CN108398479A - 用于同位素比质谱法的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于同位素比质谱法的方法和设备。同位素比质谱法包括：使含有样品的液体移动相流动通过分离装置，所述样品包括具有待定同位素比的至少一种分子物种；在所述至少一种分子物种从所述分离装置出现的至少一部分时间内设定或降低流动通过分离装置的液体移动相的流动速率，以实现所需同位素比精确度；至少在设定或降低流动速率时对已从分离装置出现的所述至少一种分子物种进行质量分析；根据该质量分析从所述至少一种分子物种的至少两个同位素体的质量峰强度确定所述至少一种分子物种的至少一个同位素比，所述质量分析通过足够高以分辨处于所述同位素体中的至少一个的标称质量的两个最丰富的质量峰的质量分辨力来执行。

Description

用于同位素比质谱法的方法和设备
技术领域
本发明涉及质谱法的领域。本发明尤其涉及同位素比质谱法(IRMS)，且更具体地涉及与液相色谱耦接的IRMS。本发明提供方法和设备两者。
背景技术
常规地，准确且精密同位素测量是在磁式扇形质谱仪上进行，特别是在利用多收集器同时检测同位素的磁式扇形质谱仪上进行。在分析之前，通常使样品在高温下经历氧化、热解和/或还原来产生气态分子，例如COx、NOx、N2、H2O和SO2中的一个或多个(x＝1或2)。随后将气体引入同位素比质谱仪中用于同位素分析。在同位素比质谱仪中，使气体电离并且例如通过比较不同收集器的输出物来测量相应同位素的比率。通常相对于同位素标准物测量所关注的同位素的比率，从而消除测量结果中的任何偏差或系统误差。
近来，已经证明例如OrbitrapTM质谱仪(赛默科技(Thermo Scientific))的静电轨道阱质谱仪同样能够测量大体上应同样准确的精确同位素比(John Eiler，2016年1月在Clumped Isotope Workshop中所演示；John Eiler等人，在2016 ASMS会议时的海报)。已使用采用耦接到气相色谱(GC)柱的电子碰撞电离和采用使所述GC柱的下游更宽的波峰的轨道阱质谱仪得到这类结果。然而，由于液体中的较慢扩散，呈直线式扫描体形式的峰增宽的概念难以在LC设定中实施。这将致使流出物中的不均匀性并且因此致使测量重现性降低。
使用耦接到质谱仪的液相色谱(LC)对精密且准确同位素比的测量已出现具体问题。LC是生物化学、生命科学和药理学领域中用于分离混合物中的分子组分的已有技术。典型样品包含溶解于有机溶剂或水溶液或包括水和有机溶剂的介质中的有机分子。对于这类样品，分子与溶剂的分离一般使用例如高效液相色谱(HPLC)、毛细管区带电泳(CZE)和尺寸排阻色谱(SEC)的技术用有机移动相实施。然而，将同位素比质谱仪耦接到液相色谱系统存在技术挑战，由于LC移动相通常基于有机溶剂和/或包含含碳缓冲液，并且因此产生与所关注有机样品分子相同的氧化或还原产物物种，因此干扰同位素分析。如下文所确认，已对液相色谱与IRMS的耦接进行多种尝试。
《用于纳克量的非挥发性有机碳的碳同位素分析的移动线装置(Moving-wiredevice for Carbon Isotopic Analyses of Nanogram Quantities of NonvolatileOrganic Carbon)》(A.L.Session、S.P.Sylva和J.M.Hayes，《分析化学》，2005,77,6519-6527)，描述一种用于分析溶解于溶液中的非挥发性有机样品的13C比率的方法。分离系统的输出溶液在镍导线上干燥以从样品去除移动相。接着燃烧残余样品并且通过IRMS分析逸出的CO2。然而，这一方法的精确度和灵敏度都受到导线内由碳产生的高背景水平的CO2限制。由于固有的不可靠性，移动线耦接市售已失败。
将液相色谱系统耦接到IRMS的另一方法呈现于《使用与气相或液相色谱导入介接的化学反应的连续流动同位素比质谱法(Continuous-Flow Isotope Ratio MassSpectrometry Using the Chemical Reaction Interface with Either Gas or LiquidChromatography Introduction)》(Y.Teffera、J.Kusmierz、F.Abramson，《分析化学》，1996,68,1888-1894)中。在这一方法中，离开液相色谱系统的溶液在半透膜处发生去溶剂化，随后进行干气溶胶的化学氧化。接着通过IRMS分析氧化产物。然而，所述方法不会去除移动相达到所需的超低溶剂含量，例如达到超过1:100的溶剂/样品比。
湿式化学氧化(如由来自赛默飞世尔科技的LC-IsolinkTM所使用的)允许耦接到液相色谱。色谱系统的溶液输出物与氧化剂混合并且供应到氧化反应器。在所述氧化反应器中，有机化合物转化成CO2，其随后在IRMS中分析。然而，移动相与样品没有分离，且因此，这个方法未适用于利用有机移动相或液相调节剂或含有碳的缓冲液的LC分离方法。
另外，与固有常规LC-MS离子源(例如电喷物电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)源)的离子源波动相关联的问题进一步阻止使用LC-MS进行准确且精确的同位素比测量。
在最近演示(A.Breidbach，《通过较小有机分子的IDMS中的峰延伸和基于扫描的统计数据而提高所测量的同位素比的精确度(Improved precision of measured isotoperatio through peak parking and scan-based statistics in IDMS of small organicmolecules)》，海报ThOS36-02，2014年第20届国际质谱会议，瑞士日内瓦)中，已使用涉及从色谱图中切出LC峰且捕获样品环中的洗脱物种的峰停放的方法。随后使环管充满且通过由第二泵产生的较低流动来将其传递到质谱仪。然而，将样品从主流中移出到环管中且接着充满到质谱仪的步骤尚未达到同位素比测量通常所要的精确度及准确性的水平。另外，系统复杂，需要额外的样品环和第二泵系统。
因此，保持对于使用耦接到LC的质谱检测的精确且准确的同位素比测定的需要。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供一种同位素比质谱法的方法，包含：
使含有样品的液体移动相流动通过分离装置，所述样品包括具有待定同位素比的至少一种分子物种；
设定或降低液体移动相流动穿过分离装置的流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中出现的至少一部分时间以实现所要的同位素比精确度；
至少在流动速率经设定或降低时，对已从分离装置中出现的至少一种分子物种进行质量分析；以及
从质量分析中确定至少一种分子物种的至少一个同位素比。
根据本发明的另一方面，提供一种根据技术方案1所述的同位素比质谱法的方法。
可从具有不同或相同标称质量的至少一种分子物种的至少两个同位素体的质量峰的强度中确定至少一个同位素比，优选地其中质量分析是用足够高以分辨在用于确定同位素比的同位素体中的至少一个的标称质量(优选地处于用于确定同位素比的同位素体中的每一个的标称质量)上的两个最丰富的质量峰的质量分辨力来进行的。在这种上下文下，分辨应意味着两个相邻峰具有彼此可区别的峰顶，即在所述相邻峰之间存在谷。
可从具有不同或相同标称质量的至少一种分子物种的至少两个同位素体的质量峰的强度中确定至少一个同位素比，优选地其中用于同位素比确定的每一同位素体质量峰是从相同标称质量上的至少任何其它质量峰中分辨的，所述其它质量峰大于同位素体的质量峰的强度的20％(优选地大于10％、或大于5％)。
质量分析从分离装置中出现的至少一种分子物种的步骤至少在流动速率降低或设定为实现所要同位素比精确度的流动速率时执行。
根据本发明的又一方面，提供一种用于同位素比质谱法的设备，包括：
用于分离液体移动相中的样品的组分的分离装置，所述样品的组分包括具有待定同位素比的至少一种分子物种；
耦接到分离装置下游的质谱仪，用于在至少一种分子物种从分离装置中洗脱时而对至少一种分子物种进行质量分析且从质量分析中确定至少一种分子物种的至少一个同位素比；以及
控制器，被配置成设定或降低通过分离装置的液体移动相的流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中洗脱的至少一部分时间以实现所要的同位素比精确度。
根据本发明的又一方面，提供一种根据技术方案25所述的用于同位素比质谱法的设备。
优选地，质谱仪可用足够高以分辨在同位素体中的至少一种的标称质量上的两个最丰富的质量峰的质量分辨力来执行质量分析。优选地，质谱仪可用足够高的分辨力执行质量分析，用于同位素比确定的每一同位素体质量峰是从大于所述同位素体质量峰的强度的20％(优选地大于10％或大于5％)的相同标称质量上的至少任何其它质量峰中分辨。
