DE19633507C1 - Genaue Massenbestimmung mit MALDI-Flugzeitmassenspektrometern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die genaue Massenbestimmung von Analytionen in Flugzeitmassenspek­ trometern, die mit einer Ionisiserung der Analytsubstanzen auf Probenträgern durch matrix­ unterstützte Laserdesorption (MALDI) und einer Verbesserung der Massenauflösung durch zeitlich verzögerten Einsatz der Beschleunigung im Feld zwischen Probenträger und einer Zwi­ schenelektrode arbeiten. Im besonderen betrifft es Verfahren zum Konstanthalten einmal kali­ brierter Massenskalen bei ungewollten Abstandsänderungen des Probenträgers von der nächst­ liegenden Beschleunigungselektrode.

Ein Verfahren für die genaue Massenbestimmung mit den Maßnahmen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 ist aus dem weiter unten ausführlicher diskutierten Artikel von Brown und Lennon bekannt.

Die genaue Bestimmung der Ionenmassen wird auch für großemolekulare Ionen biogenen Materials immer wichtiger. So gibt beispielsweise allein die Molekülmasse von Glykoproteinen, Glykolipiden oder Oligosacchariden bereits Auskünfte auch über Strukturen, da die Genese der Biomoleküle durch vorgegebene Bildungsmechanismen die an sich mögliche extrem große Strukturvielfalt stark einschränkt. Die Massenbestimmung von Fragmentionen stützt und er­ weitert diese Aussagen. Aber auch in vielen anderen Anwendungen biochemischer und medi­ zinischer Art tritt die Massenbestimmung von Ionen biogenen Materials in den Vordergrund.

Unter den Verfahren zur Ionisierung von großmolekularen Substanzen auf Probenträgern hat die matrixunterstützte Desorption durch einen Laserblitz (MALDI) weiteste Verbreitung ge­ funden. Die Ionen haben nach Verlassen der Oberfläche in der Regel eine nicht vernachlässig­ bare mittlere Geschwindigkeit, die weitgehend für Ionen aller Massen gleich ist, und eine star­ ke Streuung um die mittlere Geschwindigkeit. Die mittlere Geschwindigkeit führt zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Flugzeit und Wurzel aus der Masse, also der Massenskala Die Streuung führt zu einer Unschärfe beim Messen der Signale der einzelnen Ionenmassen, es gibt jedoch Verfahren, diese Unschärfe wieder zu kompensieren.

Für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) werden die großen Probenmoleküle auf einem Probenträger in oder auf eine Schicht einer niedermolekularen Ma­ trixsubstanz gelagert. Ein Lichtpuls von wenigen Nanosekunden Dauer aus einem Laser, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird, verdampft in einem quasi-explosiven Prozeß eine geringe Menge der Matrixsubstanz, wobei auch die Probenmoleküle in die zunächst winzige Dampfwolke überführt werden.

Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Probensubstanz, die dabei höhere kinetische Energien erhalten, als sie dem thermischen Gleichgewicht entsprächen. Selbst ohne ein beschleunigendes Feld errei­ chen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 500 bis 1000 Metern pro Sekunde, ab­ hängig von der Energiedichte des Laserstrahls; die Geschwindigkeiten sind dabei weitgehend unabhängig von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwindigkeitsstreuung, die von etwa 200 bis zu 2000 Metern pro Sekunde reicht. Es ist anzunehmen, daß auch die neutra­ len Moleküle der Wolke diese Geschwindigkeiten besitzen.

Die Ionen werden in der Ionenquelle mit elektrischen Feldern auf Energien von rund 10 bis 30 keV beschleunigt, in die Flugstrecke des Massenspektrometers eingeschossen und am Ende der Flugstrecke zeitaufgelöst detektiert. Aus ihrer Flugzeit kann ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis bestimmt werden. Da diese Art der Ionisierung praktisch nur einfach geladene Ionen liefert, wird im Folgenden meist nur von der Massenbestimmung gesprochen, nicht von der Bestim­ mung des Masse-zu-Ladungsverhältnisses. Die Umrechnung der Flugzeiten in Massen wird über eine Kalibrierkurve vorgenommen, wobei die Aufnahme dieser Kalibrierkurve als "Kali­ brierung der Massenskala" des Flugzeitspektrometers bezeichnet wird. Die Kalibrierkurve kann als tabellarische Punktfolge im Speicher des Datenverarbeitungssystems abgelegt sein, aber auch in Form der Speicherung von Parameterwerten für eine mathematisch als Gleichung ge­ gebene Funktion der Masse in Abhängigkeit von der Flugzeit.

Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der Probenmoleküle, ionisiert. Aber auch während der Ausdehnung der Dampfwolke findet durch weitere Ionen-Molekül-Reaktionen eine fortlaufende Ionisierung der großen Moleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt. Die große Streuung der Ge­ schwindigkeiten und der zeitverschmierte Bildungsprozeß der Ionen beeinträchtigen und be­ grenzen die Massenauflösung sowohl von linearen wie auch von energiefossierend reflektie­ renden Flugzeitmassenspektrometern. Eine Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten allein ließe sich mit dem energiefokussierenden Reflektor ausfokussieren, die Zeitverschmierung der Ent­ stehung der Ionen jedoch nicht.

