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Die Erfindung betrifft Verfahren
zur präzisen Massenbestimmung
von Ionen in einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss,
mit einem Pulser, einem Ionendetektor und einer Messeinrichtung
für die
Ionenströme
am Detektor gemäß dem Oberbegriff
der Patentansprüche
1 bis 4.
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Flugzeitmassenspektrometer der genannten Art
und ein Verfahren zur präzisen
Massenbestimmung von Ionen in einem solchen Flugzeitmassenspektrometer
sind aus der
US 6,373,052 B1 bekannt.
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Für
die massenspektrometrische Messung der Masse großer Moleküle, wie sie insbesondere in der
Biochemie vorkommen, eignet sich wegen beschränkter Massenbereiche anderer
Massenspektrometer kein anderes Spektrometer besser als ein Flugzeitmassenspektrometer.
Flugzeitmassenspektrometer werden häufig durch TOF oder TOF-MS
abgekürzt,
von englisch "Time-Of-Flight
Mass Spectrometer".
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Es haben sich zwei verschiedene Arten
von Flugzeitmassenspektrometern entwickelt. Die erste Art umfasst
Flugzeitmassenspektrometer für
die Messung pulsförmig
in einem winzigen Volumen erzeugter und axial in die Flugstrecke
hinein beschleunigter Ionen, beispielsweise mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption,
abgekürzt
MALDI, einer für
die Ionisierung großer
Moleküle
geeigneten Ionisierungsmethode.
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Die zweite Art umfasst Flugzeitmassenspektrometer
für den
kontinuierlichen Einschuss eines Ionenstrahls, von dem dann ein
Abschnitt quer zur Einschussrichtung in einem "Pulser" ausgepulst und als zur Flugrichtung
querliegendes, linear ausgedehntes Ionenbündel durch das Massenspektrometer
fliegen gelassen wird, wie es in 1 als
Prinzipbild dargstellt ist. Es wird also ein bandförmiger Ionenstrahl
erzeugt, in dem die Ionen einer Art, also eines Verhältnisses
von Masse zu Ladung, eine querliegende Front bilden. Diese zweite
Art von Flugzeitmassenspektrometern wird kurz als "Orthogonal-Flugzeitmassenspektrometer" (OTOF) bezeichnet;
sie wird vorzugsweise in Verbindung mit vakuumexterner Ionisierung
verwendet. Die meistverwendete Ionisierungsart hierfür ist das
Elektrosprühen
(ESI). Das Elektrosprühen
ist ebenfalls für
die Ionisierung großer
Moleküle
geeignet. Es können
aber auch andere Ionisierungsarten wie beispielsweise chemische
Ionisierung bei Atmosphärendruck
(APCI), Photoionisierung bei Atmosphärendruck (APPI) oder matrixunterstützte Laserdesorption
an Atmosphärendruck (AP-MALDI)
eingesetzt werden. Auch vakuum-intern erzeugte Ionen können verwendet
werden. Die Ionen können
vor Eintritt in das OTOF auch noch in entsprechenden Einrichtungen
selektiert und fragmentiert werden, um die Substanzen durch ihre
Fragmente besser zu charakterisieren.
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In dieser zweiten Art von Flugzeitmassenspektrometern
wird durch eine sehr hohe Zahl an Pulsvorgängen pro Zeiteinheit (bis zu
20000 Pulsungen pro Sekunde) eine hohe Zahl an Spektren mit jeweils
relativ geringer Anzahl an Ionen erzeugt, um die Ionen des kontinuierlichen
Ionenstrahls möglichst
gut auszunutzen.
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Für
die Aufnahme der Ionenströme
in diesen Orthogonal-Flugzeitspektrometern werden so genannte Kanalplatten-Sekundärelektronenvervielfacher
eingesetzt, deren durch die Ionen ausgelösten Einzelpulse in den meisten
der heute kommerziell erhältlichen
Geräte
durch Ereigniszähler
mit Digitalisierung der Ereigniszeit (TDC = time to digital converter) registriert
werden. Diese Technik hat aber pro Einzelspektrum einen nur sehr
geringen dynamischen Messbereich der Größe 1, dieser kann nur durch
eine hohe Anzahl addierter Einzelspektren erhöht werden. Der dynamische Messbereich
ist definiert als Quotient aus dem höchsten, an der Sättigungsgrenze
noch gerade unverzerrt aufgenommenen Ionensignal zum kleinsten,
sich aus dem Untergrundrauschen mit genügender Sicherheit heraushebenden
Signal. Wegen des beschränkten
dynamischen Messbereichs der TDC-Technik werden daher in Neuentwicklungen
inzwischen schnelle Transientenrekorder eingesetzt. Die schnellen
Transientenrekorder digitalisieren die verstärkten Ionenströme in einem
Takt von ein bis vier Gigahertz in Analog-zu-Digital-Wandlern mit einer Signalauflösung von
maximal acht bit. Damit hat das Einzelspektrum bereits einen dynamischen Messbereich
von etwa zwei Zehnerpotenzen; es werden dabei ebenfalls sehr viele
Einzelspektren aufaddiert, um zu höherem dynamischen Messbereich
zu kommen.
