CN115356839A - 贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法 - Google Patents

贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法 Download PDF

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Abstract

贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，涉及生物荧光显微成像领域，解决现有技术中进行生物组织像差探测时采用的光路系统结构复杂、系统装调难度大等问题。本发明在空间光调制器上分别施加轴棱锥相位和薄透镜相位，实现贝塞尔调制和高斯调制的光路切换，无需额外引入光路、也无需光学元件的移动切换。当空间光调制器实现贝塞尔调制时，照明光经照明物镜在样品中形成贝塞尔光束照明；当空间光调制器实现高斯调制时，照明光经照明物镜在样品中形成高斯焦点，激发的点状荧光导星可以作为像差探测的信号来源。通过引入模拟像差，利用测得的像差实施校正，校正后的荧光信号强度比校正前提高了8.7倍，实现了照明光路像差的准确探测。

Description

贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法
技术领域
本发明涉及生物荧光显微成像领域，具体涉及一种贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法。
背景技术
贝塞尔光束在一定距离内没有衍射，且在通过障碍物后可以自我复原，结合近红外飞秒激光光源实现双光子激发，可以扩大照明视场、提高成像速度，是荧光显微镜的理想照明光束。目前已广泛应用于双光子光片显微镜和双光子体成像显微镜中，在生物荧光显微成像领域取得了大量成果。
但由于生物组织通常是折射率不均匀的三维立体复杂结构，当照明光经过生物组织时，光在生物组织中传播、折射过程产生的像差会使得光波前发生明显畸变，光聚焦点发生弥散，照明光强度下降。随着穿透深度的增加，像差越来越大，这种效应也越来越明显，直至完全无法激发出双光子荧光。因此生物组织像差会显著降低显微镜的照明视场和成像质量。
想要消除生物组织像差对照明光的影响，目前最有效的手段就是自适应光学技术。自适应光学技术利用波前探测器实时探测畸变波前像差，然后由波前校正器对畸变像差进行实时校正，校正后就可以消除像差的影响。因此生物组织像差的探测是自适应光学校正的基础，也是自适应光学技术应用到荧光显微成像领域的难点。
目前在荧光显微镜中，生物组织像差探测的方式主要有两类：一类是无波前探测器间接探测。即不使用探测器直接探测，而直接根据成像的荧光强度迭代寻优来控制波前校正器补偿畸变像差。但该方式只能对少数低阶像差进行校正，且需要迭代计算、速度较慢。另一类是利用“荧光导星”直接波前探测。在生物样品中产生一个发荧光的“点目标”，根据该导星发出的荧光直接利用波前探测器进行波前探测。该方式可以探测高阶像差，精度高、速度快，因此具有更好的应用前景。对于利用普通高斯光束照明的双光子显微镜来说，这种直接波前探测方式也很容易实现。因为双光子激发的概率正比于照明光强的平方，而高斯光束经照明物镜聚焦后光强随着偏离焦点会急剧下降，因此只有高斯焦点处会激发出双光子荧光，这个双光子焦点就可以作为生物组织像差直接探测的导星。
然而对于利用贝塞尔光束照明的双光子显微镜来说，激发的双光子荧光不是一个点目标，而是沿着照明光轴分布的长的“线状”目标，无法作为生物组织像差直接探测的导星。解决这一问题的一种方式是在照明光路中再额外引入一路高斯光束，在生物组织像差探测时将光路切换成高斯光束，利用高斯双光子焦点作为像差探测的导星，在自适应校正成像时再切换成贝塞尔光束。但这种方式会大大增加系统的复杂度，也必然会增加系统的装调难度。
因此，针对贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测是目前亟待解决的难题。
发明内容
