DE19630547C2 - Verfahren zur Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung von Analytmolekülen, insbesondere von fragilen bzw. labilen Molekülen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung von Analytmolekülen, insbesondere von fragilen bzw. labilen Molekülen, bei dem mindestens eine Laserlicht absorbierende Matrix verwendet wird.

Massenspektrometer trennen ionisierte Probenmoleküle durch die Flugzeitspektroskopie oder durch ein Sektormagnetfeld auf. Die Ionisierung kann beispielsweise durch Elektronenstoß-Ionisierung oder durch Elektrosprüh-Ionisierung erfolgen.

Laserdesorptions-Massenspektrometer verdampfen und ionisieren die Probensubstanz (Analyt) durch die Bestrahlung mit einem Laserpuls.

In der Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung (MALDI - matrix­ assisted laser desorption and ionisation) wird die Probensubstanz mit einer anderen Substanz vermischt, die im folgenden Matrix genannt wird. Die Zugabe einer solchen Matrix setzt die geringste zur Desorption notwendige Laserfluenz herab. Eine geeignete Matrix besitzt einen hohen Extinktionskoeffizienten bei der eingestrahlten Laserwellenlänge, sublimiert schon bei niedrigen Temperaturen und umschließt die Probenmoleküle, ohne kovalente Bindungen auszubilden.

Der Stand der Technik, von dem die Erfindung ausgeht, ist den beiden Veröffentlichungen DE 40 17 804 C2 und "Organic Mass Spectroscopy" (1992), Vol. 27, S. 831-832 zu entnehmen.

Bei dem in DE 40 17 804 C2 beschriebenen MALDI-Verfahren ist Laserlicht mit einer Wellenlänge von ≧ 300 nm auf eine in diesem Wellenlängenbereich absorptionsfähige Matrix gerichtet. Dieses Verfahren ermöglicht die Desorption intakter Biomoleküle, da die meisten Biomoleküle das Laserlicht bei ≧ 300 nm nicht mehr absorbieren, jedoch die Matrix in diesem Wellenlängenbereich absorptionsfähig ist.

In "Organic Mass Spectroscopy" (1992), Vol. 27, S. 831-832 ist die Verwendung einer Zweikomponenten-Matrix beschrieben. Beiden Komponenten kommen unterschiedliche Funktionen zu. So wird die starke Absorption von Rhodamin 6G bei 532 nm für den Transfer der Laserenergie auf die zu analysierende Probe ausgenutzt. Dabei wird die Probe verdampft und durch die zweite Komponente der Matrix, durch 3-Nitrobenzylalkohol, protoniert.

Mit den hier erwähnten Verfahren zur MALDI-Methode können jedoch nicht alle Analyte unzersetzt nachgewiesen werden.

Über eine Möglichkeit zur schonenden Analyse, nämlich zur Abkühlung der Probensubstanz, wird in DE-OS 41 08 462 berichtet. Hierbei werden die aus der Probensubstanz freigesetzten Moleküle von einem Strahl eines Trägergases mitgenommen und bei dessen Expansion gekühlt. Somit wird durch die adiabatische Expansion des Trägergases und gleichzeitig des Analyten eine Reduzierung der inneren Energie des Analyten erreicht. Die hierfür notwendige Überschall-Düsenstrahl-Apparatur erfordert - wie in DE- OS 41 08 462 beschrieben - einen aufwendigen Aufbau.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfach handhabbares, kostengünstiges Verfahren zur MALDI anzugeben, das einen schonenderen und fragmentationsärmeren Nachweis von Analytmolekülen ermöglicht, die mit den bisher bekannten technischen Lösungen nicht unzersetzt nachgewiesen werden können.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in einem Verfahren der eingangs erwähnten Art eine Laserlicht absorbierende Matrix für die Desorption der Analytmoleküle und eine weitere Laserlicht absorbierende Matrix in einer Matrizenkombination verwendet werden, wobei die letztgenannte Matrix durch die Einwirkung eines Pulslasers ein Gas freisetzt, das zusammen mit den Analytmolekülen in das bei dem Verfahren vorherrschende Vakuum adiabatisch expandiert, und ein Pulslaser mit einer Wellenlänge < 200 nm eingesetzt wird.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird für die Matrix für die Desorption der Analytmoleküle und für die gasgenerierende Matrix die gleiche Substanz verwendet.

Außerdem ist vorgesehen, daß in der Matrizenkombination mindestens eine weitere Matrix verwendet wird.

