DE102008063233B4

DE102008063233B4 - Hohe Massenauflösung mit ICR-Messzellen

Info

Publication number: DE102008063233B4
Application number: DE102008063233A
Authority: DE
Inventors: Roland Jertz; Gökhan Baykut
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2012-02-16
Anticipated expiration: 2028-12-24
Also published as: GB0920864D0; DE102008063233A1; US8193490B2; US20100207020A1; GB2466551B; GB2466551A

Abstract

Verfahren zur Einstellung der Potentiale an den Kompensationselektroden einer ICR-Messzelle für die Aufnahme von ICR-Massenspektren höchster Auflösungungen unter ständig veränderten Werten der Potentiale an den Kompensationselektroden der ICR-Messzelle durchgeführt wird, wobei für jede einzelne Messung die ICR-Messzelle stets neu mit Ionen befüllt wird, und wobei eine jede Messung darin besteht, das zugehörige Bildstromsignal, d. h. die zugehörige Folge von Bildstrom-Messwerten, als Funktion der Zeit, den sogenannten Bildstrom-Transienten der Messung, zu messen, dass die nutzbare Länge eines jeden Transienten bestimmt wird, wobei die nutzbare Länge eines Transienten als die Zeitdauer definiert ist, ab der das Bildstromsignal keine Wechselstromanteile mehr enthält, d. h. der Bildstrom-Transient nur noch Rauschen zeigt, und dass diejenigen Potentiale an den Kompensationselektroden der ICR-Messzelle eingestellt werden, bei denen das entsprechende Bildstromsignal, also der Transient, im Vergleich zu den anderen Bildstromsignalen der Serie die längste nutzbare...

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Aufnahme von Massenspektren höchster Massenauflösung in Ionenzyklotronresonanz-Messzellen.
Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Einstellung der Kompensation-Potentiale einer ICR-Messzelle mit Kompensationselektroden an, die optimal sind für die Aufnahme von Massenspektren mit höchster Massenauflösung. Es werden dabei die Gleichspannungspotentiale an den Kompensationselektroden so optimiert, dass ein möglichst langer nutzbarer Transient der Bildströme entsteht. Die auf ihrer Zyklotronbahn umlaufenden Ionenwolken werden durch die entstehende Potentialverteilung über lange Zeit zusammengehalten. Es ergeben sich je nach Art des Ionengemisches Transienten von 10 bis über 20 Sekunden Länge, woraus Massenspektren mit höchstem Massenauflösungsvermögen ohne Signal-Koaleszenz gewonnen werden können.
Stand der Technik
In Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (ICR-MS) werden die ladungsbezogenen Massen m/z der Ionen durch die Frequenzen der Umlaufbewegungen von Wolken kohärent fliegender Ionen in ICR-Messzellen gemessen, die sich in einem homogenen Magnetfeld hoher Feldstärke befinden. Die Umlaufbewegung besteht aus Überlagerungen von Zyklotron- und Magnetron-Bewegungen. Das Magnetfeld wird üblicherweise durch supraleitende Magnetspulen erzeugt, die mit flüssigem Helium gekühlt werden. Kommerzielle Massenspektrometer bieten heute nutzbare Durchmesser der ICR-Messzellen bis etwa 6 Zentimeter bei magnetischen Feldstärken von 7 bis 15 Tesla.
Die Ionenumlauffrequenz wird in den ICR-Messzellen im homogensten Teil des magnetischen Feldes gemessen. Die ICR-Messzellen bestehen nach bisheriger Technik gewöhnlich aus vier Längselektroden, die sich parallel zu den magnetischen Feldlinien erstrecken und den Innenraum der Messzelle mantelförmig umschließen. Meist werden zylindrische Messzellen verwendet, wie sie zeigt. Üblicherweise werden zwei gegenüberstehende Elektroden dazu verwendet, achsennah eingebrachte Ionen auf größere Umlaufbahnen ihrer Zyklotron-Bewegung zu bringen, wobei Ionen jeweils gleicher ladungsbezogener Masse m/z möglichst kohärent angeregt werden, um eine phasengleich umlaufende Wolke dieser Ionen zu erhalten. Die beiden anderen Elektroden dienen dazu, den Umlauf der Ionenwolken durch ihre Bildströme, die im Vorbeiflug der Ionenwolken in den Elektroden induziert werden, zu messen. Einfüllen der Ionen in die Messzelle, Ionenanregung und Ionendetektion erfolgen, wie jedem einschlägigen Fachmann bekannt, in aufeinander folgenden Verfahrensphasen.
Weil das Verhältnis m/z der Masse m zur Anzahl z der Elementarladungen der Ionen (im Folgenden einfach als „ladungsbezogene Masse”, manchmal einfach auch nur als „Masse” bezeichnet) vor der Messung unbekannt ist, erfolgt die Anregung der Ionen durch eine möglichst homogene Mischung von Anregungsfrequenzen. Die Mischung kann dabei eine zeitliche Mischung mit zeitlich ansteigenden Frequenzen sein (man spricht dann von einem „Chirp”), oder sie kann eine synchrone, durch Computer berechnete Mischung aller Frequenzen sein (einem „Synch-Pulse”).
Die Bildströme, die durch die umlaufenden Ionenwolken in den Detektionselektroden induziert werden, bilden als Funktion der Zeit einen sogenannten „Transienten”. Der Transient ist ein „Zeitdomänensignal” und nimmt in der Regel in wenigen Sekunden so weit ab, dass nur noch Rauschen übrig bleibt. In Messzellen klassischer Konstruktion beträgt die Länge des nutzbaren Transienten maximal etwa vier Sekunden. Wenn im Folgenden einfach der Begriff der „Länge” eines Transienten verwendet wird, so ist damit immer die „nutzbare Länge” gemeint.
Die Bildströme der Transienten werden verstärkt, digitalisiert und durch Fourier-Analyse auf die darin vorkommenden Umlauffrequenzen der Ionenwolken verschiedener Massen untersucht. Die Fourier-Analyse transformiert dabei die Folge der originären Bildstrom-Messwerte des Transienten aus der „Zeitdomäne” in eine Folge von Frequenzwerten in einer „Frequenzdomäne”. Man spricht deshalb auch von Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FTMS), wobei jedoch anzumerken ist, dass es heute auch andere Arten der FTMS gibt, die nicht auf dem Umlauf von Ionen in Magnetfeldern beruhen. Aus den als Peaks in der Frequenzdomäne erkennbaren Frequenzsignalen der verschiedenen Ionensorten werden dann ihre ladungsbezogenen Massen m/z und ihre Intensitäten bestimmt. Wegen der hohen Konstanz der verwendeten Magnetfelder und wegen der hohen Messgenauigkeit für Frequenzmessungen kann eine außergewöhnlich hohe Genauigkeit der Massenbestimmung erzielt werden. Gegenwärtig ist die Fourier-Transformations-ICR-Massenspektrometrie (korrekt abgekürzt FT-ICR-MS) die genaueste aller Arten von Massenspektrometrie. Die Genauigkeit der Massenbestimmung ist letztendlich von der Anzahl der Ionenumläufe abhängig, die durch die Messung erfasst werden können.
Wenn im Folgenden der Begriff „Aufnahme eines ICR-Massenspektrums” oder eine ähnliche Formulierung verwendet wird, so umfasst das, wie jedem einschlägigen Fachmann bekannt, die gesamte Folge von Schritten über die Füllung der ICR-Messzelle mit Ionen, Anregung der Ionen zu Zyklotronbahnen, Messung des Bildstrom-Transienten, Digitalisierung, Fourier-Transformation, Bestimmung der Frequenzen der einzelnen Ionensorten und schließlich Berechnung der ladungsbezogenen Massen und Intensitäten der Ionensorten, die das Massenspektrum darstellen.
Für das Einführen der Ionen in die ICR-Messzelle und besonders für ihr Einfangen gibt es verschiedene Verfahren, wie beispielsweise das „side-kick”-Verfahren oder das Verfahren des dynamischen Einfangens mit einer Potentialerhöhung, die hier aber nicht näher besprochen werden. Der einschlägige Fachmann kennt diese Verfahren.
Eine genaue Massenbestimmung ist in der modernen Biomassenspektrometrie außerordentlich wichtig. Es ist keine Grenze für die Massengenauigkeit bekannt, jenseits der keine weitere Erhöhung des Informationsgehaltes mehr zu erwarten wäre. Die Erhöhung der Massengenauigkeit ist daher ein ständig weiter zu verfolgendes Ziel. – Eine hohe Massengenauigkeit allein reicht aber häufig nicht für die Lösung einer vorgegebenen analytischen Aufgabe aus. Neben der hohen Massengenauigkeit ist besonders ein hohes Massenauflösungsvermögen entscheidend, da gerade in der Biomassenspektrometrie sehr häufig Ionensignale mit sehr geringen Massenunterschieden getrennt nachgewiesen und gemessen werden müssen. So kommen beispielsweise bei enzymatischem Verdau von Proteinmischungen in einem Massenspektrum Tausende von Ionen vor; häufig müssen in einem kleinen Intervall um eine nominale Massenzahl herum fünf bis zehn oder mehr verschiedene Ionensorten getrennt und präzise vermessen werden.