Es ist seit langem ein Verfahren für eine Erhöhung des Massenauflösungsvermögens unter die­ sen Bedingungen bekannt. Die Anwendung auf MALDI-Ionen ist von Robert S. Brown und John J. Lennon in Anal. Chef 1995, 67, Seiten 1998-2003 beschrieben. Die Ionen der Wolke wer­ den zunächst für eine kurze Zeit T in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleuni­ gung fliegen gelassen. Die schnelleren Ionen entfernen sich dabei weiter von der Probenträger­ elektrode als die langsamen, aus der Geschwindigkeitsverteilung der Ionen ergibt sich dabei eine Ortsverteilung. Erst dann wird die Beschleunigung der Ionen durch ein homogenes Beschleu­ nigungsfeld, also mit einem linear abfallenden Beschleunigungspotential, eingeschaltet. Die schnelleren Ionen befinden sich dann weiter von der Probenträger-Elektrode entfernt, somit auf einem etwas geringeren Beschleunigungspotential, das ihnen eine etwas geringere Endge­ schwindigkeit für die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu Beginn lang­ sameren Ionen. Bei richtiger Wahl der Verzögerungszeit τ und des Potentialabfalls (also der Stärke des Beschleunigungsfeldes) können die zu Beginn langsameren, aber nach Beschleuni­ gung schnelleren Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung langsameren Io­ nen genau am Detektor wieder einholen. Es werden somit Ionen am Ort des Detektors in be­ zug auf die Masse dispergiert, aber bei gleicher Masse in bezug auf die Flugzeit in erster Ord­ nung fokussiert. Damit erreicht man eine hohe Massenauflösung in einem linearen Flugzeit­ massenspektrometer. Es gibt ein ähnliches Verfahren für Flugzeitspektrometer mit Reflektoren, bei denen sogar eine Fokussierung zweiter Ordnung erzielt wird.

Das verzögerte Einschalten der Beschleunigung muß nicht mit einem Schalten der gesamten Beschleunigungsspannung U verbunden sein. Die Schaltung so hoher Spannungen in extrem kurzen Zeiten von wenigen Nanosekunden ist auch heute noch fast unerreichbar und mit hohen Kosten verbunden. Man kommt mit dem Schalten einer Teilbeschleunigungsspannung V aus, wenn man in die Beschleunigungsstrecke eine Zwischenelektrode einbaut. Es braucht dann nur der Raum zwischen Probenträgerelektrode und Zwischenelektrode, die einen relativ geringen Abstand d voneinander haben, zunächst feldfrei sein und nach Zeitverzögerung in ein Beschleu­ nigungsfeld der Stärke V/d umgeschaltet werden. Der Abstand d des Probenträgers zur Zwi­ schenelektrode soll möglichst klein sein, um möglichst geringe Spannungen V schalten zu kön­ nen. Es besteht eine Untergrenze für diesen Abstand bei etwa einem Millimeter, der aber für praktische Konstruktionen von Ionenquellen kaum in Frage kommt. In der Praxis beträgt dieser Abstand d etwa drei Millimeter.

Das Bestreben nach einer guten Massenauflösung hat ganz wesentlich seinen Sinn darin, zu einer guten Massenbestimmung zu gelangen. Es hat sich aber seit der Einführung dieser Me­ thode gezeigt, daß die prinzipiell gegebene Möglichkeit für eine gute Massenbestimmung nicht immer auch zu einer richtigen Massenbestimmung führt. Die Funktion, die die Masse in Ab­ hängigkeit von der Flugzeit beschreibt, also die einkalibrierte Massenskala, führt bei der Ioni­ sierung durch MALDI häufig zu fehlerhaften Massenbestimmungen. Für ein Ion der Masse 5000 atomarer Masseneinheiten kann das Ergebnis der Massenberechnung von Spektrenauf­ nahme zu Spektrenaufnahme im Extremfall um mehrere Masseneinheiten schwanken.

Es ist daher für genaue Massenbestimmungen üblich geworden, die Massen der zu bestimmen­ den Analytionen durch gleichzeitige Aufnahme der Ionen beigemischter bekannter Substanzen (sogenannter "interner Referenzsubstanzen") zu korrigieren. Als einfachste Methode wurde dabei die Masse der Analytsubstanzen durch lineare Extrapolation auf einer als linear ange­ nommenen Beziehung zwischen Flugzeit und der Wurzel aus der Masse korrigiert. Als Refe­ renzmassen wurden die bekannten Ionen der Matrix, besonders deren dimeres Ion, genommen. Diese Methode führt zu einer wesentlich verbesserten Genauigkeit der Massenbestimmung, die in der Größenordnung von etwa 200 ppm liegt. Damit ergibt sich für das Ion der Masse 5000 µ aber immer noch eine Unsicherheit von einer Masseneinheit.

Auch das Verfahren der Verbesserung der Massenauflösung durch verzögert einsetzende Be­ schleunigung hat für genaue Massenbestimmungen einen entscheidenden Nachteil: es liefert das optimale Massenauflösungsvermögen nur in einem schmalen Bereich der Massenskala. In den anderen Massenbereichen ist das Auflösungsvermögen zwar immer noch deutlich verbessert, doch nicht bis zum optimalen Grenzwert. Dieser Bereich optimaler Auflösung kann zwar durch Änderungen der Verzögerungszeit τ, in geringerem Maße auch durch Änderungen der Teilbe­ schleunigungsspannung V auf eine beliebige Stelle des Massenbereichs verschoben werden, aber dabei geht die Kalibrierung der Massenskala verloren.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine elektrische Kompensation eines veränderten Abstandes d zwischen Probenträger und Zwischenblende zu finden, die die einkalibrierte Massenskala innerhalb enger Fehlertoleranzen gültig bleiben läßt.

Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 gelöst.

