JP2642025B2 - 磁性微粒子による細胞への生体物質導入方法及び磁気による細胞の選択的濃縮・分離法 - Google Patents
磁性微粒子による細胞への生体物質導入方法及び磁気による細胞の選択的濃縮・分離法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、磁性微粒子により細胞
へ遺伝子、酵素等の生体物質を導入する方法及び該方法
により導入された細胞を磁気により選択的に濃縮又は分
離する方法に関するものである。
へ遺伝子、酵素等の生体物質を導入する方法及び該方法
により導入された細胞を磁気により選択的に濃縮又は分
離する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】磁性微粒子について、P.J.Robinsonら(B
iotechnol. Bioeng., 15, 603-606(1973))は、バイオリ
アクター用の酵素の固定化担体として、その回収操作が
容易な点に着目して、磁性微粒子を酵素の固定化担体と
して用いる研究報告を行っている。この報告では、酸化
鉄微粒子又はセルロース−酸化鉄複合体にα−キモトリ
プシン又はβ−ガラクトシダーゼを固定化し、完全混合
型バイオリアクターに用いて、その磁性担体を磁気的に
容易に凝集、分離できることが示されている。
iotechnol. Bioeng., 15, 603-606(1973))は、バイオリ
アクター用の酵素の固定化担体として、その回収操作が
容易な点に着目して、磁性微粒子を酵素の固定化担体と
して用いる研究報告を行っている。この報告では、酸化
鉄微粒子又はセルロース−酸化鉄複合体にα−キモトリ
プシン又はβ−ガラクトシダーゼを固定化し、完全混合
型バイオリアクターに用いて、その磁性担体を磁気的に
容易に凝集、分離できることが示されている。
【０００３】また、磁性を有する鉄の超微粒子（短径約
30nm、長径約500nm)を合成高分子でカプセル化し、抗体
や酵素をその外部表面に固定化することにより磁気で誘
導可能な酵素などを固定化した超微粒子状の担体が作ら
れている（「超微粒子 創造科学技術」林主税他編、三
田出版会発行、231-235 頁）。ここでは、モデル酵素と
してグルコースオキシダーゼを固定化した磁性超微粒子
担体を用い小型のバイオリアクターにより反応を行わせ
た結果、単位体積当りの反応速度が高く、また超微粒子
の担体を磁気で容易に濃縮、回収できることが示されて
いる。
30nm、長径約500nm)を合成高分子でカプセル化し、抗体
や酵素をその外部表面に固定化することにより磁気で誘
導可能な酵素などを固定化した超微粒子状の担体が作ら
れている（「超微粒子 創造科学技術」林主税他編、三
田出版会発行、231-235 頁）。ここでは、モデル酵素と
してグルコースオキシダーゼを固定化した磁性超微粒子
担体を用い小型のバイオリアクターにより反応を行わせ
た結果、単位体積当りの反応速度が高く、また超微粒子
の担体を磁気で容易に濃縮、回収できることが示されて
いる。
【０００４】更に、磁性粒子を分散させた高分子の微粒
子として DYNABEADS（登録商標）が日本ダイナル（株）
より輸入販売されている。この製品は、抗体その他の蛋
白質や核酸などの磁気的分離を目的として酸化第二鉄
（フェライト、Fe2O3）をポリスチレンビーズに分散さ
せた微粒子（直径2.8 及び4.5 μm ）であり、この表面
に抗体をコートしたり、ある種の蛋白質又はヌクレオチ
ドなどを結合したビーズは磁石を併用することにより細
胞の分離や精製を簡便な操作で速やかに行うことができ
る。
子として DYNABEADS（登録商標）が日本ダイナル（株）
より輸入販売されている。この製品は、抗体その他の蛋
白質や核酸などの磁気的分離を目的として酸化第二鉄
（フェライト、Fe2O3）をポリスチレンビーズに分散さ
せた微粒子（直径2.8 及び4.5 μm ）であり、この表面
に抗体をコートしたり、ある種の蛋白質又はヌクレオチ
ドなどを結合したビーズは磁石を併用することにより細
胞の分離や精製を簡便な操作で速やかに行うことができ
る。
【０００５】しかし、上述した生体物質固定化磁性微粒
子のうち、担体として磁性微粒子と高分子の複合体を用
いるものは、撃ち込み用の微粒子としては密度が低く、
衝突の衝撃力が弱いため不適当である。また、粒径が標
的の細胞の大きさに比べて充分小さくない。従って、細
胞壁を有する植物細胞内への導入は不可能であり、事実
その前例はない。また、ガラスの細管を用いるマイクロ