In den heute üblichen zylindrischen Messzellen wird der Zylinder aus vier Längselektroden gebildet, wie in dargestellt. Zylindrische Messzellen werden vor allem deshalb am häufigsten benutzt, weil sie die beste Ausnutzung des Volumens im magnetischen Feld einer runden Spule ergeben. Dabei formen allerdings die Bildströme scharfer Bündel von Ionen einer Masse bei starker Annäherung an die Detektionselektroden eine Kurve mit fast rechteckigen Ausschlägen. Die bis heute stets beobachtete Verschmierung der Ionenbündel einerseits und die durch Anregungsbedingungen gewählte Entfernung der Ionenkreisbahnen von den Detektorelektroden andererseits führt jedoch zu weitgehend sinusförmigen Bildstromsignalen für jede Ionensorte, aus denen sich durch eine Fourier-Analyse leicht ihre Umlauffrequenz und damit ihre Masse bestimmen lässt.
Weil sich die Ionen frei in Richtung der magnetischen Feldlinien bewegen können, müssen die Ionen, die vom Einfüllen her jeweils Geschwindigkeitskomponenten in Richtung des Magnetfelds besitzen, daran gehindert werden, die Messzelle zu verlassen. Es sind daher die Messzellen an beiden Stirnseiten mit Elektroden ausgestattet, den so genannten „Trapping-Elektroden”. Diese sind für gewöhnlich mit Gleichspannungspotentialen versehen, die die Ionen abstoßen, um die Ionen in der Messzelle zu halten. Es gibt sehr verschiedene Formen für dieses Elektrodenpaar; im einfachsten Fall handelt es sich dabei um plane Elektroden mit zentralem Loch, wie in zu sehen ist. Das Loch dient der Einführung der Ionen in die Messzelle. In anderen Fällen werden außerhalb der Stirnseiten der Messzelle weitere Elektroden in der Form von Zylindermantelsegmenten angebracht, die die inneren Zylindermantelsegmente nach außen fortsetzen und die mit Trapping-Spannungen versehen werden. Es entsteht so ein offener Zylinder ohne stirnseitige Wände, wie in dargestellt ist; in diesen Fällen spricht man von „offenen ICR-Zellen”.
Betrachtet man einmal nur den Potentialverlauf längs der Achse der Messzelle, so erzeugen die Ionen abstoßenden Potentiale der äußeren Trapping-Elektroden (gemessen gegenüber dem Potential der Mantelelektroden) sowohl bei Lochblenden wie auch bei offenen ICR-Zellen eine Potentialmulde im Inneren der Messzelle. Der Potentialverlauf längs der Achse hat ein Minimum genau im Mittelpunkt der Messzelle, wenn die Ionen abstoßenden Potentiale an den beidseitigen Trapping-Elektroden gleich hoch sind, mit einem parabelförmigen und somit harmonischen Potentialverlauf in der direkten engen Umgebung des Zentrums. In größerer Entfernung vom Zentrum weicht der Potentialverlauf vom parabolischen Verlauf mehr und mehr ab. Die eingeführten Ionen werden in dieser Potentialmulde Oszillationen in Achsenrichtung ausführen, die so genannten Trapping-Schwingungen, weil sie vom Einführen her Geschwindigkeiten in Achsenrichtung besitzen. Solange die Ionen keine zusätzliche kinetische Energie bekommen, hält das starke Magnetfeld die Ionen in der Achse und verhindert jedes radiale Ausweichen.
Die Weite (Amplitude) der Trapping-Schwingungen hängt von der kinetischen Energie ihrer Geschwindigkeit in Achsenrichtung ab. Sind die Amplituden so klein, dass die Ionen den streng parabolischen Teil des Potentialminimums nicht verlassen, so ist ihre Schwingung „harmonisch”, hier ist die Schwingungsfrequenz unabhängig von der Schwingungsweite. Das gilt nicht mehr bei weiten Schwingungsamplituden, die über den parabolischen Teil des Potentialminimums hinausgehen; hier ist die Schwingungsfrequenz von der Amplitude abhängig.
Es soll hier aber auch angemerkt werden, dass die Trapping-Potentiale zwar ein Minimum längs der Achse aufweisen, dass die Potentiale aber in radialer Richtung in Richtung auf die Längselektroden abfallen. Das Minimum in Achsenrichtung ist, dreidimensional gesehen, ein Sattelpunkt; das Trapping-Potential fällt in radialer Richtung, also quer zur Achse nach allen Seiten hin ab. Dreidimensional bildet die genaue Form der Potentialverteilung ein räumliches Quadrupolfeld, zumindest in enger Umgebung des Sattelpunktes. Die auf der Achse eingeführten Ionen können allerdings, wie schon angemerkt, wegen des starken Magnetfelds nicht seitlich ausweichen, bis sie zusätzliche Energie von oszillierenden elektrischen Anregungsfeldern absorbieren und so auf die Zyklotronbahnen gehoben werden.
Die den Trapping-Schwingungen zugrunde liegenden Trapping-Potentiale verändern die Umlauffrequenzen der Ionen und wirken so auf die Massenbestimmung ein. Die gemessene Umlauffrequenz ω₊ (die ”reduzierte Zyklotron-Frequenz”) einer Ionensorte beläuft sich bei Abwesenheit von zusätzlichen Raumladungseffekten, also bei nur sehr wenigen Ionen in der ICR-Messzelle, auf
wobei ω_c die ungestörte Zyklotron-Frequenz, und ω_t die Frequenz der Trapping-Schwingung ist. Man sieht hieraus, dass es günstig ist, für die Trapping-Schwingungen ein harmonisches elektrisches Trapping-Potential mit einer Potentialmulde zu schaffen, die auch weit außerhalb des Zentrums noch exakt parabelförmig ist, da nur dann die Frequenz ω_t der Trapping-Schwingungen, und damit die gemessene Umlauffrequenz ω₊, gut definiert ist. Es ist also günstig, auch weit außerhalb des Zentrums eine exakt quadrupolare Potentialverteilung zu haben. Nur bei gut definierter Frequenz ω_t der Trapping-Schwingungen, die unabhängig von ihrer (zufälligen) Schwingungsweite ist, ist auch die reduzierte Zyklotronfrequenz ω+ gut definiert und es kann für die daraus bestimmte ladungsbezogene Masse m/z eine hohe Genauigkeit erwartet werden.
Die Frequenz ω_t der Trapping-Schwingungen geht nur über einen etwas komplizierten Mechanismus in die reduzierte Zyklotronfrequenz ω₊ ein. Die elektrischen Feldkomponenten des Trappingfeldes in radialer Richtung erzeugen während der Anregung der Ionen durch die kreisförmigen Beschleunigungen zu Zyklotronbewegungen eine zweite Bewegungsart der Ionen: die Magnetron-Kreisbewegung. Das Magnetron-Kreiseln ist eine kreisende Bewegung um die Achse der Messzelle, aber normalerweise sehr viel langsamer als die Zyklotron-Kreisbewegung und, nach erfolgreicher Anregung, mit viel kleinerem Radius. Die zusätzliche Magnetron-Kreisbewegung führt dazu, dass die Mittelpunkte der Zyklotron-Kreisbewegungen mit der Magnetron-Frequenz um die Achse der Messzelle kreisen, so dass die Bahnen der Ionen Zykloidenbewegungen beschreiben. Erst über diese Magnetron-Kreisbewegung nimmt das Trappingfeld Einfluss auf die Zyklotronbewegung mit dem Resultat einer reduzierten Zyklotronfrequenz ω₊.
Unter Fachleuten herrscht weitgehend Einigkeit darüber, dass ein ideales Trapping-Potential für möglichst ideal harmonische Trapping-Schwingungen auch außerhalb der engen Umgebung des Zentrums möglichst exakt die Form eines dreidimensional quadrupolaren Feldes haben sollte. Angeregte Ionen können dann auch während ihrer Zyklotronumläufe parallel zur Achse der Messzelle harmonisch schwingen. Ein solches quadrupolares Trappingfeld kann am einfachsten durch rotationshyperbolische Endkappen- und Ringelektroden erzeugt werden, geometrisch ähnlich denen einer dreidimensionalen Paulschen Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle.
Für die funktionsgerechte Konstruktion einer ICR-Messzelle gibt es daher ein schwer aufzulösendes Dilemma. Einerseits verlangt die Forderung nach einer quadrupolaren Verteilung der Trapping-Potentiale eine Messzelle, die optimal nur mit rotationshyperbolischen Endkappen- und Ring-Elektroden hergestellt werden kann, andererseits verlangt eine gleichmäßige Anregung der Ionen einer ausgedehnten Ionenwolke zu Zyklotronbewegungen sehr lange, achsenparallele Elektroden oder die Erzeugung einer entsprechenden Feldverteilung in einer „infinity cell”, wie sie von M. Allemann und P. Caravatti im Patent DE 3 914 838 C2 angegeben wird. Diese beiden Forderungen sind nur sehr schwer gleichzeitig zu erfüllen.
