CN116736532B - 贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物荧光显微成像领域，提供贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法及系统，首先通过空间调制器相位调制将照明光束从贝塞尔光束切换为高斯光束，根据高斯照明光焦点激发的荧光信号作为探测“导星”，利用波前探测器探测样品引入的光学像差，再根据傅里叶光学原理，计算空间光调制器施加轴棱锥相位时照明光束在照明物镜后瞳面电场分布，然后在该电场分布的相位中补偿探测得到的光学像差，最后根据光路的可逆性原理计算同时实现贝塞尔调制及像差校正的相位，施加给液晶空间光调制器从而在样品中获得校正了光学像差的贝塞尔光束照明，可以在像差探测器与校正器位置非共轭情况下实现光学像差的自适应校正。

Description

贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法及系统

技术领域

本发明属于生物荧光显微成像领域，具体涉及一种贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法及系统。

背景技术

贝塞尔双光子显微镜结合了双光子激发、以及贝塞尔光束无衍射照明，具有低光毒性、高分辨率、低光损伤、高成像深度等优势，在脑神经成像、胚胎发育、癌细胞迁移、器官生理活动等众多生命科学研究领域具有广阔的应用前景。

但目前也存在着一个限制其应用的瓶颈问题：照明光在传播过程中会受到生物组织折射率不均匀引入的光学像差的影响，使得照明光发生弥散、强度下降，激发出的荧光强度也会随之下降。而且随着照明深度的增加，像差会越来越大，产生的影响会越来越显著，直至完全无法激发出双光子荧光。也就是说，生物组织像差会限制照明光的穿透深度。自适应光学技术可以有效消除光学系统的像差，它利用波前探测器探测畸变像差波前相位，然后由与波前探测器位置共轭的波前校正器产生相反的相位对像差进行校正。利用该技术校正贝塞尔双光子显微镜照明光路的生物组织像差，需要解决生物组织像差的探测问题已由公开号为CN115356839A，贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法的专利实现。但由于作为像差校正器的液晶空间光调制器与像差探测器的位置并不共轭，不能像通常的自适应光学系统简单地只是在液晶空间光调制器上施加一个与测得像差相反的相位来实现光学像差的自适应校正。

所以，探测器与校正器非共轭是实现贝塞尔双光子显微镜照明光路像差校正的难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法，可以在像差探测器与校正器位置非共轭情况下实现光学像差的自适应校正，根据傅里叶光学原理理论推导校正器与探测器孔径非共轭时的像差校正机理，并在贝塞尔双光子光片显微镜中实验验证了非孔径共轭像差校正的效果。

上述目的通过如下技术方案实现：

一种贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法，包括如下步骤：

S1、通过空间光调制器将照明光束调制为高斯光束，根据高斯焦点激发的荧光作为导星，利用波前探测器探测待测样品引入的光学像差；

S2、通过空间光调制器将照明光束调制为贝塞尔光束，计算在照明物镜瞳面电场分布；

S3、在照明物镜瞳面电场分布的相位中预补偿待测样品引入的光学像差，得到像差校正的照明物镜瞳面电场分布；

S4、将像差校正的照明物镜瞳面电场分布进行二维傅里叶反变换得到实现了贝塞尔调制及像差校正的透镜前焦面处电场分布；

S5、将透镜前焦面处电场分布进行菲涅尔衍射计算得到实现了贝塞尔调制及像差校正的空间光调制器处电场分布；

S6、根据空间光调制器处电场分布计算得到应施加在空间光调制器上的相位，并施加给空间光调制器。

作为本发明更优的技术方案，所述的步骤S2中照明物镜瞳面电场分布是透镜前焦面电场分布的二维傅里叶变换得到。

作为本发明更优的技术方案，所述的透镜前焦面电场分布通过空间光调制器上加载轴棱锥相位后出射空间光调制器的电场分布菲涅耳衍射计算得到，加载轴棱锥相位后出射空间光调制器的电场分布为如下形式：