インジェクション法では原理的に可能かもしれないが、
１回で多数の細胞に導入することは困難である。
子のうち、担体として磁性微粒子と高分子の複合体を用
いるものは、撃ち込み用の微粒子としては密度が低く、
衝突の衝撃力が弱いため不適当である。また、粒径が標
的の細胞の大きさに比べて充分小さくない。従って、細
胞壁を有する植物細胞内への導入は不可能であり、事実
その前例はない。また、ガラスの細管を用いるマイクロ
インジェクション法では原理的に可能かもしれないが、
１回で多数の細胞に導入することは困難である。
【０００６】また、J.C. Sanfordらによる米国特許第5,
100,792 号明細書には遺伝子を微粒子担体に付着させ、
高速で細胞内に導入し、その機能を発現させる方法（パ
ーティクルガン法）が記載されており、ここでは微粒子
の持つ衝突エネルギーを大きくするために、主に金やタ
ングステンを用いている。この米国特許第5,100,792号
明細書において、実施例で具体的に用いているのは直径
４μm のタングステン微粒子であり、発明の詳細な説明
中には、微粒子の粒径について約10nmないし数μm と記
載され、高密度（約10〜20ｇ／cm3 ）のフェライトクリ
スタル、金、タングステン、その他の金属粒子、低密度
（１〜２ｇ／cm3 ）のガラス、ポリスチレン、ラテック
スビーズが記載されている。
100,792 号明細書には遺伝子を微粒子担体に付着させ、
高速で細胞内に導入し、その機能を発現させる方法（パ
ーティクルガン法）が記載されており、ここでは微粒子
の持つ衝突エネルギーを大きくするために、主に金やタ
ングステンを用いている。この米国特許第5,100,792号
明細書において、実施例で具体的に用いているのは直径
４μm のタングステン微粒子であり、発明の詳細な説明
中には、微粒子の粒径について約10nmないし数μm と記
載され、高密度（約10〜20ｇ／cm3 ）のフェライトクリ
スタル、金、タングステン、その他の金属粒子、低密度
（１〜２ｇ／cm3 ）のガラス、ポリスチレン、ラテック
スビーズが記載されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、物理的な性
質の磁性を有する微粒子を用いて遺伝子などの生体物質
の細胞内への導入とその機能発現を行わせることを目的
とする。また、本発明は、細胞内に導入された磁性微粒
子が磁気的に誘導可能である点を利用し、例えば遺伝子
が発現したり生理機能が発現した細胞や細胞塊、器官だ
けを選択的、特異的に濃縮、分離することを目的とす
る。
質の磁性を有する微粒子を用いて遺伝子などの生体物質
の細胞内への導入とその機能発現を行わせることを目的
とする。また、本発明は、細胞内に導入された磁性微粒
子が磁気的に誘導可能である点を利用し、例えば遺伝子
が発現したり生理機能が発現した細胞や細胞塊、器官だ
けを選択的、特異的に濃縮、分離することを目的とす
る。
【０００８】従来の磁性粒子や磁性粒子を含むプラスチ
ックビーズ (複合された磁性ミクロスフェアー) の応用
例などの場合は全て細胞外に磁性粒子があり、特に植物
などのように硬い細胞壁を有する細胞の内側に磁性微粒
子を入れることは現在まで不可能であり、本発明まで世
界的に実証されていなかった。
ックビーズ (複合された磁性ミクロスフェアー) の応用
例などの場合は全て細胞外に磁性粒子があり、特に植物
などのように硬い細胞壁を有する細胞の内側に磁性微粒
子を入れることは現在まで不可能であり、本発明まで世
界的に実証されていなかった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本願第一の発明は、生体
物質を固定化した磁性微粒子を細胞内に高速で撃ち込む
ことを特徴とする生体物質の細胞内への導入方法であ
り、本願第二の発明は、該導入方法により磁性微粒子が
導入された細胞を磁気により選択的に濃縮又は分離する
ことを特徴とする細胞の選択的濃縮・分離法である。
物質を固定化した磁性微粒子を細胞内に高速で撃ち込む
ことを特徴とする生体物質の細胞内への導入方法であ
り、本願第二の発明は、該導入方法により磁性微粒子が
導入された細胞を磁気により選択的に濃縮又は分離する
ことを特徴とする細胞の選択的濃縮・分離法である。
【００１０】本発明に用いる磁性微粒子における磁気的
性質としては、磁性体なら如何なるものでもよく、例え
ば強磁性、常磁性、超常磁性物質が用いられる。該磁性
微粒子の材質としては、例えば金属、金属酸化物、非金
属−金属複合体、セラミック複合体、上記物質との天
