DE102018208553A1

DE102018208553A1 - Massen-Fehlerkorrektur aufgrund von thermischem Drift in einem Flugzeitmassenspektrometer

Info

Publication number: DE102018208553A1
Application number: DE102018208553.6A
Authority: DE
Inventors: Christian Albrecht HOCK; Hamish Stewart; Matthias Biel; Oliver Lange
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2018-12-06
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: GB2563148A; GB201808458D0; DE102018208553B4; US10593525B2; GB2563077A; CN108987238A; US20180350575A1; CN108987238B; GB201708855D0; GB2563148B

Abstract

Ein Verfahren zum Kalibrieren eines TOF-MS-Massenspektrums zur Berücksichtigung von Temperaturveränderungen wird offenbart. Ionen werden in ein Fourier-Transform-Massenspektrometer eingeführt, und ihre Masse-/Ladungsverhältnisse werden bestimmt. Ionen, einschließlich kalibrierende Ionen, werden ebenso in ein Flugzeit-Massenspektrometer eingeführt, und die Masse-/Ladungsverhältnisse zumindest der kalibrierenden Ionen werden ebenso bestimmt. Spezifische Peaks, die für die kalibrierenden Ionen repräsentativ sind, werden selektiert und zwischen den TOF MS- und den FTMS-Spektren abgeglichen. Die relative Position der abgeglichenen Peaks in jedem Spektrum wird dann verwendet, um einen Temperaturkorrekturfaktor für die TOF-MS-Daten zu bestimmen, basierend auf der relativen Unabhängigkeit des FTMS-Spektrums von Temperaturen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, die die Kalibrierungsfunktion anpasst, die die Flugzeiten mit dem Masse-/ Ladungsverhältnis (m/z) in einem Flugzeitmassenspektrometer (TOF-MS) verbindet. Die Kalibrierungsfunktion verändert sich im Laufe der Zeit, um einen thermischen Drift auszugleichen.
Hintergrund der Erfindung
Bei der Flugzeit- (TOF-) Massenspektrometrie werden die Flugzeiten von Ionen gemessen, um die Masse-/Ladungsverhältnisse (m/z) zu bestimmen. Wie es bekannt ist, ist die Flugzeit eines Ions proportional zu der Quadratwurzel seines Masse-/Ladungsverhältnisses. Die aufgezeichnete Erfassungszeit ist durch eine Kalibrierungsfunktion mit dem m/z-Verhältnis verbunden. Die Umgebungstemperatur eines Massenspektrometers kann während der Verwendung um mehr als 10 Grad Celsius schwanken, was zu einer thermischen Ausdehnung der mechanischen Teile und einem durch die Thermik induzierten Drift der elektronischen Komponenten (Spannungszufuhr) führt. Temperaturschwankungen des TOF-MS führen zu Veränderungen der gemessenen Flugzeit von Ionen einer bestimmten Spezies. Für eine gegebene Kalibrierungsfunktion führt dies zu einer negativen Auswirkung auf die Genauigkeit des berechneten Masse-/Ladungsverhältnisses dieser Ionenspezies, wenn sich die Bedingungen verändern, nachdem die ursprüngliche Kalibrierungsfunktion bestimmt wurde.
Es wurden in der Vergangenheit verschiedene Ansätze untersucht, um diese Auswirkungen zu minimieren. In US-B-6,049,077 wird ein Gemisch aus geeigneten Materialien verwendet, um zu versuchen, eine konstante Flugbahn aufrechtzuerhalten, wenn sich die Temperatur verändert. Eine unterschiedliche Lösung wurde in US-B-6,465,777 vorgeschlagen, wobei die Temperatur kritischer mechanischer und elektronischer Komponenten durch die Verwendung eines Luftstrommechanismus konstant gehalten wird.
In US-B-6,700,118 werden mehrere Sensoren eingesetzt, um Messungen zu Temperatur und Belastung von dem Instrument zu erhalten. Die gemessenen Parameter werden dann zusammen mit einem mathematischen Modell verwendet, um angepasste Massenspektren bereitzustellen.
Noch ein weiterer Ansatz wird in US-A-2008/0087810 vorgestellt. In diesem Fall wird die Länge der Flugbahn bei einer Referenztemperatur der Anordnung bestimmt. Vorbestimmte Korrekturfaktoren für die thermische Ausdehnung der Flugbahnanordnung werden dann zur Korrektur eingesetzt. Die Korrektur wird ausgeführt, indem eine weitere Komponente des TOF MS auf geeignete Weise gesteuert wird, wie zum Beispiel die Spannung, die an ein Stromversorgungssystem angelegt wird, oder ein Signal zur Steuerung von Taktfrequenzen.
In US-B-6,797,947 wird eine interne Kalibrierungsquelle verwendet, um eine hohe Massengenauigkeit zu erreichen. Sogenannte Sperrmassenionen mit genau bekannten Massen werden vor der Massenanalyse mit Analytionen vermischt. Das aufgezeichnete Massenspektrum enthält Peaks bekannter Sperrmassenionen und Analytionen, deren m/z-Verhältnis mit hoher Genauigkeit bestimmt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schlägt eine alternative Herangehensweise an die Probleme bezüglich der Instabilität von Kalibrierungsfunktionen durch Temperaturschwankungen in einem TOF-MS vor.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Kalibrieren eines TOF-MS-Massenspektrums bereitgestellt, um Temperaturveränderungen zu berücksichtigen, wie in Anspruch 1 beschrieben. Es kann ebenso Software bereitgestellt werden, um dieses Verfahren auszuführen.
Die Erfindung erstreckt sich ebenso auf ein System zum Kalibrieren eines TOF-MS-Massenspektrums, um Temperaturveränderungen zu berücksichtigen, wie in Anspruch 14 beschrieben.
Die Massengenauigkeit der hoch auflösenden Ausgabe eines TOF-MS ist (wie in der Einführung oben besprochen) anfällig für Ungenauigkeiten/Drift als Folge einer Abhängigkeit der Flugzeit von Ionen von der Temperatur. Veränderungen der Temperatur führen zu Verschiebungen der mechanischen und/oder elektronischen Komponenten. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass im Gegensatz dazu die Massengenauigkeit von Fourier-Transform-Massenspektrometern (FTMS) wie einem Fourier-TransformationIonenzyklotronresonanzspektrometer (FT-ICR MS) oder einem Orbitalfallen-Massenspektrometer wie dem Orbitrap ® von Thermo Fisher Scientific, Inc. im Wesentlichen von Veränderungen der Temperatur (und somit von thermisch induzierten Verschiebungen der Positionierung dessen Komponenten) unberührt bleibt.
Ein Massenspektrometersystem nach der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl TOF- als auch FTMS-Massenspektrometer, die in der Lage sind, denselben Analyten entweder parallel oder nacheinander zu analysieren. In einer Ausführungsform der Erfindung zum Kalibrieren des TOF MS wird mindestens ein FTMS-Datenset eingeholt, das repräsentativ für die Masse(n) der kalibrierenden Ionenspezies ist, sowie mindestens ein Set von TOF-MS-Daten, das repräsentativ für die Masse(n) dieser kalibrierenden Ionenspezies ist. Die kalibrierenden Ionenspezies, die nachfolgend kurz kalibrierende Ionen genannt werden, sind eine Untergruppe der Ionen, die dem Massenanalysator des TOF- und FTMS-Massenspektrometers zugeführt werden. Die Ionen, die dem Massenanalysator beider Massenspektrometer zugeführt werden, können dieselben oder unterschiedliche sein. Es ist nur wichtig, dass die kalibrierenden Ionen dem Massenanalysator beider Massenspektrometer zugeführt werden. Das FTMS-Datenset umfasst Daten in dem Frequenzbereich, der einen oder mehrere Peaks aufweist, die unterschiedliche Ionenspezies darstellen, von denen einer (oder mehrere) als kalibrierender Peak ausgewählt wird. Das FTMS-Datenset kann die Rohfrequenz- vs. Häufigkeitsdaten sein, oder es kann ein Massenspektrum sein, das heißt, wobei die Frequenz in m/z umgewandelt wurde. Auf ähnliche Weise sind die TOF MS-Daten bevorzugt die reinen Flugzeitdaten, können jedoch ein Massenspektrum von m/z vs. Häufigkeit sein.
Ein geeigneter Peak oder mehrere Peaks werden in dem Datenset ausgewählt, das durch eines des FTMS und des TOF MS generiert wurde. Ein Peak oder mehrere Peaks des Analyten (das heißt, Peaks, die Ionen in einer Probe darstellen, die eingeführt wurde) oder Hintergrundpeaks (das heißt, Peaks, die beispielsweise repräsentativ für Trägergasionen sind, die verwendet werden, um die Probenionen in das Massenspektrometer einzuführen) können verwendet werden. Eine bevorzugte Anzahl von Ionenspezies (Peaks), die für die Kalibrierung des TOF verwendet werden können, können zwischen 1 und 10 liegen. Die Auswahl des Peaks basiert auf der Leichtigkeit, diese mit TOF MS- und FTMS-Daten abzugleichen, wie es nachfolgend weiter besprochen wird. Bevorzugt liegt der Peak oder die Peaks, die ausgewählt wird/werden, in den FTMS-Daten.
Die m/z-Verhältnisse von Ionenspezies, die für Kalibrierungen verwendet werden, werden nachfolgend als die kalibrierenden Massen bezeichnet, und die entsprechenden Peaks in den FTMS- und TOF-Daten, die Masse-/Ladungsverhältnisse darstellen, werden als kalibrierende Peaks bezeichnet.
Sobald der (die) Peak(s) ausgewählt wurde(n), bevorzugt in den FTMS-Daten, wird (werden) der (die) entsprechende(n) Peak(s) in dem anderen Gerät (bevorzugt in den TOF MS-Daten) gesucht, um darin (einen) passende(n) Peak(s) zu finden. Insbesondere werden in bevorzugten Ausführungsformen die TOF MS-Daten durchsucht oder gescannt, um den (die) Peak(s) zu lokalisieren, der (die) durch dieselbe kalibrierende Ionenspezies generiert wird (werden), wie die, die als kalibrierende Ionenspezies in den FTMS-Daten ausgewählt wurde. Veränderungen der Temperatur verursachen, dass sich die Flugzeit der Ionen in dem TOF verschiebt, was wiederum eine Verschiebung der Position des (der) Peak(s) in den TOF MS-Daten in Bezug auf die Position(en) der entsprechenden Peaks in den FTMS-Daten verursacht (die im Wesentlichen temperaturunabhängig sind). Wenn sich die Position des (der) TOF MS-Datenpeak(s) verschiebt, kann ein Temperaturkorrekturfaktor basierend auf dieser Verschiebung bestimmt werden.
Die kalibrierenden Massen m[i] werden bevorzugt durch die Positionen der kalibrierenden FTMS-Peaks bestimmt, unter Verwendung von einer (oder mehrerer) einer Vielzahl an Techniken, die auf dem Fachgebiet der FTMS bekannt sind. Beispielsweise können die gemessenen Flugzeiten t_m in dem TOF-Massenspektrometer als Schwerpunkte der entsprechenden kalibrierenden TOF-Peaks identifiziert werden. Die gemessene Flugzeit t_m der Ionen in einem TOF MS steht, wie es bekannt ist, in Verbindung mit der Quadratwurzel des Massen-/Ladungsverhältnisses m/z der Ionen über eine Proportionalitätskonstante, A. Zeitverzögerungen der Elektronika zur Datenerfassung führen ebenso eine Zeitverschiebung, to, ein. Als Formel, m/z=A(t_m-t₀)². Bevorzugt wird der Temperaturkorrekturfaktor, der in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung generiert wird, verwendet, um die Konstante A und/oder t_m anzupassen, so dass die korrekte Masse berechnet wird, wenn sich die tatsächliche Flugzeit von Ionen einer spezifischen Spezies mit der Temperatur verändert. Jedoch sollte es klar sein, dass es nicht wesentlich ist, den Temperaturkorrekturfaktor als Korrektur der Flugzeit auf die Masse-/Ladungs-Kalibrierfunktion anzuwenden. Es ist ebenso möglich, eine Kalibrierungsfunktion zu bestimmen (beispielsweise beim Hochfahren des Massenspektrometers) und die Kalibrierungsfunktion auch bei Temperaturdrifts mit fixen Parametern zu bestücken. In diesem Fall kann der Temperaturkorrekturfaktor auf die unkorrigierten Massendaten angewendet werden, um die Temperaturverschiebung auszugleichen.