式中：E ₀为加载轴棱锥相位后出射空间光调制器的电场分布，E _in是入射空间光调制器的高斯光束，i表示虚数单位，其计算公式为：

式中：x、y为像素坐标，ω为束腰半径，A表示高斯光束中心点的光强， exp表示以自然常数e为底的指数函数。

本发明还提供一种贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正系统，沿贝塞尔双光子显微镜照明光路依次设置的空间光调制器、透镜和照明物镜；以及在贝塞尔双光子显微镜照明光路上增加的二向色镜和波前探测器；

以及第一计算模块，在空间光调制器上施加轴棱锥相位实现贝塞尔调制，通过第一计算模块计算在照明物镜瞳面电场分布，计算公式为：

式中：E _p为照明物镜瞳面电场分布；E ₁为透镜前焦面电场分布，FFT表示快速傅里叶变换，其计算公式为：

式中：x、y为像素坐标，k=2π/λ，λ为照明光波长，s为空间光调制器到透镜前焦面的距离，E ₀为出射空间光调制器的电场分布，Diff表示菲涅耳衍射，j表示虚数单位，k表示波矢，du表示变量u的微分，dν表示变量v的微分；

以及第二计算模块，第二计算模块中在照明物镜瞳面电场分布的相位中预补偿待测样品引入的光学像差，得到像差校正的照明物镜瞳面电场分布，计算公式为：

式中：为像差校正的照明物镜瞳面电场分布；

以及第三计算模块，第三计算模块中将像差校正的照明物镜瞳面电场分布进行二维傅里叶反变换得到实现了贝塞尔调制及像差校正的透镜前焦面处电场分布。

以及第四计算模块，第四计算模块中将透镜前焦面处电场分布进行菲涅尔衍射计算得到实现了贝塞尔调制及像差校正的空间光调制器处电场分布；

以及第五计算模块，第五计算模块中将根据空间光调制器处电场分布计算得到应施加在空间光调制器上的相位。

与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：

本发明提供的方法和系统同时实现了贝塞尔双光子显微镜照明光路调制及探测器与校正器非共轭的像差校正，在贝塞尔光束调制和照明光路像差校正的过程中使用的是同一个空间光调制器。

在探测照明光路像差时，贝塞尔照明光束和高斯照明光束的切换是通过空间光调制器相位调制来实现的，无需引入额外光路、也无需光学元件的移动切换。

待测样品在照明光路引入的光学像差是通过波前探测器直接探测得到的，校正信号是根据测得的像差一次计算得到的，无需迭代寻优过程。

附图说明

图1是贝塞尔光束照明及高斯光束像差探测原理图，其中SLM表示空间光调制器（为便于理解将SLM画作了透射器件，而不是实际上的反射器件）；L为焦距f的透镜，它与SLM之间的距离为s+f；IO为焦距f _I的照明物镜，它与L之间的距离为f+f _I，DM是二向色镜，WFS是波前探测器；（a）是贝塞尔照明光束的调制原理；（b）是高斯照明光束实现光学像差探测的原理。

图2是在波前探测器与校正器孔径非共轭条件下，同时实现贝塞尔调制及生物组织像差校正的相位计算流程。

图3是贝塞尔双光子显微镜实验光路图，其中BE是扩束器，L1~6为光学透镜，M1~3为反射镜，DM为二向色镜，GS为扫描振镜，IO为照明物镜，DO为成像物镜，Filter为滤光片，SLM为液晶空间光调制器，WFS为哈特曼波前探测器。

图4中（a）是无像差条件下相机采集的贝塞尔双光子荧光；（b）是有像差（像散）情况下相机采集的贝塞尔双光子荧光；（c）是校正了像差后相机采集的贝塞尔双光子荧光；（d）是沿着（a）、（b）、（c）中虚线的光强分布对比图。

图5是在图3透镜L3与照明物镜IO之间引入像散像差后，哈特曼波前探测器WFS测得的像差：（a）像差Zernike模式系数（单位：波长）；（b）像差波前（颜色条单位：波长）。

