CN116107076B - 一种单物镜光片三维荧光成像系统 - Google Patents
一种单物镜光片三维荧光成像系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种单物镜显微成像系统，本发明提供了一种单物镜光片三维荧光成像系统包括照明物镜、用于中继的扫描透镜组、振镜、照明模块以及成像模块，其中：所述扫描透镜组包括第一与第二扫描透镜，所述第一与第二扫描透镜的主光轴正交且共焦设置；所述第一与第二扫描透镜的共同焦点落在振镜的中心；样品激发平面发出的荧光，经照明物镜收集后，沿照明光相反的方向进入扫描透镜组，进入成像模块进行成像，获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影；所述成像模块，包括面阵探测器。本发明连续的采集样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，代替传统的样品激发平面的完美成像，取消了用于校正相差的两枚远程成像物镜，解除了对于照明物镜的光学参数限制，方便的实现原位倍率切换，并且成像速度快。
Description
技术领域
本发明属于显微成像技术领域，更具体地，涉及一种单物镜光片三维荧光成像系统。
背景技术
传统的光片显微镜具有由正交的光片照明光路和荧光探测光路，分别由探测物镜和照明物镜搭建，整体光路复杂，构建难度大。光片显微镜，将照明光路和探测光路耦合到一路中，采用一枚物镜同时对样本照明和探测，称之为单物镜光片显微镜。
然而采用单物镜同时进行照明和成像，由于光片照明光路和荧光探测光路斜交，一方面导致相差，另一方面限制了单物镜只能选择高数值孔径的物镜。为了校正相差，实现完美成像，目前采用三枚物镜进行远程聚焦，系统复杂且应用性低。并且由于它必须使用数值孔径很高的物镜，而数值孔径高的物镜一般对应着较高的倍率和较小的视场，限制了单物镜光片显微镜的视场。
一直以来，由于单物镜光片荧光成像系统不能实现原位倍率切换，不能方便的对样品实现不同倍率的观察，严重的限制了单物镜光片荧光显微镜的商业化应用。中国专利文献CN115685515A，提供了一种单物镜光片的共轴成像系统，通过共轴设置的第二物镜和第三物镜，解除了对照明物镜NA值的限制。虽然实现了原位倍率切换，然而该系统牺牲了视场以及成像速度，在一个扫描周期内通过堆积实现激发平面的二维成像，三维成像需要通过样品位移实现。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种单物镜光片三维荧光成像系统，其目的在于对单物镜成像系统，连续的采集样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，代替传统的样品激发平面的完美成像，进行三维重构获得样品的三维荧光数据，从而取消了用于校正相差的两枚远程成像物镜，解除了对于照明物镜的光学参数限制，方便的实现原位倍率切换，由此解决现有技术由于需要采用样品激发平面完美成像数据，对三枚物镜的光学参数限制严格，无法实现原位倍率切换，或者采用逐行曝光实现原位倍率切换导致的成像速度慢的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种单物镜显微成像系统，其特征在于，包括照明物镜、用于中继的扫描透镜组、振镜、照明模块以及成像模块，其中：
所述扫描透镜组包括第一与第二扫描透镜，所述第一与第二扫描透镜的主光轴正交且共焦设置；所述第一与第二扫描透镜的共同焦点落在振镜的中心；
所述照明模块，用于产生照明激光；照明激光经过扫描透镜组，进入照明物镜的后瞳面，形成倾角为α的照明光片投射在样品的激发平面上，激发荧光；所述激发平面与照明物镜主光轴斜交，交角为光片倾角
；
样品激发平面发出的荧光，经照明物镜收集后，沿照明光相反的方向进入扫描透镜组，进入成像模块进行成像，获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影；
所述成像模块，包括面阵探测器。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其还包括样品承载台；所述样品承载台，包括轴向进给装置，带动样品沿照明物镜轴向运动，其步进式或连续式改变轴向位置，在振镜的转动周期T内，轴向位移L满足
其中，s光片瑞利范围，
为光片与扫描方向的倾斜角。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其在振镜的作用下，样品的激发平面物镜沿与照明物镜主光轴正交的方向扫描，荧光信号经振镜反扫描后在成像模块的面阵探测器同一位置按照时序获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，经重构堆叠获得样品的三维荧光图像。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其所述振镜步进式或连续改变角度，使得样品的激发平面沿与照明物镜主光轴正交的方向扫描，使得相邻投影对应的样品激发平面在扫描方向上的位移d满足：