Ein erster Lösungsvorschlag wurde in der Arbeit von G. Gabrielse et al., „Open-Endcap Penning Traps for High Precision Experiments”, (I J Mass Spectrom & Ion Processes, 88 (1989), 319–332) veröffentlicht. Die Autoren führten Kompensationselektroden in eine offene ICR-Messzelle ein. Es wurden Messzellen mit fünf Segmenten vorgestellt, mit denen nach mathematischen Berechnungen gute Näherungen für weite quadrupolare Trapping-Felder erzielt werden konnten.
Jüngst hat es zwei weitere Versuche gegeben, in offenen ICR-Messzellen Trapping-Potentiale zu schaffen, die im weiteren Umfeld des Zentrums möglichst gut das dreidimensional quadrupolare Feld einer idealen ICR-Messzelle wiedergeben sollen, um so harmonische Trapping-Schwingungen zu erzeugen. Auch in diesen Arbeiten wurde das oben beschriebene Dilemma zwischen hyperbolischen und zylindrischen Messzellen durch Kompensationselektroden aufzulösen getrachtet, wobei mehr Kompensationselektroden als bei Gabrielse et al. verwendet wurden. In beiden Arbeiten wurden die günstigsten Potentiale an den Kompensationselektroden durch Computersimulationen ermittelt.
In der Arbeit von A. V. Tolmachev et al., „Trapped-Ion Cell with Improved DC Potential Harmonicity for FT-ICR MS” (J Am Soc Mass Spectrom 2008, 19, 586–597) wurde versucht, durch Optimierung der Gleichspannungspotentiale einer im Computer simulierten Messzelle mit vorgegebenen Breiten der Elektroden-Segmente zu erreichen, dass das auf den Radius r normierte radiale Potential E_r/r über einen weiten Bereich um das Zentrum herum möglichst minimale Abweichungen von den theoretischen Werten einer quadrupolaren Verteilung zeigte. Es wurden dabei für die Simulation und später auch für den Bau der realen Messzelle sieben Segmente mit den relativen Breiten 10, 2, 2, 5, 2, 2, 10 mit je vier Längselektroden verwendet, die insgesamt einen langen Zylinder mit insgesamt 4 × 7 = 28 Längselektroden bildeten. Für die Anregung der Ionen zu Zyklotronbewegungen wurden jeweils zwei Längselektrodenensembles über alle sieben Segmente hinweg verwendet. Für Messungen mit der real gebauten Messzelle wurden die Gleichspannungspotentiale verwendet, die in der Simulation als optimal gefunden wurden. Die Massengenauigkeit, die mit dieser Messzelle erzielt werden konnte, war in der Tat mit 50 ppb (parts per billion) hervorragend, obwohl nur relativ kurze Abschnitte der Transienten von nur maximal zwei Sekunden, meist nur 0,2 bis 0,5 Sekunden, für die Fourier-Transformationen verwendet wurden. Über die Massenauflösungen wurde nichts mitgeteilt; sie können aber bei derartig kurzen Transienten-Abschnitten nicht außergewöhnlich hoch sein, da die Massenauflösung stets proportional zur Anzahl der gemessenen Schwingungsperioden ist.
In der Arbeit A. M. Brustkern et al., „An Electrically Compensated Trap Designed to Eighth Order for FT-ICR Mass Spectrometry”, (J Am Soc Mass Spectrom 2008, 19, 1281–1285) wurde versucht, ebenfalls am Feld einer simulierten Messzelle, hier jedoch mit insgesamt neun Segmenten, die Abweichungen zwischen simuliertem und idealem Quadrupolfeld möglichst gut anzunähern. Die jeweils drei Kompensationselektroden zu beiden Seiten des zentralen Segments waren hier sehr schmal. Die Arbeit gibt leider für die massenspektrometrischen Experimente keine exakten Messparameter an; es ist nur zu entnehmen, dass unter anderem mit gekühlten Ionenwolken gearbeitet wurde, die durch Pulse von eingelassenem Stickstoff erzeugt und dann zum Teil wieder kohärent zu Trapping-Schwingungen angeregt wurden. Die berichtete Massenauflösung von 17 Millionen für [Arg⁸]-Vasopressin bei Masse 1084,5 u ist jedoch aller Wahrscheinlichkeit nach auf eine Signal-Koaleszenz (siehe unten) oder auf ein damit zusammenhängendes „phase locking” zurückzuführen, die in einem normalen Messbetrieb vermieden werden müssen, da damit die Signale mehrerer benachbarter Massen zu einem Signal scheinbar hoher Auflösung zusammengeschoben werden. Aus dieser Arbeit kann zwar die Zielsetzung für die Optimierung entnommen werden, leider muss sie aber wegen ihres Mangels an Angaben über die Messparameter für Vergleiche des Erfolgs für die Massenauflösung und -genauigkeit unberücksichtigt bleiben.
Die vorgenannten Arbeiten zielen beide auf die Herstellung eines ideal quadrupolaren Feldverlaufs für das Trapping-Potential ab. Ein solcher Feldverlauf ist für kleine Anzahlen von Ionen in der Messzelle sicherlich ideal. Es ist jedoch fraglich, ob der Feldverlauf auch ideal ist, wenn viele Ionen in der Größenordnung einiger Zehntausend bis Hunderttausend Ionen in die Messzelle eingefüllt werden, wie für quantitative Analysen notwendig ist.
Werden sehr viele Ionen in die ICR-Messzelle eingeführt, so treten zusätzliche Effekte auf. Die Ionen werden bei ihren Trapping-Schwingungen durch die vielen elastischen Stöße mit anderen Ionen immer wieder seitlich abgelenkt, wobei stets ein Teil der zunächst längs der Achse ausgerichteten Geschwindigkeiten in Zyklotron-Bewegungen mit winzigen Radien unter einem Millimeter umgewandelt wird. Die Stöße zwischen den Ionen führen somit in Zeiten weit unter einer Sekunde zu einer Umverteilung der kinetischen Energie der anfänglich weiten Trapping-Schwingung auf die räumlichen Freiheitsgrade, ähnlich einer Thermalisierung in einem Stoßgas. Das führt zu einer Verkürzung der dünnen, länglichen, zigarrenförmigen Ionenwolke, deren Ionen jetzt nicht mehr bis an die Trapping-Elektroden heran schwingen können.
Sind die Ionen sehr schwer, bestehen sie also aus Hunderten von Atomen, so können teilelastische Stöße sogar zur Erhöhung der inneren Energie, damit zum Verschwinden von kinetischer Energie und so zu einer weiteren Verkürzung der Ionenwolke führen. Dieser Effekt wurde aber bisher nicht untersucht; er hat wahrscheinlich eine sehr lange Zeitkonstante. Ein solcher Effekt könnte zu einer Art „Kristallisation” der Ionen in der Ionenwolke führen, wie sie für Quadrupol-Hochfrequenz-Ionenfallen nach Thermalisierung der Ionenbewegungen mit einem Dämpfungsgas regelmäßig auftritt. Die Kristallisation besteht darin, dass die Ionen in der Wolke praktisch ortsfest eingefangen sind und nur noch wenige Platzwechsel stattfinden.
Ein weiterer Effekt, der auftritt, wenn sich in der ICR-Messzelle sehr viele Ionen befinden, ist die Koaleszenz von Ionenwolken sehr ähnlicher Massen auf ihrer Zyklotronbahn, die zu einer Signal-Koaleszenz führt. Nach der Anregung kreisen die Wolken von Ionen verschiedener Massen mit verschiedenen Zyklotronfrequenzen auf derselben Umlaufbahn. Ionenwolken mit fast gleichen Zyklotronfrequenzen (fast gleiche Massen) bleiben auf dieser Bahn auch relativ lange zusammen. Sie trennen sich nur extrem langsam, und die abstoßenden Coulombkräfte zwischen den beiden Wolken wirken sehr lange aufeinander ein. Die beiden Wolken beginnen unter Wirkung des abstoßenden elektrischen Feldes, um den gemeinsamen Ladungsschwerpunkt zu rotieren. Aus den Zyklotronumläufen und dieser Rotation umeinander entstehen Zykloidenbahnen, die die beiden Wolken wegen ihrer leicht verschiedenen Zyklotron-Umlaufgeschwindigkeit immer wieder ineinander führen. Sie verhaken sich auf diese Weise ineinander. Dieser Effekt hängt von der Stärke der Abstoßung zwischen den Ionenwolken, also von der Anzahl der Ionen in den beiden (oder mehreren) Ionenwolken ab. Auf diese Weise verhalten sich die beiden Ionenwolken auf der Zyklotronbahn wie eine Einheit und führen zu einem einzigen Bildstrom-Signal anstelle von zwei getrennten Signalen. So koaleszieren zwei (oder auch mehrere) ICR-Signale zu einem einzigen, oft sehr scharfen Signal.
