JPH07500009A - 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 高等真核細胞に核酸を導入するための新規結合体本発明は高等真核細胞への核酸 の導入に関する。

特に遺伝子治療において生細胞に核酸を導入する効率的なシステムが望まれてい る。例えば遺伝子欠陥かある場合に該欠陥遺伝子を置換するためのように、治療 的に有効な遺伝子生産物の生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）合成を達成させるために 、遺伝子は細胞内に導入される。「従来の」遺伝子治療は、単一の治療によって 持続的治療を達成するという原則に基づいている。しかしながら、必要に応じて 一度に、または反復して医薬（［遺伝子治療薬ｊ）のように治療的に有効なりＮ Ａ　（またはｍＲＮＡ）を投与する治療法も必要とされている。期待される研究 方法として遺伝子治療が挙げられる遺伝的に原因のある病気の例には、血友病、 β−サラセミアおよび酵素アデノシンデアミナーセの遺伝的に誘導される欠乏に よって起こる症候群である［重度合併免疫不全Ｊ　（ＳＣＩＤ）がある。その他 に可能な応用には、体液性または細胞内免疫が分泌型タンパク質抗原または非分 泌型タンパク質抗原をコードする機能的核酸の投与により、免疫感作によって達 成される免疫調節があげられる。欠陥遺伝子をコードする核酸が特定の条件に各 々適合する形態において投与されるような遺伝子欠陥の他の例には筋ジストロフ ィー症（シストロフィン遺伝子）、嚢胞性繊維症（嚢胞性繊維症ｌ・ランスメン ブレン・コンダクタンス調節遺伝子）、高コレステロール血症（ＬＤＬレセプタ ー遺伝子）が含まねる。また、ホルモン、成長因子または細胞毒性または免疫調 節活性を存するタンパク質が体内で合成される場合は遺伝子治療という処置を使 用することが可能である。

また、遺伝子治療はいわゆる「ガンワクチン」を投与するガンの治療にも期待さ れているよっである。腫瘍細胞の免疫原性を高めるために、腫瘍細胞は変化して それらがより免疫原性を発揮するようになるか、または免疫応答を誘発するため にサイトカインのような一定の免疫調節物質を生産するようになる。これは該細 胞にサイトカイン、例えはＩＬ−２、化−４、ＩＦＮ〜γ、ＴＮＦ−αをコート するＤＮＡをトランスフェクションすることによって行われる。今日までのとこ ろ、自己復製する腫瘍細胞への遺伝子転移はレトロウィルスベクターを介して行 われている。

リボザイムと同様にアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの活性の様式は、生体内に おける一定の遺伝子（調節されていない腫瘍遺伝子またはウィルス遺伝子等）の 発現を阻害するための治療薬としてそれらを使用することを可能にしている。既 に、短いアンチセンス・オリゴヌクレオチドを細胞内に導入して、中でも核酸の 強い負電荷の結果として細胞膜による取り込みが制限されることによって生じる ような低い細胞内濃度でさえも、それらの阻害効果がそこで現れたことが示され た（ザメクニク（Ｚａｍｅｃｎｉｋ）等、１９８６）。

試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での咄乳類細胞への遺伝子転移のための各種の方 法は知られているが、生体内での使用は制限されている（それらにはリポソーム 、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ− デキストランまたはリン酸カルシウム沈殿法によるＤＮＡの導入が含まれる）。

最近、それらの親ウィルスの効率的な侵入メカニズムを用いることによる遺伝子 転移をもたらすための生物学的ベクターが開発された。この戦略は試験管内およ び生体内において非常に効率的な遺伝子転移を達成するために、組み換えレトロ ウィルスおよびアデノウイルスヘクターの構築に使用された（バーフナ−（Ｂｅ ｒｋｎｅｒ）　、１９８８）。それらの効率のすへてに関して、これらのベクタ ーは転移されるＤＮＡのサイズおよび構造の点て制限を受ける。さらに、これら の試薬は元のウィルスの生育可能なウィルス遺伝子要素を同時転移という点て安 全性についての危険性を有している。従って、例えば、レトロウィルスの使用は ウィルスによる感染のような副作用（内在性ウィルスとの組み換え、またはヘル パーウィルスの混入および病原型への変異か続く可能性）またはガンの形成とい う危険性を少なくとも少量の割合で含むために、その使用には問題が残る。さら に、患者の体細胞の安定な形質転換は、レトロウィルスによって達成される場合 は、もし副作用が発生した場合などに、その治療を元に戻すことかさらに困難と なりうるために各場合において望ましいものではない。

これらの制限を回避するために、細胞を高分子の転移のために使用するメカニズ ムに基づく遺伝子転移のための別の戦略が開発された。この−例として受容体仲 介エンドサイト−シスの極めて効率的な経路を介して細胞に遺伝子を転移するも のがある（つ（Ｗｕ）およびつ（Ｗｕ）、１９８７、ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ） 等、＋９９０およびＢＰ−ＡＩ　０３８８７５８　）。この方法はＤＮＡ結合ド メインと細胞表面受容体に特異性を有するドメインを有する三機能性分子結合体 を使用する（つ（Ｗｕ）およびつ（Ｗｕ）、１９８７、ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ ）等、１９９０）。認識ドメイン（以後「インターナライジング因子」と呼ぶ） が細胞表面受容体により認識されると、その結合体が受容体仲介エンドサイト− シスの経路によって取り込まれ、該結合体に結合しているＤＮＡもまた転移され ることになる。この方法を使用すると、従来の方法で達成されるのと少なくとも 同等の遺伝子転移率を達成することができる（センダ（Ｚｅｎｋｅ）等、１９９ の。

