KR100683978B1 - 생물학적 재료내에 포어를 도입시키는 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 샘플내의 세포 또는 조직과 같은 생체재료내에 포어를 생성시키는 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 샘플내에 존재하는 자기 입자의 열에너지 또는 운동 에너지를 증가시키는 교번하는 자기장을 사용한다. 이후 자기 입자는 생체구조를 둘러싸고 있는 막에 포어를 생성시킨다. 이어서, 상기 포어는 생체구조내로 입자를 도입시키기 위해 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 장치는 온도 제어기를 갖추고 있다.

Description

생물학적 재료내에 포어를 도입시키는 장치{DEVICE FOR INTRODUCING PORES INTO BIOLOGICAL MATERIALS}

본 발명은 특히, 분자생물학적 작업에 사용하기 위한 장치에 관한 것이다.

생물공학 및 생물의학의 연구 분야에서, 종종 거대 분자 또는 바이오파티클(bioparticle)을 세균 세포와 같은 생물학적 구조체내로 도입시킬 필요가 있다. 세포 및 바이러스는 또한 환경에 대해 보호하기 위한 외부 장벽 및 영양 물질에 대한 선택적 운반 시스템을 갖고 있다. 천연 보호 메카니즘을 공략하고 표적 생물체에 대해 바람직하지 않은 물질을 도입시키기 위해서는, 표적 세포에 대한 몇가지 종류의 화학적 또는 물리적 처리가 필요하다. 세포의 외부 세포막, 및 적절한 경우 세포벽을 공략하는 기술의 예는 유전자 공학 및 분자생물학 연구 분야에 유용하다.

새로운 유전자 코드가 특이적으로 선택된 숙주 세포로 이동되는 경우, 상기 기술을 형질전환 또는 트랜스펙션으로서 칭한다. 모든 유형의 세포에 대해 사용되는 일반적인 방법은 없지만, 각각의 세포 유형 및 목적에 대한 기술이 이용가능하다. 또한 현재 이용가능한 기술을 사용하여 모든 유형의 세포를 형질전환시킬 수 없다. 1970년에, 만델(Mandel) 및 히가(Higa)[참조: J. Mol. Bio. 53: 159-162]는 CaCl₂로 전처리된 대장균 세포가 온도 쇼크로 처리되는 경우 외래 DNA를 받아들일 수 있음을 보고하였다. 이후 상기 방법은 지속적으로 개발되고 있다[참조: US patent application US97/01788]. 높은 전압의 전기 펄스에 세포를 순식간에 노출시킴으로써, 세포막의 포어를 개방시키는 것을 일렉트로포레이션이라 하며[참조: Zimmerman et al. J. Membr. Biol. 67: 165-82 (1983)], 이것은 형질전환 기술로서 자주 사용된다. 세균, 효모 및 일부 경우에 포유류 세포 및 식물 세포는 특정 조건하에서, 일렉트로포레이션에 의해 형질전환될 수 있다. 또한 이러한 경우에 있어서, 상기 기술의 지속적인 개발이 진행중이다[참조: patent applications US97/16721, US98/16042]. 상기 기술한 두 가지 방법에서, 세포 엔벨로프(envelope)는 DNA 분자가 세포로 들어가기에 충분히 오래 개방된다. 형질전환을 위해 최근 개발된 제 3의 방법은 소위 리포펙션[참조: Old and Primrose, in Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Gene Manipulation, Blackwell Science (1995)]이고 여기서 외래 DNA는 표적 세포의 외부막과 융합하는 양이온 리포솜내에 싸여지거나 결합한다. 식물 세포의 형질전환을 위한 하나 이상의 상용 기술이 존재하며, 여기서 상기 목적을 위해 선택된 식물 부분은 외래 유전자와 함께 제조된 작은 금 그레인(grain)에 의해 충격을 받게 된다[참조: Boynton J.E. et. Science 240, 1534-1538, 1988]. 이러한 유전자 수송은 세균, 진균, 곤충 및 포유류 세포와 같은 그 밖의 조직의 형질전환을 위해 개발되고 있다[참조: Johnston S.A. Nature 346, 776-777, 1990].

