DE19635643A1

DE19635643A1 - Höchstauflösendes lineares Flugzeitmassenspektrometer

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Publication number: DE19635643A1
Application number: DE19635643A
Authority: DE
Original assignee: Bruken Franzen Analytik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 1996-09-03
Filing date: 1996-09-03
Publication date: 1998-03-05
Anticipated expiration: 2016-09-04
Also published as: GB2317048A; GB2317048B; US5905259A; DE19635643C2; GB9718621D0

Description

Die Erfindung betrifft ein lineares Flugzeitmassenspektrometer, das mit einer Ionisierung oberflächlich adsorbierter Analytsubstanzen und einer Verbesserung der Massenauflösung durch zeitlich verzögerten Einsatz der Ionenbeschleunigung im Raum vor dem Probenträger arbeitet. Im besonderen betrifft es die Ausbildung eines Massenspektrometers und massenspek trometrische Meßverfahren für höchste Massenauflösung im Spektrum.

Die Erfindung besteht darin, die Flugzeit der Ionen dadurch in zweiter Ordnung zu fokussie ren, daß mindestens eine der in der Ionenquelle angelegten Beschleunigungsspannungen nach dem verzögerten Einschalten der Ionenbeschleunigung dynamisch verändert wird. Besonders einfach kann eine leicht zu erzeugende exponentielle Abnahme der Teilbeschleunigungsspan nung zwischen Probenträger und einer Zwischenblende eingesetzt werden. In Computersimu lationen werden Auflösungsvermögen von weit über eine Million erhalten.

Allgemeiner Stand der Technik

Unter den Verfahren zur Ionisierung von großmolekularen Substanzen auf Probenträgern hat die matrixunterstützte Desorption durch einen Laserblitz (MALDI = matrix assisted laser desorption and ionization) weiteste Verbreitung gefunden. Die Ionen haben nach Verlassen der Oberfläche in der Regel eine nicht vernachlässigbare mittlere Geschwindigkeit, die weitgehend für Ionen aller Massen gleich ist, und eine starke Streuung um die mittlere Geschwindigkeit. Die mittlere Geschwindigkeit führt zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Flugzeit und Wurzel aus der Masse, also der Massenskala. Die Streuung führt zu einer Unschärfe beim Messen der Signale der einzelnen Ionenmassen, also zu einem schlechten Massenauflösungs vermögen; es gibt jedoch ein Verfahren, diese Unschärfe wieder in erster Ordnung zu fokussie ren.

Ähnliche Verhältnisse gelten aber auch für andere Verfahren der Ionisierung von Substanzen, die auf einer Oberfläche aufgebracht sind. Beispiele dafür sind die Sekundärelektronenmassen spektrometrie (SIMS), die normale Laserdesorption (LD) oder die sogenannte Plasmadesorp tion (PD), die durch hochenergetische Spaltungsprodukte an dünnen Folien erhalten wird. Im Folgenden wird das MALDI-Verfahren in den Mittelpunkt gestellt, die Erfindung ist aber nicht auf dieses Verfahren allein beschränkt, sondern bezieht sich auf alle Verfahren, mit denen Io nen erzeugt werden, die eine Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten besitzen, auch wenn sie in der Regel nicht so groß ist wie beim MALDI-Prozeß.

Für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) werden die großen Probenmoleküle auf einem Probenträger in oder auf eine Schicht einer niedermolekularen Ma trixsubstanz gelagert. Ein Lichtpuls von wenigen Nanosekunden Dauer aus einem Laser, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird, verdampft in einem quasi-explosiven Prozeß eine geringe Menge der Matrixsubstanz, wobei auch die Probenmoleküle in die zunächst winzige Dampfwolke überführt werden.

Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Probensubstanz, die dabei höhere kinetische Energien erhalten, als sie dem thermischen Gleichgewicht entsprächen. Selbst ohne ein beschleunigendes Feld errei chen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 500 bis 1000 Metern pro Sekunde, ab hängig von der Energiedichte des Laserstrahls; die Geschwindigkeiten sind dabei weitgehend unabhängig von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwindigkeitsstreuung, die von etwa 200 bis zu 1500 Metern pro Sekunde reicht.

Die Ionen werden in der Ionenquelle mit elektrischen Feldern auf Energien von rund 5 bis 30 keV beschleunigt, in die Flugstrecke des Massenspektrometers eingeschossen und am Ende der Flugstrecke zeitaufgelöst detektiert. Aus ihrer Flugzeit kann ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis bestimmt werden. Da diese Art der Ionisierung praktisch nur einfach geladene Ionen liefert, wird im Folgenden meist nur von der Massenbestimmung gesprochen, nicht von der Bestim mung des Masse-zu-Ladungsverhältnisses.

Die Umrechnung der Flugzeiten in Massen wird über eine Kalibrierkurve vorgenommen, die als tabellarische Punktfolge im Speicher des Datenverarbeitungssystems abgelegt sein kann, sie kann aber auch in Form von Parameterwerten für eine mathematische Funktion der Masse in Abhängigkeit von der Flugzeit gespeichert werden.