このベクターシステムは適当な細胞表面受容体を有する細胞に大量のＤＮＡを転 移することができるが、対応する遺伝子発現が転移量と一致しないことが非常に 多い（コツトン（Ｃｏｔｔｅｎ）等、＋９９０）。この現象の理由としては受容 体仲介エンドサイト−シスにより細胞内に運搬されたＤＮＡかリゾソームに沈着 し、そこで分解するためであると中でも考えられた（センダ（Ｚｅｎｋｅ）等、 １９９０、コツトン（Ｃｏｔｔｅｎ）等、１９９の。それゆえにリゾソーム中に 取り込まれたＤＮＡは細胞内の運搬システムを残すための特定のメカニズムを全 く有しないという事実はこの輸送システムに固有の制限を構成している。

本発明の目的は、この制限を軽減または消滅させることである。

多くのウィルスは、主として受容体仲介エンドサイト−シスのメカニズムに対応 するメカニズムによって真核細胞宿主に侵入する。このメカニズムに基づくウィ ルス感染は一般的に細胞膜上の受容体に対するウィルス粒子の結合とともに開始 する。この後、ウィルスは細胞の中に取り込まれる。この取り込み過程は細胞中 への生理学的リガンドまたは高分子の侵入に対応する共通の経路に従う、最初に 、細胞表面上の受容体が群になって各自整列して所謂「被覆膜孔（ｃｏａｔｅｄ 　ｐｉｔ）」を形成し、膜が内部に逆転し被覆によって囲まれた小胞（ｖｅｓｉ ｃｌｅ　）を形成する。この小胞がクラスリン・コートから抜は出した後、膜に 存在するプロトンポンプによりその内部で酸性化が起こる。これがウィルスのエ ンドソームからの放出を誘発する。ウィルスが脂質被覆を有しているかどうかに 依存してエンドソームからのウィルスの放出には２つのタイプが考えられている 。いわゆる「裸の」ウィルス（例えばアデノウィルス、ポリオウィルス、ライノ ウィルス）の場合、低ｐＨがウィルスタンパク質の構造に変化を起こすと提唱さ れている。これにより生理学的ｐＨては接近しえない疎水性ドメインが露出する 。このようにこれらのドメインはエンドソーム膜と相互作用し、それによってエ ンドソームから細胞質ヘウイルスゲノムを放出させるための能力を獲得する。被 覆を有するウィルス（水庖性口炎ウィルス、セムリキ森林熱ウィルス、インフル エンザ・ウィルス等）の場合は、低ｐＨがいくつかのウィルスタンパク質の構造 または立体配座を変化させ、それによりエンドソーム膜とウィルス膜との融合が 進行すると考えられている。

このメカニズムにより細胞内に侵入するウィルスは細胞質への侵入を獲得するた めにエンドソーム膜の破壊を可能にする一定の分子的特性を有している。

他のウィルス、例えば被覆ウィルスではセンダイ、ＨＩＶおよびある腫のモロニ ー白血病ウィルス、また非被覆ウィルスではＳＶ４０およびポリオーマは、細胞 への侵入のために低ｐｌを必要としない：これらは細胞の表面上で直接膜に融合 するか（センダイ・ウィルス、おそら＜ＨＩＶも）、または細胞膜を分解するか またはそれを通過するメカニズムを誘発することかてきる。ｐＨに依存していな いウィルスもエンドサイト−シスの経路を使用することができると考えられてい る（マクルレ（ＭｃＣｌｕｒｅ）等、１９９０）。

本発明に先行する実験において、インターナライジング因子に任意に結合したポ リカチオン、例えばトランスフェリン・ポリリジン結合体と核酸か複合体を形成 している核酸複合体による遺伝子転移は、アデノウィルス、特定のレトロウィル スまたは該ウィルスフラグメントによる処理により存意に増加することが確認さ れた。この効果はこれらのウィルスかエンドサイト−シスというメカニズムによ り細胞内に取り込まれ、例えはアデノウィルスの場合のようにエンドソームを打 ち破ることにより小胞システムから開放するための特別のメカニズムを有してい るという現象を利用することによって達成される（バスタン（Ｐａｓｔａｎ）等 、１９８６）。

これらの観察から出発して、本発明の課題は機能性構築物の統合部分としてウィ ルスを含む生物結合体を開発することによって解決した。

従って、本発明は、高等真核細胞に核酸を導入するための、核酸と複合体を形成 する能力を存しかつインターナライジング因子および核酸に対する親和性を有す る物質を含む結合体に関する。該結合体はインターナライジング因子が抗体を介 して核酸結合物質に結合されているウィルスであり、その結果、それ自体が結合 体／核酸複合体の一部として細胞に侵入し、カリ、細胞に侵入後腹合体が存在す るエンドソームの内容物を細胞質に放出することができるという特徴を有する。

さらに別の側面において本発明は本発明による結合体が核酸とともに形成する複 合体に関する。

ウィルスが細胞に侵入し、結合体／核酸複合体が存在するエンドソームの内容物 を細胞質に放出するという能力を以後「取り込み機能」と呼ぶ。

本発明による結合体は、インターナライジング因子結合体に基づくベクターシス テムの利点とウィルスがこれらのシステムにもたらす利点とを組み合わせている 。受容体仲介エンドサイト−シスによる遺伝子転移と比べて、本発明によるウィ ルス・ポリカチオン・ＤＮＡ複合体は、これらが従来の分子結合体システムに内 在する基本的制限を回避するという、即ち、従来の結合体とは異なり、細胞小胞 システムから放出されることを可能にする特定のメカニズムを有しているという 利点を存している。生物学的ベクターと比べて、本発明によるベクターシステム は輸送される外来ＤＮＡがピリオンの外側上に運ばれるという点で組み換えウィ ルスベクターとは基本的概念の逸脱を構成する。従って、本発明による結合体は 配列に関していかなる種類の制限を伴わずに、細胞内に非常に大きい遺伝子構築 物を輸送しうる。

