DE19633441C1 - Verfahren und Vorrichtung für die genaue Massenbestimmung in einem Flugzeitmassenspektrometer - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die genaue Massenbestimmung von Analytionen in hochauflösenden Flugzeitmassenspektrometern, in denen die Ionen durch eine Ionisierung der Analytsubstanzen auf einem Probenträger erzeugt werden, beispielsweise durch matrixunterstützte Laserdesorp­ tion (MALDI). Im besonderen betrifft es Verfahren und Vorrichtungen zum Konstanthalten einmal kalibrierter Massenskalen anhand interner Referenzsubstanzen.

Es gibt mehrere verschiedenartige Verfahren, mit denen Substanzen auf der Oberfläche eines Probenträgers ionisiert werden können. Dazu gehören Ionenbeschuß (Sekundärionen-Massen­ spektrometrie = SIMS), Laserdesorption (LD), Schockwellen und die sogenannte Plasma­ desorption (PD), die durch hochenergetische Spaltungsteilchen ausgelöst wird. Weiteste Ver­ breitung hat die matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) gefunden. Die Ionen haben bei allen Verfahren nach Verlassen der Oberfläche in der Regel eine nicht vernachlässigbare Ge­ schwindigkeit mit starker Streuung um eine mittlere Geschwindigkeit Soll ein solches Verfah­ ren mit einem Flugzeitmassenspektrometer gekoppelt werden, so ist eine kurzzeitige Ionener­ zeugung erforderlich. Die mittlere Geschwindigkeit führt zu einer nichtlinearen Beziehung zwi­ schen Flugzeit und Wurzel aus der Masse. Die Streuung führt zu einer Unschärfe beim Messen der Signale der einzelnen Ionenmassen, es gibt jedoch Verfahren, diese Unschärfe wieder zu kompensieren. Im Folgenden werde insbesondere auf das MALDI-Verfahren eingegangen, ohne daß aber die Schlußfolgerungen auf dieses Verfahren allein beschränkt sein sollen.

Für die Ionisierung von großen Probenmolekülen durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) werden die großen Probenmoleküle auf einem Probenträger in oder auf eine Schicht einer niedermolekularen Matrixsubstanz gelagert. Ein Lichtpuls von wenigen Nanosekunden Dauer aus einem Laser, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird, verdampft in einem qua­ si-explosiven Prozeß eine geringe Menge der Matrixsubstanz, wobei auch die Probenmoleküle in die zunächst winzige Dampfwolke überführt werden.

Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Probensubstanz, die dabei höhere kinetische Energien erhalten, als sie dem thermischen Gleichgewicht entsprächen. Selbst ohne ein beschleunigendes Feld errei­ chen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 500 bis 1000 Metern pro Sekunde, ab­ hängig von der Energiedichte des Laserstrahls; die Geschwindigkeiten sind dabei weitgehend unabhängig von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwindigkeitsstreuung, die von etwa 200 bis zu 2000 Metern pro Sekunde reicht. Es ist anzunehmen, daß auch die neutra­ len Moleküle der Wolke diese Geschwindigkeiten besitzen.

Die Ionen werden in der Ionenquelle mit elektrischen Feldern auf Energien von rund 10 bis 30 keV beschleunigt, in die Flugstrecke des Massenspektrometers eingeschossen und am Ende der Flugstrecke zeitaufgelöst detektiert. Aus ihrer Flugzeit kann ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis bestimmt werden. Da diese Art der Ionisierung praktisch nur einfach geladene Ionen liefert, wird im Folgenden meist nur von der Massenbestimmung gesprochen, nicht von der Bestim­ mung des Masse-zu-Ladungsverhältnisses. Die Umrechnung der Flugzeiten in Massen wird über eine Kalibrierkurve vorgenommen, wobei die Aufnahme dieser Kalibrierkurve als "Kali­ brierung der Massenskala" des Flugzeitspektrometers bezeichnet wird. Die Kalibrierkurve kann als Punktfolge im Speicher des Datenverarbeitungssystems abgelegt sein, aber auch in Form der Speicherung von Parameterwerten für eine mathematisch als Formel gegebene Funktion.

Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der Probenmoleküle, ionisiert. Aber auch während der Ausdehnung der Dampfwolke findet durch weitere Ionen-Molekül-Reaktionen eine fortlaufende Ionisierung der großen Moleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt. Die große Streuung der Ge­ schwindigkeiten und der zeitverschmierte Bildungsprozeß der Ionen beeinträchtigen und be­ grenzen die Massenauflösung sowohl von linearen wie auch von energiefossierend reflektie­ renden Flugzeitmassenspektrometern. Eine Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten allein ließe sich mit dem energiefokussierenden Reflektor ausfokussieren, die zeitverschmiert entstehenden Ionen jedoch nicht.