其中，h为光片厚度，
为光片与扫描方向的倾斜角。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其所述扫描透镜组与所述照明物镜之间设有管透镜组件，其与所述扫描透镜组的位置相对固定，用于对物镜收集的荧光信号进行准直校正。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其所述照明模块包括准直激光器和调制器，所述调制器包括掩模板，照明激光经调制器调制形成预设的光片，通过二相色镜与荧光光路合并，进入所述扫描透镜组。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其所述光片厚度在0.3um~5um之间。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其所述成像模块，包括汇聚透镜和面阵探测器，所述面阵探测器设置在所述汇聚透镜的焦平面上；所述面阵探测器按照控制信号的时序获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其包括景深拓展组件，所述景深拓展组件设置在扫描透镜组件和汇聚透镜之间，通过景深拓展组件，拓展光片沿物镜轴向的景深。
优选地，所述单物镜显微成像系统，其所述景深拓展组件为相位调制掩模、空间光调制器、轴棱镜、或棱镜组。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明创造的创新点在于利用振镜扫描采集投影信息，样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，代替传统的样品激发平面的完美成像，进行三维重构获得样品的三维荧光数据，仅需一枚照明物镜即可实现对样本的照明和信号采集，结合三维重构算法，快速且便捷的得到生物样本的三维结构信息；更重要的是，采用单物镜实现光片三维荧光成像的同时，取消了用于校正相差的两枚远程成像物镜，光路搭建不受照明物镜放大倍率的限制，需要实现倍率切换时，直接在原位更换一枚照明物镜即可，方便的实现原位倍率切换，并且不影响成像速度，其呈现速度与现有的光片荧光显微镜相当，远高于共聚焦显微镜，大大拓宽光片荧光显微镜的应用领域，从科研成像拓展到检测、影像的商业化应用。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的单物镜光片三维荧光成像系统光路示意图；
图2是本发明实施例2提供的单物镜光片三维荧光成像系统光路示意图；
图3是本发明实施例采用的控制信号示意图。
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1为照明物镜，2为管透镜，3为第一扫描透镜，4为振镜，5为第二扫描透镜，6透镜，7为汇聚透镜，8为探测器，9为照明激光，10为景深拓展模块。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的单物镜显微成像系统，包括照明物镜、用于中继的扫描透镜组、振镜、照明模块以及成像模块、样品承载台；其中：
所述扫描透镜组包括第一与第二扫描透镜，所述第一与第二扫描透镜的主光轴正交且共焦设置；所述第一与第二扫描透镜的共同焦点落在振镜的中心。
照明激光经过扫描透镜组，进入照明物镜的后瞳面，形成倾角为
的照明光片投射在样品的激发平面上，激发荧光；所述激发平面与照明物镜主光轴斜交，交角为光片倾角
；
样品激发平面发出的荧光，经照明物镜收集后，沿照明光相反的方向进入扫描透镜组，进入成像模块进行成像，获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影。
所述成像模块，包括面阵探测器。
在振镜的作用下，样品的激发平面物镜沿与照明物镜主光轴正交的方向扫描，荧光信号经振镜反扫描后在成像模块的面阵探测器同一位置按照时序获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，经重构堆叠获得样品的三维荧光图像。
所述振镜步进式或连续改变角度，使得样品的激发平面沿与照明物镜主光轴正交的方向扫描，使得相邻投影对应的样品激发平面在扫描方向上的位移d满足：
其中，h为光片厚度，
为光片与扫描方向的倾斜角。
通过调整振镜转动与相机成像速度匹配，控制相邻投影对应的样品激发平面在扫描方向上的位移d处于合适的范围之内，避免相机采样过于稀疏导致的漏采样或者采样过于密集导致的荧光信息串扰，提高三维重构后的图像成像质量。
本系统利用扫描透镜和振镜使样品的激发平面进行扫描，采集投影数据而不是完美成像直接形成三维图像，从而避免了对样品激发平面进行完美成像的需求，取消了用于矫正相差的第二物镜和第三物镜，解除了对照明物镜NA值的设置限制，可以通过更换照明物镜方便的实现原位变倍。需要进行倍率切换时，仅需要将照明物镜切换为其他倍率的照明物镜即可，系统的其他部件无需更换和重新配准，不要重新搭建光路。