一方、適当なウィルスには、受容体仲介エンドサイト−シスにより細胞に侵入す ることができ、エンドソームから細胞質への放出−それゆえ核酸の放出−を引き 起こすことができるものが含まれる。（さらに本発明の範囲内のウィルスの好適 性は、さらにそれらが核酸複合体の成分であるときでさえもこの性質を維持して いるという点て定義される。）この理論に束縛されることを望むわけてはないが 、エンドソームの内容物を放出するというウィルスの能力がエンドソームとリゾ ソーム間の融合を阻害し、その結果これらの細胞オルガホラ中で通常生じる酵素 的分解を阻害する限りにおいて、本メカニズムは細胞内に輸送された核酸複合体 に恩恵を提供しうる。

高等真核細胞は良く知られているものであるが酵母は含まれない。（ワトソン（ Ｗａｔｓｏｎ）等、１９８７）。アデノウィルス感染力河能な高等真核細胞の例 はフィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）およびナイブ（にｎ１ｐｅＸ１９９０）によって 報告されている。

感染の開始時に起こる取り込み機能が受容体仲介エンドサイト−シスによって生 し、かつこの性質によって本発明の結合体の一部として好適であるウィルスには 、一方ではアデノウィルス、ポリオウィルス、ライノウィルスのような脂質被覆 を有しないウィルスが含まれ、そして他方では外皮を被ったウィルスである水庖 性口炎ウィルス、セムリキ森林熱ウィルス、インフルエンザ・ウィルス、モロニ ー・ウィルスのｐＨ依存株も好適である。特に本発明において使用するのに好適 なウィルスは、アデノウィルス・サブグループＣ、タイ方、セムリキ森林熱ウィ ルス、水庖性口炎ウィルス、ポリオウィルス、ライノウィルスおよびモロニー白 血病ウィルスである。逆転写酵素を有しないＲＮＡウィルスを本発明のために使 用することは、そのようなウィルスの存在下でのトランスフェクションが細胞中 でウィルスＤＮＡの生成を導かないという利点を有している。

本発明から誘導される重要な利点とは、転移されるへきＤＮＡが標準の組み換え ウィルスベクターを使用する場合のように親ウィルスのゲノム中に組み込まれな いということである（バーフナ−（Ｂｅｒｋｎｅｒ）　、１９８８　：　エグリ チス（Ｅｇｌｉｔｉｓ）およびアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、１９８８を 参照）。従って、本発明は転写が親ウィルス遺伝子中のプロモーターに依存しな いために、発現されるべき外来遺伝子配列の設計に関して非常により大きな柔軟 性を提供する。さらに、この戦略は、ウィルスのパッケージングの制約が外部上 に運搬されつるＤＮＡ量を制限しないことから転移しうるＤＮＡのサイズを非常 に大きくすることができる。これらの実質的かつ直接的利点に加えて、重要な潜 在的安全性の特徴がベクターの設計から誘導される。従来の組み換えウィルスベ クターは親ウィルスのゲノム要素の必然的供給を仲介しており、そこから潜在的 な安全に関する障害が発生する（レドリー（Ｌｅｄｌｅｙ）、１９８９　；アン ダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、＋９８４）、本発明の結合体はウィルスの侵入 特性を選択的に利用しているため、ウィルスゲノムは本質的な特徴ではない。こ の設計により、親ウィルスからの生活力のある遺伝子の転移から派生する安全障 害を最小にするために機能的および／または構造的に“不活性化したウィルスゲ ノム”を使用して本システムを修正することが可能になる。

本発明の範囲内において、上で定義したような取り込み機能を存するならば、ウ ィルスという語には野生型に加えて、１以上の変異の結果として取り込み機能以 外の野生型の一定の機能、特には複製能力を欠いた変異体も含まれる。しかしな がら、以下に定義する「ターナリー複合体Ｊの一部として使用され、かつ、該変 異体ウィルスがそのエンドフロモリチック（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ　）活 性を失っていないかぎり、取り込み機能を欠いた変異体も本発明の実施において 使用することができる。

変異体は、複製機能および取り込み機能の原因となりかっパッケージング・ライ ンによる補填が可能なウィルスタンパク質領域における変異によって従来の突然 変異誘発法によって生成しうる。例えば、アデノウィルスの場合、ｔｓ−変異体 （温度感受性変異体）　、　ＥＩＡ−およびＥＩＢ−変異体、ＵＰ−駆動遺伝子 に変異を示す変異体（バーフナ−（Ｂｅｒｋｎｅｒ）　、１９８８）および一定 のキャプシドタンパク質の領域に変異を示す変異体が含まれる。対応する天然の 変異を有するウィルス株も好適である。ウィルスの複製能は、例えば文献から知 られるプラーク検定法で調べることができ、この方法においては細胞培養液を種 々のウィルス濃度の懸濁液で覆い、プラークにより観察できる分解細胞の数を記 録するのである（ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）、１９８の。

