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Anwendungsgebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur histologischen
Klassifizierung von Gewebeschnitten.
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Stand der Technik
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Die
Histologie ist die Lehre von den menschlichen, tierischen und pflanzlichen
Geweben, insbesondere deren Struktur und Funktion. Eine histologische
Klassifizierung wird in der Regel an einem wenige Mikrometer dicken
gefärbten Gewebeschnitte durchgeführt und betrifft
die vorkommenden Gewebearten, Differenzierungen des Gewebes, bakterielle und
parasitäre Krankheitserreger im Gewebe und Krankheitszustände
des Gewebes. Die Klassifizierung kann auf ein oder mehrere Teilgebiete
eines Gewebeschnittes eingeschränkt werden oder sich sogar nur
auf eine oder mehrere einzelne Zellen beziehen. Die Krankheitszustände
von menschlichem Gewebe betreffen entzündliche Erkrankungen,
Stoffwechselerkrankungen und den Nachweis von Tumoren, insbesondere
die Differenzierung zwischen gut- und bösartige Tumorformen.
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Die
Herstellung eines histologischen Gewebeschnittes erfolgt in folgenden
Schritten:
- – Gewebestabilisierung
durch eine chemische Fixierung oder durch Gefrieren
- – Herstellung eines 2 bis 10 Mikrometer dicken Schnittes
mit einem Mikrotom
- – Anfärben des Gewebeschnittes
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Die
Gewebestrukturen, die Zellen des Gewebes selber und sogar intrazelluläre
Strukturen (z. B. Zellkerne, Endoplamatische Retikulum, Mitochondrien)
bleiben aufgrund der Gewebestabilisierung im Gewebeschnitt erhalten.
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Die
Strukturen des Gewebeschnittes werden im histologischen Routinebetrieb
mit Hilfe von lichtoptischen Mikroskopen und Scannern abgebildet bzw.
abgerastert. Ein derart aufgenommenes optisches Bild des Gewebeschnittes
kann eine Ortsauflösung von etwa 250 Nanometer aufweisen,
d. h., es werden Strukturen der entsprechenden Größe
räumlich aufgelöst. Mit einer elektronenoptischen
Abbildung oder neueren lichtoptischen Fluoreszenzverfahren, wie
z. B. der STED-Mikroskopie (STED = Simulated Emission Depletion)
kann die Ortsauflösung des optischen Bildes weiter erhöht
werden, also noch kleinere Strukturen räumlich aufgelöst
werden.
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Das
Anfärben des Gewebeschnittes steigert den Kontrast in dem
optischen Bild des Gewebeschnittes. Es gibt eine Vielzahl verschiedener
histologischer Färbungen, die sich in ihrer Affinität
zu bestimmten Gewebe- und Zellstrukturen unterscheiden und diese
selektiv im optischen Bild sichtbar machen. Die Hämatoxylin-Eosin
Färbung ist die am weitesten verbreitete Färbung
in Routine- und Übersichtsuntersuchungen. Neben anderen
spezifischen Färbungen gibt es Immunfärbungen,
bei denen die Verteilung von Proteinen in Gewebeschnitten und in
den Zellen des Gewebeschnittes sichtbar gemacht wird, indem spezifische
Antikörper affin an bestimmte Proteine binden. Es werden
neben Antigen-Antikörper Bindungen auch sogenannte In-Situ
Hybridisieungsverfahren mit spezifischen DNS-Sonden (DNS = Desoxyribonukleinsäure)
eingesetzt.
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Eine
Färbung macht Strukturen des Gewebeschnittes bzw. Verteilungen
des Färbemittels im Gewebeschnitt sichtbar. Die Histologie
ist im Allgemeinen eine morphologische Diagnostik, da anhand des
Erscheinungsbildes und färberischen Verhaltens der Gewebe-
und Zellstrukturen die histologische Klassifizierung vorgenommen
wird. Die Immunofärbung und die In-Situ-Hybridisierung
sind in der Regel hoch spezifisch, so dass neben morphologischen
Informationen auch molekulare Informationen abgeleitet werden können.