Für die Massenbestimmung muß die Flugzeit t auf Bruchteile einer Nanosekunde genau be stimmt werden. Da das Massensignal als Linienprofil vorliegt, wird üblicherweise eine Schwer punktsbildung dieses Linienprofils für die genaue Bestimmung der Flugzeit herangezogen. Das Linienprofil wird nach heutiger Technik durch einen Transientenrekorder mit 1 oder 2 Giga hertz abgetastet. Transientenrekorder mit 4 Gigahertz Abtastrate (und mehr) befinden sich in der Entwicklung. In der Regel werden die Messungen aus mehreren Meßzyklen aufaddiert, bevor die Schwerpunktsbildung vorgenommen wird.

Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der Probenmoleküle, ionisiert. Aber auch während der explosiven Ausdeh nung der Dampfwolke findet durch weitere Ionen-Molekül-Reaktionen eine fortlaufende Ioni sierung der großen Moleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt. Die große Streuung der Geschwindigkeiten und der zeitverschmierte Bildungsprozeß der Ionen beeinträchtigen und begrenzen die Massenauflösung sowohl von linearen wie auch von energiefossierend re flektierenden Flugzeitmassenspektrometern.

Es ist jedoch ein Verfahren für eine Erhöhung des Massenauflösungsvermögens unter diesen Bedingungen bekannt. Die Ionen der Wolke werden zunächst für eine kurze Zeit τ in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleunigung fliegen gelassen. Die schnelleren Ionen entfernen sich dabei weiter von der Probenträgerelektrode als die langsamen, aus der Ge schwindigkeitsverteilung der Ionen ergibt sich dabei eine Ortsverteilung. Erst dann wird die Beschleunigung der Ionen durch ein zeitlich konstantes homogenes Beschleunigungsfeld, also mit einem räumlich linear abfallenden Beschleunigungspotential, eingeschaltet. Die schnelleren Ionen befinden sich dann weiter von der Probenträger-Elektrode entfernt, somit auf einem et was geringeren Beschleunigungspotential, das ihnen eine etwas geringere Endgeschwindigkeit für die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu Beginn langsameren Ionen. Bei richtiger Wahl der Verzögerungszeit τ und des Potentialabfalls (also der Starke des Be schleunigungsfeldes) können die zu Beginn langsameren, aber nach Beschleunigung schnelleren Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung langsameren Ionen genau am De tektor wieder einholen. Es werden somit Ionen am Ort des Detektors in bezug auf die Masse dispergiert, aber bei gleicher Masse in bezug auf die Flugzeit in erster Ordnung fokussiert. Damit erreicht man eine relativ hohe Massenauflösung selbst in einem linearen Flugzeitmassen spektrometer. Es gibt ein ähnliches Verfahren für Flugzeitspektrometer mit Reflektoren, bei denen sogar eine Fokussierung zweiter Ordnung erzielt wird.

Das verzögerte Einschalten der Beschleunigung ist in der Regel nicht mit einem Schalten der gesamten Beschleunigungsspannung U verbunden. Die Schaltung so hoher Spannungen in ex trem kurzen Zeiten von wenigen Nanosekunden ist auch heute noch fast unerreichbar und mit hohen Kosten verbunden. Man kommt mit dem Schalten einer Teilbeschleunigungsspannung U₁ aus, wenn man in die Beschleunigungsstrecke eine Zwischenelektrode einbaut. Es braucht dann nur der Raum zwischen Probenträgerelektrode und Zwischenelektrode, die einen relativ geringen Abstand d voneinander haben, zunächst feldfrei sein und nach Zeitverzögerung in ein Beschleunigungsfeld der Stärke U₁/d umgeschaltet werden. Der Abstand d des Probenträgers zur Zwischenelektrode soll möglichst klein sein, um möglichst geringe Spannungen U₁ schalten zu können. Es besteht eine Untergrenze für diesen Abstand bei etwa einem Millimeter, der aber für praktische Konstruktionen von Ionenquellen kaum in Frage kommt. In der Praxis beträgt dieser Abstand d etwa drei Millimeter.

Eine Ionenquelle für verzögert einschaltende Beschleunigung besitzt also in der Regel minde stens eine Zwischenblende zwischen dem Probenträger und der Grundelektrode, die sich auf dem Potential der feldfreien Flugstrecke befindet. Die Ionenquelle wird also mit mindestens zwei Beschleunigungsspannungen betrieben, von denen die erste zwischen dem Probenträger und der ersten Zwischenelektrode, und die letzte zwischen der letzten Zwischenelektrode und der Grundelektrode angelegt ist. Normalerweise wird nur eine Zwischenelektrode verwendet, dementsprechend gibt es dann zwei Beschleunigungsspannungen. In einigen Fällen werden zwei Zwischenblenden benutzt. Vom Prinzip her ist es auch möglich, ohne Zwischenblende mit nur einer einzigen (voll schaltbaren) Beschleunigungsspannung auszukommen.

Das Verfahren der verzögert einsetzenden Beschleunigung hat jedoch auch Nachteile. So lie fert es das optimale Massenauflösungsvermögen nur in einem schmalen Massenbereich. In den anderen Teilen des gesamten Spektrums ist das Auflösungsvermögen zwar immer noch deut lich verbessert, doch nicht bis zum optimalen Grenzwert. Dieser Bereich optimaler Auflösung kann aber durch Änderungen der Verzögerungszeit τ oder durch Änderungen der Teilbeschleu nigungsspannung U₁ auf eine beliebige Stelle des Massenbereichs verschoben werden, so daß dieser Nachteil nicht zu schwer wiegt.