本発明の範囲内で使用するのに好適な他のウィルスにはいわゆる欠陥ウィルス、 即ち１以上の遺伝子において自己ウィルス複製に必要な機能を欠き、そのためヘ ルパーウィルスを必要とするようなウィルスが含まれる。このカテゴリーの例に は、感染性の標準ウィルスから誘導され、標準ウィルスと同様の構造タンパク質 を有し、変異を有し、かつ複製のためのヘルパーウィルスとして標準ウィルスを 必要とするＤＩ〜粒子（欠失妨害粒子）がある（ハング（Ｈｕａｎｇ）　、１９ ８７　；ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）　、１９９０）。また、このグループの 例には、サテライト・ウィルスが含まれる（ホーラント（Ｈｏｌｌａｎｄ）　、 ＋９９０）。もう一つのグループにはアデノ関連ウィルスと呼ばれるベルボウイ ルスのクラスがある（バーンズ（Ｂｅｒｎｓ）　、１９９０）。

多くのウィルスの細胞への取り込みサイクルはまだ十分に説明されていないので 、本発明での好適な使用に必要とされるエントソモリチック活性を有するその他 のウィルスが存在するということを想定しなければならない。

また、弱毒化生ワクチン（ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）、１９８０）また はワクチン化株は本発明の範囲内で好適である。

また、本発明の範囲内のウィルスという語には、無傷のウィルスの取り込み機能 を維持しているという条件下で、不活性化ウィルス、例えばホルムアルデヒドに よる処理のような化学的処理、ｕ■前照射Ｕｖ照射の組み合わせた化学的処理、 例えばソラレン・Ｕ■照射、ガンマ線照射または中性子衝突で不活性化したウィ ルス並びにウィルスの一部、例えば核酸の抜けたタンパク質部分（空のウィルス キャプシド）が含まれる。

ワクチンとしても使用される不活性化ウィルスは、例えば文献から知られている 従来法で調製され（デービス（Ｄａｖｉｓ）およびダルベラ＝７（Ｄｕｌｂｅｃ ｃｏ）、１９８０．　バースト（Ｈｅａｒｓｔ）およびサリイ（Ｔｈｉｒい、１ ９７７）　、本発明の結合体の成分として好適であるかどうか調べるために試験 される。

おそらくウィルスはその取り込み機能に必要ではない領域に外来のエピトープを 有するキメラウィルスである。しかしながら、このようなキメラウィルスがその 取り込み機能を失ったときでさえ、このウィルスがエンドフロリチック特性を失 っていないかぎり組み合わせ複合体の範囲で使用しつる。

実行するべき特定のトランスフェクション用のウィルス、不活性化ウィルスまた はウィルス成分を選択するために、例えば先ず核酸／ポリカチオン複合体が標的 細胞に取り込まれる際に影響を有するかどうかを判定する予備実験においてウィ ルスを調査するだめの方法を使用してもよい。さらに、その取り込み機能を、小 結合体、例えばトランスフェリン−ポリカチオン結合体またはトランスフェクト するべき標的細胞に特異的な別の小結合体とともにトランスフェクションにおい てそれを使用して、レポーター遺伝子の発現を測定することにより遺伝子転移能 を増加させる能力をチェックすることによって試験してもよい。

無傷ウィルスを使用する場合、ウィルスが複製できるかどうかを見るために、提 案されたトランスフェクションに対する好適性についてウィルスを調へる予備試 験も同時に平行して行うことが望ましい。複製能力の調査は細胞毒性ウィルスの 場合または宿主細胞の生育を著しく阻害するウィルスの場合にはプラーク検定法 （上述）を使用して行う。他のウィルスの場合は、問題のウィルスに特異的な検 出法、例えばヘマグルチネーション試験、又は物理化学的方法（電子顕微鏡を使 用する）が使用される。

本発明の範囲内において、好ましいウィルスは、高力価で生産することができ、 安定であり、天然の状態で病原性が低く、複製能力を標的とした除去が可能であ るようなウィルスであり、特にはアデノウィルスである。もし、特定の細胞集団 がトランスフェクションされる場合、この細胞集団に特異的に感染するウィルス が好ましい。もしトランスフェクションが異なる細胞型を攻撃することを意図す るものであるならば、広範囲の細胞型に感染性を示すウィルスが使用される。

いずれの場合にも、本発明を生体内で治療用に使用する場合、安全性に関する危 険性、特に細胞内でのウィルスの複製および宿主ＤＮＡとウィルスＤＮＡの組み 換えの危険性をできるかぎり少な（するようなウィルスまたはウィルス成分のみ が使用される。

予備試験において、アデノウィルス調製物を慣用の四滅菌ランプまたはホルムア ルデヒドを用いて不活性化したところ、意外にもウィルスの失活の程度が遺伝子 転移効果の減少よりも実質的に大きいことが分かった。このことは、活性ウィル スにおける通常の感染メカニズムに関連するメカニズムを遺伝子転移に必要な効 果を除外すること無しに破壊することができることを明確に示している。

本発明により使用される核酸に対する親和性を有する物質には、例えば、ポリリ ジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンのようなホモポリカチオン、または２以 上の異なる正電荷を帯びたアミノ酸を有するヘテロポリカチオンであって、異な る鎖長を持つもの、およびポリエチレンイミンのような非ペプチド合成ポリカチ オンも含まれる。また、核酸に対する親和性を有する好適な他の物質にはヒスト ンまたはプロタミンまたはその類似体またはそれらの断片のようなポリカチオン 性の天然のＤＮＡ結合タンパク質がある。

細胞への結合体の侵入を容易にするかまたはこの細胞型に対するリガンドを構成 するウィルスによる形質転換に対する所定の細胞株の感受性は、標的細胞上のウ ィルスに関する受容体の存在および数に依存する。細胞表面上のアデノウィルス 受容体の数の測定方法はＨｅＬａ細胞およびＫＢ細胞に関してはスベンソン（Ｓ ｖｅｎｓｓ。