设定或降低流动通过分离装置的液体移动相的流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中出现的至少一部分时间以实现如下文中所描述的所要同位素比精确度。
根据本发明的又一方面，提供一种同位素比质谱法的方法，包括：
使含有样品的液体移动相流动通过分离装置，所述样品包括具有待定同位素比的至少一种分子物种；
设定流动穿过分离装置的液体移动相的流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中出现的至少一部分时间，达到能够实现所要同位素比精确度的流动速率；
至少在流动速率降低时对已从分离装置中出现的至少一种分子物种进行质量分析；
从质量分析中确定至少一种分子物种的至少一个同位素比。
如上文所描述，优选地提供分离装置和质谱仪。另外，控制器优选地被配置成设定通过分离装置的液体移动相的流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中洗脱的至少一部分时间，达到能够实现所要同位素比精确度的流动速率。优选地，所要同位素比精确度为<20δ‰，且更优选地，所要同位素比精确度为<10δ‰。在某些实施例中，未使用降低流动速率的步骤但相反可以能够达成所要同位素比精确度的足够低的流动速率执行样品的全部分离，直到包含具有待定同位素比的至少一种分子物种的洗脱。然而，这类实施例具有增加整体分析时间的缺点。因此，优选的是采用将流动速率降低有限时间(尤其具有待定同位素比的至少一种分子物种从分离装置中洗脱的至少一部分时间)的步骤。
本发明使用耦接到基于液体的样品分离技术(例如LC)尤其在利用有机溶剂时的质谱检测实现精确且准确的同位素比确定。本发明还可允许使用通常顺从LC-MS的电离技术，例如大气压电离(API)，例如电喷物电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)。
分离装置是用于分离液相中的样品的分子物种的样品分离装置。分离装置优选地包括液相色谱(LC)柱，例如用于高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UHPLC)或尺寸排阻色谱(SEC)或离子色谱(IC)的柱。LC柱内直径优选地在0.1到10毫米(mm)范围内，但可采用更小或更大的柱直径。所述类型的色谱可以是例如反相色谱(RPC)或正常相色谱(NPC)。分离装置可包括用于薄层色谱(TLC)的板。优选地，色谱是其中移动相至少部分包括或完全地包括有机溶剂的一种色谱。分离装置可包括毛细管电泳(CE)系统，例如用于毛细管区带电泳(CZE)或包含毛细管凝胶电泳(CGE)的其它电泳技术。
液体移动相可以是水相或有机溶剂或水和有机溶剂的混合物。优选地，液体移动相包括一定量(例如按体积计至少10％、20％、30％、40％或50％有机溶剂)的有机溶剂。液体移动相可包括按体积计至少60、70％、80％、90％或100％有机溶剂)。有机溶剂可以是单一有机溶剂或两种或更多种有机溶剂的混合物。液体移动相组合物可随时间根据预定梯度改变。当使用梯度液体移动相时，梯度的至少一部分包括有机溶剂。液体移动相将大体上借助于至少一个泵流动通过分离装置。
样品可以是(例如)从血、尿、唾液、脑脊髓液提取的样品，或从食品、饲料、尘土、灰尘、工业产品、焚化产品或类似裂解细胞中提取的其它生物材料。
待分析样品可包括单一分子物种，或更典型地包括多种分子物种，其中存在具有待定同位素比的至少一种分子物种。分子物种可根据其在分离装置中的不同滞留时间而分离。可使样品通过注入口或环管从自动取样器传送到移动相中。
具有待定同位素比的至少一种分子物种是或典型地是有机分子。所述至少一种分子物种的分子量优选地小于1000Da，更优选地小于800Da，再更优选地小于600Da，并且甚至更优选地小于300Da。至少一种分子物种的分子量优选地大于45Da，更优选地大于60Da。
含有样品的液体移动相流动通过分离装置，使得优选地在与至少一种其它分子物种分离后，更优选地在至少多种分子物种已由分离装置分离后，包括至少一种分子物种的样品从分离装置中出来(即，样品的多种分子物种在不同滞留时间从分离装置中出来)，且可随后被检测到，即通过下游质谱仪进行质量分析。具有待定同位素比的至少一种分子物种优选地通过分离装置与其它分子物种分离。因此，在优选实施例中，移动相中的样品流动通过分离装置(例如液相色谱柱)以分离样品中的两种或更多种分子物种。更优选地，具有待定同位素比的至少一种分子物种以这种方式与其它分子物种分离(即通过滞留时间分离)。然而，具有待定同位素比的至少一种分子物种以这种方式与样品中的所有其它分子物种分离不是必需的。然而，优选的是分离在质谱中使得靠近具有待定同位素比的至少一种分子物种的质量峰的其它分子物种的干扰峰的存在(即在距同位素峰2m/z单元更近的附近中)最小化。最优选地，在距具有待定同位素比的至少一种分子物种的同位素峰2m/z单元更近的附近中，不存在来自其它分子物种的干扰峰。更优选地，源自具有待定同位素比的至少一种分子物种(即所关注化合物)的质量峰是与大致上共洗脱分子物种的任何其它峰分离的基线。共洗脱物种在上下文中意味着在相同质谱中检测到来自每一物种的峰。
在质谱仪下游执行的质量分析优选地可测量从分离装置共洗脱的两种或更多种分子物种的质荷比(m/z)且由此区别所述两种或更多种分子物种(即具有相同或类似，即重叠、滞留时间)，特别其中共洗脱的分子物种具有不同的m/z。
在将流动速率降低低于第一流动速率之前，液体移动相最初以第一流动速率优选地流动通过分离装置。当流动速率降低时，其优选地降低到低于第一速率的第二流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中出现(即洗脱)的至少一部分时间，即至少一种分子物种在从分离装置中出现的洗脱物中的至少一部分时间。流动速率优选地降低持续至少一种分子物种从分离装置出现的全部时间或至少大致上全部时间。流动速率可从至少一种分子物种开始从分离装置出现之前(例如仅在其之前)的时间至少到当至少一种分子物种的大部分已从分离装置出现时的时间(例如直到当至少一种分子物种已大致完成从分离装置出现的时间)内降低。流动速率可保持降低直到至少一种分子物种的全部已从分离装置出现之后的时间。在已通过这种方式降低流动之后，流动速率可以典型地提高到流动速率降低之前的第一流动速率。流动速率的后续提高优选地发生在至少一种分子物种已大致上完成从分离装置洗脱之后的时间处。因此，可将流动速率再次提高到其原始较高(第一)流动速率，即一旦至少一种分子物种已大致上完成从分离装置洗脱后。一旦至少一种分子物种的洗脱峰大致上结束后，再次典型地提高流动。在一些情况下，流动速率典型地降低至少3倍、或仍较好地至少5倍、或仍更好的至少10倍，或至少100倍。降低倍数典型地对柱大小(直径)具有依赖性。具体的流动速率可因此取决于分离装置的尺寸(例如柱内径(I.D.))。在液相色谱柱和ESI离子源的情况下，在流动速率降低之前流动速率的典型变化的实例是：4mm(I.D.)柱＝800到2000μl/min；2.1mm柱＝150到400μl/min；1mm柱＝30到80μl/min；以及0.5mm柱＝10到30μl/min。期望降低流动速率以使用典型ESI离子源的最低稳定流动速率，其典型地在2到5μl/min范围中。流动速率因此典型地降低：对于4mm柱，160到1000倍；对于2.1mm柱，30到200倍；对于1mm柱，5到40倍；以及对于0.5mm柱，2到15倍。本文中，色谱柱的横截面假定为圆形。
优选地，分离装置是液相色谱(LC)柱(例如HPLC柱或UHPLC柱)。LC柱具有内径并且优选地降低流动速率的步骤包括将流动速率降低到小于由0.06×(以mm为单位的内径)2给定值的一半的以mL/min为单位的值。已凭经验发现这个公式来限定合适的降低的流动速率。在采用LC柱作为分离装置的一些实施例中，设定通过分离装置的液体移动相的流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中洗脱的至少一部分时间(视需要分离的整个时间段)，达到能够实现所要同位素比精确度的流动速率。这个设定流动速率优选地由小于以0.06×(以mm为单位的内径)2给定值的一半的以mL/min为单位的值来给出。同样已发现合适的设定或降低的流动速率大体上低于柱制造商所建议的用于最佳色谱分辨率的流动速率范围的下限的约0.5倍。众所周知可从范德姆特方程(Van Deemter equation)确定色谱中的最佳流动速率，所述范德姆特方程限定最佳流动速率对于移动相的线性流速的依赖性。最佳流动速率还按柱直径的平方进行比例调整(用于圆形横截面柱)。设定或降低的流动速率可低于最佳流动速率(即用于等于理论板(HETP)的极小高度的流动速率)约0.5倍，即由范德姆特方程给定。