Manchmal betrifft diese Signal-Koaleszenz die verschiedenen Signale einer Ionensorte, die durch die verschiedenen ¹³C-Satelliten gebildet werden, sich also jeweils um eine Masseneinheit unterscheiden. Besonders häufig betrifft es die Feinstruktur dieser ¹³C-Satelliten bei ein und derselben nominalen Masseneinheit, die aber auch einige der Isotopen ²D, ¹⁵N, ¹⁸O oder ³⁴S besitzen, und deren Signale nur mit besonders hohem Massenauflösungsvermögen getrennt werden können. Auch die Ionensignale zweier verschiedener Substanzen, die die gleiche nominale Massenzahl haben, können davon betroffen sein. Die besonders scharfen Signale der Signal-Koaleszenz können leicht für hochaufgelöste ICR-Signale gehalten werden, sie enthalten jedoch keine korrekte analytische Information und verfälschen die Massenbestimmung.
Dieser Effekt der Signal-Koaleszenz (engl. peak coalescence) tritt in der Regel nur bei hoher Ionendichte auf. Da die angeregten Ionenwolken in der ICR-Zelle die Form einer dünnen Zigarre haben, deren Länge vom Trapping-Potential abhängt, wird die Ionendichte bei erhöhtem Trappingpotential größer, und die Koaleszenz kann bei einer niedrigeren Ionenzahl auftreten. Es ist nicht bekannt, ob die Signal-Koaleszenz auch von der Form der Ionenwolken, der Weite der Zyklotronbahnen oder anderen Parametern abhängt.
Die Umlauffrequenzen der Wolken mit den jeweiligen Ionensorten können durch die Fourier-Transformationen der Bildstrom-Transienten bestimmt werden. Dabei gilt, dass die Frequenzen umso genauer bestimmt werden können, je länger die Bildströme gemessen werden. Die Messzeiten für die Zyklotron-Umläufe der Ionen sind jedoch begrenzt; sie betragen in kommerziellen ICR-Massenspektrometern häufig nur maximal vier Sekunden. In dieser Zeit ist die Stärke der Bildströme des Transienten in der Zeitdomäne für gewöhnlich so weit abgefallen, dass das Rauschen vorherrscht und eine Verlängerung der Messzeit keine Verbesserungen der Frequenzbestimmung mehr ergibt. Damit wird auch die Massenauflösung nicht mehr verbessert.
Das Vakuum in der Messzelle muss so gut wie möglich sein, weil während der Messung der Bildströme keine Stöße der Ionen mit Restgasmolekülen stattfinden dürfen. Jeder Stoß eines Ions mit einem Restgasmolekül bringt das Ion aus der Umlaufphase der übrigen Ionen gleicher ladungsbezogener Masse. Durch den Verlust an Phasenhomogenität (Kohärenz) kommt es zu einer Abnahme der Bildströme und zu einer kontinuierlichen Verminderung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses, wodurch die nutzbare Messdauer herabgesetzt wird. Die Dauer der Messungen soll sich mindestens auf einige Hundert Millisekunden, idealer Weise auf einige Sekunden belaufen. Damit sind Vakua im Bereich von 10^–7 bis 10^–9 Pascal erforderlich.
In der Arbeit von E. N. Nikolaev et al., „Realistic modelling of ion cloud motion in a Fourier transform ion cyclotron resonance cell by use of a particle-in-cell approach” (Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21, 1–20) konnte in aufwändigen Computer-Simulationen gezeigt werden, dass selbst in ideal guten Vakua die zunächst zigarrenförmigen Wolken der Ionen gleicher ladungsbezogener Masse während der Umläufe einer stetigen Formänderung unterliegen. In ICR-Messzellen mit stirnseitigen Trapping-Lochblenden bilden die zigarrenförmigen Wolken je nach Bedingungen von den Enden oder vom Zentrum her Schwänze aus, die auf der Kreisbahn der Wolken hinterher gezogen werden. Schwänze vom Zentrum her erzeugen zunächst eine Form, die an breite Kaulquappen erinnert. Die Schwänze verlängern sich ständig, bis sie zu umlaufenden Ringen werden, die für die Detektion der Bildströme nichts mehr beitragen können. Die Kaulquappenköpfe werden zu bloßen Verdickungen der ringförmig umlaufenden Ionenwolken und verschwinden allmählich ganz. Die nutzbare Messzeit ist jetzt zu Ende, da die Bildströme keine Wechselstromanteile mehr enthalten, aus denen allein die Frequenzen der Zyklotronumläufe bestimmt werden können.
Die Gründe für diese Ausbildung von Schwänzen sind noch nicht aufgeklärt, hängen aber wahrscheinlich mit der Raumladung der einzelnen Ionenwolken in Verbindung mit der Form der Trapping-Potentiale zusammen. In den Ionenwolken herrschen starke abstoßende Kräfte, die die Wolke auseinander zu treiben versuchen. Diese Kräfte führen im starken Magnetfeld zu einer Rotation der Wolke um ihre eigene Achse, wobei sich die Rotation so einstellt, dass sich die Kraft der abstoßenden Raumladung, die zusätzliche Fliehkraft und die Lorentzkraft die Waage halten. Dabei kann es durch Dichteschwankungen oder andere Effekte zu Ungleichgewichten mit Protuberanzen führen. Interessanterweise spielt es kaum eine Rolle, dass die verschiedenen Wolken der Ionen verschiedener Massen einander dauernd auf ihrer Kreisbahn überholen, wobei sie sich immer wieder gegenseitig durchdringen müssen.
Die Patentanmeldung US 2008/0067346 A1 offenbart ein Kalibrierungsverfahren für ein Massenspektrometer, das die Aufnahme von mehreren Massenspektren auf Grundlage von Ionengesamtheiten unterschiedlicher Dichte bei Verwendung voneinander abweichender Einfangpotentiale umfasst.
Die Patentanmeldung US 2007/0176094 A1 beschreibt ein Verfahren zum Anlegen eines Hochfrequenzfelds an eine zweidimensionale Elektrodenstruktur, wobei Hochfrequenzspannungen an Hauptelektroden und an Kompensationselektroden angelegt werden. Die Spannungen an den Kompensationselektroden werden proportional zu den Spannungen an den Hauptelektroden derart gewählt, dass das Hochfrequenzfeld für Anwendungen wie eine Ionenanregung, die eine stoßinduzierte Dissoziierung einschließen kann, optimiert ist.
Die Patentanmeldung DE 10 2007 047 075 A1 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung für ein ICR-Massenspektrometer, bei dem die Ionen parallel zum Magnetfeld durch Potentiale an einem Muster von Elektrodenelementen in der ICR-Falle eingeschlossen werden und während ihres Vorbeiflugs ein inhomogenes elektrisches Hochfrequenzwechselfeld mit abstoßender Wirkung erfahren. Diesem, auf die Ionen einwirkenden elektrischen Wechselfeld wird mit einer speziell ausgeführten Spannungsversorgung ein zusätzliches elektrostatisches Feld mit anziehender Wirkung überlagert. Durch geeignete Einstellung der Spannungen ermöglicht das zusätzliche elektrostatische Feld eine Kompensation der durch die Raumladung verursachten Zyklotronfrequenzverschiebung der Ionen und somit eine Verbesserung in der Massenbestimmung.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Potentialeinstellung von ICR-Messzellen mit Kompensationselektroden bereitzustellen, das Aufnahmen von Massenspektren höchster Massenauflösung ergibt. Besonders günstig ist es, wenn sich auch bei Füllungen mit einigen Zehntausend bis Hunderttausend Ionen keine Signal-Koaleszenz zeigt.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beruht auf der neu gewonnenen Erkenntnis, dass in einer ICR-Messzelle mit einer nutzbar hohen Befüllung mit Ionen das elektrische Potentialfeld für ein langes Zusammenhalten der umlaufenden Ionenwolken anders ausgeformt sein muss als ein ideal quadrupolares Potentialfeld. Das lange Zusammenhalten der umlaufenden Ionenwolken führt zu einem lange messbaren nutzbaren Transienten, und dieser wiederum zu einer hohen Massenauflösung.
Die Erfindung stellt zunächst ein Optimierungs-Verfahren für die Einstellung der Kompensations-Potentiale für eine höchste Massenauflösung einer ICR-Messzelle mit Kompensationselektroden vorgegebener geometrischer Abmessungen bereit. Das Verfahren für die Einstellung besteht darin, die Potentiale an den Kompensationselektroden in entsprechenden Messserien so zu optimieren, dass die Messungen der Bildströme einen zeitlich möglichst langen nutzbaren Transienten ergeben. Dieses „Optimierungs-Verfahren für die Einstellung der Potentiale an den Kompensationselektroden” werde im Weiteren kurz mit „Adjustierung der Potentiale” bezeichnet.
