DE102019114771B4

DE102019114771B4 - Vorläuferionen-auswahl für eine datenabhängige tandem-massenspektrometrie

Info

Publication number: DE102019114771B4
Application number: DE102019114771.9A
Authority: DE
Inventors: Jens Decker
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2039-06-04
Also published as: US10937639B2; GB2575168A; GB201906845D0; CN110554084B; CN110554084A; US20190371585A1; GB2575168B; DE102019114771A1

Abstract

Ein Verfahren zur Aufnahme von Fragmentmassenspektren von Substanzen aus komplexen Substanzmischungen durch ein massenspektrometrisches System, das eine lonenquelle, einen lonenmobilitätsseparator, einen Massenfilter, eine Fragmentierungszelle und einen Massenanalysator umfasst, welches die Schritte eines ersten Messzykluses umfasst:(a) Zeitliche Trennung einer ersten Gruppe von Ionen gemäß ihrer Mobilität mithilfe des Mobilitätseparators und nachfolgend eine weitere Trennung der Ionen gemäß ihrer Masse mithilfe des Massenanalysators und Messung der Signale der getrennten Ionen;(b) Erstellung einer Peakliste aus den Signalen, wobei jedem Peak der Peakliste eine Mobilitätsscanzeit, eine Masse und eine Intensität zugeordnet werden;(c) Zuordnung von Gewichtungen zu den Peaks, wobei einem Peak eine höhere Gewichtung zugeordnet wird, wenn sich in der Nähe des Peaks andere Peaks befinden, und insbesondere, wenn sich in der Nähe dieses Peaks andere Peaks mit einer hohen Intensität befinden;(d) Auswahl der Peaks, die (i) Gewichtungen oberhalb einer vorbestimmten Schwelle besitzen und/oder die höchsten gewichteten Intensitäten innerhalb einer bestimmten Umgebung aufweisen und (ii) deren Mobilitätsscanzeiten durch eine minimale Zeitdauer voneinander getrennt sind; und weiterhin umfassend die Schritte eines zweiten Messzykluses:(e) Zeitliche Trennung einer zweiten Gruppe von Ionen gemäß ihrer Mobilität mithilfe des Mobilitätsseparators und anschließende Filterung der Ionensorten gemäß ihrer Masse mithilfe des Massenfilters, wobei die Mobilitätsscanzeiten und die Massen der gefilterten Ionensorten denen der ausgewählten Peaks entsprechen;(f) Fragmentierung der gefilterten Ionensorten in der Fragmentierungszelle; und(g) Aufnahme von Fragmentmassenspektren der gefilterten Ionensorten.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren für eine datenabhängige Tandem-Massenspektrometrie, insbesondere zur Vorläuferionen-Auswahl als Teil der Aufnahme von Fragmentmassenspektren für komplexe Substanzgemische, wie beispielsweise Verdaupeptide in einem Bottom-up-Proteomik-Verfahrensablauf.
Stand der Technik
Bottom-up-Proteomik ist ein Verfahren zur Identifizierung von Proteinen und Charakterisierung ihrer Aminosäuresequenzen und post-translationalen Modifikationen durch proteolytischen Verdau der Proteine, die vor der Analyse durch Massenspektrometrie, insbesondere durch eine Tandem-Massenspektrometrie, aus einer biologischen Probe extrahiert wurden. Es gibt ein wachsendes Interesse an der Identifizierung möglichst vieler Peptide und Proteine. Es wurde gezeigt, dass hybride massenspektrometrische Systeme, die Massenspektrometrie mit lonenmobilitätsspektrometrie koppeln, Messungen verbessern, um dieses Ziel zu erreichen.
Als ein Beispiel für die Durchführung eines Bottom-up-Proteomik-Verfahrensablaufs kann ein massenspektrometrisches System verwendet werden, das einen vorgeschalteten Substanzseparator, z. B. einen Flüssigkeitschromatographen (LC), einen Mobilitätsseparator, einen Massenfilter (üblicherweise einen HF-Quadrupolmassenfilter), eine Fragmentierungszelle und einen nachgeschalteten Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem loneneinschuss kombiniert. Eine Ionenfalle kann verwendet werden, um Ionen vor dem lonenmobilitätsseparator zu sammeln, und ein Driftrohrlonenmobilitätsseparator, um die Ionen gemäß ihrer Mobilität zeitlich zu trennen.