HETP＝A+B/u+C.u
其中：
HETP＝等于理论板的高度，柱的分辨力的测量[m]
A＝涡流扩散(Eddy-diffusion)参数[m]
B＝在纵向方向上的洗脱粒子的扩散系数[m2s-1]
C＝对移动相与固定相之间的分析物的质量传递系数的阻力[s]
u＝线速度[m s-1]
HETP与用于HPLC柱的流动速率之间的大体关系的示意性范德姆特曲线图展示于图15中。用于柱的最佳流动速率发生在如所展示的理论板的最小高度处。优选地，本发明中的第一流动速率处于或接近最佳(即，对应于分离装置或柱的最小理论板高度的最佳流动速率)。第一流动速率宜应为最佳流动速率的至少50％，或具有增大偏好，最佳流动速率的至少70％、或至少80％、或至少90％。在一些实施例中，第一流动速率可在如图15中所指示的最佳流动速率的+/-50％的范围内，更优选地在最佳流动速率的+/-30％或+/-20％的范围内，或最优选地在最佳流动速率的+/-10％的范围内。第二流动速率低于第一流动速率但对应于较高理论板高度。较高理论板高度对应于较低色谱分离有效性。然而，已发现在分子物种从分离装置中出现时，这种降低的流动速率引起利用高分辨率准确质谱的同位素比测量值的精确度的提高。理想地，第二流动速率小于最佳流动速率的50％并且，具有增大偏好，可以小于40％或小于30％、或小于20％、或小于10％的最佳流动速率。优选实施例的一些实例可利用以下第一流动速率和第二流动速率：
(i)为至少50％的最佳流动速率的第一流动速率和小于50％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速率相对于第一速率降低至少2倍；
(ii)为至少70％的最佳流动速率的第一流动速率和小于30％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速相对于第一速率降低至少3倍；
(iii)为至少80％的最佳流动速率的第一流动速率和小于20％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速率相对于第一速率降低至少5倍；
(iv)为至少90％的最佳流动速率的第一流动速率和小于10％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速率相对于第一速率降低至少10倍；
(v)为+/-50％的最佳流动速率的第一流动速率和小于50％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速率相对于第一速率降低至少2倍；
(vi)为+/-30％的最佳流动速率第一流动速率和小于30％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速率相对于第一速率降低至少3倍；
(vii)为+/-20％的最佳流动速率的第一流动速率和小于20％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速率相对于第一速率降低至少5倍；
(viii)为+/-10％的最佳流动速率的第一流动速率和小于10％的最佳流动速率的第二流动速率，优选地其中第二流动速率相对于第一速率降低至少10倍。
优选地，第一流动速率和第二流动速率的上述实例还受制于第二流动相对于第一速率降低至少2倍、或至少3倍、或仍较好地至少5倍、或甚至仍较好地至少10倍、或至少20倍、或至少50倍或至少100倍的条件。
流动速率的降低可以不同方式实现。在一个优选实施例中，可降低驱动移动相流动通过分离装置的泵的速度(即，泵抽的压力)。所述泵位于分离装置的上游。在另一优选实施例中，流动可以在分离装置的上游分离以使得穿过分离装置的移动相的流动速率降低，例如使得移动相流动的一部分分流到分离装置的分支流动路径上游中而一部分穿过分离装置。在需要通过分离装置的降低的流动速率时，可启用激活阀门来分流通过支线。在这个实施例中，泵的速度可保持或其可随着流动的分流而改变。可借助于安置在分离装置的移动相上游的流动路径中的T形接头或其它多路接头(3路或更多路)和从控制流入分支流动路径中的接头引导的分支流动路径上定位的至少一个阀门来提供流动的分流。分流流动可引起浪费或再流通或再循环。流动速率不需要在仅两个离散流动速率之间步进但可根据流动速率的程序化梯度而改变。举例来说，流动速率可逐渐降低且接着逐渐提高，或可经历两个或更多个不同梯度的流动降低和/或随后再次经历两个或更多个梯度的流动提高。被配置成降低液体移动相通过分离装置的流动速率的控制器可以是控制包括分离装置(例如LC系统)和质谱仪的分离系统的控制器。控制器优选地包括计算机系统，所述计算机系统例如从所测量的质谱中接收用于所关注峰(即用于具有待定同位素比的分子物种)的滞留时间的输入数据且根据输入数据控制分离系统以降低根据本发明的流动速率。举例来说，控制器可控制分离系统(例如LC系统)的泵的泵速和/或控制一个或多个阀的启用来控制通过分离系统的流动。控制器可被配置成控制通过分离装置的液体移动相的流动，即被配置成使液体移动相以第一流动速率流动通过分离装置持续第一部分时间以及使通过分离装置的液体移动相的流动速率从第一流动速率降低到低于第一流动速率的第二流动速率持续至少一种分子物种从分离装置中洗脱的至少一部分时间。
已从分离装置出现的至少一种分子物种的质量分析优选地在通过使洗脱物从分离装置流动到质谱仪中而使分子物种从分离装置出现时而发生。可替换地，可收集且存储从样品分离装置洗脱的具有待定同位素比的至少一种分子物种用于脱机质量分析。举例来说，洗脱物可收集于孔板中且稍后通过注入或纳米喷雾引入到质谱仪中用于质量分析。
对已从分离装置出现的具有待定同位素比的至少一种分子物种的质量分析优选地执行至少超过在液体移动相的流动速率降低时的时间。流动速率的降低对于具有待定同位素比的至少一种分子物种具有增加峰宽(或洗脱时间，即在洗脱中所耗费的时间)的效果。因此，用于具有待定同位素比的至少一种分子物种的总质量分析时间可通过流动速率的降低，例如通过按峰宽的比率(例如，具有流动降低的峰宽/不具有流动降低的峰宽)的倍数增加测量点的数量而有效地延长。优选地，信号强度未因流动速率的降低而受显著地影响。这是针对当耦接到类似于LC的液体分离时质谱仪中采用的优选的电离方法中的多个(例如电喷雾电离法)的情况。因此，整体流动降低提供更好精确度的质量分析测量值且由此提高同位素比确定的精确度。同位素比精确度大体上按所记录的质谱数的平方根的倒数(近似测量时间)进行调整使得更长测量时间提供更精确的结果。保持流动速率的降低至少长达实现所要精确度所花费的时间。一般来说，使流动速率降低保持长于需要来实现这个精确度的时间并不另外受益，因为可引起不必要的较长分析时间。优选地，所要同位素比精确度是<20δ‰，优选地(以递增的优先次序)<15δ‰，或<10δ‰，或<7δ‰，或<5δ‰，或<3δ‰，或<1δ‰，或<0.5δ‰，或<0.1‰。通过这种方式，分析的持续时间的确定可基于所期望的精确度。作为一实例，如果需要达到1‰精确度，那么可以实验方式确定，例如通过10次扫描所达到的精确度是17‰(一次扫描可得到一个波谱)。因此，可计算出为了1‰精确度需采集至少10×(17‰/1‰)2＝10×289次扫描且可因此设定关于流动速率的实验性参数。因此，在一个方法中，大体上在第一实验中，基于第一数目的测量波谱确定具有第一同位素比精确度的同位素比。基于第一同位素比精确度和第一数目的测量波谱，为了所要第二同位素比精确度(大体上优于第一同位素比精确度)，可确定第二数目的测量波谱以便实现第二同位素比精确度。随后，大体上在第二实验中，可使用第二数目的测量波谱确定具有第二同位素比精确度的同位素比。
所述方法可另外包括校准从至少两种同位素分子的质量峰的强度中确定的至少一个同位素比。同位素比测量值的准确性可通过将至少一个原始同位素比(即直接地从质谱中确定的比率)与用于一个或多个已知标准的一个或多个同位素比进行校准而提高，如此项技术中已知。举例来说，通过在质谱仪上测量一个或多个已知标准的一个或多个同位素比，可获得一个或多个校准因数且接着应用到至少一个原始同位素比以提供经校准的同位素比。
质量分析可包括记录分子物种的质谱而不仅是特定质量峰。举例来说，使用静电轨道阱质量分析仪，或FT-ICR质量分析仪，或TOF质量分析仪可记录分子物种的分子物种的质谱。使用较慢或扫描质量分析仪例如四极质量分析仪或磁式扇形质量分析仪，或使用多收集器磁式扇形质量分析仪，可在用液相分离技术(例如LC)获得的时间标度中，以足够的分辨率监测仅某些质量峰。