Alle Informationen, die aus einem optischen Bild eines Gewebeschnittes
gewonnen werden, werden im Folgenden unter dem Begriff „optische
Informationen” zusammengefasst.
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Der
Zustand eines Gewebes kann sich in Bezug auf Krankheitszustände,
Gewebedifferenzierungen und den Befall mit Krankheitserregern gegenüber
einer anderen normal differenzierten bzw. gesunden Gewebeprobe durch
eine charakteristische Substanzzusammensetzung bemerkbar machen.
Der Gewebezustand wird also durch Konzentrationsmuster von Substanzen
und damit molekularen Informationen charakterisiert. Sind die Konzentrationen
der Substanzen hinreichend hoch, so können die Konzentrationsmuster
durch eine massenspektrometrische Analyse nachgewiesen werden. Die
Substanzen können alle Arten von biologischen Substanzen sein,
z. B. Proteine, Nukleinsäuren, Lipide oder Zucker. Ein
ungewöhnliches Muster kann sich dadurch ergeben, dass bestimmte
biologische Substanzen unter- oder überexprimiert sind.
Insbesondere Proteine können auch in charakteristischer
Weise modifiziert vorliegen, z. B. durch posttranslationale Modifikationen.
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Die
Massenspektrometrie mit Ionisierung einer Probe durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization)
wird seit mehreren Jahren erfolgreich zur Bestimmung von Molekülmassen,
zur Identifizierung und zur struktu rellen Charakterisierung von
biologischen Substanzen, insbesondere von Proteinen oder Peptiden,
eingesetzt.
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Eine
Gewebeprobe kann für die Bestimmung charakteristischer
Konzentrationsmuster in bekannter Weise homogenisiert werden. Die
darin befindlichen Substanzen werden aufgearbeitet und zusammen
mit einer Lösung einer Matrixsubstanz auf einen Probenträger
aufgebracht. Hiernach verdampft das Lösungsmittel und die
Matrixsubstanz kristallisiert, wobei die biologischen Substanzen
in den Matrixkristallen in Form einzelner, weit voneinander getrennter Moleküle
mitkristallisieren. Ein Beschuss einer so präparierten
homogenisierten Probe mit kurzen Laserpulsen ausreichender Energie
führt dazu, dass die Matrixsubstanz explosionsartig verdampft
und die biologischen Substanzen und ionisiert werden.
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In
der bildgebenden massenspektrometrischen Analyse, also der Aufnahme
eines massenspektrometrischen Bildes (IMS = Imaging Mass Spectrometry),
werden anstelle homogenisierter Gewebeproben solche Gewebeschnitte
untersucht, wie sie aus der Histologie bekannt sind. Ein Gewebeschnitt
wird dazu auf einen elektrisch leitenden Probenträger aufgelegt.
Auf den Gewebeschnitt wird dann mit einem geeigneten Verfahren eine
Matrixlösung aufgebracht. Nach dem Trocknen der Matrixlösung
wird der Probenträger in ein Massenspektrometer eingebracht.
Für die nachfolgende bildgebenden massenspektrometrische
Analyse kann das Rasterscan-Verfahren nach Caprioli (
US 5,808,300 A ) oder eine
stigmatische Abbildung eines kleinen Bereichs der Gewebeprobe (
Luxembourg
et al., Analytical Chemistry, 76(18), 2004, 5339–5344: „High-Spatial Resolution
Mass Spectrometric Imaging of Peptide and Protein Distributions
on a Surface") verwendet werden. In beiden Fällen
ergibt sich ein massenspektrometrisches Bild des Gewebeschnittes,
d. h., die molekularen Informationen in den Massenspektren sind
räumlich aufgelöst.