이것은 본 발명이 사용될 수 있는 상기 기술한 적용에 있어서 특히 그러하다. 그러나, 특정 세포 및 바이러스의 반응을 연구하기 위해, 단백질, RNA 분자, 지방산, 펩티드, 의학 제제 등의 직접적인 전달과 같은 적용에 있어서 그 밖의 외인성 재료를 도입시키기 위해 본 발명의 장치를 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 장치는 동일한 방법으로 특정 세포 성분의 확인 및 단리 뿐만 아니라 용해를 수행하는 목적을 위한 세포의 용해를 위해 특히 적합하다.

발명의 요약

따라서, 본 발명은 교번 자기장을 생성시킬 수 있고 샘플이 삽입될 수 있는 하나 이상의 코일을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치에 관한 것이고, 여기서 상기 자기장은 상기 샘플의 자기적으로 민감한 입자의 열에너지 및/또는 운동 에너지를 증가시키고, 상기 입자의 증가된 열에너지 및/또는 운동 에너지는 상기 샘플에서 발견되는 생물학적 막으로 싸여진 구조체에 포어를 형성시키고, 상기 포어는 상기 생물학적 막으로 싸여진 구조체내로 바이오파티클이 도입되거나 상기 생물학적 막으로 싸여진 구조체로부터 바이오파티클이 추출되도록 해준다.

또한 상기 방법은 본 발명에 따른 장치가 세포의 용해를 위해 사용되는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 장치가 숙주 세포의 유전자 코드 및/또는 대사작용을 변경시키기 위해 특이적으로 사용되는 방법에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명에 따른 장치의 근본적인 개요도이다.

도 2는 전류 공급 회로의 예이다.

도 3은 코일의 연결부의 예이다.

도 4는 자기적으로 민감한 입자의 예를 도시한 것이다.

도 5는 구배장을 생성시킬 수 있는 장치를 도시한 것이다.

본 발명의 한 양태에 따라, 장치는 상기 자기장이 1 내지 5 MHz의 주파수의 교번하는 장 방향을 가짐을 특징으로 한다.

또 다른 양태에 따라, 장치는 상기 자기장이 1 mT 이상의 장 세기를 가짐을 특징으로 한다.

하나 이상의 양태에 따라, 본 발명은 상기 자기장이 불균일하고 교번하는 구배장 방향을 가짐을 특징으로 하고, 상기 교번하는 구배장의 방향은 두 개의 코일에 의해 생성되고, 상기 샘플은 코일 사이에 삽입된다.

하나 이상의 양태에 따라, 본 발명에 따른 장치는 상기 코일에 상이한 주파수의 교류가 공급됨을 특징으로 한다.

또 다른 양태에 따라, 장치는 공급되는 교류의 포지티브 또는 네가티브 부분이 상기 코일에 공급됨을 특징으로 한다.

또 다른 양태에 따라, 장치는 상기 코일 또는 코일 및/또는 상기 샘플의 정확한 온도 제어를 위한 자동온도조절기를 갖추고 있음을 특징으로 한다.

추가 양태에 따라, 장치는 교류가 가해지는 시간 및 상기 샘플이 상기 적용된 자기장에 노출되는 시간의 정확한 제어를 위한 가변 타이밍 수단을 갖추고 있음을 특징으로 한다.

또 다른 양태에 따라, 장치는 상기 교류의 세기 및 주파수의 정확한 세팅을 위한 제어 시스템을 갖추고 있음을 특징으로 한다.

생체막으로 싸여진 구조체는, 특히 신체 조직, 세포, 세균, 바이러스 입자, 세포내 수준에서의 세포소기관, 리포솜 또는 단백질로 구성된다.

막으로 싸여진 구조체내로의 도입 및 막으로 싸여진 구조체로부터의 추출을 위해 적합한 바이오파티클은, 특히, DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 그 밖의 생체중합체, 펩티드, 화학 제제, 유기 화합물, 무기 화합물 또는 합성 중합체 또는 이들의 조합물이다.

