DE102008024297B4

DE102008024297B4 - Fragmentierung von Ionen in Kingdon-Ionenfallen

Info

Publication number: DE102008024297B4
Application number: DE102008024297A
Authority: DE
Inventors: Claus Köster
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2008-05-20
Filing date: 2008-05-20
Publication date: 2011-03-31
Anticipated expiration: 2028-05-21
Also published as: DE102008024297A1; GB2460165A; GB0908560D0; GB2460165B; US20090294656A1; US7989758B2

Abstract

Verfahren für die Aufnahme von Fragmentionenspektren in einem Kingdon-Ionenfallen-Massenspektrometer mit einem Verlauf des Längspotentials, in dem Ionen harmonisch schwingen können, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) eine Kingdon-Ionenfalle verwendet wird, in der Ionen in radialer Richtung zwischen zwei oder mehr inneren Elektroden in einer Ebene pendeln können,
(b) metastabile Analytionen nahe am Potentialminimum des Längspotentials in die Kingdon-Ionenfalle eingeführt werden,
(c) die metastabilen Analytionen solange im Potentialminimum des Längspotentialverlaufs pendelnd gespeichert gehalten werden, bis sie teilweise zu Fragmentionen zerfallen sind,
(d) die Analyt- und Fragmentionen zu harmonischen Schwingungen im Längspotential angeregt werden, und
(e) die Bildströme der harmonisch längs schwingenden Ionen gemessen werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fragmentierung von Analytionen in besonders geformten Kingdon-Ionenfallen, die in Längsrichtung ein Potential für harmonische Schwingungen der Ionen aufweisen und in denen die Ionen in einer Ebene zwischen zwei oder mehr inneren Elektroden pendeln können.
Die Erfindung führt vorzugsweise durch Laserdesorption erzeugte metastabile Ionen nahe am Minimum des Längspotentialverlaufs in die Kingdon-Ionenfalle ein und speichert sie dort lokal. Dabei zerfallen die metastabilen Ionen zu großen Teilen ergodisch durch ihren Überschuss an interner Energie zu Fragmentionen. Erst dann werden alle Ionen zu harmonischen Schwingungen im Längspotentialverlauf angeregt. Die harmonischen Schwingungen werden als Bildströme gemessen, woraus sich ein hochaufgelöstes Massenspektrum der Fragmentionen berechnen lässt.
Stand der Technik
Kingdon-Ionenfallen sind elektrostatische Ionenfallen, in denen Ionen mit einer vorgegebenen kinetischen Energie um ein inneres Elektroden-Arrangement herumfliegen oder durch ein inneres Elektroden-Arrangement hindurchpendeln. Ein äußeres, umschließendes Gehäuse liegt dabei auf einem Potential, das für die Ionen unerreichbar ist. Das äußere Gehäuse und das innere Elektroden-Arrangement können dabei so geformt werden, dass erstens die Bewegungen der Ionen in Längsrichtung der Kingdon-Ionenfalle von den Bewegungen in radialer Richtung vollständig entkoppelt werden, und dass zweitens ein Potentialverlauf in Längsrichtung erzeugt wird, in dem die Ionen harmonisch schwingen können, unabhängig von ihrer Bewegung in radialer Richtung. Eine Kingdon-Ionenfalle muss für längere Speicherzeiten unter Ultrahochvakuum betrieben werden, da sonst die Ionen durch Stöße mit dem Restgas ihre kinetische Energie verlieren und schließlich auf das zentrale Elektroden-Arrangement aufschlagen.
Werden umfliegende oder pendelnde Ionenpakete im Potentialverlauf der Längsrichtung zu kohärenten harmonischen Schwingungen angeregt, so trennen sich die Ionenpakete verschiedener ladungsbezogener Massen, da sie mit verschiedenen Frequenzen schwingen. Die Frequenzen sind umgekehrt proportional zur Wurzel aus der ladungsbezogenen Masse √m/z. Mit geeigneten Detektionselektroden, beispielsweise durch eine mittig in zwei Halbschalen geteilte Außenelektrode, können die Bildströme dieser Schwingungen als zeitliches Transientensignal gemessen werden. Aus diesem Bildstrom-Transienten lässt sich durch eine Fourier-Analyse das Spektrum der Schwingungen erhalten, und aus diesem ein Massenspektrum. Wie bei anderen Fourier-Transform-Massenspektrometern auch, lässt sich eine sehr hohe Massenauflösung R erzeugen. Voraussetzung ist allerdings eine sehr präzise Fertigung der Form, da der harmonische Potentialverlauf von der Form der Elektroden abhängt.
Der Vorteil der Kingdon-Ionenfallen-Massenspektrometer gegenüber Ionenzyklotronresonanz-Massenspetrometern (ICR-MS) mit ähnlich hohen Massenauflösungen R besteht darin, dass für die Speicherung der Ionen kein supraleitender Magnet notwendig und damit der gerätetechnische Aufwand geringer ist. Außerdem fällt in Kingdon-Ionenfallen-Massenspektrometern die Auflösung R nur umgekehrt proportional zur Wurzel aus der Masse √m/z der Ionen ab, während in ICR-MS die Auflösung R umgekehrt proportional zur Masse m/z selbst abfällt; damit nimmt bei ICR-MS die Auflösung zu höheren Massen hin wesentlich rascher ab.