Das gilt nicht für einen weiteren, ganz entscheidenden Nachteil für genaue Massenbestimmun gen im höheren Massenbereich: Das optimale Massenauflösungsvermögen nimmt zu höheren Massen hin schnell ab. Aus Gründen der Fokussierung der Anfangsionengeschwindigkeit in erster Ordnung ist das Massenauflösungsvermögen von der Geschwindigkeitsstreubreite der Ionen vor dem Probenträger abhängig. Für ein Flugzeitmassenspektrometer mittlerer Länge (1,6 Meter) und einer Geschwindigkeitsverteilung zwischen 200 und 1300 Metern pro Sekun de ist die Massenauflösung nach einer durch Simulationen ermittelten Faustregel auf maximale Werte von etwa R_m = 40 000 000 u/m beschränkt. Unter Massenauflösung wird hier, abwei chend von der üblichen Definition, die Flugzeit der Ionen geteilt durch die volle Linienbreite am Fuß der Linie (gemessen in denselben Zeiteinheiten) verstanden, nicht durch die übliche Breite in halber Höhe. Für Ionen der Masse m = 1000 u wird somit ein Auflösungsvermögen von etwa R_m = 40 000 erreicht, das aber für Ionen der Masse m = 8000 u schon auf R_m = 5000 abfällt. Das bedeutet, daß sich zwei Ionen der Massen m₁ = 8000 u und m₂ = 8001 u nicht mehr voneinander trennen lassen. Zu höheren Massen hin können also die bekannten Isotopenmuster organischer Ionen keinesfalls mehr aufgelöst werden. In der Praxis sehen diese Werte noch etwas schlechter aus.

Das schlechte Massenauflösungsvermögen für Ionen höherer Masse führt auch zu einem schlechteren Verhältnis des Signals zum Rauschen, und damit zu einer schlechteren Empfind lichkeit und zu einem schlechteren Nachweisvermögen.

Eine Fokussierung zweiter Ordnung in bezug auf variierende Anfangsgeschwindigkeiten ist für ein lineares Massenspektrometer nicht explizit bekannt geworden. Es sind jedoch in der Veröf fentlichung "Space-Velocity Correlation Focusing" von S. M. Colby und J. P. Reilly, Anal. Chem. 1996, 68, 1419-1428, Kurven der Abweichungen der Flugzeiten für variierende An fangsgeschwindigkeiten dargestellt, die auf eine Fokussierung zweiter Ordnung hinweisen, ohne daß die Autoren sie als solche bezeichnet haben. Diese Kurven wurden durch Simulati onsprogramme berechnet, deren Grundlagen jedoch nicht so ausführlich dargestellt wurden, daß sie sich ohne weitere Kenntnisse nachprüfen lassen. Da es sich um ein ungewöhnliches Massenspektrometer mit zwei weiteren Nachbeschleunigungsstrecken nach der feldfreien Flugstrecke handelt, liegt der Verdacht nahe, daß die Kombination von vier Beschleunigungs strecken, eine davon mit verzögert einschaltender Beschleunigung, diese Art der Fokussierung bewirkt. Die Spannungen wurden nach dem Einschalten der Beschleunigung nicht zeitlich ver ändert, außer einer Untersuchung eines Einschaltens mit endlicher Anstiegszeit, die jedoch nach Aussage der Autoren keine wesentliche Änderung der Fokussierung bewirkt.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, besonders im höheren Massenbereich das erzielbare Massen auflösungsvermögen linearer Flugzeitmassenspektrometer deutlich zu verbessern.

Erfindungsgedanke

Die Fokussierung der Anfangsgeschwindigkeiten in erster Ordnung, die durch die verzögert einsetzende Beschleunigung bewirkt wird, zeigt eine bestimmte Form der Abweichung der Flugzeiten derjenigen Ionen, deren Anfangsgeschwindigkeit nicht mit der mittleren Geschwin digkeit der Ionen übereinstimmt. Diese Abweichung ist proportional zum Quadrat der Diffe renz der Anfangsgeschwindigkeiten von einer mittleren Anfangsgeschwindigkeit, bildet also eine Parabel, wie sie in den Fig. 3 und 5 zu sehen ist. Diese Parabel ist typisch für Fokussie rungen erster Ordnung. Sowohl langsamere wie auch schnellere Ionen haben dabei etwas kür zere (oder in anderen Fällen längere) Flugzeiten als die Ionen mittlerer Anfangsgeschwindig keit. Sie bilden also am Profil des Ionensignals einen einseitigen Ausläufer. Schon dieser ein seitige Ausläufer ist nicht günstig für eine genaue Bestimmung der Masse, da er eine stark un symmetrische Form des Massensignals erzeugt und so die Bestimmung des Signalzentrums erschwert.

Es ist nun die Grundidee der Erfindung, diese Abweichungen der Flugzeiten durch eine dyna mische Veränderung einer der (oder mehrerer) Beschleunigungsspannungen nach dem Ein schalten der Beschleunigung so zu kompensieren, daß eine Fokussierung zweiter Ordnung entsteht.