然、合成有機化合物を含む有機磁性体、及びその複合
体、蛍光性物質、光応答性物質、光磁気的機能性物質、
電子伝達物質及び電気化学的機能性物質、量子力学的機
能性物質、半導体物質が挙げられるが、磁気的な誘導分
離や濃縮を行う際にその微粒子を含む細胞等の磁気によ
る移動速度が大きいことから、特に強磁性化合物、例え
ばマグネタイト、その他鉄、コバルト、ニッケル等の強
磁性元素の化合物微粒子、またクロム、マンガン、アル
ミニウム、イットリウム、テルル、タングステン、チタ
ン等を含む磁性体微粒子が好ましい。かかる強磁性化合
物のうち、マグネタイトは生体に対して毒性を示さず、
かつ安定である点において特に好ましいものである。
性質としては、磁性体なら如何なるものでもよく、例え
ば強磁性、常磁性、超常磁性物質が用いられる。該磁性
微粒子の材質としては、例えば金属、金属酸化物、非金
属−金属複合体、セラミック複合体、上記物質との天
然、合成有機化合物を含む有機磁性体、及びその複合
体、蛍光性物質、光応答性物質、光磁気的機能性物質、
電子伝達物質及び電気化学的機能性物質、量子力学的機
能性物質、半導体物質が挙げられるが、磁気的な誘導分
離や濃縮を行う際にその微粒子を含む細胞等の磁気によ
る移動速度が大きいことから、特に強磁性化合物、例え
ばマグネタイト、その他鉄、コバルト、ニッケル等の強
磁性元素の化合物微粒子、またクロム、マンガン、アル
ミニウム、イットリウム、テルル、タングステン、チタ
ン等を含む磁性体微粒子が好ましい。かかる強磁性化合
物のうち、マグネタイトは生体に対して毒性を示さず、
かつ安定である点において特に好ましいものである。
【００１１】該磁性微粒子の粒径としては、最大粒径が
対象細胞の1/5 位から超微粒子のサイズまで可能であ
り、平均粒径５nm〜100nm の超微粒子又はその凝集粒子
を用いることができ、好ましくは平均粒径10nm〜数μm
の磁性微粒子が用いられる。該磁性微粒子の密度は、通
常１〜21ｇ／cm3 、好ましくは３〜８ｇ／cm3 である。
従って、マグネタイト（密度：約５ｇ／cm3 ）、ヘマタ
イト（密度：約５ｇ／cm3 ）、コバルト鉄酸化物（密
度：約３ｇ／cm3 ）、バリウムフェライト（密度：約５
ｇ／cm3 ）、その他密度が８ｇ／cm3 程度の炭素鋼、タ
ングステン鋼、ＫＳ鋼や、密度が４〜５ｇ／cm3 程度の
酸化鉄と亜鉛、マグネシウム、マンガン又はニッケルと
の鉄化合物(Ferroxcube)材料の微粒子や希土類コバルト
磁石（密度：約８ｇ／cm3 ）の微粒子を用いることが好
ましい。
対象細胞の1/5 位から超微粒子のサイズまで可能であ
り、平均粒径５nm〜100nm の超微粒子又はその凝集粒子
を用いることができ、好ましくは平均粒径10nm〜数μm
の磁性微粒子が用いられる。該磁性微粒子の密度は、通
常１〜21ｇ／cm3 、好ましくは３〜８ｇ／cm3 である。
従って、マグネタイト（密度：約５ｇ／cm3 ）、ヘマタ
イト（密度：約５ｇ／cm3 ）、コバルト鉄酸化物（密
度：約３ｇ／cm3 ）、バリウムフェライト（密度：約５
ｇ／cm3 ）、その他密度が８ｇ／cm3 程度の炭素鋼、タ
ングステン鋼、ＫＳ鋼や、密度が４〜５ｇ／cm3 程度の
酸化鉄と亜鉛、マグネシウム、マンガン又はニッケルと
の鉄化合物(Ferroxcube)材料の微粒子や希土類コバルト
磁石（密度：約８ｇ／cm3 ）の微粒子を用いることが好
ましい。
【００１２】該磁性微粒子の形態は、細胞壁や細胞膜に
貫入、突破しやすくするため、非球形で角のあるものが
好ましく、また同一断面積で比べると球状の微粒子より
も慣性モーメントが大きく細胞壁や細胞膜に貫入、突破
しやすいため、針状で断面が棒状のものが好ましい。本
発明において、上記磁性微粒子に固定化させる生体物質
とは、動物、植物、原生動物、微生物等の生理活性物
質、細胞内器官、生物微粒子等をいい、例えば遺伝子、
酵素、抗体、蛋白質、フェロモン、アロモン、ミトコン
ドリア、ウィルス等が挙げられる。
貫入、突破しやすくするため、非球形で角のあるものが
好ましく、また同一断面積で比べると球状の微粒子より
も慣性モーメントが大きく細胞壁や細胞膜に貫入、突破
しやすいため、針状で断面が棒状のものが好ましい。本
発明において、上記磁性微粒子に固定化させる生体物質
とは、動物、植物、原生動物、微生物等の生理活性物
質、細胞内器官、生物微粒子等をいい、例えば遺伝子、
酵素、抗体、蛋白質、フェロモン、アロモン、ミトコン
ドリア、ウィルス等が挙げられる。
【００１３】本発明において、固定化とは、生体物質を
磁性微粒子に、主に物理的吸着やその他生物化学的親和