Unter der Annahme, daß die Ionen keine Anfangsgeschwindigkeit haben, ist die Beziehung zwischen der Flugzeit der Ionen t und der Wurzel aus ihrer Masse streng linear. Durch die Existenz einer mittleren Anfangsgeschwindigkeit der Ionen ist diese Beziehung jedoch nicht mehr linear, sondern besitzt ein schwaches quadratisches Glied, das nicht vernachlässigt wer­ den kann. Das quadratische Glied wird auch durch die Verbesserung des Auflösungsvermögens durch eine zeitverzögert einsetzende Beschleunigung der Ionen (häufig mit "delayed extracti­ on" bezeichnet) nicht beseitigt.

Durch die mathematische Ableitung der theoretisch ableitbaren Beziehung nach verschiedenen instrumentellen oder verfahrenstechnischen Parametern konnten wir die Kritizität dieser Para­ meter prüfen. Dabei stellten wir fest, daß ein instrumentell nicht völlig konstant zu haltender Parameter einen überragenden Einfluß hat: der Abstand d des Probenträgers von der ersten Beschleunigungsblende, also der Zwischenelektrode. Von kleinerem Einfluß ist die mittlere Geschwindigkeit v der Ionen beim Einsetzen der Beschleunigung. Alle übrigen Parameter sind Spannungen oder andere geometrische Abmessungen, die sehr präzise konstant gehalten werden können.

Eine Änderung des Abstandes d um nur 100 Mikrometer verändert das Ergebnis einer Massen­ bestimmung um etwa 500 ppm, ein Ion der Masse 10000 u wird also bereits um fünf atomare Masseneinheiten falsch gemessen.

Führen wir für die Wurzel aus dem Masse-zu-Ladeverhältnis die Abkürzung

ein, so nimmt die Beziehung zwischen der Flugzeit t (gemessen ab Einsetzen der Beschleuni­ gung, also um die Zeit τ später als die Ionenerzeugung durch den Laserblitz) und der Wurzel w folgende sehr einfache Form an, wobei alle nichtkritischen Parameter in der reduzierten Flug­ strecke l zusammengefaßt sind, und nur die Abhängigkeiten von den Beschleunigungsspannun­ gen, vom Abstand d und der mittleren Geschwindigkeit v wiedergegeben werden:

wobei U die volle Beschleunigungsspannung, V die Teilbeschleunigungsspannung zwischen Probenträger und Zwischenblende, und l eine reduzierte Flugstrecke ist, die nur von der Geo­ metrie des Flugzeitspektrometers abhängt und in der alle übrigen geometrischen Abmessungen enthalten sind. Die Teilbeschleunigungsspannung V wird um die Zeit τ verzögert eingeschaltet, um die Massenauflösung zu verbessern. Wie bereits oben beschrieben, ist d der Abstand zwi­ schen dem Probenträger und der Zwischenblende, und v ist die mittlere Geschwindigkeit der Ionen beim Einschalten der Beschleunigung. Der Term mit w² ist zwar klein gegenüber dem in w linearen Term, erlangt aber mit zunehmender Masse deutlichen Einfluß.

Unsere Untersuchungen zeigen, daß sich Verschiebungen der Massenskala gegenüber der Ka­ libration nun teilweise bereits dadurch ergeben, daß die Probenaufträge verschieden dick aus­ fallen. Nach der heute noch weitestverbreiteten Methode werden die Proben in Lösung, zu­ sammen mit gelöster Matrixsubstanz, auf den Probenträger aufgebracht. Es ist dabei das Ziel, kleine Kristalle der Matrix zu erzeugen, die Probenmoleküle aufnimmt. Das Wachstum dieser Kristalle läßt sich dabei nicht steuern; es entstehen einmal große Kristalle, ein anderes Mal kleine. Diese Methode wird allerdings gegenwärtig durch Methoden abgelöst, die eine gleich­ mäßig dicke Schicht ergeben.

Aber auch technische Probleme führen dazu, daß der Abstand d nicht immer konstant ist und dem bei der Kalibration der Massenskala gegebenen Wert entspricht Moderne Probenträger sollen Tausende von Proben aufnehmen, daher sind sie großflächig auszubilden; Probenträger von mehr als 100 Millimeter Länge werden angestrebt. Die Probenträger werden über Schleu­ sen ins Vakuumsystem des Massenspektrometers eingeführt und werden dort von einer Halte­ rung aufgenommen, die von einer Bewegungsvorrichtung bewegt wird. Die Aufnahme in Gleitschienen der Halterung mit Positionierung durch Federdruck kann dabei wegen der Vaku­ umbedingungen nicht immer so präzise erfolgen wie erforderlich. Enge Toleranzen der Gleit­ schienen und Gleitmittel können im Vakuum nicht angewandt werden. Bei einer parallelen Verschiebung dieser Probenträger über mehr als hundert Millimeter zur Spektrenaufnahme der verschiedenen Proben kann deshalb leicht eine Änderung des Abstandes d zur Zwischenelek­ trode in der Größenordnung von einigen Zehnteln Millimeter eintreten. Bei einer Änderung dieses Abstandes d um nur 100 Mikrometer verändert sich aber die Flugzeit der Ionen bereits so, daß das Signal eines Ions der Masse 5000 µ um mehr als zwei atomaren Masseneinheiten auf der Massenskala verschoben erscheint.

Bisher ist es nicht gelungen, eine elektrische Kompensation für einen variierenden Abstand d zu finden, um die einmal einkalibrierte Beziehung zwischen Flugzeit und Masse (also die Mas­ senskala) durch eine rein elektrische Justierung für alle Massen genau wiederherzustellen. Aus der Gleichung (2) ist die Existenz einer solchen elektrischen Kompensation guter Genauigkeit nicht zu ersehen, da eine Veränderung des Abstands d im linearen Glied über im quadra­ tischen dagegen über V kompensiert werden muß.