所确定的分子物种的至少一个同位素比可以是13C/12C、14C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O、17O/16O或34S/32S、37Cl/35Cl、81Br/79Br、29Si/28Si、30Si/28Si等(或这类比率的倒数)中的至少一个。比率的确定大体上是重同位素与轻同位素的比率(R)，例如:
同位素比可确定为德耳塔符号(δ符号)。报导得自IRMS分析的稳定同位素比的大体方式是使用德耳塔符号。δ值是未知样品相对于已知同位素值的标准物(即，参考物质)的稳定同位素比，计算为：
优选地，从质量分析中确定的同位素比是校正的同位素比，其中使用测量的同位素比与从多个标准物或参考物质(即已知正确同位素比或δ值)中获得的正确(已证)同位素比(本文中还意味着正确δ值)的曲线图来校正从质量分析中测量的同位素比。
本发明中的同位素比确定是基于强度，例如基于对分子物种的同位素体的质量峰的强度进行比较(即发现分子物种的同位素体的质量峰的比率)，其中同位素体具有不同标称质量(典型地相差一个或两个标称质量单元)。也就是说，不执行样品分子物种与CO2等的燃烧。具有待定同位素比的至少一种分子物种优选地具有与移动相的分子(例如移动相的溶剂)不同的质荷比，且因此至少一种分子物种的所记录的质谱并不受溶剂干扰(无来自移动相分子的同质异位干扰)。这避免通过燃烧技术对基于有机溶剂和/或包含含碳缓冲液的移动相进行同位素比分析将产生与所关注的有机样品分子相同的氧化或还原产物物质的问题。典型地，具有待定同位素比的至少一种分子物种的质谱中的单同位素峰(用于单同位素同位素体)，例如从电喷雾源获得的质谱中的[M+H]+峰可为所关注的特定轻同位素(例如，12C、14N、16O、1H、32S)提供同位素丰度且A+1同位素体或A+2同位素体(大体上具有与单同位素同位素体相同的电荷)的A+1峰或A+2峰可为所关注的特定重同位素(例如，13C、15N、18O、2H、34S)提供同位素丰度。同位素比确定可因此包括将单同位素质量峰A与A+1质量峰或A+2质量峰的强度进行比较以提供所关注的轻同位素与重同位素的同位素比。已发现质谱仪，尤其包括轨道阱或FT-ICR质量分析仪的这类质谱仪的高分辨力能够分辨具有所关注的特定重同位素(13C、或15N、或18O、或2H、或34S等)的同位素体的特定A+1峰(或A+2峰)，即分辨所述峰与具有另一重同位素的同位素体的其它A+1标称质量峰(或A+2标称质量峰)。应优选地从处于相同标称质量的至少任何其它质量峰中分辨出用于同位素比确定的每一同位素体质量峰，所述其它质量峰大于20％，或更优选地大于10％，或最优选地大于5％的所述同位素体质量峰的强度。举例来说，在本发明的一实施例中，所分辨的A+1峰的同位素峰图案展示可充分地分辨13C同位素体峰与15N同位素体峰或2H峰。另外，所分辨的A+2峰的同位素峰图案展示出可充分地分辨18O同位素体峰与13C2同位素体峰或13C15N同位素体峰。因此，本发明实现经多重取代的同位素体以及经单一取代的同位素体的分析。因此，质量分析优选地分辨单同位素峰与A+1峰和A+2峰。质量分析另外优选地将两个或更多个A+1同位素体和/或两个或更多个A+2同位素体进行彼此分辨。轻同位素优选地选自：12C、14N、16O、1H、32S、35Cl、79Br、28Si且重同位素优选地选自：13C、14C、15N、17O、18O、2H、34S、37Cl、81Br、29Si、30Si。本文中，当提到处于相同标称质量的峰时，其并不意味着处于相同标称质荷比(m/z)的峰。举例来说，在由带多电荷离子(例如+5或更高、+10或更高…)引起的同位素质量峰情况中，数个同位素峰(例如A+1峰、A+2峰、A+3峰)将以相同标称m/z呈现(尽管其不会具有相同标称质量)。本发明并不涉及对这类带多电荷的同位素峰(具有不同标称质量)进行彼此分辨。相反，本发明涉及分辨特定A+n组的峰(n＝1、2、3…)的各种同位素体，即分辨处于相同标称质量的峰。因此，当涉及‘处于相同标称质量的峰’时，这实际上是涉及其中任何带多电荷的峰已变成单电荷峰的质谱。换句话说，对于带多电荷的离子，其并不意味着对A+1峰、A+2峰、A+3峰…进行彼此分辨，但相反是对处于相同A+n(A+1、A+2、A+3…)组的多个同位素体峰进行彼此分辨。
优选地，同位素体未标记为同位素，即它们未人工地富含于至少一个同位素中。因此，本发明并不主要涉及所谓的同位素标记实验，其中一个样品以同位素标记而另一样品不标记且确定以同位素标记的分子物种与未标记的分子物种的比率，在本发明中，至少一种分子物种衍生于一个样品，而非与标记实验中一样衍生于两个或更多个样品。因此，所确定的分子物种的同位素比优选地是分子物种的天然或固有同位素比，即标记的分子物种与非标记的分子物种的丰度的比率。同位素的天然或固有丰度的测量值广泛用于环境化学、地理化学及法医分析中以及用于生物、生物化学及生物医学的研究及应用中。
质量分析优选地通过高分辨力(R)执行。质量分析优选地通过足够的分辨力(R)执行来分辨至少一种分子物种的同位素分子的质量峰。质量分析优选地通过足够高以分辨处于用于确定同位素比的至少一种同位素分子的标称质量(优选地处于用于确定同位素比的同位素体中的每一个的标称质量)的两个最丰富的质量峰(分子物种的同位素体或来自其它分子物种的非同位素体干扰)的质量分辨力来执行。所分辨的处于相同标称质量的两个最丰富的质量峰宜为两个同位素体(由于优选地液体分离步骤将确保不存在具有用于确定同位素比的同位素体的2m/z单元内的质量峰的其它分子物种)。处于标称质量的两个最丰富的质量峰优选地是如果未分辨将各自显著地促成确定同位素比(例如，通过促成处于标称质量的同位素体的峰强度的>20％、或>10％、或>5％)。质量分析优选地通过足够高以分辨两个最丰富的A+1同位素体和/或两个最丰富的A+2同位素体(其中A是单同位素质量峰)的质量分辨力来执行。质量分析优选地通过充足的分辨力(R)执行以分辨以下至少一种分子物种的同位素体对中的至少一种：13C和12C同位素体、15N和14N同位素体、18O和16O同位素体、34S和32S同位素体。分辨力优选地足够高以分辨将另外显著地促成(例如，对所观察到的峰丰度的大于20％、或10％或5％促成作用)所关注同位素比的同位素体。质量分析优选地通过充足分辨力(R)执行以分辨由于13C同位素体和15N同位素体引起的A+1峰(其中A是单同位素质量峰)。质量分析另外优选地通过充足分辨力(R)执行以分辨由于18O同位素体、13C2同位素体及13C15N同位素体引起的A+2峰。分辨力R(处于m/z 200)优选地为至少50,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少400,000或至少500,000。在用采集时间权衡时，分辨力R(处于m/z 200)优选地在50,000到400,000、或100,000到400,000，更优选地50,000到300,000或100,000到300,000，或甚至更优选地200,000到300,000的范围内。在一优选实施例中，分辨力足够高以分辨将另外显著地促成所关注的同位素比的全部同位素体(例如，将对所观察到的峰丰度具有大于20％、或10％或5％的贡献的同位素体)。然而，分辨力不适宜显著地高于需要来分辨这类同位素体的分辨力(因为以更高分辨力操作大体上减缓质量分析的步骤)。
本发明的方法和设备可提供典型地为<20δ‰(即<2δ％)，优选地<10δ‰(<1δ％)的同位素比精确度(可重复性)。优选地，流动速率降低到这种流动速率和/或用于至少足够长来达到所要同位素比精确度。优选地，所要同位素比精确度为<20δ‰、或<15δ‰、或<10δ‰、或<7δ‰、或<5δ‰、或<3δ‰、或<1δ‰、或<0.5δ‰或<0.1δ‰。
质谱仪优选地包括任何合适的电离源。优选的电离源是兼容耦接到液体分离装置(例如LC柱)的电离源。这些优选的电离源可以是电喷物电离(ESI)源、纳米喷雾电离源、其它大气压电离(API)源(例如大气压化学电离(APCI)源)。但可使用其它电离源，例如电子碰撞(EI)电离、化学电离(CI)等。
质谱仪优选地包括具有质量分辨力的质量分析仪，所述质量分辨力足够高以分辨处于用于确定具有待定同位素比的分子物种的同位素比的同位素体的标称质量的至少两个最丰富的质量峰。质量分辨力宜足够高以分辨处于用于确定同位素比的每一同位素体的标称质量的至少两个最丰富的质量峰。两个最丰富的质量峰可以是处于相同标称质量的分子物种的两个最丰富的同位素体的质量峰。用于确定同位素比的处于各自不同标称质量的分子物种的同位素体优选地为处于所述标称质量的两个最丰富的同位素体中的一个。质谱仪可包括一种质量分析仪或以下类型的质量分析仪：离子阱、RF离子阱、静电离子阱、静电轨道阱(例如轨道阱)、傅里叶变换(Fourier transform，FTMS)分析仪、傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，FT-ICR)分析仪、飞行时间(TOF)分析仪、线性TOF、正交加速度TOF(OA-TOF)、反射极TOF、多反射TOF(MR-TOF)、四极滤质器、磁式扇形质量分析仪。优选地，质谱仪包括具有高分辨率和准确质量(HR-AM)的质量分析仪。优选地，质谱仪包括能够以一个获取或扫描测量所有的所关注m/z的质量分析仪。优选的质谱仪包括静电离子阱、静电轨道阱(例如轨道阱)、或FT-ICR，或例如单一反射或多反射(MR)-TOF的TOF(优选地是MR-TOF)。