Die Länge des nutzbaren Teils der Transienten lässt sich leicht visuell, aber auch durch computergestützte Auswertung bestimmen. Mit einer computergestützten Auswertung lässt sich ein voll automatisches Optimierungsverfahren programmieren. Die Optimierung auf einen langen Transienten ist wesentlich einfacher als die direkte Optimierung auf höchste Auflösung, da letztere je nach Länge der Transienten jeweils andere Fourier-Transformationen für andere Datenmengen erfordert, die aber nur beschränkt zur Verfügung stehen.
Für die wiederholten Messungen der Transienten ist bei dieser Adjustierungsoptimierung die Messzelle stets neu mit Ionen zu befüllen. Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Anzahl der Ionen durch eine geeignete Steuerung möglichst immer gleich hoch zu halten. Es kann dabei durchaus eine hohe Anzahl von Ionen verwendet werden.
Mit der so adjustierten Messzelle werden dann in üblicher Weise die Aufnahmen der ICR-Massenspektren durchgeführt, wobei vorzugsweise die Messzelle jeweils mit der gleichen Anzahl von Ionen wie bei der Adjustierung gefüllt wird. Wird die gesamte Länge des Transienten für die Fourier-Transformation verwendet, zeigen die Massenspektren die gewünschte extrem hohe Massenauflösung. Die Aufnahmen der ICR-Massenspektren können dann beliebig oft an gleichen oder auch an verschiedenen Ionengemischen durchgeführt werden. Eine erneute Adjustierung der Potentiale an den Kompensationselektroden ist nur erforderlich, wenn sich die Verfahrensbedingungen, beispielsweise die Anzahl der eingefüllten Ionen oder der Massenbereich der Ionen, erheblich ändern.
Die Erfindung stellt darüber hinaus auch ein Verfahren für die Konstruktion einer ICR-Messzelle mit Kompensationselektroden bereit, mit der ein besonders hohes Auflösungsvermögen erzeugt werden kann. Dieses Verfahren besteht in einer Optimierung der Anzahl und der Langen der Segmente der ICR-Messzelle. Die Optimierung wird mit dem Ziel durchgeführt, dass, nach jeweiliger Adjustierungsoptimierung der Potentiale an den Kompensationselektroden, ein möglichst langer nutzbarer Transient entsteht.
Die Adjustierungsoptimierung zielt auf möglichst lange Transienten. Es wird also im Gegensatz zu dem Vorgehen in den obig zitierten Veröffentlichungen nicht angestrebt, ein ideal quadrupolares Trappingfeld zu erzeugen, sondern es wird auf ein Trappingfeld abgezielt, das die Ionen in den einzelnen Ionenwolken auf ihrer Umlaufbahn möglichst lange stabil zusammenhält. Überraschenderweise zeigen die Signale trotz hoher Anzahlen von Ionen in der ICR-Messzelle bis zu sehr hohen Ionenbefüllungen von etwa 100 000 Ionen praktisch keine Koaleszenz.
Soweit in unseren Arbeiten eine ICR-Messzelle verwendet wurde, die in den Abmessungen der Kompensationselektroden mit derjenigen von Tolmachev et al. übereinstimmte, ergab die Adjustierungsoptimierung Potentiale für die Kompensationselektroden, die in charakteristischer Weise verschieden von denen bei Tolmachev et al. waren. Für die beiden Paare von Kompensationselektroden wurden Potentiale erhalten, die, gemessen in Relation zu den Trapping-Potentialen an den äußersten Elektrodensegmenten, geringfügig, aber signifikant höher waren als die Potentiale von Tolmachev et al. Die geringfügige Änderung der Potentiale hat aber eine durchschlagende Wirkung auf die Länge des Transienten und auf das erreichbare Auflösungsvermögen. Die so adjustierten Potentiale waren auch stets verschieden von den Potentialen, die in eigenen Simulationen für eine ideal quadrupolare Potentialverteilung gefunden wurden. Es wird dadurch bestätigt, dass für das lange Zusammenhalten der Ionenwolken eine andere Potentialverteilung notwendig ist als eine ideal quadrupolare.
Es konnten Transienten mit nutzbaren Langen von 10 bis 20 Sekunden und mehr erzielt werden. Es ergaben sich daraus bisher unerreichte Massenauflösungen sowohl für die Massenspektren einzelner Substanzen mit geringer Anzahl verschiedener Ionensorten wie auch für komplexe Ionengemische. So wurde beispielsweise für die schwierig zu messenden Isotopensignale der 49fach geladenen Ionen von BSA (bovine serum albumin) in einem Magnetfeld von sieben Tesla bei Masse m/z = 1350 u ein bisher noch nie erreichtes Auflösungsvermögen von R = 800 000 erhalten, wobei 200 Einzelspektren addiert werden konnten (siehe ). Für Einzelspektren von Reserpin ergab sich ohne Signal-Koaleszenz bei B = 7 T ein Auflösungsvermögen von R = 6 000 000, mit einem Transienten, der über 20 Sekunden fast gar nicht abfiel. In den und sind, wiederum bei nur sieben Tesla, die gut aufgelösten Feinstrukturen des jeweils zweiten ¹³C-Satelliten für die doppelt geladenen Ionen von [Arg⁸]-Vasopressin und Substanz P gezeigt, jeweils im Vergleich zu den theoretisch berechneten Feinstrukturen.
Selbst wenn diese langen Transienten nicht in ihrer ganzen Länge für die Fourier-Transformation genutzt werden, sondern beispielsweise nur in der Länge einer Sekunde, ist die erzielte Massenauflösung besser als die entsprechende Auflösung von unkompensierten oder falsch kompensierten ICR-Messzellen, die nur kürzere Transienten liefern.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
gibt eine zylindrische ICR-Messzelle nach dem Stand der Technik wieder. Zwischen den beiden Trapping-Elektroden (01) und (07), die hier als Lochblenden ausgebildet sind, befinden sich vier Längselektroden (02–05) in der Form von Zylindermantelsegmenten, von den hier aber nur zwei Längselektroden (03, 04) sichtbar sind. Von den vier Längselektroden dienen zwei gegenüberliegende Elektroden, beispielsweise die Elektroden (03) und (05), zur Anregung der Ionen zu Zyklotronbahnen und die beiden anderen zum Messen der Bildströme.
zeigt eine offene ICR-Messzelle, wie sie für diese Erfindung verwendet werden kann, in zylindrischer Ausführung mit insgesamt sieben Segmenten. Die geteilten Längselektroden sind in vier Reihen angeordnet, von den hier nur die beiden oben liegenden Reihen (21–27) und (31–37) voll sichtbar sind. Durch Trapping-Spannungen an den Längselektroden der jeweils drei äußeren Segmente werden die Ionen nur im mittleren Abschnitt im Bereich der Längselektroden (14, 24, 34, 44) gehalten. Die Anregung erfolgt durch Chirp- oder Synch-Pulse an gegenüberliegenden Reihen von Längselektroden, beispielsweise der Reihe (21–27) und der hier nicht voll sichtbaren Reihe (41–47). Dadurch wird eine gleichmäßige Anregung aller Ionen im mittleren Abschnitt erzielt. Da sich die Wolken bevorzugt nur im zentralen Segment aufhalten, können für die Messung der Bildströme beispielsweise allein die Längselektroden (14, nicht sichtbar) und (34) verwendet werden; es brauchen die weiter außen liegenden Längselektroden nicht einbezogen werden, da sie nur zum Signalrauschen beitragen.
zeigt die gleiche ICR-Messzelle wie , jedoch mit abschirmenden, stirnseitigen Lochblenden. ICR-Messzellen dieser Art werden für diese Erfindung bevorzugt verwendet, da sie die elektrischen Felder der Zuleitungen aus dem Inneren der ICR-Messzelle fernhalten.
bezieht sich auf Schmalband-Messungen an der Substanz [Arg8]-Vasopressin (C₄₆H₆₇N₁₅O₁₂S₂) mit einer Massenauflösung von R = 2 000 000 in einem nur sieben Tesla starken Magnetfeld. Die Abbildung gibt oben (als ) den 18 Sekunden langen Transienten, darunter (als ) das Massenspektrum der doppelt geladenen Molekülionen und darunter (als ) die Feinstruktur des zweiten ¹³C-Satelliten wieder. zeigt zum Vergleich die berechnete Feinstruktur.