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Aus
dem Patentschrift
DE
10 2006 019 530 B4 sind verschiedene Verfahren zur Präparation
von Gewebeschnitten für die bildgebende massenspektrometrische
Analyse bekannt. Die Matrixlösung oder eine Rekristallisationslösung
kann beispielsweise durch pneumatisches Sprühen, durch
vibratives Vernebeln oder durch Nanospotting von Tröpfchen
auf den Gewebeschnitt aufgebracht werden. Das Aufbringen der Matrixlösung
ist nicht trivial, da (a) eine laterale Verschmierung der biologischen
Substanzen zu vermieden ist, (b) die biologischen Substanzen möglichst
aus dem Gewebeschnitt extrahiert und in die Kristalle der Matrixschicht
eingebaut werden müssen, und (c) ein günstiges
Verhältnis von biologisch relevanten Substanzen zu Verunreinigungen zu
erzielen ist. Durch das Aufbringen der Matrixsubstanz auf den Gewebeschnitt
und deren Wirkung auf den Gewebeschnitt sind derzeit massen spektrometrische
Bilder von Gewebeschnitten auf eine Ortsauflösung zwischen
zehn bis zweihundert Mikrometer begrenzt. Es können somit
keine Strukturen räumlich aufgelöst werden, die
kleiner als 10 Mikrometer sind. Im Vergleich zu optischen Bildern
der herkömmlichen Histologie ist die Ortsauflösung
um mehr als eine Größenordnung geringer.
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Es
sind drei verschiedene Verfahren bekannt, die auf optischen Bildern
beruhende Histologie mit massenspektrometrischen Bildern zu koppeln (Bruker
Application Note #MT-89: „Advances in Molecular Histology
with the MALDI Molecular Imager”). Zum einen kann die Aufnahme
eines optischen Bildes und eines massenspektrometrischen Bildes
an zwei verschiedenen aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten einer
Gewebeprobe getrennt durchge-führt werden. Da zwei aufeinanderfolgende
Gewebeschnitte aufgrund von mechanischen Toleranzen beim Herstellen
der beiden Gewebeschnitte in der Regel nicht ausreichend deckungsgleich
sind, ist hier eine räumliche Zuordnung zwischen den beiden
Bildern nur sehr eingeschränkt möglich. Zum zweiten kann
zuerst ein optisches Bild und danach ein massenspektrometrisches
Bild von einem einzelnen Gewebeschnitt aufgenommen werden. In diesem
Fall darf die Färbung des Gewebeschnittes die Extraktion der
biologischen Substanzen und deren nachfolgende Ionisierung nicht
beeinflussen. Da die meisten histologischen Färbungen diese
Anforderungen nicht erfüllen und den Informationsgehalt
der Massenspektren in einem zu starken Maße herabsetzen, wird
diese Vorgehensweise nur selten angewendet. Zum dritten kann zuerst
ein massenspektrometrisches Bild und danach ein optisches Bild aufgenommen
werden. Die auf einen Gewebeschnitt aufgebrachte Matrixschicht wird
nach der Aufnahme des massenspektrometrischen Bildes wieder vom
dem Gewebeschnitt abgelöst. Danach wird der Gewebeschnitt
der histologischen Routine entsprechend angefärbt und ein
optisches Bild aufgenommen.
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Die
so gewonnenen Arten von Bildern eines Gewebeschnittes werden in
der Regel in einer graphischen Darstellung übereinandergelegt.
Die ortsaufgelösten Massenspektren werden dabei in der graphischen
Darstellung oft auf einzelne ausgewählte Massen oder auf
eine Klassenzugehörigkeit reduziert. Die Zuordnung zu bestimmten
Klassen erfolgt dabei mit Hilfe von statistischen Analyseverfahren. Das
optische Bild dient nur als Orientierungshilfe im massenspektrometrischen
Bild, das wie beschrieben eine geringere Ortsauflösung
aufweist. Aus der Veröffentlichung von
Schwamborn
et al. (International Journal of Molecular Medicine, 20, 155–157,
2007: "Identifying prostate carcinoma by MALDI-Imaging") ist
zudem bekannt, dass morphologische Informationen aus einem optischen
Bild eines Gewebeschnittes dazu verwendet werden, räumlich
aufgelöste Massenspektren mit Hilfe eines überwachten Lernverfahrens
zu klassifizieren und krankheitsspezifische Muster in den Massenspektren
zu finden.
