置。
因为存在来自盖玻片的第一侧面OS和第二侧面US二者的反射BSref，所以必须能够区分这些反射。如果在沿着Z轴Z的正方向(图4中向上)上移动样品保持件7，则可以首先将第一侧面OS处的反射BSref中心地定位在检测器表面9.1上。由第二侧面US引起的反射BSref仅仅可以在沿着Z轴Z的正方向上的其他位移的情况下被中心地调整。
如果中心地调整光片6的横截面，则将图像60中心地成像在检测器表面9.1上的预期的相对位置，如图4示意性示出的。
可以通过确定例如样品保持件7的基底的厚度d来补充样品保持件7的上述调整。下面，为了简化起见，参考样品保持件7的基底的厚度d或者参考用作样品保持件7的盖玻片的厚度d。
图5示出了照明辐射BS的示例性束路径以及检测辐射DS的示例性束路径或照明辐射BS的反射分量BSref的示例性束路径。将照明辐射BS在与垂线成60°的角处沿着第一光轴A1指引到样品保持件7的下侧面US上。当照明辐射BS穿过由下侧面US形成的、在具有折射率n＝1.33的水和具有折射率n＝1.52的样品保持件7的材料之间的界面时，照明辐射BS朝向垂线折射并且与样品保持件7的上侧面OS成48°的角行进。
在像平面BE中的第一侧面OS处将照明辐射的分量BSref反射回第二侧面US。当照明辐射的反射分量BSref穿过第二侧面US时，该反射分量BSref再次远离垂线折射并且作为检测辐射DS沿着第二光轴A2到达例如检测器9(未示出，参见图4)。
在照明辐射BS通过样品保持件7的倾斜通道的情况下发生的像差实质上取决于样品保持件7的厚度d，即取决于在第一和第二侧面OS、US之间的距离。为此，校正元件12(图2)例如可移位地安装在照明物镜2和/或检测物镜3中，以便通过相对于彼此移位校正元件12来对于厚度d匹配像差校正。
样品保持件7的厚度d可以基于来自第一和第二侧面OS、US的反射BSref来确定。图5中示意性示出了两个反射BSref，其中d是厚度并且d’是样品保持件7在沿着Z轴Z的正方向上的位移路径。
如下确定厚度d：
首先，设定样品保持件7使得来自第一侧面OS的反射BSref位于例如如图像60一样中心地在检测器表面9.1上(参见图4)的预期的相对位置，并且样品保持件7没有倾斜。在示例中，照明辐射BS和参考轴线B之间的角在样品保持件7的外侧为60°但由于发生折射而在样品保持件7内为48°。参考轴线B延伸通过像平面BE(参见图3)并且通过照明辐射BS在第一侧面OS上的入射点(以简化方式所示)。在Y轴Y的方向上，Δy表示照明辐射BS通过第二侧面US的经过点和第一侧面OS上的入射点之间的路径。
然后，样品保持件7在沿着Z轴Z的正方向上移位，直到来自第二侧面US的反射Bsref位于如图像60一样在检测器表面9.1上的预期的相对位置(参见图4)。为此所需要的位移路径d’被确立，例如被测量或计算出。示例中未折射的照明辐射BS和参考轴线B之间的角现在是60°。
现在可以通过以下三角函数关系和示例中指定的角度计算出样品保持件7的厚度d：
tan(60°)＝Δy/d'
tan(48°)＝Δy/d
其中Δy表示在X轴X的方向上所测量的、照明辐射BS的通道和参考轴线B之间的路径。
厚度d由d’×tan(60°)/tan(48°)计算出。
在方法的其他配置中，可以存在倾斜的附加校正，其借助于以不用于成像的波长(例如在红外光的范围中)来产生光片6。该光片6可以永久地或在某些时候(例如在实验期间)用于检查样品保持件7的实际位置(特别是在Z轴Z方向上样品保持件7的实际位置)，并且该光片6可选地用于在实验期间校正所述实际位置。还可以使用束(例如高斯束、贝塞尔束或Mathieu束)来代替光片6。四象限二极管可以用作检测器9。
在其他可能的配置中，可以将自动准直的望远镜引入到样品保持件7上。将样品保持件7的倾斜位置变换为自动准直的望远镜的检测器9上的反射BSref的位移。仅可以使用该方法调整倾斜角。