In einem ersten Messzyklus kann ein Mobilitäts-Massen-Diagramm unter Einsatz des Mobilitätsseparators und des Flugzeitanalysators ohne eine Massenfilterung und lonenfragmentierung gemessen werden. In einem zweiten Messzyklus werden wieder die Ionen vom lonensammler gemäß ihrer Mobilität zeitlich getrennt. Der Massenfilter wird so eingestellt, dass er vorgegebene Ionensorten von Interesse (Vorläuferionen) während der spezifischen Driftzeit der Ionensorten auswählt, die dann in der Fragmentierungszelle fragmentiert werden, und das gewünschte Fragmentionenspektrum wird durch den Flugzeitmassenanalysator aufgenommen. Das US-Patent Nr. US 6,960,761 B2 („INSTRUMENT FOR SEPARATING IONS IN TIME AS FUNCTIONS OF PRESELECTED ION MOBILITY AND ION MASS“) offenbart diese datenabhängige Aufnahme von Fragmentmassenspektren mithilfe eines hybriden Systems mit einem Mobilitätsseparator vom Drifttyp und einem Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem loneneinschuss.
Die Offenlegungsschrift US 2015/0041636 A1 offenbart ebenfalls ein Verfahren zur Analyse von Ionen, das die Durchführung eines anfänglichen mehrdimensionalen Vermessungs-Scans umfasst, der die Trennung von Vorläuferionen gemäß einer ersten physikalisch-chemischen Eigenschaft (z.B. lonenmobilität) und dann die Trennung der Vorläuferionen gemäß einer zweiten physikalisch-chemischen Eigenschaft (z.B. Masse-Ladungs-Verhältnis) umfasst. Aus dem anfänglichen mehrdimensionalen Vermessungs-Scan wird dann eine Vielzahl von interessierenden Vorläuferionen bestimmt. Sobald die interessierenden Vorläuferionen bestimmt wurden, werden die mehreren interessierenden Vorläuferionen während eines einzigen Trennungszyklus nacheinander auf der Grundlage der ersten und zweiten physikalisch-chemischen Eigenschaften ausgewählt. Die interessierenden Vorläuferionen können dann fragmentiert werden und die entsprechenden Fragment-Ionen können dann einer Massenanalyse unterzogen werden. Die Kombination aus einem Mobilitätsseparator, einem Massenfilters und eines Flugzeitanalysator ist aus weiteren Offenlegungsschriften wie z.B. DE 10361023 A1 und DE 102017111067 A1 bekannt.
Der kürzlich eingeführte Parallel-Accumulation SErial-Fragmentation (PASEF)-Aufnahmemodus nutzt ein hybrides massenspektrometrisches System mit einem Fallen-Ionenmobilitätsseparator und einem Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem loneneinschuss (TIMS-OTOF) und trennt Ionen zeitlich gemäß ihrer Mobilität und eluiert Ionenpakete von dem TIMS-Gerät (Meier et al., J. Proteome Res., 2015, 14 (12), Seite 5378-5387). Vorläuferionen werden entweder in der Massen- oder in der Mobilitätsdimension nachgewiesen. Der Quadrupol isoliert verschiedene Vorläuferionensorten während der wenigen Millisekunden, in denen sie tatsächlich vom TIMS-Gerät eluieren, und schaltet dann sofort zum nächsten Vorläuferion um, was zu einer verbesserten Geschwindigkeit und Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Tandem-MS-Scanmodi führt.
Angesichts der obigen Ausführungen besteht nach wie vor ein Bedarf an einem schnellen und zuverlässigen Verfahren, um relevante und nichtredundante Vorläuferionen für eine Tandem-MS-Analyse aus kombinierten Mobilitäts-Massenspektren auszuwählen, insbesondere dann, wenn die kombinierten Spektren Signale einer Vielzahl von unterschiedlichen Ionensorten unter den Zeitbeschränkungen, die die chromatographische Retentionslänge vorgibt, umfassen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Aufnahme von Fragmentmassenspektren von Substanzen aus komplexen Substanzmischungen durch ein massenspektrometrisches System bereit, das eine lonenquelle, einen Mobilitätsseparator, einen Massenfilter, eine Fragmentierungszelle und einen Massenanalysator beinhaltet, und das die Schritte eines ersten und eines zweiten Messzykluses umfasst.