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Bei
jeder Art von Klassifizierung, also auch einer histologischen Klassifizierung
von Gewebeschnitten, treten verschiedene Arten von Zuordnungsfehlern
auf. Aus diesen ergeben sich statistische Kenngrößen,
die die Güte der Klassifizierung festlegen. Zu den Kenngrößen
zählen die Sensitivität (Richtig-Positiv-Rate),
die Spezifität (Richtig-Negativ-Rate), die Falsch-Positiv-Rate
(Fehlalarm), die Falsch-Negativ-Rate. Es gibt zudem die Wahrscheinlichkeit,
dass ein Gewebeschnitt bei einer positiven Diagnose tatsächlich
den entsprechenden Krankheitszustand aufweist (Relevanz) bzw. dass
ein Gewebeschnitt bei einer negativen Diagnose tatsächlich den
Krankheitszustand nicht aufweist. Des Weiteren lassen sich die Korrektklassifikationsrate
und Falschklassifikationsrate angeben.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, die Güte der histologischen
Klassifizierung von Gewebeschnitten zu verbessern.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen
Patentansprüchen 2 bis 19 ausgeführt.
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Die
Erfindung besteht darin, dass ein massenspektrometrisches und ein
optisches Bild von einem einzelnen Gewebeschnitt aufgenommen werden,
wobei das optische Bild eine höhere Ortsauflösung
als das massenspektrometrische Bild aufweist, und dass optische
Informationen, die Strukturen eines Teilgebietes des Gewebeschnittes
betreffen, mit massenspektrometrischen Informationen des Teilgebietes
verknüpft werden, wobei die Strukturen im massenspektrometrischen
Bild nicht räumlich aufgelöst sind. Das Teilgebiet
kann dabei beispielsweise nur eine einzelne Zelle umfassen.
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Das
optische Bild weist dabei bevorzugt eine fünffach bis zweihundertfach
höhere Ortsauflösung als das massenspektrometrische
Bild auf. Die Ortsauflösung des massenspektrometrischen
Bildes liegt typischer Weise zwischen zehn und zweihundert Mikrometer,
während die Ortsauflösung des optischen Bildes
unter zwei Mikrometer beträgt.
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Aus
dem Stand der Technik ist zwar bekannt, dass ein optisches Bild
und ein massenspektrometrisches Bild von einem einzigen Gewebeschnitt
aufgenommen werden. Allerdings werden die optischen Bilder bisher
für eine Orientierung im massenspektrometrischen Bild bzw.
für eine Zuordnung der massenspektrometrischen Informationen
auf grobe Gewebestrukturen verwendet. Es ist aber möglich,
von einem einzelnen Gewebeschnitt ein massenspektrometrisches und
ein optisches Bild aufzunehmen, wobei überraschenderweise
die Ortsauflösung des optischen Bildes bezogen auf herkömmliche
histologische Anforderungen nicht vermindert ist. Dies gilt insbesondere
auch für den bevorzugten Fall, dass die bildgebende massenspektrometrische
Analyse (also die Aufnahme des massenspektrometrischen Bildes) vor
der Aufnahme des optischen Bildes erfolgt. Es stehen damit zwei
unabhängige inhaltsreiche Informationsquellen ohne Qualitätseinschränkungen
zur Verfügung, mit denen unabhängig voneinander
eine histologische Klassifizierung möglich ist, deren erfindungsgemäße
Verknüpfung aber die Güte der histologischen Klassifizierung
entscheidend verbessert. Im Gegensatz zum Stand der Technik werden
also beide Arten von Informationen für die histologische Klassifizierung
verwendet, wodurch in einigen Fällen eine Klassifizierung
mit hinreichender Güte überhaupt erst ermöglicht
wird.