Durch die hohe Durchsatzgeschwindigkeit des TOF (hunderte Massenspektren pro Sekunde) muss nur ein sehr kleiner Anteil der gesamten Analysezeit des TOF dafür aufgewendet werden, geeignete Daten zu erhalten, um den Temperaturkorrekturfaktor zu erhalten.
Es werden verschiedene Arbeitsabläufe angedacht. In einer optionalen Ausführungsform wird ein MS1-(Vorläufer-) Scan einer Probe, die aus einem flüssigen Chromatographen eluiert wurde, beispielsweise in dem FTMS ausgeführt, um alle Peaks in dieser Probe zu erfassen. Vorläufer-Probenionen aus demselben eluierten chromatographischen Peak werden dann in das TOF eingespritzt, wo sie erfasst werden. Die sich daraus ergebenden FTMS-Daten, die repräsentativ für die Masse(n) der kalibrierenden Ionenspezies sind, können verwendet werden, um die TOF MS-Daten zu kalibrieren. In diesem Szenario werden Vorläufer-Probenionen in das TOF eingespritzt, unmittelbar nachdem Vorläufer-Probenionen in das FTMS eingespritzt werden.
In einer alternativen Anordnung wird eine MS1-Analyse durch das FTMS ausgeführt. Jedoch werden die Proben-Vorläuferionen (aus demselben chromatographischen Peak) dann unter Verwendung einer Kollisionszelle oder Ähnlichem fragmentiert, und die sich daraus ergebenden Ionenfragmente werden in das TOF eingespritzt. Daten, die repräsentativ für die Fragmentmassen sind (MS2-Daten), können dann erhalten werden. Die Kalibrierung des TOF MS kann erreicht werden, indem Peaks in den MS2-Daten identifiziert werden, die durch das TOF MS generiert werden, die aus unfragmentierten Vorläuferionen entstehen. Diese können mit der Position der entsprechenden Peaks in dem Vorläufer-MS1-Scan, der durch das FTMS erhalten wurde, verglichen werden.
In einem Fall, in dem keine geeigneten Vorläufer-Peaks in dem MS2-Scan identifiziert werden können, der durch das TOF MS erhalten wurde, können Ionenfragmente, die durch die Kollisionszelle oder Ähnliches generiert wurden, zurück zu dem FTMS geschickt werden, um durch das FTMS MS2-Daten zu generieren, die repräsentativ für Fragmentmassen sind. Dann können geeignete Peaks in dem MS2-Scan, der durch das FTMS erhalten wurde, mit entsprechenden Peaks in den MS2-Daten kreuzkorreliert werden, die durch das TOF MS erhalten wurden.
Hierin werden die Begriffe „Auflösung“ und „Auflösungsvermögen“ verwendet. Die Auflösung ist die Differenz in dem Masse-/Ladungsverhältnis m/z der zwei Peaks Δm/z, zu dem die zwei Peaks in dem Massenspektrum getrennt werden können. Entsprechend ist das Auflösungsvermögen R des Massenanalysators für ein Peak definiert, der ein Masse-/Ladungsverhältnis m/z im folgenden Verhältnis aufweist: $R (m / z) = \frac{m / z}{Δ m / z}$
Zum Zweck der vorliegenden Erörterung nimmt das Auflösungsvermögen R an, dass zwei Peaks bei der halben maximalen Höhe eines Peaks (dem 50 %-Kriterium, wie es von strengeren Kriterien wie der Breite über die untersten 10 % jedes Peaks abgegrenzt wird) getrennt werden sollten. Dann ist die Auflösung Δm/z die FWHM (full width at half maximum, volle Breite bei halbem Maximum) des Peaks. Entsprechend wird das Auflösungsvermögen R des Massenanalysators dann gegeben durch: $R (m / z) = \frac{m / z}{F W H M}$
Allgemein ist es wünschenswert, dass das Auflösungsvermögen des TOF-Massenanalysators ausreichend ist, um sicherzustellen, dass die Peakverschiebung, die durch Temperaturschwankungen verursacht wird, geringer als die Breite des Peaks eines ausgewählten kalibrierenden Ionenpeaks ist. Für ein gegebenes TOF MS-Auflösungsvermögen kann dies als ein Auswahlkriterium für mögliche kalibrierende Peaks in dem FTMS-Massenspektrum manifestiert werden. Anders betrachtet kann das Auflösungsvermögen des TOF MS als nicht weniger als ein minimaler Grenzwert spezifiziert werden, wenn eine ausreichende Anzahl geeigneter kalibrierender Peaks identifiziert und erfolgreich verwendet werden soll, um eine Kalibrierfunktion zu generieren.
Bevorzugt können Ionen gefangen werden (z. B. in einer Fangvorrichtung wie einer linearen Ionenfalle) und über mehrere Zyklen gesammelt werden. Dieses Einfangen kann unmittelbar vor der (den) TOF MS- und/oder der (den) FTMS-Vorrichtung(en) erfolgen. Dies ermöglicht, dass zusätzliche Vorläuferionen und beispielsweise A+1- oder A+2- Isotope zu der Ionenspezies zugegeben werden können, die in jeden Analysator eingespritzt werden, um die Kalibrierung zu verbessern.
Während ein einzelnes Set aus FTMS-Daten, die für die Masse(n) der kalibrierenden Ionenspezies repräsentativ sind, verwendet werden kann, um die TOF MS-Daten zu kalibrieren, können stattdessen mehrere Zyklen verwendet werden, und eine statistische Analyse kann durchgeführt werden, um einen noch weiter verbesserten Temperaturkorrekturfaktor bereitzustellen.
Typischerweise ist das Auflösungsvermögen des FTMS höher als das Auflösungsvermögen des TOF MS. Es ist daher bevorzugt, dass ein Peak oder Peaks, der (die) in Betracht gezogen wird (werden), in den FTMS-Daten identifiziert und in den TOF MS-Daten abgeglichen wird (werden). Jedoch ist dies nicht von wesentlicher Bedeutung. Ein Peak oder Peaks, der (die) in Betracht gezogen wird (werden), kann (können) stattdessen in den TOF MS-Daten identifiziert und dann in den FTMS-Daten abgeglichen werden.
Verschiedene andere bevorzugte Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus den angefügten Ansprüchen und aus der folgenden spezifischen Beschreibung einiger bevorzugter Ausführungsformen ersichtlich.
Figurenliste
Die Erfindung kann auf vielfältige Weise praktisch umgesetzt werden, und einige Ausführungsformen werden nun lediglich beispielhaft und unter Bezugnahme auf die anliegenden Figuren beschrieben, in denen:

1 einen schematischen Aufbau eines Massenspektrometers zeigt, einschließlich eines Fourier-Transform-Massenanalysators und eines Flugzeitmassenanalysators, und eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt;
2 eine Reihe von Kalibrierungsfunktionen zur Temperaturkorrektur eines Massenspektrums zeigt, das durch den Flugzeitmassenanalysator aus 1 generiert wurde, bei einer Reihe unterschiedlicher Temperaturen;
3a einen Vergleich der Verschiebung der gemessenen Masse in dem TOF-Massenspektrum zeigt, vor und nachdem die Korrektur auf Temperaturschwankungen angewendet wurde;
3b einen Vergleich der Verschiebung der gemessenen Masse im Laufe der Zeit zeigt, jeweils für die FTMS- und TOF MS-Massenspektren; und
4 einen schematischen Aufbau eines Massenspektrometers zeigt, einschließlich eines Fourier-Transform-Massenanalysators und eines Flugzeitmassenanalysators, und eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Hierin kann der Begriff Masse verwendet werden, um das Masse-/Ladungsverhältnis m/z zu bezeichnen.
1 zeigt eine schematische Anordnung eines Massenspektrometers 10, das sich dazu eignet, Verfahren in Übereinstimmung mit Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durchzuführen. In 1 wird eine zu analysierende Probe (beispielsweise von einem Autosampler) einem Chromatographiegerät wie einer Flüssigkeitschromatographie- (LC-) Säule zugeführt (nicht in 1 gezeigt). Ein solches Beispiel einer LC-Säule ist die monolithische Säule von Thermo Fisher Scientific, Inc ProSwift , die eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) dadurch bietet, dass die Probe, die in einer mobilen Phase getragen wird, unter hohem Druck durch eine stationäre Phase aus unregelmäßig oder kugelförmigen geformten Partikeln gedrückt wird, welche die stationäre Phase darstellen. In der HPLC-Säule eluieren die Probenmoleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten je nach ihrem Interaktionsgrad mit der stationären Phase.
Ein Chromatograph kann durch das Messen einer Menge von Probenmolekülen im Laufe der Zeit, die aus der HPLC-Säule eluieren, unter Verwendung eines Erfassungsgeräts (beispielsweise eines Massenspektrometers) hergestellt werden. Probenmoleküle, die von der HPLC-Säule eluieren, werden als eine Messung des Peaks über der Basislinie auf dem Chromatograph erfasst. Wenn unterschiedliche Probenmoleküle unterschiedliche Elutionsgeschwindigkeiten aufweisen, kann eine Vielzahl von Peaks auf dem Chromatographen erfasst werden. Bevorzugt werden einzelne Peaks im Laufe der Zeit von anderen Peaks in dem Chromatographen getrennt, so dass unterschiedliche Probenmoleküle nicht störend aufeinander einwirken.
In einem Chromatographen entspricht ein Vorkommen eines chromatographischen Peaks einer Zeitdauer, über die Probenmoleküle am Erfassungsgerät vorhanden sind. Als solches entspricht eine Breite eines chromatographischen Peaks einem Zeitraum, über welchen die Probenmoleküle an einem Erfassungsgerät vorhanden sind. Bevorzugt weist der chromatographische Peak die Form einer Gauss-Kurve auf oder es kann angenommen werden, dass er ein Profil einer Gauss-Kurve aufweist. Entsprechend kann eine Breite eines chromatographischen Peaks basierend auf einer Reihe von Standardabweichungen bestimmt werden, die aus dem Peak berechnet werden. Beispielsweise kann ein Peak basierend auf 4 Standardabweichungen eines chromatographischen Peaks berechnet werden. Alternativ kann eine Peakbreite basierend auf der Breite bei der Hälfte der maximalen Höhe des Peaks berechnet werden. Andere Verfahren zum Bestimmen der Breite des Peaks, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können ebenso geeignet sein.
Die Probenmoleküle, die auf diese Art über Flüssigkeitschromatographie getrennt wurden, werden dann unter Verwendung einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI-Quelle) 20 ionisiert, die auf Atmosphärendruck ist.
Probenionen treten dann in eine Vakuumkammer des Massenspektrometers 10 ein und werden durch ein Kapillarrohr 25 in eine nur-HF-S-Linse 30 geleitet. Die Ionen werden durch die S-Linse 30 in einen Einspritz-Flatapole 40 fokussiert, der die Ionen in einen gebogenen Flatapole 50 mit einem Axialfeld einspritzt. Der gebogene Flatapole 50 leitet (geladene) Ionen entlang einer Kurvenbahn hindurch, während unerwünschte neutrale Moleküle wie zum Beispiel mitgetragene Lösungsmittelmoleküle nicht entlang der Kurvenbahn geleitet werden und verloren gehen.