质量分析包括将电离源中的至少一种分子物种电离来产生至少一种分子物种的离子接着使用质量分析仪对离子进行质量分析。因此前提是质谱仪包括电离源和质量分析仪。方法优选地包括对电离源的下游和质量分析仪的上游的离子进行滤质。质谱仪因此在电离源与质量分析仪之间优选地包括滤质器。通过这种方式，来自离子源的离子可穿过路径上的滤质器到质量分析仪。滤质器可选择离子的较窄的m/z窗用于注入到质量分析仪中用于质量分析，即m/z窗来包含具有待定同位素比的分子物种的m/z。这可使得质量分析仪充满更多数量的具有待定同位素比的分子物种的离子。溶剂基质分子优选地还可通过与较窄m/z窗一起操作的滤质器来从离子串流移除，所述较窄m/z窗包含待分析的分子物种的m/z。优选的滤质器是四极滤质器。通过滤质器选择的较窄m/z窗可以是20amu宽或更窄，或15amu宽或更窄，或10amu宽或更窄。具有待定同位素比的分子物种的离子，尤其所滤质的离子优选地累积于离子存储器，例如离子源的线性离子阱下游中，并且其中存在滤质器。所积聚离子可随后从离子存储器中喷射到质量分析仪以用于质量分析。优选实施例利用弯曲线性阱(或C阱)作为离子存储器并且将离子从C阱中喷射到作为质量分析仪的静电轨道阱(例如轨道阱)。
至少一种分子物种的至少一个同位素比的确定可包括确定至少一个位置特定同位素比。在质量分析之前，离子视需要可碎片化，使得可对碎片进行质量分析由此获得关于同位素比的可获得的位置特定信息。因此，在此类实施例中，确定至少一种分子物种的至少一个同位素比的步骤可包括确定关于所确定的同位素比的位置特定信息。质谱仪因此可包括电离源的碎片化单元下游，例如相对于质量分析仪定位，使得所关注分子物种可被碎片化且接着对碎片进行质量分析。例如，可通过滤质器过滤离子，随后碎片化且接着视需要在将碎片存储于离子存储器中后对碎片进行质量分析。通过这种方式，从通过质量分析仪测量的碎片的同位素质量图案中，可获得关于同位素比的位置特定信息。碎片化单元可以是用于碰撞诱导解离(CID)的碰撞单元，或用于电子转移解离(ETD)，或电子捕获解离(ECD)或光诱发解离(PID)等的单元。
通过使用用于确定位置特定同位素比和经多重取代的同位素体的组合装置，将了解分析分子物种来确定经多重取代的同位素体的位置特定同位素比是可能的。
附图说明
图1展示示意性地展示本发明的实施例的流程图。
图2示意性地展示用于用于本发明中的LC/MS的设备的实施例。
图3示意性地展示用于用于本发明中的LC/MS的设备的另一实施例。
图4示意性地展示用于本发明中的质谱仪仪器的实施例。
图5展示从注入MS实验中的咖啡碱的样品获得的代表性质谱。
图6展示咖啡碱的测量和模拟同位素图案。
图7展示来自注入MS实验的咖啡碱的测量同位素比(196/195)与已知证实δ13C值的曲线图。
图8展示用于LC/MS比较实验中的溶剂梯级梯度。
图9展示在LC/MS比较实验中获得的色谱和质谱。
图10展示咖啡碱的测量同位素比与来自比较LC/MS实验的已知证实δ13C值的曲线图。
图11展示用于具有降低流动步骤的LC/MS实验中的溶剂梯级梯度。
图12展示在使用降低流动的LC/MS实验中获得的色谱、质谱和LC泵压力与时间特征图。
图13展示咖啡碱的测量同位素比与来自使用降低的流动的LC/MS实验的已知证实δ13C值的曲线图。
图14展示显示洗脱分子物种的同位素体的同位素质量峰图案的示意性质谱。实线表示同位素比为待定的相同分子物种的同位素体的质量峰。虚线表示外部干扰的质量峰。
图15展示HETP与用于HPLC柱的流动速率之间的示意性关系。
具体实施方式
为了能够更详细地理解本发明，现将借助于实例并参考附图描述实施例。
参看图1，描述一种关于LC柱方法，但应理解本发明适用于如上文所描述的其它基于液体的分离装置。在第一步骤102中，在LC系统中以常规方式将含有待分离的多种组分的样品注入到液体移动相中。典型地，多种组分为待分离的。在其它实施例中，单一组分可存在于样品中。
可使用如图2中示意性地展示的设备。在这个实施例中，将质谱仪10介接到LC系统20。LC系统包含用于容纳待分析样品的自动取样器24和包含驱动液体移动相的至少一个泵(例如注射泵)的泵系统28和将样品注入到移动相中的样品注入器。优选的质谱仪10是来自赛默科技的例如HF，其包含轨道阱质量分析仪。优选的LC系统是来自赛默科技的UHPLC系统。将装载有样品的移动相泵抽通过LC柱30。优选的LC柱是来自赛默科技的2.1x100mm的Accucore aQ HPLC柱。质谱仪10和LC系统20典型地处于包含计算机系统的控制器15的控制下。控制器典型地处理来自质谱仪的数据获取和获得数据的数据处理。数据处理包含对来自质量分析数据的同位素比的确定。控制器还控制LC系统20的泵系统以降低根据本发明的移动相的流动速率。将理解在其它实施例中，用于LC系统或分离装置的控制器可以是来自用于质谱仪的控制器的单独控制器。
用于本发明中的另一设备示意性地展示在图3中，更详细地描述在下文中。
样品包括是具有待定同位素比的分子物种的至少一种组分。移动相将典型地包括有机溶剂。如果使用梯度溶剂，那么梯度的至少一部分将典型地包括有机溶剂。然而，在其它实施例中，可使用含水类、甚至完全地含水的移动相。
在步骤104中，使用泵系统，移动相借助于泵流动通过LC柱到质谱仪并且样品的组分中的一种或多种通过LC柱变得分离，因为其通过不同滞留时间从柱中洗脱。离开柱的洗脱物及移动相流动到下游质谱仪以用于检测。在另一类型的实施例中，从LC柱中洗脱的组分可收集和/或存储在一个或多个单独隔间中并且随后脱机分析(例如在单独脱机质谱仪中)。例如：可在孔板中进行LC样品收集并且稍后通过MS注入或电喷物或纳米喷雾来分析。
在优选实施例中，质谱仪能够在一个获取循环中分析从柱中洗脱的组分中的每一种的完全质谱，即化合物的所有质量(m/z)峰可记录在单一获取循环中。包括高分辨率和准确质量(HR-AM)分析仪的谱仪是优选的。优选的谱仪包含以下类型的质量分析仪：傅里叶变换(FT)质量分析仪、典型地是FT、FT-ICR质量分析仪的静电轨道阱(例如轨道阱质量分析仪)，及单一或多反射TOF质量分析仪。在这类分析仪中，在一个获取循环期间(即从将离子单一注入到分析仪中)测量化合物的所有质量(m/z)峰(本文中被称作‘并行’测量值)。
质谱仪典型地随时间分析洗脱物，例如以设定抽样间距，以提供质量色谱图，即在整个滞留时间中的一系列数据点处测量的一系列质谱。在步骤106中，使流动穿过LC柱的液体移动相的流动速率降低持续具有待定同位素比的分子物种从柱中出现的至少一部分时间。优选实施例中的流动速率仅在所关注分子物种开始从柱中出现之前(例如从前1与100sec之间，更优选地在前1与50sec之间，并且甚至更优选地在前1与10ses之间开始的时间处)降低。速率保持降低直到至少当大部分的分子物种已从柱中出现的时间，例如直到当分子物种已大致上完成从柱中出现时的时间，或优选地直到已实现同位素比确定中的所要精确度。流动速率可保持降低直到所有的分子物种已从柱中出现后的时间。在一些情况下，流动速率典型地降低至少3倍、或仍较好地至少5倍、或仍更好的至少10倍，或至少100倍。降低倍数典型地对如上文所描述的柱大小(直径)具有依赖性。典型地采用降低5与1000之间或5与200之间的倍数的流动速率。在已通过这种方式降低流动之后，流动速率可以典型地提高到在流动速率降低之前的原始流动速率。降低流动速率的时间可从先前测量值(即先前LC实验)确定，或其可从数据库得知，或可凭经验得知。可替换地，降低流动速率的时间可通过在质谱仪分析洗脱物质时而即时的检测所关注分子物种的一个或多个质谱峰来触发。
流动速率的降低可以不同方式实现。在一个优选实施例中，驱动移动相流动通过柱的泵的速度(即泵抽的压力)降低。在另一优选实施例中,流动可通过启用阀门在柱的上游分流以使得移动相流动的一部分分流到分离装置的分支流动路径上游中且仅一部分穿过柱，由此提供通过柱的降低的流动速率。这类系统示意性地展示在图3中。在图3中，系统组件大体上类似于图2使得类似附图标号指示类似组件。然而，在图3的设定中，已将T形接头40插入到LC柱的流动路径上游中且连接到HPLC切换阀门50。阀门可切换于两个位置之间：i)阻断端口，及ii)连接到通向废物接收器60的限流毛细管的端口。如果阀门切换到位置i)，那么所有流动经过柱。然而，当阀门切换到位置ii)时，仅流动的一部分经过所述柱(即，10％)，由此延长从柱中洗脱峰所花费的时间并且使得主要峰变宽。切换阀50处于控制器15的控制下。