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Die
optischen Informationen, die für eine histologische Klassifizierung
relevant sind, werden in bekannter Weise aus dem optischen Bild
abgeleitet und betreffen beispielsweise die Form und Anordnung von
Zellen oder die Form von intrazellulären Strukturen (wie
z. B. Zellkerne, endoplasmatisches Retikulum, Mitochondrien), und
zwar jeweils unter Berücksichtigung der verwendeten Färbung
des Gewebeschnittes.
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Um
die optischen Informationen über die Strukturen in einem
Teilgebiet des Gewebeschnittes zu erhalten, wird in bevorzugter
Weise ein Ausschnitt des optischen Bildes, das das Teilgebiet vollständig oder
teilweise enthält, vergrößert dargestellt.
In besonders bevorzugter Weise werden mehrere Ausschnitte des optischen
Bildes, die alle das Teilgebiet vollständig oder teilweise
enthalten, gleichzeitig oder nacheinander vergrößert
dargestellt, wobei die Lage und/oder die Vergrößerung
der Ausschnitte unterschiedlich sind. Um eine vergrößerte
Darstellung eines Ausschnittes des optischen Bildes zu erhalten, kann
einerseits ein zweites optisches Bild aufgenommen werden, das dem
Ausschnitt mit entsprechender Vergrößerung entspricht.
Es kann andererseits aus dem bereits aufgenommenen optischen Bild
des Gewebeschnittes eine vergrößerte Darstellung
eines Ausschnittes berechnet werden. In diesem bevorzugten Fall
spricht man von einem „virtuellen Mikroskop”, da
die Vergrößerung eines Ausschnittes oder auch die
Rückkehr zu einem Ausschnitt mit geringerer Vergrößerung
rein rechnerisch ohne die physikalische Aufnahme eines neuen optischen
Bildes erfolgt.
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Die
geringere Ortsauflösung des massenspektrometrischen Bild
wird durch den hohen molekularen Informationsgehalt der Massenspektren
ausgeglichen. Die massenspektrometrischen Informationen können
neben einem lokalen Massenspektrum, das dem Teilgebiet bzw. dessen Umgebung
zugeordnet ist, auch Unterschiede des lokalen Massenspektrums zu
Massenspektren sein, die anderen Teilgebieten des Gewebeschnittes
zugeordnet sind, oder zu Massenspektren aus anderen Datenquellen
(z. B. Datenbanken) sein. Des Weiteren bestehen massenspektrometrische
Informationen bevorzugt darin, dass das lokale Massenspektrum mit
Hilfe einer statistischen Analyse einer Klasse oder mehreren Klassen
zugeordnet wird. Dafür wird das lokale Massenspektrum in
der Regel mit Massenspektren von anderen Teilgebieten des Gewebeschnittes
und/oder mit Massenspektren aus anderen Datenquellen verglichen.
Entsprechende statistische Analyse sind beispielsweise: Neuronale
Netze (z. B.: Linear Vector Quantization (LVQ), Neural Gas (NG),
Self-Organizing Map (SOM)), Support-Vector-Maschinen (SVM), Genetische
Algorithmen zur Clusteranalyse, Hauptkomponentenanalyse (Principal
Component Analysis (PCA)), Entscheidungsbäume oder Nächste-Nachbarn-Klassifikatoren
(k-Nearest-Neighbor (KNN)). Die Klassen entsprechen denen der histologischen Klassifizierung
und betreffen die in dem Gewebeschnitt vorkommenden Gewebearten,
Differenzierungen des Gewebes, Krankheitserreger und Krankheitszustände.
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Es
werden hier auch sogenannte Peaklisten oder reduzierte Massenspektren
als Massenspektren aufgefasst. Eine Peakliste ist eine Liste von
Wertepaaren, die aus einem gemessenen Rohspektrum extrahiert werden
und die jeweils die Masse und die Signalstärke einer Signalspitze
(„peak”) in dem gemessenen Rohspektrums enthalten.