力等によりその粒子に保持することをいう。上記生体物
質の上記磁性微粒子への固定化は、例えば、該磁性微粒
子の溶液と生体物質の緩衝溶液とを混合し、弾丸の先端
に載せて風乾することにより行うことができる。
磁性微粒子に、主に物理的吸着やその他生物化学的親和
力等によりその粒子に保持することをいう。上記生体物
質の上記磁性微粒子への固定化は、例えば、該磁性微粒
子の溶液と生体物質の緩衝溶液とを混合し、弾丸の先端
に載せて風乾することにより行うことができる。
【００１４】本発明において対象となる細胞としては、
動物細胞 (ヒト細胞を含む) 、植物細胞、その他の生物
細胞、器官、組織等が挙げられる。本発明において、
「高速で撃ち込む」とは、微粒子の初速が毎秒50〜400m
程度であることをいい、例えば、米国特許第5,100,792
号明細書、特願平4-25626 号明細書等に記載のパーティ
クルガン法により行うことができる。
動物細胞 (ヒト細胞を含む) 、植物細胞、その他の生物
細胞、器官、組織等が挙げられる。本発明において、
「高速で撃ち込む」とは、微粒子の初速が毎秒50〜400m
程度であることをいい、例えば、米国特許第5,100,792
号明細書、特願平4-25626 号明細書等に記載のパーティ
クルガン法により行うことができる。
【００１５】上述のようにして磁性微粒子が導入された
細胞は磁気により選択的に濃縮又は分離することができ
る。この濃縮又は分離は、例えば、次のようにして行う
ことができる。例えば、細胞を分散させた溶液を試験管
等の透明容器に移し、その側壁に磁石を密着させて、細
胞を濃縮する。その後、他の溶液部分をピペット等で除
くことにより磁性微粒子が入っている細胞のみが分離さ
れる。必要に応じて、この操作を数回繰り返す。
細胞は磁気により選択的に濃縮又は分離することができ
る。この濃縮又は分離は、例えば、次のようにして行う
ことができる。例えば、細胞を分散させた溶液を試験管
等の透明容器に移し、その側壁に磁石を密着させて、細
胞を濃縮する。その後、他の溶液部分をピペット等で除
くことにより磁性微粒子が入っている細胞のみが分離さ
れる。必要に応じて、この操作を数回繰り返す。
【００１６】本発明は、遺伝子導入、組換え、組換え体
の育成の効率化；生理効果 (植物、動物) のある物質の
導入と磁気誘導、選択分離；抗癌剤等の薬剤；遺伝子組
換え細胞を用いるバイオリアクター (分析用−工業生産
用) ；磁気的遺伝子組換えのセンシング；細胞内の情報
を磁気的手段とその他のあらゆる化学的、生化学的、物
理的性質、方法を媒介として組み合わせた方法により外
部から認識する手法等に応用することができる。
の育成の効率化；生理効果 (植物、動物) のある物質の
導入と磁気誘導、選択分離；抗癌剤等の薬剤；遺伝子組
換え細胞を用いるバイオリアクター (分析用−工業生産
用) ；磁気的遺伝子組換えのセンシング；細胞内の情報
を磁気的手段とその他のあらゆる化学的、生化学的、物
理的性質、方法を媒介として組み合わせた方法により外
部から認識する手法等に応用することができる。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるも
のではない。 （実施例１） マグネタイトによる遺伝子の導入、発現 磁性微粒子としてマグネタイト (平均粒径 0.3μm 、密
度 5.2ｇ／cm3 ) ( 図１参照) を用い、パーティクルガ
ン法により微粒子発射装置（特願平4-25626 号明細書記
載の装置を使用）を用いて遺伝子の導入とその発現を行
った。
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるも
のではない。 （実施例１） マグネタイトによる遺伝子の導入、発現 磁性微粒子としてマグネタイト (平均粒径 0.3μm 、密
度 5.2ｇ／cm3 ) ( 図１参照) を用い、パーティクルガ
ン法により微粒子発射装置（特願平4-25626 号明細書記
載の装置を使用）を用いて遺伝子の導入とその発現を行
った。
【００１８】遺伝子にはプラスミドＤＮＡ, ｐＢＩ２２
１ (米国、クローンテック社製) を用いた。このプラス
ミドはβ−グルクロニダーゼ (ＧＵＳ）遺伝子を有し、
これはカリフラワーモザイクウィルス (ＣａＭＶ) ３５
Ｓプロモーター（ｐＣａＭＶ３５Ｓ）とノパリン合成酵
素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーター (pAnos)との間に接
続されている。