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Wenn man einen TDC benutzt, erhält man in einer
Sekunde bei 20 000 Pulsungen pro Sekunde ein Spektrum mit einem
dynamischen Messbereich von 20 000. Verwendet man dagegen einen
ADC mit einem dynamischen Messbereich von 50, so steigt der dynamische
Messbereich auf etwa 1 000 000. Die Verwendung von ADCs setzt aber
durch die Signalverschnierung der Elektronenlawine in der Kanalplatte
die Massenauflösung
leicht herab, zumal, wenn durch gute Fokussierungen eine Ionenstromsignalbreite
von nur etwa zwei Nanosekunden erzielt wird.
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Die Verwendung von ADCs in Flugzeitmassenspektrometern
mit orthogonalem Ioneneinschuss ist dabei keineswegs neu, sondern
bereits in
DE 694 25
588 T2 (
EP
0 746 403 B1 ; PCT/US94/06892) beschrieben, wobei in dieser
Patentschrift besondere Verfahren und Einrichtungen zur Begrenzung
der Ionenmessung auf die Ionensignalgruppen beansprucht werden,
um Speicherplatz und insbesondere Auslesezeit der so aufgenommenen
Summenspektren zu sparen.
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Wie in allen Massenspektrometern
kann man in einem Flugzeitmassenspektrometer immer nur das Verhältnis aus
Masse m des Ions zur Anzahl z von Elementarladungen bestimmen, die
das Ion trägt.
Wenn im Folgenden von „spezifischer
Masse" oder kurz
einfach nur von „Masse" gesprochen wird, so
ist damit immer das Verhältnis
m/z gemeint. Soll mit „Masse" im Folgenden ausnahmsweise
die physikalische Dimension der Masse verstanden werden, so wird
eigens von Molekularmasse gesprochen. Die Einheit der Molekularmasse
m ist die vereinheitlichte atomare Masseneinheit, abgekürzt u, meist
einfach als „Masseneinheit" oder „atomare
Masseneinheit" bezeichnet.
In der Biochemie und Molekularbiologie wird häufig die eigentlich veraltete
Einheit Dalton („Da") verwendet. Die
Einheit der spezifischen Masse m/z ist „Masseneinheit pro Elementarladung" oder „Dalton
pro Elementarladung" .
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Durch Elektrosprühen werden Ionen gebildet,
deren spezifische Masse m/z den Wert von etwa 5000 atomaren Masseneinheiten
pro Elementarladung kaum je übersteigt.
Das bedeutet nicht, dass nur Ionen von Molekülen einer Molekularmasse von maximal
5000 Masseneinheiten ionisiert werden können; Moleküle größerer Molekularmasse werden
nur entsprechend häufiger
geladen, so dass ihre spezifische Masse m/z in diesen Bereich fällt. Ionen
eines Moleküls
mit 50 Kilodalton haben eine breite Ladungsverteilung z von etwa
10 bis 50 elementaren Ladungen.
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Wie in
1 dargestellt,
werden die Ionen im Pulser quer zu ihrer Einschussrichtung, der x-Richtung,
beschleunigt und verlassen den Pulser durch Schlitze in Schlitzblenden.
Die Beschleunigungsrichtung nennen wir die y-Richtung. Die Ionen haben
nach ihrer Beschleunigung jedoch eine Richtung, die zwischen der
y-Richtung und der x-Richtung liegt, da sie ihre ursprüngliche
Geschwindigkeit in x-Richtung ungestört beibehalten. Der Winkel
zur y-Richtung beträgt α = arcus
tangens
, wenn E
x die
kinetische Energie der Ionen im Primärstrahl in x-Richtung und E
y die Energie der Ionen nach Beschleunigung
in y-Richtung ist. Die Richtung, in der die Ionen nach dem Auspulsen
fliegen, ist unabhängig
von der Masse der Ionen.
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Die Ionen, die den Pulser verlassen
haben, bilden jetzt ein breites Band, wobei sich Ionen einer Sorte
(einer spezifischen Masse m/z) jeweils in einer Front befinden,
die die Breite des Strahles im Pulser hat. Leichte Ionen fliegen
schneller, schwere langsamer, jedoch alle in gleicher Richtung,
abgesehen von eventuell auftretenden leichten Richtungsunterschieden,
die von leicht unterschiedlichen kinetischen Energien Ex der
Ionen beim Einschuss in den Pulser herrühren können. Die feldfreie Flugstrecke
muß ganz
vom Beschleunigungspotential umgeben sein, um die Ionen in ihrem
Flug nicht zu stören.
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Die Ionen gleicher spezifischer Masse,
die sich in verschiedenen Orten des Strahlquerschnitts befinden
und daher verschiedene Wegstrecken bis zum Detektor vor sich haben,
können
in Bezug auf ihre verschiedenen Startorte zeitfokussiert werden, indem
beim Einschalten der Auspulsspannung das Feld im Pulser gerade so
gewählt
wird, dass die am weitesten entfernten Ionen eine etwas höhere Beschleunigungsenergie
mitbekommen, die sie befähigt,
die vorausfliegenden Ionen in einem Startortfokuspunkt wieder einzuholen.
Die Lage des Startortfokuspunkts ist durch die Auspulsfeldstärke im Pulser frei
wählbar.
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Zur Erzielung eines hohen Auflösungsvermögens wird
das Massenspektrometer mit einem energiefokussierenden Reflektor
ausgestattet, der den ausgepulsten Ionenstrahl in seiner ganzen
Breite zum Ionendetektor hin reflektiert und dabei Ionen gleicher
Masse, jedoch leicht verschiedener kinetischer Anfangsenergie in
y-Richtung genau auf den breitflächigen
Detektor zeitfokussiert. Es können auch
mehrere Reflektoren verwendet werden.