Der erste Messzyklus umfasst die Schritte: (a) zeitliche Trennung einer ersten Gruppe von Ionen gemäß ihrer Mobilität mithilfe des Mobilitätsseparators und nachfolgend eine weitere Trennung der Ionen gemäß ihrer Masse mithilfe des Massenanalysators und Messung der Signale der getrennten Ionen; (b) Erstellung einer Peakliste aus den Signalen, wobei jedem Peak der Peakliste eine Mobilitätsscanzeit, eine Masse und eine Intensität zugeordnet werden; (c) Zuordnung von Gewichtungen zu den Peaks, wobei einem Peak eine höhere Gewichtung zugeordnet wird, wenn sich in der Nähe dieses Peaks andere Peaks befinden, und insbesondere, wenn sich in der Nähe dieses Peaks andere Peaks mit einer hohen Intensität befinden; und (d) Auswahl der Peaks, die (i) Gewichtungen oberhalb einer vorbestimmten Schwelle besitzen und/oder die höchsten gewichteten Intensitäten innerhalb einer bestimmten Umgebung aufweisen und (ii) deren Mobilitätsscanzeiten durch eine minimale Zeitdauer voneinander getrennt sind.
Der zweite Messzyklus umfasst die Schritte: (e) zeitliche Trennung einer zweiten Gruppe von Ionen gemäß ihrer Mobilität mithilfe des Mobilitätsseparators und anschließende Filterung der Ionensorten gemäß ihrer Masse mithilfe des Massenfilters, wobei die Mobilitätsscanzeiten und die Massen der gefilterten Ionensorten denen der ausgewählten Peaks entsprechen; (f) Fragmentierung der gefilterten Ionensorten in der Fragmentierungszelle; und (g) Aufnahme von Fragmentmassenspektren der gefilterten Ionensorten.
Die gemessenen Signale werden gewöhnlich durch mehrere Datenpunkte dargestellt, sodass die Erstellung der Peakliste die Menge der jeder Ionensorte zugeordneten Datenpunkte verringert. Das gemessene Mobilitäts-Massen-Diagramm des ersten Messzykluses umfasst eine Vielzahl von Ionensorten und somit eine Vielzahl von Peaks. Die Peaks werden daher zusätzlich im Mobilitäts-Massen-Raum gebündelt, optional werden Peaks von vorherigen Messzyklen miteinbezogen.
Diese Bündelung (Clustering) basiert auf der Zuordnung von Gewichtungen zu den Peaks. Je mehr andere Peaks sich in der Nähe des zu gewichtenden Peaks befinden, desto höher ist die berechnete Gewichtung dieses Peaks. Insbesondere ist die berechnete Gewichtung umso höher, je mehr andere Peaks mit hoher Intensität sich in der Nähe des zu gewichtenden Peaks befinden. Die Bezeichnung „in der Nähe“ bedeutet in diesem Zusammenhang ein Abstandsmaß d(p1,p2) im Mobilitäts-Massen-Raum. Die einem einzelnen Peak zugeordnete Gewichtung kann die Summe der Abstandsmaße zu allen anderen Peaks der Peakliste oder einer ausgewählten Anzahl von Peaks sein, die zusätzlich mit der Peakintensität gewichtet werden kann.
Die minimale Zeitdauer in Schritt (d) kann im Wesentlichen die Zeitdauer einer einzelnen Ionensorte nach der Trennung im Mobilitätsseparator sein. Die ausgewählten Peaks können in eine Liste eingetragen werden, die für den dynamischen Ausschluss derjenigen Peaks verwendet wird, die bereits als Vorläuferionen ausgewählt wurden.
