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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer ersten codierenden Sequenz für ein Peptid und/oder ein Protein zur Translationsverstärkung, wobei die erste codierende Sequenz ein N-terminales Peptid und/oder Protein zur Translationverstärkung codiert und das N-terminale Peptid und/oder Protein insbesondere zwischen 20 und 30 Aminosäuren, insbesondere zwischen 4 und 12 Aminosäuren und insbesondere 8 Aminosäuren, und ein erstes Zielprotein aufweist.
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Effektive und unkomplizierte Proteinüberexpression in den prokaryotischen Modellorganismus E.coli ist sowohl von wissenschaftlichen, als auch ökonomischen Interesse. Um Proteine in E.coli zu exprimieren, wird die codierende DNS-Sequenz üblicherweise in einem Plasmid kloniert. Die Expression wird von einem starken Promoter kontrolliert. Die Induktion des Promoters führt zu Produktion einer mRNA, welche anschließend in das erwünschte Protein translatiert wird.
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Trotz der Verwendung eines starken Promoters zur Kontrolle der mRNA-Synthese wird jedoch in einer nicht zu vernachlässigen Zahl der Fälle nur wenig oder kein Protein in den Zellen hergestellt. Dies gilt insbesondere für cyan flureszierende Proteine, welche im Weiteren mit CFP bezeichnet werden, und gelb fluoreszierende Proteine, welche im Weitern YFP bezeichnet werden.
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Wenn das Protein nicht selbst toxisch für die Zellen ist, wird angenommen, dass eine abweichende Codon-Verwendung in der klonierten codierenden Sequenz die Ursache für das Problem ist. Das bedeutet, dass die Sequenz viele seltene von E.coli verwendete Codons enthält.
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In der Schrift „visualisation of differential gene expression by improved cyan florescent Protein and yellow florescent Protein production in Bacillus subtilis in der Zeitschrift Applied and Environmental Microbiology (70 (11) 6 8 09-6815)" von Veening et al. wird beschrieben wie ein kurzens N-terminales Fusionspeptid zur CFP und YFP Expressionsverstärkung in bacillus subtilis ohne die Codons von cfp und yfp anzupassen ist, um funktionierende Reportergene herzustellen. Dabei hat sich herausgestellt, dass CFP und YFP in E.coli nicht expremierbar sind.
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Dabei sei folgendes Begriffliche angeführt: cfp und yft umfassen Gene, welche für die Proteine CFP und YFT codieren.
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Aufgabe der Erfindung ist es den Stand der Technik zu verbessern.
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Die Aufgabe wird gelöst, durch ein Verfahren zum Herstellen einer ersten codierenden Sequenz für ein Peptid und/oder Protein zur Translationsverstärkung, wobei die erste codierende Sequenz ein N-terminales Peptid und/oder Protein zur Transalationsverstärkung codiert und das N-terminale Peptid und/oder Protein insbesondere zwischen 2 und 30 Aminosäuren, insbesondere zwischen 4 und 12 und insbesondere 8 Aminosäuren und ein erstes Zielprotein aufweist, wobei das Verfahren den Schritt des Fusionierens von einem Leserahmen der ersten codierenden Sequenz mit einem Leserahmen des ersten Zielproteins mittels molekulartechnischer Methoden aufweist.
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Dadurch können CFP und YFP in E.coli exprimiert werden.
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Zunächst sei folgendes begriffliche erläutert.
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Unter einer „”ersten codierenden Sequenz für ein Peptid und/oder ein Protein” umfasst zum einen die für die ersten 8 Aminosäuren des E.coli Proteins RplL codierende DNA Sequenz, das die Translation im Vergleich mit zwei anderen codierenden DNA Sequenzen am meisten verstärkt und zum anderen eine auf dieser DNA Sequenz basierende durch Mutagenese weiter optimierte codierende Sequenz.
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Unter einer „Translationsverstärkung” ist insbesondere zu verstehen, dass die Fusion der für die ersten 8 Aminosäuren des E.coli Proteins RplL codierenden DNA Sequenz mit einer zweiten codierenden DNA Sequenz die Translation dieser zweiten DNA Sequenz verstärkt oder sogar erst ermöglicht, d. h. ohne die Fusion mit der ersten codierenden Sequenz wird und die zweite codierende Sequenz nicht oder nur sehr schwach in E.coli translatiert. Somit kann die Fusion die Produktion von Proteinen in E.coli ermöglicht werden, welche ohne diese Fusion unmöglich oder aufgrund der geringen Ausbeute unökonomisch wäre.