在步骤108中，在样品洗脱期间的一点处，质谱仪记录对应于具有待定同位素比的至少分子物种的来自LC柱的所关注峰的质谱。如所提到，质谱仪在一系列随时间变化的数据采集周期中记录洗脱液从LC柱中出现的质谱。通常在从0分钟(或样品注入)直到至少具有待定同位素比的分子物种的质谱已记录于其洗脱峰上的整个滞留时间范围内记录质谱。如所描述，对于具有待定同位素比的分子物种，流动速率在所关注洗脱峰增加峰宽的时段期间(或洗脱时间，即在洗脱中所耗费的时间)降低。因此，用于具有待定同位素比的分子物种的总质量分析时间通过流动速率的降低，即通过将测量点数量增大峰宽度的比率(具有流动降低的峰宽/无流动降低的峰宽)的倍数来延长。对于当耦接到类似于LC的液体分离时在质谱仪中采用的优选的电离方法中的多个，例如电喷雾电离法，流动速率的降低并不显著地影响信号强度。因此，整体结果是质谱的精确度的增加。优选地，同位素比精确度为<20δ‰，优选地(以递增的优先次序)<15δ‰，或<10δ‰，或<7δ‰，或<5δ‰，或<3δ‰，或<1δ‰，或<0.5δ‰，或<0.1‰。
所记录的质谱包含同位素图案，从所述同位素图案中分辨多个同位素峰(即由于具有待定同位素比的分子物种的不同同位素体而产生的峰)是可能的。从对同位素分辨质谱的分析中可确定同位素比(步骤110)。举例来说，从质谱中的两个或更多个分辨的同位素峰的强度(通常其中一个是单同位素峰)中，确定元素的同位素比(视需要表达为德耳塔(δ)值)是可能的。确定同位素比的优选的所关注元素为C、N、O、H、S、P、Cl、Br及Si。一些共同的待定同位素比包含：13C/12C、14C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O、17O/16O或34S/32S、37Cl/35Cl、81Br/79Br、29Si/28Si、30Si/28Si等。
本发明中的同位素比确定可基于强度，例如基于对分子物种的同位素体的质量峰的强度进行比较(即发现分子物种的同位素体的质量峰的比率)，其中同位素体具有不同标称质量(典型地相差一个或两个标称质量单元)。典型地，具有待定同位素比的至少一种分子物种的质谱中的单同位素峰(用于单同位素同位素体)，例如从电喷雾源获得的质谱中的[M+H]+峰可为所关注特定轻同位素(例如，12C、14N、16O、1H、32S)提供同位素丰度且A+1同位素体或A+2同位素体的A+1峰或A+2峰(其中A为单同位素质量峰)可为所关注特定重同位素(例如，13C、15N、18O、2H、34S)提供同位素丰度。同位素比确定可因此包括将单同位素质量峰A与A+1质量峰或A+2质量峰的强度进行比较以提供所关注的轻同位素与重同位素的同位素比。已发现质谱仪(尤其是包括轨道阱质量分析仪的质谱仪)的高分辨力能够分辨具有所关注的特定重同位素(13C、或15N、或18O、或2H、或34S等)的同位素体的特定A+1峰(或A+2峰)，即从具有另一重同位素的同位素体的其它A+1标称质量峰(或A+2标称质量峰)中分辨出特定同位素物峰。应优选地从处于相同标称质量的至少任何其它质量峰中分辨出用于同位素比确定的每一同位素体质量峰，所述其它质量峰大于20％，或更优选地大于10％，或最优选地大于5％的所述同位素体质量峰的强度。举例来说，在本发明的一实施例中，所分辨的A+1峰的同位素峰图案展示可充分地分辨13C同位素体峰与15N同位素体峰或2H峰。另外，所分辨的A+2峰的同位素峰图案展示可充分地分辨18O同位素体峰与13C2同位素体峰或13C15N同位素体峰。因此，本发明实现经多重取代的同位素体以及经单一取代的同位素体的分析。因此，质量分析优选地分辨单同位素峰与A+1峰和A+2峰。质量分析另外优选地将两个或更多个A+1同位素体和/或两个或更多个A+2同位素体进行彼此分辨。
在一些实施例中，本发明中的同位素比确定可基于强度，例如基于将分子物种的同位素体的质量峰的强度进行比较(即发现分子物种的同位素体的质量峰的强度的比率)，其中同位素体具有相同标称质量。举例来说，同位素比确定可基于15N同位素体峰与13C同位素体峰的比率。
质量分析优选地通过充足分辨力(R)来执行，以分辨至少一种分子物种的同位素体的质量峰，例如以分辨处于用于确定同位素比的同位素体中的至少一个的标称质量(优选地处于用于确定同位素比的同位素体中的每一个的标称质量)的两个最丰富的质量峰。分辨处于相同标称质量的两个最丰富的质量峰典型地为两个同位素体(由于液体分离步骤将典型地意味着不存在具有在2m/z单元内的用于确定同位素比的同位素体中的质量峰的其它分子物种)。处于标称质量的两个最丰富的质量峰优选地为在非分辨时将各自显著地促成待定同位素比(例如通过促成>20％、或>10％、或>5％的处于标称质量的同位素体的峰强度)的峰。质量分析优选地通过足够高以分辨两个最丰富的A+1同位素体和/或两个最丰富的A+2同位素体(其中A是单同位素质量峰)的质量分辨力来执行。
参看图14，展示显示洗脱分子物种的同位素体的同位素质量峰图案的示意性质谱。实线表示同位素比为待定的相同分子物种的同位素体的质量峰。虚线表示其它分子物种外部干扰的质量峰。展示标称质量A的单同位素峰P1，其与处于相同标称质量A的较小外部干扰质量峰i1分辨。也指示处于标称质量A+1的同位素体峰P2，其连同单同位素峰P1一起使用以发现分子物种的同位素比，即P2(A+1)峰与P1(A)峰的强度的比率，可表达为德尔塔值。分辨P2A+1同位素体峰与两个其它A+1同位素体峰(P3和P4)以及外部干扰峰i2。可见至少两个最丰富的A+1质量峰(P2和P4)彼此进行质量分辨。分辨P2与P4特别地重要，由于P4大于20％的P2峰的强度并且因此将显著地影响同位素比确定。分辨P2与P3也为优选的，由于P3大于10％的P2峰的强度。作为一实例，A+1峰(P2)可以是13C同位素体且连同单同位素峰P1一起可用于确定13C/12C比率。另外，A+1峰(P3)可以是15N同位素体且连同单同位素峰P1一起可用于确定15N/14N比率。类似地，通过A+2标称质量峰，展示同位素物峰P5、P6、P7和P8以及外部干扰峰i3，其所有与彼此进行质量分辨且可与单同位素峰P1一起用于确定同位素比，例如，相差两个标称质量单元的同位素(例如34S/32S或18O/16O)的同位素比，或经多重取代的同位素体(例如13C2或13C15N)的同位素比。重要的是，至少两个最丰富的A+2质量峰(P6与i3)彼此进行质量分辨。
不同工作流程可用于从质谱中确定同位素比。用于从质谱中确定同位素比的一个工作流程的实例通过以下步骤给出。
1.对于所获取的每一质谱(这包含处于没有峰从柱中洗脱的滞留时间的那些质谱)确定所关注的两个同位素峰的峰强度。这典型地通过采用围绕所关注峰的准确质量的较窄质量窗内的最高强度点来完成。
对于除FT类以外的质量分析仪，峰集成可为代替峰的高度的选择方法。
2.可选步骤：确定色谱图的面积中的两个质量峰的平均背景强度，其中没有所关注峰以及没有峰干扰所关注的质量洗脱。这可以是平均值、几何平均值或确定这种值的任何其它类似方法。这个步骤可包含异常值分析以及去除。这个步骤可包含其它步骤(类似于偏移测试)来确保色谱图的选定部分适用于背景确定。
3.可选步骤：对于横跨洗脱峰的每一频谱，从所关注峰中减去平均背景强度。
4.对于每一频谱，通过所关注第一同位素峰的强度(视需要减去背景)除以所关注另一峰的强度来确定同位素比。
5.可选步骤：使用统计工具来验证且改进所确定的比率。举例来说：i)分析且去除异常值，ii)确定数据中是否存在任何时间趋势(仪器零点漂移)，iii)绘制比率与峰强度的曲线图以消除对峰强度的任何依赖性等。
6.基于从步骤4(或视需要从步骤5中)获得的数据组确定与数据组相关联的平均同位素比和标准误差。
在数据评估的可替代模式中，可首先平均化频谱，随后减去背景且将最终同位素比确定为平均化频谱中的所关注两个峰的比率。
实验实例
现将描述多个实验实例，本发明的范围非限制性来辅助理解本发明。
样品和参考材料