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Die Ionen fliegen aus dem (letzten)
Reflektor auf einen Detektor zu, der ebenso breit sein muss wie der
Ionenstrahl, um alle ankommenden Ionen messen zu können. Auch
der Detektor muss parallel zur x-Richtung ausgerichtet sein, wie
in 1 wiedergegeben,
um die Front der fliegenden Ionen einer Masse auch zeitgleich zu
detektieren.
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In den Pulser wird normalerweise
ein kontinuierlicher Ionenstrom in Form eines feinen Ionenstrahls
in x-Richtung eingeschossen. Die Ionengeschwindigkeit in x-Richtung
wird in der Folge trotz der dazu senkrechten Ablenkung nicht verändert. Nach der
seitlichen Ablenkung in y-Richtung und der Reflektion im Reflektor
erreichen die Ionen den Detektor also in der gleichen Zeit, die
sie benötigt
hätten,
ohne die seitliche Ablenkung im Pulser durch einen Geradeausflug
den Detektor zu erreichen (sie würden dann
allerdings nicht auf den Detektor auftreffen, da sie parallel zu
seiner Oberfläche
fliegen).
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Die neuerliche Füllung des Pulsers nach seiner
Leerung beginnt sofort, wenn die Ionen den Pulser verlassen haben.
Sind die Ionen der schwersten Masse so weit geflogen, dass sie am
Detektor angekommen wären,
wenn der Durchgang zum Detektor frei wäre, so ist nicht nur der Pulser
wieder mit den schwersten Ionen gefüllt, sondern es würde auch
der Zwischenraum zwischen Pulser und Detektor mit Ionen gefüllt sein.
Es können
aber nur diejenigen Ionen nachgewiesen werden, die sich zu diesem
Zeitpunkt des nächsten
Auspulsens im Pulser befinden. Die Ionen im Zwischenraum zwischen
Pulser und Detektor sind für
die Analyse verloren. Man sieht hieran, dass es für eine hohe
Ausnutzung des Ionenstrahls notwendig ist, die Geometrie des Flugzeitmassenspektrometers
so zu wählen,
dass sich bei paralleler Anordnung von Reflektor und Detektor zum
Pulser der Detektor möglichst
nahe am Pulser befindet.
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Das Auflösungsvermögen R und die Massengenauigkeit
eines Flugzeitmassenspektrometers sind proportional zur Fluglänge. Man
kann also das Auflösungsvermögen erhöhen, indem
man ein sehr langes Flugrohr wählt
oder Mehrfachreflektionen durch mehrere Reflektoren einführt. Beispielsweise kann
man mit einer Flugstrecke von anderthalb Metern eine Massenauflösung von
etwa R = m/Δm
= 10000, mit etwa sechs Metern eine Massenauflösung von R = m/Δm = 40000
erreichen (d m ist dabei die Linienbreite des Ionensignals in halber
Maximalhöhe, gemessen
in Masseneinheiten). Eine lange Fluglänge bedeutet aber, dass man
bei gleicher Beschleunigungsspannung den Pulsertakt erniedrigen
muss, um alle Ionen zum Detektor gelangen zu lassen, bevor die nächste Pulsung
stattfindet. Das bedeutet aber wiederum, dass man nur wenige Ionen
des Ionenstroms für
die Messung ausnutzt.
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Eine bekannte Lösung für einen hohen Nutzgrad an Ionen
bei hohem Auflösungsvermögen durch eine
lange Flugstrecke ist die Zwischenspeicherung der Ionen in einer
speichernden Ionenleiteinrichtung, beispielsweise einem Ionenführungshexapol.
Eine Zwischenspeicherung in einem Quadrupol, das auch für Selektierungen
und Fragmentierungen verwendet werden kann, ist in
US 6,285,027 B1 (I. Chernushevich
und B. Thomson) beschrieben. Die Ionen können hier durch bekannte Maßnahmen
gespeichert und dann bei Bedarf zur Füllung des Pulsers ausgetrieben
werden. Diese Lösung
hat aber den Nachteil, dass der dynamische Messbereich wegen der
Sättigungsgrenze
des Detektors einerseits und der herabgesetzten Spektrenaufnahmefrequenz
andererseits stark eingeschränkt
wird. Man kann nur soviel Ionen sammeln, wie durch die. Sättigungsgrenze
vorgegeben ist. Die heute verwendeten schnellen Transientenrekorder
mit einem, zwei oder vier Gigahertz haben einen Analog-zu-Digital-Wandler von nur acht
bit Signalauflösung,
also 256 Zähleinheiten,
wobei bei hoher Datendigitalisierungsrate die Signalauflösung bereits
auf 5 bis 7 bit eingeschränkt
ist. Der dynamische Messbereich des Einzelspektrums ist also nur
in der Größenordnung
von etwa 50, zumal die einzelnen Ionen bereits einige Zähleinheiten
erreichen müssen,
um aus dem Rauschen erkannt zu werden. Die Sättigungsgrenze darf in keinem
der Einzelspektren überschritten
werden. Eine hoher dynamischer Messbereich kann somit nur über die
Addition einer großen
Anzahl von Spektren erreicht werden. Beipielsweise sind für einen
anzustrebenden dynamischen Messbereich von 100 000, wie sie von
anderen Arten der Massenspektrometrie leicht geliefert wird, mindestens
2000 Spektren zu addieren. Wird aber für die lange Flugstrecke die
Anzahl von Spektren pro Zeiteinheit vermindert, so vermindert sich
der dynamische Messbereich in gleicher Weise. Werden statt des hier
erwähnten
Analog-zu-Digital-Wandlers (ADC) nur so genannte Ereigniszeit-zu-Digital-Wandler
(TDC) benutzt, wie bei den derzeitigen kommerziellen OTOFs üblich, so
gehen weitere ein bis zwei Zehnerpotenzen an dynamischem Messbereich
verloren, die über
eine höhere
Zahl an Spektrenadditionen wettgemacht werden müssen.