Aus US 5886346 A ist eine Kingdon-Ionenfalle bekannt, die von der Firma Thermo-Fischer Scientific GmbH Bremen unter der Bezeichnung Orbitrap^TM in den Markt eingeführt wurde. Die Orbitrap^TM besteht aus einer einzelnen spindelförmigen Innenelektrode und einer koaxialen Außenelektrode, wobei die Außenelektrode ein Ionen abstoßendes elektrisches Potential und die Innenelektrode ein Ionen anziehendes elektrisches Potential aufweisen. Die Ionen werden mit Hilfe einer Ionenoptik als Ionenpakete tangential zur Innenelektrode eingeschossen und bewegen sich in einem hyperlogarithmischen elektrischen Potential. Die kinetische Einschussenergie der Ionen wird dabei so eingestellt, dass sich die anziehenden Kräfte und die Zentrifugalkräfte ausgleichen und sich die Ionen somit auf praktisch kreisförmigen Trajektorien bewegen. In Längsrichtung der Elektrodenachse weist das elektrische Potential der Orbitrap^TM mittig eine Potentialsenke auf, in der die Ionenpakete harmonische Schwingungen ausführen können. Die harmonisch schwingenden Ionenpakete induzieren in den Halbschalen der mittig geteilten Außenelektrode Bildströme, die als Funktion der Zeit gemessen werden. Die Massenauflösung einer Orbitrap^TM liegt derzeit bei etwa R = 50000 bei m/z = 1000 atomaren Masseneinheiten, bei guten Geräten noch höher. Die mechanischen Anforderungen an die Präzision bei der Herstellung der Elektroden sind sehr hoch. Außerdem ist der Einschuss der Ionen kritisch, da die kinetische Energie der Ionen beim Einschuss nur in einem kleinen Toleranzbereich variieren darf. Aus den Offenlegungsschriften US 2007/0023629 A1 (Makarov) und US 2005/0121609 A1 (Makarov et al.) ist zudem bekannt, dass eine elektrostatische Ionenfalle vom Typ Orbitrap^TM für die Aufnahme von Fragmentionenspektren verwendet wird, wobei die Fragmentionen außerhalb der elektrostatischen Ionenfalle erzeugt werden.
In der Offenlegungsschrift DE 10 2007 024 858 A1 (C. Köster) wird eine weitere Art von Kingdon-Ionenfallen mit mehreren Ausführungsformen beschrieben, die sich jeweils durch Arrangements von mehreren inneren Elektroden auszeichnen. Auch hier können die inneren Elektroden und die äußeren Hüllelektroden präzise so geformt werden, dass die Längsbewegung vollständig von der radialen Bewegung entkoppelt wird und dass in Längsrichtung ein Potentialverlauf für eine harmonische Schwingung erzeugt wird. Der Patentantrag enthält die mathematischen Ausdrücke für die Äquipotentialflächen innerhalb solcher Kingdon-Ionenfallen, womit auch die exakten Formen der Innen- und Außenelektroden beschrieben werden, da diese Äquipotentialflächen bilden müssen. Unter den Ausführungsformen befinden sich auch solche, bei denen die Analytionen in radialer Richtung praktisch in einer Ebene zwischen zwei oder mehr inneren Elektroden hindurch pendeln. Die in dieser Weise radial pendelförmig schwingenden Analytionen können dann in Längsrichtung harmonische Schwingungen ausführen, deren Messung zu einem Massenspektrum hoher Auflösung führt. Der Vorteil dieser Ausführungsformen mit pendelförmigen Schwingungen praktisch in einer Ebene liegt darin, dass die Anforderungen an die Homogenität der kinetischen Energie der eingeschossenen Analytionen sehr gering sind, da die Ionen sowohl mit weiten wie auch mit engen Pendelbewegungen gespeichert werden. Werden die Analytionen nahe am Potentialminimum des Längsachsenpotentials eingebracht, so können sie auch über längere Zeiten lokal in diesem Minimum gesammelt werden, bevor sie zu harmonischen Schwingungen in Längsrichtung angeregt werden.
In Massenspektrometern kann immer nur das Verhältnis aus der Ionenmasse zur Ladung des Ions bestimmt werden. Wenn im Folgenden von der „Masse eines Ions” oder der „Ionenmasse” gesprochen wird, so ist immer das Verhältnis von Masse m zur Anzahl z der Elementarladungen des Ions gemeint, also die elementarladungs-bezogene Masse m/z. Die Güte eines Massenspektrometers wird neben anderen Kriterien im Wesentlichen durch die Massenauflösung und die Massengenauigkeit bestimmt. Die Massenauflösung ist definiert als R = m/Δm, wobei R das Auflösungsvermögen, m die Masse eines Ions, gemessen in Einheiten der Massenskala, und Δm die Breite des Massensignals in halber Höhe ist, gemessen in den gleichen Einheiten. Unter Massengenauigkeit wird sowohl die statistische Streuung um einen gemessenen Mittelwert als auch die systematische Abweichung des gemessenen Mittelwert vom wahren Wert der Masse verstanden.
Unter „metastabilen” Ionen werden hier solche Ionen verstanden, die durch einen Überschuss an innerer Energie, der größer ist als die Bindungsenergie einzelner Bindungen im Molekül, nicht mehr stabil sind und in einer Zeitspanne von etwa 10 Nanosekunden bis etwa 100 Mikrosekunden (oder auch mehr) in Bruchstücke zerfallen. Die Bruchstücke können geladen sein und somit Fragmentionen darstellen; sie können auch neutral sein. Der etwas seltsam gewählte Ausdruck stammt aus frühen Zeiten der Tandem-Massenspektrometrie, in denen man die Zerfälle der Ionen in geraden Flugstrecken zwischen ionenoptischen Ablenkelementen wie magnetischen und elektrischen Feldern studiert hat, und die in diesen Zeitfenstern zerfallenden Ionen als „metastabil” bezeichnet hat.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, in einem Kingdon-Ionenfallen-Massenspektrometer durch Fragmentierung von Analytionen Fragmentionenspektren mit sehr hoher Massenauflösung und Massenpräzision zu messen. Das Verfahren soll für alle Ionisierungsarten geeignet sein, die metastabile Analytionen liefern, insbesondere für Analytionen, die durch Laserdesorption, vorzugsweise durch matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI) ionisiert wurden.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 14 ausgeführt.