Im Falle verzögert einsetzender Beschleunigung gilt außerdem, daß eine Änderung von V, die so vorgenommen wird, daß sich wieder ein bestes Massenauflösungsvermögen ergibt, nicht auch gleichzeitig die Flugzeiten der Ionen restauriert. Diese Wiederherstellung des besten Auf­ lösungsvermögens muß das Beschleunigungsfeld, also die Relation V/d, wieder auf seinen vor­ bestimmten Wert bringen.

Überraschenderweise zeigt sich in Experimenten, daß eine elektrische Kompensation der Ände­ rung des Abstands d entgegen dem durch Gleichung (2) gegebenen Augenschein doch möglich ist. Eine experimentell herbeigeführte Abstandsänderung um 10% ließ sich in erster Näherung bereits durch eine Veränderung allein der Teilbeschleunigungsspannung V zwischen Probenträ­ ger und Zwischenelektrode (bei Konstanz der Gesamtbeschleunigungsspannung U) so kom­ pensieren, daß die einkalibrierte Massenskala mit einem maximalen Fehler von etwa 30 ppm der Masse über einen weiten Massenbereich von 500 u bis 2500 u wieder gültig wurde. Es mußte dazu aber die Spannung V mehr als nur 10% verändert werden, es war eine Überkom­ pensation von etwa 14% notwendig. Dabei tritt aber eine Verschlechterung des Auflösungs­ vermögens, also der Schärfe der Massensignale, auf.

Die Verschlechterung des Auflösungsvermögens kann aber vermieden werden, wenn durch eine Veränderung der Teilbeschleunigungsspannung V im wesentlichen nur die Feldstärke in der ersten Beschleunigungsstrecke zwischen Probenträger und Zwischenelektrode wiederher­ gestellt wird, und die weitere Kompensation der Abstandsveränderung durch die Gesamtbe­ schleunigungsspannung U vorgenommen wird. Es wird also V proportional zur Veränderung des Abstandes d verändert, und der Rest der Kompensation wird durch eine Veränderung der Spannung U bewirkt. Überraschenderweise bleibt durch diese gekoppelte Veränderung beider Beschleunigungsspannungen U und V die Massenskala über den ganzen, einkalibrierten Mas­ senbereich mit guter Genauigkeit erhalten.

Dabei stellt sich wiederum überraschend heraus, daß auch die Beschleunigungsspannung U linear zur Veränderung von d verändert werden muß, allerdings nicht voll proportional, son­ dern nur mit einem kleinen Bruchteil linear proportional. Für ein Flugzeitmassenspektrometer mit einem Abstand d = 3 Millimeter, einer zweiten Beschleunigungsstrecke von 30 Millimeter, und einer Flugstrecke von 1,6 Meter beträgt dieser Bruchteil etwa 1/130. Wird also d um 10% verändert, so muß auch V um 10% verändert werden, die Beschleunigungsspannung U dage­ gen nur um 0,075%. Dann ist die Massenskala wieder gültig, und zwar mit einem maximalen Fehler von 1 ppm der Flugzeit oder 2 ppm der Masse in einem sehr großen Massenbereich von 500 bis 10 000 atomaren Masseneinheiten. Diese Ergebnisse übersteigen die experimentell ge­ gebene Meßgenauigkeit und wurden durch Computersimulationen gewonnen, konnten aber im Rahmen der dort vorhandenen Meßgenauigkeit von etwa 10 ppm auch am Flugzeitspektrome­ ter verifiziert werden.

Hat sich also der Abstand d um einen relativen Betrag Δd/d geändert, so muß auch die Be­ schleunigungsspannung V um diesen Betrag V × Δd/d geändert werden, die Gesamtbeschleu­ nigungsspannung dagegen um den Betrag c₁ × U × Δd/d, wobei für den oben beschriebenen Typ von Flugzeitspektrometer der Bruchteil c₁ = 0,0075 gilt. Für geometrisch veränderte Ty­ pen von Massenspektrometern konnten mit anderen Werten für die Konstante c₁ ähnliche Re­ sultate erhalten werden.

Es ist also der Grundgedanke der Erfindung, eine unbekannte Veränderung des Ab­ standes d dadurch zu kompensieren, daß beide Spannungen V und U nach oben gegebener Be­ ziehung gekoppelt so weit verändert werden, bis die Flugzeit einer bekannten Referenzionen­ masse wieder genau den Wert annimmt, der ihr durch die Kalibrierung der Massenskala zu­ steht. Wird dabei V um den relativen Betrag ΔV/V verändert, so muß also U um den relativen Betrag c₁ × U × ΔV/V geändert werden. Dabei muß insbesondere für einen Typ von Massen­ spektrometer nur einmalig ermittelt werden, wie groß der Bruchteil c₁ der linearen Änderung von U gegenüber der Änderung von V sein muß.

Führen wir den Index c für die bei Kalibration der Massenskala verwendeten Parameter ein, und den Index s für die durch die Steuerung veränderten Parameterwerte, und benutzen wir die Abkürzung

p = ΔV/V = (V_s - V_c)/V_c, (3)

so gilt

V_s = V_cx(1 + p) und (4)

U_s = U_c × (1 + c₁ × ΔV/V) = U_c × (1 + c₁ × p) = U_c + U_c × c₁ × p. (5)

Daraus läßt sich eine Regelung konstruieren, die über die Messung der Flugzeit t einer Refe­ renzionenmasse und einem Vergleich mit einem Sollwert für diese Flugzeit auf den Parameter p so lange einwirkt, bis die gemessene Flugzeit t den Sollwert annimmt. Wie bereits oben beschrieben, läßt sich durch Computersimu­ lationen (und im Rahmen der Genauigkeit auch experimentell) zeigen, daß dann die Massenska­ la über einen sehr großen Bereich, beispielsweise für den Bereich von 500 u bis 10000 u mit einem maximalen Fehler unter 2 ppm der Masse in (1 ppm der Flugzeit t) gültig ist Selbst bei der Masse 10000 u könnte die Masse noch auf 0,02 u genau ermittelt werden, wenn es die Meßgenauigkeit zuließe. Gleichzeitig bleibt das eingestellte Auflösungsvermögen optimal er­ halten.