Es stellt sich bei Untersuchungen mit Computersimulationen heraus, daß dieses Ziel durch ganz verschiedenartige, beliebige glatte und stetige Veränderungsfunktionen für die Beschleuni gungsspannungen erreicht werden kann, beispielsweise durch eine lineare Veränderung der Beschleunigung, durch eine hyperbolische Veränderung, oder durch eine exponentielle Verän derung. Dabei kann die Veränderung auf die erste Beschleunigungsspannungsspannung zwi schen Probenträger und Zwischenblende wirken, aber auch auf eine andere Beschleunigungs spannung zwischen erster Zwischenblende und Grundelektrode. Auch eine Veränderung meh rerer Spannungen gleichzeitig kann in diesem Sinne verwendet werden, beispielsweise eine Veränderung des Zwischenpotentials an der Zwischenblende bei konstanter Gesamtspannung, wodurch beide Beschleunigungsfelder (und -spannungen) vor und hinter der Zwischenblende gleichzeitig verändert werden.

Alle diese Veränderungen ergeben bei richtiger Wahl der Einstellparameter eine Fokussierung zweiter Ordnung am Ort einer Masse im Spektrum. Dieser Ort kann durch Veränderung der Einstellparameter mit leichten Einschränkungen an jede beliebige Masse des Massenbereichs verschoben werden.

Ein einfaches, lineares Flugzeitmassenspektrometer ohne Nachbeschleunigungsstrecke mit ei ner Ionenquelle, die nur eine Zwischenblende besitzt, hat drei geometrisch gegebene Bestim mungsgrößen: den Abstand d₁ zwischen Probenträger und Zwischenblende, den Abstand d₂ zwischen Zwischenblende und Grundelektrode, und die Länge l der Flugstrecke bis zum De tektor. Diese Bestimmungsgrößen sind fest. Bei einer einparametrigen Veränderungsfunktion, die auf nur eine der Beschleunigungsspannungen einwirkt, ergeben sich zusätzlich folgende vier Einstellparameter:

1. Die Verzögerungszeit τ für das Einschalten der Beschleunigung vor dem Probenträger,
2. der Wert der unveränderten Beschleunigungsspannung,
3. der Anfangswert für die zu verändernde Beschleunigungsspannung, und
4. der Parameter für die zeitliche Veränderung der Beschleunigungsspannung, beispielsweise die absolute Spannungsabnahme pro Zeiteinheit für den linearen oder die relative Span nungsabnahme pro Zeiteinheit für den exponentiellen Abfall der Spannung nach dem Ein schalten (in diesem Fall kann beispielsweise auch die Halbwertszeit oder die Zeit des Abfalls auf den Wert 1/e verwendet werden).

Sind zwei dieser Einstellparameter fest vorgegeben, so kann durch Wahl der beiden anderen der Punkt der Fokussierung zweiter Ordnung an eine beliebige Stelle des Massenbereichs ver schoben werden. Die Vorgabe der beiden festeingestellten Einstellparameter muß allerdings in einem günstigen Wertebereich liegen, andernfalls existiert eine untere Massenschwelle für den Fokuspunkt zweiter Ordnung.

Sind beispielsweise die Anfangswerte beider Beschleunigungsspannungen fest gewählt, so kann der Fokuspunkt durch Verzögerungszeit und die Zeitkonstante der Spannungsveränderung eingestellt werden. Sind dagegen die unveränderte Beschleunigungsspannung und die Zeitkon stante der Veränderung der anderen Beschleunigungsspannung fest eingestellt, so kann der Fokuspunkt zweiter Ordnung durch Verzögerungszeit und Anfangswert der veränderlichen Beschleunigungsspannung eingestellt werden, wenn die Zeitkonstante der Veränderung nur eine genügend schnelle Änderung ergibt.

Es sei noch angemerkt, daß ein Fokuspunkt erster Ordnung jeweils durch Veränderung eines einzigen Parameters eingestellt werden kann. Die Verschiebung dieses Fokuspunkts erster Ordnung erfordert die Zuhilfenahme eines zweiten Einstellparameters. Dieser Fokuspunkt ist in der Regel bereits schärfer als der Fokuspunkt ohne dynamische Veränderung einer Beschleuni gungsspannung, bietet also ein höheres Auflösungsvermögen.

Im Fokuspunkt zweiter Ordnung können in Computersimulationen ganz außerordentlich hohe Auflösungen erhalten werden, wobei die optimalen Auflösungen allerdings auch wieder zu hohen Massen hin abfallen. Immerhin ist es möglich, bei Masse 32 000 u noch eine Einheitsauf lösung (R_m = 32 000 im oben definierten Sinn) zu erreichen, d. h., es läßt sich das Signal der Masse 32 000 u noch vollständig vom Signal der Masse 32 001 u trennen. Da die beiden Flug zeiten dieser Massen (bei einer allerdings hohen Beschleunigungsspannung von 30 Kilovolt) aber nur etwa 2 Nanosekunden auseinanderliegen, kann beim gegenwärtigen Stand der Tech nik sowohl der Transientenrekorder wie auch der Ionendetektoren die Auflösung experimentell nur knapp nachgewiesen werden.