Ein Verfahren für eine Erhöhung des Massenauflösungsvermögens unter diesen Bedingungen ist bekannt und in der Arbeit "Mass Resolution Improvement by Incorporation of Pulsed Ion Extraction in a Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Linear Time-of-Flight Mass Spectrometer" von R. S. Brown und J. J. Lennon, Anal. Chem. 67, 1998 (1995) beschrieben. Die Ionen der Wolke werden zunächst für eine kurze Zeit in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleunigung fliegen gelassen. Die schnelleren Ionen entfernen sich dabei weiter von der Probenträger-Elektrode als die langsamen, aus der Geschwindigkeits-Verteilung der Ionen ergibt sich dabei eine Ortsverteilung. Erst dann wird die Beschleunigung der Ionen durch ein homogenes Beschleunigungsfeld, also mit einem linear abfallenden Beschleunigungspoten­ tial, eingeschaltet. Die schnelleren Ionen befinden sich dann weiter von der Probenträger- Elektrode entfernt, somit auf einem etwas geringeren Beschleunigungspotential, das ihnen eine etwas geringere Endgeschwindigkeit für die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu Beginn langsameren Ionen. Bei richtiger Wahl der Verzögerungszeit ("time lag") und des Potentialabfalls (also des Beschleunigungsfeldes) können die zu Beginn langsameren, aber nach Beschleunigung schnelleren Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleuni­ gung langsameren Ionen genau am Detektor wieder einholen. Es werden somit Ionen am Ort des Detektors in bezug auf die Masse dispergiert, aber bei gleicher Masse in bezug auf die Flugzeit in erster Ordnung fokussiert. Damit erreicht man eine hohe Massenauflösung in einem linearen Flugzeitmassenspektrometer. Die Einschaltung der Beschleunigung muß nicht mit einem Schalten der gesamten Beschleuni­ gungsspannung verbunden sein. Die Schaltung so hoher Spannungen in extrem kurzen Zeiten von wenigen Nanosekunden ist auch heute noch fast unerreichbar und mit hohen Kosten ver­ bunden. Man kommt mit dem Schalten einer Teilspannung aus, wenn man in die Beschleuni­ gungsstrecke eine Zwischenelektrode einbaut. Es braucht dann nur der Raum zwischen Pro­ benträgerelektrode und Zwischenelektrode zunächst feldfrei sein und nach Zeitverzögerung in ein Beschleunigungsfeld umgeschaltet werden. Der Abstand des Probenträgers zur Zwischene­ lektrode soll möglichst klein sein, um möglichst geringe Spannungen schalten zu können. Es besteht eine Untergrenze für diesen Abstand bei etwa einem Millimeter, der aber für praktische Konstruktionen von Ionenquellen kaum in Frage kommt.

Das Bestreben nach einer guten Massenauflösung hat primär seinen Sinn darin, zu einer guten Massenbestimmung zu gelangen. Es hat sich aber seit der Einführung dieser Methode gezeigt, daß die prinzipiell gegebene Möglichkeit für eine gute Massenbestimmung nicht immer auch zu einer richtigen Massenbestimmung führt. Die Funktion, die die Masse in Abhängigkeit von der Flugzeit beschreibt, also die einkalibrierte Massenskala, ist bei der Ionisierung durch MALDI häufig nicht konstant. Für ein Ion der Masse 5000 atomaren Masseneinheiten (u) kann das Ergeb­ nis der Massenberechnung von Spektrenaufnahme zu Spektrenaufnahme im Extremfall um mehrere Masseneinheiten schwanken.

Es ist daher für genaue Massenbestimmungen üblich geworden, die Massen der zu bestimmen­ den Analytionen durch gleichzeitige Aufnahme der Ionen beigemischter bekannter Substanzen (sogenannter "interner Referenzsubstanzen") zu korrigieren. Als einfachste Methode wurde dabei die Masse der Analytsubstanzen durch lineare Extrapolation auf einer als linear ange­ nommenen Beziehung zwischen Flugzeit und der Wurzel aus der Masse korrigiert. Als Refe­ renzmassen wurden die bekannten Ionen der Matrix, besonders dessen dimeres Ion, genom­ men. Diese Methode führt zu einer wesentlich verbesserten Genauigkeit der Massenbestim­ mung, die in der Größenordnung von etwa 200 ppm liegt. Damit ergibt sich für das Ion der Masse 5000 u aber immer noch eine Unsicherheit von einer Masseneinheit.

Unter der Annahme, daß die Anfangsgeschwindigkeit der Ionen keine Rolle spielt, ist die Beziehung zwischen der Flugzeit der Ionen und der Wurzel aus ihrer Mas­ se streng linear. Eine theoretische Analyse ergibt, daß diese Bezie­ hung durch die Existenz einer mittleren Anfangsgeschwindigkeit der Ionen nicht mehr linear ist, son­ dern ein schwaches quadratisches Glied besitzt, das nicht vernachlässigt werden kann. Das quadratische Glied wird auch durch die Verbesserung des Auflösungsvermögens durch eine zeitverzögert einsetzende Beschleunigung der Ionen (häufig mit "delayed extraction" bezeich­ net) nicht beseitigt.