本发明为解决现有技术中进行生物组织像差探测时采用的光路系统结构复杂、系统装调难度大等问题，提供一种贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法。
贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，该方法通过在空间光调制器上分别施加轴棱锥相位和薄透镜相位，用于实现贝塞尔调制和高斯调制的光路切换；需要贝塞尔光束照明时采用贝塞尔调制，需要探测像差时采用高斯调制；
实现贝塞尔调制的轴棱锥相位ΦB具有如下形式：
Figure BDA0003833816140000021
式中，(x,y)为空间光调制器的象素坐标，r0为调制参数，其相位从0变化到2π的宽度，r0的取值决定了贝塞尔光束的宽度和长度。
实现高斯调制的薄透镜相位ΦL具有如下形式：
Figure BDA0003833816140000022
其中k＝2π/λ，s为薄透镜的焦距，λ为光束波长。
本发明的有益效果：本发明利用空间光调制器调制轴棱锥相位来实现贝塞尔光束的调制。在生物组织像差探测时，将空间光调制器的轴棱锥相位替换成薄透镜相位，就可以将贝塞尔光路方便地切换成高斯光路，在生物组织样品中形成高斯双光子荧光焦点，实现像差的直接探测；在自适应校正成像时，将空间光调制器的相位再恢复为轴棱锥相位，实现高斯光路到贝塞尔光路的自由切换。
本发明的照明光路结构简单、实施方便，为自适应校正生物像差从而提高显微镜成像效果奠定基础。
附图说明
图1为本发明所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法中贝塞尔双光子显微镜的照明光路原理图，其中Laser表示入射的近红外飞秒激光，SLM表示空间光调制器(为了便于理解，将SLM画作了透射器件，而不是实际上的反射器件)。L为焦距f的透镜，IO为焦距fI的照明物镜，Sample表示成像样品。
图2为模拟仿真得到的贝塞尔单光子、双光子荧光图像，坐标方向与图1中的坐标系相同。(a)是贝塞尔单光子在XZ面的截面图，(b)是贝塞尔单光子在XY面的截面图。(c)是贝塞尔双光子在XZ面的截面图，(d)是贝塞尔双光子在XY面的截面图。
图3为模拟仿真得到的高斯单光子、双光子荧光图像，坐标方向与图1中的坐标系相同。(a)是高斯单光子在XZ面的截面图，(b)是高斯单光子在XY面的截面图。(c)是高斯双光子在XZ面的截面图，(d)是高斯双光子在XY面的截面图。
图4为贝塞尔双光子显微镜照明光路像差探测原理图，其中Laser表示入射的近红外飞秒激光，SLM表示空间光调制器(为了便于理解，将SLM画作了透射器件，而不是实际上的反射器件)。L为焦距f的透镜，它与SLM之间的距离为s+f。IO为焦距fI的照明物镜，它与L之间的距离为f+fI。Sample表示成像样品，DM是二向色镜，WFS是波前探测器。
图5为本实施方式二的光路图，其中，1、2、5、9、10、13、16、18为光学透镜，4、6、17为反射镜，7为二向色镜，8为扫描振镜，11为照明物镜，12为成像物镜，14为滤光片，3为空间光调制器，15为成像相机，19为哈特曼波前探测器。
图6为空间光调制器SLM实现贝塞尔调制时，成像相机Camera(a)和哈特曼波前探测器WFS(b)分别采集得到的荧光信号效果图。
图7为空间光调制器SLM实现贝塞尔调制时，在贝塞尔双光子显微镜照明光路引入像散像差，哈特曼波前探测器WFS测得的像差；(a)为像差Zernike系数，(b)像差波前效果图。
图8为空间光调制器SLM实现高斯调制时，成像相机Camera(a)和哈特曼波前探测器WFS(b)分别采集得到的荧光信号效果图。
图9为空间光调制器SLM实现高斯调制时，在贝塞尔双光子显微镜照明光路引入像散像差，哈特曼波前探测器WFS测得的像差；(a)为像差Zernike系数，(b)像差波前效果图。
图10为根据空间光调制器SLM实现高斯调制时测得的像差校正前后，在相同的曝光时间条件下，成像相机测得的荧光信号；(a)为像差校正前荧光信号，(b)像差校正后的荧光信号，(c)为校正前后荧光截面灰度对比图。
具体实施方式