Die Erfindung besteht darin, (1) für das Verfahren der Aufnahme von Fragmentionenspektren eine Kingdon-Ionenfalle zu benutzen, in der die Analytionen in radialer Richtung zwischen zwei oder mehr inneren Elektroden pendeln können, (2) metastabile Analytionen nahe am Potentialminimum des harmonischen Längspotentials in der radialen Pendelebene einzuführen, (3) die metastabilen Ionen im Minimum des Längspotentialverlaufs lokal beschränkt pendeln und dabei während einer vorgegebenen Speicherzeit mindestens teilweise zerfallen zu lassen, (4) erst dann die Ionen zu harmonischen Längsschwingungen im Längspotential anzuregen und (5) die Bildströme dieser Schwingungen für die Erzeugung eines Frequenz- beziehungsweise Massenspektrums zu messen.
Durch die Pendelbewegung im Minimum des Längspotentials befinden sich die Analytionen jeweils längere Zeiten in der Nähe der Umkehrpunkte der Pendelbewegung und zerfallen bevorzugt hier. Dadurch verbleiben etwa 60 bis 70 Prozent der Fragmentionen aus den zerfallenden Analytionen in der Kingdon-Ionenfalle und können der Massenanalyse zugeführt werden.
Für die Messung der Bildströme werden bevorzugt die beiden Halbschalen einer in Längsrichtung mittig geteilten Außenelektrode verwendet, die sich vorzugsweise auf Massepotential befinden und an einen entsprechenden Bildstromverstärker angeschlossen sind. Die beiden Halbschalen können auch durch entsprechende elektrische Beschaltung die Anregung der Analytionen oder der Fragmentionen zu harmonischen Längsschwingungen übernehmen. Verschiedenartige Verfahren für diese Anregungen sind aus der Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometrie bekannt. Das Arrangement von Innenelektroden befindet sich auf einem Ionen anziehenden Potential, beispielsweise auf minus 1 bis minus 10 Kilovolt für positive Analytionen. Vorzugsweise befinden sich alle inneren Elektroden auf dem gleichen Potential, doch können auch Arrangements von Innenelektroden auf verschiedenen Potentialen verwendet werden, wenn die Formen der Innen- und Außenelektroden entsprechend an diese Potentiale angepasst gewählt werden.
Die Öffnung zur Einführung der Analytionen kann sich in einer der beiden Halbschalen der Außenelektrode sehr nahe am mittigen Teilungsspalt befinden. Es kann die Eintrittsöffnung aber auch direkt in den Teilungsspalt gesetzt werden.
Eine solche Kingdon-Ionenfalle ist besonders für Analytionen geeignet, die durch Laserdesorption aus festen Proben auf Probenträgern erzeugt wurden. Es kann sich der Probenträger dabei fast direkt vor der Einschussöffnung befinden, mit nur sehr wenig Strahlführungsoptik zwischen Probe und Öffnung; er kann aber auch durch ein Quadrupolfilter von der Kingdon-Ionenfalle getrennt sein. Der Laserstrahl zur Desorption kann dabei durch die Kingdon-Ionenfalle selbst geführt werden, da sich im Zentrum der Kingdon-Ionenfallen dieser Art keine Innenelektrode befindet. Der Laserstrahl wird dabei durch eine zweite Öffnung, die sich der Einschussöffnung gegenüber in der Außenelektrode befindet, hindurch geführt.
Die durch einen oder mehrere Laserstrahlpulse erzeugten Analytionen fliegen durch die Einschussöffnung in die Kingdon-Ionenfalle und werden von ihr direkt eingefangen. Dabei kann während des Einschusses die Spannungsdifferenz zwischen Außen- und Innenelektroden vergrößert werden, um die Einfangkonditionen noch zu verbessern. Die durch Laserlichtpulse desorbierten und ionisierten Analytionen sind, wie aus MALDI-Flugzeitmassenspektrometern bekannt, weitgehend mit einem Überschuss an innerer Energie ausgestattet, also metastabil, was erfindungsgemäß für die Aufnahme von Fragmentionenspektren ausgenutzt werden kann.
Es können selbstredend auch beliebig anders erzeugte metastabile Analytionen in die Kingdon-Ionenfalle eingeführt werden und durch den erfindungsgemäßen Zerfall zu Fragmentionen während der lokalen Speicherung einer schlussendlichen Messung zugeführt werden.
Für die Laserdesorption, besonders für die matrix-unterstützte Laserdesorption, ist bekannt, dass eine Erhöhung der Strahlstromstärke des desorbierenden Laserstrahls eine weitere Fragmentierungsart von Proteinionen im direkten Laserplasma erzeugt, die „in-source-decomposition” (ISD) genannt wird. Diese Fragmentionen zeigen ein ganz anderes Fragmentierungsschema; diese Fragmentionenspektren gleichen den Spektren, die aus elektroneninduzierten Fragmentierungen wie ECD (electron capture dissociation) oder ETD (electron transfer dissociation) gewonnen werden. Da diese Fragmentionen ebenfalls leicht in die Kingdon-Ionenfalle eingeführt werden können, können so Fragmentionenspektren aus beiden Arten von Fragmentierungsprozesse, ergodische wie auch elektroneninduzierte, aus der gleichen Probe gewonnen werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die zeigt eine elektrostatische Kingdon-Ionenfalle mit einer mittig in zwei Halbschalen (10) und (11) geteilten Außenelektrode und zwei spindelförmigen Innenelektroden (12, 13) in einer drei-dimensionalen Darstellung mit Angabe der Koordinatenrichtungen x, y und z.