Das Verfahren kann weiterhin beinhalten, dass Peaks und bevorzugt ausgewählte Peaks (Cluster) bestimmt werden, die einem Isotopenmuster einer Substanz entsprechen, dass sie in eine Isotopenkette gruppiert werden und dass in Schritt (d) nur ein einzelner Peak jeder Isotopenkette ausgewählt wird. Der einzelne Peak der Isotopenkette entspricht bevorzugt der monoisotopischen Masse der Substanz. Bevorzugt wird in Schritt (d) kein Peak einer Isotopenkette ausgewählt, wenn das Intensitätsmuster der Isotopenkette um einen vorbestimmten Umfang von dem Referenzintensitätsmuster abweicht.
Die einem einzelnen Peak zugeordnete Gewichtung ist bevorzugt die Summe der Abstandsmaße zu allen anderen Peaks der Peakliste oder einer ausgewählten Anzahl ausgewählter Peaks, die zusätzlich mit der Intensität dieser Peaks gewichtet werden kann. Das Abstandsmaß zwischen zwei Peaks p1 und p2 kann beispielsweise definiert sein durch: $d (p 1, p 2) \sim exp (- Δ m^{2} / σ m^{2} - Δ K^{2} / σ K^{2})$
wobei Δm = m1-m2 der Massenunterschied zwischen den beiden Peaks p1 und p2 ist und ΔK=K1-K2 der Mobilitätsunterschied zwischen den beiden Peaks p1 und p2 ist. Das Verfahren kann weiterhin beinhalten, dass nur eine begrenzte Anzahl an Peaks aus der Peakliste zur Berechnung der Gewichtungen für diese Peaks oder für alle Peaks verwendet wird.
Die Substanzen des Substanzgemisches können durch eine Flüssigkeitschromatographie oder durch Elektrophorese getrennt werden, bevor sie an die lonenquelle weitergeleitet werden. Der Mobilitätsseparator kann entweder ein Mobilitätsseparator vom Drifttyp, ein Wanderwellenseparator oder ein Speicherionenmobilitätsseparator (Trapping Ion Mobility Separator) sein. Der Massenanalysator ist entweder ein Flugzeitmassenanalysator, ein Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem loneneinschuss, eine HF-Ionenfalle, eine Gleichspannungsionenfalle (wie beispielsweise eine Orbitrap- oder eine Cassini-Falle) oder eine lonenzyklotronresonanzfalle.
Figurenliste
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf folgende Abbildungen verwiesen. Die Elemente in den Abbildungen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu dargestellt, sondern sollen in erster Linie die Prinzipien der Erfindung (größtenteils schematisch) veranschaulichen.

zeigt ein massenspektrometrisches System, wie es aus der Offenlegungsschrift US 2016/0231275 A1 (US-Patentanmeldung Nr. 14/614,456 ; TRAPPING ION MOBILITY SPECTROMETER WITH PARALLEL ACCUMULATION) bekannt ist, die hierin als Verweis aufgenommen ist.
zeigt ein Flussdiagramm eines multizyklischen Verfahrens zur Messung von Fragmentmassenspektren, wie es aus der Offenlegungsschrift US 2017/0122906 A1 (US-Patentanmeldung Nr. 14/931,163 ; ACQUISITION OF FRAGMENT ION MASS SPECTRA OF IONS SEPARATED BY THEIR MOBILITY) bekannt ist, die hierin als Verweis aufgenommen ist.
zeigt ein Flussdiagramm der Verfahrensschritte für die Vorläuferionen-Auswahl als Teil einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
zeigt ausgewählte Peaks in einem Ausschnitt eines Mobilitäts-Massen-Diagramms. zeigt Peaks und beschriftete Cluster in einem Ausschnitt eines Mobilitäts-Massen-Diagramms, wobei die Cluster zu Isotopenketten gruppiert sind.
und stellen Resultate eines Bottom-up-Identifizierungslaufs mithilfe einer herkömmlichen Vorläuferionen-Auswahl dar, verglichen mit der Vorläufer-Auswahl gemäß der vorliegenden Erfindung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Während die Erfindung mit Bezug auf eine Anzahl unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung gezeigt und beschrieben wurde, werden Fachleute auf dem Gebiet anerkennen, dass verschiedene Änderungen bezüglich der Form und Einzelheiten daran vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der in den beigefügten Ansprüchen definierten Erfindung abzuweichen.
zeigt ein hybrides massenspektrometrisches System, wie es aus der Offenlegungsschrift US 2016/0231275 A1 (US-Patentanmeldung Nr. 14/614,456 ; TRAPPING ION MOBILITY SPECTROMETER WITH PARALLEL ACCUMULATION) bekannt ist, die hierin als Verweis aufgenommen ist. Das System kann mit Verfahren gemäß dieser Erfindung eingesetzt werden.