Durch die mathematische Ableitung dieser theoretisch erhaltenen Beziehung nach verschiede­ nen instrumentellen oder verfahrenstechnischen Parametern konnten wir die Kritizität dieser Parameter prüfen. Dabei stellten wir fest, daß ein instrumentell nicht völlig konstant zu halten­ der Parameter einen überragenden Einfluß hat: der Abstand d des Probenträgers von der ersten Beschleunigungsblende (der Zwischenelektrode im Falle der verzögert einsetzenden Beschleu­ nigung). Von kleinerem Einfluß ist die mittlere Geschwindigkeit v der Ionen beim Einsetzen der Beschleunigung. Alle übrigen Parameter sind Spannungen oder geometrische Abmessun­ gen, die sehr präzise konstant gehalten werden können.

Verschiebungen der Massenskala gegenüber der Kalibration ergeben sich teilweise bereits da­ durch, daß die Probenaufträge verschieden dick ausfallen. Nach der heute noch weitestverbrei­ teten Methode werden die Proben in Lösung, zusammen mit gelöster Matrixsubstanz, auf den Probenträger aufgebracht. Es ist dabei das Ziel, kleine Kristalle der Matrix zu erzeugen, die Probenmoleküle aufnimmt. Das Wachstum dieser Kristalle läßt sich dabei nicht steuern; es entstehen einmal große Kristalle, ein anderes Mal kleine.

Moderne Probenträger sollen Tausende von Proben aufnehmen; daher sind sie großflächig aus­ gebildete Probenträger von mehr als 100 Millimeter Länge werden angestrebt. Die Probenträ­ ger werden über Schleusen ins Vakuumsystem des Massenspektrometers eingeführt und wer­ den dort von einer Halterung aufgenommen, die von einer Bewegungsvorrichtung bewegt wird. Die Aufnahme in Gleitschienen der Halterung mit Positionierung durch Federdruck kann dabei wegen der Vakuumbedingungen nicht so präzise erfolgen wie erforderlich. Bei einer pa­ rallelen Verschiebung dieser Probenträger zur Spektrenaufnahme an verschiedenen Proben kann deshalb leicht eine Änderung des Abstandes d zur Zwischenelektrode in der Größenord­ nung von einigen Zehnteln Millimeter eintreten. Bei einer Änderung dieses Abstandes d um nur 100 Mikrometer verändert sich aber die Flugzeit der Ionen bereits so, daß das Signal eines Ions der Masse 5000 u um mehr als eine volle Masse auf der Massenskala verschoben erscheint.

Führen wir für die Wurzel aus dem Masse-zu-Ladungsverhältnis die Abkürzung

ein, so nimmt die Beziehung zwischen der Flugzeit t (gegebenenfalls ab verzögert eingeschalte­ ter Beschleunigung gemessen) und der Wurzel w folgende Form an:

wobei U die volle Beschleunigungsspannung, l eine reduzierte Flugstrecke, die nur von der Geometrie des Flugzeitspektrometers abhängt, und ΔU die Spannung zwischen Probenträger und der nächstliegenden Beschleunigungselektrode ist (gegebenenfalls der Zwischenblende für das verzögerte Einschalten der Beschleunigung). Wie bereits oben beschrieben, ist d der Ab­ stand zwischen dem Probenträger und der Zwischenblende, und v ist die mittlere Geschwindig­ keit der Ionen beim Einschalten der Beschleunigung. Der Term mit w² ist zwar klein gegenüber dem in w linearen Term, erlangt aber mit zunehmender Masse deutlichen Einfluß.

Bisher ist es nicht gelungen, eine elektrische Kompensation für einen variierenden Abstand d zu finden, um die einmal einkalibrierte Beziehung zwischen Flugzeit und Masse (also die Mas­ senskala) durch eine rein elektrische Justierung für alle Massen wiederherzustellen. Aus der Gleichung (2) ist eine solche elektrische Kompensation nicht zu ersehen, da eine Veränderung des Abstands d im linearen Glied über die Wurzel aus ΔU, im quadratischen dagegen linear mit ΔU kompensiert werden muß.

Durch die Verbesserung der Ionisierung mit dem MALDI-Verfahren kann man inzwischen die mittlere Geschwindigkeit v der Ionen beim Einschalten der Beschleunigung recht gut konstant halten, sie kommt außerdem nur in dem schwächeren quadratischen Glied vor. Insbesondere kann man durch die Verwendung von explosiven Matrixkomponenten die Abhängigkeit der Geschwindigkeit v von der Bestrahlungsdichte durch den Laser verringern.