Dem zu untersuchenden Stoff (Analyt) werden ein oder mehrere chemische Substanzen als einzelne Matrix oder als Matrizenkombination zugemischt, wobei mindestens eine Substanz durch die Einwirkung eines Lasers bei der Desorption ein Gas freisetzt, das zusammen mit dem Analyt in das in der Apparatur vorherrschende Vakuum adiabatisch expandiert. Hierbei wird die innere Energie des Analyten reduziert, wodurch dieser schonend und fragmentationsarm desorbiert und ionisiert wird. Da die aus mindestens einer Laserlicht absorbierenden und Gas freisetzenden Substanz bestehende Matrix üblicherweise im Überschuß zum Analyt eingesetzt wird, entsteht eine größere Anzahl von Gasmolekülen pro desorbiertem Analytmolekül. Das Gas expandiert, wobei die inneren Freiheitsgrade der Analytmoleküle abgekühlt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das expandierende Gas nur dann freigesetzt, wenn es auch benötigt wird, d. h. direkt während der Laserdesorption des zu untersuchenden Stoffes. Damit wird der negative Einfluß auf das Vakuum im Massenspektrometer im Vergleich zur bereits erwähnten und in DE-OS 41 08 462 beschriebenen Lösung wesentlich verringert, bei der der benötigte Trägergasstrom entweder kontinuierlich oder gepulst in die Apparatur geleitet wird.

In der erfindungsgemäßen Lösung wird also das Gas, welches in das Vakuum expandieren soll, gleichzeitig mit dem Desorptionspuls aus einer Matrix erzeugt. Diese Laserlicht absorbierende Matrix wird dem Analyten beigemengt und setzt durch den Laserpuls ein Gas frei. Die nun ablaufende adiabatische Expansion des generierten Gases gemeinsam mit dem Analyten bewirkt eine Reduzierung der inneren Energie des Analyten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine einfache und unkomplizierte Probenpräparation. Besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, daß sowohl die Laserlicht absorbierende und Gas freisetzende Matrix in Kombination mit bereits bekannten und bewährten Matrizen als auch für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein kommerzielles Laserdesorptions-Massenspektrometer ohne Zusatzgeräte und bauliche Veränderung verwendet werden kann.

Die folgenden Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auf die Laserlicht absorbierenden Matrizen. So ist vorgesehen, diese in festem oder flüssigem Zustand zu verwenden. Bei Verwendung in flüssigem Zustand werden die Analytmoleküle und Matrizen entweder im gleichen Lösungsmittel miteinander vermengt oder in unterschiedlichen Lösungsmitteln gelöst und dann miteinander vermengt.

Andere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die bei Einwirkung eines Lasers Gas freisetzende Matrix. So kann als Material für eine solche gasgenerierende Matrix NaBF₄ oder Fe₂(CO)₉ eingesetzt werden. Für die MALDI von Biomolekülen, wie beispielsweise Proteinen, ist NaBF₄ besonders geeignet, da es genauso wie die meisten Proteine wasserlöslich ist. Das Fe₂(CO)₉ zeichnet sich gegenüber anderen Metallcarbonylen dadurch aus, daß es im Vakuum nicht sublimiert und sich bereits bei 100°C, dem Schmelzpunkt der Substanz, zersetzt. Dabei werden aus jedem Molekül Fe₂(CO)₉ bis zu neun Moleküle gasförmiges Kohlenmonoxid CO frei.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Laser, die Licht einer Wellenlänge < 200 nm aussenden, mit Pulsdauern von 10 fs bis 1000 ns eingesetzt. Es kann sich hierbei um einen UV-Laser, einen Laser im sichtbaren Bereich oder einen IR-Laser handeln. Beispielsweise kann ein N₂- Laser oder ein XeCl-Excimer-Laser oder ein XeF-Excimer-Laser oder ein CO₂-Laser oder ein Er-Laser, vorzugsweise ein Er-YAG- oder Er-YILF-Laser, oder ein Nd-YAG-Laser oder ein Dioden-Laser oder ein Farbstoff-Laser eingesetzt werden.