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Ein „N-terminales Peptid und/oder Protein” umfasst insbesondere die ersten 8 Aminosäuren von RplL.
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Unter einem „Zielprotein” ist insbesondere ein in E.coli (überzu-)expremierendes Protein zu verstehen.
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Unter „Fusionieren” versteht man insbesondere die Fusion der codierenden Sequenz für das N-terminale Peptid von RplL mit der codierenden Sequenz eines Zielproteins mit Hilfe molekularbiologischer Methoden wie beispielsweise PCR (Polymerase Kettenreaktion), Klonierung und/oder in vitro Synthese.
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Ein „Leserahmen” umfasst insbesondere einen offenen Leserahmen, welcher eine für ein Peptid oder Protein kodierende DNA Sequenz umfasst.
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Die in diesem Verfahren eingesetzten „molekulartechnischen Methoden” umfassen insbesondere PCR, Klonierung, in vitro Synthese.
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In einer weiteren Ausgestaltung, weist die erste codierte Sequenz zwei, drei, vier oder mehr Zielproteine auf, welche mit dem ersten oder einem der anderen Zielproteine fusioniert werden. Dadurch können vorteilhafterweise Fusionsproteine bereit gestellt werden, welche aus zwei oder mehreren Untereinheiten bestehen in E.coli (über-)expremiert werden.
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In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch eine erste codierende Sequenz, welche nach einem der vorher beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Durch diese erste codierende Sequenz können Zielproteine, deren kodierende Sequenz an die kodierende Sequenz von RplL fusioniert, in E.coli (über-)expremiert werden.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst, durch einen Expressionsverktor, wobei der Expressionsvektor, welcher eine Resistenzkassette, insbesondere Antibiotika, eine Replikationsorigin an der eine DNA-Polymerase die DNA-Synthese initiiert, einen Promoter, insbesondere ein regulierbarer Promoter, an der RNA-Polymerase und eine mRNA-Snythese initiiert, insbesondere zum Startpunkt der Transkription, die erste kodierende Sequenz, wie sie zuvor beschrieben wurde, für ein translationsverstärkendes Peptid und/oder eine multiple Klonierungsstelle für das Klonieren einer zweiten codierenden Sequenz für das Zielprotein und einen Transkriptionsterminator enthält.
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Dadurch kann die für das Zielprotein kodierende DNA Sequenz in E.coli eingebracht und stabil weitervererbt werden. Des Weiteren kann durch Verwendung eines kontrollierbaren Promotors die Produktion des Zielproteins an- und abgeschaltet werden.
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Folgendes Begriffliche sei erläutert.
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Ein „Expressionsvektor” kann insbesondere ein ringförmig geschlossenes DNA Molekül mit kontrollierbarem und/oder starkem Promoter und Ribosomenbindungsstelle, einem Startcodon, der kodierenden ersten Sequenz und einer anschließenden multiplen Klonierungsstelle für die zu expremierende zweite Sequenz umfassen.
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Unter „Resitenzkassette” ist insbesondere ein Gen umfasst, dessen Produkt E.coli vor schädigenden oder abtötenden Substanzen schützt, somit dem Bakterium einen Selektionsvorteil gewährt und die stabile Vererbung des Expressionssvektors gewährleistet.
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Ein „Replikationsorigin” umfasst insbesondere eine DNA Sequenz, an der die Replikation, d. h. die „Kopierung” des Expressionsvektors, in vivo beginnt.
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Eine „DNA-Polymerase” umfasst insbesondere ein Enzym, welches DNA kopiert.
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Die „DNA-Synthese” umfasst insbesondere das Kopieren des Expressionsvektors in vivo.
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Unter „initiieren” versteht man insbesondere den Startpunkt einer DNA Synthese.
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Ein „Promoter” oder entsprechend ein „regulierbarer Promoter” umfasst insbesondere die DNA Bindestelle für die RNA-Polymerase und enthält insbesondere den Startpunkt der RNA Synthese. Ein regulierbarer Promoter enthält zusätzlich eine oder mehrere Bindestellen für ein oder mehrere Regulatorproteine in unmittelbarer Nähe. Die Aktivität der Regulatorproteine ist durch Zugabe von Substanzen oder Veränderung der Wachstumsbedingungen wie beispielsweise Temperatur und/oder pH Wert beeinflussbar. Dadurch kann der Promoter und somit RNA Synthese an- oder abgeschaltet werden.