Die bis zeigen die Kingdon-Ionenfalle in der x-y Ebene, x-z Ebene bzw. y-z Ebene, wobei auch die Trajektorien (14) von gespeichert pendelnden und in Längsrichtung z schwingenden Ionen als Projektion auf die jeweilige Ebene dargestellt sind.
zeigt die Kingdon-Ionenfalle mit einem Laser (21), dessen gepulster Strahl aus Proben (16) auf dem Probenträger (15) Material desorbiert und ionisiert, wobei die so erzeugten Ionen durch eine Blende (17), ein Quadrupolfilter (18) und eine kurze Ionenoptik (19) als Ionenpakete in das Innere der Kingdon-Ionenfallen eingebracht werden und dort lokal im Potentialminimum als fadenförmiges Bündel (20) von Ionen pendeln. Sind die eingebrachten Ionen metastabil, so zerfällt ein Teil von ihnen zu Fragmentionen. Mit dem Quadrupolfilter können leichte Ionen, beispielsweise der Matrix, unterdrückt oder Elternionen für die Fragmentierung ausgewählt werden.
zeigt die Kingdon-Ionenfalle aus , nachdem die unzerfallenen Analytionen und die neu gebildeten Fragmentionen (14) in Längsrichtung zu harmonischen Schwingungen in z-Richtung angeregt wurden. Ihre Bildströme können jetzt in den beiden Halbschalen (10) und (11) der Außenelektrode gemessen werden, wobei aus den Bildstrommessungen in bekannter Weise zunächst ein Frequenz-, und dann ein Massenspektrum höher Auflösung gewonnen werden kann.
Bevorzugte Ausführungsformen
Für das erfindungsgemäße Verfahren der Aufnahme von Fragmentionenspektren wird eine Kingdon-Ionenfalle mit einer besonderen Form benutzt, in der die Analytionen in radialer Richtung zwischen zwei oder mehr inneren Elektroden pendeln können, und in der in Längsrichtung ein Potentialverlauf herrscht, in der Ionen harmonisch und vollständig abgekoppelt von ihrer radialen Bewegung schwingen können. In der Patentanmeldung DE 10 2007 024 858 A1 (C. Köster) sind mehrere Ausführungsformen dieser Art von Kingdon-Ionenfallen mit präziser Angabe der dazu notwendigen Formen von Innen- und Außenelektroden angegeben. Diese Patentanmeldung soll hier wegen ihrer Wichtigkeit für die vorliegende Patentanmeldung vollinhaltlich eingeschlossen sein.
In den bis ist ein Typ einer solchen Kingdon-Ionenfalle mit zwei Innenelektroden sowohl in dreidimensionaler Darstellung ( ) wie auch in den drei Raumschnitten bis ) mit einer Wolke (14) der in einer Ebene radial wie auch axial schwingenden Ionen wiedergegeben.
Der Kern dieser Erfindung besteht darin, in eine solche Kingdon-Ionenfalle metastabile Analytionen nahe am Potentialminimum des harmonischen Längspotentials in der radialen Pendelebene einzuführen und im Minimum des Längspotentialverlaufs lokal beschränkt während einer vorgegebenen Speicherzeit pendeln zu lassen. Dabei zerfällt ein großer Teil der metastabilen Ionen. Erst nach Beendigung dieser Speicherperiode für das Zerfallen der Analytionen, im optimalen Fall nach Zerfall fast aller metastabilen Analytionen, werden die entstandenen Fragmentionen, zusammen mit den restlichen unzerfallenen Analytionen, mit bekannten Verfahren zu harmonischen Längsschwingungen im Längspotential angeregt. Die Bildströme der schwingenden Ionen werden in geeigneten Detektionselektroden gemessen, beispielsweise in den beiden Halbschalen (10, 11) der Außenelektroden, und aus den Bildströmen wird, wieder mit bekannten Verfahren, das Massenspektrum der Fragmentionen mit hoher Massenauflösung R gewonnen.
Im Gegensatz zur Orbitrap^TM können die Ionen mit einer nahezu verschwindenden kinetischen Energie und auch mit größerer Energiestreubreite in eine solche Kingdon-Ionenfalle eingeführt werden, wenn sie nahe der Spiegelebene zwischen den beiden Innenelektroden eingeführt werden, da keine Zentrifugalkräfte für eine Rotationsbewegung um eine zentrale Innenelektrode benötigt werden, um die Ionen radial zu speichern. Die Einführung der Ionen in diese Art der elektrostatischen Ionenfalle kann dadurch erheblich vereinfacht werden.
Durch die Pendelbewegung im Minimum des Längspotentials befinden sich die Analytionen jeweils längere Zeiten in der Nähe der Umkehrpunkte der Pendelbewegung und zerfallen bevorzugt hier. Dadurch verbleibt der größte Teil der aus den zerfallenden Analytionen entstehenden Fragmentionen weiterhin pendelnd in der Kingdon-Ionenfalle, wenn auch mit teilweise weniger weiten Pendelbewegung, und kann der Massenanalyse zugeführt werden.
Das Verfahrens verwendet bevorzugt eine in Längsrichtung mittig in zwei Halbschalen (10, 11) geteilte Außenelektrode, die sich vorzugsweise auf Massepotential befindet und deren beiden Halbschalen (10, 11) als Detektionselektroden für die Bildströme dienen. Es kann sich aber auch die Außenelektrode auf einem hohen, Ionen abstoßenden Umgebungspotential befinden, während sich die Innenelektroden (12, 13) weitgehend auf Massepotential befinden und mittig geteilt an den Bildstromverstärker zur Messung der Ionenschwingungen in Längsrichtung z angeschlossen sind.
Die Halbschalen der Außen- oder Innenelektroden können auch durch entsprechende elektrische Beschaltung nach Beendigung der Zerfallsperiode die Anregung des Gemisches aus Analytionen und Fragmentionen zu kohärenten harmonischen Längsschwingungen übernehmen. Für die Anregung zu harmonischen Längsschwingungen sind aus der Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometrie verschiedenartige Verfahren bekannt. Es können beispielsweise so genannte Chirp- oder Synch-Pulse verwendet werden, die alle Anregungsfrequenzen entweder in aufsteigender Reihenfolge oder synchron enthalten. Es können aber auch Gleichspannungspulse verwendet werden, bevorzugt mit scharf ansteigender Spannung, um Ionen aller Massen etwa die gleiche Schwingungsweite zu geben.