ｎ）、１９８５およびデファー（Ｄｅｆｅｒ）、１９９０に報告されている。ア デノウィルス受容体は公平に分散して発現されていると考えられている。

それゆえに、アデノウィルスまたはその一部を含むベクターシステムを用いて多 くの細胞株を形質転換することができる。しかしながら、ある高等真核細胞はほ とんどまたは全くウィルス受容体を有していない。この様な細胞を形質転換する 場合、核酸に対する親和性を有する物質に結合しているインターナライジング因 子の第２結合体であって、そのインターナライジング因子が高等真核細胞の表面 受容体に特異的であり、そのウィルス結合体およびインターナライジング因子結 合体が核酸と複合しているような結合体を使用する必要がある。この様な複合体 をうまく使用することでアデノウィルス受容体の細胞表面密度が比較的低い呼吸 器管上皮細胞のような高等真核細胞の形質転換を行うことができる（例えば、細 胞株Ｈｅευ。

従って、本発明の好ましい態様においては、複合体には場合によってはウィルス 結合体に加えて、一般にはウィルス結合体の場合と同様の核酸に対する親和性を 有している物質が標的細胞に対する親和性を有するインターナライジング因子と 結合しているような他の結合体が含まれる。本発明のこの態様は特に標的細胞が ウィルスに対する受容体を全くまたはほとんど有していない場合に使用される。

別のインターナライジング因子−結合因子結合体の存在下で、これらのエンドソ モリチック結合体は第２結合体とともに核酸と複合体を形成し、以後「組み合わ せ複合体」または「ターナリー複合体」と呼ばれる生成した複合体の一部として 細胞に取り込まれることによって第２結合体の取り込み活性の恩恵を受けている 。

特に、（別の）インターナライジング因子の使用が核酸複合体の取り込みを可能 にするかまたは改良するかとうかを決定するための予備試験は、先ず付加的イン ターナライジング因子なしに、即ち核酸とウィルス結合体を含む複合体ととも。

に、次いで核酸が標的細胞が受容体を有するための付加的インターナライジング 因子を含む別の結合体と結合しているような複合体とともに、核酸複合体ととも にトランスフェクションを平行して行うことによってなされる。別のインターナ ライジング因子を使用する場合は、それは特に標的細胞、例えばあるタイプの細 胞への核酸の標的転移を可能にする該細胞型に特異的な表面抗原又は受容体によ り限定される。

本発明の目的にとって［インターナライジング因子］という語は、細胞への結合 後、エンドサイト−シス、好ましくは受容体仲介エンドサイト−シスにより取り 込まれるかりガントまたは断片、またはその結合または取り込みが細胞膜の要素 との融合によって進行する因子を示す。

好適なインターナライジング因子には、リガンドであるトランスフェリン（クロ ースカー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ）等、１９８３）　、フンアルブミン（セネット（ Ｓｅｎｎｅｔｔ）等、１９８１）　、アシアログリコプロティン（アシアロトラ ンスフェリン、アシアロロソムコイドまたはアシアロフェチュイン等）（アッシ ュウェル（Ａｓｈｗｅｌｌ）等、１９８２）またはレクチン（ゴールドシュタイ ン（Ｇｏｌｄａｔｅｉｎ）等、１９８０およびシャートン（Ｓｈａｒｄｏｎ）　 、１９８７）またはガラクトースを含みアシアログリコプロティン受容体により 取り込まれる物質、マンノシル化糖蛋白質（ストール（Ｓｔａｈｌ）等、１９８ ７）、リソソーマル酵素（スライ（Ｓｌｙ）等、１９８２）　、ＬＤＬ（ゴール ドシュタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｊｎ）等、１９８２）　、修飾ＬＤＬ（ゴールド シュタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）等、１９７９）　、受容体を介して細胞に取 り込まれるリポ蛋白質（アポＢ１００／ＬＤＬ）　、　ＨＩＶ蛋白質ｇｐ１２０ 等のウィルス蛋白質、例えば抗ＣＤ４および抗ＣＤ７等の細胞表面抗原に対する 抗体（メルマン（Ｍｅｌ　１ｍａｎ）等、１９８４　、クン（Ｋｕｈｎ）等、１ ９８２．アブラハムソン（Ａｂｒａｈａｍｓ。

ｎ）等、１９８２）またはその断片、インターロイキン−２（スミス（Ｓｍｉ　 ｔｈ）等、１９８５）、ＴＮＦ（イマムレ（１ｍａｍｕｒｅ）等、１９８７）　 、インターフェロン（アンダーフン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）等、１９８２　）　、 ＣＳＦ　（コロニー刺激因子）（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）等、１９８７）等 のサイトカイン類、インシュリン（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌ　ｌ）、１９８ ５）　、ＥＧＦ　（上皮成長因子）（カーベンターＣＣａｒｐｅｎｔｅｒ）　、 １９８４）　、　ＰＤＧＰ　（血小板由来成長因子）（ヘルジン（Ｈｅｌｄｉｎ ）等、１９８２）　、ＴＧＦＢ　（形質転換成長刃子β）（マサグ（Ｍａｓｓａ ｇｕｅ）等、１９８６）　、神経成長因子（ホサン（）Ｉｏｓａｎｇ）等、１９ ８７）　、インシュリン様成長因子Ｉ（シャルチ（Ｓｃｈａｌｃｈ）等、１９８ ６）　、ＬＨ，ＦＳＨ（アスコリ（Ａｓｃｏｌ　Ｄ等、＋９７８）　、成長ホル モン（ヒズカ（Ｈｉｚｕｋａ）等、１９８１）　、プロラクチン（ボスカー（Ｐ ｏｓｎｅｒ）等、１９８２）　、グルカゴン（アサダ・クボタ（Ａｓａｄａ−Ｋ ｕｂｏｔａ）等、１９８３）　；チロイドホルモン（チェノ（Ｃｈｅｎｇ）等、 １９８０等の因子または成長因子、α〜２−マクログロブリンプロテアーゼ（カ ブラン（Ｋａｐｌａｎ）等、＋９７９）　、および［ジイスアームρ（ｄｉｓａ ｒｍｅｄ）　Ｊ　トキシン類が含まれる。その他の例にはＦｃ−受容体に対する リガンドとして免役グロブリンまたはその断片またはＳ１ｇ　（表面免役グロブ リン）に結合する抗免役グロブリン抗体がある。このリガンドは天然のものでも 合成したものでもよい（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｓｅｅ、　（１ ９８９）および本明細書で引用している文献参照）。