Für diese Regelungen und Messungen muß die Flugzeit t für kleine Ionen auf etwa zwei hun­ dertstel Nanosekunde genau bestimmt werden, was heute noch nicht ganz möglich ist. Für die Messungen wird üblicherweise eine Schwerpunktsbildung des Linienprofils herangezogen. Das Linienprofil wird nach heutiger Technik durch einen Transientenrekorder mit 1 oder 2 Giga­ hertz abgetastet Transienterekorder mit 4 Gigahertz Abtastrate befinden sich in der Einfüh­ rungsphase. In der Regel werden die Messungen aus mehreren Meßzyklen aufaddiert, bevor die Schwerpunktsbildung vorgenommen wird.

Das Verfahren der Verbesserung der Massenauflösung durch verzögert einsetzende Beschleu­ nigung liefert, wie oben bereits erwähnt, das optimale Massenauflösungsvermögen nur in ei­ nem schmalen Bereich der Massenskala. In den anderen Massenbereichen ist das Auflösungs­ vermögen zwar immer noch deutlich verbessert, doch nicht bis zum optimalen Grenzwert. Die­ ser Bereich optimaler Auflösung kann insbesondere durch Änderungen von Verzögerungszeit τ (aber auch durch die Beschleunigungsspannungen U und V) auf eine beliebige Stelle des Mas­ senbereichs verschoben werden.

Ist die Masse der Referenzionen viel kleiner als die der Analytionen, wie es beispielsweise bei der Benutzung der immer vorhandenen Matrixionen als Referenzionen der Fall ist, so kann ein besonderes Verfahren zur Verbesserung der Massengenauigkeit angewandt werden: Man kann den Bereich optimalen Auflösungsvermögens vorübergehend durch eine Änderung der Verzö­ gerungszeit τ auf den Bereich der leichten Referenzionenmassen schieben, und dann die Ein­ stellung des Abstandes d anhand der Flugzeit dieser leichten Referenzionen vornehmen. Für leichte Ionen ergibt sich dabei eine extrem gute Fokussierung. Die Breite des Massensignals beträgt für leichte Ionen von etwa 500 atomaren Masseneinheiten nur ein bis zwei Nanosekun­ den, daher läßt sich hier eine Einstellung auf eine Sollflugzeit sehr genau vornehmen. Die Flug­ zeit t der Matrixionen muß dabei auf einen Wert eingestellt werden, der einer anderen Kali­ brierkurve für die Massenskala bei diesem verschobenen Schärfebereich entspricht. Nach Rückverschieben des optimalen Schärfebereichs zu den Analytionen, deren Masse zu messen ist, können dann die Massen dieser Analytionen richtig gemessen werden, da jetzt die Verände­ rung des Abstands d durch die Änderungen der Beschleunigungsspannungen kompensiert ist.

Es ist dazu nicht einmal notwendig, die gesamte Massenskala für den Fall des verschobenen Schärfebereichs kalibriert zu haben, es genügt, den Wert der Flugzeit t für die Matrixionen zu kennen. Wenn immer wieder nur eine kleine Anzahl verschiedener Matrixionen benutzt wird, kann deren Flugzeit t bei der Kalibrierung der Massenskala leicht mit gemessen und gespei­ chert werden. Die Einstellung der Spannungen kann heutzutage so präzise erfolgen, daß Span­ nungsungenauigkeiten keine Rolle spielen.

Wenn aber stets wechselnde, nicht immer vorhersehbare Referenzionen verwendet werden sollen, so ist dieses Verfahren nicht anwendbar, da ja deren Flugzeiten bei der einmaligen Kali­ brierung der Massenskala mit vermessen werden müssen. Es ist nun ein weiterer, überraschen­ der Befund unserer Experimente, daß sich auch die Verschiebung des Bereichs optimalen Auf­ lösungsvermögens so vornehmen läßt, daß die einkalibrierte Massenskala innerhalb sehr gerin­ ger Fehler gültig bleibt. Damit läßt sich eine Verschiebung des optimalen Schärfebereiches auf die leichten Referenzmassen so vornehmen, daß die Einstellung der Flugzeit t auf denjenigen Sollwert vorgenommen werden kann, der durch die einkalibrierte Massenskala für diese Refe­ renzionen vorgegeben ist.

Soll die Massenskala gültig bleiben, so kann der Bereich optimaler Schärfe nicht allein durch eine Veränderung der Spannungen verschoben werden. Diese führt immer zu einem Kippen der Massenskala und ist elektrisch nicht zu korrigieren. Es ist dazu notwendig, die Verschiebung des Schärfebereichs durch die Verzögerungszeit τ vorzunehmen. Bei alleiniger Veränderung von τ verschiebt sich zwar die Massenskala leicht, diese Verschiebung kann aber durch eine leichte Mitsteuerung der Gesamtbeschleunigungsspannung U wieder ausgeglichen werden. Dazu kann überraschenderweise die Beschleunigungsspannung wieder in einfacher Weise linear mit τ verändert werden. Wird τ um den relativen Betrag Δτ/τ geändert, so muß die Beschleu­ nigungsspannung U um den Faktor (1 + c₂ × Δτ/τ) geändert werden. Für das Beispiel des oben angeführten Massenspektrometers ist c₂ = 0,00299.