１ (米国、クローンテック社製) を用いた。このプラス
ミドはβ−グルクロニダーゼ (ＧＵＳ）遺伝子を有し、
これはカリフラワーモザイクウィルス (ＣａＭＶ) ３５
Ｓプロモーター（ｐＣａＭＶ３５Ｓ）とノパリン合成酵
素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーター (pAnos)との間に接
続されている。
【００１９】プラスミドＤＮＡのマグネタイト微粒子へ
のコーティングとプラスチック弾丸への付着操作は以下
のように行った。50mgのマグネタイト微粒子を 100％エ
タノール１mlに懸濁させてある溶液を作り、この溶液と
プラスミドＤＮＡのＴＥ緩衝溶液（ＤＮＡ濃度 200〜50
0ng ／μl の間）と適量混ぜ、軽く超音波を照射して暫
時静置した後、混合溶液を１〜２μl プラスチック弾丸
の先端に載せて風乾した。
のコーティングとプラスチック弾丸への付着操作は以下
のように行った。50mgのマグネタイト微粒子を 100％エ
タノール１mlに懸濁させてある溶液を作り、この溶液と
プラスミドＤＮＡのＴＥ緩衝溶液（ＤＮＡ濃度 200〜50
0ng ／μl の間）と適量混ぜ、軽く超音波を照射して暫
時静置した後、混合溶液を１〜２μl プラスチック弾丸
の先端に載せて風乾した。
【００２０】遺伝子の導入処理は微粒子発射装置によ
り、タバコ懸濁培養細胞ＢＹ−２（北海道大学農学部よ
り入手）の移植４日目のものを無菌下で漉紙上に集め
て、それを装置内の試料台に載せ次の発射条件下で風乾
した弾丸を用いて行った。発射条件は試料までの距離を
10cmとし、試料を格納する容器内の真空度を 100mmHgに
調節し、ポリアセタール弾丸の加速に用いる窒素ガスの
供給圧力は約28kg／cm2 とした（初速毎秒 200〜250m程
度）。また、この際、対照実験として遺伝子がマグネタ
イト微粒子へ付着してないものもタバコ培養細胞と同じ
発射条件で撃ち込んだ。
り、タバコ懸濁培養細胞ＢＹ−２（北海道大学農学部よ
り入手）の移植４日目のものを無菌下で漉紙上に集め
て、それを装置内の試料台に載せ次の発射条件下で風乾
した弾丸を用いて行った。発射条件は試料までの距離を
10cmとし、試料を格納する容器内の真空度を 100mmHgに
調節し、ポリアセタール弾丸の加速に用いる窒素ガスの
供給圧力は約28kg／cm2 とした（初速毎秒 200〜250m程
度）。また、この際、対照実験として遺伝子がマグネタ
イト微粒子へ付着してないものもタバコ培養細胞と同じ
発射条件で撃ち込んだ。
【００２１】遺伝子がタバコ培養細胞に導入され、その
機能が発現していることを評価するため人工基質の５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド(X
-Gluc)を用いたアッセイを行った。マグネタイト微粒子
を撃ち込んだ後、25℃で24時間インキュベートしたタバ
コ培養細胞をX-Glucのリン酸緩衝液に漉紙ごと浸して37
℃で24時間インキュベートした。この結果、漉紙のうえ
に青いスポットが約10箇所程観察された。
機能が発現していることを評価するため人工基質の５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド(X
-Gluc)を用いたアッセイを行った。マグネタイト微粒子
を撃ち込んだ後、25℃で24時間インキュベートしたタバ
コ培養細胞をX-Glucのリン酸緩衝液に漉紙ごと浸して37
℃で24時間インキュベートした。この結果、漉紙のうえ
に青いスポットが約10箇所程観察された。
【００２２】このスポットの実体顕微鏡写真を図２に示
す。約 100以上の青いタバコ細胞（細胞塊）が確認され
た。これは、遺伝子が導入された結果、その働きにより
タバコ細胞中に酵素のβ−グルクロニダーゼが形成さ
れ、人工基質のX-Glucを酵素分解し、青色の色素のイン
ジゴチンが生成したためである。このタバコ細胞を少量
取り生物顕微鏡で観察した一例を図３に示す。遺伝子が
発現した細胞の色は発現していない細胞と比較して明ら
かに色が青く変化しているのが確認された。また、詳細
に観察すると、細胞内の核小体、核領域そして細胞質が
青色であることが観察された。この実験では全部で約10
00細胞以上に遺伝子の導入、発現が確認され、マグネタ
イトにより初めて生体物質の遺伝子の導入、発現に成功
した。
す。約 100以上の青いタバコ細胞（細胞塊）が確認され
た。これは、遺伝子が導入された結果、その働きにより
タバコ細胞中に酵素のβ−グルクロニダーゼが形成さ