Ein reduziertes Massenspektrum enthält nur die Signale
eines oder mehrerer Massefenster, die in der Regel durch den Anwender
festgelegt werden.
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Um
einen Gewebeschnitt mit ausreichender Güte histologisch
klassifizieren zu können, kann es erforderlich sein, dass
jeweils die optischen und massenspektrometrischen Informationen
von mehreren Teilgebieten des Gewebeschnittes verknüpft
werden. Die histologische Klassifizierung kann auf einen Bereich
oder mehrere Bereiche des Gewebeschnittes eingeschränkt
sein und sich insbesondere auf eine einzelne Zelle oder mehrere
einzelnen Zelle beziehen.
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Beschreibung der Abbildungen
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Die 1 zeigt
in den Schritten A bis E, dass von einem Gewebeschnitt (1)
zuerst ein massenspektrometrisches Bild (20) und danach
ein optisches Bild (30) aufgenommen wird, wobei die Ortsauflösung
des massenspektrometrische Bild (20) etwa 30 Mikrometer
und die Ortsauflösung des optischen Bildes (30)
etwa einen halben Mikrometer beträgt.
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Die 2 zeigt
in den Schritten F und G, dass ein Teilgebiet (40) des
Gewebeschnittes (1) ausgewählt wird, ein das Teilgebiet
(40) enthaltender Ausschnitt (50) des optischen
Bildes (30) vergrößert dargestellt wird
und optische Informationen über Zellen (31, 33, 35)
in dem Teilgebiet (40) mit massenspektrometrischen Informationen
des Teilgebietes (40) verknüpft werden, um den
Gewebeschnitt (1) histologisch zu klassifizieren. Das Teilgebiet
(40) ist dabei im massenspektrometrischen Bild (20)
nicht räumlich aufgelöst.
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Bevorzugte Ausführungsbeispiele
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Die 1 und 2 zeigen
in den Schritten A bis G ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
des erfindungsgemäßen Verfahrens zur histologischen Klassifizierung
eines Gewebeschnittes.
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Im
Schritt A wird ein etwa zehn Mikrometer dicker Gewebeschnitt (1)
auf einem Objektträger (3) bereitgestellt. Dafür
wird eine Gewebeprobe zuerst durch Gefrieren stabilisiert und anschließend
mit einem Mikrotom geschnitten.
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Im
Schritt B wird eine Matrixschicht (
6) auf den Gewebeschnitt
(
1) aufgebracht. Die Vorrichtung (
4) ist in der
Patentschrift
DE
10 2006 019 530 B4 beschrieben und erzeugt aus einer gelösten
Matrixsubstanz vibrativ einen Nebel (
5) aus kleinen Tröpfchen, die
sich auf dem Gewebeschnitt (
1) absetzen und trocknen. Das
Vernebeln und anschließende Trocknen der Matrixtröpfchen
auf dem Gewebeschnitt (
1) wird zyklisch wiederholt, bis
die Matrixschicht (
6) optimal für eine bildgebende
massenspektrometrische Analyse geeignet ist.
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Im
Schritt C wird ein massenspektrometrisches Bild (20) des
in Schritt B präparierten Gewebeschnittes (1)
aufgenommen. Der Gewebeschnitt (1) wird mit Laserpulsen
eines fokussierten Laserstrahls (7) abgerastert. Jeder
Rasterpunkt wird dabei mindestens einmal mit einem Laserpuls bestrahlt.
Die durch den MALDI-Prozess erzeugten Ionen (8) werden
in einem nicht dargestellten Flugzeitmassenspektrometer analysiert,
so dass jedem Rasterpunkt ein Massenspektrum zugeordnet ist. Das
massenspektrometrische Bild (20) weist damit neben zwei räumlichen
Achsen (X, Y) auch eine Massenachse (m/z) auf, d. h., man erhält
für jede einzelne Masse ein zweidimensionales Bild.