Im Falle verzögert einsetzender Beschleunigung gilt außerdem, daß eine Änderung von ΔU, die so vorgenommen wird, daß sich wieder ein bestes Massenauflösungsvermögen ergibt, nicht auch gleichzeitig die Flugzeiten der Ionen restauriert. Diese Wiederherstellung des besten Auf­ lösungsvermögens muß das Beschleunigungsfeld, also die Relation d/ΔU, wieder auf seinen vorbestimmten Wert bringen.

Es ist seit langem üblich, über die gleichzeitige Aufnahme des Spektrums einer intern beige­ mischten Referenzsubstanz eine proportionale Korrektur der Masse des Analytions vorzuneh­ men. Da der Parameter d aber sowohl im linearen wie auch im quadratischen Term vorkommt, führt diese proportionale Korrektur mit der Wurzel aus der Masse nur zu einem Teilerfolg. Diese kann nur vorgenommen werden, wenn eine Referenzmasse gewählt wird, die nahe bei der Analytmasse liegt

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu finden, mit dem in Flugzeitmassenspektro­ metern mit einer Ionisierung oberflächlich aufgebrachter Proben sehr genaue Massenbestim­ mungen durchgeführt werden können. Im besonderen ist es die Aufgabe der Erfindung, die bisher in wechselnder Stärke auftretenden Verschiebungen der Ionenmassen auf der Mas­ senskala so zu korrigieren, daß die Kalibrierkurve für die Massenskala beibehalten werden kann und daß die Masse der Ionen bis weit über den Bereich von 5000 u hinaus mindestens auf eine Masseneinheit genau bestimmt werden kann.

Es ist nun der Grundgedanke der Erfindung, den Abstand d des Probenträgers zur Zwischen­ elektrode während der Messung mechanisch so nachzukorrigieren, daß die Flugzeit der Ionen und damit die Gültigkeit einer einmalig vorgenommenen Kalibrierung der Massenskala wieder­ hergestellt wird. Der Abstand d des Probenträgers von der Zwischenelektrode wird dabei über vorzugsweise elektromechanische Stellglieder so eingestellt, daß die Flugzeit der Ionen einer Referenzsubstanz den durch die Kalibrierung vorbestimmten Wert annimmt.

Wird durch die Einstellung des Abstands d die Flugzeit t eines gegebenen Referenzions richtig eingestellt, so stimmt nach Gleichung (2) auch die Abhängigkeit aller sonstigen Massen von der Flugzeit. Es ist somit die einkalibrierte Massenskala wieder gültig. Dabei wird eine Repro­ duzierbarkeit der Massenbestimmung erzielt, die sehr viel höher ist als die bisher angewandte proportionale Berücksichtigung der Referenzmasse.

Als Stellglieder für die Steuerung des Abstandes des Probenträgers von der Beschleunigungs­ blende können Piezoelemente, Bimetallelemente, aber auch motorische Stellglieder verwendet werden.

Die Flugzeit muß auf weit weniger als eine Nanosekunde genau eingehalten werden, wozu üblicherweise eine Schwerpunktsbildung des Linienprofils herangezogen wird. Das Linienprofil wird nach heutiger Technik durch einen Transientenrekorder mit 1 oder 2 Gigahertz abgeta­ stet. In der Regel werden die Messungen aus mehreren Meßzyklen aufaddiert, bevor die Schwerpunktsbildung vorgenommen wird.

Ist die Masse der Referenzionen viel kleiner als die der Analytionen, wie es beispielsweise bei der Benutzung der immer vorhandenen Matrixionen als Referenzionen der Fall ist, so kann ein besonderes Verfahren zur Verbesserung der Massengenauigkeit angewandt werden: Man kann die Beschleunigungsspannungen des Flugzeitspektrometers alle proportional herabsetzen, bei­ spielsweise von 30 Kilovolt auf 2 Kilovolt, und dann die Einstellung des Abstandes d anhand der Flugzeit der Matrixionen vornehmen. Die Flugzeit der Matrixionen muß dabei auf einen Wert eingestellt werden, der der neuen Kalibrierkurve für die Massenskala bei dieser erniedrig­ ten Spannung entspricht. Nach Rückkehr zu der hohen Spannung können dann die Analytionen richtig gemessen werden, da jetzt der Abstand d stimmt. Es ist dazu nicht einmal notwendig, die gesamte Massenskala für die erniedrigte Spannung kalibriert zu haben, es genügt, den Wert der Flugzeit für die Matrixionen zu kennen. Diese kann bei der Kalibrierung der Massenskala leicht mit gemessen werden. Die Einstellung der Spannungen kann heutzutage so präzise erfol­ gen, daß Spannungsungenauigkeiten keine Rolle spielen.