れ、人工基質のX-Glucを酵素分解し、青色の色素のイン
ジゴチンが生成したためである。このタバコ細胞を少量
取り生物顕微鏡で観察した一例を図３に示す。遺伝子が
発現した細胞の色は発現していない細胞と比較して明ら
かに色が青く変化しているのが確認された。また、詳細
に観察すると、細胞内の核小体、核領域そして細胞質が
青色であることが観察された。この実験では全部で約10
00細胞以上に遺伝子の導入、発現が確認され、マグネタ
イトにより初めて生体物質の遺伝子の導入、発現に成功
した。
【００２３】（実施例２） 遺伝子を付着させたマグネ
タイト微粒子の導入処理をした細胞の選択的濃縮、分離 上記の、プラスミドｐＢＩ２２１をコートしたマグネタ
イト微粒子を撃ち込み遺伝子の導入処理を行いインキュ
ベートしたタバコ培養細胞を適量取り、リン酸緩衝液に
懸濁し、ガラス製小型試料容器に移してこの細胞の磁気
誘導の実験を行った。容器を振り、タバコ細胞を一様に
分散させた（図４）。その後、磁石 (文房具用磁石付紙
クリップ) を容器右上部に密着させた２分後の写真を図
５に示す。図５から明らかなように容器内の大部分のタ
バコ細胞が容器の右側面上部に濃集しており、磁性を有
するマグネタイト微粒子を含む細胞だけが磁気により選
択的に分離、濃縮された。また、対照実験として単にマ
グネタイト微粒子とタバコ培養細胞を混合させた場合に
ついて同じ条件で実験を行ってみた。この場合、まずマ
グネタイト微粒子だけが速やかに磁石の近くに集まり、
粗大粒子を形成した。最初に一部のタバコ細胞が粒子の
動きに影響されて移動するのが認められたが、磁石によ
る濃縮操作を３回ほど行うと磁性のマグネタイト微粒子
だけが移動、凝集してタバコ細胞は全く磁気に感応して
動かなくなった。
タイト微粒子の導入処理をした細胞の選択的濃縮、分離 上記の、プラスミドｐＢＩ２２１をコートしたマグネタ
イト微粒子を撃ち込み遺伝子の導入処理を行いインキュ
ベートしたタバコ培養細胞を適量取り、リン酸緩衝液に
懸濁し、ガラス製小型試料容器に移してこの細胞の磁気
誘導の実験を行った。容器を振り、タバコ細胞を一様に
分散させた（図４）。その後、磁石 (文房具用磁石付紙
クリップ) を容器右上部に密着させた２分後の写真を図
５に示す。図５から明らかなように容器内の大部分のタ
バコ細胞が容器の右側面上部に濃集しており、磁性を有
するマグネタイト微粒子を含む細胞だけが磁気により選
択的に分離、濃縮された。また、対照実験として単にマ
グネタイト微粒子とタバコ培養細胞を混合させた場合に
ついて同じ条件で実験を行ってみた。この場合、まずマ
グネタイト微粒子だけが速やかに磁石の近くに集まり、
粗大粒子を形成した。最初に一部のタバコ細胞が粒子の
動きに影響されて移動するのが認められたが、磁石によ
る濃縮操作を３回ほど行うと磁性のマグネタイト微粒子
だけが移動、凝集してタバコ細胞は全く磁気に感応して
動かなくなった。
【００２４】このように、細胞内にマグネタイトを有す
るタバコ細胞だけを選択的に磁気により濃縮、分離でき
ることが確認された。 （実施例３） タバコ培養細胞形質転換体の育成 前記実施例と同様の条件下で、プラスミドＤＮＡだけを
ｐＢＩ１２１としてマグネタイト微粒子にコートして同
様にタバコ培養細胞に導入した。今回実験に用いたプラ
スミドＤＮＡは植物の染色体内への組換えを起こさせ
る。
るタバコ細胞だけを選択的に磁気により濃縮、分離でき
ることが確認された。 （実施例３） タバコ培養細胞形質転換体の育成 前記実施例と同様の条件下で、プラスミドＤＮＡだけを
ｐＢＩ１２１としてマグネタイト微粒子にコートして同
様にタバコ培養細胞に導入した。今回実験に用いたプラ
スミドＤＮＡは植物の染色体内への組換えを起こさせ
る。
【００２５】バイナリーベクターｐＢＩ１２１を図６に
示す。プラスミドＤＮＡ、ｐＢＩ１２１にはレポーター
遺伝子として、発現部位を染色により観察できるβ−グ
ルクロニダーゼ (ＧＵＳ）遺伝子をもつ。この遺伝子は
植物での発現を可能にするため植物で働くプロモーター
(promoter, P)とターミネーター (ポリアデニル化部
位、poly-adenylation, pA) に囲まれている。ＮＰＴII
は、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター (Pnos) と
同遺伝子のターミネーター (pAnos)に、ＧＵＳはカリフ
ラワーモザイクウイルス (ＣａＭＶ) の３５Ｓプロモー
ター (pCaMV 35S)とpAnos に囲まれている。また、マー