Die Anschlüsse der Halbschalen müssen in diesem Fall also mindestens zwischen Bildstrommessung und Anregung der Ionen zu Längsschwingungen umgeschaltet werden. Es hat sich als günstig erwiesen, eine dritte Anschlussart einzuführen, die darin besteht, die beiden Halbschalen fest auf Massepotential zu halten. In bevorzugter Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kingdon-Ionenfalle in dieser Anschlussart, also mit Massepotential an den Halbschalen, mit Ionen befüllt. Stoßen dabei Ionen von außen oder auch von innen auf die Halbschalen, so findet hierbei keine Aufladung der Halbschalen statt, die die spätere Messung der Bildströme stören könnte. Es ist auch zweckmäßig, die Halbschalen nach der Anregung der Ionen zu Längsschwingungen nochmals kurz auf dieses Massepotential zu legen, um Aufladungen der Halbschalen zu entladen, die sich bei der Anregung der Ionen zu Längsschwingungen ergeben haben könnten.
Die beiden Halbschalen können aber auch, statt einfach mittig geschlitzt zu sein, jeweils durch ein Paar zusätzlicher Elektroden in Form schmaler Ringe voneinander getrennt sein. Die Ringe können für die oben beschriebenen Abmessungen etwa ein bis zehn Millimeter breit sein; bevorzugt wird eine Breite von zwei bis vier Milliemeter. Dadurch können die Halbschalen stets mit den Verstärkern für die Bildströme verbunden bleiben, was günstig für einen sehr geringen Ohmschen Leitungswiderstand ist. Die Anregung zu Längsschwingungen und auch das Anlegen des Massepotentials wird dabei über die zusätzlichen Anregungselektroden übernommen.
Befinden sich im Gemisch der Fragmentionen auch solche Ionen, die das Fragmentionenspektrum stören und den dynamischen Messbereich herabsetzen würden, beispielsweise zu viele unzerfallene Analytionen, so können diese durch resonante Anregung über die Halbschalen (oder die zusätzlichen Anregungselektroden) so stark angeregt werden, dass sie die Kingdon-Ionenfalle verlassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die geteilten Außenelektroden im Wesentlichen auf Massepotential und das Arrangement von Innenelektroden (hier 12, 13) auf einem Ionen anziehenden Potential, beispielsweise auf minus ein bis minus zehn Kilovolt für positive Analytionen; besonders günstig sind etwa vier bis sechs Kilovolt. Es wurde bereits angemerkt, dass es nicht zwingend ist, dass sich die Innenelektroden alle auf gleichem Potential befinden, wenn die Form der Elektroden entsprechend angepasst ist. Für bevorzugte Ausführungsformen befinden sich jedoch alle inneren Elektroden auf dem gleichen Potential.
Eine höhere Spannungsdifferenz zwischen Innen- und Außenelektroden führt zu besserer Massenauflösung, aber auch zu größeren Schwierigkeiten für die Entwicklung einer stabilen Elektronik. Die Spannungen müssen extrem stabil gehalten werden; für eine Massenpräzision von einem Millionstel der Masse (1 ppm) ist eine mindestens ebenso stabile Spannung notwendig.
Die Öffnung zur Einführung der Analytionen kann sich in einer der beiden Halbschalen (10, 11) der Außenelektrode oder in einer der zusätzlich eingefügten Anregungselektroden sehr nahe am mittigen Teilungsspalt befinden. Die Öffnung wird bevorzugt von einer ionenoptischen Blende (19) so abgeschirmt, dass keine Ionen auf die Halbschalen der Außenelektrode fallen können, um Störungen der Bildstrommessung zu vermeiden. Es kann die Eintrittsöffnung aber auch vorzugsweise direkt in den Teilungsspalt gesetzt werden, ebenfalls mit ionenoptischer Abschirmung.
Wenn die Analytionen nicht durch eine Öffnung des mittigen Spaltes zwischen den beiden Halbschalen (10, 11) der Außenelektroden eingebracht werden, sondern etwa seitwärts davon, so beginnen die eingeführten Analytionen sofort auch in einem kleinem Längsabschnitt in Längsrichtung zu schwingen. Befindet sich beispielsweise die Öffnung etwa fünf Millimeter vom mittigen Spalt entfernt, so schwingen die Analytionen mit etwa zehn Zentimeter Schwingungsweite um den mittigen Spalt. Das ist nicht schädlich. Nach Beendigung der Zerfallsperiode für die metastabilen Analytionen kann jetzt das ganze zehn Millimeter breite Paket an Ionen in Längsrichtung zum Schwingen angeregt werden. Dieses Paket ist immer noch kohärent genug für die Bildstrommessung.
Eine besonders für diese Erfindung geeignete Art von Analytionen wird durch Laserdesorption, vorzugsweise durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), aus festen Proben auf einem Probenträger erzeugt. Die desorbierten Analytionen sind, wie aus MALDI-Flugzeitmassenspektrometern bekannt, weitgehend mit einem Überschuss an innerer Energie ausgestattet, also metastabil, was erfindungsgemäß für die Aufnahme von Fragmentionenspektren ausgenutzt werden kann. Es kann sich der Probenträger dabei fast direkt vor der Einschussöffnung befinden, mit nur sehr wenig Strahlführungsoptik zwischen Probe und Öffnung. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich jedoch ein Quadrupol-Ionenfilter (18) zwischen Kingdon-Ionenfalle und Probenträger (15); es können dann aus dem Gemisch der erzeugten Ionen störende Ionen herausgefiltert werden. Dazu können die leichten Ionen gehören, die in großen Mengen bei der matrixunterstützten Laserdesorption aus weitgehend zerstörten Matrixmolekülen gebildet werden. Es ist aber insbesondere auch möglich, diejenigen Analytionen, deren Fragmentionenspektrum gemessen werden soll, aus dem Gemisch an Analytionen allein ausgefiltert in die Kingdon-Ionenfalle einzuführen. Diese Analytionen, deren Fragmentionenspektrum gemessen werden soll, werden häufig „Elternionen” genannt, die zugehörigen Fragmentionen heißen dann „Tochterionen”.