Ein Ionentor (TK-Linse) 60 befindet sich an dem distalen Ende des gebogenen Flatapoles 50 und steuert den Übergang von Ionen von dem gebogenen Flatapole 50 in einen nachgelagerten Quadrupol-Massenfilter 70. Der Quadrupol-Massenfilter 70 ist typischerweise, jedoch nicht notwendigerweise, segmentiert und dient als Bandpassfilter, so dass zugelassen wird, dass eine selektierte Massenanzahl oder ein begrenzter Massenbereich übergehen kann, während Ionen mit anderen Masse-/Ladungsverhältnissen (m/z) ausgeschlossen werden. Der Massenfilter kann auch in einem nur-HF-Modus betrieben werden, in dem er nicht massenselektiv ist, d. h. er überträgt im Wesentlichen Ionen mit allen m/z. Beispielsweise kann der Quadrupol-Massenfilter 70 durch die Steuerung 130 gesteuert werden, um einen Bereich von Masse-/Ladungsverhältnissen zu selektieren, in dem die Vorläuferionen durchgelassen werden, die zur Masse zugelassen werden, während andere Ionen in dem Vorläuferionenstrom ausgefiltert werden.
Auch wenn in 1 ein Quadrupol-Massenfilter gezeigt wird, ist dem Fachmann klar, dass andere Arten von Massenselektionsvorrichtungen ebenso zum Auswählen von Vorläuferionen innerhalb eines fraglichen Massenbereichs geeignet sein können. Beispielsweise ein Ionenseparator wie in US-A-2015287585 beschrieben, eine Ionenfalle wie in WO-A-2013076307 beschrieben, ein Ionenmobilitätsseparator wie in US-A-2012256083 beschrieben, eine Ionentor-Massenselektionsvorrichtung wie in WO-A-2012175517 beschrieben, oder eine Falle für geladene Teilchen wie in US799223 beschrieben, auf deren Inhalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. Dem Fachmann ist klar, dass andere Verfahren zur Auswahl von Vorläuferionen nach der Ionenmobilität, der differenziellen Mobilität und/oder Quermodulation ebenso geeignet sein können.
Die Ionen durchqueren dann eine Quadrupol-Ausgangslinsen-/Spaltlinsenanordnung 80 und treten in einen ersten Transfer-Multipol 90 ein. Der erste Transfer-Multipol 90 leitet die massengefilterten Ionen von dem Quadrupol-Massenfilter 70 in eine kurvenförmige Falle (C-Falle) 100. Die C-Falle (erste Ionenfalle) 100 weist sich längs erstreckende, kurvenförmige Elektroden auf, an die HF-Spannungen angelegt werden, und Endkappen, an die DC-Spannung angelegt wird. Das Ergebnis ist ein Potentialtopf, der sich entlang der kurvenförmigen Längsachse der C-Falle 100 erstreckt. In einem ersten Betriebsmodus werden die DC-Spannungen der Endkappen auf der C-Falle so eingestellt, dass Ionen, die von dem ersten Transfer-Multipol 90 ankommen, in dem Potentialtopf der C-Falle 100 eingefangen werden, wo sie abgekühlt werden. Die Einspritzzeit (IT) der Ionen in die C-Falle bestimmt die Anzahl der Ionen (Ionenpopulation), die danach aus der C-Falle in den Massenanalysator ausgeworfen wird. Abgekühlte Ionen bleiben in einer Wolke am Boden des Potentialtopfs und werden dann orthogonal aus der C-Falle zu dem ersten Massenanalysator 110 ausgeworfen.
Wie in 1 gezeigt wird, ist der erste Massenanalysator ein Fourier-Transform-Massenanalysator (FTMS) 110, beispielsweise der Orbitrap® Orbitalfallen-Massenanalysator, der von Thermo Fisher Scientific, Inc. erhältlich ist und beispielsweise in WO-A-96/30930 beschrieben wird. Das FTMS 110 weist eine exzentrische Einspritzöffnung auf, und die Ionen werden in das FTMS 110 als kohärente Einheiten durch die exzentrische Einspritzöffnung eingespritzt. Die Ionen werden dann innerhalb des Orbitalfallen-Massenanalysators durch ein hyperlogarithmisches elektrisches Feld gefangen und werden einer Vorwärts- und Rückwärtsbewegung in einer Längsrichtung unterzogen, während sie die innere Elektrode umkreisen.
Die axiale (z) Komponente der Bewegung der Ioneneinheiten in dem Orbitalfallen-Massenanalysator ist (mehr oder weniger) als einfache harmonische Bewegung definiert, wobei die Winkelfrequenz in der z-Richtung in Verbindung mit der Quadratwurzel des Masse-/Ladungsverhältnisses einer gegebenen Ionenspezies steht. Somit trennen sich Ionen im Laufe der Zeit in Übereinstimmung mit ihren Masse-/Ladungsverhältnissen.
Ionen werden in dem FTMS durch Verwendung eines Bilddetektors (nicht gezeigt) erfasst, der eine „Transiente“ in dem Zeitbereich produziert, die Informationen zu allen Ionenspezies enthält, wenn sie den Bilddetektor durchlaufen. Die Transiente wird dann einer Fast Fourier-Transformation (FFT) unterzogen, was zu einer Reihe von Peaks im Frequenzbereich führt. Aus diesen Peaks kann ein Massenspektrum erstellt werden, das die Häufigkeit/Ionenintensität vs. m/z darstellt.
Auch wenn 1 ein FTMS 110 zeigt, in dem Ionen axial und radial durch ein elektrostatisches Feld gefangen werden, ist es klar, dass andere Formen von FTMS in Betracht gezogen werden, wie beispielsweise ein Fourier-Transformation-Ionen-Zyklotron-Resonanz- (FT-ICR) Massenanalysator, in dem Ionen axial durch ein elektrostatisches Feld gefangen werden, während das radiale und azimutale Einfangen durch das Anlegen eines Magnetfelds erreicht wird. Die primäre Anforderung an den FTMS 110 ist es, dass die Ausgabe (das heißt, die Position und Form von Peaks in einem Massenspektrum, das er generiert) relativ stabil in Bezug auf kurzfristige und langfristige Verschiebungen der Temperatur sein sollte.
In der oben beschriebenen Konfiguration werden die Probenionen (spezifischer ein Massenbereichssegment der Probenionen innerhalb eines fraglichen Massenbereichs, der durch den Quadropol-Massenfilter ausgewählt wurde) durch den Orbitalfallen-Massenanalysator ohne Fragmentierung analysiert. Das sich daraus ergebende Vorläufermassenspektrum wird als MS1 bezeichnet.
In einem zweiten Betriebsmodus der C-Falle 100 können Ionen, die die Quadrupol-Ausgangslinsen-/Spaltlinsenanordnung 80 und den ersten Transfer-Multipol 90 in die C-Falle 100 passieren, auch ihren Weg durch die C-Falle und in die Fragmentierungskammer 120 fortsetzen. Somit arbeitet die C-Falle im zweiten Betriebsmodus effektiv als Ionenleiter. Alternativ können abgekühlte Ionen in der C-Falle 100 aus der C-Falle in einer axialen Richtung in die Fragmentierungskammer 120 ausgeworfen werden. Die Fragmentierungskammer 120 ist in dem Massenspektrometer 10 aus 1 eine Higher Energy Collisional Dissociation- (HCD-) Vorrichtung, der ein Kollisionsgas zugeführt werden kann. Vorläuferionen, die in der Fragmentierungskammer 120 ankommen, werden so in einem Betriebsmodus der Fragmentierungskammer 120 mit hochenergetischen Kollisionsgasmolekülen bombardiert, was zu einer Fragmentierung der Vorläuferionen in Ionenfragmente führt. Im Wesentlichen können alle Vorläuferionen fragmentiert werden. Jedoch, wie es weiter unten detaillierter erklärt wird, wird in Übereinstimmung mit einigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Energie der Kollisionsgasmoleküle so eingestellt, dass mindestens einige der Vorläuferionen die Fragmentierungskammer 120 durchlaufen, ohne durch Kollision dissoziiert zu werden.
In einem alternativen Betriebsmodus der Fragmentierungskammer 120 werden die Vorläuferionen jedoch nicht einem Kollisionsgas ausgesetzt, oder die Energie des Kollisionsgases, das der Fragmentierungskammer zugeführt wird, ist nicht ausreichend, um die Vorläuferionen zu fragmentieren. Daher fungiert die Fragmentierungskammer 120 in diesem alternativen Betriebsmodus als Ionenleiter für die Vorläuferionen.
Auch wenn eine HCD-Fragmentierungskammer 120 in 1 gezeigt wird, können andere Fragmentierungsvorrichtungen stattdessen verwendet werden, es können Verfahren wie kollisionsinduzierte Dissoziation (CID), Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD), Elektronentransfer-Dissoziation (ETD), Fotodissoziation und so weiter eingesetzt werden.
Ionen (entweder teilweise fragmentiert oder unfragmentiert) können aus der Fragmentierungskammer 120 am gegenüberliegenden axialen Ende zu der C-Falle 100 ausgeworfen werden. Die ausgeworfenen Ionen treten in einen zweiten Transfer-Multipol 130 ein. Der zweite Transfer-Multipol 130 leitet die Ionen aus der Fragmentierungskammer 120 in eine Extraktionsfalle (zweite Ionenfalle) 140. Die Extraktionsfalle 140 ist eine spannungsgesteuerte Hochfrequenzfalle, die ein Puffergas enthält. Beispielsweise ist ein geeignetes Puffergas Argon bei einem Druck im Bereich von 5×10-4 mBar bis 1×10-2 mBar. Die Extraktionsfalle ist dazu fähig, schnell die angelegte HF-Spannung abzuschalten und DC-Spannung anzulegen, um die gefangenen Ionen zu extrahieren. Eine geeignete Flachplatten-Extraktionsfalle wird ferner in US9548195 (B2) beschrieben. Alternativ kann eine C-Falle auch für die Verwendung als zweite Ionenfalle geeignet sein.
Die Extraktionsfalle 140 wird bereitgestellt, um Ionen, die aus der Fragmentierungskammer 120 ausgeworfen werden, vor dem Einspritzen dieser Ionen in den Flugzeitmassenanalysator 150 anzusammeln. In 1 ist der gezeigte Flugzeitmassenanalysator 150 ein Multipler Reflexions-Flugzeitmassenanalysator (mr-TOF) 150.