zeigt den 26 Sekunden langen Transienten, und gibt einen Ausschnitt aus einem Massenspektrum von Substanz P mit der Bruttoformel C₆₃H₁₀₀N₁₈O₁₃S wieder. Das Schmalband-Massenspektrum wurde mit einem Auflösungsvermögen von R = 2 500 000 gemessen. In dem Massenspektrum sind das monoisotopische Signal der doppelt geladenen Molekülionen und drei ¹³C-Satelliten sichtbar. In ist als Vergrößerung aus die Feinstruktur des zweiten ¹³C-Satelliten wiedergegeben; zum Vergleich zeigt die berechnete Feinstruktur. Die Signale der Feinstruktur erstrecken sich nur über etwa acht Tausendstel einer atomaren Masseneinheit oder etwa 10 ppm der Masse. Aus solchen Feinstrukturen lässt sich die Elementzusammensetzung von Biomolekülen hoher Masse bestimmen.
zeigt ein Breitband-Massenspektrum von BSA (bovine serum albumin) mit dem Molekulargewicht von M = 66 432,45558 u, zur Vorbereitung der Aufnahmen einer Isotopengruppe allein mit höchstem Auflösungsvermögen.
gibt die besonders schwierige Aufnahme des Schmalband-Massenspektrums einer Isotopengruppe des BSA wieder, und zwar der Isotopengruppe der 49-fach geladenen Ionen, deren monoisotopisches Signal bei m/z = 1355,90243 u liegt. Als ist oben der Transient mit seinen „Beats” gezeigt, darunter ( ) das Schmalband-Massenspektrum mit der gesamten Isotopengruppe der 49fach geladenen Ionen, darunter ( ) als Vergrößerung ein zentraler Ausschnitt, der sich über nur zwei atomare Masseneinheiten erstreckt, und darunter ( ) nochmals vergrößert ein Ausschnitt, der sich nur noch über 0,030 atomare Masseneinheiten hinzieht, aber noch 15 Ionensignale der einzelnen Isotopensatelliten enthält. Die Massenauflösung liegt bei R = 800 000. Alle Messungen wurden in einem Magnetfeld von sieben Tesla gemacht. Die hier dargestellten Massenspektren von BSA sind nicht auf genaue Massen kalibriert, können also von den wahren Werten abweichen.
Im obersten Bildausschnitt ist der Transient gezeigt, der sich nutzbar über 14 Sekunden erstreckt und einen starken „Beat” aufweist. Der „Beat” kommt von der starken Periodizität der Ionensignale. Die gemeinsam auf die Zyklotronbahn gehobenen Ionenwolken sind zunächst nahe beieinander und erzeugen starke Bildströme. Sie laufen dann aber auseinander und verteilen sich über lange Zeit fast gleichmäßig über die ganze Umlaufbahn; ihre Bildstromsignale löschen sich dabei wie bei einer Interferenz praktisch aus. Erst wenn sie sich nach vielen Umläufen wieder alle Ionenwolken nahe zusammenfinden, wird ein nächster „Beat” des Bildstroms erzeugt.
Beste Ausführungsformen
Die Erfindung stellt Verfahren bereit, mit denen ICR-Messzellen mit Kompensationselektroden so konstruiert und eingestellt werden können, dass bei einer Aufnahme von Massenspektren eine höchste Massenauflösung erzielt wird. ICR-Messzellen mit Kompensationselektroden sind in dem hier verwendeten Sinne lange Messzellen konstanten Querschnitts, beispielsweise kubisch oder zylindrisch, deren mindestens vier Längselektroden jeweils in mindestens fünf Segmente geteilt sind. In ist als Beispiel eine zylindrische Sieben-Segment-Messzelle mit vier Längselektroden gezeigt. Das zentrale Segment (24, 34) nimmt die Ionenwolken auf, die Elektroden der endständigen Segmente (21, 31) und (27, 37) tragen die Trapping-Potentiale. Die Elektroden der Segmente zwischen dem zentralen Segment und den endständigen Segmenten sind die Kompensationselektroden; die Messzelle der hat je zwei Segmente mit Kompensationselektroden (22, 32, 23, 33, 25, 35, 26, 36) zu beiden Seiten des zentralen Segments. Die ICR-Messzellen können auch stirnseitig angebrachte Lochblenden als Abschirm-Elektroden tragen, wie in dargestellt.
Die ICR-Messzellen bestehen im Allgemeinen aus vier Reihen von Längselektroden; wobei zwei gegenüberstehende Elektrodenreihen der Anregung der zentral in einer schlanken Wolke gesammelten Ionen dienen und sie auf weite Zyklotronbahnen heben, während einige oder alle Elektroden der beiden übrigen einander gegenüberstehenden Elektrodenreihen für die Messung der Bildströme verwendet werden. Es ist aber auch möglich, ICR-Messzellen mit mehr als vier Reihen von Längselektroden zu verwenden, beispielsweise mit acht Reihen von Längselektroden, wobei sich in bekannter Weise durch vier Reihen von Messelektroden für die Bildströme eine Verdoppelung der gemessenen Umlauffrequenz und damit eine Verdoppelung des erzielbaren Auflösungsvermögens ergibt. Diese Verdoppelung ergibt sich allerdings nur so lange, wie die Ionenwolken nicht während der Umläufe so weit auseinanderlaufen, dass sie mehrere Messelektroden überstreichen. Es können selbstredend auch zwölf oder sechzehn Reihen von Längselektroden verwendet werden. Die Verwendung von sechs oder zehn Reihen ist ebenfalls möglich, erfordert aber besondere Maßnahmen für die Zusammenschaltung der Bildstromsignale. (Kapazitiv gekoppelte Platten. Anregung auf Trappingelektroden mit Trappingpotentialen).
Zunächst stellt die Erfindung ein Verfahren für die optimale Einstellung der Potentiale an den Kompensationselektroden einer vorhandenen ICR-Messzelle mit Kompensationselektroden bereit. Eine optimale Einstellung bedeutet, dass mit den so gefundenen Einstellungen der Potentiale in anschließenden Spektrenaufnahmen eine höchste Massenauflösung ohne Signal-Koaleszenz erreicht werden kann. Das Verfahren für die Suche nach der günstigsten Einstellung besteht darin, die Potentiale an den Kompensationselektroden in entsprechenden Messserien so zu optimieren, dass die Messung der Bildströme einen zeitlich möglichst langen nutzbaren Transienten ergibt. Das „Verfahren für die Optimierung der Einstellung der Potentiale mit dem Ziel höchster Massenauflösung” werde, wie schon oben angesagt, im Weiteren kurz mit „Adjustierung der Potentiale” bezeichnet.
Für höchste Auflösungsvermögen werden die ICR-Massenspektrometer stets in einem sogenannten „Schmalband-Modus” betrieben, mit dem jeweils nur ein kleiner Ausschnitt aus einem vollen Massenspektrum gemessen wird, wie dem einschlägigen Fachmann bekannt. Kommerzielle ICR-Massenspektrometer bieten jeweils diesen Schmalband-Modus an, zusätzlich zu einem Breitband-Modus, der Massenspektren über einen weiten Massenbereich zu messen gestattet. Die Erfindung richtet sich zunächst auf höchste Auflösungsvermögen in diesem Schmalband-Modus, zugleich wird aber auch ein besseres Auflösungsvermögen im Breitband-Modus erreicht.
Für die Optimierung ist es vorteilhaft, dass sich die Länge des Transienten bei einer geringen Änderung der Potentiale bereits stark ändert, dass also ein ausgeprägtes Optimum existiert. Weiterhin ist es vorteilhaft, dass sich die Länge des nutzbaren Teils der Transienten visuell, aber auch durch computergestützte Auswertung leicht bestimmen lässt. Mit einer computergestützten Auswertung lässt sich ein voll automatisches Optimierungsverfahren programmieren.
Die Optimierung auf einen langen Transienten ist wesentlich einfacher, als die direkte Optimierung auf höchste Auflösung, da letztere je nach Länge der Transienten jeweils andere Fourier-Transformationen für andere Datenmengen erfordert, die aber nur beschränkt zur Verfügung stehen. Eine Optimierung, die direkt auf ein höchstes gemessenes Auflösungsvermögen abzielt und durch diese gesteuert wird, ist wesentlich schwieriger, aber nicht unmöglich. So kann man beispielsweise stets eine Fourier-Transformation für eine große Datenbreite, beispielsweise für 512 Tausend Datenpunkte, verwenden, ohne Rücksicht auf die nutzbare Länge des Transienten.
Das während der Adjustierungsoptimierung angewandte Optimierungsverfahren zielt über möglichst lange Bildstrom-Transienten darauf ab, ein Trappingfeld zu erzeugen, das die Ionen in den einzelnen Ionenwolken auf ihrer Umlaufbahn möglichst lange stabil zusammenhält. Es wird also im Gegensatz zu den oben zitierten Arbeiten von Tolmachev et al. und von Brustkern et al. nicht angestrebt, ein ideal quadrupolares Trappingfeld zu erzeugen. Die Potentiale, die bei den beiden verschiedenen Optimierungszielen gewonnen werden, sind voneinander nur relativ geringfügig verschieden, der geringe Unterschied ist aber entscheidend für den Erfolg. Es wird also hier die Erkenntnis bestätigt, dass für das lange Zusammenhalten der Ionenwolken eine zwar geringfügig, aber doch signifikant andere Potentialverteilung in der ICR-Messzelle notwendig ist als eine ideal quadrupolare. Die Erfindung basiert auf dieser Erkenntnis.