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Es besteht also ein bisher unauflösbares Dilemma:
Eine höhere
Massenauflösung
durch eine lange Flugstrecke bedeutet für ein OTOF herkömmlicher
Technik auch immer eine geringere Empfindlichkeit oder einen geringeren
dynamischen Messbereich.
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Es ist die Aufgabe der Erfindung,
bei einem hohen Auflösungsvermögen gleichzeitig
eine hohe Ausnutzung der Ionen des Ionenstrahls und einen hohen
dynamischen Messbereich zu erzielen.
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Diese Aufgabe wird durch die in den
Patentansprüchen
1 bis 4 angegebenem Maßnahmen
gelöst.
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Es ist die Grundidee der Erfindung,
die Messeinrichtung (also den TDC einschließlich seiner Steuerelektronik
und seinem Digitalspeicher oder den Transientenrekorder mit seinem
ADC und seinem Speicher) eines hochauflösenden Flugzeitmassenspektrometers
mit orthogonalem Ioneneinschuss ohne jede Pause laufen zu lassen,
eine addierende Einspeicherung der Messwerte ohne Rücksicht
auf die Flugzeit der Ionen zyklisch mit einer hohen Zyklusfrequenz
in einen Abschnitt des Speichers vorzunehmen, bei jedem Zyklusanfang
den Ionenstrom synchron auszupulsen (das Spektrum der Ionen somit über mehrere
Messzyklen hinweg zu verteilen und aufzunehmen), und die Zugehörigkeit
der Ionen zu einem bestimmten Startpuls (zu „ihrem" Startpuls) durch die Form der Ionensignale,
insbesondere ihre Breite, durch die Form einer Ionensignalgruppe,
die durch die Isotopie erzeugt wird, durch eine Geschwindig keitsanalyse
der Ionen, oder zusätzlich durch
das Muster der mehrfach geladenen Ionen zu bestimmen. Mit dem Wissen
der Zugehörigkeit
zum n-ten Messzyklus nach dem Startpuls ist die exakte Flugzeit
berechenbar, und aus der Flugzeit kann die exakte spezifische Masse
m/z ermittelt werden.
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Die Grundidee ist in den Ansprüchen 1 bis
4 näher
dargelegt.
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Zur Vermeidung eines Jitters ist
es zweckmäßig, den
Pulser durch die Messeinrichtung exakt synchron zu den Einspeicherzyklen
steuern zu lassen.
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Die Breite der Ionensignale, gemessen
als Flugzeitbreite Δt
in halber Höhe
des Signals, steigt theoretisch linear mit der Flugzeit an: Δt = t/2R,
wobei R die theoretisch über
das Spektrum konstante Massenauflösung R = m/Δm ist. In der Praxis kommt jedoch
(in pythagoräischer
Addition) noch ein konstanter Zeitbetrag hinzu, der von einer Verbreiterung
des Signals durch den Detektor stammt, und der sich besonders bei
leichten und daher schnellen Ionen bemerkbar macht. Wie in 2 zu sehen, gibt es eine eindeutige
Beziehung zwischen der Signalbreite und der spezifischen Masse,
die zur groben Bestimmung der Masse verwendet werden kann. Die Signalbreite Δt kann für solche
Signale, die gut aus dem Untergrundrauschen herausragen, auf etwa
5% (und besser) bestimmt werden; damit kann sehr einfach bestimmt
werden, ob ein Ion im ersten, zweiten, dritten oder einem noch höheren Messzyklus
nach dem Startpuls den Detektor erreicht hat. Daraus wiederum ergibt
sich die genaue Flugzeit und damit wieder die präzise spezifische Masse des
Ions.
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Es gibt aber noch weitere Wege, die
ungefähre
Masse zu bestimmen. Einer dieser Wege führt über die Isotopie der Ionen.
Für organische
Ionen, die keine Halogene enthalten (beispielsweise alle gängigen Biomoleküle), ist
die Verteilung auf die verschiedenen Iosotopenmassen eines Moleküls praktisch nur
durch die Isotopie des Kohlenstoffs gegeben. 3 zeigt die Isotopenverteilungen für einfach
geladene organische Ionen am Ende des ersten, des zweiten, des dritten,
des vierten und des fünften Messzyklus.
Es wurde hierbei angenommen, dass die Enden der Messzyklen durch
die Massen 200, 800, 1800, 3200 und 5000 Dalton gegeben sind. Diese
Zahlen spiegeln die quadratische Abhängigkeit der Masse von der
Flugzeit wieder: es handelt sich um einmal, viermal, neunmal, sechszehnmal
und fünfundzwanzigmal
200 Dalton.
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Aus dem Isotopenverteilungsmuster
einer Liniengruppe lässt
sich also nach Regeln, die dem Fachmann bekannt sind, ebenfalls
grob die Molekularmasse der Ionen bestimmen. Das Muster kann aber
zu einfach oder mehrfach geladenen Ionen gehören; es muss also noch die
Ladung der Ionen bestimmt werden, um zu der spezifischen Masse der
Ionen zu gelangen. Die Ladung lässt
sich aber aus dem Abstand der Linien innerhalb der Liniengruppe
ermitteln: Entspricht der Abstand einer vollen Masseneinheit, so
handelt es sich um einfach geladene Ionen; entspricht er einer halben
Masse, so handelt es sich um doppelt geladene Ionen, und so weiter.