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Eine „RNA-Polymerase” umfasst insbesondere ein mRNA synthetisierendes Enzym.
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Unter einer „mRNA-Synthese” ist insbesondere die Transkription der DNA zu verstehen.
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Ein „Startpunkt der Transkription” umfasst insbesondere die DNA-Sequenz an der die RNA Synthese initiiert wird.
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Unter einem „translationsverstärkendem Peptid” ist insbesondere eine Aminosäurensequenz deren Anwesenheit die Translationsrate eines Proteins erhöht zu verstehen.
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Eine „multiple Klonierungsstelle” umfasst insbesondere eine Stelle mit mehreren Restriktionsenzymschnittstellen für die Klonierung von erwünschten DNA-Sequenzen.
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Ein „Transkriptionsterminator” ist insbesondere eine DNA-Sequenz an der die RNA Synthese abgebrochen wird.
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In einer besonderen Ausprägungsform weist der Expressionsvektor eine Ribosomen-Bindestelle auf. Dadurch kann die Initiation der Proteinsynthese erleichtert werden.
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Eine „Ribosomen-Bindestelle” umfasst insbesondere eine mRNA-Sequenz, welche die Initiation der Proteinsynthese erleichtert.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch einen zweiten Expressionsvektor, wobei der zweite Expressionsvektor, welcher eine Resistenzkassette insbesondere gegen Antibiotika, ein Replikationsorigin an der DNA-Polymerase die DNA-Synthese initiiert, einen Promoter, insbesondere ein regulierbarer Promoter, an dem die RNA-Polymerase mRNA-Synthese initiiert, insbesondere von einem Startpunkt der Transkription, die erste codierende Sequenz wie sie zuvor beschrieben wurde, für ein translationsverstärkendes Peptid und das Zielprotein aufweist,
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Dadurch kann insbesondere eine starke Transkription und darauffolgende starke Translation an einem beliebigen Zeitpunkt und unter verschiedenen Wachstumsbedingungen induziert werden.
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Die hier aufgeführten Begrifflichkeiten können analog wie oben beschrieben verstanden werden.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch eine Zelle, welche einen wie zuvor beschriebenen Expressionsvektor enthält.
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Dadurch kann das Protein in einer ”natürlichen” Umgebung der Zelle produziert werden.
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Unter „Zelle” können alle biologischen Systeme verstanden werden, bei denen ein durch das Plasmamembran umgrenzte Zytoplasma mit einem oder mehreren Chromosomen eine reproduzierbare Einheit bildet.
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In einer diesbezüglichen Ausprägungsform ist ein Expressionsvektor wie er zuvor beschrieben mittels Transformation und/oder Elektroporation und/oder Konjugation in die Zelle verbracht.
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Dadurch kann dieser Expressionvektor in unterschiedlichen Wirten effizient etabliert werden.
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Unter einer „Transformation” wird insbesondere die natürliche oder künstliche Integration eines fremden Genmaterials in eine Wirtszelle beschrieben.
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Die „Elektroporation” umfasst insbesondere die Techniken des Transformationsvorgangs mittels elektrischen Schocks, welcher den Wirtszellen aufgeprägt wird.
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Unter „Konjugation” sind insbesondere die Techniken des Transfers des genetischen Materials mittels einer Pili umfasst, welche zwischen dem Donor und der Wirtszelle ausgebildet werden.
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In einer weiteren Ausprägungsform kann die Zelle Escherichia Coli Zelle oder eine Hefezelle sein.
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Eine „Escherichia Coli Zelle” ist insbesondere bevorzugt weil in diesem klassischen Modelorganismus mehrere für die Medizin und Biotechnologie wichtigen Vorgänge verstanden und nachgestellt werden können. Jedoch können auch weitere Zellen verwendet werden.
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Eine „Hefezelle” umfasst insbesondere die einfachste eukaryontische Zelle mit einem Zellkern, welcher auch für die höhere Eukaryonten inklusive Menschen charakteristisch ist.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst, durch ein Expressionsprotein, welches durch Expression in einer der zuvor beschriebenen Zelle hergestellt wird. Dadurch kann eine Expression von neuen wirtschaftlich bedeutsamen oder der für die Medizin wichtigen Proteine etabliert oder eine effizientere Herstellung von bekannten Proteinen ermöglicht werden.
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Unter „Expression” kann insbesondere die Herstellung eines Proteins durch Anwendung von Expressionsvektoren verstanden werden.