Der mr-TOF 150 ist um zwei gegenüberliegende Ionenspiegel 160, 162 konstruiert, die sich längs in einer Driftrichtung erstrecken. Die Extraktionsfalle 140 spritzt Ionen in den ersten Spiegel 160 ein, und die Ionen oszillieren dann zwischen den zwei Spiegeln 160, 162. Der Auswurfwinkel von Ionen aus der Extraktionsfalle 140 und die zusätzlichen Deflektoren 170, 172 ermöglichen die Steuerung der Energie der Ionen in der Driftrichtung, so dass Ionen entlang der Länge der Spiegel 160, 162 hinabgeleitet werden, während sie oszillieren, so dass sie eine Zickzackbahn produzieren. Die Spiegel 160, 162 selbst sind in Bezug aufeinander geneigt, wodurch ein Potentialgefälle hergestellt wird, das die Driftgeschwindigkeit der Ionen abbremst und verursacht, dass sie in der Driftdimension zurückreflektiert und auf einen Detektor 180 fokussiert werden. Die Neigung der gegenüberliegenden Spiegel hätte normalerweise die negative Auswirkung, dass sie die Zeitdauer von Ionenoszillationen verändert, während diese in der Driftdimension reisen, was es unmöglich macht, einen guten Ionen-Zeitfokus zu erreichen. Dies wird durch eine Streifenelektrode 190 korrigiert, die das Flugpotential für einen Teil des Raums zwischen den Spiegeln verändert, wobei die Länge der gegenüberliegenden Spiegel 160, 162 nach unten variiert wird. Die Kombination der variierenden Breite der Streifenelektrode 190 und der Variation des Abstands zwischen den Spiegeln 160, 162 ermöglicht die Reflexion und die räumliche Fokussierung von Ionen auf den Detektor 180 sowie das Beibehalten eines guten Zeitfokusses. Ein für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignetes mr-TOF 150 wird ferner in US -B-9,136,101 beschrieben. Natürlich können andere mr-TOFs eingesetzt werden, wie diejenigen, die beschrieben werden in GB-A-2,080,021 an Wollnik, WO-A-2005/001878 an Verentchikov, US-A- 2011/0168880 an Ristroff, die spiralförmige TOF-Anordnung von US-B-7,504,620 an Jeol, US-B-8,637,815 an Makarov und Giannakopulos, und US-B-8,395,115, US-B-8,674,293, US-B-9,082,605, und US-B-9,324,553, alle an Makarov und Grinfield. Es ist somit so zu verstehen, dass die Beschreibung eines spezifischen mr-TOF-Massenspektrometers hierin lediglich dem Zwecke der Veranschaulichung dient und auf keine Weise einschränkend verstanden werden soll. Tatsächlich sind, auch wenn die Verwendung eines Multireflexions-Flugzeitmassenspektrometers bestimmte Vorteile bietet, die Konzepte der Erfindung, die beschrieben und beansprucht werden, ebenso auf jede Form eines Flugzeitmassenspektrometers anwendbar, und die Ansprüche sind entsprechend auszulegen.
Ionen, die an dem Detektor 180 des mr-TOF ankommen, werden verwendet, um ein Massenspektrum zu konstruieren, da, wie bekannt ist, die Flugzeit der Ionen durch das mr-TOF in einer Beziehung zu dem Masse-/Ladungsverhältnis m/z steht. Im zweiten Betriebsmodus der Fragmentierungskammer 120 sind die Ionen, die in das mr-TOF 150 eintreten, unfragmentiert, so dass das sich daraus ergebende Massenspektrum ein MS1-Massenspektrum ist. In dem ersten Betriebsmodus der Fragmentierungskammer 120 enthält das Massenspektrum jedoch Ionenfragmente und kann als MS2 bezeichnet werden.
Auch wenn das Vorhergehende die Verwendung einer Extraktionsfalle 140 beschreibt, um die Ansammlung von Ionen über mehrere Zyklen vor dem Einspritzen in den mr-TOF 150 zu ermöglichen, ist es klar, dass dies vorteilhaft, jedoch nicht wesentlich für die Umsetzung des Verfahrens in Übereinstimmung mit der Erfindung ist.
Das Massenspektrometer 10 wird allgemein durch eine Systemsteuerung 200 gesteuert. Die Systemsteuerung 200 ist, allgemein gesagt, konfiguriert, um die Daten, die durch das FTMS 100 und das mr-TOF 150 generiert werden, zu empfangen und zu verarbeiten, und um eine modifizierte Kalibrierungsfunktion für das mr-TOF zu generieren, basierend auf einem Vergleich zwischen den Daten des FTMS und des mr-TOF, wobei Veränderungen der Flugzeit von Ionen in dem TOF berücksichtigt werden, wenn sich die Temperatur verändert. Die bestimmte modifizierte Kalibierungsfunktion kann dann auf nacheinander erhaltene mr-TOF-Daten angewendet werden, um diese Daten auf Veränderungen der Temperatur in dem System und insbesondere in dem mr-TOF zu korrigieren. Die Systemsteuerung 200 kann in Software, Hardware oder in beidem umgesetzt werden. Des Weiteren können das FTMS 110 und das mr-TOF jeweils eigene assoziierte Prozessoren aufweisen, um die Rohdaten von dem Bilddetektor des FTMS 110 und des mr-TOF-Detektors 180 zu erfassen und jeweils FTMS- und mr-TOF-Massenspektren zu generieren. Alternativ kann ein einziger Prozessor verwendet werden, um die Fast-Fourier-Transformation der transienten Daten durchzuführen, die durch den Bilddetektor des FTMS 110 erhalten wurden, und die Daten zu Häufigkeit vs. Ankunftszeit von dem Detektor 180 ebenso in ein Massenspektrum umzuwandeln.
Die Systemsteuerung 200 kann physisch und/oder logisch von diesem oder diesen Prozessor(en) getrennt sein. In diesem Fall kann die Systemsteuerung nicht (im Gegensatz zu der in 1 gezeigten Anordnung) für das Massenspektrometer 10 lokal sein. Die von dem FTMS 110 und dem mr-TOF 150 erhaltenen Daten könnten beispielsweise lokal zu dem Massenspektrometer erhalten werden und dann drahtgebunden oder drahtlos der Systemsteuerung 200 übermittelt werden, die als Software gebildet sein kann, die auf einem lokalen oder entfernten Personal Computer (PC) arbeiten kann. Somit ist klar, dass, während die Systemsteuerung 200 einen logischen Teil des Massenspektrometers 10 bildet, diese hinsichtlich der definierten Funktion nicht unbedingt einen physischen Part davon bilden muss. Nichtsdestotrotz ist es in praktischer Hinsicht, und um die Geschwindigkeit der Kalibrierung und Neukalibrierung zu optimieren, bevorzugt, dass die Systemsteuerung 200 als ein Teil der Hardware oder Software des lokalen Betriebssystems des Massenspektrometers 10 gebildet ist.
Wie es im Hintergrundbereich zu sehen ist, sind Massenspektren, die durch das mr-TOF generiert wurden, insbesondere anfällig für Temperaturschwankungen, die in Bewegungen (Ausdehnung oder Zusammenziehen) mechanischer Komponenten und/oder Schwankungen elektrischer Komponenten resultieren. Die Ausgabe des FTMS 110 bleibt im Vergleich dazu relativ unberührt durch solche Temperaturschwankungen.
Somit verwendet die Systemsteuerung 200 Daten von dem FTMS als Basis zum Korrigieren von temperaturbasierten Verschiebungen der Position der Peaks in den mr-TOF-Daten. Eine Reihe unterschiedlicher Beispiele von Arten, wie dies erfolgen könnte, wird nun vorgestellt.
Verwendung nur der Vorläuferionen
Hier werden für eine erste Zeitdauer Vorläuferionen in die C-Falle 100 gesammelt und dann in das FTMS 110 eingespritzt, so dass ein MS1-Massenspektrum generiert wird. Sobald die Vorläuferionen von der C-Falle in das FTMS 110 ausgeworfen wurden, wird die C-Falle 110 für eine zweite Zeitdauer umgeschaltet, so dass sie zulässt, dass Vorläuferionen sie axial zu der Fragmentierungskammer 120 durchlaufen. Die Fragmentierungskammer 120 selbst wird während dieser zweiten Zeitdauer im Ionenleitermodus betrieben, so dass im Wesentlichen keine Fragmentierung der Vorläuferionen stattfindet. Die Vorläuferionen treten dann in das mr-TOF 150 ein, und ihre Flugzeiten werden auf bekannte Weise erfasst. Die Systemsteuerung 200 (oder der Prozessor, der mit dem mr-TOF wie oben beschrieben assoziiert ist) wird mit einer initialen Kalibrierungsfunktion programmiert, die die Flugzeit-Rohdaten, die durch das mr-TOF erfasst werden, in ein Massenspektrum umwandelt. Die initiale Kalibrierungsfunktion kann während dem ersten Hochfahren und der Kalibrierung des Massenspektrometers 10 oder auf andere Weise erhalten werden. Geeignete Techniken (jedoch natürlich nicht auf diese beschränkt) zum Umwandeln von Flugzeiten in m/z werden oben beschrieben.
Bevorzugt sind die erste und zweite Zeitdauer und die Umschaltdauer zwischen diesen beiden schnell genug, dass Vorläuferionen von demselben chromatographischen Peak gefangen und durch das FTMS 110 und das mr-TOF 150 analysiert werden.
Wenn ein MS1 von dem FTMS 110 und ein MS1 von dem mr-TOF 150 generiert wurden, sucht die Systemsteuerung nach charakteristischen Peaks in dem MS1 des FTMS 110. Charakteristische Peaks sollten selektiert werden, die deutlich in beiden Massenspektren auszumachen sind, das heißt, ein MS1 von dem FTMS 110 und ein MS1 von dem mr-TOF 150. Bevorzugt sind die charakteristischen Peaks in dem FTMS-Massenspektrum bei dem Auflösungsvermögen des FTMS 110 einzelne Peaks und keine Doppelpeaks (die interferierende Ionenspezies/Isotope etc. repräsentieren). Es ist insbesondere erwünscht, dass charakteristische Peaks in dem FTMS-Massenspektrum einzelne Peaks mit dem Auflösungsvermögen des FTMS 110 sind. Es ist ferner bevorzugt, dass ein charakteristischer Peak unter Verwendung des Kriteriums ausgewählt wird, dass keine anderen Peaks in dem Massenspektrum des FTMS 110 in einem Massenbereich beobachtet werden können, der in der Nähe des charakteristischen Peaks liegt. Bevorzugt wird der Massenbereich durch die Anforderung definiert, dass als Folge des selektierten Massenbereichs der charakteristische Peak garantiert ein einzelner Peak in dem Massenspektrum des mr-TOF ist (auch wenn es ein geringeres Auflösungsvermögen aufweist), der deutlich identifiziert werden kann. Ein einzelner charakteristischer Peak kann ausreichend sein, oder alternativ kann eine Vielzahl von Peaks verwendet werden. Diese Peaks können isoliert werden (das heißt, die charakteristischen Peaks können durch einen oder mehrere andere Peaks getrennt werden, die nicht zu Kalibrierungszwecken verwendet werden). Alternativ können Gruppen von Peaks in dem FTMS-MS1-Massenspektrum als charakteristische Peaks verwendet werden.
Diese Peaks werden daher als „kalibrierende Peaks“ bezeichnet. Ihr Masse-/Ladungsverhältnis ist aus dem Massenspektrum offensichtlich. Üblicherweise sind in der Folge Ionenspezies, die für den (die) kalibrierenden Peak(s) verantwortlich sind, identifizierbar. Jedoch ist dies nicht von wesentlicher Bedeutung: solange das Masse-/Ladungsverhältnis des selektierten kalibrierenden Peaks bekannt ist, ist es ausreichend, eine darauffolgende Kalibrierung des mr-TOF-Massenspektrums wie weiter unten beschrieben zuzulassen.
Der Begriff „kalibrierender Peak“ ist im allgemeinsten Sinn zu verstehen, um die Peaks in dem FTMS-Massenspektrum zu identifizieren, die die Systemsteuerung 200 zum Zweck der Kalibrierung verwenden wird. Probenionenspezies, die einen geeigneten Peak erzeugen (das Problem der Eignung wird weiter unten besprochen) können als kalibrierende(r) Peak oder Peaks verwendet werden. In anderen Ausführungsformen kann (können) der (die) gewählte(n) (selektierte(n)) Peak oder Peaks von Ionenspezies stammen, die gemeinsam mit den Probenionen vorhanden sind. Beispielsweise können Hintergrund-Ionenspezies, die vorhanden sind (beispielsweise Ionen, die von Lösungsmitteln stammen, die verwendet werden, um die Probe in das Massenspektrometer zu tragen), einen Peak oder Peaks generieren, der bzw. die sich zur Verwendung als kalibrierender Peak eignet bzw. eignen.