以下に示したものは本発明に従うようなインターナライジング因子の適性に関す る必要条件である。

（ａ）核酸が導入されるべきてあり、結合因子と結合している場合にもその導入 活性が全くまたは殆ど影響を受けないような特定の細胞型によって取り込まれる ことができるということ。

（ｂ）この性質の範囲内で、使用される経路を介して核酸を「ピギーバッタ方式 」て細胞内に運びうろこと。

この理論に拘束されることなく、組み合わせ複合体はインターナライジング因子 に特異的な表面受容体への結合、またはウィルスまたはウィルス成分が使用され る場合には、ウィルス受容体への結合または受容体仲介エンドサイト−シスによ る両受容体への結合のどちらかにより細胞によって取り込まれる。エンドソモリ チンク物質がエンドサイトから放出される場合、複合体中に含まれるＤＮＡも細 胞質中に放出され、その結果リソソーマル分解か免れる◇ＤＮＡ複合体中のエン ドソモリチック結合体の成分としてのウィルス、ウィルス成分または非つィルス 性エンドソモリチック試剤の存在は以下に示す利点を有している。

ｌ）特にウィルスまたはウィルス成分を使用する場合にはエンドソモリチック試 剤はインターナライジング因子を構成したりあるいは他のインターナライジング 因子（例えばトランスフェリンまたはアシアロフェチュイン）と共にＤＮＡと結 合して複合体を形成しうることによる、核酸複合体を用いた遺伝子転移技術の広 範囲な応用。この点において、問題のウィルスに対する受容体を全く持たない細 胞に対してさえ該ウィルスの積極的作用を利用することができる。

２）ＤＮＡに対するエンドソモリチック結合体の結合によってそれらが一緒に細 胞内へ取り込まれることか保証されることによる、遺伝子転移の効率の改善。ま た、ウィルスおよびＤＮＡの一致した取り込みおよび放出は効率的な遺伝子転移 に必要とされるＤＮＡおよびウィルス量の軽減の可能性を生じさせ、このことは 生体内で使用する場合に特に重要となる。

本発明に従って行う実験において、ヒトトランスフェリンを付加的インターナラ イジング因子として使用した。さらに、本発明の結合体の性能は付加的インター ナライジング因子−結合因子結合体を含まないＤＮＡおよびポリリジン結合ウィ ルスの複合体によって証明された。

核酸に対する親和性を持つ物質に対するウィルスの結合は、核酸に対する親和性 を有する物質の抗体への共有結合により達成される。ウィルスの取り込み機能に 関係しないウィルスタンパク質領域におけるエピトープに結合する抗体を使用す ることが好ましい。

本発明の範囲内で実行される試験において、アデノウィルスとポリカチオン間の 結合はアデノウィルス・キャプシドに対する特異性を有する抗体をポリリジン分 子に共有結合させることによって達成した。アデノウィルス繊維およびベントン タンパク質がウィルスの結合および細胞内へのその取り込みに必要であることが 知られているが、一方、主キャプシドタンパク質ヘクソンは、これらの過程にお いてあまり重要ではない。それゆえに、ヘクソンタンパク質上のエピトープの認 識によってアデノウィルスのポリリジンへの結合を生じさせる抗体を使用した。

この特異的な結合は、一方ではそのヘクソンタンパク質の表面領域に外来エピト ープを存するキメラアデノウィルスを用いることにより達成された。一方では、 ヘテロエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用した。（この構築物は第 １図に模式図で示した）。これはキャプシドタンパク質を機能的に破壊すること なしにアデノウィルスをポリリジンに結合させる。

ウィルスおよび核酸結合物質間の結合を確立するための特定の抗体の使用は重要 ではない。特定の抗体の好適性に関する必要条件は、ウィルスの取り込み機能を 中和しないか、または部分的にだけ中和するということである。

本発明の範囲においては、取り込み機能に関して本質的ではないウィルスタンパ ク質領域のエピトープに対する抗体が好ましい。このようなウィルス領域の例に は上述のアデノウィルスのヘクソンタンパク質またはインフルエンザの二二一ラ ミニダーゼがある。

しかしながら、取り込み機能に関係するウィルスタンパク質に対する特異性を有 する抗体も、好適な化学量論比を維持することによって抗体がウィルスの細胞結 合領域の一部分しか専有せず、その結果細胞に対するウィルスの結合に関して自 由で七分なドメインがまだ存在することが保証されるならば、好適である。一方 、複合体がさらにインターナライジング因子および核酸結合物質を含む第２結合 体を含む複合体、即ぢ組み合わせ複合体である限り、ウィルスの取り込み機能を 阻害する抗体を使用してもいい。