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Die
Ionen werden in einem Massenspektrometer prinzipiell nach ihrem
Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z, auch „ladungsbezogene
Masse” genannt) getrennt. Aus einem gemessenen Massenspektrum
lässt sich die ladungsbezogene Masse m/z und daraus ihre
physikalische Masse m bestimmen. Da die Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption im Wesentlichen nur einfach geladene Ionen liefert,
wird im Folgenden vereinfachend nur von der „Masse” und
nicht der „ladungsbezogenen Masse” gesprochen.
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Die
Ortsauflösung wird in der bildgebenden massenspektrometrischen
Analyse in der Regel durch die Präparation des Gewebeschnittes
(1) begrenzt und beträgt hier etwa 30 Mikrometer.
Der Fokusdurchmesser des Laserstrahls (7) ist dementsprechend
angepasst. Um von einem Rasterpunkt zum nächsten zu gelangen,
wird der Objektträger (3) mit einer nicht dargestellten
Bewegungsvorrichtung entlang der X- und Y-Achse verschoben.
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Die
massenspektrometrische Analyse kann prinzipiell in verschiedenartigen
Massenspektrometern durchgeführt werden. Es werden für
die bildgebende massenspektrometrische Analyse derzeit meistens
Flugzeitmassenspektrometer (Time-Of-Flight Mass Spectrometer = TOF-MS)
mit oder ohne Reflektor eingesetzt. Es können aber beispielsweise
auch Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss,
Ionenfallen oder Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer verwendet
werden.
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Im
Schritt D wird die Matrixschicht (6) vom Gewebeschnitt
(1) abgelöst, beispielsweise durch aufeinanderfolgendes
Waschen mit Methanol und Aceton. Danach wird der freigelegte Gewebeschnitt (1)
nach einem histologischen Standardprotokoll mit Hämatoxylin-Eosin
gefärbt.
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Im
Schritt E wird ein optisches Bild (30) des Gewebeschnittes
(1) mit einem hochauflösenden lichtoptischen Scanner
(9) aufgenommen, wie er in der histologischen Klassifizierung
von gefärbten Gewebeschnitten üblich ist. Obwohl
die Ortsauflösung im massenspektrometrischen Bild (20)
nur 30 Mikrometer beträgt, ist der Scanner (9)
so eingestellt, dass das optische Bild (30) eine Ortsauflösung
von nur einen halben Mikrometer aufweist. Der Abstand von zwei räumlich
aufgelösten Bildpunkten ist im optischen Bild (30)
also etwa sechzigfach kleiner als im massenspektrometrischen Bild
(20). Die Achsen des optischen Bildes (30) sind
deshalb anders gekennzeichnet (X*, Y*). Es ist überaus überraschend,
dass der Informationsgehalt des optischen Bildes (30) nicht
oder nur sehr geringfügig dadurch eingeschränkt
wird, dass zuvor die Matrixschicht (6) auf den Gewebeschnitt
(1) aufgebracht und wieder abgelöst wird.
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Im
Schritt F wird ein Teilgebiet (40) des Gewebeschnittes
(1) ausgewählt. Das Teilgebiet (40) liegt
in einem Ausschnitt (50) des optischen Bildes (30).
Da beide Bilder (20, 30) von einem einzelnen Gewebeschnitt
(1) stammen, sind die beiden Bilder (20, 30)
deckungsgleich, so dass eine räumliche Zuordnung zwischen
den Bildpunkten der beiden Bilder (20, 30) leicht
möglich ist. Die Auswahl des Teilgebietes (40)
kann sowohl im optischen Bild als auch im massenspektrometrischen
Bild erfolgen.
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Das
massenspektrometrische Bild (20) wird hier bevorzugt so
reduziert, dass nur das Signal einer einzelnen Masse oder die Signale
von wenigen Massen dargestellt werden. Im letzteren Fall können
unterschiedlichen Massen beispielsweise farblich codiert werden.