其他可能的配置需要校准的激光，将其指引到样品保持件7上。将激光平行于垂线(例如参考轴线B)对准。作为示例，将反射BSref通过分束器或极光学单元反射出并且将其记录在四象限二极管上。现在，可以借助于四象限二极管的信号设定并且校正样品保持件7的倾斜。使用该配置设定Z轴Z的方向上的实际位置是不可能的。两个前述的方法适合于常规的显微镜系统和光片显微镜。
另外，在方法的其他配置中附加地采取根据图像质量测量的评估是可能的。因此，例如，可以反复地调整检测物镜3的倾斜和/或聚焦位置，以便将所选择的图像质量测量的测量值带到期望的测量值或者以便最大化所述测量值。为此，可以使用自身将要测量的样品5，或者分析所选择的照明辐射BS的束的束轮廓。
在其他可能的实施例中，通过在至少三个点处测量支撑的样品5的锐度或另外的图像质量标准并且通过适当地调整物镜2、3中的至少一个距样品5的距离来确定样品5的形貌，并且从其计算出局部盖玻片倾斜。
在其他可能的配置中，位于样品保持件7上的纳米颗粒(所谓的基准点、珠)或者施加于样品保持件7的标记物可以充当样品5。
图6以示例性方式示出了厚度d和具有先验未知的厚度d的样品保持件7的锐度的图像质量测量之间的关系。检测辐射DS的束路径中存在的多个校正元件12或至少校正元件12被渐增地设定至样品保持件7的可能厚度d。起始于160μm的厚度d，增量选择为5μm。用以这种方法选择的多个校正元件12或校正元件12的每个设定来确立通过检测辐射DS捕获的图像的锐度。在测量值的图表示意图中，可以识别出在校正元件12或多个校正元件12的设定的情况下达到锐度图像质量测量的最大值，其中样品保持件7的像差用175μm的标称厚度d来补偿。因此，可以推导出175μm的实际厚度。
图7说明根据本发明的方法的配置的顺序的流程图，该方法确定厚度d且将至少一个校正元件12设定为厚度d的函数。
可选地，图像质量测量(图像质量度量)的初始值可以由用户输入或者它可以被预先确定，例如基于使用反射分量BSref确定厚度。以这种方式确立或预先确定的厚度d用作初始值并且作为至少一个校正元件12的第一设定。随后，将校正元件12引入到与较大的厚度d对应的设定中。如果用这个设定所确立的图像质量测量的值增加，则继而选择与较大的厚度d对应的设定。可以重复该循环直到图像质量测量的值不会再增加或者又下降。
如果在选择至少一个校正元件12的设定之后图像质量测量的值下降，则选择分配到相对于先前设定减少的厚度d的设定。一旦已经发现图像质量测量的值在最大值处的设定，那么至少一个校正元件12被设定并且可以停止该控制循环。有利的是，如果设定终止标准，则满足该终止标准会引起控制循环停止。因此，例如，可以设定图像质量测量的值中的最小差异，如果低于最小差异则引起终止。
附图标记
1 显微镜
2 照明物镜
3 检测物镜
4 样品平面
5 样品
6 光片
60 图像(光片横截面的成像/图像)
60’ (在移位的样品保持件7’的情况下光片横截面的)图像
B 参考轴线
BS 照明辐射
BSref (照明辐射BS的)反射分量
DS 检测辐射
BE 像平面
7 样品保持件
7’ 虚拟移位的样品保持件7
8 液体
9 检测器
9.1 检测器表面
10 弯月形透镜
11 样品台
12 校正元件
13 控制单元
14 物镜驱动器
15 激光器模块
16 束成形
17 XY-扫描仪
18 浸没介质
A1 第一光轴
A2 第二光轴
α1 角(第一光轴A1和参考轴线B之间)
α2 角(第二光轴A2和参考轴线B之间)
d 距离、厚度
d’ 位移路径
OS 第一侧面、第一界面(上侧)
US 第二侧面、第二界面(下侧)
Δy (Y轴Y的方向上的)路径

Claims (10)

1.一种方法，用于在显微镜(1)的束路径中确定样品保持件(7)的厚度(d)，所述样品保持件对于照明辐射(BS)是透明的并且实施为接收样品(5)，所述方法包括以下步骤：
A：在样品平面(4)中布置所述样品保持件(7)，所述样品保持件(7)具有第一界面(OS)和第二界面(US)，其中所述样品平面(4)位于由笛卡尔坐标系中的X轴(X)和Y轴(Y)跨越的XY平面中，
B：将所述第一界面(OS)和所述第二界面(US)平行于所述样品平面(4)对准，