然而由于采用投影重构三维图像而不是完美图像重构三维图像，需要避免投影产生的串扰。若投影随激发平面的扫描而在探测器上出现位移，则投影串扰会导致恢复成样品激发平面时错位，三维重构失败。本系统将振镜同时作用于照明光路和探测光路上，由于激发光路和探测光路经过振镜的方向正好相反，经过扫描和反扫描作用，成像位置在探测器固定不变，只需要按照时间顺序获取相应帧的图像，探测器成像连续变化，无须与振镜相位同步，即可有效的避免投影串扰导致的三维重构失败，无需通过复杂的振镜控制多次扫描来避免投影串扰。
所述扫描透镜组与所述照明物镜之间，设有透镜，优选为管透镜组件，其与所述扫描透镜组的位置相对固定，用于对物镜收集的荧光信号进行准直校正，从而兼容适配不同倍率的物镜，提高不同物镜的成像质量。
所述照明模块，用于产生照明激光；优选所述照明模块包括准直激光器和调制器，所述调制器包括掩模板，照明激光经调制器调制形成预设的光片，通过二相色镜与荧光光路合并，进入所述扫描透镜组。所述光片厚度在0.3um~5um之间，过厚的光片会导致投影串扰严重，过薄的光片会导致不利于三维成像堆叠，而且光片越薄，瑞利距离越短，增加了轴向扫描的成本。在设计时，需考虑光片的瑞丽距离和物镜景深的关系。
所述成像模块，包括汇聚透镜和面阵探测器，所述面阵探测器设置在所述汇聚透镜的焦平面上；所述面阵探测器按照控制信号的时序获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影。所述汇聚透镜优选为管透镜组件。
优选包括景深拓展组件，所述景深拓展组件设置在扫描透镜组件和汇聚透镜之间，可以为相位调制掩模、空间光调制器、轴棱镜、或棱镜组。通过景深拓展组件，拓展光片沿物镜轴向的景深，拓展单帧图像的视场范围，相机一次曝光获取更多的深度信息，从而增加物镜在其轴向上的位移步长，减少轴向扫描次数。
所述样品承载台，包括轴向进给装置，带动样品沿照明物镜轴向运动，其步进式或连续式改变轴向位置，在振镜的转动周期T内，轴向位移L满足
其中，s光片瑞利范围，
为光片与扫描方向的倾斜角。
以下为实施例：
实施例1
本实施例提供的单物镜显微成像系统，如图1所示，包括照明物镜、用于中继的扫描透镜组、振镜、照明模块以及成像模块、样品承载台；
照明模块：激光器发出的激光准直扩束后作为照明激光9平行出射，经过二向色镜反射至扫描透镜组。
扫描透镜组：入射第二扫描透镜5的光聚焦在振镜4上，在振镜上的焦点经过第一扫描透镜3和透镜2到达照明物镜1的后瞳面，经过照明物镜1在样本平面形成光片，激发样本荧光。其中，振镜与物镜后瞳面共轭，光片随着振镜4的振动在样本平面平动横向扫描，光片的参数由透镜组2决定。激光激发出的荧光被同一照明物镜1收集，经过扫描透镜组与扫描透镜3后被振镜4解扫描，以稳定不动的发散光的形式入射扫描透镜5，经过扫描透镜5后平行出射透过二向色镜。
成像模块：二向色镜反射较短波长的激光，透射较长波长的荧光，平行光最后经过管透镜制作的汇聚透镜7汇聚在面阵探测器8的感光面上。
所述样品承载台（图中未示出），包括轴向（Z方向）进给装置，带动样品沿照明物镜轴向运动，其步进式或连续式改变轴向位置，在振镜的转动周期T内，轴向位移L满足
其中，s光片瑞利范围，
为光片与扫描方向的倾斜角。
除Z方向上进给外，样品承载台使用二维位移台实现快速寻找视野的功能。
本实施例提供的单物镜显微成像系统在使用60X1.3NA的物镜1时，入射物镜1的光片宽度为3.54mm，光片偏离物镜1后瞳中心2.13mm，光片与扫描方向的倾斜角
设计为54°光片厚度为407nm；振镜步进式或连续改变角度，速率由h和/>
制约。
实施例2
本实施例提供的单物镜显微成像系统，如图2所示，包括照明模块、扫描与解扫描模块、样品搭载模块、景深拓展模块以及成像模块；照明模块、扫描与解扫描模块与实例1类似，与实例1不同之处在于经过扫描透镜5后，经透镜6平行出射的光透过二向色镜，经汇聚透镜7聚焦在探测器9之前经过景深拓展模块10，景深拓展模块10包括但不限于锥透镜、衍射光学元件、分光棱镜等等。
本实施例提供的单物镜显微成像系统在使用60X1.3NA的物镜1时，由于加入了景深拓展模块，探测方的光片厚度由216nm变为439nm，单帧图像的视场范围拓展至4080nm，约7倍；振镜步进式或连续改变角度，速率由h和
制约，由于单帧视野拓展，振镜扫描步长变长，加快了振镜扫描速率；同时增加物镜在其轴向上的位移步长，减少了物镜轴向扫描的次数。
实施例3
实施例1和2的耽误经显微成像系统，其振镜、样品承载台、面阵探测器的控制时序如图3所示：
在控制方案1中，振镜步进式的改变角度，实现横向扫描；
面阵探测器与振镜同步获取样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影；使得相邻投影对应的样品激发平面在扫描方向上的位移d满足：