Auch diese Konstante c₂ kann für einen Gerätetyp einmalig festgestellt und immer wieder be­ nutzt werden. Wird jetzt analog zu oben die Abkürzung

q = Δτ/τ = (τ_s - τ_c)/τ_c (6)

eingeführt, so ist die Beschleunigungsspannung wie folgt zu steuern:

U_s = U_c × (1 + c₂ × Δτ/τ) = U_c × (1 + c₂ × q) = U_c + U_c × c₂ × q (7)

Damit läßt sich eine Steuerung aufbauen, die den Bereich optimaler Schärfe an beliebige Stel­ len des Massenbereiches legt, ohne die kalibrierte Massenskala ungültig werden zu lassen. Die Beziehung zwischen τs (oder q) und der Masse, bei der die optimale Schärfe liegt, kann leicht experimentell ermittelt und in einer Steuertabelle abgelegt werden. Es läßt sich wieder durch Computersimulationen (und auch experimentell im Rahmen der dort vorhandenen Meßgenau­ igkeit) zeigen, daß die Massenskala über einen sehr großen Bereich, beispielsweise für den Bereich von 500 u bis 10000 u mit einem maximalen Fehler unter 2 ppm der Masse (1 ppm der Flugzeit) gültig bleibt. Selbst bei der Masse 10000 u könnte die Masse noch auf 0,02 u genau ermittelt werden, wenn es die Meßgenauigkeit zuließe.

Bei überlagerten Verschiebungen des Abstands und des Schärfebereichs tritt für ein optimales Erhalten der Massenskala ein weiteres Glied p×q mit einer neuen Konstante c₃ hinzu:

U_s = U_c + U_c × c₁ × p + U_c × c₂ × q + U_c × c₃ × p × q =
U_c + U_c × c₁ × (V_s-V_c)/V_c + U_c × c₂ × (τs-τc)/τc + U_c × c₃ × (V_s-V_c)/V_c × (τ_s-τ_c)/τ_c (8)

Für das oben beschriebene Flugzeitmassenspektrometer betragen c₁ = 0,0075, c₂ = 0,00299 und c₃ = 0,00015.

Die Massenskala bleibt bei einer Steuerung nach Gleichung (8) bis auf einen maximalen Fehler der Flugzeiten von etwa 2 ppm, der Massenbestimmung von 4 ppm genau. Damit kann ein Ion der Masse 10000 u bei einem falsch justierten Abstand von d = 3,300 Millimeter noch auf 0,04 atomare Masseneinheiten genau vermessen werden, obwohl beispielsweise die Kalibrierung der Massenskala bei optimaler Schärfe auf der Masse 1000 u und bei einem Abstand von d = 3,000 Millimeter erfolgte. Gleichung (8) schließt die oben gegebenen Gleichungen (5) und (7) ein, ist also eine umfassende Gleichung für die Mitsteuerung von U_s nach dieser Erfindung.

Die Kompensation, die durch Gleichung (8) beschrieben wird, läßt sich durch Hinzunahme von quadratischen Gliedern p² und q² (mit Konstanten c₄ und c₅) noch weiter verbessern, doch ist diese Verbesserung im Rahmen der hier geforderten Aufgaben kaum notwendig. Die Präzision der Flugzeitbestimmung aus dem Ionenstromsignal, die von der Anzahl der gemessenen Ionen abhängt, reicht in der Regel schon nicht an die oben angegebenen Genauigkeiten der Massen­ bestimmung heran und bildet daher eine stärkere Beschränkung als die restliche Ungenauigkeit der Gleichung (8). Eine volle Ausnutzung der durch die Gleichung (8) gegebenen Genauigkeit verlangt bereits eine Ansteuerung der Beschleunigungsspannung U_s mit einem Digital-zu- Analog-Wandler, der eine Steuergenauigkeit von 20 bit besitzt.

Im Falle leichter Referenzionen, beispielsweise bei Benutzung der dimeren oder trimeren Ma­ trixionen, kann also die Schärfe durch den Parameter τ_s (oder q) zunächst zu diesen Ionen ver­ lagert werden (unter Mitsteuerung von U_s nach Gleichung (8)), ohne die Massenskala ungültig werden zu lassen. Anhand dieser Ionen wird eine eventuelle Abstandsänderung elektrisch durch den Steuerparameter V_s (oder p) kompensiert (unter Mitsteuerung von U_s), bis die Flug­ zeit der leichten Referenzionen auf dem Wert der Kalibrierung liegt. Dann wird der Bereich optimaler Schärfe durch den Parameter τ_s (oder q) auf die Analytionen zurückverschoben (unter Mitsteuerung von U_s), wobei der Steuerparameter V_s (oder p) erhalten bleibt. Die Mas­ sen der Analytionen können jetzt über eine Spektrenaufnahme sehr genau gemessen werden. Für Probenträger mit kleiner Probenauftragsfläche ist in der Regel nur ein einziger Regelvor­ gang erforderlich, da die Parallelität der Probenoberfläche zur Zwischenelektrode im allgemei­ nen durch die Montage genügend gut gewährleistet ist.

Für MALDI-Probenaufträge verschiedener Dicke muß für jede Messung einer Probe auch eine Kompensation des Abstandes erfolgen. Dazu ist es erforderlich, bei der Messung der Analytio­ nen auch immer Ionen einer Referenzprobe mitmessen zu können. In vielen Fällen können dazu Ionen der Matrix verwendet werden, beispielsweise die häufig auftretenden dimeren oder tri­ meren Ionen der Matrixsubstanz. Dabei kann das oben geschilderte besondere Verfahren mit einer Verschiebung des Schärfebereiches verwendet werden. In anderen Fällen muß der Ana­ lytsubstanz eine geeignete Referenzsubstanz beigegeben werden.