Dass die Signale nach dieser Adjustierung trotz hoher Anzahlen von Ionen in der ICR-Messzelle bis zu hohen Ionenbefüllungen von etwa 100 000 Ionen praktisch keine Koaleszenz zeigen, war nicht vorauszusehen, ist daher überraschend und macht die Erfindung besonders wertvoll. Nur bei sehr genauer Vermessung der Frequenzabstände von Signalen zweier Ionensorten fast gleicher Masse kann man feststellen, dass sich die Frequenzen um einen sehr geringen Betrag einander angenähert haben. Diese Annäherung ist reproduzierbar und lässt sich für eine präzise Massenbestimmung durch entsprechende Korrekturen berücksichtigen.
Die Adjustierungsoptimierung erfordert eine Anzahl wiederholter Messungen der Bildstrom-Transienten unter ständig veränderten Werten der Potentiale. Für jede einzelne Messung ist die ICR-Messzelle stets neu mit Ionen zu befüllen. Es hat sich gezeigt, dass für eine rasche und eindeutige Optimierung die Anzahl der Ionen durch eine geeignete Steuerung möglichst immer gleich hoch zu halten ist. Mit dieser einmal festgelegten Anzahl von Ionen müssen dann auch die nachfolgenden Aufnahmen der Massenspektren vorgenommen werden, wenn optimal gute Massenauflösungen erreicht werden sollen. Für einen hohen dynamischen Messbereich innerhalb der Massenspektren ist es günstig, eine hohe Anzahl von Ionen in der ICR-Messzelle zu haben. Es ist also günstig, eine hohe Anzahl von Ionen auch schon bei der Adjustierungsoptimierung zu verwenden.
Mit der so adjustierten Messzelle werden dann in üblicher Weise die Aufnahmen der ICR-Massenspektren durchgeführt. Die Massenspektren zeigen auch bei anderen Mischungen von Ionen die gewünschte hohe Massenauflösung, zumindest dann, wenn die gesamte Länge des Transienten für die Fourier-Transformation verwendet wird. Aber auch dann, wenn diese langen Transienten nicht in ihrer ganzen Länge für die Fourier-Transformation genutzt werden, ist die erzielte Massenauflösung besser als eine entsprechende Auflösung von unkompensierten oder nicht optimal adjustierten ICR-Messzellen, die nur kürzere Transienten lieferten. Ist es notwendig, Serien von Massenspektren schnell aufeinanderfolgend aufzunehmen, wie beispielsweise bei Kopplungen mit hochauflösender Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), so brauchen die Transienten nur für jeweils kürzere Zeiten, beispielsweise für nur jeweils eine Sekunde, aufgenommen werden, wobei die Erfindung aber immer noch eine verbesserte Massenauflösung liefert. Für solche Transienten, die einen starken „Beat” zeigen (siehe unten) gibt es Beschränkungen zu kurzen Messzeiten für den Transienten hin.
Aufnahmen der ICR-Massenspektren können dann beliebig oft durchgeführt werden; eine erneute Adjustierung der Potentiale an den Kompensationselektroden ist nur erforderlich, wenn sich Verfahrensbedingungen erheblich ändern. Zu den Verfahrensbedingungen von Einfluss gehört beispielsweise die Anzahl der eingefüllten Ionen, die die Raumladung innerhalb der ICR-Messzelle bestimmt.
Die Erfindung stellt darüber hinaus auch ein Verfahren für die Optimierung der Konstruktion einer ICR-Messzelle mit Kompensationselektroden bereit, wobei auch hier das Konstruktionsziel ist, mit der ICR-Messzelle Massenspektren mit besonders hohen Auflösungsvermögen aufnehmen zu können. Dieses Verfahren besteht in einer Optimierung der Anzahl und der Längen der Segmente der ICR-Messzelle. Die Optimierung wird so durchgeführt, dass eine Reihe von ICR-Messzellen mit variierten Anzahlen und Langen von Kompensationselektroden hergestellt wird, dass für jede dieser ICR-Messzellen eine Adjustierung der Potentiale an den Kompensationselektroden durchgeführt und dann diejenige ICR-Messzelle ausgewählt wird, die insgesamt den längsten nutzbaren Transienten liefert.
Dieses sehr aufwändige Optimierungsverfahren lässt sich erheblich vereinfachen. So können durch Computer-Simulation zunächst die geometrischen Maße einer ICR-Messzelle mit ihren Kompensationselektroden gefunden werden, die eine möglichst weit ausgedehnte, ideal quadrupolare Trapping-Potentialverteilung ausbilden kann. Diese ICR-Messzelle wird gebaut und als Ausgangspunkt für die Adjustierung der Potentiale an den Kompensationselektroden für lange Transienten verwendet. Dieses Vorgehen geht davon aus, dass die geometrischen Formen der Messzelle für ideales Quadrupolfeld und für langes Zusammenhalten der Ionenwolken fast gleich sind. Es kann die so gefundene ICR-Messzelle aber auch als Ausgangsform für weitere geometrische Variationen dienen.
In unseren Experimenten wurde meist eine ICR-Messzelle verwendet, die der von Tolmachev et al. sehr ähnlich war. Sie hatte bei sechs Zentimeter Innendurchmesser vier Längselektroden mit sieben Segmenten in den Längen 6,0 cm, 1,2 cm, 1,2 cm, 3,0 cm, 1,2 cm, 1,2 cm und 6,0 cm. Eine solche Messzelle ist in wiedergegeben. Sie wurde aber mit Schirmelektroden an den Enden benutzt, wie in dargestellt. Die auf eine Trapping-Spannung von 1,0 V adjustierten Potentiale betrugen 1,0 V, 0.22 V, 0.12 V, 0,0 V, 0.12 V, 0.22 V und 1,0 V.
Alle Messungen wurden in einem Magnetfeld von nur sieben Tesla durchgeführt; in heute erhältlichen supraleitenden Magneten mit einer magnetischen Flussdichte von 11 und 15 Tesla würden entsprechend höhere Massenauflösungsvermögen erzielt werden können.
Es konnten für Substanzen eines Bereichs der Molekulargewichte von 500 u bis etwa 2000 u, die intensivste Ionen geeigneter Ladungsstufen im Bereich ladungsbezogener Massen m/z von etwa 500 u bis 800 u liefern, Transienten mit nutzbaren Längen von 10 bis 20 Sekunden und sogar weit mehr erzielt werden. Beispielsweise ergab sich in dem Magnetfeld von sieben Tesla für Einzelspektren von Reserpin (M = 608,7 u) ein Auflösungsvermögen von R = 6 000 000 ohne Signal-Koaleszenz, mit einem Transienten, der über 20 Sekunden fast gar nicht abfiel.
In sind Massenspektren von [Arg⁸]-Vasopressin (C₄₆H₆₇N₁₅O₁₂S₂) gezeigt. Im obersten Bildteil ist der Transient wiedergegeben, der hier über 18 Sekunden gemessen werden konnte. Darunter ( ) ist ein Ausschnitt eines Massenspektrums wiedergegeben, das über einen Massenbereich von zehn atomaren Masseneinheiten aufgenommen wurde und die doppelt geladenen Ionen von [Arg⁸]-Vasopressin zeigt, zusammen mit einigen Verunreinigungen der Substanz. Das Massenspektrum zeigt neben dem Signal der doppelt geladenen, monoisotopischen Ionen der Masse m/z = 542,72620 u auch den ersten (m/z = 543,22788 u) und zweiten ¹³C-Satelliten (m/z = 543,72956 u). Die Massenauflösung beträgt R = 2 000 000, ermöglicht durch die Adjustierung der ICR-Messzelle nach dieser Erfindung. Unter „monoisotopischen Ionen” werden in der Massenspektrometrie diejenigen Ionen verstanden, die nur aus den Hauptisotopen der Elemente zusammengesetzt sind, also nur aus ¹H, ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, ³¹P, ³²S oder ³⁵Cl.
Darunter ist in die Feinstruktur des zweiten ¹³C-Satelliten gezeigt, als Vergrößerung aus dem Massenspektrum in Bildteil . Die Feinstruktur beruht darin, dass hier nicht nur das Signal der Ionen vorhanden ist, die statt zweier ¹²C-Atome zwei Atome ¹³C enthalten, sondern auch Signale der Ionen mit ¹⁸O statt ¹⁶O, ³⁴S statt ³²S, ¹³C¹⁵N statt ¹²C¹⁴N, ²D statt ¹H₂, usw. Im untersten Bildteil ist die theoretisch aus der bekannten Isotopenzusammensetzung berechnete Feinstruktur zum Vergleich dargestellt. Man erkennt die gute Übereinstimmung. Für unbekannte Substanzen können aus der Messung einer solchen Feinstruktur leicht die beteiligten Elemente bestimmt werden, die mit anderen Mitteln nur schwer zu bestimmen sind.