Für sehr hohe
Ladungszustände,
wie sie durch Elektrosprüh-Ionisierung
sehr schwerer Analytmoleküle
auftreten, muss eine sehr hohe Massenauflösung vorliegen, damit diese
Isotopen linien voneinander getrennt sind; es ist aber diese Endung
gerade für
Flugzeitspektrometer sehr hoher Massenauflösung zugeschnitten.
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Aber auch für Ionen sehr schwerer Molekularmassen,
die ein Profil der Isotopengruppe ohne Isotopenauflösung zeigen,
kann man aus der Breite des Gruppensignals sehr grob auf die spezifische Masse
schließen,
wie durch 4 illustriert.
Diese Grobbestimmung der Masse kann durch eine Analyse der Gruppen
verschiedener Ladungszustände noch
erhärtet
werden, da für
sehr schwere Moleküle immer
eine breite Verteilung der Ionen vieler Ladungszustände z, z+1,
z+2, z+3 und so weiter vorliegt. Die Analyse des Spektrums auf Ionensignale hin,
die (bis auf ihre verschieden Protonierung) gleiche spezifische
Masse, aber verschiedene Ionenladung haben, ist eine zusätzliche,
bereits viel feinere Absicherung der Grobbestimmung der spezifischen Masse.
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Eine weitere Möglichkeit zur groben Bestimmmung
der spezifischen Masse der Ionen besteht in einer Geschwindigkeitsanalyse
der am Detektor ankommenden Ionen, beispielsweise, indem der Detektor
nur einen Teil der Ionen vom Ionenstrahl abgreift und der restliche
Teil der Ionen in einem zweiten, in der Fluglänge versetzten Detektor gemessen
wird. Ein Vergleich der Spektren beider Detektoren ergibt die Geschwindigkeit
der jeweiligen Ionen, und daraus lässt sich sofort die grobe spezifische
Masse bestimmen. Die Höchstauflösung braucht
dabei nur für
einen der beiden Detektoren eingestellt sein.
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Aus der Grobbestimmung der Masse
ergibt sich jeweils, im wievielten Zyklus nach dem Start der Ionen
diese den Detektor erreicht haben. Daraus kann die präzise Flugzeit
und damit die präzise
Masse bestimmt werden.
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Bei Überlappungen von zwei oder
mehr isotopenaufgelösten
Signalgruppen kann man durch mathematische Methoden eine Auflösung der Überlappung
vornehmen; doch hat diese Methode ihre Grenzen. Die Erfindung ist
besonders auf eine hohe Massenauflösung im Spektrum zugeschnitten,
bei der nur relativ wenige Überlappungen
von Signalen auftreten. Die Erfindung setzt zur Vermeidung von zu vielen Überlappungen
auch verhältnismäßig „saubere" Spektren voraus,
also Spektren aus Ionen nur mäßig vielen
gleichzeitig vorhandener Substanzen. Die Erfindung ist somit ideal
geeignet für
hochauflösende
Spektrenaufnahmen von Substanzen, die durch vorgeschaltete Trennverfahren
getrennt wurden, beispielsweise durch Flüssigkeitschromatographie oder
Kapillarelektrophorese.
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1 zeigt
ein Prinzipschema eines Flugzeitmassenspektrometers mit orthogonalem
Ioneneinschuss. Durch eine Öffnung
(1) einer Vakuumkammer (2) tritt ein Bündel (3)
von Ionen verschiedener Anfangsenergien und Anfangsrichtungen in
ein Ionenleitsystem (4) ein, das sich in einer gasdichten Hülle befindet.
Gleichzeitig tritt auch Dämpfungsgas mit
in das Ionenleitsystem ein. Im Gas werden die eintretenden Ionen
durch Stöße abgebremst.
Da im Ionenleitsystem ein Pseudopotential für die Ionen herrscht, das in
der Achse (5) am geringsten ist, sammeln sich die Ionen
in der Achse (5). Die Ionen breiten sich in der Achse (5)
bis zum Ende des Ionenleitsystems (4) aus. Das Gas aus
dem Ionenleitsystem wird durch die Vakuumpumpe (6) an der
Vakuumkammer (2) abgepumpt.
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Am Ende des Ionenleitsystems (4)
befindet sich das Ziehlinsensystem (7). Eine Lochblende
dieses Ziehlinsensystems ist in die Wand (8) zwischen Vakuumkammer
(2) für
das Ionenleitsystem (4) und Vakuumkammer (9) für das Flugzeitmassenspektrometer
integriert. Letztere wird durch eine Vakuumpumpe (10) bepumpt.