Es sei hier ein erstes Beispiel für simulativ zu erzielende Auflösungen gegeben. Das Massen spektrometer sei durch folgende geometrische Bestimmungsgrößen charakterisiert:

d₁ = 3 Millimeter (Abstand zwischen Probenträger und Zwischenblende),
d₂ = 30 Millimeter (Abstand zwischen Zwischenblende und Grundelektrode),
l = 1,6 Meter (feldfreie Flugstrecke zwischen Grundelektrode und Detektor).

Folgende Einstellparameter seien ebenfalls fest vorgegeben:

t_a = 1 Mikrosekunde (exponentieller Abfall auf 1/e),
U = 30 Kilovolt (gesamte Beschleunigungsspannung).

Für dieses Massenspektrometer können in Computersimulationen folgende Auflösungsvermö gen erreicht werden:

Tabelle 1

Auflösungsvermögen R_m bei exponentiellem Abfall mit Zeitkonstante 1 µs

Wird statt dessen die Zeitkonstante des exponentiellen Abfalls auf t_a = 2 Mikrosekunden er höht, so kann für die unteren Massen die Fokussierung zweiter Ordnung nicht mehr erreicht werden:

Tabelle 2

Auflösungsvermögen R_m bei exponentiellem Abfall mit Zeitkonstante 2 µs

Die Massenauflösung R_m wurde aus der Zeitauflösung R_t berechnet. Die Zeitauflösung ist da bei die Differenz zwischen der größten und der kleinsten Flugzeit, geteilt durch die Flugzeit, gerechnet für Ionen der Anfangsgeschwindigkeiten von 250 bis 1150 Meter pro Sekunde. Die Massenauflösung ist wegen des quadratischen Zusammenhangs gleich der halben Zeitauflö sung. Da die Zeitauflösung die gesamte Linienbreite, gemessen am Fuß, berücksichtigt, ist auch die Massenauflösung (entgegen der Konvention) so definiert.

Der Bereich hohen Auflösungsvermögens ist dabei recht schmal. Bei Masse m = 32 000 u, bei der im ersten Beispiel eine Massenauflösung von R_m ≈ 44 000 errechnet wurde, erstreckt sich der Bereich der Einheitsauflösung (R_m 32 000) nur über etwa 40 Masseneinheiten, etwa von 31 980 bis 32 020 u. Im zweiten Beispiel (R_m ≈ 105 000) reicht der Bereich der Einheitsauflö sung über 100 Masseneinheiten von 31 955 u bis 32 055 u.

Die hohen Auflösungen sind allerdings reine Rechenwerte, die in der Realität nicht erreicht werden können, da der MALDI-Prozeß, Feldfehler und insbesondere die heute erhältlichen Detektoren die Signalbreiten auf schmalste Linien von bestenfalls 2 Nanosekunden begrenzen. Damit lassen sich in Flugzeitmassenspektrometern bei 30 Kilovolt Gesamtbeschleunigung und 1,6 Meter Länge bestenfalls folgende Werte erhalten:

Tabelle 3

Praktisch erzielbare maximale Auflösungsvermögen

Alle rechnerischen Werte, die darüberliegen, können daher heute in Experimenten noch nicht verifiziert werden. Es ist jedoch mit dem Verfahren und Gerät nach dieser Erfindung möglich, die hier gegebenen Werte einzustellen. Es ist auch zu erwarten, daß neue Generationen von Detektoren zu besseren Auflösungen befähigen werden.

Im Gegensatz zur normalen verzögert einschaltenden Beschleunigung sind im Falle der hier vorgestellten "verzögert einschaltenden dynamischen Beschleunigung" stets zwei Parameter optimal einzustellen, um die Fokussierung zweiter Ordnung zu erhalten.

Es sei hier ein drittes Beispiel für simulativ zu erzielende Auflösungen gegeben, wobei dieses Mal ein linearer Abfall der Beschleunigungsspannung programmiert wird. Das Massenspektro meter sei wie vor durch folgende geometrische Bestimmungsgrößen charakterisiert:

d₁ = 3 Millimeter (Abstand zwischen Probenträger und Zwischenblende),
d₂ = 12 Millimeter (Abstand zwischen Zwischenblende und Grundelektrode),
l = 1,6 Meter (feldfreie Flugstrecke zwischen Grundelektrode und Detektor).

Folgende Einstellparameter seien dieses Mal fest vorgegeben:

a = 0,5 (voller linearer Abfall in zwei Mikrosekunden),
U₂ = 30 Kilovolt (zweite Beschleunigungsspannung).

Tabelle 4

Auflösungsvermögen bei vollem linearem Abfall in 2 µs

Wird ein voller linearer Abfall in nur einer Mikrosekunde gewählt, so können wieder für alle oben angegebene Massen Fokuspunkte zweiter Ordnung gefunden werden, mit Auflösungsver mögen über 30 Millionen für die Massen 1000 und 2000 u. Der Abfall des Auflösungsvermö gens zu hohen Massen hin ist dabei etwas größer, wie es auch schon bei den beiden ersten Bei spielen sichtbar wurde.

Zweites und drittes Beispiel zeigen, daß es eine Massenschwelle für das Auftreten der Fokus sierung zweiter Ordnung gibt, die von der Zeitkonstante der Spannungsveränderung abhängt. Zwischen dem Massenbereich, der nur eine Fokussierung erster Ordnung erlaubt, und dem darüberliegenden Bereich mit Fokussierung zweiter Ordnung liegt übrigens stets eine Masse, die sich in dritter Ordnung fokussieren läßt. Hier lassen sich extreme Auflösungen erreichen. Dieser Punkt kann durch Veränderung von drei Einstellparametern ebenfalls an jede beliebige Stelle im Spektrum verschoben werden.