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In einer diesbezüglichen Ausprägungsform kann das Expressionsprotein aufgereinigt sein. Dadurch können größere Mengen an wirtschaftlich bedeutsamen oder der für die Medizin wichtigen Proteine in reiner Form gewonnen werden.
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Unter „Aufreinigen” können insbesondere die chromatographische Verfahren und/oder die Proteinelektrophoretischen Methoden verstanden werden.
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Im Weiteren wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen unter zu Hilfenahme der Figuren erläutert.
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Dabei wird folgendes dargestellt:
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1 mehrere mikroskopische Bilder von DH5ά Zellen eine Stunde nach Induktion der Expression des angegebenen Konstrukts von pBAD;
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2 mehrere Mikroskopiebilder von Zellen der systematischen Verkürzungen der codierten RpIL Peptid-Sequenz fusioniert an yfp expremierenden Codons (A sechs Codons (ATGGTGTCTATCACTAAAGATCAAGTG) B fünf Codons (ATGGTGTCTATCACTAAAGATGTG) C vier Codons (ATGGTGTCTATCACTAAGTG), D drei Codons (ATGGTGTCTATCACTGTG), E zwei Codons (ATGGTGTCTATCGTG), F ein Codon (ATGGTGTCTGTG), G null Codons (ATGGTGGTG);
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3 eine Darstellung einer angewandten Klonierungsstatik, aufgrund derer die Benutzung von NcoI/SmaI Schnittstellen in einer Reihe von Vektoren die außerdem angehängten oder nicht angehängten N-terminalen Peptid identisch sind;
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4 Realtime PCR Messung von yfp mRNA mit den angegebenen Fusionen dargestellt im Vergleich zur ohne Fusion produzierter yfp mRNA Menge;
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5 Fluoreszenzmessung unterschiedlicher chromosonlaer cfp Integrationen
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6 stellt die einzelnen Rahmen der codierenden Sequenz und des Zielproteins dar, so wie es durch molekulartechnische Methoden zusammengesetzt wird;
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7 stellt eine Tabelle der verwendeteten Primer und deren Nukleotid-Sequenzen dar.
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Bevor auf die einzelnen Verfahrensschritte eingegangen wird, sollen die grundlegenden Labormethoden erläutert werden. Dabei werden die grundlegenden Labormethoden insbesondere gemäß dem Buch „molecular cloning, a labatory manual" von Sambruck und Russel, 2001 durchgeführt, deren diesbezüglicher Inhalt, Bestandteil dieser Schrift sind.
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Konstruktion von Plasmiden
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Die codierenden Sequenzen für CFP und YFP wurden durch PCR mit Vent Polymerase von pLAU53.SEQ mit den Vorwärtsreimern, die in 7 dargestellt sind und den universalen Reversprimern C/YFP_REV amplifiziert (siehe Tabelle 1 7). Die PCR Produkte wurden mit Mcol, das Plasmid pBAD24 mit Ncol und Smal geschnitten und beide DNS Fragmente mit T4 DNS Ligase ligiert. Die Vorwärtsprimer für cfp/yfp Vervielfältigung enthielten 5' Überhänge mit einer Ncol Schnittstelle und die codierenden Sequenzen für die N-terminalen Peptide von FabB, MetE oder RpIL, wobei die Codons sieben Aminosäuren umfassen, keine Codons für ein N-terminales Peptid (c/yfp_for) oder systematische Verkürzungen der N-terminalen RpIL codierenden Sequenz (MBPD69-75 siehe Tabelle 1, 7). Die Klonierung der so hergestellten und geschnitten PCR Produkte in Ncol und Smal Schnittstellen von pBAD24 (siehe Plasmid in 3) führt zu identischen transkriptionellen Fusionen der offenen Leserahmen an den induzierbaren pBAD Promoter wie sie in 3 dargestellt sind. Alle Plasmide die in dieser Studie verwendet wurden, sind nach ihrer Herstellung durch Sequenzierung überprüft worden.
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Induktion von C/YFP Expression von pBAD und Probenentnahmen
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Übernachtkulturen von DH5ά-Zellen mit denen unterschiedlichen Konstrukten wurden 1:100 im LB-Medium mit dem Antibiotika Ampicilin in einer Konzentration von 50 μg/ml verdünnt, bei 37°C bis zu einer OD600 = 0,4 bis 0,6 inkubiert und anschließend CYFP Expression durch Zugabe von 10-%iger L-Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,1% induziert. OD600 entspricht der optischen Dichte bei 600 nm, dies entspricht in etwa dem Absorptionsmaximum bei E-Coli.