Somit ist klar, dass Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Massengenauigkeit des TOF MS-Massenspektrums zulassen, ohne dass „Sperrmassen“ mit genau bekanntem m/z direkt eingespritzt werden müssen, um das TOF MS direkt zu kalibrieren. Alles, was erforderlich ist, ist, dass ein Peak (oder Peaks) in einem ersten der FTMS/TOF MS-Massenspektren ausgewählt wird (werden), und der entsprechende Peak dann in dem anderen der FTMS/TOF MS-Massenspektren identifiziert wird. Es ist nicht erforderlich, tatsächlich die Ionenspezies zu identifizieren, die den Peak verursacht.
Verschiedene Kriterien können angewendet werden, um geeignete Peaks in dem FTMS-Massenspektrum zu identifizieren, wie eine oder mehrere des Signal-/Rauschverhältnisses, der Peakform und der Peakqualität. Siehe beispielsweise Cox et al, J Am Soc Mass Spectrom. 2009 Aug; 20(8):1477-85. Veröff.: 10.1016/j.jasms.2009.05.007. Epub 20. Mai 2009 „Computational principles of determining and improving mass precision and accuracy for proteome measurements in an Orbitrap“, und Gorshkov et al, J Am Soc Mass Spectrom. 2010 Nov;21(11):1846-51. Veröff.: 10.1016/j.jasms.2010.06.021. Epub 7 Juli 2010.
Nach der Identifizierung des oder der kalibrierenden Peaks in dem FTMS-Massenspektrum wird jeweils der Schwerpunkt und der assoziierte Qualitätsfaktor durch die Systemsteuerung 200 gespeichert. Als Teil dieses Schritts können Raumladungseffekte in dem FTMS berücksichtigt werden.
Als nächstes durchsucht die Systemsteuerung 200 das mr-TOF-Massenspektrum nach entsprechenden Peaks. Best Fit-Algorithmen können beispielsweise verwendet werden. Der Zweck des hierin beschriebenen Verfahrens ist es, das mr-TOF unter Verwendung des FTMS-Massenspektrums zu kalibrieren. Daher wird erwartet, dass es mindestens eine geringfügige Verschiebung in der gemessenen Position eines Peaks in dem mr-TOF-Massenspektrum in Bezug auf die gemessene Position desselben Peaks in dem FTMS-Massenspektrum gibt. Jedoch können der Durchsuchung des mr-TOF-Massenspektrums durch die Systemsteuerung weitere Beschränkungen auferlegt werden. Beispielsweise kann die Systemsteuerung 200 so konfiguriert sein, dass sie nur diejenigen Peaks in dem mr-TOF-Massenspektrum berücksichtigt, die innerhalb eines eingeschränkten Massenbereichs des potentiell entsprechenden Peaks in dem FTMS-Massenspektrum liegen. Des Weiteren kann die Menge der Verschiebung der Position des Massenpeaks (in absoluten Zahlen, d. h., amu) von dem m/z des kalibrierenden Peaks selbst abhängig sein, das bedeutet, Ionen mit einem ersten m/z können in Bezug auf das FTMS-Massenspektrum eine größere oder geringere Positionsverschiebung in dem mr-TOF-Massenspektrum erfahren als Ionen mit einem zweiten, unterschiedlichen m/z. Folglich kann es sein, dass die maximale Beschränkung der m/z-Verschiebung für entsprechende Peaks über die Massenspektren nicht konstant ist.
Sobald der Peak oder die Peaks in dem mr-TOF-Massenspektrum identifiziert wurde(n), bestimmt die Systemsteuerung eine modifizierte Kalibrierungsfunktion zum Umwandeln der Flugzeiten in m/z, basierend auf der Menge der Peakverschiebung zwischen den kalibrierenden Peaks des mr-TOF und FTMS, Insbesondere behandelt die Systemsteuerung 200 die Position des (der) FTMS-Peaks so, als wäre sie durch Temperaturveränderungen unberührt geblieben, und berechnet dann einen Korrekturfaktor, der auf die mr-TOF-Daten angewendet werden soll, um die Daten aufgrund von Veränderungen der Flugzeiten, die sich aus Temperaturdrifts ergeben, zu korrigieren. In der bevorzugten Ausführungsform wird der Korrekturfaktor als eine Anpassung der Parameter der Kalibrierungsfunktion manifestiert, die verwendet wird, um die Flugzeit-Rohdaten in ein Massenspektrum umzuwandeln.
Die gemessene Flugzeit t_m der Ionen in einem TOF MS steht, wie es bekannt ist, in Verbindung mit der Quadratwurzel des Massen-/Ladungsverhältnisses m/z der Ionen über eine Proportionalitätskonstante, A. Zeitverzögerungen der Elektronika zur Datenerfassung führen ebenso eine Zeitverschiebung, to, ein. Als Formel, m/z=A(t_m-t₀)². In einem einfachsten Beispiel kann die Systemsteuerung einen einzelnen kalibrierenden Peak (oder eine einzelne Gruppe aneinander angrenzender Peaks, wie oben besprochen) in dem FTMS und einen einzelnen entsprechenden Peak oder eine Peak-Gruppe in dem mr-TOF-Massenspektrum suchen. Sie kann dann aus der Verschiebung zwischen der Peakposition in dem mr-TOF und dem FTMS einen einzelnen konstanten Korrekturfaktor (im Wesentlichen ein skalarer Multiplikator) bestimmen, der dann verwendet wird, um die Proportionalitätskonstante A und/oder die Zeitverschiebung to, die die gemessenen Flugzeiten der Ionen in dem TOF MS mit ihren Masse-/Ladungsverhältnissen in Verbindung setzt, anzupassen. Wenn der Temperaturkorrekturfaktor zunächst bestimmt wird, wird er auf die initiale Kalibrierungsfunktion angewendet, die beispielsweise beim Hochfahren des Massenspektrometers bestimmt wurde, so dass die Proportionalitätskonstante A auf A' und/oder die Zeitverschiebung t₀ auf t₀' in der oben als Beispiel genannten Kalibrierungsfunktion modifiziert wird. Die modifizierte Kalibrierungsfunktion kann dann auf die TOF-Daten angewendet werden, um auf Temperatur korrigierte Massenspektren zu erzeugen. Der Prozess kann in Intervallen (z. B. in festen Zeitintervallen, nach einer bestimmten Anzahl von Analysezyklen etc.) wiederholt werden, und die Kalibrierungsfunktion kann aktualisiert werden, wenn ein neuer Temperaturkorrekturfaktor identifiziert wurde (so dass in dem Beispiel oben A' zu A", und dann zu A'" etc. modifiziert wird, während t₀' zu t₀" und dann zu t₀'" etc. modifiziert wird).
Alternativ kann eine Vielzahl von Massenpeaks, die sich über den Bereich des FTMS-Massenspektrums erstrecken, als kalibrierende Peaks verwendet werden. Eine entsprechende Vielzahl von Massenpeaks wird dann in dem mr-TOF-Massenspektrum identifiziert, und die Kalibrierungsfunktion des Temperaturkorrekturfaktors/der modifizierten Flugzeit zu dem m/z kann durch einen Vergleich jeder der entsprechenden Spitzen bestimmt werden. Wie oben angemerkt, kann die absolute Menge der Peakverschiebung über den in den FTMS- und mr-TOF-Massenspektren analysierten Bereich variieren. Somit wird, auch wenn ein einziger konstanter Korrekturfaktor auch in diesem Fall noch erhalten werden könnte (beispielsweise durch Berechnen eines Durchschnitts der unterschiedlichen Peakverschiebungen über den m/z-Bereich), in diesem Fall bevorzugt stattdessen ein nicht konstanter Temperaturkorrekturfaktor bestimmt und auf die Flugzeit-zu-m/z-Formel angewendet, beispielsweise, indem die Proportionalitätskonstante und alle Zeitverschiebungen modifiziert werden, aber auch beispielsweise durch Zufügen von Termen höherer Ordnung, um nichtlineare Verschiebungen der Flugzeit über den Massenbereich zu berücksichtigen. Am einfachsten kann eine lineare Interpolation zwischen den gemessenen Massenverschiebungen der kalibrierenden Peaks eingesetzt werden. Alternativ kann ein Algorithmus zur Kurvenanpassung verwendet werden. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Schwerpunkte und Qualitätsfaktoren, die durch die Systemsteuerung 200 in Bezug auf das FTMS-Massenspektrum gespeichert werden, für die Kalibrierung des mr-TOF-Massenspektrums verwendet. Während der Anpassung können Ausreißer identifiziert werden, beispielsweise wenn die R² der unterschiedlichen Fits verglichen werden.
Während der Kalibrierung können Qualitätsfaktoren der kalibrierenden Peaks auf die folgende Weise verwendet werden, um das Kalibrierungsergebnis zu verbessern:

Kalibrierenden Peaks, die eine höhere Intensität aufweisen, wird eine größere Gewichtung gegeben;
kalibrierenden Peaks, die einzelne Peaks in dem mr-TOF-Massenspektrum sind, wird eine größere Gewichtung gegeben;
kalibrierenden Peaks, die in dem mr-TOF-Massenspektrum vollständig aufgelöst sind, wird eine größere Gewichtung gegeben;
es wird nur eine spezifische Anzahl n von kalibrierenden Peaks (die, die die höchste Intensität in dem FTMS- und/oder mr-TOF-Massenspektrum aufweisen) für die Kalibrierung verwendet;
es werden nur kalibrierende Peaks, die in dem mr-TOF-Massenspektrum einzelne Peaks sind, für die Kalibrierung verwendet;
es werden nur kalibrierende Peaks, die in dem mr-TOF-Massenspektrum vollständig aufgelöst sind, für die Kalibrierung verwendet.

Diese Auflistung von Kriterien wird nicht als einschränkend angesehen, sondern nennt nur einige bevorzugte Kriterien. Ein Kriterium kann alleine verwendet werden, oder mehrere Kriterien können zusammen verwendet werden, um die Qualität der Kalibrierung weiter zu verbessern.
Die Kriterien können abhängig von den untersuchten Proben verwendet werden. Beispielsweise ist die ausschließliche Nutzung kalibrierender Peaks, die einzelne Peaks sind, bevorzugt, wenn diese einzelnen Peaks in einem mr-TOF-Massenspektrum einer Probe in ausreichender Menge vorhanden sind, so dass andere komplexere Peaks für die Kalibrierung nicht erforderlich sind.
Die Anzahl von Kalibrierungspeaks, die verwendet werden, ist ebenso abhängig von den oben aufgeführten Kriterien. Je besser die Qualität der einzelnen Peaks ist, desto kleiner kann die Anzahl der verwendeten Kalibrierungspeaks sein.
Das Experiment, bei dem die untersuchte Probe dem FTMS und dem TOF-MS zugeführt wird, kann zu einer Peakstruktur der beobachteten Massenspektren führen, die sich im Laufe der Zeit verändert. Beispielsweise kann die Probe mittels eines Chromatographie-Prozesses zugeführt werden, was verursacht, dass die kalibrierenden Peaks sich im Laufe der Zeit verändern. Insbesondere können die Kriterien, die verwendet werden, um die Kalibrierungspeaks und/oder die Anzahl der Kalibrierungspeaks auszuwählen, sich im Laufe der Zeit verändern. Diese Veränderung erfolgt auf der Basis, dass die Temperaturkorrekturfaktoren aller gemessenen TOF-MS-Daten stets ordnungsgemäß zur Verfügung gestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, insbesondere, wenn ein konstanter Temperaturdrift eines TOF-Massenspektrometers erwartet wird, wird eine detaillierte Kalibrierung nur für ein erfasstes TOF-Massenspektrum zu einer spezifischen Zeit durchgeführt, was nach einer spezifischen Zeitdauer wiederholt wird. Eine grobe Kalibrierung wird zu einem dazwischenliegenden Zeitpunkt unter Verwendung nur einer kleinen Anzahl kalibrierender Peaks durchgeführt. Bevorzugt werden in dieser Ausführungsform die relevantesten kalibrierenden Peaks verwendet, d. h. Peaks, die die höchste Intensität und/oder die beste Auflösung aufweisen. Dies reduziert den erforderlichen Aufwand, um die Kalibrierung durchzuführen, während andererseits eine stabile Kontrolle eines Temperaturdrifts erreicht wird, insbesondere eines linearen Temperaturdrifts. Ein solcher Temperaturdrift kann beispielsweise durch eine Aufheizwirkung einer Komponente des TOF-Massenspektrometers eingeführt werden.