Das Instrument umfasst einen vorgeschalteten Substanzseparator, z. B. einen Flüssigkeitschromatographen (LC), der Substanzen einer komplexen Mischung zeitlich trennt und sie einer lonenquelle bereitstellt (z. B. einer ESI-Quelle). Das System umfasst weiterhin einen Fallen-Ionenmobilitätsseparator (TIMS) mit einer vorgeschalteten Sammeleinheit, einen Massenfilter (z. B. einen QuadrupolMassenfilter), eine lonenfragmentierungszelle und einen Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem loneneinschuss (OTOF-Massenanalysator).
Der Fallen-Ionenmobilitätsseparator (TIMS) trennt Ionen, die von einer lonenquelle bereitgestellt werden, zeitlich gemäß ihrer Mobilität und ist mit dem nachgeschalteten OTOF-Massenanalysator verbunden. Die gemäß ihrer Mobilität getrennten Ionen werden in dem OTOF-Massenanalysator gemäß ihrer Masse weiter zeitlich getrennt, was zu einem kombinierten Mobilitäts-Massen-Diagramm (MS-Rahmen) führt, falls der Massenfilter und die Fragmentierungszelle nicht in Betrieb sind.
In Betrieb ist der Massenfilter so eingestellt, dass er Ionen einer vorbestimmten Masse als Vorläuferionen auswählt, die in der nachfolgenden Fragmentierungszelle fragmentiert werden. Der OTOF-Massenanalysator wird dann verwendet, um ein Fragmentmassenspektrum aufzunehmen.
zeigt ein Flussdiagramm eines multizyklischen Verfahrens zur Messung von Fragmentmassenspektren, wie es aus der Offenlegungsschrift US 2017/0122906 A 1(US-Patentanmeldung Nr. 14/931,163 ; ACQUISITION OF FRAGMENT ION MASS SPECTRA OF IONS SEPARATED BY THEIR MOBILITY) bekannt ist, die hierin als Verweis aufgenommen ist. Die zitierte Anmeldung offenbart die Verwendung des massenspektrometrischen Systems der zur Messung eines Mobilitäts-Massen-Diagramms und der Fragmentmassenspektren.
In einem ersten Messzyklus einer neuen Schleife wird ein Mobilitäts-Massen-Diagramm für eine erste Gruppe von Ionen aus der Sammeleinheit des Fallen-Ionenmobilitätsseparators (TIMS) gemessen. Ionensorten werden aus dem Mobilitäts-Massen-Diagramm ausgewählt, z. B. in der Reihenfolge ihrer Intensität, von der höchsten Intensität zur niedrigeren Intensität. In einem zweiten Messzyklus mit denselben Bedingungen wie für den ersten Messzyklus wird eine zweite Gruppe von Ionen von der Sammeleinheit des TIMS wieder gemäß ihrer Mobilität zeitlich getrennt, aber die Ionen von Interesse werden nunmehr nacheinander durch den Massenfilter ausgewählt, in der Fragmentierungszelle fragmentiert und die Fragmentionenmassenspektren werden durch den Flugzeitmassenanalysator aufgenommen. Wenn kein neues Mobilitäts-Massen-Diagramm benötigt wird, werden weitere Ionensorten aus demselben Mobilitäts-Massen-Diagramm ausgewählt und in einem weiteren Messzyklus werden die entsprechenden Fragmentmassenspektren aufgenommen. Anderenfalls wird ein neues Mobilitäts-Massen-Diagramm gemessen und somit eine neue Schleife begonnen.