Das Ziehlinsensystem (7) besteht in diesem Prinzipbild
aus fünf
Lochblenden; es zieht die Ionen aus dem Ionenleitsystem (4)
heraus und formt einen feinen Ionenstrahl mit geringem Phasenvolumen,
der in den Pulser (12) fokussiert wird. Der Ionenstrahl
wird in x-Richtung in den Pulser eingeschossen. Ist der Pulser mit
durchfliegenden Ionen der bevorzugt untersuchten Masse gefüllt, so
treibt ein kurzer Spannungspuls ein breites Paket an Ionen quer
zur bisherigen Flugrichtung in y-Richtung aus und bildet einen breiten
Ionenstrahl, der in einem Reflektor (13) reflektiert und
von einem Ionendetektor (14) zeitlich hochaufgelöst gemessen
wird. Im Ionendetektor (14) wird das Ionensignal, das in
einem Sekundärelektronenverstärker in
Form einer doppelten Vielkanalplatte verstärkt wird, kapazitiv auf einen 50-Ω-Konus übertragen,
Das so bereits verstärkte
Signal wird über
ein 50-Ω-Kabel
an einen Verstärker weitergegeben.
Der 50-Ω-Konus
dient dazu, das Kabel eingangsseitig abzuschließen, so dass hier keine Signalreflektionen
stattfinden können.
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Reflektor (13) und Detektor
(14) sind in diesem Prinzipbild exakt parallel zur x-Richtung
der in den Pulser eingeschossenen Ionen ausgerichtet. Der Abstand
zwischen Detektor (14) und Pulser (12) bestimmt
den maximalen Ausnutzungsgrad für
Ionen aus dem feinen Ionenstrahl.
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2 zeigt
die Zunahme der Linienbreiten für
Ionensignale, die im ersten Messzyklus oder nach einmaligem, zweimaligem
oder n-maligem Durchlaufen der Messzykluszeit im darauffolgenden
Messzyklus gemessen werden. Die Linienbreiten Δt sind in halber Maximalhöhe der Ionenstromsignale
zu messen und hier für
eine Auflösung
von R = 20 000 in Nanosekunden dargestellt. Aus diesem Diagramm
kann aus der gemessenen Linienbreite sofort bestimmt werden, wieviele
Messzyklen das Ion im Flugzeitmassenspektrometer bereits unterwegs
ist. Aus dieser Kenntnis kann dann sofort die präzise Flugzeit seit zugehörigem Startpuls,
und aus dieser die präzise
Masse der Ionen bestimmt werden.
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3 zeigt
die Isotopenmuster von einfach geladenen bioorganischen Ionen am
Ende des ersten, zweiten, oder n-ten Messzyklus. Es ist hier die Fluglänge des
Spektrometers so lang gewählt
worden, dass am Ende des ersten Messzyklus die Ionen der spezifischen
Masse 200 atomare Masseneinheiten pro Elementarladung den
Detektor erreichen. Am Ende des zweiten Messzyklus kommen dann Ionen der
Masse 800 Masseneinheiten an; nach dem dritten Messzyklus Ionen
der Masse 1800 Masseneinheiten, dann Ionen der Masse 3200 Masseneinheiten und
schließlich
nach dem fünften
Messzyklus Ionen der Masse 5000 Masseneinheiten pro Elementarladung.
Aus diesen Isotopenmustern lässt
sich sofort die ungefähre
Molekularmasse bestimmen. Für mehrfach
geladene Ionen, also Ionen einer anderen spezifi schen Masse, tritt
natürlich
das gleiche Isotopenmuster auf. Es muss daher zur Bestimmung der spezifischen
Masse auch der Abstand der Signallinien innerhalb der Isotopengruppe
hinzugezogen werden.
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4 zeigt
die Verbreiterung der Isotopengruppe mit steigender Molekularmasse.
Bei vielfacher Ladung dieser Isotopengruppe nimmt auch die Breite
dieser Isotopengruppe entsprechend ab; die Breite ist also ein direktes
Maß für die spezifische Masse
der Ionen. Man kann für
die Breite der Isotopengruppen eine analoge Kalibrierkurve aufstellen zu
der in 2 gezeigten Kalibrierkurve
für Einzelsignalbreiten.
Diese Grobbestimmung der Masse ist aber sehr unsicher und bedarf
der Absicherung.
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Wie oben beschrieben, ist es die
Grundidee der Erfindung, die Messeinrichtung eines Flugzeitmassenspektrometers
mit orthogonalem Ioneneinschuss ohne Rücksicht auf die Flugzeit der
Ionen zyklisch in einer hohen Zyklusfrequenz laufen zu lassen, den
Ionenstrom synchron zu den Messzyklen auszupulsen, und die Zugehörigkeit
der Ionen zu „ihrem" Startpuls durch
die Form der Ionenstromsignale, die Form einer Ionenstromsignalgruppe
oder die Geschwindigkeit der Ionen zu bestimmen. Mit dem Wissen
der Zugehörigkeit
zum n-ten Messzyklus nach dem Startpuls ist die exakte Flugzeit
berechenbar, und aus der Flugzeit kann die exakte spezifische Masse
m/z ermittelt werden.
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Da die Messeinrichtung ihre eigene
Steueruhr besitzt, ist es zur Vermeidung eines Jitters zweckmäßig, den
Pulser exakt synchron zu den Messzyklen durch die Messeinrichtung
selbst steuern zu lassen, und nicht eine externe Uhr zur Steuerung
der Messeinrichtung und des Pulsers zu verwenden.