Für Probenträger mit kleiner Probenauftragsfläche ist in der Regel nur ein einziges Stellglied erforderlich, da die Parallelität im allgemeinen durch die Montage genügend gut gewährleistet ist.

Für MALDI-Probenaufträge verschiedener Dicke muß für jede Messung einer Probe auch eine Steuerung des Abstandes erfolgen. Dazu ist es erforderlich, bei der Messung der Analytionen auch immer Ionen einer Referenzprobe mitmessen zu können. In vielen Fällen können dazu Ionen der Matrix verwendet werden, beispielsweise die häufig auftretenden dimeren oder tri­ meren Ionen der Matrixsubstanz. Dabei kann das oben geschilderte besondere Verfahren mit einer Herabsetzung der Beschleunigungsspannungen verwendet werden. In anderen Fällen muß der Analytsubstanz eine geeignete Referenzsubstanz beigegeben werden.

Das Ziel der automatischen Messung von Tausenden von Proben macht immer größere Pro­ benträger erforderlich. Diese können durchaus so plan hergestellt werden, so daß der Einfluß der Abweichungen von der Planität auf den Abstand des Probenträgers vernachlässigt werden kann. Die Proben können auch sehr gleichmäßig dünn aufgetragen werden, auch hierdurch ergeben sich kaum Abweichungen. Aber die genaue Positionierung des Abstandes im Inneren des Vakuumsystems ist schwierig, da im Vakuum weder Schmierfette noch sehr enge Gleitto­ leranzen benutzt werden dürfen. Bei der Einführung der Probenträger in die Halterung und bei der Parallelbewegung des Probenträgers treten sehr leicht Abstandsänderungen zur Zwischene­ lektrode auf, die nach dieser Erfindung nachjustiert werden müssen.

Dazu sind für diese großen Probenträger mindestens drei Stellglieder notwendig, die möglichst randnahe am Halterahmen des Probenträgers angreifen sollen. Die Referenzproben sind zweck­ mäßigerweise an den Punkten des Probenträgers aufgebracht, unter denen sich die Stellglieder befinden. Dadurch wird die Einstellung des richtigen Abstandes für jede Stelle erleichtert. Ist die große Probenträgerplatte einmal an drei Stellen justiert (3-Punkt-Justierung), so können die Proben aller übrigen Positionen automatisch vermessen werden. Die Stellglieder werden dazu nach anfänglicher Justage nicht mehr bewegt.

Die Einhaltung des richtigen Abstands bewirkt aber nur dann auch eine Parallelität zur Be­ schleunigungsblende, wenn die Einrichtung zur parallelen Verschiebung des Probenträgers richtig justiert ist. Die Parallelität des Probenträgers ist für die Richtung des Ionenstrahls ver­ antwortlich. Da der Ionendetektor nur bei guter Parallelität durch den Ionenstrahl voll ausge­ leuchtet wird, hängt die Zahl der gemessenen Ionen und damit die Empfindlichkeit des Flug­ zeitspektrometers von dieser Parallelität ab.

Es ist nun eine weitere Idee dieser Erfindung, die Stellglieder auch für die Einstellung der Parallelität des Probenträgers zu benutzen, falls die Justage der Parallelverschiebungseinrich­ tung nicht vollkommen lotrecht zur Strahlrichtung erfolgte. Dazu ist es erforderlich, außer dem Abgleich des Abstandes der Prüfpunkte auch deren Parallelität einzustellen, und die drei Stellglieder auch bei der parallelen Verschiebung des Probenträgers entsprechend nachzufüh­ ren. Diese gleichmäßige Veränderung der drei Stellglieder während der Paralleleverschiebung kann nach dem Einbau der Bewegungseinrichtung ein einziges Mal einkalibriert und dann im­ mer wieder benutzt werden.

Ist der Probenauftrag ungleichmäßig dick, oder wird eine wellige Matrixfolie auf den Proben­ träger geklebt, so ist eine Abstandssteuerung für jede einzelne Probe notwendig. Dazu ist wie­ der eine immer mitgemessene Referenz notwendig.

Es ist ein besonderer Vorteil dieser Erfindung, daß durch die mechanische Einstellung des Ab­ standes auch immer automatisch die optimale Massenauflösung durch die verzögert einsetzen­ den Beschleunigung erreicht wird. Weder eine elektrische Kompensation eines variablen Ab­ standes d, der sowieso nur für einen kleinen Massenbereich erfolgen kann, noch eine rein rech­ nerische Korrektur der Massenskala während einer nachträglichen Datenauswertung kann diese optimale Massenauflösung erhalten oder wieder herstellen.

Es ist ein weiterer besonderer Vorteil der Erfindung, daß die Korrektur des Abstandes d auch die Fokussierung zweiter Ordnung in einem Flugzeitspektrometer mit Reflektor wiederher­ stellt. Die Wiedereinstellung des Soll-Abstands beseitigt die Ursache aller Abweichungen, und heilt nicht am Symptom.