Es hat sich weiterhin als Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens erwiesen, daß der Laserstrahl unter einem beliebigen Winkel auf die Oberfläche des Analyt-Matrix-Gemisches auftreffen kann. Somit kann das Verfahren bei einer beliebigen Anordnung von Probe und Eintrittsfenster des Laserstrahls zueinander angewendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung von Analytmolekülen, insbesondere von fragilen bzw. labilen Molekülen, ist zur schonenden und fragmentationsarmen Laserdesorption und Ionisierung von Analytmolekülen, in besonders vorteilhafter Weise für die Laserdesorptions-Massenspektroskopie von Biomolekülen und Fullerenderivaten in einem Bereich von 500 u bis mehreren 100.000 u (u bedeutet hierbei: atomic mass unit) vorgesehen.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung im Vergleich ohne Matrix, mit einer Matrix und mit einer Matrizenkombination anhand der Zeichnung näher beschrieben.

Dabei zeigen:

Fig. 1 das Laserdesorptions-Massenspektrum von C₆₀H₃₆ ohne Verwendung einer Matrix;

Fig. 2 das Laserdesorptions-Massenspektrum von C₆₀H₃₆ bei Verwendung einer bekannten, Laserlicht absorbierenden Matrix für die Desorption;

Fig. 3 das Laserdesorptions-Massenspektrum von C₆₀H₃₆ bei Verwendung einer Matrizenkombination, die sowohl eine bekannte, Laserlicht absorbierende Matrix für die Desorption als auch eine bei der Laserwellenlänge Gas freisetzende Matrix enthält.

Das Ausführungsbeispiel beschreibt die massenspektroskopische Untersuchung von C₆₀H₃₆. Hierfür wurde ein Flugzeit-Massenspektrometer mit Reflektron verwendet (RETOF-MS). Dieses Massenspektrometer besitzt eine Massenauflösung von m/Δm = 2000. Die durch einen Laserpuls freigesetzten Ionen werden nach einer Verzögerungszeit durch eine Ionenoptik (beispielsweise eine Wiley-McLaren-Anordnung) beschleunigt und im Reflektron reflektiert und durch einen MCP(micro-channel-plate)-Detektor nachgewiesen. Dessen Signal wird vorverstärkt, mit einem digitalen Speicheroszilloskop erfaßt und in einen Computer eingelesen, auf dem auch die Auswertung erfolgt.

Für die in Fig. 1 bis Fig. 3 dargestellten Massenspektren wurden jeweils die gleichen Bedingungen realisiert: Die Laserfluenz betrug ca. 10 mJ.cm^-2, die Verzögerungszeit zwischen dem Laserpuls und dem Abzug der Ionen beträgt 20 µs; die Aufnahme der Spektren erfolgte bei 355 nm und einer Pulsdauer von 30 µs; die Spektren zeigen ausschließlich positiv geladene Ionen des Fullerenderivates.

Hydrierte Fullerene wie C₆₀H₃₆ konnten bei der Laserdesorptions- Massenspektroskopie ohne Matrix nur fragmentiert, das heißt in einer Verteilung von Ionen mit unterschiedlicher Anzahl an Wasserstoffatomen, nachgewiesen werden. Die Fragmentierung erfolgt erst durch die Untersuchung selbst. Ein dafür typisches Laserdesorptions-Massenspektrum zeigt Fig. 1. Bei der Laserdesorption wird sogar das C₆₀⁺-Ion (720 u) erhalten, bei dem alle Wasserstoffatome durch die destruktiven Reaktionsbedingungen abgetrennt werden.

Da der Analyt C₆₀H₃₆ durch Oxidation leicht zerstört ist und sich in Lösungsmitteln innerhalb von Minuten zersetzt, muß die Probenpräparation bei der Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung bei diesen Fullerenderivaten aus den Feststoffen erfolgen. Nach genauer Einwaage des Analyts C₆₀H₃₆ und einer Laserlicht absorbierenden Matrix (5- Methoxysalicylsäure) im Massenverhältnis 1 : 20 werden die Feststoffe mehrere Minuten innig verrieben. Um eine wohldefinierte, glatte Probenoberfläche zu erhalten und das Pulver besser handhaben zu können, wird dieses in einer Presse mit einem Preßwerkzeug für KBr-Preßlinge im Vakuum verdichtet. Dieser Preßling besteht aus zwei Schichten, einer unteren KBr-Schicht von ca. 1 mm Dicke und einer ca. 0,1 mm dicken oberen Probenschicht. Damit wird der Preßling stabiler, zugleich wird eine geringere Menge an Probenmaterial benötigt. Das Laserdesorptions-Massenspektrum des so präparierten Analyten zeigt Fig. 2. Im Gegensatz zu dem Massenspektrum von C₆₀H₃₆ ohne Matrix wird nun eine geringere Anzahl von verschieden hydrierten Fulleren-Ionen erhalten. Da nur Fragmente mit höherer Anzahl an Wasserstoffatomen nachgewiesen werden - wie aus dem in Fig. 2 dargestellten Massenspektrum erkennbar - läuft die Laserdesorption und Ionisierung unter milderen Bedingungen ab, d. h. es werden weniger stark fragmentierte Ionen gebildet und detektiert. Ähnliche Ergebnisse werden auch bei der Verwendung anderer bekannter Matrizen erhalten. Die besten Ergebnisse für C₆₀H₃₆ wurden mit 5-Methoxysalicylsäure erzielt, da hierbei Fragmente mit einer größeren Anzahl an Wasserstoffatomen und eine schmalere Verteilung von Fragment-Ionen C₆₀H_x⁺ beobachtet werden konnten.