C：以照明角将所述照明辐射(BS)中的至少一个束沿着第一光轴(A1)指引到对准的样品保持件(7)上，
D：捕获所述照明辐射(BS)中的反射分量(BSref)中的至少两个测量值或者由所述照明辐射(BS)引起的检测辐射(DS)中的至少两个测量值，
E：取决于至少两个捕获的测量值，将所述第一界面和第二界面(OS、US)彼此之间在所述Z轴(Z)的方向上的间隔确立为厚度(d)，
步骤C中，所述第一光轴(A1)和垂直于所述XY平面的参考轴线之间的所述照明角不等于零，
步骤D中，通过检测器(9)，在预期的相对位置，将从所述样品保持件(7)的第一侧面(OS)或者从所述样品保持件(7)的第二侧面(US)反射的所述照明辐射(BS)中的反射分量(BSref)捕获作为第一测量值，并且随后在垂直于所述XY平面指引的所述Z轴(Z)的方向上移位所述样品保持件(7)，直到通过所述检测器(9)，在预期的相对位置，将相应的另一个界面(OS、US)的反射分量(BSref)捕获作为第二测量值，以及
步骤E中，基于所述第一测量值和第二测量值确立所述Z轴(Z)的方向上的位移路径(d’)，所述位移路径是必需的，以在所述预期的相对位置捕获所述第一界面和第二界面(OS、US)的反射分量(BSref)，以及确立所述厚度(d)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，布置在所述照明辐射(BS)的束路径中、所述反射分量(BSref)的束路径中和/或所述检测辐射(DS)的束路径中的光学有效校正元件(12)被致动，该致动取决于在相应的束路径中设定所确立的厚度(d)及其相对位置。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过所述照明辐射(BS)在所述样品平面(4)中产生光片(6)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
限定图像质量测量，
修改所述校正元件(12)中的至少一个的实际的定位方式，
捕获所述图像质量测量的测量值，其分配到选择的实际的定位方式中的每一个，
所述图像质量测量的当前值各基于所述图像质量测量的测量值来确立，以及
选择所述至少一个校正元件(12)的实际的定位方式，其中出现所述图像质量测量的期望值。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述测量值使用对比度、锐度测量、信噪比、信号强度和点扩散函数的参数的所述图像质量测量中的至少一个。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，使用包含分离的点状的荧光源的样品(5)，并且基于多个所述点状的荧光源的检测辐射(DS)捕获所述图像质量测量的至少两个测量值。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，基于捕获的图像的空间频率空间的分析，借助于将所述捕获的图像的空间频率分量通过阈值细分成组，以及包含在相应的组中的空间频率分量的最大值或最小值用作锐度测量，确立所述锐度测量。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，借助于选择的峰态的低值或最小值，基于捕获的图像的空间频率谱(所述峰态)的第四中心矩的分析，确立所述锐度测量。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用具有自重构束或无衍射束的辐射作为照明辐射(BS)。
10.一种方法，用于捕获布置在显微镜(1)的样品平面(4)中的样品(5)的图像数据，所述方法包括根据权利要求1的步骤A至E，其中通过照明辐射(BS)在所述样品(5)中引起检测辐射(DS)并且将所述检测辐射(DS)捕获。
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