其中，h为光片厚度，
为光片与扫描方向的倾斜角。
样品承载台沿Z方向步进式移动，实现轴向扫描，振镜每完成一个周期的转动，样品承载台Z方向进给一个步长。
在控制方案2中，振镜连续的改变角度，实现横向扫描；
面阵探测器根据自己固有的时序获取样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，使得相邻投影对应的样品激发平面在扫描方向上的位移d满足：
其中，h为光片厚度，
为光片与扫描方向的倾斜角。
样品承载台沿Z方向步进式移动，实现轴向扫描，振镜每完成一个周期的转动，样品承载台Z方向进给一个步长。
在控制方案3中，振镜连续的改变角度，实现横向扫描；
面阵探测器根据自己固有的时序获取样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，使得相邻投影对应的样品激发平面在扫描方向上的位移d满足：
其中，h为光片厚度，
为光片与扫描方向的倾斜角。
样品承载台沿Z方向连续移动，实现轴向扫描，振镜每完成一个周期的转动，样品承载台Z方向进给位移量L相当于景深，
，其中，s光片瑞利范围，/>
为光片与扫描方向的倾斜角。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，包括照明物镜、用于中继的扫描透镜组、振镜、照明模块以及成像模块，其中：
所述扫描透镜组包括第一与第二扫描透镜，所述第一与第二扫描透镜的主光轴正交且共焦设置；所述第一与第二扫描透镜的共同焦点落在振镜的中心；
所述照明模块，用于产生照明激光；照明激光经过扫描透镜组，进入照明物镜的后瞳面，形成倾角为
的照明光片投射在样品的激发平面上，激发荧光；所述激发平面与照明物镜主光轴斜交，交角为光片倾角/>
；
样品激发平面发出的荧光，经照明物镜收集后，沿照明光相反的方向进入扫描透镜组，进入成像模块进行成像，获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影；
所述成像模块，包括面阵探测器。
2.如权利要求1所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，还包括样品承载台；所述样品承载台，包括轴向进给装置，带动样品沿照明物镜轴向运动，其步进式或连续式改变轴向位置，在振镜的转动周期T内，轴向位移L满足
其中，s光片瑞利范围，
为光片与扫描方向的倾斜角。
3.如权利要求1或2所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，在振镜的作用下，样品的激发平面沿与照明物镜主光轴正交的方向扫描，荧光信号经振镜反扫描后在成像模块的面阵探测器同一位置按照时序获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影，经重构堆叠获得样品的三维荧光图像。
4.如权利要求3所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，所述振镜步进式或连续改变角度，使得样品的激发平面沿与照明物镜主光轴正交的方向扫描，使得相邻投影对应的样品激发平面在扫描方向上的位移d满足：
其中，h为光片厚度，
为光片与扫描方向的倾斜角。
5.如权利要求1或2所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，所述扫描透镜组与所述照明物镜之间设有管透镜组件，其与所述扫描透镜组的位置相对固定，用于对物镜收集的荧光信号进行准直校正。
6.如权利要求1或2所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，所述照明模块包括准直激光器和调制器，所述调制器包括掩模板，照明激光经调制器调制形成预设的光片，通过二相色镜与荧光光路合并，进入所述扫描透镜组。
7.如权利要求6所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，所述光片厚度在0.3um~5um之间。
8.如权利要求1或2所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，所述成像模块，包括汇聚透镜和面阵探测器，所述面阵探测器设置在所述汇聚透镜的焦平面上；所述面阵探测器按照控制信号的时序获得样品激发平面在照明物镜主光轴正交平面上的投影。
9.如权利要求1或2所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，包括景深拓展组件，所述景深拓展组件设置在扫描透镜组件和汇聚透镜之间，通过景深拓展组件，拓展光片沿物镜轴向的景深。
10.如权利要求9所述的单物镜光片三维荧光成像系统，其特征在于，所述景深拓展组件为相位调制掩模、空间光调制器、轴棱镜、或棱镜组。
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