Bevor die Elternionen für eine Fragmentierung ausgesucht werden können, wird üblicherweise ein Massenspektrum aller in die Kingdon-Ionenfalle eingeführten Analytionen aus der Probe gemessen, um einen Überblick über die eingeführten Analytionen zu erhalten. Für diesen Überblick müssen die Analytionen sofort nach ihrem Einbringen zu Längsschwingungen angeregt werden, um die Bildung von Fragmentionen zu vermeiden. Müssen die Analytionen dabei über längere Zeit aus mehreren Laserschüssen gesammelt werden, ist das nicht mehr möglich. Es hat sich hier als zweckmäßig erwiesen, die entsprechenden Proben doppelt auf den Probenträger aufzubringen, und jeweils einer der beiden Proben etwas Zucker, ein Monosaccharid oder auch ein Disaccharid, zuzufügen. Dieser Zucker mengt sich in das Plasma, das bei dem Laserschuss gebildet wird, und verringert die innere Energie der Analytionen, so dass weit weniger metastabile Analytionen gebildet werden. Es können diese gezuckerten Proben also besser für die Aufnahme der Übersichtsspektren verwendet werden.
Der Laserstrahl zur Desorption kann, wie in gezeigt, aus dem Laser (21) durch die Kingdon-Ionenfalle selbst geführt werden, da sich im Zentrum der Kingdon-Ionenfallen dieser Art keine Innenelektrode befindet. Der Laserstrahl wird dabei durch eine zweite Öffnung, die sich der Einschussöffnung gegenüber in der Außenelektrode befindet, hindurch geführt. Die durch einen oder mehrere Laserstrahlpulse aus einer der Proben (16) auf dem Probenträger (15) erzeugten Analytionen fliegen durch Blende (17), Quadrupolfilter (18), Linsensystem (19) und Einschussöffnung in die Kingdon-Ionenfalle und werden von ihr direkt eingefangen. Dabei kann während des Einschusses die Spannungsdifferenz zwischen Außen- und Innenelektroden vergrößert werden, um die Einfangkonditionen noch zu verbessern.
Es kann der gepulste Laserstrahl jedoch auch, wie beispielsweise in MALDI-Flugzeitmassenspektrometern mit axialem Einschuss in die Flugbahn üblich, unter einem Winkel von seitlich kommend auf die Probe geschossen werden. Der Einschuss kann dabei durch die Öffnungen der Stäbe des Quadrupolfilters (18) hindurch gehen.
Die Blende (17) kann insbesondere dazu verwendet werden, die Ionen aus dem durch den Laserschuss gebildeten Plasma nicht sofort abzuziehen, sondern erst mit einer kleinen Verzögerung zwischen etwa 10 und 1000 Nanosekunden. Diese Verzögerung führt zu einer Erhöhung der Ausbeute an Analytionen, insbesondere auch an metastabilen Analytionen. Die Ionen können sodann durch die Blende (17) auf eine günstige kinetische Energie zum Passieren des Quadrupolfilters beschleunigt werden. Es kann damit eine optimale Zeitdauer eingestellt werden, die die Ionen in dem Quadrupolfilter verbringen und damit der Wirkung des selektierenden Feldes unterliegen. Die endgültige Einschussenergie wird dann durch die Spannungen an der ionenoptischen Linse (19) und der Außenelektrode (10, 11) festgelegt.
Es können selbstredend auch beliebig anders erzeugte metastabile Analytionen in die Kingdon-Ionenfalle eingeführt werden und durch den erfindungsgemäßen Zerfall zu Fragmentionen während der lokalen Speicherung einer Messung eines Fragmentionenspektrums zugeführt werden.
Für die Messung werden die Ionen in kohärenter Form zu harmonischen Schwingungen in Längsrichtung angeregt. Die Detektion des massenabhängigen Signals erfolgt bevorzugt durch die Messung der Periodendauer der harmonischen Schwingung in z-Richtung. Die Ionen jeweils einer Masse müssen dafür im Wesentlichen als ein kohärentes Ionenpaket in z-Richtung schwingen bzw. zumindest zeitweise eine beschränkte räumliche Ausdehnung entlang der z-Richtung aufweisen. Der große inhärente Vorteil eines harmonischen Potentials besteht darin, dass Ionen der gleichen Masse, aber mit unterschiedlichen Anfangsgeschwindigkeiten die gleiche Periodendauer haben, so dass ein Ionenpaket nach einer Schwingungsperiode wieder räumlich und zeitlich fokussiert ist, sich die Ionen also zumindest zeitweise kohärent bewegen. Eine grundsätzliche Voraussetzung für die Messung der Periodendauer der harmonischen Schwingung ist, dass sich die Ionen auch radial hinreichend lange auf räumlich stabilen Trajektorien bewegen und nicht auf eine Elektrode des Elektrodensystems treffen. Das erfordert ein hinreichend gutes Vakuum, damit die Ionen auch bei Speicherzeiten von bis zu zehn Sekunden keine Verluste ihrer kinetischen Energie durch Stöße mit dem Restgas erleiden. Das erforderliche Ultrahochvakuum in der Kingdon-Ionenfalle ist wegen der geschlossenen Bauart nicht einfach herzustellen; es ist daher günstig, wenn die Außenelektroden an den axialen Enden, wo das elektrische Feld leichte Störungen ertragen kann, durch mehrere Öffnungen einen guten Pumpzugang bieten.