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Proben für Mikroskopie, Fluoreszenzmessung und Realtime PCR wurden vor und eine Stunde nach Induktion genommen.
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Mikroskopie
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Die Mikroskopiebilder wurden mit einem Laserscanning microscope von Zeiss LM510meta mit der Programmversion 3.2 aufgenommen und aufgezeichnet. Falls nicht anders angegeben wurden alle Bilder mit einem 100fachen Objektiv und gleichen Mikroskopeinstellungen für alle Stämme aufgenommen. YFP Fluoreszenz wurde durch Anregung bei 514 nm und Detektion des Emissionssignals mit einem Langpassfilter 530 nm aufgezeichnet. CFP Fluoreszenz wurde durch Anregung bei 448 nm und Detektion des Emissionssignals mit einem Langpassfilter 475 nm aufgezeichnet. Das Pinhole wurde für beide Fluorophore auf 1 Airy Einheit gesetzt.
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RNA Extraktion und Realtime PCR
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RNA für realtime PCR Experimente wurde mit Hilfe des RNeasy minikit einschließlich einer auf-Säule DNase Verdau von der Firma Qiagen präpariert. Spuren von DNS Kontamination wurden durch einen zusätzlichen DNase Verdau mit dem Turbo-DNS free Kit von der Firma Ambion entfernt. Die RNA Konzentration wurde durch NanoDrop Messung bestimmt und die Qualität der RNA durch Gelelektrophorese von 1 μg total RNA anhand der Integrität der 30S und 50S ribosomalen RNA überprüft. QuantiTec SYBR Green one-step Real-Time PCR der Firma Qiagen Reaktionen mit Primer spezifisch für das 5' Ende der Transkripte wurde gemäß Anleitung des Hersteller in einen Mx300 RealTime Cycler von der Firma Stratagene durchgeführt. Die Daten wurden aufgezeichnet und mit Hilfe des Stratagene Mx300P Programms Vervielfältigungskurven gezeichnet und eine einzige Schwellenwertslinie für jedes Experiment gesetzt. Alle weiteren Berechnungen wurden mit Hilfe des Microsofts Excel durchgeführt. Der Zyklusschwellenwert CT, welchen dem Schnittpunkt zwischen Vervielfältigungskurve und Schwellenwertlinie entspricht, wurde für jede Probe ermittelt und die relative Expression eines Gens mit der Formel RE = (2Ct[Kontrolle]/2Ct[x]) berechnet.
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Fluoreszenzmessung
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Für die Fluoreszenzmessungen wurden die Zellen mit Formaldehyd 3,7%ig, 100 mM Phosphat Puffer mit pH 7.4 für 1 Stunde bei Raumtemperatur fixiert, durch Zentrifugation konzentriert, in PBS resuspendiert, auf eine OD600 = 2.0 eingestellt und einem TECAN Safire mit optimaler Signalverstärkung gemessen (PBS ist ein physiologischer Phosphatpuffer). Der Hintergrundswert (PBS) wurde von den Messwerten abgezogen und die resultierenden Fluoreszenzidentitäten in einem Graph dargestellt.
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In der 1 ist das Ergebnis der Expression von C/YFP und unterschiedlicher N-terminaler Fusionen zu C/YFP von pBAD dargestellt. Besonders zu beachten ist, dass C/YFP bei identischen Mikroskopeinstellungen nicht detektierbar ist, wenn sie ohne N-terminale Fusion exprimiert werden. Dabei ist nur ein Hintergrundrauschen zu beachten. Die Fluoreszenzsignale RpIL-C/YFP exprimierenden Stämme musste mit reduzierten Signalverstärkung aufgenommen werden, woraus sich schließen lässt, dass das Signal im Vergleich wesentlich stärker als für andere Fusionsproteine ist. Somit ist die Expression C/YFP deutlich stärker, wenn c/yfp an die codierenden Sequenzen für die N-terminalen Peptide von häufigen E.coli Proteinen fusioniert sind. Zudem reduziert sich die Expression YFP dramatisch, wenn die N-terminalen angehängten codierten RpIL Sequenzen verkürzt sind. Dabei zeigt die 2 den Effekt der systematischen Verkürzung der N-terminal angehängten codierten RpIL Sequenz. Wenn weniger als 5 Codons des N-Terminus von RpIL an YFP angehängt sind, kann unter sonst identischen experimentellen Bedingungen kein Fluoreszenzsignal detektiert werden.