Fig. 1 zeigt den Aufbau der Halterung für den Probenträger, wie er im Vakuumsystems des Massenspektrometers als Teil der Ionenquelle montiert ist. Die gesamte Halterung ist über eine Bewegungseinrichtung parallel zur Oberfläche des Probenträgers verschiebbar. Sie besteht aus folgenden Teilen:

1 = Aufnahmeplatte für den Probenträger mit Gleitschienen,
2 = Probenträger mit Proben 3, 4, 5 auf seiner Oberfläche,
3 = Referenzprobe über dem Stellglied 8,
4 = Referenzprobe über dem Stellglied 9,
5 = Proben des Analytmaterials,
6 = Isolator über dem Stellglied 8,
7 = Isolator über dem Stellglied 9,
8, 9 = Stellglieder zur Veränderung des Abstandes zwischen Aufnahmeplatte und Basisplatte (beispielsweise als Packung von Piezoelementen), das dritte Stellglied liegt nicht in der Zeichenebene und ist nur gestrichelt angedeutet,
10 = Basisplatte der Halterung,
11 = Bewegungseinrichtung für die Verschiebung der Halterung parallel zur Oberfläche des Probenträgers (also längs zweier Koordinaten).

Fig. 2 zeigt das Grundschema des Flugzeitmassenspektrometers. Die Ionenquelle besteht aus Laser 16, Probenträger 2 (eingeschoben in die Halterung 12) und Beschleunigungselektroden 13 und 14. Die in den Beschleunigungsstrecken zwischen Probenträger 2, Zwischenblende 13 und Grundblende 14 beschleunigten Ionen durchqueren als Ionenstrahl 19 die Flugstrecke zwi­ schen Grundelektrode 14 und Detektor 15 und werden am Detektor 15 zeitaufgelöst gemes­ sen. Der Abstand zwischen Probenträger 2 und Zwischenelektrode 13 ist durch die Stellglieder 8 und 9 (siehe Fig. 1) variabel.
12 = Halterung für den Probenträger 2 (in Fig. 1 im Detail wiedergegeben),
13 = Zwischenelektrode der Ionenquelle,
14 = Grundelektrode (schließt die Ionenquelle mit ihrer Ionenbeschleunigungseinrichtung ab),
15 = Ionendetektor,
16 = Pulslaser,
17 = Linse,
18 = fokussierter Lichtstrahl,
19 = Ionenstrahl, durchquert Flugstrecke zwischen Grundblende 14 und Detektor 15.

Das hier vorgestellte Verfahren der präzisen Massenbestimmung nach dieser Erfindung stützt sich auf eine Einrichtung, die in Fig. 1 und 2 gezeigt wird. Es wird dabei eine Ausführungs­ form mit einem großen Probenträger und drei Stellgliedern vorgestellt. Jedem Fachmann ist es geläufig, das Grundprinzip auf andere Probenträger, beispielsweise mit weniger Stellgliedern, zu übertragen.

Die Ausführungsform der Halterung für den großen Probenträger mit drei Stellgliedern ist schematisch in Fig. 1 gezeigt. Es sind in der Zeichnung nur die Stellglieder 8 und 9 bezeich­ net, das dritte Stellglied liegt nicht in der Zeichnungsebene und ist nur gestrichelt angedeutet.

Die Probensubstanzen 5 und die Referenzsubstanzen 3, 4 sind zusammen mit Matrixsubstanzen auf der Oberfläche des metallischen (oder metallisierten) Probenträgers 2 aufgebracht. Der Probenträger 2 wird durch eine (nicht gezeigte) Vakuumschleuse in das Vakuum des Massen­ spektrometers gebracht und dort automatisch in die Gleitnuten der Aufnahmeplatte 1 einge­ schoben. Der Probenträger 2 wird in den Gleitnuten durch Federn in einer Position gehalten, die sich auch bei leichten Erschütterungen des Spektrometers nicht verändert. Die Aufnahme­ platte 1 liegt auf der beschleunigenden Hochspannung und ist daher über Isolatoren 6 und 7 mit den Stellgliedern 8 und 9 verbunden. Die Stellglieder 8 und 9 sitzen auf der Basisplatte 10 der Halterung und erlauben eine geringfügige Änderung des Abstandes zwischen Basisplatte 10 und Probenträger 2. Der maximale Weg für diese Abstandsänderungen braucht nur etwa 200 Mikrometer zu betragen, wenn die Montage- und Halterungstoleranzen auf etwa 150 Mi­ krometer beschränkt werden können. Der Probenträger 2 läßt sich mitsamt Aufnahmeplatte, Isolatoren und Stellgliedern durch die Bewegungsvorrichtung 11 parallel zu seiner Proben­ oberfläche in zwei Richtungen verschieben, dadurch können sehr viele Proben nebeneinander aufgebracht und nacheinander analysiert werden.