Die Periodendauer der harmonischen Schwingung ist proportional zur Wurzel aus der Ionenmasse. Die Massenauflösung ist proportional zur Anzahl der gemessenen Schwingungsperioden. Um die Massenauflösung zu erhöhen, müssen die Ionenpakete nur länger in der elektrostatischen Ionenfalle gespeichert bleiben und gemessen werden. Mit typischen Schwingungsfrequenzen von einigen hundert Kilohertz wird leicht für Ionen von etwa 200 atomare Masseneinheiten eine hohe Massenauflösung von über 50000 in einer Messzeit von etwa einer Sekunde erzielt. Mit längeren Messzeiten sind Massenauflösungen von weit über R = 100000 durchaus erreichbar.
Die schwingenden Ionenpakete induzieren in einem Ionendetektor ein periodisches Signal, das elektronisch verstärkt und zeitlich aufgelöst gemessen wird. Der Ionendetektor kann Detektionselemente aufweisen, wie beispielsweise Detektionsspulen, in denen die Ionenpakete beim Durchflug Spannungen induzieren, oder Detektionselektroden, wie beispielsweise Segmente der Außenelektrode oder der Innenelektroden, in denen die Ionenpakete beim Vorbeiflug Bildströme induzieren.
Ein Massenspektrometer für das erfindungsgemäße Verfahren umfasst neben der elektrostatischen Ionenfalle weiterhin eine Ionenquelle und optional auch ein Ionenleitsystem nach dem Stand der Technik, das die Ionen zwischen der Ionenquelle und der elektrostatischen Ionenfalle überführt, gegebenenfalls speichert, zeitlich oder räumlich konditioniert, nach ihrer Masse selektiert oder fragmentiert.
Der Abstand zwischen den beiden Innenelektroden (12, 13) ist bevorzugt kleiner als 50 Millimeter und insbesondere um 10 Millimeter. Der maximale Innendurchmesser der Außenelektroden (10, 11) ist bevorzugt kleiner als 200 Millimeter, günstig ist ein Wert um etwa 50 Millimeter. Eine günstige Länge der Außenelektroden liegt bei weniger als 200 Millimetern, vorzugsweise bei etwa 100 Millimetern. Ein Massenspektrometer für diese Erfindung kann somit eine sehr kompakte Bauform aufweisen.
Die bis zeigen das Elektrodensystem (1) aus der in der x-y Ebene, x-z Ebene bzw. y-z Ebene. Neben den Außenelektroden (10, 11) und den Innenelektroden (12, 13) sind hier zusätzlich die Trajektorien (14) von gespeicherten Ionen dargestellt, die auf die jeweilige Ebene projiziert sind.
Der Abstand der Innenelektroden (12, 13) in der x-y Ebene beträgt hier etwa 10 Millimeter bei einer Elektrodenlänge von etwa 90 Millimeter. Wie in den und zu erkennen ist, ist die Außenelektrode durch die x-y Ebene in die beiden Halbschalen (10, 11) unterteilt.
Die und zeigen eine Kingdon-Ionenfalle mit einer Desorptions-Ionenquelle, bevorzugt mit einer MALDI-Ionenquelle, zur Einpulsung von metastabilen Ionen. Die MALDI-Ionenquelle besteht hier aus einem Probenträger (15), auf dem Proben (16) aufgebracht sind, der Blende (17), dem Quadrupolfilter (18) und den Elektroden (19). Die Außenelektrode in die beiden Halbschalen (10, 11) segmentiert.
Der Probenträger (15) kann über eine nicht dargestellte Bewegungseinrichtung so verschoben werden, dass weitere Proben (16) auf dem Probenträger (15) nacheinander in den Fokus des gepulsten Laserstrahls aus dem Laser (21) gebracht werden können. Es können damit auch verschiedene Stellen einer Probe (16) abgerastert werden.
In den Proben (16) sind Analytmoleküle in eine feste polykristalline Matrix eingebettet. Der gepulste Laserstrahl aus dem Pulslaser (21) wird durch zwei Öffnungen in der Außenelektrode (10, 11) auf eine der Proben (16) fokussiert. Durch die gepulste Bestrahlung wird die Matrix explosionsartig aus dem festen Aggregatzustand in ein Plasma einer Verdampfungswolke überführt, in der die Ionisation der Analytmoleküle erfolgt. Es ist günstig, die Ionen nicht sofort aus dem Plasma abzuziehen, sondern zunächst für eine kurze Zeit im Plasma zu belassen. Dadurch wird die Ausbeute an Analytionen, insbesondere auch an metastabilen Analytionen, erhöht. Die Ionen können dann nach etwa 10 bis 1000 Nanosekunden durch eine Spannung an der Blende (17) abgezogen und mit einer günstigen Beschleunigung versehen werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden die Elternionen im Quadrupol-Stabsystem (18) ausgewählt und durch das Linsensystem (19) in die Kingdon-Ionenfalle eingebracht.
Da die Einpulsung senkrecht zur Innenwand der Außenelektrode (10, 11) erfolgt, sollte die kinetische Energie der Ionen beim Eintritt sehr gering sein, damit die Ionen bei der Rückkehr von der ersten Pendelbewegung nicht an die Außenelektroden anstoßen. Es ist besonders günstig, während des Einpulsens der Ionen die Spannungsdifferenz zwischen Außen- und Innenelektroden kontinuierlich zu erhöhen, beispielsweise von etwa 1000 Volt auf 5000 Volt.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat seinen besonderen Reiz und einen besonderen Vorteil darin, dass es die Herstellung eines Hochleistungs-Tischgerätes für höchstaufgelöste und massengenaue MALDI-Massenspektrometrie (MALDI = Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption) ermöglicht. Dabei können nicht nur massengenaue Massenspektren von Proteingemischen, beispielsweise von Gemischen von Verdaupeptiden erhalten werden, sondern auch hochaufgelöste Fragmentionenspektren des ergodischen Typs der einzelnen Gemischkomponenten.