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Zur Erläuterung wird auf 3 verwiesen. Diese zeigt eine graphische Abbildung des Expressionsplasmides. Gezeigt sind der induzierbare Promoter (pBAD, 1), die Ribosomenbindungsstelle (RBS, 2), die multiple Klonierungsstelle (angezeigt sind die Schnittstellen NcoI und SmaI, 3), der Transkriptionsterminator (rrnB terminator, 4), die Resistenzkassette (bla, 5), Replikationsorigins (M13 und pBR Ori, 6), die erste kodierende Sequenz zur Translationsverstärkung (X-L, 7), die zweite kodierende Sequenz, die für das Zielprotein kodiert (cfp/yfp, 8) und die für die Klonierung in die multiple Klonierungsstelle benutzten Schnittstellen (NcoI und SmaI, 9).
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Ergebnisse
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Wie an dem Beispiel der nicht oder nur schwach in Escherichia Coli produzierten Proteine CFP und YFP gezeigt, wird eine N-terminale Fusion der ersten kodierenden DNS Sequenz (RplL) und einer zweiten kodierenden DNS Sequenz (hier CFP und YFP) mit molekularbiologischen Methoden hergestellt. Anschließend wird das Fusionsprodukt in ein Expressionsplasmid kloniert und in Escherichia Coli Zellen transformiert. Die Induktion der Expression führt anschließend zu der gewünschten Produktion der Proteine CFP und YFP. Ohne N-terminale Fusion mit der ersten kodierenden Sequenz werden nach Induktion weder CFP noch YFP produziert. Somit erhöht beziehungsweise ermöglicht Die N-terminale Fusion mit der ersten kodierenden Sequenz die Produktion von bisher nicht oder nur in geringer Menge in Escherichia Coli herstellbarer Zielproteine.
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Es wurde gezeigt (siehe 4), dass die YFP mRNA Menge im Vergleich zur YFP mRNA Menge ohne N-terminalen Anhang mit zunehmender RplL Codon Anzahl zunimmt, sodass sich die mRNA Stabilität mit zunehmender RplL codon Länge erhöht was zusätzlich zu einer Erhöhung der Zielproteinmenge beiträgt.
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Drei unterschiedliche chromosomale cfp Integrationen in den fis Locus wurden auf CFP Expression untersucht (6). 5 zeigt die Ergebnisse von Fluoreszenzmessungen der unterschiedlichen Konstrukte. Zu beachten ist, dass im fis Locus integriertes cfp in kaum detektierbaren Fluoreszenzsignal resultiert, während rplL-cfp signifikant mehr Fluoreszenz produziert als die translationale Fusion zu dem N-Terminus des fis Gens, welche wie von anderen gezeigt die höchste lacZ Aktivität in einer Reihe fis Promoter-lacZ Fusionen in diesem Operon aufwies (Ninnemann, O., Koch, C., Kahmann, R. (1992) The E.coli fis promoter is subject to stringent control and autoregulation. Embo Journal 11 (3) 1075–1083).
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Zusammenfassend folgt, dass die translationale Fusion von kodierenden Sequenzen N-terminaler Peptide häufig in der Zelle vorkommender E.coli Proteine an cfp und yfp, die kaum detektierbar sind wenn sie ohne N-terminales Fusionspeptid expremiert werden, verstärkt deren Expression enorm. Der Grad der Expressionsverstärkung hängt sowohl vom gewählten Peptid, als auch von dessen Länge ab. Der N-terminale Teil von RplL aktiviert die Expression von CFP und YFP am stärksten und sollte dies auch bei beliebigen schwer in E.coli expremierbaren Genen tun. Deshalb könnte die kodierende Sequenz des N-terminalen Teils von RplL als funktionale Einheit einer neuen Generation von starken und zuverlässigen E.coli Expressionsvektoren höchst nützlich sein.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- „visualisation of differential gene expression by improved cyan florescent Protein and yellow florescent Protein production in Bacillus subtilis in der Zeitschrift Applied and Environmental Microbiology (70 (11) 6 8 09-6815)” von Veening et al. [0005]
- „molecular cloning, a labatory manual” von Sambruck und Russel, 2001 [0065]
- Ninnemann, O., Koch, C., Kahmann, R. (1992) The E.coli fis promoter is subject to stringent control and autoregulation. Embo Journal 11 (3) 1075–1083 [0077]