본 발명이 부분적으로 기초하고 있는 기술은 자기 나노기술 및 펩티드 화학의 결합이다. 약 10 ㎛ 내지 1 ㎚의 크기를 갖는 자기적으로 민감한 입자가 본 기술에 반응물로서 사용된다. 이러한 입자가 특정 자기장에 노출되는 경우, 이것은 진동하여 열을 생성시킨다. 도 1은 본 발명의 근본적인 개요도이다. 생물학적 샘플은 목적을 위해 의도된 반응물과 혼합된 후 샘플 홀더(a)에 배치된다. 자기 공급원(b)이 바람직한 세기 및 주파수로 조정되며, 그 결과 쿨링 엘리먼트(c)가 바람직한 온도로 조정된다. 자기 공급원은 하나의 코일 또는 두 개의 코일이고, 샘플은 도 5에 따라 이들 사이에 배치된다. 자기 공급원 및 샘플 홀더는 분리된 유닛내에 넣어지고, 온도는 쿨링 엘리먼트에 의해 결정된다. 샘플 홀더의 정확한 온도를 보장하기 위해, 온도 센서(d)가 상기 시스템에 연결될 수 있다. 가변 온도, 자기장의 세기 및 주파수 및 처리 간격은 제어되며 디지털 디스플레이(e) 상에서 지켜볼 수 있다.

도 2는 회로 XR2206에 기초한 발진기(1)를 포함하는 전자 전류 공급 회로의 예를 도시한 것으로, 이의 출력 신호(2)는 전력 증폭 단계(3)에 의해 증폭되고, 이는 회로 PBD 3548/1에 기초하며, 이의 출력 신호(4)는 하나 이상의 코일을 통해 교류(1MHz, 2A)를 작동시킬 수 있다. 상기 코일의 연결부의 예를 도 3에 도시하였는데, 2 Ω의 저항(6), 0.50 nF의 축전기(7) 및 50 μH의 코일(8)로 구성된 진동 회로를 갖추고 있으며, 상기 회로에 교류(5)가 공급된다. 당업자에게 도 2 및 도 3에 도시된 상기 기술한 예가 쉽게 변경될 수 있고 동일한 결과가 교번하는 연결부 및 코일의 도움으로 수득될 수 있음은 명백하다.

본 발명에 따른 방법에서 사용된 자기 재료의 예는 특허 문헌, 예컨대, 미국 특허 제 4,323,056호(Borelli et al)에 기술되어 있다. 자기적으로 민감한 입자 및 가능한 형태를 또한 도 4에 도시하였다. 상기 입자의 자기적으로 민감한 코어(9)는 필수적으로 자철석(산화철)으로 구성된다. 추가로 상기 입자는 유도체화된 중합체(덱스트란), 또는 유도체화된 지방산의 단층 또는 대안적으로는 이중층으로 구성되는 외부층(10)으로 코팅된다. 유도체화를 위해 사용되는 리간드(11)의 유형(아미노산 또는 탄수화물 단위의 수 및 서열)의 선택은 자기적으로 민감한 입자의 각각의 적용에 개별적으로 적합되며, 이의 표면에 의해 더욱 증폭될 수 있는 이의 효과는 하나 이상의 이펙터 분자(12)에 의해 추가로 변형된다.

상기 입자를 세포 현탁물에 첨가한 후 상기 세포를 교번하는 장 방향에 노출시킴으로써, 각각의 자기적으로 민감한 입자를 둘러싸고 있는 매질이 순간적으로 가열된다. 상기 열은 세포 및 세포막에 온도 쇼크를 유도시키고, 이는 세포막의 일시적인 개방이 일어나게 한다. 상기 열은 전체 샘플에서 신속하고 균일하게 유도되며, 이는 상기 샘플 및 세포가 짧은 시간 동안의 처리에 노출될 수 있도록 해주고, 이는 노출된 세포의 생존 빈도를 증가시킨다. 실시예 1은 대장균의 형질전환을 기술한다.