In Fig. 3 ist zum Vergleich das Laserdesorptions-Massenspektrum für den gleichen Analyten C₆₀H₃₆ dargestellt, dem aber nunmehr erfindungsgemäß sowohl 5-Methoxysalicylsäure als Laserlicht absorbierender Bestandteil als auch NaBF₄ als Gas generierender Bestandteil der Matrix im Verhältnis 1 : 10 : 10 zugemischt wurde. NaBF₄ ist ein wasserlösliches farbloses Salz, das sich beim Erhitzen über 384 °C in kristallines NaF und gasförmiges Bortrifluorid BF₃ zersetzt. Das erzeugte Gas BF₃ expandiert, wobei die inneren Freiheitsgrade der Analytmoleküle abgekühlt werden. Unter diesen Desorptionsbedingungen ist es möglich, das in Fig. 3 dargestellte Massenspektrum zu erhalten, das fast ausschließlich C₆₀H₃₅⁺-Ionen aufweist. Diese Ionen entstehen aus dem empfindlichen Fullerenderivat C₆₀H₃₆ aufgrund einer chemischen Ionisierung durch Matrixfragmente. Eine Fragmentierung von C₆₀H₃₆ oder eine Protonierung durch 5- Methoxysalicylsäure kann aufgrund von Experimenten mit deuterierter 5- Methoxysalicylsäure unter diesen Bedingungen ausgeschlossen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit eine schonende und fragmentationsarme Laserdesorption und Ionisierung von fragilen bzw. labilen Molekülen.

Claims (11)

1. Verfahren zur Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung von Analytmolekülen, insbesondere von fragilen bzw. labilen Molekülen, bei dem mindestens eine Laserlicht absorbierende Matrix verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Laserlicht absorbierende Matrix für die Desorption der Analytmoleküle und eine zweite Laserlicht absorbierende Matrix in einer Matrizenkombination verwendet werden, wobei die zweite Matrix durch die Einwirkung eines Pulslasers ein Gas freisetzt, das zusammen mit den Analytmolekülen in ein bei dem Verfahren vorherrschendes Vakuum adiabatisch expandiert, und ein Pulslaser mit einer Wellenlänge < 200 nm eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Matrix für die Desorption der Analytmoleküle und für die gasgenerierende Matrix die gleiche Substanz verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Matrizenkombination mindestens eine weitere Matrix eingesetzt wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Laserlicht absorbierenden Matrizen in festem Zustand verwendet werden.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Laserlicht absorbierenden Matrizen in flüssigem Zustand verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß Analytmoleküle und Matrizen im gleichen Lösungsmittel vermischt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß Analytmoleküle und Matrizen in unterschiedlichen Lösungsmitteln gelöst und dann miteinander vermischt werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Laserlicht absorbierende und Gas freisetzende Matrix NaBF₄ verwendet wird.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Laserlicht absorbierende und Gas freisetzende Matrix Fe₂(CO)₉ verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Laser, die Licht mit einer Wellenlänge von < 200 nm aussenden, Laser mit Pulsdauern von 10 fs bis 1000 ns verwendet werden.

11. Verwendung des Verfahrens zur Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisierung von Analytmolekülen, insbesondere von fragilen bzw. labilen Molekülen, nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche zur schonenden und fragmentationsarmen Desorption und Ionisierung von Analytmolekülen, insbesondere von Biomolekülen und Fullerenderivaten, in einem Bereich von 500 u bis mehreren 100 000 u.