特定の用途に好適な抗体量は滴定で測定することができる。

モノクローナル抗体、またはそのＦａｂ’フラグメントが好ましい。

もしウィルスが外来エピトープを存するキメラウィルスであるならば、抗体はこ のエピトープに向けられる。好ましくは、このウィルスは、ヘクフン領域のコー ト配列を修正して抗体が生成することができる非対応タンパク質をコードする配 列を含むようにした場合、キメラアデノウィルスである。ヘキソンタンパク質は 、１つの非常に保存性の高い基本ドメインおよびピロン（ｖｉｒｏｎ　）の表面 に大きく露出している保存性の低い３つのループを含んでいる（ロバーツ（Ｒｏ ｂｅｒｔｓ）等、１９８６）。これらのループ中には幾つかの短い領域が存在し 、その中のＡｄ２およびＡｄ５のアミノ酸配列は異なるものでＡｄ５はＡｄ２に 比べて変異および欠失を含んでいる。これらは核酸に対する親和性を有する物質 にアデノウィルスを免疫学的に結合させるために使用される外来タンパク質をコ ードする外来遺伝子配列の挿入のための潜在的部位である。好ましくは、外来遺 伝子配列はＡｄ５遺伝子配列中に、各々部位工、■、■および■と称されるアミ ノ酸部位１６１−１６５．１８８−１９４゜２６９−２８１および４３６−４３ ８に挿入される（第８図参照）。各潜在的部位の所で、Ａｄ５ヘキソンフン子の サブクローンの部位特異的突然変異誘発により特定の制限部位を作製することが できる。非保存的アミノ酸をコードするヌクレオチドを同時に欠失させ、外来遺 伝子配列の挿入のための空間をより大きくしつる。一般に、部位Ｉ、■、■およ び■に挿入しうるアミノ酸の数が小さい（約６５個まで）ことから、外来遺伝子 配列は、エピトープと少数の隣接配列に対応するアミノ酸しかコートしていない （部位特異的突然変異誘発によりＡｃ１５ヘクソン遺伝子配列中に生成される可 能な挿入部位を第８図に示す。ヘクフンサブユニットの三次元的スケッチのため に、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）等、１９８６による表示方法を採用した。）特 定のモノクローナル抗体の外来タンパク質に対するエピトープ特異性はベブチド スキャンニングにより測定することができる。ギーセン（Ｇｅｙｓｅｎ）等、１ ９８４゜１９８５．１９８６．１９８７、ＢＰ−Ａ−３９２，３６９（本公開は 本明細書において参考として引用する）を参照。　本方法に従い、外来タンパク 質の重複する８アミノ酸ペプチドを固相合成法により調製した。例えば、ペプチ ド１はアミノ酸１−８からなり、ペプチド２はアミノ酸２−９からなるという具 合に調製した。合成後、ペプチドは固相担体に結合したままにしておく。ＥＬ［ ＳＡにより固定化ペプチドに対する反応性について、ハイブリドーマ細胞培養上 清またはその精製したモノクローナル抗体について試験した。一度エピトープ領 域を同定すれば、エピトープ領域をコードする遺伝子配列は領域■、■、■また は■の制限部位の任意のところに挿入される。

タンパク質およびこのタンパク質に特異的な抗体の例はた（さんある。当業者は せいぜい決まりきった実験を行うだけで本発明において使用できる外来タンパク 質−抗体の組み合わせを選択することかできる。例えば、それに対する抗体が既 知であるようなタンパク質をコードする既知の配列をアデノウィルスのヘクフン 領域に挿入する。それから生成したキメラウィルスについて、例えば競合実験、 ＥＬ［ＳＡまたは他の免役検定法において標識抗体に対する免疫学的結合に関し 試験することができる。このような免役検定技術は既知であり、当業者により決 まりきまった方法で実施されている。

抗体−ポリカチオン結合体はペプチドを結合するためのそれ自体既知の方法、好 ましくはワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等、１９９０およびＥＰ−Ａｔ　３８８７５ ８に報告されている方法を使用して化学的に製造することができる。

モノクローナル抗体が重鎮の定常領域に好適な炭水化物側鎖、特に末端がシアル 酸のものを有している場合には、結合体はワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等、１９９ １ｂに報告されている方法を使用してポリカチオンを炭水化物側鎖に結合するこ とによって調製することができる。

本発明のもう一つの側面は、核酸並びに、インターナライジング因子および核酸 に対する親和性を有する物質の結合体を含む複合体であって、高等真核細胞に取 り込まれる複合体に関する。この複合体は、インターナライジング因子が抗体を 介して核酸に対する親和性を有する物質に結合するウィルスであり、その結果、 結合体／核酸複合体の一部として細胞に侵入し、細胞に侵入した後に複合体が存 在するエンドソームの内容物を細胞質中に放出する能力を有することを特徴とし ている。

核酸複合体の定性的組成に関しては、一般に細胞に転移するべき核酸を最初に決 定する。核酸は細胞内で達成すべき生物学的効果によって主として定められ、遺 伝子治療のために使用する場合には、例えば欠陥遺伝子を置換することを目的と して発現されるべき遺伝子または遺伝子断片、または阻害すべき遺伝子の標的配 列によって決定される。細胞に輸送するべき核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよ（、 核酸配列に制限はない。

もし、本発明をガンワクチンとして使用するために腫瘍細胞に適用するならば、 細胞内に導入されるへきＤＮＡは免役調節物質、例えば［Ｌ−２、■シー４、［ ＦＮ−γ、Ｗ−αのようなサイトカインをコードすることが好ましい。サイトカ インをコードするＤＮＡの組み合わせ、例えば、［Ｌ−２およびＩＦＮ〜γの組 み合わせは特に有用である。