Aus der bekannten massenabhängigen Änderung der beiden Einstellparameter für optimales Auflösungsvermögen kann nun nach dieser Erfindung eine Steuerung konstruiert werden, mit der sich das optimale Auflösungsvermögen an eine beliebige Stelle im Massenspektrum ver schieben läßt. Damit läßt sich ein Massenspektrometer bauen, mit dem sich an einer Stelle im Spektrum, an dem ein besonderes Signal erwartet wird, die optimale Auflösung einstellen läßt.

Für die meisten analytischen Aufgaben in Industrie, Medizin und Forschung existiert ein sol cher Erwartungswert für die Masse der zu bestimmenden Ionen. Es seien nur einige Gebiete kurz erwähnt: Produktionskontrolle, Qualitätssicherung, medizinische Proteinanalysen, DNA-Mu tantenanalysen, Markierungen mit stabilen Isotopen. Aber es kommen auch immer wieder Aufgaben vor, bei denen es darauf ankommt, einen größeren Massenbereich gleichzeitig zu überschauen. Für solche Aufgaben stellt man das Massenspektrometer auf einen Kompromiß leichter Defokussierung ein. Auch für diesen Kompromiß bietet diese Erfindung Vorteile. So ist es möglich, den Massenbereich bis 4000 u gleichzeitig mit Einheitsauflösung aufzunehmen; dabei ist also jede Masse von der nächsten getrennt.

Die Erfindung hat besondere Vorteile, die nicht nur in der hohen Auflösung liegen. Im Fokus punkt zweiter Ordnung sind insbesondere die Profile der Massensignale symmetrisch, so daß sich durch das Verfahren der Schwerpunktsbildung die Lage des Massensignals wesentlich richtiger bestimmen läßt, als im Fokuspunkt erster Ordnung mit seiner unsymmetrischen Form. Außerdem ist die Lage des Massensignals wesentlich unabhängiger von der mittleren Ge schwindigkeit der Ionen. Wird durch zufällige Variation der Laserlichtstärke (oder durch ande re Einflüsse) die mittlere Geschwindigkeit der Ionen in der entstehenden Dampfwolke geän dert, so resultiert im Fokuspunkt zweiter Ordnung eine wesentlich kleinere Verschiebung der Lage des Massensignals als im Fokuspunkt erster Ordnung. Das Verfahren ist viel stabiler ge genüber zufälligen oder gewollten Eingriffen.

Beschreibung der Bilder

Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines Flugzeitmassenspektrometers mit ihren schema tisch angedeuteten Versorgungseinheiten. Die Probenträgerelektrode 1 befindet sich auf dem Beschleunigungspotential U = U₁ + U₂, die Zwischenelektrode 2 auf dem Potential U₂, die Grundelektrode 3 auf Erdpotential. In der feldfreien Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10 befindet sich hier eine ionenoptische Ionenstrahleinzellinse 4.

Die Beschleunigungsspannung U₁ zwischen Probenträger 1 und Zwischenblende 2 ist schaltbar und dynamisch veränderbar. Ein Lichtblitz aus dem Laser 5 wird von der Linse 6 in einem konvergenten Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 fokussiert, die sich auf dem Probenträger 1 befin det. Zu dieser Zeit hat die Beschleunigungsspannung den Wert U₁ = 0. Der Lichtblitz erzeugt in einem MALDI-Prozeß Ionen der Analytsubstanz mit einer mittleren Anfangsgeschwindig keit ν ≈ 700 Meter pro Sekunde und großer Geschwindigkeitsstreuung. Nach einer Verzöge rungszeit τ wird die Beschleunigungsspannung U₁ auf den Anfangswert U_1,0 geschaltet, worauf sie exponentiell mit einer Halbwertszeit von θ_½ abfällt. Ab der Zeit t = τ werden die Ionen be schleunigt. Sie bilden den Strahl 9 des Ionenstromes, der nach Durchlaufen der feldfreien Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10 vom Detektor 10 zeitaufgelöst ge messen wird.

Die hier gezeigte Anordnung hat gitterlose Blenden als Zwischenelektrode und 2 und Grunde lektrode 3 und braucht daher die Einzellinse 4 zur Parallelisierung des Ionenstrahls 9. Bei Ein führung von Gittern in Zwischenelektrode 2 und Grundelektrode 3 kann die Einzellinse 4 ent fallen, allerdings verringern die Zwischengitter wegen ihrer unvermeidlichen Kleinwinkelstreu ung die erzielbare Auflösung.

Fig. 2 zeigt ein Diagramm der zeitlichen Veränderung der Beschleunigungsspannung U₁. Zur Zeit t = 0 startet der Laserblitz den Ionisierungsprozeß. Nach einer Verzögerungszeit τ wird die Beschleunigungsspannung U₁ auf den Anfangswert U_1,0 geschaltet, worauf sie exponentiell mit einer Halbwertszeit von θ_½ abfällt.