具体实施方式

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。

本发明提供的贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法，应用于如下情况：作为像差探测器的波前探测器与照明物镜后瞳面共轭，而作为像差校正器的空间光调制器与照明物镜后瞳面不共轭，也就是像差探测器与像差校正器并不共轭。该方法首先通过空间调制器相位调制将照明光束从贝塞尔光束切换为高斯光束，根据高斯照明光焦点激发的荧光信号作为探测“导星”，利用波前探测器探测样品引入的光学像差，再根据傅里叶光学原理，计算空间光调制器施加轴棱锥相位（贝塞尔光束调制）时照明光束在照明物镜后瞳面电场分布，然后在该电场分布的相位中补偿探测得到的光学像差，最后根据光路的可逆性原理计算同时实现贝塞尔调制及像差校正的相位，施加给液晶空间光调制器从而在样品中获得校正了光学像差的贝塞尔光束照明。所述方法具体步骤是：

步骤一、在空间光调制器上加载薄透镜相位Φ_L，将照明光束切换为高斯光束。根据高斯焦点激发的荧光作为导星，利用波前探测器探测得到贝塞尔双光子显微镜照明光路的光学像差Φ_S。

步骤二、在不考虑像差的情况下，根据傅里叶光学原理计算当液晶空间光调制器加载轴棱锥相位Φ_B后，照明光束在照明物镜瞳面上的电场分布E _p。

步骤三、在步骤二计算得到的照明物镜瞳面上的电场分布E _p的相位部分补偿光学像差Φ_S，可以得到校正了像差的照明光在照明物镜瞳面上的电场分布E ^c _p。

步骤四、由步骤三计算得到的E ^c _p，根据傅里叶光学原理及光路可逆原理，计算液晶空间光调制器处实现了贝塞尔调制及生物组织像差校正的照明光束电场分布E ^c _SLM。对该电场分布的相位部分施加给液晶空间光调制器，就可以在样品中得到校正了生物组织像差的贝塞尔照明光束。

下面详述本实施例的内容。根据贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法（公开号为CN115356839A）得到的贝塞尔双光子显微镜照明光路原理图如图1所示。为了便于理解，光路中起到扩束或孔径共轭作用的4F透镜组以及扫描器件已被忽略。当SLM上加载轴棱锥相位Φ_B时，入射的高斯照明光被调制为贝塞尔光束，在经透镜L与照明物镜IO形成的4F系统后在样品中形成贝塞尔光束照明；当SLM上加载薄透镜相位Φ_L时，空间光调制器等效于一个焦距为s的透镜， SLM和透镜L就构成一组4F系统，使得照明光以高斯光束入射照明物镜IO，并被IO聚焦在样品中形成高斯焦点，高斯焦点激发的双光子荧光作为像差探测的荧光导星。其中Φ_B和Φ_L具有如下形式，x、y为像素坐标，r₀为调制参数，k=2π/λ，λ为照明光波长。

(1)

样品引入的光学像差Φ_S被与照明物镜IO后瞳面共轭的WFS探测，但SLM与IO后瞳面并不共轭。因此空间光调制器与WFS并不共轭，也就不能在空间光调制器上施加与Φ_S相反的相位来实现像差校正。

首先考虑不存在像差的情况下，当SLM上加载轴棱锥相位Φ_B后，出射SLM的电场分布E ₀将具有如下形式：

(2)

其中E _in是入射SLM的高斯光束（束腰半径为ω）：

(3)

那么透镜L前焦面电场分布E ₁可以通过E ₀菲涅耳衍射距离s计算得到：

(4)

照明光束在IO瞳面（也是透镜L后焦面处）电场分布E _p则为E ₁的二维傅里叶变换：

(5)

如果样品不存在像差，E _p将在样品中产生理想的贝塞尔光束照明。那么要想消除生物组织像差Φ_s的影响，则需要在IO瞳面上照明光束的电场分布E _p的相位中预补偿Φ_s：

(6)

反推出透镜L前焦面处实现了贝塞尔调制及生物组织像差校正的照明光束电场分布应为/>的二维傅里叶反变换：

(7)