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Die Erfindung ist besonders wirksam,
wenn es sich um hoch- bis höchstauflösende Flugzeitmassenspektrometrie
handelt, weil dann die Ionensignale schmal und weit voneinander
entfernt sind. Überlappungen
von Ionensignalen kommen kaum vor, zumal, wenn eine Substanztrennung
wie beispielsweise Flüssigkeitschromatographie
oder Kapillarelektrophorese vorgeschaltet sind.
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In der Regel wird eine vorbestimmte,
hohe Anzahl von Messzyklen durchlaufen, beipielsweise, bis eine
Zeit von einer Zehntel Sekunde abgelaufen ist. So erhält man zehn
Summenspektren pro Sekunde, die bei einer Messzyklusrate von 20
Kilohertz jeweils 2000 Einzelspektren umfassen. Die Messwerte der
Zyklen werden addierend gespeichert, und die Bestimmung der Form
der Ionenstromsignale oder der Ionenstromsignalgruppe, also der
Isotopengruppe, wird an dem so erlangten Summenspektrum durchgeführt. Der
dynamische Messbereich beträgt in
jedem Summenspektrum etwa 100 000.
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Am einfachsten ist die Bestimmung
der ungefähren
spezifischen Masse für
ein Ionenstromsignal aus der Halbwertsbreite Δt dieses Ionenstromsignals.
Wie in 2 gezeigt, gibt
es eine eindeutige Beziehung zwischen der Signalbreite und der spezifischen
Masse, die in sehr einfacher Weise zur goben Bestimmung der Masse
verwendet werden kann. Die Signal breite Δt kann für solche Signale, die gut aus dem
Untergrundrauschen herausragen, auf etwa 5% (und besser) bestimmt
werden. Es kann so sehr einfach bestimmt werden, ob eine Ionensorte
im ersten, zweiten, dritten oder einem noch höheren Messzyklus nach dem Startpuls
den Detektor erreicht hat. Daraus wiederum ergibt sich die genaue
Flugzeit und damit wieder die präzise
spezifische Masse der Ionensorte.
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So kann beispielsweise bei sechs
Meter Fluglänge,
die sich entweder durch ein langes Flugrohr oder durch mehrfache
Reflektionen, aber auch durch teils kreisförmige Bahnen erzeugen lässt, und einer
Beschleunigungsspannung von zehn Kilovolt eine Auflösung von
etwa R = 40 000 erhalten werden. Ionen der spezifischen Masse 200
Dalton pro Elementarladung erreichen nach 64 Mikrosekunden den Ionendetektor.
Wird ein Transientenrekorder mit vier Gigahertz Wandlungsrate verwendet,
so entspricht das gerade 218 ≈ 256 000 Messwerten
in 64 Mikrosekunden. Zyklische Speicherungen lassen sich besonders
gut mit Speicheradressabschnitten einrichten, die vollen Zweierpotenzen
entsprechen. Es kann hier also besonders gut ein erfindungsgemäßer Messzyklus
von 64 Mikrosekunden mit 218 Speicherzellen eingerichtet
werden. Die theoretische Signalhalbwertsbreite für das Ionensignal der spezifischen
Masse 200 Dalton pro Elementarladung beträgt dann ∆t = 0,8
Nanosekunden; die Linienbreite ist aber wegen der additiven Detektorzeit
größer, wie
in 2 dargestellt. Die
Zyklusfrequenz beträgt
dann 15,625 Kilohertz. Ein Summenspektrum von einem Zehntel Sekunden
Aufnahmedauer enthält
dann 1562 Einzelspektren in ebenso vielen Messzyklen, obwohl sich die
Spektren jeweils über
mehrere Zyklen hinziehen. Wird für
ein Einzelspektrum ein dynamischer Messbereich von 60 angenommen,
so ergibt sich insgesamt eine Messdynamik von etwa 105 für ein Spektrum
mit einem Zehntel Sekunde Aufnahmedauer, ein sehr guter Wert.
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Als anderes Beispiel kann man auch
ein Massenspektrometer mit vier Meter Flugstrecke, einem Transientenrekorder
von zwei Gigahertz, einer Beschleunigungsspannung von 18 Kilovolt
und einem Aufnahmezyklus von 31,25 Kilohertz betreiben. Das Spektrum
besteht dann nur aus 216 ≈ 64 000 Messwerten.
Der dynamische Messumfang ist hier noch höher, die Massenauflösung dagegen
geringer.
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Die Isotopie der organischen Moleküle bildet einen
zweiten Weg, die ungefähre
Masse zu bestimmen. Wenn organische Ionen keine Halogene enthalten,
wie es beispielsweise für
alle gängigen
Biomoleküle
der Fall ist, ist die Verteilung auf die verschiedenen Iosotopenmassen
eines Moleküls
praktisch nur durch die Isotopie des Kohlenstoffs gegeben. Die Isotopie
des Kohlenstoffs bildet charakteristische Isotopenmuster für große organische
Moleküle,
aus denen die Molekülmasse
grob bestimmt werden kann.
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3 zeigt
die Isotopenverteilungen für einfach
geladene Ionen, deren Masse eine Flugzeit jeweils so ergibt, dass
sie am Ende des ersten, des zweiten, des dritten, des vierten und
des fünften Messzyklus
am Ionendetektor ankommen. Die Fluglänge des Spektrometers wurde
dabei so gewählt, dass
am Ende des ersten Messzyklus einfach geladenen Ionen der Masse 200 Dalton
am Detektor ankommen. An den Enden der nächsten Messzyklen kommen dann
einfach geladene Ionen der Massen 800, 1800, 3200 und 5000 Dalton
am Detektor an. Diese Zahlen kommen durch die quadratische Abhängigkeit
der Masse von der Flugzeit zustande: es handelt sich dabei um viermal,
neunmal, sechszehnmal und fünfundzwanzigmal
200 Dalton.
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Aus dem gemessenen Isotopenverteilungsmuster
einer Liniengruppe lässt
sich also ebenfalls grob die Molekularmasse der Ionen bestimmen.