Es wird erwartet, dass die Temperaturabhängigkeit des TOF-MS-Massenspektrums größtenteils einfach durch Anpassen der Proportionalitätskonstanten A in der oben identifizierten Formel angepasst werden kann. Jedoch können für einen höheren Grad der Massengenauigkeit in dem TOF MS-Massenspektrum weitere Korrekturen verwendet werden: beispielsweise kann die Zeitverschiebung to berücksichtigt werden, und eine unterschiedliche Proportinalitätskonstante A' kann eingesetzt werden. Es können Terme höherer Ordnung zu der m/z zu Flugzeit-Formel zugefügt werden, z. B. m/z = A'(t_m-t₀)² + A"t_m + A'" und so weiter.
Eine weitere Erörterung der Umwandlung von Flugzeiten in Masse-/Ladungsverhältnisse in einem TOF MS ist beispielsweise in „Improved Calibration of Time-of-Flight Mass Spectra by Simplex Optimization of Electrostatic Ion Calculations“, Christian et al, Anal. Chem. 2000, 72, Seiten 3327-3337 zu finden.
2 zeigt grafische Darstellungen der Massenverschiebung (das heißt, den Unterschied zwischen der Peakposition, wie sie in dem mr-TOF-Massenspektrum gemessen wurde, und der Peakposition, wie sie in dem FTMS-Massenspektrum gemessen wurde) gegen die Massenzahl m/z, wie sie in dem FTMS-Massenspektrum bestimmt wurde. Es wird darauf hingewiesen, dass die Kurven und Datenpunkte in 2 lediglich ein besseres Verständnis der oben aufgeführten Grundsätze vermitteln sollen und keine realen oder simulierten Datenpunkte darstellen.
2 stellt ein Beispiel bildlich dar, in dem die Massenverschiebung (Delta m/z) mit m/z sich über einen Bereich mit unterschiedlichen Temperaturen des mr-TOF verändert, und auf eine nicht lineare Weise. Insbesondere werden vier unterschiedliche Kurven gezeigt, die grafische Darstellungen von Delta m/z vs. m/z für unterschiedliche Temperaturen des mr-TOF repräsentieren. Ein Best Fit-Algorithmus wurde verwendet, um die Kurven mit der Bezeichnung F1, F2, F3 und F4 zu generieren. Diese Kurven können verwendet werden, um die Flugzeit zu m/z-Kalibrierungsfunktion für unterschiedliche Temperaturen des mr-TOF anzupassen. In dem Beispiel aus 2 unterscheiden sich sowohl die erste als auch die zweite Ableitung der Kurven zu Veranschaulichungszwecken für ein gegebenes m/z bei den unterschiedlichen Temperaturen.
Auch wenn 2 Temperaturen T1-T4 anzeigt, sollen diese das Konzept erläutern, nicht die spezifische Temperatur individueller Komponenten darstellen.
Es gibt viele Faktoren, die im Laufe der Zeit zu mechanischen und elektrischen Verschiebungen in dem mr-TOF 150 führen können, und es ist schwierig, die Temperatur von (einer) spezifischen Komponente(n) des mr-TOF mit einer bestimmten Massenverschiebung zu korrelieren.
Daher wird es im Allgemeinen nicht als wünschenswert erachtet, eine Gruppe von Flugzeit-zu-m/z-Kalibrierungsfunktionen (für unterschiedliche Temperaturen) als Teil der Werkseinstellung des Massenspektrometers 10 für alle darauffolgenden Verwendungen zu erhalten. Ein solches Verfahren würde es erfordern, dass die Temperatur des mr-TOF gemessen und die entsprechende vorbestimmte Kalibrierungsfunktion auf das mr-TOF angewendet wird, was aus den oben genannten Gründen schwierig ist.
Es ist stattdessen wünschenswert, dass das oben beschriebene Verfahren in regelmäßigen Intervallen im Verlauf des Experiments durchgeführt wird, und eine regelmäßig aktualisierte Kalibrierungsfunktion wird „spontan“ berechnet. Beispielsweise kann eine initiale Kalibrierung vor dem Beginn der Experimente unter Verwendung einer bekannten Probe durchgeführt werden. Diese bekannte Probe kann in das Massenspektrometer 10 eingeführt werden, was eine Reihe identifizierbarer kalibrierender Peaks über bevorzugt den Großteil des oder den gesamten Massenbereich erzeugt, der während der darauffolgenden Experimente untersucht wird. Von der bekannten Probe kann eine initiale Kalibrierungsfunktion erhalten werden. Dann können die Experimente beginnen. Beispielsweise ist die Anordnung in 1 besonders geeignet für eine datenunabhängige Analyse (DIA) und eine Technik, die die Vorrichtung aus 1 verwendet, wird in EP17174365.1, eingereicht am selben Tag, mit dem Titel „Hybrid Mass Spectrometer“, beschrieben.
Die initiale Kalibrierungsfunktion kann auf die Flugzeitdaten angewendet werden, die aus dem mr-TOF erhalten werden, um diese Flugzeiten in m/z umzuwandeln, um ein Massenspektrum zu bilden. Jedoch kann entweder nach einer vorbestimmten Zeitdauer oder nach einer vorbestimmten Anzahl von Experimenten beispielsweise eine neue Kalibrierungsfunktion unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken erhalten werden, um eine neue Kalibrierungsfunktion zu erzeugen, die die Temperaturdrifts in der Zwischenzeit berücksichtigt. Wie bereits angemerkt, wird (werden) (ein) geeignete(r) Peak(s) aus denen ausgewählt, die durch (eine) experimentelle Probe(n) (und/oder die Hintergrundspezies, die die experimentelle(n) Probe(n) begleiten) erzeugt werden, und wird (werden) verwendet, um die darauffolgende modifizierte Kalibrierungsfunktion zu generieren.
Sobald die modifizierte Kalibrierungsfunktion bestimmt wurde, werden die darauffolgenden Flugzeitdaten in m/z umgewandelt, indem stattdessen diese verwendet wird. Der Prozess kann wiederholt werden, bis alle Experimente abgeschlossen sind; während dieser Zeit können weitere modifizierte Kalibrierungsfunktionen erhalten werden, um aktuelle Temperaturschwankungen zu berücksichtigen.
(ii) Verwendung sowohl der Vorläuferionen als auch der Ionenfragmente
Oben wird die Fragmentierungskammer 120 in dem Ionenleitermodus verwendet, wobei im Wesentlichen keine Fragmentierung der Vorläuferionen vonstattengeht, bis diese in das mr-TOF eingespritzt werden. Die Kalibrierungsfunktion wird somit aus zwei Massenspektren abgeleitet, die im Wesentlichen dieselben Daten enthalten. Unterschiede in den Spektren können somit den temperaturabhängigen Auswirkungen auf das mr-TOF-Massenspektrum zugeschrieben werden.
Jedoch erfordern die meisten Experimente, die durch das Massenspektrometer 10 ausgeführt werden, eine Fragmentierung der Vorläuferionenspezies. Beispielsweise verwendet die DIA-Analyse, die in dem oben genannten EP17174365.1, eingereicht am selben Tag mit dem Titel „Hybrid Mass Spectrometer“, beschrieben wird, einen Arbeitsablauf, in dem Ionen von einem chromatographischen Peak als unfragmentierte Vorläuferionenspezies in dem FTMS 110 analysiert werden, um ein MS1-Spektrum zu erstellen, während Ionen von demselben chromatographischen Peak dann durch die Fragmentierungskammer 120 fragmentiert und danach (optional) gesammelt und durch das mr-TOF analysiert werden, um ein MS2-Massenspektrum der Ionenfragmente zu erstellen. In solchen Experimenten kann das Erhalten eines MS1-Massenspektrumsaus dem mr-TOF durch Umschalten der Fragmentierungskammer 120 in den Ionenleitermodus - zum Zwecke des Erhalts einer temperaturmodifizierten/kompensierten Kalibrierungsfunktion in Übereinstimmung mit den oben in (i) aufgeführten Grundsätzen - die Gesamtzeit des Experiments erhöhen. Typischerweise wird ein einziger Vorläufer- (MS1-) Scan bei etwa 2 Hz unter Verwendung eines Orbitrap ® -Massenanalysators mit einem Auflösungsvermögen von etwa 240.000 durchgeführt. Das TOF MS kann bis zu 500 MS1- (oder MS2-) Scans pro Sekunde einholen.
Eine alternative Option ist es daher, die Energie des Kollisionsgases in der Fragmentierungskammer 120 so einzustellen, dass einige, aber nicht alle der Vorläuferionen fragmentiert werden. Dann kann ein MS2-Massenspektrum aus dem mr-TOF 150 erhalten werden, während mindestens einige Vorläuferionenspezies in das mr-TOF zur Verwendung als potentielle kalibrierende Ionen zugelassen werden. Wie zuvor angemerkt, sind die Peakform und das Fehlen störend einwirkender Ionenspezies/Isotope wünschenswert, wenn ein bestimmter Peak als kalibrierender Peak verwendet werden soll.
Die Systemsteuerung 200 kann entsprechend mit logischen Anweisungen konfiguriert werden, die diese Überlegungen mit berücksichtigen. Beispielsweise kann die Systemsteuerung 200 zu einer vorbestimmten Zeit, wenn eine neue Kalibrierungsfunktion erhalten werden soll, die Kollisionsenergie der Fragmentierungskammer 120 auf eine erste Energie einstellen, die zu einem Gemisch aus Vorläuferionen und Ionenfragmenten in dem Massenspektrum führt, das durch das mr-TOF generiert wird. Die FTMS- und mr-TOF-Massenspektren werden dann verglichen, um herauszufinden, ob eine ausreichende Anzahl von Peaks (die auch nur ein einzelner Peak sein können) als geeignete kalibrierende Peaks identifiziert werden können. Wenn ja, wird eine neue Kalibrierungsfunktion bestimmt und in einem Speicher zur Anwendung auf zukünftige mr-TOF-Massenspektren aktualisiert. Wenn nein, kann die Kollisionsenergie verringert werden, um zuzulassen, dass mehr Vorläuferionenspezies die Fragmentierungskammer 120 ohne Fragmentierung durchlaufen. Die Analyse wird dann wiederholt, bis eine ausreichende Anzahl kalibrierender Peaks in jedem der FTMS- und mr-TOF-Massenspektren identifiziert wird. Dies kann in einigen Fällen erfordern, dass die Fragmentierungsenergie auf einen Punkt reduziert wird, an dem das mr-TOF-Massenspektrum im Wesentlichen ein MS1-Spektrum ist, in dem keine, oder keine nützlichen, Fragmentdaten enthalten sind.