온도 쇼크와 관련된 통상적인 형질전환 방법에서, 세포 현탁물을 함유하는 시험관은 주위 온도 보다 높은 온도(42℃)에 노출됨으로써, 온도 구배가 시험관 벽으로부터 본 발명에 따른 방법 보다 더 긴 시간을 필요로 하는 조성물인 샘플내로 일어나고, 이는 세포벽에 가장 가까이 위치한 세포가 시험관의 중앙에서의 시간 보다 더 긴 시간 동안 더 높은 온도에 노출됨을 추가로 암시한다. 따라서, 세포 중 일부는 증가된 온도에 기인하여 사멸하지만 상기 세포의 일부는 처리되지 않은 채 남게 될 것이다. 본 발명에 따른 방법은 샘플 홀더에서 각각의 입자를 순간 가열하는 라운드에 의해 이러한 문제점을 회피한다. 상기 효과는 상기 입자가 입자의 표면상의 리간드 분자를 통해 세포 엔벨로프에 즉시 배향되는 경우 증폭된다. 이것은 열 쇼크 및 세포 사멸 사이의 균형이 최종 결과에 있어서 중요한 통상적인 형질전환 방법과 비교하여 큰 장점이다.

더욱이, 자기장의 장 세기는 스페이스, 즉 교번하는 장 방향과 함께 입자에서의 기계적인 진동(운동 에너지 증가)을 일으키고, 열 복사(열 에너지)과 함께 모든 세포를 둘러싸고 있는 세포막(및 적절한 경우, 세포벽)에 대한 입자의 효과를 증폭시키는 소위, 구배장에서 다양할 수 있다. 본 발명은 열의 유도 또는 전단력의 강력한 유도, 또는 이들의 조합을 수반하는 완전히 새로운 방법을 기술한다. 전단력은 기계적인 피로에 기인하여 세포막에서 전위를 개시하며, 이는 세포막(및 표적 세포가 예컨대, 세균인 경우에는 세포벽)의 파괴를 초래한다. 상기 방법은 교번하는 외부적으로 적용된 구배 자기장의 사용에 기초한다. 구배장은 두 개 이상의 코일을 제공되며, 공급된 교류의 포지티브 또는 네가티브 부분이 상기 코일에 공급되거나, 대안적으로는 상기 코일에 상이한 주파수의 교류가 제공된다. 구배장을 생성시킬 수 있는 장치를 도 5에 도시하였다. 기능적인 원리는 도 5에 따라 서로 반대로 정렬되어 있는 두 개의 코일 (A) 및 (B)(페라이트 코어를 가지거나 가지지 않음)에 기초한다. 제어 유닛(c)은 코일을 통해 상기 전류를 제어함으로써, 한번에 하나의 코일만이 이들의 와인딩(winding)을 통해 전류를 통과시킨다. 주파수가 발진기(OSC)에 의해 제어되는 상기 전류 교대는 상기 코일이 상이한 구배 방향으로 구배 자기장 (D) 및 (E)를 교대로 생성시키도록 한다. 상기 코일들 사이에 위치된 자기적으로 민감한 입자(P)는 주기적으로 교대하는 방향을 가진 구배 자기장을 겪을 것이고, 이는 기계적인 진동을 유도할 것이다. 또한, 구배장은 두 개의 코일에 두 가지의 상이한 주파수의 전류가 공급되는 경우 생성될 수 있다. 두 개의 코일에서의 전류 사이의 주파수에 있어서의 차이는 상기 구배의 교대의 빈도를 제어한다.

자기 처리가 짧은 시간 동안 일어나도록 함으로써, 처리 후에 다수의 세포가 생존하기 위한 조건이 생성된다. 세포 엔벨로프가 개방되어 있는 동안, 형질전환될 분자가 세포내로 도입되어야 한다. 이러한 과정을 최적화시키기 위해, 상기 분자는 또한 세포 엔벨로프로 배향될 수 있다. 두 방법 모두는 한편으로는 세포 표면, 다른 한편으로는 인식 분자중 하나 및 동일한 강자성 입자에 결합하기 위한 인식 분자가 연결됨으로써 영향을 받는다. 상이한 종류의 생물학적 구조를 인식하여 이에 결합할 수 있는 생화학에 기초한 분자는, 예컨대, 항체 또는 효소의 일부인 짧은 합성 펩티드일 수 있다.

재조합 단백질과 같은 표적 단백질의 인식 분자를 자기적으로 민감한 입자에 연결시킴으로써, 본 발명에 다른 장치는 임의의 방법 및 동일한 방법으로 용해 및 상기 표적 단백질의 특이적인 정제를 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 정제 단계와 함께, 용해(주로 효소적 및 기계적 용해)의 대안적인 기술에 비해, 본 발명에 따른 장치의 사용은 상기 모든 시간 뿐만 아니라 재료를 절약시킨다.