具体实施方式一、结合图1至图4说明本实施方式，下面详述本发明的内容。本发明提出的贝塞尔双光子显微镜的照明光路原理图如图1所示。为了便于理解，光路中起到扩束或孔径共轭作用的4F透镜组以及扫描器件已被忽略。平行的近红外飞秒激光入射空间光调制器SLM，被SLM上加载的轴棱锥相位ΦB调制为贝塞尔光束。同样地，这里为了便于理解，将SLM画作了透射器件，而不是实际上的反射器件。经焦距为f的透镜L后在后焦面处形成一个环状光束，再经照明物镜IO(焦距为fI)后在样品中形成贝塞尔光束照明。这里SLM与透镜L之间的距离为s+f而不是f，这对下面将光路切换为高斯光路实现像差探测非常关键。透镜L与照明物镜IO之间的距离为f+fI。
实现贝塞尔调制的轴棱锥相位ΦB具有如下形式：
Figure BDA0003833816140000041
其中(x,y)为SLM的象素坐标，因此ΦB具有同心圆环的形式。r0是调制参数(相位从0变化到2π的宽度)，它的大小决定了贝塞尔光束的宽度和长度。
模拟仿真得到的贝塞尔单、双光子荧光和高斯单、双光子荧光分别如图2、3所示，可见贝塞尔光束作为照明光束确实可以扩大照明光轴(Z轴)方向上的照明视场。同时由于双光子激发的概率正比于照明光强的平方，而贝塞尔光束的旁瓣的能量远小于中心主光束，因此双光子激发时旁瓣并不能激发出荧光，消除了贝塞尔旁瓣的影响。由此可见，贝塞尔光束是双光子显微镜的理想照明光束。
贝塞尔照明光束激发的双光子荧光是沿光轴分布的线状荧光，而生物组织像差直接探测需要一个点状的荧光导星，这就需要照明光路可以从贝塞尔光路切换为高斯光路。本实施方式提出的光路可以十分方便地实现光路切换：如图4所示，在像差探测时，将SLM上的轴棱锥相位ΦB替换成如下式所示的薄透镜相位ΦL，其中k＝2π/λ。此时，SLM的作用等效于一个焦距为s的透镜。SLM和透镜L就构成一组4F系统，使得照明光以平行光入射照明物镜IO。样品中被IO聚焦的照明光焦点激发的双光子荧光，就可以作为像差探测的荧光导星。
Figure BDA0003833816140000051
该导星发出的荧光被照明物镜收集，后向传播经DM反射就可以进入WFS进行像差探测。由于双光子激发效应，荧光的波长略大于照明激光波长的一半，荧光和照明光的波长差异很大，可以很容易用二向色镜分开。
具体实施方式二、结合图5至图10说明本实施方式，本实施方式为具体实施方式一所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法的实施例：
首先在实验室光学平台上搭建如图5所示的贝塞尔双光子显微镜实验光路，所需的元器件包括透镜1、2、5、9、10、13、16、18，反射镜4、6、17，二向色镜7，扫描振镜8，照明物镜11、成像物镜12，滤光片14，空间光调制器3，成像相机15和哈特曼波前探测器19。
贝塞尔光片照明时，空间光调制器SLM上加载如上式(1)所示的轴棱锥相位ΦB。飞秒激光Laser经4F透镜组(1、2)扩束，入射SLM后被调制成贝塞尔光束(沿光轴向传播的“针状”光束)。与图1相比，照明光路增加了反射镜6、二向色镜7、扫描振镜8和4F透镜组9、10。反射镜6的作用是使得整体光路更紧凑，二向色镜7对照明近红外飞秒激光不起作用(透射)。扫描振镜8的作用是当其沿X方向高速扫描时，可以在样品中形成一个XZ平面内的片状照明光。4F透镜组(9、10)的作用是使得扫描振镜8与照明物镜11孔径共轭。贝塞尔照明光激发的双光子荧光，被与照明物镜垂直的成像物镜12收集，经过透镜13及滤光片14，进入成像相机(Camera)成像。生物样品的三维成像，由连接样品载物台的高精度电动平移台在Y方向的平移实现。
本实施方式中，在生物组织像差探测时，空间光调制器SLM上加载如上式(2)所示的薄透镜相位ΦL。此时SLM等效于一个薄透镜，与透镜5构成一组4F系统，再经过4F透镜组(9、10)使得照明光以平行光入射照明物镜11，最终被照明物镜11聚焦的高斯焦点激发的双光子荧光，就可以作为像差探测的荧光导星。该荧光导星的发出的双光子荧光(波长小于照明激光波长)，被照明物镜11收集，并沿照明光路后向传播，经扫描振镜8解扫描，再被二向色镜7反射后，再经4F透镜组(16、18)及反射镜17后进入哈特曼波前探测器，进行生物组织像差探测。这部分荧光与照明光在生物样本中经过同一路径，因而携带了与照明光相同的生物组织像差信息。