In der MALDI-Massenspektrometrie werden die Proben in flüssiger Form auf Probenträger aufgetragen und dann getrocknet, wobei es sich bei den Proben im Allgemeinen um mehr oder weniger weitgehend aufgetrennte Substanzgemische aus Separationsprozessen wie 2D-Gelelektrophorese oder HPLC (Flüssigchromatographie) handelt. Online-Kopplungen mit Separationsverfahren bringen immer zeitliche Zwänge für das verwendete Analysenverfahren mit, Bei MALDI ist diese zeitliche Kopplung aufgehoben, so dass für die Analyse eine Probe jeweils so viel Zeit zur Verfügung steht, wie immer benötigt werden mag. Das ist insbesondere für hochaufgelöste Verfahren unter Verwendung von Fourier-Transform-Massenspektrometern vorteilhaft, da diese stets längere Analysenzeiten zwischen einem Viertel und etwa zehn Sekunden verwenden und jede Probe häufig einer Mehrzahl verschiedener Analysen für die verschiedenen Komponenten oder verschiedenartigen Fragmentierungen unterworfen werden.
Für die Laserdesorption, besonders für die matrix-unterstützte Laserdesorption, ist bekannt, dass eine Erhöhung der Strahlstromstärke des desorbierenden Laserstrahls eine weitere Fragmentierungsart von Proteinionen im direkten Laserplasma erzeugt, die „in-source-decomposition” (ISD) genannt wird. Diese Fragmentionen zeigen ein ganz anderes Fragmentierungsschema, diese Fragmentionenspektren gleichen den Spektren, die aus elektroneninduzierten Fragmentierungen wie ECD (electron capture dissociation) oder ETD (electron transfer dissociation) gewonnen werden. Da diese Fragmentionen ebenfalls leicht in die Kingdon-Ionenfalle eingeführt werden können, können so mit einer Anordnung nach den und Fragmentionenspektren aus beiden Arten von Fragmentierungsprozesse, ergodische wie auch elektroneninduzierte, aus der gleichen Probe gewonnen werden. Die beiden Arten von Fragmentionenspektren nebeneinander erlauben die Feststellung der nackten Sequenz der Aminosäuren einerseits wie auch andererseits der Art und Lokalisierung von posttranslationalen Modifikationen. Solche Untersuchungen waren bisher nur mit aufwändigen TOF-TOF-Geräten möglich, und auch hier nur mit beschränkter Massengenauigkeit.
Dem Fachmann ist es leicht möglich, weitere interessante Anwendungen für das erfindungsgemäße Verfahren der internen Fragmentierung metastabiler Ionen in besonderen Arten von Kingdon-Ionenfallen abzuleiten. Diese sollen durch dieses Schutzbegehren mit abgedeckt sein.

Claims

Verfahren für die Aufnahme von Fragmentionenspektren in einem Kingdon-Ionenfallen-Massenspektrometer mit einem Verlauf des Längspotentials, in dem Ionen harmonisch schwingen können, dadurch gekennzeichnet, dass (a) eine Kingdon-Ionenfalle verwendet wird, in der Ionen in radialer Richtung zwischen zwei oder mehr inneren Elektroden in einer Ebene pendeln können, (b) metastabile Analytionen nahe am Potentialminimum des Längspotentials in die Kingdon-Ionenfalle eingeführt werden, (c) die metastabilen Analytionen solange im Potentialminimum des Längspotentialverlaufs pendelnd gespeichert gehalten werden, bis sie teilweise zu Fragmentionen zerfallen sind, (d) die Analyt- und Fragmentionen zu harmonischen Schwingungen im Längspotential angeregt werden, und (e) die Bildströme der harmonisch längs schwingenden Ionen gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metastabilen Analytionen durch Laserdesorption erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die metastabilen Analytionen durch matrix-unterstützte Laserdesorption erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den metastabilen Analytionen um Elternionen handelt, die aus einem Gemisch von Analytionen durch Ausfiltern gewonnen wurden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausfiltern der Elternionen in einem Quadrupol-Massenfilter geschieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kingdon-Ionenfalle Außen- und Innenelektroden besitzt und dass die Spannungsdifferenz zwischen Außen- und Innenelektroden während des Einbringens der Analytionen abgesenkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kingdon-Ionenfalle Außen- und Innenelektroden besitzt, dass die Außen- oder Innenelektroden symmetrisch in Halbschalen geteilt sind, und dass die Halbschalen als Detektionselektroden für die Messung der Bildströme verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Halbschalen als Anregungselektroden für die Anregung der Ionen zu harmonischen Längsschwingungen im Längspotentialverlauf verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kingdon-Ionenfalle Außen- und Innenelektroden besitzt, dass die Außen- oder Innenelektroden symmetrisch in Halbschalen geteilt sind, dass sich zwischen den Halbschalen ein Paar von zusätzlichen Anregungselektroden befindet, und dass die Halbschalen als Detektionselektroden für die Messung der Bildströme und die zusätzlichen Anregungselektroden für die Anregung der Ionen zu harmonischen Längsschwingungen im Längspotentialverlauf verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionen in axialer Richtung durch Chirp- oder Synch-Pulse an den Halbschalen der Detektionselektroden oder an den zusätzlichen Anregungselektroden angeregt werden.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionen in axialer Richtung durch Gleichspannungspulse an den Halbschalen oder Anregungselektroden angeregt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Gleichspannungspulse eine ansteigende Spannung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionen durch eine Öffnung eingebracht werden, die sich im Spalt zwischen den Halbschalen der Detektionselektroden oder dem Paar der zusätzlichen Anregungselektroden befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass solche Ionen, die das Fragmentionenspektrum störend überlagern und den dynamischen Messbereich einschränken würden, durch resonante Anregung über die Halbschalen der Detektionselektroden oder das Paar der zusätzlichen Anregungselektroden aus der Kingdon-Ionenfalle ausgeworfen werden.