본 발명의 장치는 한편으로는 형질전환 방법 및 다른 한편으로는 특정 세포 성분의 정제를 위해 이롭게 사용될 수 있으며, 이는 상기 장치가 독특해지도록 한다. 본 목적과 상관없이, 상기 방법은 코일이 일정한 온도로 유지되는 동안 일어나야 하며, 이는 냉각 엘리먼트 및 온도 제어기가 제어될 수 있는 자기 장치내로 통합되어야 함을 의미한다. 또한 이는 자기장의 세기 및 주파수 뿐만 아니라 상기 샘플이 상기 처리에 노출되는 동안의 시간이 가변적인 장치의 적용의 다양한 포텐셜 장(potential field)에 대해 유리하다.

실시예 1

하기 실시예는 대장균(E. coli)을 pUC18 플라스미드를 사용하여 형질전환시키는 방법을 기술한 것이다.

100 ㎕의 컴피턴트(competent) 대장균 세포를 0℃에서 30 ㎕의 0.05 M CaCl₂중에 용해된 500 ㎍의 pUC18와 혼합하였다. 샘플을 본 발명에 따른 장치의 샘플 컨테이너 내로 도입시키고 코일내에서 0℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이후 샘플을 1MHz, 2A에서 30초 동안 처리하였다. 이후 1 ml 멸균 LB 브로쓰(broth)를 샘플에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 수조에서 인큐베이션시켰다. 이어서 상기 세포를 형질전환된 세균만 수득되도록 하기 위한 선택압(selection pressure)인 50 ㎍/㎕의 암피실린을 함유하는 아가(agar) 플레이트상에 스프레딩하였다. 실험은 생존 및 형질전환 빈도를 평가하기 위해 pUC18을 함유하지 않는 참조 샘플을 포함해야 한다.

Claims (13)

1. 생체막으로 싸여진 구조체 및 자기적으로 민감한 입자를 포함하는 샘플에 교번 자기장을 적용시킴으로써 자기적으로 민감한 입자의 열에너지, 운동에너지, 또는 열에너지 및 운동에너지의 증가가 생체막으로 싸여진 구조체에 포어를 형성하도록 하는 것을 포함하여, 생체막으로 싸여진 구조내로 바이오파티클(bioparticle)을 도입시키거나 생체막으로 싸여진 구조로부터 바이오파티클을 추출하는 방법으로서, 포어가 생체막으로 싸여진 구조내로 바이오파티클을 도입시키거나 생체막으로 싸여진 구조로부터 바이오파티클을 추출하도록 해주는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 자기장이 1 내지 5 MHz의 주파수의 교번하는 장 방향(field direction)을 가짐을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 자기장이 1 mT의 장 세기(field strength)를 가짐을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 자기장이 불균일하고 교번하는 구배장 방향을 가지며, 교번 구배장의 방향이 2개의 코일에 의해 생성되고, 샘플이 코일 사이에 삽입됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 코일에 상이한 주파수의 교류가 공급됨을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4항에 있어서, 공급된 교류의 포지티브 또는 네가티브 부분이 코일에 공급됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 바이오파티클이 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 그 밖의 생체중합체, 펩티드, 화학 제제, 유기 화합물, 무기 화합물 또는 합성 중합체 또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 생체막으로 싸여진 구조체가 신체 조직, 세포, 세균, 바이러스 입자, 세포내 수준에서의 세포소기관, 리포솜 또는 단백질로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 세포의 용해를 위해 사용됨을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 숙주 세포의 유전자 코드, 대사작용, 또는 숙주 세포의 유전자 코드 및 대사 작용을 변형시키기 위해 사용됨을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항 또는 제 2항에 따른 방법을 수행하기 위한 장치로서, 교번 자기장을 생성시키기 위한 하나 이상의 코일, 하나 이상의 코일의 정확한 온도 제어를 위한 자동온도조절기, 교류가 가해지는 시간 및 처리될 샘플이 적용된 자기장에 노출되는 시간의 가변적이고 정확한 타이밍 제어를 위한 수단, 및 교류의 세기 및 주파수의 정확한 세팅을 위한 제어 시스템을 포함하는 장치.
12. 삭제
13. 삭제

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