同样地，可以反推出SLM处实现了贝塞尔调制及生物组织像差校正的照明光束电场分布应为/>反向传播距离s后的电场分布，可以通过菲涅耳衍射计算得到：

(8)

因为SLM仅仅调制相位而不是振幅，故要想同时实现贝塞尔调制及生物组织像差校正，在SLM上施加的信号应为的相位（Arg表示取辐角运算）：

(9)

Arg表示对复数取辐角运算。

通过上述得到在波前探测器与像差校正器孔径非共轭条件下同时实现贝塞尔调制及生物组织像差校正的相位计算方法，计算流程如图2所示。入射光和调制参数r ₀不变的条件下，E _p可以通过公式（2）~（5）计算得到。当Φ_S被WFS探测得到后，就可以通过公式（6）~（9）计算得到同时实现了贝塞尔光束调制以及生物组织像差自适应校正的相位。

实施例1

首先在实验室光学平台上搭建如图3所示的贝塞尔双光子显微镜实验光路，所需的元器件包括扩束器BE，透镜L1~6，反射镜M1~3，二向色镜DM，扫描振镜GS，照明物镜IO、成像物镜DO，滤光片Filter，液晶空间光调制器，成像相机和哈特曼波前探测器。各元件的技术参数如下：

入射的照明光是波长920nm、平均功率2W、脉冲宽度100fs、脉冲能量25nJ、重复频率80MHz的近红外飞秒激光；扩束器BE为美国Thorlabs公司BE02-05-B的产品；透镜L1、L2、L3、L5、L6均为双胶合消色差透镜，口径分别为25mm、50mm、50mm、25mm、50mm，焦距分别为200mm、80mm、180mm、200mm、300mm；透镜L4为口径25mm、焦距200mm的筒镜；反射镜M1~3的口径为50mm、25mm、25mm；二向色镜DM透射700nm以上的光波段，反射700nm以下的光波段；扫描振镜GS为美国Thorlabs公司GVS111型号的产品，口径10mm，扫描范围±20°；照明物镜IO、成像物镜DO均为日本Nikon公司CFIAPO型号的产品，焦距为5mm，数值孔径0.8，放大率40倍；滤光片Filter为美国Thorlabs公司MF525-39型号的产品，中心波长525nm，带宽39nm；液晶空间光调制器SLM为美国Meadowlark公司纯位相LCOS型液晶空间光调制器，接收窗口为12.28mm×12.28mm，像素数512×512；成像相机为英国ANDOR公司Zyla4.2型号的产品，像素数2048×2048，像素大小6.5um；哈特曼波前探测器WFS具有6.4mm接收孔径，可探测波段从350nm～1000nm，微透镜阵列10*10；SLM与透镜L1之间的距离为500mm，透镜L1与扫描振镜GS之间的距离为200mm，扫描振镜GS与透镜L2之间的距离为80mm，透镜L2与透镜L3之间的距离为260mm，透镜L3与照明物镜IO之间的距离为185mm，成像物镜DO与筒镜L4之间的距离为205mm，扫描振镜GS到透镜L5的距离为200mm，透镜L5到透镜L6的距离为500mm，透镜L6到WFS的距离为300mm。

为了定量地评估本发明提出的贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法的有效性，利用罗丹明染料溶液作为样品做了如下实验：

1）首先在液晶空间光调制器上加载如式（1）所示的轴棱锥相位Φ_B（参数r ₀取值130um），成像相机采集得到无像差条件（均匀溶液折射率均匀，不引入像差）下的贝塞尔双光子荧光如图4（a）所示。

2）其次在透镜L3与照明物镜IO之间插入一个像散镜片来模拟引入像差，采集得到存在像差时的贝塞尔双光子荧光如图4（b）所示。在液晶空间光调制器上加载如式（1）所示的薄透镜相位Φ_L（参数s取值300mm），将照明光束切换为高斯光束。根据高斯焦点激发的荧光作为导星，利用哈特曼波前探测器探测得到的光学像差Φ_S如图5所示。可以看出，哈特曼波前探测器测得的像差基本只有像散项，其他项均在探测误差范围内（小于1/14波长）。