咖啡碱用作模拟化合物来证明本发明的有效性。咖啡碱的三个标准同位素参考材料获自USGS：USGS61、USGS62、USGS63(Schimmelmann,A、Qi,H、Coplen,T.B.、Brand、W.A.、Fong,J.、Meier-Augenstein,W.、Kemp,H.F.、Toman,B.、Ackermann,A.、Assonov,S.和Aerts-Bijma,A.T，2016，《用于氢、碳和氮稳定同位素比测量的有机参考材料：咖啡碱、正烷烃、脂肪酸甲酯、甘氨酸、l-缬胺酸、聚乙烯和油(Organic Reference Materials forHydrogen,Carbon,and Nitrogen Stable Isotope-Ratio Measurements:Caffeines,n-Alkanes,Fatty Acid Methyl Esters,Glycines,l-Valines,Polyethylenes,and Oils)》，分析化学，88(8)，第4294-4302页)。另外的咖啡碱样品获自Sigma(SigmaC-8960，批号#30K0169)并且使用耦接到EA Isolink元素分析仪的Delta V质谱仪特性化。标准的δ13C参考值(用于USGS61-63)和测量值(用于来自Sigma的样品，本文中指示为BRE001)在表1中列出。
表1-用于δ13C的标准参考值和测量值
样品名称 δ13C[‰]
USGS61 -35.05
USGS62 -14.97
USGS63 -1.17
BRE001 -39.21
实例1-注入测量(比较实例)
制得约10μg/ml的表1中列出的样品于甲醇/水50:50(v:v)中的样品溶液并且直接注入到来自赛默飞世尔科技的标准赛默科技轨道阱质谱仪中。仪器的示意图展示于图4中，所述仪器是用于本发明中的优选质谱仪。质谱仪200包括产生离子的电喷雾离子源202，所述离子在通过有源光束导引离子光学件206引导到四极滤质器208之前进入RF透镜204。质量隔离窗可通过滤质器设定来将具有所要质量的离子发射到下游离子阱(C阱)210，其中在将离子喷射到轨道阱质量分析仪212用于质量分析之前可积聚离子。如果需要，那么可将离子发射通过C阱210到下游更高能量碰撞分解(HCD)单元214，在所述下游更高能量碰撞分解单元处，离子可在传回到C阱210之前经碎片化并且随后在轨道阱质量分析仪212中进行质量分析。
使用以下参数操作质谱仪：
-使用注射泵注入
-质谱仪的质量隔离范围190到200m/z
-在m/z 200下分辨力＝240k
-利用10次微扫描，即，在轨道阱中执行10次扫描用于经历傅里叶变换的每一瞬态
-目标AGC值1E6
-15分钟总数据获取，其对每一数据文件产生约160次扫描(每一扫描利用10次微扫描)。
图5展示获自注入到质谱仪的咖啡碱的BRE001样品的代表性质谱。对应于[M+H]+离子的单同位素咖啡碱峰标记于195.09处且A+1峰在196.09处。由于所述仪器的高分辨率，对同位素峰的质谱更靠近查看展示将在196.09处的13C同位素峰与在196.08处的15N同位素峰良好地分辨出，但未分辨出如图6中所展示的17O同位素峰。然而，相较于13C丰度中的变化，可忽略17O的天然丰度使得这个对于研究非常可接受的。
图6中的频谱的顶部行展示咖啡碱的测量同位素图案并且证明分辨力。频谱的较低行表示咖啡碱的频谱的模拟以展示与测量数据的良好对应性。图6中的峰标注指示咖啡碱同位素体(例如15N、13C、13C2等)类型。
使用具有USGS61的标准/样品界定顺序作为界定标准依序测量所有样品。表2展示对标示为类型STD标准物和标示为类型UNK的样品中的每一个的测量结果。图7展示测量同位素比(196/195)对比已知标准δ13C值的曲线并且还展示线性校准曲线。注入实验中的每一单一测量值的标准误差为约0.5‰到0.6‰并且方法的准确性为约2‰到2.5‰。
表2
实例2-不降低流动的LC/MS测量(比较实例)
将10μg/ml(+/-0.02μg/ml)的表1中列出的样品于甲醇/水20:80中的溶液用于实验中。如图2中示意性地展示的LC/MS系统与以下LC设定一起使用：
-具有自动取样器和四元泵的赛默飞世尔科技系统
-10μl注入(对应于100ng注入)
-赛默飞世尔科技Accucore aQ柱；2.1×100mm、2.6mm粒径
-溶剂A：水、0.1％甲酸(FA)、2mM乙酸铵
-溶剂B：甲醇、0.1％FA、2mM乙酸铵
-溶剂梯度100％A(0到0.5分钟)；50％A/50％B(0.5到3.0分钟)；20％A/80％B(3.0到3.3分钟)；100％A(3.3到5分钟)。图8展示用于实验中的溶剂梯级梯度。
使用以下参数操作质谱仪：
-质量扫描/隔离范围190到200m/z
-在m/z 200下分辨力＝240k
-每一瞬态处理1次微扫描
-目标AGC值1E6
-4分钟总数据获取
获取和数据评估策略采用以下：
-样品/标准界定
-USGS1作为参考/标准
-界定设定的8次重复(总计49次注入)
-数据评估使用USGS1测量值来校正偏移
-δ值的直接计算而无另外的校正
图9展示典型色谱图和质谱。通过约0.5分钟的咖啡碱的LC峰宽，这导致整个LC峰的约40次扫描。表3展示测量的结果且图10展示测量的同位素比对比连同线性校准曲线的已知标准δ13C值的曲线图。每一单一测量值的标准误差为约4‰到6‰。方法的准确性为约5‰。
表3
实例3：具有降低流动的LC/MS测量值
将10μg/ml(+/-0.02μg/ml)的表1中列出的样品于甲醇/水20:80中的样品溶液用于实验中。如图3中示意性地展示的LC/MS系统与以下LC设定一起使用：
-具有自动取样器和四元泵的赛默飞世尔科技
-10μl注入(对应于100ng注入)
-赛默飞世尔科技Accucore aQ柱；2.1100mm×、2.6mm粒径
-溶剂A：水、0.1％FA、2mM乙酸铵
-溶剂B：甲醇、0.1％FA、2mM乙酸铵
-梯度100％A(0到0.5分钟)；50％A/50％B(0.5到8.5分钟)；20％A/80％B(8.5到9.0分钟)；100％A(9.0到11.0分钟)(梯级梯度)
-分流阀门在t＝2.75分钟和t＝8.00分钟时切换
图11展示用于实验中的溶剂梯级梯度。在这个实验中，使用降低的流动设定。如图3中所展示，将T形管插入到LC柱之前的流动路径中且连接到HPLC切换阀门。阀门可切换到两个位置中的任一个：i)阻断端口，或ii)连接到将浪费的限流毛细管的端口。如果阀门切换到位置i)，那么所有流动经过柱。当切换到位置ii)时，仅流动的一部分经过柱，从而延长从柱中洗脱峰所花费的时间。这显著地导致峰变宽。在这种情况下，峰宽从0.5分钟延伸到约6分钟。由于电喷雾电离法的特征，信号强度未因流动速率的降低而显著地受到影响，从而有效地延长分析时间并且将测量点的数量乘以峰宽度的比率。将了解也可使用如图2所展示的设定通过将泵速(压力)降低所需要持续时间来实现流动速率的降低。降低流动速率的方式产生更好精确度的同位素比测量值。
使用以下参数操作质谱仪：
-质量扫描/隔离范围190到200m/z
-在m/z 200下分辨力＝240k
-每一瞬态处理1次微扫描
-目标AGC值1E6
-4分钟总数据获取
获取和数据评估策略采用以下：
-样品/标准界定
-USGS1作为参考/标准
-界定设定的8次重复(总计49次注入)
-数据评估使用USGS1测量值来校正偏移
-δ值的直接计算；无另外的校正
图12展示典型色谱图、质谱和LC泵压力与时间的特征曲线。通过咖啡碱的LC峰宽增加到约6分钟，这导致整个LC峰的约400次扫描。表4展示测量的结果且图13展示测量的同位素比与连同线性校准曲线的已知标准δ13C值的曲线图。每一单一测量值的标准误差为约0.7‰到0.9‰且方法的准确性为约2‰。可见本发明的降低的流动方式能够使用耦接到液相色谱或另一液体分离的高分辨率质谱(例如，轨道阱质谱)实现对分子物种的精确及准确的同位素比的可靠确定。
表4
在本文中，关于质量分析的术语质荷比(m/z)意味着涉及m/z的质量分析的任何量，例如质量、时间(例如TOF质量分析中的飞行时间)、频率(例如，傅里叶变换质量分析中的离子振荡频率)等。
本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(“举例来说”、“诸如”、“例如”以及类似语言)的使用意图仅更好地说明本发明，并且除非另外要求，否则并不指示对本发明的范围的限制。本说明书中的任何语言均不应解释为指示实践本发明所必需的任何未要求要素。
如本文所使用(包含在权利要求书中)，除非上下文以其它方式指示，否则本文中的术语的单数形式应被解释为包含复数形式，且反之亦然。举例来说，除非上下文另外指示，否则本文中(包括在权利要求书中)的单数参考物，如“一(a)”或“一(an)”意指“一个或多个”。
在整个本说明书的描述和权利要求书中，词语“包括”、“包含”、“具有”及“含有”以及所述词的变化形式(例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”等)意指“包含但不限于”，并且不意图(并且并不)排除其它组件。
本发明也涵盖准确术语、特征、值及变化等，在这些术语情况下、特征、值及变化等结合例如约、围绕、一般来说、大致上、基本上、至少等的术语使用，(即，“约3”也应涵盖确切3或“大致上恒定”也应涵盖确切恒定)。