カー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を持ってい
る。
示す。プラスミドＤＮＡ、ｐＢＩ１２１にはレポーター
遺伝子として、発現部位を染色により観察できるβ−グ
ルクロニダーゼ (ＧＵＳ）遺伝子をもつ。この遺伝子は
植物での発現を可能にするため植物で働くプロモーター
(promoter, P)とターミネーター (ポリアデニル化部
位、poly-adenylation, pA) に囲まれている。ＮＰＴII
は、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター (Pnos) と
同遺伝子のターミネーター (pAnos)に、ＧＵＳはカリフ
ラワーモザイクウイルス (ＣａＭＶ) の３５Ｓプロモー
ター (pCaMV 35S)とpAnos に囲まれている。また、マー
カー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を持ってい
る。
【００２６】マグネタイトを撃ち込んだ細胞を上記の実
施例のように磁気で選択的に分離回収するスクリーニン
グを行い、その後ジェネティシン等の抗生物質を含む培
地で薬剤耐性細胞のスクリーニングを行った。この際、
磁気的スクリーニングを行った実験と行わなかった実験
の両者を行ってスクリーニング効率を比較した。この結
果、磁気的なスクリーニングを行わない実験例と比較し
て、例えば少なくとも約10〜20倍位耐性カルスの選抜効
率が高いことが見積もられた。なお、ＰＣＲ法により導
入遺伝子の確認を行ったところ、導入遺伝子の存在が認
められた。また、サザンハイブリダイゼーション分析を
行った結果も導入遺伝子特有のバンドが確認され、これ
らの細胞は形質転換体であると考えられた。
施例のように磁気で選択的に分離回収するスクリーニン
グを行い、その後ジェネティシン等の抗生物質を含む培
地で薬剤耐性細胞のスクリーニングを行った。この際、
磁気的スクリーニングを行った実験と行わなかった実験
の両者を行ってスクリーニング効率を比較した。この結
果、磁気的なスクリーニングを行わない実験例と比較し
て、例えば少なくとも約10〜20倍位耐性カルスの選抜効
率が高いことが見積もられた。なお、ＰＣＲ法により導
入遺伝子の確認を行ったところ、導入遺伝子の存在が認
められた。また、サザンハイブリダイゼーション分析を
行った結果も導入遺伝子特有のバンドが確認され、これ
らの細胞は形質転換体であると考えられた。
【００２７】以上のように、新しい磁気的スクリーニン
グ法は、形質転換体を育成する時に時間と手間がかかる
薬剤耐性細胞のスクリーニングのプロセスが大幅に効率
的に行えることが示された。
グ法は、形質転換体を育成する時に時間と手間がかかる
薬剤耐性細胞のスクリーニングのプロセスが大幅に効率
的に行えることが示された。
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、磁性を有する微粒子を
用いて遺伝子等の生体物質の細胞内への導入とその機能
発現が可能となり、また遺伝子が発現したり生理機能が
発現した細胞や細胞塊、器官だけを選択的、特異的に濃
縮、分離することことができる。
用いて遺伝子等の生体物質の細胞内への導入とその機能
発現が可能となり、また遺伝子が発現したり生理機能が
発現した細胞や細胞塊、器官だけを選択的、特異的に濃
縮、分離することことができる。
【図１】マグネタイト微粒子の粒子構造を示す写真であ
る。
る。
【図２】タバコ細胞（細胞塊）についての生物の形態を
示す写真である。
示す写真である。
【図３】図２に示すタバコ細胞を少量取り生物顕微鏡で
観察した場合の生物の形態を示す写真である。
観察した場合の生物の形態を示す写真である。
【図４】タバコ細胞を一様に分散させた状態を表す生物
の形態を示す写真である。
の形態を示す写真である。
【図５】タバコ細胞を一様に分散させた後、磁石を容器
右上部に密着させた２分後における生物の形態を示す写
真である。
右上部に密着させた２分後における生物の形態を示す写
真である。
【図６】バイナリーベクターｐＢＩ１２１を示す図であ
る。
る。
Claims (2)
- 【請求項１】 生体物質を固定化した磁性微粒子を細胞
内に高速で撃ち込むことを特徴とする生体物質の細胞内
への導入方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の導入方法により磁性微粒
子が導入された細胞を磁気により選択的に濃縮又は分離