zeigt ein Flussdiagramm der Verfahrensschritte für die Vorläuferionen-Auswahl als Teil einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
In einem ersten Schritt werden Ionen gemäß ihrer Mobilität und Masse getrennt und die Signale der getrennten Ionen werden mithilfe des massenspektrometrischen Systems aus gemessen. Die Ionen einer einzelnen Ionensorte, die beim Detektor des OTOF-Massenanalysators ankommen, erzeugen einen lonenstrompuls, der in einem Analog-Digital-Wandler (A/D) (Digitalisierer) digitalisiert wird. Das gemessene Signal der einzelnen Ionensorte umfasst mehrere Datenpunkte, wobei jedem einzelnen Datenpunkt eine Mobilitätsscanzeit, eine Masse und eine Intensität zugeordnet sind.
In einem zweiten Schritt wird eine Peakliste aus den gemessenen Signalen erzeugt, in der jede einzelne Ionensorte durch einen einzelnen Peak wiedergegeben wird, dem eine Mobilitätsscanzeit, eine Masse und eine Intensität zugeordnet sind. Die Peakauswahl kann zusammen mit der A/D-Wandlung in einer elektronischen Schaltung durchgeführt werden, z. B. einem Field-Programmable-Gate-Array (FPGA), das sich in der Nähe des A/D-Wandlers befindet oder in den A/D-Wandler integriert ist. Der Schritt der Erstellung einer Peakliste verringert die Datenmenge, die von dem A/D-Wandler weg übermittelt werden muss.
Die Peaks werden in einem dritten Schritt im Mobilitäts-Massen-Raum durch schnelle, kleine, dichtebasierte Algorithmen gebündelt, die optional Peaks von vorherigen Messzyklen miteinbeziehen. Diese Bündelung (Clustering) basiert auf der Zuordnung von Gewichtungen zu den Peaks . Je mehr andere Peaks sich in der Nähe des zu gewichtenden Peaks befinden, desto höher ist die berechnete Gewichtung dieses Peaks. Insbesondere ist die berechnete Gewichtung umso höher, je mehr andere Peaks mit hoher Intensität sich in der Nähe des zu gewichtenden Peaks befinden. Die Bezeichnung „in der Nähe“ bedeutet in diesem Zusammenhang ein Abstandsmaß d(p1,p2) im Mobilitäts-Massen-Raum, beispielsweise: $d (p 1, p 2) \sim exp (- Δ m^{2} / σ m^{2} - Δ K^{2} / σ K^{2})$
wobei Δm = m1-m2 der Massenunterschied zwischen den Peaks p1 und p2 ist und ΔK=K1-K2 der Mobilitätsunterschied zwischen den Peaks p1 und p2 ist. Die einem einzelnen Peak zugeordnete Gewichtung kann die Summe der Abstandsmaße zu allen anderen Peaks der Peakliste oder einer ausgewählten Anzahl ausgewählter Peaks sein, wobei die Abstandsmaße zusätzlich mit der Peakintensität gewichtet werden können.
Die Peaks, die Gewichtungen oberhalb einer vorbestimmten Schwelle haben und/oder die die höchsten gewichteten Intensitäten innerhalb einer bestimmten Umgebung aufweisen, werden als Cluster bestimmt.
In einem vierten Schritt werden die Cluster in Bezug auf Ladungszustände und Isotopen-Einhüllende untersucht, um andere Cluster zu bestimmen, die einem Isotopenmuster einer Substanz entsprechen, und zu Isotopenketten gruppiert. Ein Cluster jeder Isotopenkette wird ausgewählt, um Vorläuferionenkandidaten zu erhalten.
In einem fünften Schritt können einige Vorläuferionenkandidaten dynamisch ausgeschlossen werden, abhängig von der Vorgeschichte der Vorläuferionen, die bereits in vorhergehenden Messzyklen gemessen wurden.
In einem sechsten Schritt werden Cluster von verschiedenen Isotopenketten für die Aufnahme von Fragmentmassenspektren eines nachfolgenden Messzykluses so ausgewählt, dass ihre zugeordneten Mobilitätsscanzeiten durch eine minimale Zeitdauer voneinander getrennt sind.