本实施方式所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路像差探测方法，无需在照明光路中再额外引入一路高斯光束，也无需光学元件的移动切换。只需切换空间光调制器上加载的相位，就可以十分方便地进行贝塞尔光束和高斯光束的切换。当空间光调制器实现贝塞尔调制时，照明光经照明物镜在样品中形成贝塞尔光束照明；当空间光调制器实现高斯调制时，照明光经照明物镜在样品中形成高斯焦点，激发的点状荧光导星可以作为像差探测的信号来源。
本实施方式中，贝塞尔双光子显微镜实验光路中各元件的技术参数如下：
照明光(近红外飞秒激光Laser)是波长920nm、平均功率2W、脉冲宽度100fs、脉冲能量25nJ、重复频率80MHz的飞秒激光；
所述透镜1、2、5、9、10、16、18均为双胶合消色差透镜，口径分别为25mm、50mm、50mm、50mm、50mm、50mm、50mm，焦距分别为100mm、300mm、300mm、80mm、180mm、200mm、300mm；透镜13为口径25mm、焦距200mm的筒镜；
所述反射镜4、6、17的口径为25mm；
所述二向色镜7透射700nm以上的光波段，反射700nm以下的光波段；
所述扫描振镜8为美国Thorlabs公司GVS111型号的产品，口径10mm，扫描范围±20°；
所述照明物镜11和成像物镜12为日本Nikon公司CFIAPO型号的产品，焦距为5mm，数值孔径0.8，放大率40倍；
所述滤光片14为美国Thorlabs公司MF525-39型号的产品，中心波长525nm，带宽39nm；
所述空间光调制器3为美国Meadowlark公司纯位相LCOS型液晶空间光调制器，接收窗口为12.28mm×12.28mm，像素数512×512；
所述成像相机15为英国ANDOR公司Zyla4.2型号的产品，像素数2048×2048，像素大小6.5um；
所述哈特曼波前探测器19具有6.4mm接收孔径，可探测波段从350nm～1000nm，微透镜阵列10*10；
所述透镜1、2之间的距离为400mm，透镜2与SLM之间的距离为300mm，SLM与透镜5之间的距离为500mm，透镜5与扫描振镜8之间的距离为300mm，扫描振镜8与透镜9之间的距离为80mm，透镜9与透镜10之间的距离为260mm，透镜10与照明物镜11之间的距离为185mm，成像物镜12与筒镜之间的距离为205mm，扫描振镜8到透镜16的距离为200mm，透镜16到透镜18的距离为500mm，透镜18到WFS的距离为300mm。
如图6和图7所示，本实施方式中，实现贝塞尔调制光片照明：在空间光调制器SLM上加载如上式(1)所示的轴棱锥相位ΦB时(参数r0取值400um)，照明光路在样品(罗丹明溶液)中形成贝塞尔光片照明，成像相机Camera采集得到的贝塞尔双光子光片如图6(a)所示。贝塞尔双光子荧光光片厚度为0.97um，长度为45.34um。此时对于像差探测光路来说，进入哈特曼波前探测器WFS的信号来源于溶液中沿着像差探测光轴分布的线状荧光。因此WFS微透镜阵列聚焦的光斑阵列将不是点状光斑，而是沿着不同方向被拉长(近轴的拉长程度较小，随着远离光轴而拉长程度越来越大)，如图6(b)所示。在这种情况下，WFS无法实现像差的准确探测。在透镜10与照明物镜11之间插入一个像散镜片(模拟像差)，WFS探测得到的像差如图7所示。可以看出，WFS测得的像差不仅包含像散项，还包含一个很大的离焦项，和不可忽略的慧差项。