3）根据本发明提出的非共轭像差校正方法计算同时实现了贝塞尔光束调制以及生物组织像差自适应校正的相位，并加载到液晶空间光调制器上。然后利用采集得到校正了像差的贝塞尔双光子荧光如图4（c）所示。

图4（a）、（b）、（c）由相机在相同曝光时间下采集得到，沿同一截面的光强灰度对比如图4（d）所示。可以看出，像差使得贝塞尔双光子荧光一分为二，而且也急剧降低了荧光强度。而经过本发明提出的非共轭像差校正后，贝塞尔双光子荧光的形貌得到恢复，最大光强比校正前提高了7.4倍，实施例1充分说明了本发明的有效性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多种实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.一种贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、通过空间光调制器将照明光束调制为高斯光束，根据高斯焦点激发的荧光作为导星，利用波前探测器探测待测样品引入的光学像差；

S2、通过空间光调制器将照明光束调制为贝塞尔光束，计算在照明物镜瞳面电场分布；

S3、在照明物镜瞳面电场分布的相位中预补偿待测样品引入的光学像差，得到像差校正的照明物镜瞳面电场分布；

S4、将像差校正的照明物镜瞳面电场分布进行二维傅里叶反变换得到实现了贝塞尔调制及像差校正的透镜前焦面处电场分布；

S5、将透镜前焦面处电场分布进行菲涅尔衍射计算得到实现了贝塞尔调制及像差校正的空间光调制器处电场分布；

S6、根据空间光调制器处电场分布计算得到应施加在空间光调制器上的相位并施加给空间光调制器。

2.如权利要求1所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法，其特征在于，所述的步骤S2中照明物镜瞳面电场分布为透镜前焦面电场分布的二维傅里叶变换得到。

3.如权利要求2所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正方法，其特征在于，所述的透镜前焦面电场分布通过空间光调制器电场分布菲涅耳衍射计算得到，所述的空间光调制器电场分布为空间光调制器上加载轴棱锥相位Φ_B后出射空间光调制器的电场分布，空间光调制器为如下形式：

式中：E ₀为出射空间光调制器的电场分布，E _in是入射空间光调制器的高斯光束，i表示虚数单位，计算公式为：

式中：x、y为像素坐标，ω为束腰半径，A表示高斯光束中心点的光强， exp表示以自然常数e为底的指数函数。

4.一种贝塞尔双光子显微镜照明光路非共轭像差校正系统，特征在于，包括沿贝塞尔双光子显微镜照明光路依次设置的空间光调制器、透镜和照明物镜；以及在贝塞尔双光子显微镜照明光路上增加的二向色镜和波前探测器；

以及第一计算模块，在空间光调制器上施加轴棱锥相位实现贝塞尔调制，通过第一计算模块计算在照明物镜瞳面电场分布，计算公式为：

式中：E _p为照明物镜瞳面电场分布；E ₁为透镜前焦面电场分布，FFT表示快速傅里叶变换，其计算公式为：

式中：x、y为像素坐标，k=2π/λ，λ为照明光波长，s为空间光调制器到透镜前焦面的距离，E ₀为出射空间光调制器的电场分布，Diff表示菲涅耳衍射，j表示虚数单位，k表示波矢，du表示变量u的微分，dν表示变量v的微分；

以及第二计算模块，第二计算模块中在照明物镜瞳面电场分布的相位中预补偿待测样品引入的光学像差，得到像差校正的照明物镜瞳面电场分布，计算公式为：

式中：为像差校正的照明物镜瞳面电场分布；/>为光学像差；

以及第三计算模块，第三计算模块将像差校正的照明物镜瞳面电场分布进行二维傅里叶反变换得到实现了贝塞尔调制及像差校正的透镜前焦面处电场分布；

以及第四计算模块，第四计算模块中将透镜前焦面处电场分布进行菲涅尔衍射计算得到实现了贝塞尔调制及像差校正的空间光调制器处电场分布；

以及第五计算模块，第五计算模块中将根据空间光调制器处电场分布计

算得到应施加在空间光调制器上的相位。