Das Ziel der automatischen Messung von Tausenden von Proben macht immer größere Pro­ benträger erforderlich. Diese können durchaus so plan hergestellt werden, so daß der Einfluß der Abweichungen von der Planität auf den Abstand des Probenträgers vernachlässigt werden kann. Die Proben können auch sehr gleichmäßig dünn aufgetragen werden, auch hierdurch ergeben sich kaum Abweichungen. Aber die genaue Positionierung des Abstandes im Inneren des Vakuumsystems ist schwierig, da im Vakuum weder Schmierfette noch sehr enge Gleitto­ leranzen benutzt werden können. Bei der Einführung der Probenträger in die Halterung und bei der Parallelbewegung des Probenträgers treten sehr leicht Abstandsänderungen zur Zwischene­ lektrode auf, die nach dieser Erfindung elektrisch nachjustiert werden müssen.

Hier ergibt sich ein besonderer Vorteil aus dieser Erfindung, da die Veränderung der Teilbe­ schleunigungsspannung V: direkt proportional zur Änderung des Abstands d ist. Ist also die elektrische Kompensation durch V_s an einigen Stellen auf dem Probenträger bekannt, so kön­ nen die optimalen Werte von V_s an den anderen Stellen des Probenträgers linear interpoliert werden.

Dazu sind für diese großen Probenträger mindestens drei Referenzproben notwendig, die mög­ lichst weit voneinander entfernt nahe am Rand des Probenträgers aufgebracht sein sollen. Sind die Abstände d der großen Probenträgerplatte einmal an drei Stellen durch Bestimmung der Steuerwerte V_s (oder p) kompensiert, so können die Proben aller übrigen Positionen automa­ tisch vermessen werden, indem V_s (oder p) aus der Position in bekannter Weise interpoliert wird.

Ist der Probenauftrag ungleichmäßig dick, oder wird eine wellige Matrixfolie auf den Proben­ träger geklebt, so ist eine elektrische Kompensation für jede einzelne Probe notwendig. Dazu ist wieder eine immer mitgemessene Referenz notwendig.

Es ist ein weiterer besonderer Vorteil der Erfindung, daß die elektrische Kompensation des Abstandes d auch die Fokussierung zweiter Ordnung in einem Flugzeitspektrometer mit Re­ flektor wiederherstellt.

Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines Flugzeitmassenspektrometers mit der Probenträ­ gerelektrode 1 auf dem Beschleunigungspotential U, der Zwischenelektrode 2 auf einem schaltbaren Potential, der Grundelektrode 3 auf Erdpotential, einer ionenoptischen Ionenstrahl­ einzellinse 4, und dem Ionendetektor 10. Ein Lichtblitz aus dem Laser 5 wird von der Linse 6 in einem konvergenten Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 fokussiert, die sich auf dem Probenträger 1 befindet. Zu dieser Zeit befindet sich die Zwischenelektrode ebenfalls auf dem Beschleuni­ gungspotential U. Der Lichtblitz erzeugt in einem MALDI-Prozeß Ionen der Analytsubstanz mit einer Anfangsgeschwindigkeit v und großer Geschwindigkeitsstreuung. Nach einer Verzö­ gerungszeit τ wird die Zwischenelektrode 2 vom Potential U auf das Potential U - V herabge­ schaltet, und die Ionen werden beschleunigt. Sie bilden den Strahl 9 des Ionenstromes, der nach Durchlaufen der Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10 vom Detektor 10 zeitaufgelöst gemessen wird.

Die hier gezeigte Anordnung hat gitterlose Blenden als Zwischenelektrode und 2 und Grunde­ lektrode 3 und braucht daher die Einzellinse 4. Bei Einführung von Gittern in Zwischenelek­ trode 2 und Grundelektrode 3 kann die Einzellinse 4 entfallen.

Das hier vorgestellte Verfahren der präzisen Massenbestimmung nach dieser Erfindung stützt sich auf ein lineares Flugzeitmassenspektrometer, das in Fig. 1 gezeigt wird. Das Verfahren der Mitsteuerung von U_s nach Gleichung (8) ist jedoch mit anderen Werten für die Konstanten c₁, c₂ und c₃ auch für Flugzeitspektrometer mit energiefokussierenden Reflektoren anwendbar.

Bei Benutzung der oben bereits geschilderten verzögert einsetzenden Beschleunigung befindet sich die Zwischenelektrode 2 zunächst auf dem Potential U des Probenträgers 1, und wird nach der Verzögerungszeit τ von einigen zehn bis hundert Nanosekunden auf das Potential U - V herabgeschaltet. Es ist auch ein Betrieb möglich, bei dem sich Probenträger und Zwischenblen­ de beide zunächst auf dem Potential U - V befinden, wobei der Probenträger 1 nach der Ver­ zögerungszeit τ auf das Potential U angehoben wird.