Als Stellglieder können vorzugsweise Piezoelemente verwendet werden. So sind piezoelek­ trisch betriebene Biegescheibenelemente kommerziell erhältlich, die bei 50 Millimeter Durch­ messer und 12 Millimeter Höhe einen Höhenverstellweg von 200 Mikrometern bieten. Ein größerer Verstellweg kann durch Stapeln von Stellgliedern erreicht werden.

Die Probenträgerhalterung 12 mit ihrer Bewegungsvorrichtung 11 ist ein Teil der Ionenquelle des Flugzeitmassenspektrometers, wie in Fig. 2 gezeigt. Der Probenträger 2 dient dabei als erste Beschleunigungselektrode für die Ionen, er befindet daher auf der erforderlichen Hoch­ spannung, die im allgemeinen 10 bis 30 Kilovolt beträgt. Die Zwischenelektrode 13 befindet sich in der Beschleunigungsphase auf einem geringeren Potential, so daß sich zwischen dem Probenträger 2 und der Zwischenelektrode 13 ein erstes Beschleunigungsfeld für die Ionen ausbildet. Zwischen der Zwischenblende 13 und der Grundelektrode 14, die sich auf dem Po­ tential der Flugstrecke befindet, herrscht ein zweites Beschleunigungsfeld.

Bei Benutzung der oben bereits geschilderten verzögert einsetzenden Beschleunigung befindet sich die Zwischenelektrode zunächst auf dem Potential des Probenträgers, und wird nach der Verzögerungszeit von einigen zehn bis hundert Nanosekunden herabgeschaltet.

Mit dieser Anordnung eines Flugzeitmassenspektrometers können wie gewöhnlich Spektren der Analytsubstanzen aufgenommen werden. Die Spektrenaufnahme beginnt mit der Ionisie­ rung der Probensubstanzen auf dem Probenträger, wobei hier das MALDI-Verfahren zur Ioni­ sierung beschrieben wird. Die Ionen werden durch einen Lichtblitz von etwa 3 bis 5 Nanose­ kunden Dauer aus dem Laser 16 erzeugt. Gewöhnlich wird UV-Licht mit einer Wellenlänge von 337 Nanometer aus einem preiswerten Stickstoff-Laser benutzt. Der Lichtblitz ist durch die Linse 17 auf die Oberfläche des Probenträgers fokussiert. Nach ihrer Beschleunigung in den elektrischen Feldern zwischen den Elektrode 2, 13 und 14 durchlaufen sie die Flugstrecke des Massenspektrometers und werden am Ende der Flugstrecke vom Ionendetektor 15 gemes­ sen.

Der durch den Ionenstrahl gegebene zeitvariable Ionenstrom wird am Detektor gewöhnlich mit einer Abtastrate von 1 oder 2 Gigahertz gemessen und digitalisiert. Üblicherweise werden die zeitgleichen Meßwerte aus mehreren Spektrenaufnahmen addiert, bevor die Massenlinien in den gespeicherten Daten gesucht und über die Datenauswertung von der Zeitskala über die Massenkalibrierkurve in die Massenwerte transformiert werden.

Die Polarität der verwendeten Hochspannung für die Ionenbeschleunigung muß gleich der Po­ larität der untersuchten Ionen sein: Positive Ionen werden durch einen positiv geladenen Pro­ benträger abgestoßen und beschleunigt, negative Ionen durch einen negativ geladenen Proben­ träger.

Selbstverständlich kann man das Flugzeitmassenspektrometer auch so betreiben, daß sich die Flugstrecke in einem Rohr befindet, das sich auf dem Beschleunigungspotential befindet, wäh­ rend der Probenträger auf Grundpotential liegt. In diesem besonderen Fall liegt das Flugrohr auf positivem Potential, wenn negativ geladene Ionen untersucht werden sollen, und umge­ kehrt. Dieser Betrieb vereinfacht die Konstruktion der Ionenquelle, da die Isolatoren 6 und 7 entfallen können, bringt jedoch an anderen Stellen Nachteile mit sich.

Die Verbesserung der Spektrenaufnahme nach dem Verfahren dieser Erfindung hat das Ziel, zu besser reproduzierbaren Flugzeiten der Ionen zu kommen, und über einen kalibrierten Zusam­ menhang zwischen Flugzeit und Masse über die Messung der Flugzeit zu einer richtigeren Bestimmung der Masse zu gelangen.