(iii) Nur Verwendung von Ionenfragmenten
Noch eine weitere Option zur Temperaturkorrektur von mr-TOF-Massenspektren verwendet nur Ionenfragmente. In diesem Fall werden Vorläuferionen von der Ionenquelle 20 nicht in der C-Falle 100 zum Einspritzen in das FTMS 110 gefangen, sondern sie durchlaufen die C-Falle und treten in die Fragmentierungskammer 120 ein, in der sie fragmentiert werden. Einige der sich daraus ergebenden Ionenfragmente werden dann in der Extraktionsfalle zur Analyse durch das mr-TOF- 150 gesammelt, so dass danach ein MS2-Scan durch das mr-TOF erzeugt wird. Andere Ionenfragmente, die durch die Fragmentierungskammer 120 erzeugt werden, werden jedoch zu der C-Falle 100 zurückgesendet, wo sie gefangen und danach in das FTMS 110 eingespritzt werden, so dass das FTMS 110 ebenso ein MS2-Spektrum erstellt. Dann kann eine auf die Temperatur abgeglichene Kalibrierungsfunktion wie zuvor bestimmt werden.
Eine solche Technik kann vorteilhaft sein, wenn eine wesentliche Abhängigkeit der Massenverschiebung von der Massenzahl vorliegt, da die Massen von Ionenfragmenten sich oftmals wesentlich von den Vorläuferionen unterscheiden, von denen sie abstammen (und somit möglicherweise wesentlich unterschiedlichen Massenverschiebungen unterliegen).
Die Verwendung eines MS2- Spektrums oder von MS2-Spektren hat den Vorteil, dass Störungen und chemisches Rauschen minimiert werden. Das bedeutet, dass es einfacher ist, geeignete Peaks für die Kreuzkalibrierung zu finden.
Es ist wünschenswert, das absolute und relative Auflösungsvermögen der FTMS- und mr-TOF-Massenanalysatoren bei der Generierung wirksamer Kalibrierungsfunktionen zu berücksichtigen. Beispielsweise kann es, wenn das Auflösungsvermögen des FTMS etwa eine Größenordnung größer als das Auflösungsvermögen des TOF MS ist, schwierig werden, erfolgreich geeignete kalibrierende Peaks zu identifizieren, da diese Artfakte der in dem FTMS-Massenspektrum identifizierten Peaks in dem TOF-MS (durch das geringere Auflösungsvermögen) fehlen können. Mit Stand 2017 können typische Auflösungsvermögen des mr-TOF bis zu den hohen Zehntausenden erreichen, jedoch können in Zukunft selbstverständlich höhere Auflösungsvermögen in Betracht gezogen werden. Ebenso liegt das Auflösungsvermögen des FTMS 110 (in einem Fall, in dem ein Orbitrap ® verwendet wird), aktuell mindestens bei 100.000 und bis zu mehreren Hunderttausend, wobei in Zukunft höhere Auflösungsvermögen in Betracht gezogen werden können.
Die spezifischen Auflösungsvermögen des FTMS und TOF MS sind jedoch für die Umsetzung der Erfindung nicht kritisch. Die Verschiebung der Flugzeit der Ionen bei einer Temperaturveränderung in dem TOF MS hat eine viel höhere Auswirkung auf die gesamte Massengenauigkeit des TOF MS als andere Faktoren unter typischen Betriebsbedingungen. Beispielsweise ist die Massengenauigkeit eines Orbitrap ® besser als einige Teile pro Million (z. B. +/-3 ppm oder besser) und ist in jedem Fall unabhängig von der Auflösung. Die Massengenauigkeit eines TOF MS (wobei hierfür die Temperaturabhängigkeit außer Acht gelassen wird) ist mit der Auflösung und der Anzahl der erfassten Ionen in einem Peak verbunden, jedoch liegt bei einem Peak, der 100 Ionen bei einer 50-100t Auflösung enthält, die Massengenauigkeit immer noch etwa bei +/-3 ppm oder besser.
Der Effekt einer Temperaturverschiebung ist, dass eine Massengenauigkeit (oder genauer gesagt eine zusätzliche Massenungenauigkeit) in der Größenordnung einiger Dutzend ppm über mehrere Stunden eingeführt wird. Somit ist deutlich zu sehen, dass die relativen Auflösungen des FTMS und TOF MS eine eingeschränkte Auswirkung auf die Massengenauigkeit des TOF MS haben, wenn die dominante Wirkung der Temperaturverschiebung des TOF MS berücksichtigt wird.
Erforderlich ist ledigich, dass mindestens ein Peak in dem FTMS-Massenspektrum mit einem entsprechenden Peak in dem TOF MS-Massenspektrum mit einem akzeptablen Vertrauensniveau abgeglichen werden kann. Es ist klar, dass, wenn das Auflösungsvermögen einer der FTMS- und TOF MS-Vorrichtungen wesentlich von der anderen abweicht, die Formen der Peaks so unterschiedlich sein können, dass dies den Abgleich der Peaks schwierig gestalten kann. Die Selektion von Peaks, die in Betracht gezogen werden, ist entsprechend erwünscht: insbesondere ist es bevorzugt, eine Ionenspezies auszuwählen, die im Wesentlichen frei von Störungen ist. Mehrere nahe beieinanderliegende Peaks können in dem FTMS-Massenspektrum sichtbar sein (das typischerweise bei einer relativ höheren Auflösung erhalten wird), während nur ein einziger, breiterer, flacherer Peak in dem TOF MS-Massenspektrum sichtbar ist, das bei einer relativ niedrigeren Auflösung erhalten wird.
3b zeigt eine grafische Darstellung der Massenverschiebung (Delta m/z) vers. Zeit (in Minuten) für einen einzelnen Peak, der durch das Einspritzen von Ionen mit m/z 524 in ein Orbitrap ® (rautenförmige Datenpunkte) und dem zuvor beschriebenen mr-TOF (kreuzförmige Datenpunkte) erhalten wurde. Ein TOF-Massenspektrum wurde jede Minute erhalten, wohingegen ein Orbitrap ® - Massenspektrum alle 5 Minuten erhalten wurde. Die Skala der vertikalen Achse ist Teile pro Million. Eine deutliche und immer bedeutendere Verschiebung der gemessenen Masse ist bei den TOF-Datenpunkten über eine Zeitdauer von 2 Stunden (120 Minuten) zu sehen, während die Massenverschiebung in dem Orbitrap ®-Massenspektrum mehr oder weniger konstant ist, zumindest auf ppm-Niveau über diesen Zeitraum.
3a zeigt eine grafische Darstellung der unkorrigierten Massenverschiebung (Delta m/z) vers. Zeit (in Minuten) für denselben einzelnen Peak bei m/z=524, wie er aus dem TOF-MS erhalten wurde (die Datenpunkte sind Kreuze). Es wird jedoch ebenso die TOF-Massenverschiebung gezeigt, die auf die Korrektur in Übereinstimmung mit den oben genannten Techniken folgt (rautenförmige Datenpunkte). Auch wenn die Standardabweichung der korrigierten Massenverschiebungsdatenpunkte (wie zu erwarten wäre) höher ist als die Standardabweichung der Orbitrap ®-Massenverschiebungsdaten (3b) wurde nichtsdestotrotz die systematische Verschiebung in dem Massenpeak, die durch die Kurve der unkorrigierten (rohen) TOF MS-Daten in 3a gezeigt wird, größtenteils ausgemerzt.
Während eine Reihe spezifischer Ausführungsformen lediglich zu Illustrationszwecken vorgestellt wurden, ist es natürlich klar, dass verschiedene Modifikationen und Zufügungen möglich sind. Beispielsweise stellt die spezifische Anordnung der in 1 aufgeführten Anordnung eine besonders bevorzugte Konfiguration dar, auf die die hierin aufgeführten Konzepte angewendet werden können. Nichtsdestotrotz kann eine Reihe anderer Anordnungen in Betracht gezogen werden. Beispielsweise können die mr-TOF- und FTMS-Vorrichtungen in der Anordnung aus 1 umgekehrt werden, so dass eine dazwischenliegende Falle (eine C-Falle oder eine andere Falle) Ionen entweder in das mr-TOF oder stromabwärts, über eine Fragmentierungskammer 120 zu einer C-Falle zum Einspritzen in ein FTMS, leitet. Des Weiteren kann, statt einer einzelnen Fragmentierungskammer 120, die zwischen der C-Falle und dem mr-TOF positioniert ist, jeder Massenanalysator stattdessen seine eigene dazu bestimmte Fragmentierungskammer aufweisen. Dies könnte das Verfahren zum Erhalt von MS2-Scans sowohl von dem FTMS 110 als auch von dem mr-TOF 150 vereinfachen, wie es in Verfahren (iii) oben beschrieben wurde.
4 zeigt eine alternative Ausführungsform eines Massenspektrometers, das zum Umsetzen der Techniken der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Ausführungsform des Massenspektrometers aus 4 nutzt eine verzweigte Pfadanordnung.
In der Ausführungsform in 4 wird eine Ionenquelle 200 mit einer Massenselektionsvorrichtung 210 gekoppelt. Eine solche Anordnung kann beispielsweise durch die ESI-Ionenquelle 20 und die jeweiligen Kopplungen mit dem Quadrupol-Massenfilter 70 wie in der Ausführungsform aus 1 bereitgestellt werden.
Wie in 4 gezeigt, ist der Ausgang der Massenselektionsvorrichtung 210 mit dem verzweigten Ionenpfad 220 gekoppelt. Der verzweigte Ionenpfad leitet Ionen, die von der Massenselektionsvorrichtung ausgegeben werden, entlang eines von zwei Pfaden. Ein erster Pfad 222 leitet Ionen in eine C-Falle 230, wo Ionen zur Analyse durch einen FTMS-Analysator 240 gesammelt werden (typischerweise, um Vorläufer-MS1-Daten wie oben in Verbindung mit 1 besprochen zu erfassen). Ein zweiter Pfad 224 leitet Ionen zu einer Fragmentierungskammer 250. Hier können sie teilweise fragmentiert (siehe (ii) oben) oder vollständig fragmentiert (siehe (iii) oben) werden, oder die Energie der Fragmentierungskammer 250 kann so eingestellt werden, dass Ionen diese im Wesentlichen ohne Fragmentierung zur darauffolgenden Massenanalyse durch den mr-TOF-Analysator 270 durchlaufen (Beispiel (i) oben). Der verzweigte Ionenpfad kann eine HF-Spannung verwenden, um Ionen entweder entlang des ersten Pfads 222 oder des zweiten Pfads 224 zu leiten. Der verzweigte Ionenpfad kann ein verzweigter HF-Multipol sein. Ein verzweigter Ionenpfad, der zur Verwendung in der Ausführungsform von 4 geeignet ist, wird ferner in US-B-7,420,161 beschrieben.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform in 4 kann der verzweigte Ionenpfad verwendet werden, um Ionen in eine C-Falle 230 zur Analyse durch den FTMS-Analysator 240 oder zu einem mr-TOF-Analysator 260 zur TOF-Analyse zu leiten, über eine Fragmentierungskammer 250, die im Fragmentierungs- oder im Ionenleitermodus verwendet werden kann. Vorläuferionen oder Ionenfragmente, die aus der Fragmentierungskammer 250 ausgestoßen werden, können in einer Ionenextraktionsfalle 260 gesammelt werden, bevor sie als Paket in den mr-TOF-Analysator 270 eingespritzt werden. So kann die Anordnung der Fragmentierungskammer 250, der Ionenfalle 260 und des mr-TOF 270 durch eine ähnliche Anordnung wie die in 1 beschriebene bereitgestellt werden.
Somit können nach der alternativen Ausführungsform in 4 Ionen zur Analyse durch den mr-TOF-Analysator 270 geleitet werden, ohne dass die C-Falle 230, die für den FTMS-Analysator 240 zuführt, leer sein muss. Eine solche Konfiguration kann eine erhöhte Parallelisierung der FTMS- und mr-TOF-Scans zulassen. Als solches kann ein größerer Anteil der Zeitdauer eines chromatographischen Peaks zur Durchführung von mr-TOF-Scans zur Verfügung stehen. Des Weiteren kann bei dieser Konfiguration eine Reihe von Beladungen oder Füllungen in der C-Falle vor der Analyse in dem FTMS 240 gesammelt werden. In solchen Ausführungsformen kann die Beladung der C-Falle auf mehrere kleinere Füllungen aufgeteilt werden, während der FTMS-Analysator scannt, wodurch eine Population von Ionen erhalten wird, die für die Ionen über den gesamten Peak repräsentativer ist.