Mit dieser Anordnung eines Flugzeitmassenspektrometers können wie gewöhnlich Spektren der Analytsubstanzen aufgenommen werden. Die Spektrenaufnahme beginnt mit der Ionisie­ rung der Probensubstanzen 8 auf dem Probenträger 1, wobei hier das MALDI-Verfahren zur Ionisierung beschrieben wird. Die Ionen werden durch einen Lichtblitz von etwa 3 bis 5 Nano­ sekunden Dauer aus dem Laser 5 erzeugt. Gewöhnlich wird UV-Licht mit einer Wellenlänge von 337 Nanometer aus einem preiswerten Stickstoff-Laser benutzt. Der Lichtblitz ist durch die Linse 6 als konvergenter Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 auf der Oberfläche des Probenträgers 1 fokussiert. Die in der Dampfwolke, die durch den Laserfokus erzeugt wird, gebildeten Ionen werden nach der Verzögerungszeit τ zunächst im elektrischen Feld zwischen Probenträger 1 und Zwischenelektrode 2 beschleunigt, und dann im elektrischen Feld zwischen Zwischenelek­ trode 2 und Grundelektrode 3. Die in der Elektrodenanordnung leicht defokussierte Ionen­ strahl wird zu Beginn der Flugstrecke in der Einzellinse 4 auf den Detektor 10 fokussiert. Die fliegenden Ionen bilden einen zeitlich stark variierenden Ionenstrom 9, der am Ende der Flug­ strecke vom Ionendetektor 10 mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen wird.

Der durch den Ionenstrahl gegebene zeitvariable Ionenstrom wird am Detektor gewöhnlich mit einer Abtastrate von 1 oder 2 Gigahertz gemessen und digitalisiert. Transientenrekorder mit noch höherer zeitlicher Auflösung werden in Kürze eingesetzt werden können. Üblicherweise werden die zeitgleichen Meßwerte aus mehreren Spektrenaufnahmen addiert, bevor die Mas­ senlinien in den gespeicherten Daten gesucht und über die Datenauswertung von der Zeitskala über die Massenkalibrierkurve in die Massenwerte transformiert werden.

Die Polarität der verwendeten Hochspannung für die Ionenbeschleunigung muß gleich der Po­ larität der untersuchten Ionen sein: Positive Ionen werden durch einen positiv geladenen Pro­ benträger abgestoßen und beschleunigt, negative Ionen durch einen negativ geladenen Proben­ träger.

Selbstverständlich kann man das Flugzeitmassenspektrometer auch so betreiben, daß sich die Flugstrecke in einem′ (nicht in Fig. 1 gezeigten) Rohr befindet, das sich auf dem Beschleuni­ gungspotential U befindet, während der Probenträger 1 auf Grundpotential liegt. In diesem besonderen Fall liegt das Flugrohr auf positivem Potential, wenn negativ geladene Ionen unter­ sucht werden sollen, und umgekehrt. Dieser Betrieb vereinfacht die Konstruktion der Ionen­ quelle, da die Isolatoren für den Halter des auswechselbaren Probenträgers 1 entfallen können, bringt jedoch an anderen Stellen Nachteile mit sich.

Die hier wiedergegebenen Überlegungen für lineare Massespektrometer gelten in gleicher Wei­ se, wie jeder Fachmann nachvollziehen kann, auch für Flugzeitmassenspektrometer mit ener­ giefokussierenden Reflektoren. Dabei sind die Reflektorspannungen in gleicher Weise wie die Beschleunigungsspannungen U mitzusteuern. Für ein solches Massenspektrometer gelten dann andere Apparatekonstanten c₁, c₂ und c₃.

Claims (6)

1. Verfahren für die genaue Massenbestimmung von Analytionen in einem Flugzeitmassen­ spektrometer anhand einer einmalig kalibrierten Massenskala, mit Ionisierung der auf einen Probenträger aufgebrachten Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) und mit Verbesserung der Massenauflösung durch eine zeitverzögert einsetzende Be­ schleunigung in einer ersten Teilbeschleunigungsstrecke zwischen Probenträger und Zwi­ schenblende, wobei die Massenskala mit der Teilbeschleunigungsspannung V_c zwischen Probenträger und Zwischenblende und der Gesamtbeschleunigungsspannung U_c zwischen Probenträger und Flugstrecke kalibriert wurde, dadurch gekennzeichnet, daß der Einfluß eines veränderten Abstandes zwischen dem Probenträger, der auch eine Referenzsubstanz trägt, und der Zwischenblende auf die Kalibrierung durch eine kombi­ nierte Steuerung der Teilbeschleunigungsspannung V_s und der Gesamtbeschleunigungs­ spannung U_s durch einen gemeinsamen Steuerparametern und eine Apparatekonstante c₁ nach den Gleichungen V_s = V_c × (1 + p) und U_s = U_c × (1 + c₁ × p) so kompensiert wird, daß für die Referenzsubstanz die richtige Masse erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer zusätzlichen Verände­ rung der Verzögerungszeit τ_s = τ_c × (1 + q) zur Verschiebung des Bereichs optimaler Mas­ senauflösung die Gesamtbeschleunigungsspannung U_s nach der Gleichung U_s = U_c × (1 + c₁ × p + c₂ × q + c₃ × p × q) verändert wird, wobei τ_c die bei der Kalibrie­ rung verwendete Verzögerungszeit, und c₂ und c₃ zwei weitere Apparatekonstanten sind.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Appara­ tekonstanten in den Bereichen 0,04 c₁ 0 , 0,004 c₂ 0, und 0,001 c₃ 0 liegen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstanten c₁, c₂ und c₃ durch eine einmalige Eichung eines Massenspektrometers gleichen Typs bestimmt werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die monomeren, dimeren oder oligomeren Ionen der MALDI-Matrixsubstanz als Referenzio­ nen verwendet werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche unter Benutzung eines großflächi­ gen Probenträgers, dadurch gekennzeichnet, daß sich auf dem Probenträger an mindestens drei weitauseinanderliegenden Orten Proben einer Referenzsubstanz befinden, daß die Referenzproben zu einer Ermittlung der Werte für den Steuerparameter p an den Orten der Referenzproben verwendet werden, und daß für die übrigen Proben auf dem Probenträger lineare Interpolationen des Steuerpa­ rameters p nach den Ortskoordinaten der Probe verwendet werden.