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Das Muster kann aber zu einfach oder
mehrfach geladenen Ionen gehören;
es muss also noch die Ladung der Ionen bestimmt werden, um zu der spezifischen
Masse der Ionen zu gelangen. Die Ladung lässt sich aber aus dem Abstand
der Linien innerhalb der Liniengruppe ermitteln:
Entspricht
der Abstand einer vollen Masseneinheit, so handelt es sich um einfach
geladene Ionen; entspricht er einer halben Masse, so handelt es
sich um doppelt geladene Ionen, und so weiter.
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Neben der Einzelsignalanalyse und
der Isotopengruppensignalanalyse gibt es eine dritte Möglichkeit
zur groben Bestimmmung der spezifischen Masse der Ionen durch eine
Geschwindigkeitsanalyse der am Detektor ankommenden Ionen. Diese
kann beispielsweise an den Spektren eines Doppeldetektors vorgenommen
werden. Greift ein Detektor nur einen Teil der Ionen vom Ionenstrahl
ab und wird der restliche Teil der Ionen in einem zweiten, in der
Fluglänge
versetzten Detektor gemessen, so kann aus einem Vergleich der Spektren
beider Detektoren die Geschwindigkeit der jeweiligen Ionen bestimmt
werden. Aus der Geschwindigkeit lässt sich die spezifische Masse
genügend
gut abschätzen,
um eine Zuordnung der Ionen zu einer vorhergehenden Auspulsung vornehmen
zu können.
Die Höchstauflösung braucht
dabei nur für
einen der beiden Detektoren eingestellt werden.
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Da durch Elektrosprühen kaum
Ionen einer größeren spezifischen
Masse als 5000 Dalton pro Elementarladung gebildet werden, ist eine
Kalibrierung der Ionenstromsignalbreiten über die in 3 hinaus gezeigten Bereiche kaum notwendig,
jedoch leicht herzustellen.
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Für
hohe Ladungszustände,
wie sie durch Elektrosprüh-Ionisierung
schwerer Analytmoleküle auftreten,
sollte eine sehr hohe Massenauflösung vorliegen,
damit diese Isotopenlinien auch voneinander getrennt sind; es ist
aber diese Erfindung gerade für
Flugzeitspektrometer sehr hoher Massenauflösung zugeschnitten.
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Aber auch für Ionen mit sehr schweren Molekularmassen,
die ein Profil der Isotopengruppe ohne Isotopenauflösung zeigen,
kann man aus der Breite des Signals sehr grob auf die spezifische
Masse schließen,
wie aus 4 zu ersehen
ist. Eine so grob bestimmte Masse kann durch eine Analyse der Gruppen
verschiedener Ladungszustände
noch erhärtet
werden, da für
sehr schwere Moleküle
immer eine breite Verteilung der Ionen vieler Ladungszustände vorliegt.
Die Verwendung der Muster verschiedener Ladungszustände unter
Berücksichtigung
der steigenden Anzahlen an Protonen mit höheren Ladungszuständen für die Bestimmung
der Masse ist dem Fachmann bekannt.
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Bei Überlappungen von Signalgruppen
kann man durch mathematische Methoden eine Auflösung der Überlappung vornehmen; doch
hat diese Methode ihre Grenzen. Die Erfindung ist besonders auf eine
hohe Massenauflösung
im Spektrum zugeschnitten, bei der nur relativ wenige Überlappungen von
Signalen auftreten. Die Erfindung setzt zur Vermeidung von zu vielen Überlappungen
auch verhältnismäßig „saubere" Spektren voraus,
also Spektren aus Ionen nur relativ wenigen gleichzeitig vorhandener
Substanzen. Die Erfindung ist somit ideal geeignet für hochauflösende Spektrenaufnahmen
von Substanzen, die durch vorgeschaltete Trennverfahren getrennt
wurden, beispielsweise durch Flüssigkeitchromatographie
oder Kapillarelektrophorese.
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Die zyklische Aufnahme nach dieser
Erfindung setzt voraus, dass vom Pulser keine Störsignale auf den Detektor überkoppeln.
Das ist in der Praxis schwierig zu erreichen und für Spektrometer
nach bisheriger Betriebsweise auch ohne großen Belang, wenn nicht die
ganz leichten Ionen ebenfalls gemessen werden sollen. Um zu erreichen,
dass keine Überkopplung
stattfindet, müssen
sowohl Pulser wie auch Detektor möglichst gut abgeschirmt werden. Bei
Orthogonal-Flugzeitmassenspektrometern bisheriger Bauart ist das
schwierig zu erreichen, weil, wie auch 1 zeigt, Pulser und Detektor nahe zueinander
angeordnet sind. Für
höchstauflösende Massenspektrometer
mit langer Flugstrecke lassen sich aber Pulser und Detektor durch
entsprechende Verwendung von Reflektoren weit voneinander entfernen,
so dass das Problem auch elektronisch lösbar wird. Schwache Reste der Überkopplung
lassen sich auch in bekannter Weise von den Summenspektren abziehen.