Fig. 3, 4 und 5 zeigen drei Diagramme der Flugzeitabweichungen zu schneller und zu langsamer Ionen von denen der mittleren Geschwindigkeit. Es wurden sieben Anfangsge schwindigkeiten gewählt und durch die Indizes 1 bis 7 gekennzeichnet. Index 1 entspricht Io nen einer Anfangsgeschwindigkeit von 250 Metern pro Sekunde, Index 7 einer Geschwindig keit von 1150 Metern pro Sekunde. Die mittlere Geschwindigkeit (Index 4) entspricht 700 Metern pro Sekunde. Die Abweichungen der Flugzeit sind in Nanosekunden angegeben.

Alle Diagramme wurden für dieselbe Anfangsbeschleunigung U_1,0 = 2,6 Kilovolt gerechnet und für dieselbe exponentielle Abfallfunktion, die in jeweils einer Mikrosekunde auf 39,6% abfällt. Es wurden für die Massen 4000 u, 8000 u und 16 000 u jeweils durch die Wahl der Verzöge rungszeit τ Fokussierungen eingestellt. Im Falle der Fig. 3 und 5 sind die Fokussierungen von erster Ordnung, kenntlich an den parabelförmigen Kurven der Abweichungen. Im Falle der Fig. 4 wird für die Masse 8000 u gerade ein Fokuspunkt dritter Ordnung erreicht, kenntlich an der Parabel dritter Ordnung. In diesem Fall sind die absolut gemessenen Abweichungen minimal, sie betragen hier weniger als ± 0,03 Nanosekunden. Aus einer gesamten Flugzeit von 62 Mikrosekunden ergibt sich bei genauer Berücksichtigung der maximalen Abweichungen eine Flugzeitauflösung von 1,3 Millionen.

Besonders günstige Ausführungsformen

Eine Ausführung eines linearen Flugzeitmassenspektrometer mit Hochauflösung nach dieser Erfindung wird im Prinzip in Fig. 1 gezeigt.

Bei Benutzung der oben bereits geschilderten verzögerten dynamischen Beschleunigung befin den sich Probenträgers 1 und Zwischenelektrode 2 zunächst auf dem Potential U₂, Der Proben träger wird nach der Verzögerungszeit τ von einigen zehn bis tausend Nanosekunden nach ionisierendem Laserblitz auf das Potential U₁ + U₂ heraufgeschaltet. Es setzt sofort ein expo nentieller Abfall der Beschleunigungsspannung U₁ ein, so daß sich der Probenträger nach eini ger Zeit wieder auf dem Potential U₂ befindet. Die zeitliche Veränderung der Beschleunigungs spannung U₁ ist im Diagramm der Fig. 2 wiedergegeben. Bei richtiger Wahl der Verzöge rungszeit τ, der Spannungen U₁ und U₂, und der Halbwertszeit θ_½ des exponentiellen Abfalls erzielt man an einer Masse im Spektrum Hochauflösung durch Fokussierung zweiter Ordnung. Dabei können zwei der vier Einstellparameter fest gewählt werden, für die Einstellung der Hochauflösung genügen zwei der Einstellparameter.

Dieser Betrieb mit einer Variation allein von U₁ ist aber nur eine von vielen möglichen Varian ten. So kann beispielsweise auch die Beschleunigungsspannung U₂ allein oder in Verbindung mit einer Änderung von U₁ variiert werden. Es kann beispielsweise auch die Gesamtspannung U = U₁ + U₂ konstant gehalten werden, aber beide Spannungen U₁ + U₂ werden gegenläufig verändert. Die Veränderungen brauchen auch nicht exponentiell erfolgen. Es ist jede Funktion mit stetiger Veränderung anwendbar. So können mit linearer Veränderung ähnliche Werte der Hochauflösung erreicht werden; die lineare Veränderung hat aber den Nachteil, daß ihr aktiv ein Ende gesetzt werden muß. Auch verschiedene andere Funktionen, beispielsweise ein hy perbolischer Abfall 1-1/(t-t₀), können verwendet werden.

Die exponentielle Änderung hat die Vorteile, daß sie (a) elektronisch sehr leicht, beispielsweise durch Kondensator und entladendem Widerstand, erzeugt werden kann, und daß sie (b) ein natürliches Ende findet, das nicht aktiv gesetzt werden muß.

Mit dieser Anordnung eines Flugzeitmassenspektrometers können wie gewöhnlich Spektren der Analytsubstanzen aufgenommen werden. Die Spektrenaufnahme beginnt mit der Ionisie rung der Probensubstanzen 8 auf dem Probenträger 1, wobei hier das MALDI-Verfahren zur Ionisierung beschrieben wird. Die Ionen werden durch einen Lichtblitz von etwa 3 bis 5 Nano sekunden Dauer aus dem Laser 5 erzeugt. Gewöhnlich wird UV-Licht mit einer Wellenlänge von 337 Nanometer aus einem preiswerten Stickstoff-Laser benutzt. Der Lichtblitz ist durch die Linse 6 als konvergenter Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 auf der Oberfläche des Probenträgers 1 fokussiert. Die in der Dampfwolke, die durch den Laserfokus erzeugt wird, gebildeten Ionen werden nach der Verzögerungszeit τ zunächst im elektrischen Feld zwischen Probenträger 1 und Zwischenelektrode 2 beschleunigt, jedoch nach dieser Erfindung zeitlich abnehmend, und dann im elektrischen Feld zwischen Zwischenelektrode 2 und Grundelektrode 3. Der in der gitterfreien Elektrodenanordnung leicht defokussierte Ionenstrahl wird zu Beginn der Flug strecke in der Einzellinse 4 auf den Detektor 10 fokussiert. Die fliegenden Ionen bilden einen zeitlich stark variierenden Ionenstrom 9, der am Ende der Flugstrecke vom Ionendetektor 10 mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen wird.