如图8至图10所示，实现高斯调制像差探测：在空间光调制器SLM上加载如上式(2)所示的薄透镜相位ΦL(参数s取值200mm)，此时SLM等效于一个聚焦为200mm的薄透镜。SLM与透镜5(焦距为300mm)之间的距离为500mm，SLM与透镜5正好构成一组4F系统，再经过4F透镜组(9、10)将使得照明光以平行光入射照明物镜11，最终被照明物镜聚焦的高斯焦点激发的双光子荧光如图8(a)所示。双光子荧光厚度为0.81um，长度为4.06um。该荧光导星信号进入哈特曼波前探测器形成的光斑阵列如图8(b)所示，可以看出光斑呈点状，可以实现像差的准确探测。同样地，在透镜10与照明物镜11之间插入一个像散镜片(模拟像差)，WFS探测得到的像差如图9所示。可以看出，WFS测得的像差基本只有像散项，其他项均在探测误差范围内。为了进一步验证像差探测的准确性，根据测得的像差利用空间光调制器实施像差校正。在相同的曝光时间条件下，校正前后成像相机测得的荧光信号分别如图10(a)和(b)所示。可以看出像差使得信号发生了弥散、信号强度降低，而经过校正后信号重新得到了汇聚、强度显著提升。校正后的荧光信号强度比校正前提高了8.7倍，如图10(c)所示。这说明本方法确实可以实现贝塞尔双光子显微镜照明光路像差的准确探测。

Claims (6)

1.贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，其特征是：该方法通过在空间光调制器上分别施加轴棱锥相位和薄透镜相位，用于实现贝塞尔调制和高斯调制的光路切换；需要贝塞尔光束照明时采用贝塞尔调制，需要探测像差时采用高斯调制；
实现贝塞尔调制的轴棱锥相位ΦB具有如下形式：
Figure FDA0003833816130000011
式中，(x,y)为空间光调制器的象素坐标，r0为调制参数，代表相位从0变化到2π的宽度，r0的取值决定了贝塞尔光束的宽度和长度；
实现高斯调制的薄透镜相位ΦL具有如下形式：
Figure FDA0003833816130000012
其中k＝2π/λ，s为薄透镜的焦距，λ为光束波长。
2.根据权利要求1所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，其特征在于：贝塞尔双光子显微镜照明光路中，空间光调制器到其后方透镜的距离为后方透镜的焦距与高斯调制时施加的薄透镜相位的焦距之和。
3.根据权利要求1所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，其特征在于：当空间光调制器实现贝塞尔调制时，照明光束经照明物镜在样品中形成贝塞尔光束照明；当空间光调制器实现高斯调制时，照明光束经照明物镜在样品中形成高斯焦点，激发的点状荧光导星用于作为像差探测的信号来源。
4.根据权利要求1所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，其特征在于：所述贝塞尔双光子显微镜照明光路由沿光轴依次设置的空间光调制器SLM、透镜L和照明物镜IO组成；
平行的近红外飞秒激光入射空间光调制器，所述空间光调制器通过加载的轴棱锥相位ΦB将近红外飞秒激光调制为贝塞尔光束；贝塞尔光束经透镜L后在照明物镜后瞳面处形成一个环状光束，所述环状光束经照明物镜IO后在样品中形成贝塞尔光束照明。
5.根据权利要求1所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，其特征在于：将贝塞尔双光子显微镜照明光路切换为高斯像差探测光路，即：在贝塞尔双光子显微镜照明光路中增加二向色镜和波前探测器；
将空间光调制器上的轴棱锥相位ΦB替换成薄透镜相位ΦL，所述空间光调制器等效于一个焦距为s的透镜；SLM和透镜L构成一组4F系统，使经过透镜L后的照明光以平行光入射照明物镜IO；
样品中被照明物镜IO聚焦的照明光焦点激发的双光子荧光，则作为像差探测的荧光导星；所述荧光导星发出的荧光被照明物镜收集，后向传播经二向色镜DM反射进入波前探测器进行像差探测。
6.根据权利要求5所述的贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法，其特征在于：由于双光子激发效应，所述荧光导星发出的荧光的波长小于照明激光波长，大于照明激光波长的一半。
CN202211082314.1A 2022-09-06 2022-09-06 贝塞尔双光子显微镜照明光路生物组织像差探测方法 Pending CN115356839A (zh)

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