Die Techniken zur Temperaturkorrektur der Position der Massenpeaks in den mr-TOF-Daten sind ansonsten wie in Verbindung mit den 1, 2 und 3 beschrieben.
Durch die obige Besprechung wird die Selektion von in Betracht kommenden kalibrierenden Peaks in dem FTMS-Massenspektrum und dann das Abgleichen derselben in dem mr-TOF-Massenspektrum vorgeschlagen. Da das Auflösungsvermögen des FTMS im Allgemeinen höher ist als das des TOF, wird die Wahrscheinlichkeit eines Abgleichs der falschen Peaks vermindert. Trotzdem ist die Erfindung nicht darauf beschränkt, und es ist möglich, eine auf Temperatur korrigierte Kalibrierungsfunktion zu erhalten, indem (ein) in Betracht kommende(r) Peak(s) in dem TOF-Massenspektrum ausgewählt wird (werden) und dann entsprechende Peaks in dem FTMS-Massenspektrum lokalisiert werden, wobei die Kalibrierungsfunktion von diesem Vergleich abgeleitet wird.
Des Weiteren ist es nicht erforderlich, die Temperaturkorrektur auf die Flugzeit zu m/z Kalibrierungsfunktion anzuwenden (so dass eine temperaturkorrigierte Kalibrierungsfunktion generiert würde). Stattdessen kann die Kalibrierungsfunktion, die bei Beginn des Experiments bestimmt wird, über das gesamte Experiment ohne darauffolgende Modifizierung verwendet werden. Dann kann das Massenspektrum (spezifischer, die m/z-Daten) - statt der rohen Flugzeitdaten - unter Verwendung eines Temperaturkorrekturfaktors korrigiert werden, der das m/z jedes Peaks in dem Massenspektrum basierend auf der Position dieses oder dieser Peaks in dem FTMS-Massenspektrum anpasst.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2015287585 A [0035]
US 9548195 [0045]

Claims

Verfahren zum Kalibrieren eines TOF-MS-Massenspektrums zur Berücksichtigung von Temperaturveränderungen, umfassend: (a) Einführen von Ionen in ein Fourier-Transform-Massenspektrometer (FTMS); (b) Erhalt von Daten, die für die Masse-/Ladungsverhältnisse mindestens einiger kalibrierender Ionen repräsentativ sind, die in das FTMS eingeführt werden; (c) Einführen von Ionen in ein Flugzeitmassenspektrometer (TOF MS), wobei die Ionen, die in das TOF MS eingeführt werden, Ionen von der kalibrierenden Ionenspezies einschließen; (d) Erhalt von Daten, die für das Masse-/Ladungsverhältnis mindestens der Ionen der kalibrierenden Ionenspezies repräsentativ sind, die in das TOF MS eingeführt wird; (e) Auswahl eines oder mehrerer Peaks in den Daten, die von einem ersten des FTMS und des TOF MS erhalten werden, die repräsentativ für eine oder mehrere kalibrierende Ionenspezies sind; (f) Abgleichen des oder jedes ausgewählten Peaks in den erhaltenen Daten aus dem ersten des FTMS und des TOF MS mit einem entsprechenden einen oder mehreren Peaks in den Daten, die von dem zweiten des FTMS und des TOF MS erhalten werden und repräsentativ für die oder jede ausgewählte kalibrierende Ionenspezies ist; (g) Bestimmen eines Temperaturkorrekturfaktors für die TOF MS-Daten, basierend auf einer relativen Position der Peaks der kalibrierenden TOF MS- und FTMS-Ionenspezies; und (h) Anwenden des Temperaturkorrekturfaktors auf Daten, die von dem TOF MS erhalten werden, um diese TOF MS-Daten in Bezug auf Veränderungen der Temperatur des TOF MS zu korrigieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (h) ferner das Anwenden des Temperaturkorrekturfaktors auf ein oder mehrere aufeinanderfolgende Datensets einschließt, die von dem TOF MS erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Daten, die von dem TOF MS erhalten werden, die Flugzeitdaten sind, wobei das Verfahren ferner das Bestimmen einer ersten Kalibrierungsfunktion umfasst, die auf die TOF MS-Flugzeitdaten angewendet wird, um sie in ein Massenspektrum umzuwandeln, und wobei ferner Schritt (g) des Bestimmens des Temperaturkorrekturfaktors für die TOF MS-Daten das Bestimmen einer modifizierten ersten Kalibrierungsfunktion umfasst, die auf die TOF MS-Flugzeitdaten angewendet werden soll, um diese in ein Massenspektrum umzuwandeln, das in Bezug auf die Veränderung der Temperatur des TOF MS korrigiert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt (e) das Auswählen eines oder mehrerer Peaks in den Daten umfasst, die von dem FTMS erhalten werden, wobei der Schritt (f) das Abgleichen eines oder mehrerer entsprechenden(r) Peaks in den Daten umfasst, die von dem TOF MS erhalten werden, die für die oder jede ausgewählte kalibrierende Ionenspezies repräsentativ sind, und wobei der Schritt (g) das Bestimmen eines Temperaturkorrekturfaktors von der Verschiebung der Position des oder jedes kalibrierenden Peaks in den TOF MS-Daten in Bezug auf die Position des oder jedes kalibrierenden Peaks in den FTMS-Daten umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt (a) das Einführen von Vorläuferionen in das FTMS von mindestens einer kalibrierenden Ionenspezies umfasst, und wobei der Schritt (c) das Einführen von Vorläuferionen in das TOF MS von dieser mindestens einen kalibrierenden Ionenspezies umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, ferner das Fragmentieren der Vorläuferionen der kalibrierenden Ionenspezies unter Bedingungen umfassend, so dass einige, aber nicht alle der Ionen dieser kalibrierenden Ionenspezies fragmentiert werden, wobei der Schritt (a) und/oder der Schritt (c) das Einführen sowohl der Ionenfragmente, die von den Vorläuferionen stammen, als auch der unfragmentierten Vorläuferionen der kalibrierenden Ionenspezies in das TOF MS einfasst, wobei der Schritt (e) das Auswählen eines oder mehrerer Peaks in den TOF-MS- oder FTMS-Daten umfasst, die repräsentativ für die oder mindestens eine der unfragmentierten Vorläuferionenspezies sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner das nacheinander erfolgende Wiederholen der Schritte (a) bis (g) umfassend, um einen aktualisierten Temperaturkorrekturfaktor zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wiederholung der Schritte (a) bis (g) zu einer Vielzahl zuvor bestimmter Zeitintervalle durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die kalibrierende Ionenspezies einen Massenpeak aufweist, der ein einzelner aufgelöster Peak in dem FTMS ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt des Auswählens eines oder mehrerer Peaks in den FTMS- und TOF MS-Daten das Selektieren einer entsprechenden Gruppe von Peaks in jedem der FTMS- und TOF MS-Daten umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner vor dem Schritt (c) des Einführens von Ionen in das TOF-MS den Schritt des Sammelns von Ionen der kalibrierenden Ionenspezies in einer Ionenfalle umfassend, wobei der Schritt (c) dann das Einführen der gesammelten Ionen aus der Ionenfalle in das TOF MS umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin Schritt (a) das Einführen von Ionen in ein Orbitalfallen-Massenspektrometer umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin Schritt (c) das Einführen von Ionen in ein Multireflexions-Flugzeitmassenspektrometer (MR-TOF MS) umfasst.
System zum Kalibrieren eines TOF-MS-Massenspektrums zur Berücksichtigung von Temperaturveränderungen, umfassend: (i) eine Ionenquelle, die angeordnet ist, um Ionen zu generieren; (j) ein Fourier-Transform-Massenspektrometer (FTMS) zum Analysieren von Ionen, die in dieses eingeführt werden, und Generieren von Daten, die repräsentativ für das Masse-/Ladungsverhältnis dieser Ionen sind, (k) ein Flugzeitmassenspektrometer (TOF MS) zum Analysieren von Ionen, die in dieses eingeführt werden, und Generieren von Daten, die repräsentativ für das Masse-/Ladungsverhältnis dieser Ionen sind, (I) eine Systemsteuerung, die angeordnet ist, um i. einen oder mehrere Peaks in einem ersten aus den FTMS- und den TOF MS-Daten auszuwählen, die repräsentativ für eine oder mehrere kalibrierende Ionenspezies sind, die jeweils in das erste des FTMS und des TOF MS eingeführt werden; ii. den oder jeden ausgewählten Peak in den erhaltenen Daten aus dem ersten des FTMS und des TOF MS mit entsprechend einem oder mehreren Peaks in den Daten abzugleichen, die von dem zweiten des FTMS und des TOF MS erhalten werden und repräsentativ für die oder jede ausgewählte kalibrierende Ionenspezies ist; iii. einen Temperaturkorrekturfaktor für die TOF MS-Daten zu bestimmen, basierend auf einer relativen Position der Peaks der kalibrierenden TOF MS- und FTMS-Ionenspezies; und iv. den Temperaturkorrekturfaktor auf Daten anzuwenden, die von dem TOF MS erhalten werden, um diese TOF MS-Daten auf Veränderungen der Temperatur des TOF MS zu korrigieren.
System nach Anspruch 14, ferner umfassend das Mittel zum Fangen von Ionen, das so positioniert ist, dass es Ionen aus der Ionenquelle empfängt und so, dass es danach die Ionen direkt oder indirekt in das FTMS und das TOF MS einführt.
Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei das Mittel zum Fangen von Ionen eine erste Ionenfalle umfasst, die konfiguriert ist, um Ionen von der Ionenquelle einzufangen und diese in das FTMS einzuführen, und eine zweite Ionenfalle, die von der ersten Ionenfalle getrennt ist und konfiguriert ist, um Ionen von der Ionenquelle einzufangen und sie in das TOF MS einzuführen.
System nach Anspruch 16, wobei das FTMS ein Orbitalfallen-Massenspektrometer ist, und die erste Ionenfalle eine kurvenförmige Ionenfalle (C-Falle) ist, die angeordnet ist, um Ionen von der Ionenquelle aufzunehmen und im Allgemeinen entlang einer ersten Achse einzufangen, und diese von der C-Falle zu dem Orbitalfallen-Massenspektrometer in einer Richtung auszuwerfen, die im Allgemeinen senkrecht zu der ersten Achse liegt.
System nach einem der Ansprüche 14 bis 17, ferner umfassend eine Fragmentierungskammer, die vor dem TOF MS positioniert ist, um Vorläuferionen von der Ionenquelle aufzunehmen und optional einige, aber nicht alle, Vorläuferionen der kalibrierenden Ionenspezies vor deren Einführung in das TOF MS zu fragmentieren.
System nach Anspruch 18, wobei die Fragmentierungskammer zwischen der ersten Ionenfalle und der zweiten Ionenfalle positioniert ist.
System nach Anspruch 19, wobei die Systemsteuerung während einer ersten Zeitdauer konfiguriert ist, um die C-Falle zu steuern, so dass Ionen von der Ionenquelle darin gefangen werden, und diese danach orthogonal zu dem Orbitalfallen-Massenspektrometer auszuwerfen, und um während einer zweiten Zeitdauer die C-Falle zu steuern, so dass Ionen, die von der Ionenquelle ankommen, die C-Falle durchlaufen und weiter zu der Fragmentierungskammer gelangen, ohne durch die C-Falle gefangen zu werden.
System nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei das TOF MS ein Multireflexions-Flugzeitmassenspektrometer (MR TOF MS) ist.