Durch den besonderen MALDI-Prozeß können Massensignale am Detektor erzeugt werden, die eine zeitliche Breite haben, die weit unter einer Nanosekunde liegen, obwohl der Lichtblitz des Lasers eine zeitliche Dauer von 3 bis 5 Nanosekunden hat. (Es existiert eine "virtuelle", sehr scharf definierte Anfangszeit für die adiabatische Expansion).

Der durch den Ionenstrahl gegebene zeitvariable Ionenstrom wird am Detektor gewöhnlich mit einer Abtastrate von 1 oder 2 Gigahertz gemessen und digitalisiert. Transientenrekorder mit noch höherer zeitlicher Auflösung werden in Kürze eingesetzt werden können. Üblicherweise werden die zeitgleichen Meßwerte aus mehreren Spektrenaufnahmen addiert, bevor die Mas senlinien in den gespeicherten Daten gesucht und über die Datenauswertung von der Zeitskala über die Massenkalibrierkurve in die Massenwerte transformiert werden.

Die Polarität der verwendeten Hochspannung für die Ionenbeschleunigung muß gleich der Po larität der untersuchten Ionen sein: Positive Ionen werden durch einen positiv geladenen Pro benträger abgestoßen und beschleunigt, negative Ionen durch einen negativ geladenen Proben träger.

Selbstverständlich kann man das Flugzeitmassenspektrometer auch so betreiben, daß sich die Flugstrecke in einem (nicht in Fig. 1 gezeigten) Rohr befindet, das sich auf dem Beschleuni gungspotential U befindet, während der Probenträger 1 auf Erdpotential liegt. In diesem be sonderen Fall liegt das Flugrohr auf positivem Potential, wenn negativ geladene Ionen unter sucht werden sollen, und umgekehrt. Dieser Betrieb vereinfacht die Konstruktion der Ionen quelle, da die Isolatoren für den Halter des auswechselbaren Probenträgers 1 entfallen können. In diesem Fall ist es günstig, das Potential der Zwischenelektrode zu schalten und zu variieren.

Der Schärfebereich kann durch Steuerung zweier Einstellparameter, beispielsweise durch die Verzögerungszeit τ und die Anfangsbeschleunigungsspannung U_1,0 beliebig verschoben wer den. Es ist dabei möglich, die Verschiebung so durchzuführen, daß die einkalibrierte Mas senskala gültig bleibt. Dazu ist die Beschleunigungsspannung U₂ in geeigneter Weise mitzufüh ren. Wird diese Art der Verschiebung des Schärfebereichs fest in die Rechnersteuerung des Massenspektrometers eingebaut und keine andere Steuerung der Verschiebung zugelassen, so schadet diese Verschiebung der Schärfebereichs einer Massenbestimmung nicht, da die Mas senskala unter diesen Verhältnissen gültig bleibt.

Claims

1. Verfahren für die Spektrenaufnahme von Analytionen in einem linearen Flugzeitmassen spektrometer mit Ionisierung der auf einer Oberfläche eines Probenträgers aufgebrachten Analytsubstanzen in einer Ionenquelle, die mit mindestens zwei Beschleunigungsspannun gen betrieben wird, und mit Verbesserung der Massenauflösung durch eine zeitverzögert einsetzende Beschleunigung der Ionen im Raum vor dem Probenträger, dadurch gekennzeichnet, daß Höchstauflösung durch eine Fokussierung zweiter Ordnung an einem Punkt des Massenspektrums dadurch erreicht wird, daß mindestens eine der Be schleunigungsspannungen während der Ionenbeschleunigung verändert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung der veränderli chen Beschleunigungsspannungen in stetiger Weise durch je eine einparametrige Funktion erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die veränderlichen Beschleuni gungsspannungen linear verändert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die veränderlichen Beschleuni gungsspannungen exponentiell verändert werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nur die Beschleunigungsspannung zwischen dem Probenträger und einer ersten Zwischenblen de verändert wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtbeschleunigungsspannung zwischen Probenträger und dem Potential der feldfreien Flugstrecke konstant bleibt, und daß nur das Potential einer ersten Zwischen blende verändert wird.

7. Flugzeitmassenspektrometer mit einer Ionenquelle, die eine Probenträgerelektrode, min destens eine Zwischenelektrode, und eine Grundelektrode auf dem Potential der feldfreien Flugstrecke besitzt, mit Spannungsversorgungen für die Potentiale der Probenträger- und Zwischenelektroden, wobei eines der Potentiale mit einer Verzögerungszeit für das Ver fahren der verzögert einschaltbaren Beschleunigung umschaltbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Spannungsversorgungen so eingerichtet sind, daß sich mindestens eines der Potentiale während der Beschleunigung der Ionen zeitlich stetig ver ändert.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich das veränderliche Poten tial exponentiell mit der Zeit verändert.