することを特徴とする細胞の選択的濃縮・分離法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28629092A JP2642025B2 (ja) | 1992-10-23 | 1992-10-23 | 磁性微粒子による細胞への生体物質導入方法及び磁気による細胞の選択的濃縮・分離法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28629092A JP2642025B2 (ja) | 1992-10-23 | 1992-10-23 | 磁性微粒子による細胞への生体物質導入方法及び磁気による細胞の選択的濃縮・分離法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06133784A JPH06133784A (ja) | 1994-05-17 |
| JP2642025B2 true JP2642025B2 (ja) | 1997-08-20 |
Family
ID=17702470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28629092A Expired - Fee Related JP2642025B2 (ja) | 1992-10-23 | 1992-10-23 | 磁性微粒子による細胞への生体物質導入方法及び磁気による細胞の選択的濃縮・分離法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2642025B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7465579B2 (en) | 2004-06-25 | 2008-12-16 | Canon Kabushiki Kaisha | Device and method for introducing particle into cell and device and method for collecting particle from cell |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100683978B1 (ko) * | 1999-09-08 | 2007-02-22 | 게노비스 에이비 | 생물학적 재료내에 포어를 도입시키는 장치 |
| US8580544B2 (en) | 2002-10-16 | 2013-11-12 | Universal Bio Research Co. Ltd. | Apparatus for introducing biological material, method of introducing biological material and magnetic support for introducing biological material |
| CN101173250B (zh) | 2003-06-30 | 2011-01-26 | 卫材R&D管理有限公司 | 磁性细胞及其使用方法 |
| JP6278187B2 (ja) * | 2014-03-19 | 2018-02-14 | 株式会社Ihi | 磁性微粒子制御システム |
| EP3597732A4 (en) * | 2017-03-16 | 2020-03-18 | FUJIFILM Corporation | METHOD FOR SEPARATING MEGAKARYOCYTES FROM BLOOD PLATES AND BLOOD PLATE SEPARATION KIT |
-
1992
- 1992-10-23 JP JP28629092A patent/JP2642025B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7465579B2 (en) | 2004-06-25 | 2008-12-16 | Canon Kabushiki Kaisha | Device and method for introducing particle into cell and device and method for collecting particle from cell |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06133784A (ja) | 1994-05-17 |
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