术语“至少一个”应理解为意指“一个或多个”，并且因此包含具有一个或多个组件的两个实施例。此外，参考用“至少一个”描述特征的独立权利要求的从属权利要求在所述特征被提及为“所述”以及“所述至少一个”时均具有相同含义。
除非另有陈述或上下文另有要求，否则本说明书中描述的任何步骤可按任何次序执行或同时执行。
本说明书中所公开的全部特征可以任何组合来组合，但其中此类特征和/或步骤中的至少一些互斥的组合除外。确切地说，本发明的优选的特征适用于本发明的所有方面且可以任何组合形式使用。同样，可单独地使用(不以组合形式)以非必需组合形式描述的特征。

Claims (25)

1.一种同位素比质谱法的方法，包括：
使含有样品的液体移动相以第一流动速率流动通过分离装置，所述样品包括具有待定同位素比的至少一种分子物种，其中所述第一流动速率是对应于所述分离装置的最小理论板高度的最佳流动速率的至少50％；
使流动通过所述分离装置的所述液体移动相的所述流动速率从所述第一流动速率降低到第二流动速率持续至少一种分子物种从所述分离装置中出现的至少一部分时间，所述第二流动速率低于所述第一流动速率但对应于所述分离装置的更高理论板高度；
至少在所述流动速率降低到所述第二流动速率时，对已从所述分离装置中出现的所述至少一种分子物种进行质量分析；以及
根据所述质量分析从所述至少一种分子物种的至少两个同位素体的质量峰的强度中确定所述至少一种分子物种的至少一个同位素比，其中所述质量分析是通过足够高以分辨处于所述同位素体中的至少一种的标称质量的所述两个最丰富的质量峰的质量分辨力来执行。
2.一种同位素比质谱法的方法，包括：
使含有样品的液体移动相以第一流动速率流动通过分离装置，所述样品包括具有待定同位素比的至少一种分子物种，其中所述第一流动速率是对应于所述分离装置的最小理论板高度的最佳流动速率的至少50％；
使流动通过所述分离装置的所述液体移动相的所述流动速率从所述第一流动速率降低到第二流动速率持续所述至少一种分子物种从所述分离装置中出现的至少一部分时间，所述第二流动速率低于所述第一流动速率但对应于所述分离装置的更高理论板高度；
至少在所述流动速率降低到所述第二流动速率时，对已从所述分离装置中出现的所述至少一种分子物种进行质量分析；以及
根据所述质量分析从所述至少一种分子物种的至少两个同位素体的质量峰的强度中确定所述至少一种分子物种的至少一个同位素比，其中用于所述同位素比确定的每一同位素体质量峰是从处于相同标称质量的大于所述同位素体质量峰的所述强度的20％的至少任何其它质量峰中分辨的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分离装置为液相色谱柱，排阻色谱(SEC)柱，离子色谱(IC)柱、薄层色谱(TLC)板或毛细管电泳(CE)系统。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述分离装置是液相色谱柱，其中所述柱具有内部直径且其中降低所述流动速率包括使所述流动速率从所述第一速率降低到所述第二流动速率，所述第二流动速率具有小于由0.06×(以mm为单位的内部直径)2给定值的一半的以mL/min为单位的值。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述液体移动相包括有机溶剂。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中至少大致在所述至少一种分子物种从所述分离装置中洗脱的全部时间内,所述流动速率降低到所述第二流动速率。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述同位素比确定具有<20δ‰的同位素比精确度。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中一旦所述至少一种分子物种已大致完成从所述分离装置中洗脱，则所述流动速率从所述第二流动速率提高。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二流动速率相较于所述第一流动速率降低至少5倍。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一流动速率是所述最佳流动速率的至少80％且所述第二流动速率小于所述最佳流动速率的20％，其中所述第二流动速率相对于所述第一速率降低至少5倍，或至少10倍。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中通过降低使所述液体移动相流动通过所述分离装置的泵的泵速，使所述流动速率从所述第一流动速率降低到所述第二流动速率。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中通过将所述分离装置的上游移动相的所述流动分离来使所述流动速率从所述第一流动速率降低到所述第二流动速率,从而使得降低流动速率的移动相穿过所述分离装置。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述质量分析是利用高分辨率准确质量(HR-AM)质谱仪执行的。
14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述质量分析是通过足够高以分辨所述至少一种分子物种的所述两个最丰富的A+1同位素以和/或所述两个最丰富的A+2同位素体的质量分辨力来执行的，其中A是单同位素质量峰。
15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述质量分析是通过至少50,000的分辨力来执行的。
16.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述质量分析是使用包括质量分析仪的质谱仪来执行，所述质量分析仪选自：静电轨道阱质量分析仪、FT-ICR质量分析仪或飞行时间TOF质量分析仪。
17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述质量分析包括在将所述离子喷射到质量分析仪用于质量分析之前对所述至少一种分子物种进行电离。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述质量分析包括在质量分析之前使所述电离的至少一种分子物种碎片化。
19.根据权利要求18所述的方法，其中确定所述至少一种分子物种的至少一个同位素比包括确定关于所确定的同位素比的位置特定信息。
20.根据任一前述权利要求所述的方法，其中确定所述至少一种分子物种的至少一个同位素比包括将单同位素质量峰A与A+1质量峰或A+2质量峰的所述强度进行比较以提供所关注的轻同位素与重同位素的同位素比。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述质量分析分辨两个或更多个A+1同位素体和/或两个或更多个A+2同位素体。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述轻同位素选自：12C、14N、16O、1H、32S、35Cl、79Br、28Si且所述重同位素选自13C、14C、15N、17O、18O、2H、34S、37Cl、81Br、29Si、30Si。
23.根据任一前述权利要求所述的方法，其中确定所述至少一种分子物种的至少一个同位素比包括将具有相同标称质量的两个峰与两个A+1质量峰或两个A+2质量峰的所述强度进行比较。
24.根据任一前述权利要求所述的方法，另外包括将从至少两个同位素体的质量峰的所述强度中确定的所述至少一个同位素比对照一个或多个已知标准物的一个或多个同位素比进行校准。
25.一种用于同位素比质谱法的设备，包括：
用于分离液体移动相中的样品的组分的分离装置，所述样品的组分包括具有待定同位素比的至少一种分子物种；
耦接到所述分离装置下游的质谱仪，所述质谱仪用于在所述至少一种分子物种从所述分离装置中洗脱时而对所述至少一种分子物种进行质量分析并且根据所述质量分析确定所述至少一种分子物种的至少一个同位素比，其中所述质量分析是通过足够高以分辨处于所述同位素体中的至少一个的标称质量的所述两个最丰富的质量峰的质量分辨力来执行；以及
控制器，被配置成控制通过所述分离装置的所述液体移动相的所述流动,以使所述液体移动相以第一流动速率流动通过所述分离装置持续第一部分时间以及使通过所述分离装置的所述液体移动相的所述流动速率从所述第一流动速率降低到低于所述第一流动速率的第二流动速率持续所述至少一种分子物种从所述分离装置中洗脱的至少一部分时间。
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