Dieses Verfahren besteht darin, vor einer Spektrenaufnahme zur präzisen und genauen Mes­ sung der Massen zunächst anhand der Messung der Flugzeiten einer Referenzmasse den Ab­ stand d zu überprüfen und gegebenenfalls mit den hier eingeführten Stellgliedern neu einzure­ geln. Es wird dazu in einer ersten Probemessung die Flugzeit der Referenzionen gemessen und mit der Soll-Flugzeit verglichen. Besteht eine Abweichung, so wird der Abstand d über die Stellglieder korrigiert. Die Korrektur kann aus dem bekannten Verhalten der Stellglieder und der Abweichung der Flugzeit berechnet werden. Für sehr genaue Messungen ist eine Wieder­ holung der Referenzmessung mit einer zweiten Korrektur angebracht.

Für die Einstellung des Abstandes d ist es bequem, die Ionen der Matrix zu verwenden, da dann keine besondere Referenzsubstanz zugefügt werden muß. Dabei hat es sich gezeigt, daß die monomeren Ionen wegen ihrer viel zu hohen Intensität und der dadurch gegebenen Überla­ dung der Meßeinrichtung nicht gut geeignet sind, außerdem liegt ihre Masse so weit am unte­ ren Rande des nutzbaren Massenbereichs, daß die Extrapolation in den gewünschten Massen­ bereich hinein ungünstig wird. Es treten aber in den meisten Spektren dimere Ionen im richti­ gen Intensitätsbereich, manchmal sogar trimere oder noch höhere oligomere Ionen auf. Diese Linien sind sehr scharf und eignen sich auch besser wegen ihrer höheren Masse. Die Massen dieser Ionen sind aber immer noch sehr klein, verglichen mit schweren Analytionen. Sie liegen im allgemeinen im Massenbereich bis 1000 u.

Werden diese Ionen der Matrixsubstanz als Referenzmassen benutzt, so ist es zweckmäßig, die Beschleunigungsspannung der Ionen vor der Einstellung des Abstandes d herabzusetzen. Wird die Spannung um den Faktor 16 herabgesetzt (beispielsweise von 32 Kilovolt auf 2 Kilovolt), so verlängert sich die Flugzeit dieser Ionen um den Faktor 4. Damit kann der Abstand d präzi­ ser eingestellt werden. Es ist dann allerdings notwendig, die Soll-Flugzeit der Matrixionen für diese Beschleunigungsspannung zu kennen. Diese kann in einer vorhergehenden Kalibration gemessen werden.

Für große Probenträger mit drei Stellgliedern ist es zweckmäßig, die Referenzproben für die Abstandsregelung genau über den Orten der Stellglieder aufzubringen. Man erreicht dadurch, daß die Abstandsregelung eines Punktes in erster Näherung unabhängig von der Abstandsrege­ lung der beiden anderen Punkte wird. Die drei Abstandsregelungen für die drei Stellglieder können also unabhängig voneinander vorgenommen werden. Falls jeder Abstand in zwei Ein­ stellzyklen eingestellt wird, ist es zweckmäßig, zunächst den ersten Einstellzyklus für alle drei Punkte durchzuführen, und dann den zweiten Einstellzyklus.

Die hier wiedergegebenen Überlegungen für lineare Massespektrometer gelten in gleicher Wei­ se, wie jeder Fachmann nachvollziehen kann, auch für Flugzeitmassenspektrometer mit ener­ giefokussierenden Reflektoren. Dabei sind die Reflektorspannungen unter die oben genannten Beschleunigungsspannungen zu zählen.

Claims (6)

1. Verfahren für die genaue Massenbestimmung von Analytionen in einem Flugzeitmassen­ spektrometer anhand einer einmalig kalibrierten Massenskala, wobei eine Probe mit Ana­ lytmolekülen auf der Oberfläche eines Probenträgers zugeführt und auf dieser ionisiert wird und wobei die entstehenden Ionen beschleunigt und ihre Flugzeit gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe auch eine Referenzsubstanz enthält und daß der Abstand des Probenträgers von der nächstliegenden Beschleunigungsblende mechanisch so verändert wird, daß die Flugzeit der Ionen der Referenzsubstanz den durch die Massenskala vorgegebenen Wert annimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand automatisch geregelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) die monome­ ren, dimeren oder oligomeren Ionen der MALDI-Matrixsubstanzen als Referenzionen verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Benutzung leichter Referenzionen zur Einstellung des richtigen Abstandes alle Beschleunigungsspannungen vorübergehend proportional herabgesetzt werden, wobei die Flugzeit der Referenzionen auf einen für diese Verhältnisse gültigen Wert eingestellt wird.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Halterahmen für die Halterung des Probenträgers im Vakuumsystem vorgesehen ist, daß der Halterahmen an drei Punkten mit ortsveränderbaren Stellgliedern in Verbin­ dung steht und daß der Probenträger in der Nähe der drei Haltepunkte des Halterahmens Proben mit der Referenzsubstanz aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stellglieder piezoelektrisch, bimetallisch oder motorisch ausgebildet sind.