Eine besonders bevorzugte Art der reduzierten Darstellung besteht
darin, dass jedes Massenspektrum mit Hilfe einer statistischen Analyse
einer Klasse oder mehreren Klassen zugeordnet wird und nur die Verteilung
der Klassenzugehörigkeit bildlich dargestellt wird.
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Im
Schritt G werden optische Informationen über Strukturen
in dem Teilgebiet (40) mit massenspektrometrischen Informationen
des Teilgebietes (40) verknüpft werden, um den
Gewebeschnitt (1) zumindest im Teilgebiet (40)
histologisch zu klassifizieren.
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Um
die optischen Informationen zu gewinnen, wird der Ausschnitt (50)
des optischen Bildes (30) vergrößert
dargestellt, und zwar mit einem virtuellen Mikroskop. Die Ortsauflösung
im optischen Bild (30) ist so hoch, dass die Zellen (31, 33, 35)
im Teilgebiet (40) und ihre intrazelluläre Strukturen,
wie z. B. die Zellkerne (32, 34, 36),
räumlich aufgelöst werden. Die optischen Informationen
beziehen sich hier auf die unterschiedliche Färbung der
Zelle (31) gegenüber den umliegenden Zellen (33, 35)
und auf die unterschiedliche Form ihres Zellkerns (32).
Es ist weiterhin möglich, dass nacheinander mehrere Ausschnitte
vergrößert dargestellt werden, wobei die Lage
und/oder die Vergrößerung der Ausschnitte unterschiedlich
sind. Das virtuelle Mikroskop erlaubt es auch, in das Teilgebiet
(40) weiter hineinzuzoomen.
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Im
massenspektrometrischen Bild (20) sind innerhalb des Teilgebietes
(40) keine Strukturen räumlich aufgelöst
werden. Die massenspektrometrischen Informationen beziehen sich
somit zum einen auf ein lokales Massenspektrum (21), das
der Umgebung des Teilgebietes (40) zugeordnet ist. Die
Umgebung wird durch die Ortsauflösung des massenspektrometrischen
Bildes (20) und die Lage des Teilgebietes (40)
zum Raster des massenspektrometrischen Bildes (20) festgelegt.
Zum zweiten ist ein Differenzspektrum (22) zwischen dem
lokalen Massenspektrum (21) und einem Referenzspektrum
einer Datenbank dargestellt, wobei diejenigen Signale, die nur im lokalen
Massenspektrum (21) vorhandenen sind, durchgezogen dargestellt
sind und diejenigen Signale, die nur im Referenzspektrum vorhanden
sind, gestrichelt dargestellt sind. Des Weiteren wird das lokale
Massenspektrum (21) mit Hilfe einer statistischen Analyse
den Klassen A, B und C zugeordnet, wobei die Klasse A für
einen positiven Befund, die Klasse B für einen negativen
Befund und die Klasse C für eine fehlgeschlagene Zuordnung
zu den Klassen A und B steht. Die Zuordnung (23) ist hier
unscharf und entspricht einer Wahrscheinlichkeit für die
Klassenzugehörigkeit.
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Durch
die Verknüpfung der beiden unterschiedlichen Informationsquellen
wird die Güte der histologischen Klassifizierung entscheidend
verbessert. Um den ganzen Gewebeschnitt (1) an verschiedenen
Stellen zu klassifizieren bzw. die Güte der Klassifizierung
weiter zu erhöhen, können die Schritte F und G
in anderen Teilgebieten wiederholt werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - US 5808300
A [0011]
- - DE 102006019530 B4 [0012, 0030]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Luxembourg
et al., Analytical Chemistry, 76(18), 2004, 5339–5344: „High-Spatial
Resolution Mass Spectrometric Imaging of Peptide and Protein Distributions
on a Surface” [0011]
- - Schwamborn et al. (International Journal of Molecular Medicine,
20, 155–157, 2007: ”Identifying prostate carcinoma
by MALDI-Imaging”) [0014]