Auf der Basis der Liste von ausgewählten Clustern können optimierte Messaufgaben erzeugt werden, insbesondere für PASEF-Läufe (Parallel Accumulation Serial Fragmentation). Ein typischer PASEF-Ablauf umfasst die Aufnahme von mehr als 100 Fragmentmassenspektren pro Sekunde.
zeigt ausgewählte Peaks in einem Ausschnitt eines Mobilitäts-Massen-Diagramms. zeigt Peaks und beschriftete Cluster (ausgewählte Peaks mit hohen Gewichtungen) in einem Ausschnitt eines Mobilitäts-Massen-Diagramms, wobei die Cluster in Isotopenketten gruppiert sind.
Beispiel
Ein tryptischer Verdau einer menschlichen Krebszelllinie (200 ng HeLa) wird durch eine Nano-LC-Säule in einem 90-minütigen Gradientenlauf getrennt und auf einem Instrument wie dem in gezeigten analysiert, das mit einer modifizierten Aufnahmesoftware ausgestattet ist. Die Qualität der aufgenommenen Fragmentmassenspektren wird mithilfe von Mascot- und PEAKS-Suchmaschinen ausgewertet. Die Treffer im Peptidspektrum werden auf eine gewünschte Falscherkennungsrate von 1 % normiert.
zeigt Ergebnisse der Peptididentifizierung (Mascot, Durchschnitt von Dreifachmessungen) unter Verwendung einer herkömmlichen Vorläuferionen-Auswahl verglichen mit der Vorläuferionen-Auswahl gemäß der vorliegenden Erfindung. Der herkömmliche (Standard-)Vorläuferionen-Auswahlalgorithmus wählt Signale hoher Intensität im Massenspektrum aus, die aus einer Integration des vollständigen Mobilitäts-Massen-Diagramms oder von Teilen davon entlang der Mobilitätsachse stammen.
Die Anzahl der eindeutigen Peptide (unterschiedliche Ladungszustände derselben Sequenz als Peptid gezählt) und auch die Anzahl der eindeutigen Sequenzen werden durch die erfindungsgemäße Vorläuferionen-Auswahl um - 15 % erhöht. Aufgrund des genaueren Vorläuferionennachweises und des dynamischen Ausschlusses werden unerwünschte Wiederholungsmessungen signifikant verringert. Die Anzahl der Treffer im Peptidspektrum ist daher durch die Vorläuferionen-Auswahl, die auf dem Clustering im Mobilitäts-Massen-Raum basiert, verringert.
zeigt Venn-Diagramme von eindeutigen Sequenzen, die durch Dreifachmessungen des herkömmlichen und des Clustering-Ansatzes erzielt wurden (oben), sowie einen Vergleich zwischen beiden Algorithmen (unten).
Die Vorläuferionen-Auswahl gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt eine verbesserte Ausbeute an eindeutigen Peptidsequenzen.

Claims

Ein Verfahren zur Aufnahme von Fragmentmassenspektren von Substanzen aus komplexen Substanzmischungen durch ein massenspektrometrisches System, das eine lonenquelle, einen lonenmobilitätsseparator, einen Massenfilter, eine Fragmentierungszelle und einen Massenanalysator umfasst, welches die Schritte eines ersten Messzykluses umfasst: (a) Zeitliche Trennung einer ersten Gruppe von Ionen gemäß ihrer Mobilität mithilfe des Mobilitätseparators und nachfolgend eine weitere Trennung der Ionen gemäß ihrer Masse mithilfe des Massenanalysators und Messung der Signale der getrennten Ionen; (b) Erstellung einer Peakliste aus den Signalen, wobei jedem Peak der Peakliste eine Mobilitätsscanzeit, eine Masse und eine Intensität zugeordnet werden; (c) Zuordnung von Gewichtungen zu den Peaks, wobei einem Peak eine höhere Gewichtung zugeordnet wird, wenn sich in der Nähe des Peaks andere Peaks befinden, und insbesondere, wenn sich in der Nähe dieses Peaks andere Peaks mit einer hohen Intensität befinden; (d) Auswahl der Peaks, die (i) Gewichtungen oberhalb einer vorbestimmten Schwelle besitzen und/oder die höchsten gewichteten Intensitäten innerhalb einer bestimmten Umgebung aufweisen und (ii) deren Mobilitätsscanzeiten durch eine minimale Zeitdauer voneinander getrennt sind; und weiterhin umfassend die Schritte eines zweiten Messzykluses: (e) Zeitliche Trennung einer zweiten Gruppe von Ionen gemäß ihrer Mobilität mithilfe des Mobilitätsseparators und anschließende Filterung der Ionensorten gemäß ihrer Masse mithilfe des Massenfilters, wobei die Mobilitätsscanzeiten und die Massen der gefilterten Ionensorten denen der ausgewählten Peaks entsprechen; (f) Fragmentierung der gefilterten Ionensorten in der Fragmentierungszelle; und (g) Aufnahme von Fragmentmassenspektren der gefilterten Ionensorten.