Es sei hier angemerkt, dass es für den Fachmann sehr verwunderlich ist, dass in Arbeit von Brustkern et al. nicht die Feinstruktur der Satellitensignale des [Arg⁸]-Vasopressin gezeigt wurde. Für dieses Signal von [Arg⁸]-Vasopressin wurde eine Massenauflösung von R = 17 000 000 angegeben. Eine so hoch massenaufgelöste Feinstruktur wäre in der Fachwelt eine Sensation. Das deutet daraufhin, dass für dieses Signal eine Signal-Koaleszenz vorlag, die keine Feinstruktur erkennen ließ.
In den bis ist das gleiche Schema für die Substanz P (C₆₃H₁₀₀N₁₈O₁₃S) gezeigt. stellt die Feinstruktur des zweiten ¹³C-Satelliten für die doppelt geladenen Ionen von Substanz P dar, die mit einer Massenauflösung von R = 2 500 000 erhalten wurde, im Vergleich zu der theoretisch berechneten Feinstruktur in .
Für Substanzen mit sehr viel höherer Masse in der Größenordnung einiger Zehntausend atomarer Masseneinheiten ist es üblich, nach einer Breitband-Aufnahme eines Übersichtsspektrums eine weitere Aufnahme eines Schmalband-Massenspektrums anzuschließen, das bei höchster Auflösung nur die Ionen eines Ladungszustands zeigt. Ein Breitband-Massenspektrum von BSA ist in gezeigt.
Die Ionen jeweils eines Ladungszustands bilden eine Isotopengruppe mit oft weit mehr als hundert Isotopensatelliten. Da die Ionen dieser Isotopengruppe sich jeweils um eine Masseneinheit unterscheiden (genauer um jeweils die Massendifferenz zwischen ¹²C und ¹³C), hat man es mit einem sehr regelmäßig strukturiertem Gemisch von Ionen zu tun, die in einer Schmalband-Messung einen Transienten ganz besonderer Art bildet. Der Transient besteht, wie in zu sehen, aus einer Folge von einzelnen „Beats”. Die Bildung dieser Beats beeinträchtigt das Auflösungsvermögen des daraus gewonnenen Massenspektrums. Die Beats verlangen einen besonders hohen dynamischen Messbereich der Elektronik, insbesondere der Analog-zu-Digital-Wandler. Trotzdem konnte mit dieser Erfindung in einer adjustierten Messzelle, wie , und zeigen, ein Massenspektrum der Isotopensignale der 49fach geladenen Ionen von BSA (bovine serum albumin; Molekülmasse M = 66 432,455 58 u) mit einer Massenauflösung von R = 800 000 gemessen werden, wobei aber 200 Einzelspektren addiert werden mussten.
Eine erfolgreiche Addition von 200 Einzelspektren verlangt eine außergewöhnlich hohe Konstanz der Elektronik, die hier aber gegeben war.
Die Beats entstehen durch das Interferenzverhalten der Ionen bei ihren Umläufen. Die Ionen werden bei der Anregung auf eine Zyklotronbahn gehoben, bei der sich alle Ionenwolken zunächst sehr dicht beieinander befinden und ein hohes Bildstromsignal, den Beat, ergeben. Dann laufen die Ionenwolken, die sich ja jeweils um einen winzigen relativen Massenbetrag und somit um einen winzigen Betrag ihrer Geschwindigkeit unterscheiden, langsam auseinander und verteilen sich fast gleichmäßig über die gesamte Zyklotronbahn. Bei gleichmäßiger Verteilung löschen sich aber die Bildstromsignale gegenseitig fast aus. Bei BSA kommen aber alle Ionen nach 66 389 Umläufen der monoisotopischen Ionen wieder zusammen, wobei der erste Satellit einen Umlauf weniger durchlaufen hat, der zweite Satellit zwei Umläufe weniger, der dritte Satellit drei Umläufe weniger, usw. So entsteht der zweite Beat; nach weiteren 66 390 Umläufen ein dritter Beat, usw.
Ohne die Adjustierung nach dieser Erfindung können für die Isotopengruppen solcher Substanzen meist nur Transienten mit ein oder zwei Beats gemessen werden. Die Messung von 18 Beats ist außergewöhnlich gut und bisher noch nie gelungen.
Aus Massenspektren der Art nach und kann bestimmt werden, ob es sich um eine einzige Substanz hohen Molekulargewichts oder um eine Mischung handelt. Solche Substanzen hohen Molekulargewichts sind häufig nicht rein, sondern enthalten neben der Grundsubstanz auch oxidierte oder sonst derivatisierte Moleküle, oder sie sind verbunden mit assoziierten Molekülen kleineren Molekulargewichts. Aus diesen Massenspektren können Analysen dieser Art vorgenommen werden. Daher ist ihre erfolgreiche Messung nicht nur von akademischem Interesse.
Transienten mit Beats können übrigens nicht nach Belieben unter proportional verringerter Massenauflösung gekürzt verwendet werden. Jeder Beat, der nicht mehr für die Fourier-Transformation zur Verfügung steht, verringert die Massenauflösung sprunghaft.
Der einschlägige Fachmann wird in Kenntnis dieser Erfindung weitere vorteilhafte Analysenverfahren unter Verwendung entsprechender ICR-Messzellen mit Kompensationselektroden entwickeln können. Auch die Entwicklung weiterer Arten von ICR-Messzellen ist möglich. So können beispielsweise die Kompensationselektroden auch als ringförmige Teile der Planaren Abschirmelektroden ausgeführt werden. Die Potentiale auch an diesen Kompensationselektroden können durch das erfindungsgemäße Adjustierverfahren optimal für höchste Massenauflösungen eingestellt werden.

Claims

Verfahren zur Einstellung der Potentiale an den Kompensationselektroden einer ICR-Messzelle für die Aufnahme von ICR-Massenspektren höchster Auflösung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Serie von Messungen unter ständig veränderten Werten der Potentiale an den Kompensationselektroden der ICR-Messzelle durchgeführt wird, wobei für jede einzelne Messung die ICR-Messzelle stets neu mit Ionen befüllt wird, und wobei eine jede Messung darin besteht, das zugehörige Bildstromsignal, d. h. die zugehörige Folge von Bildstrom-Messwerten, als Funktion der Zeit, den sogenannten Bildstrom-Transienten der Messung, zu messen, dass die nutzbare Länge eines jeden Transienten bestimmt wird, wobei die nutzbare Länge eines Transienten als die Zeitdauer definiert ist, ab der das Bildstromsignal keine Wechselstromanteile mehr enthält, d. h. der Bildstrom-Transient nur noch Rauschen zeigt, und dass diejenigen Potentiale an den Kompensationselektroden der ICR-Messzelle eingestellt werden, bei denen das entsprechende Bildstromsignal, also der Transient, im Vergleich zu den anderen Bildstromsignalen der Serie die längste nutzbare Länge aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nutzbaren Langen der Transienten durch ein Computerprogramm ermittelt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einstellung computergesteuert automatisch abläuft.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die ICR-Messzelle mindestens vier Reihen von Längselektroden aufweist, die in jeweils mindestens fünf Segmente aufgeteilt sind, wobei die Potentiale an den die Kompensationselektroden ausbildenden Elektroden der Segmente zwischen dem zentralen Segment und den endständigen Segmenten eingestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Messzelle bei der Messung der Serie der Bildstromsignale durch eine Steuerung der Befüllung jeweils mit der gleichen Anzahl von Ionen befüllt wird.
Verfahren zur Aufnahme von ICR-Massenspektren in einer ICR-Messzelle mit Kompensationselektroden, dadurch gekennzeichnet, dass die Potentiale an den Kompensationselektroden durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ermittelt und für die Aufnahme der ICR-Massenspektren verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die ICR-Messzelle für die Aufnahme der ICR-Massenspektren mit der gleichen Anzahl von Ionen befüllt wird, die auch beim Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Potentiale an den Kompensationselektroden durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erneut ermittelt werden, falls sich Verfahrensparameter für die Aufnahme der ICR-Massenspektren ändern, wobei dann im Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 die geänderten Verfahrensparameter verwendet werden.
Verfahren zur Auswahl einer Elektrodenkonfiguration einer ICR-Messzelle, dadurch gekennzeichnet, – dass mehrere ICR-Messzellen, die unterschiedlich viele und unterschiedlich lange Kompensationselektroden aufweisen, konstruiert werden, – dass für jede der ICR-Messzellen eine Serie von Bildstromsignalen bei unterschiedlichen Potentialen an den Kompensationselektroden gemessen wird und die nutzbare Länge jedes Bildstromsignals der Serie bestimmt wird, und – dass diejenige ICR-Messzelle ausgewählt wird, mit der das Bildstromsignal mit der längsten nutzbaren Länge gemessen wird.