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin umfasst, dass Peaks bestimmt werden, die einem Isotopenmuster einer Substanz entsprechen, dass sie in eine Isotopenkette gruppiert werden und dass in Schritt (d) nur ein einzelner Peak jeder Isotopenkette ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin umfasst, dass ausgewählte Peaks bestimmt werden, die einem Isotopenmuster einer Substanz entsprechen, dass sie in eine Isotopenkette gruppiert werden und dass in Schritt (d) nur ein einzelner Peak jeder Isotopenkette ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der einzelne Peak der Isotopenkette der monoisotopischen Masse der Substanz entspricht.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass kein Peak einer Isotopenkette in Schritt (d) ausgewählt wird, wenn das Intensitätsmuster der Isotopenkette um einen vorbestimmten Umfang von dem Referenzintensitätsmuster abweicht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einem einzelnen Peak zugeordnete Gewichtung die Summe der Abstandsmaße zu allen anderen Peaks der Peakliste oder einer ausgewählten Anzahl ausgewählter Peaks ist, die zusätzlich mit der Intensität dieser Peaks gewichtet werden kann.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Abstandsmaß d zwischen zwei Peaks p1 und p2 d(p1, p2)~ exp(-Δm²/σm² - ΔK²/σK²) ist, wobei Δm = m1-m2 der Massenunterschied zwischen den Peaks p1 und p2 ist und ΔK=K1-K2 der Mobilitätsunterschied zwischen den Peaks p1 und p2 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen des Substanzgemischs durch eine Flüssigkeitschromatographie oder durch Elektrophorese getrennt werden, bevor sie an die lonenquelle weitergeleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mobilitätsseparator entweder ein Mobilitätsseparator vom Drifttyp, ein Wanderwellenseparator oder ein Speicheronenmobilitätsseparator ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Massenanalysator entweder ein Flugzeitmassenanalysator, ein Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem loneneinschuss, eine HF-Ionenfalle, eine Gleichspannungsionenfalle oder eine lonenzyklotronresonanzfalle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die minimale Zeitdauer die Zeitdauer einer einzelnen Mobilitätssorte nach der Trennung im Mobilitätsseparator ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine begrenzte Anzahl an Peaks aus der Peakliste zur Berechnung der Gewichtungen für diese Peaks oder für alle Peaks verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählten Peaks in eine Liste eingetragen werden, die für den dynamischen Ausschluss derjenigen Peaks verwendet wird, die bereits als Vorläuferionen ausgewählt wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) die Ionen in einem Flugzeitanalysator gemäß ihrer Masse zeitlich getrennt werden und Ionen jeder einzelnen Ionensorte, die eine gegebene Mobilität und Masse besitzen, einen gepulsten lonenstrom am Ionendetektor erzeugen, der in einem A/D-Wandler so digitalisiert wird, dass das gemessene Signal der einzelnen Ionensorte mehrere Datenpunkte enthält und jedem der Datenpunkte eine Mobilitätsscanzeit, eine Masse und eine Intensität zugeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Erstellung der Peakliste zusammen mit der Digitalisierung in einer elektronischen Schaltung durchgeführt wird, die sich in der Nähe des A/D-Wandlers befindet oder in den A/D-Wandler integriert ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (b) bis (c) in weniger als einer Sekunde ausgeführt werden, insbesondere in weniger als 300 ms, und noch spezifischer in weniger als 100 ms.