腫瘍細胞への挿入のために有用なその他の遺伝子には多薬剤耐性遺伝子（ｍｄｒ ）がある。

また、細胞内に２以上の異なる核酸配列、例えば適当な調節配列の調節下にある ２つの異なるタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドまたは異なるｃ ＤＮＡを含む２ｆｌ類のプラスミド構築物等を導入することも可能である。

特定の遺伝子配列を阻害するために細胞内に転移するための治療的に有効な阻害 性核酸にはアンチセンスＲＮＡまたはりボザイムに転写される遺伝子構築物が含 まれる。さらに、細胞内にオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌク レオチドを導入することも可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドには１ ５以上のヌクレオチドが含まれることが好ましい。場合によっては、オリゴヌク レオチドは重合化していてもよい。リボザイムを細胞内に導入する場合、安定化 遺伝子要素、例えば、ｔＲＮＡ遺伝子要素を含む遺伝子構築物の一部分として導 入することが好ましい。この望の遺伝子構築物はＥＰ　Ａ　０３８７７７５に開 示されている。

それらの相補性の理由から遺伝子、例えばウィルス遺伝子を阻害する核酸分子と は異なり、別の阻害様式を存する遺伝子を使用してもよい。その例にはいわゆる トランス−ドミナント変異を有するウィルスタンパク質をコードする遺伝子があ る（ハースコビッツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚ）、１９８７）。細胞内での遺伝 子の発現によって対応する野生型のタンパク質を超えるタンパク質が生成し、ウ ィルスの複製を阻害することにより「細胞性免役」を獲得した細胞が保護される 。ＨＩＶ複製を阻害することが示されている、例えばＧａｇ−１ＴａｔおよびＲ ｅｖ変異体等のような、複製および発現に必要なウィルスタンパク質のトランス ・ドミナント変異が好適である（トロン（Ｔｒｏｎｏ）等、１９８９、グリーン （Ｇｒｅｅｎ）等、１９８９、マリム（Ｍａｌｉｍ）等、１９８９）。

細胞内免役を達成するもう一つのメカニズムには例えば、いわゆるＴＡＲデコイ （ｄｅｃｏｙｓ）のような必須ウィルスタンパク質に対する結合部位を含むＲＮ Ａ分子の発現が含まれる（スレッシ＋−（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）等、１９９０） 。

ツマチック遺伝子治療で使用でき、かつ本発明により遺伝子構築物の成分として 細胞内に転移できる遺伝子の例には、因子■（ヘモフィリアＡ）（例えばウッド （Ｗｏｏｄ）等、１９８４参照）、因子■（ヘモフィリアＢ）（例えばクラチ（ Ｋｕｒａｃｈｉ）等、！９８２参照）、アデノシンデアミナーゼ（ＳＣ［Ｄ）　 （例えば、バレリオ（Ｖａｌｅｒｊ。

）等、１９８４参照）、α−１アンチトリプシン（肺のエンフィセマ）（例えば チリベルト（Ｃ４Ｊｉｂｅｒｔｏ）等、１９８５参照）または嚢胞性線維症トラ ンスメンブレン・コンダクタンス調節遺伝子（例えばリョウダン（Ｒｉｏｒｄａ ｎ）等、１９８９参照）が含まれる。

これらの例にはいかなる種の制限も含まれない。

核酸のサイズに関しては広い範囲が可能である。約０．１５ｋｂ（リボザイム遺 伝子を含むｔＲＮＡ遺伝子の場合）から約５０ｋｂ以上の遺伝子構築物が本発明 の方法で細胞内に転移され、オリゴヌクレオチドのようなより小さい核酸分子を 使用してもよい。

本発明は遺伝子配列に関して何ら制限が無く、また本発明により非常に大きな遺 伝子構築物でさえ輸送できるために、可能な応用は非常に広いということは明ら かである。

抗体−ボリカチオン：核酸のモル比を決定する場合、核酸の複合体化が起こるこ とに留意しなければならない。より初期の発明において、細胞中への核酸の最適 転移は、もしインターナライジング因子−ポリカチオン／核酸複合体が実質的に 電気的中性になるように核酸に対する結合体の比を選択すれば、達成することが できることが確認されている。もしいくらかのトランスフェリン−ポリカチオン 結合体が非共有結合ポリカチオンと置換されれば、細胞に取り込まれる核酸の量 は減少しないことが分かった；ある場合にはＤＮＡ取り込みの増加さえあった（ ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等、１９９１ａ　）、複合体内のＤＮＡは直径８０か ら１００　ｎｍのトロイド状構造に濃縮された形態で存在することが観測された 。このようにポリカチオン量は電気的中性およびコンパクトな構造の達成という ２つのパラメーターの観点から選択される一方、本発明によって好ましいとされ るように複合体の電気的中性を達成するという観点から核酸の電荷から生じるポ リカチオンの量は一般的にはＤＮＡの圧縮をも保証する。

本発明の複合体中に含まれる成分の比を決定するための好適な方法は、第一に細 胞に転移するべき遺伝子構築物を決定し、さらに、上記したように特定のトラン スフェクションに対して好適なウィルスを決定することである。それからこのウ ィルスに結合する抗体をポリカチオンと結合し、遺伝子構築物と複合体を形成さ せる。決定したウィルス量から出発して、次にこの（一定）量のウィルスと減少 していく種々の濃度のＤＮＡ複合体（場合によってはこの逆）で標的細胞を処理 することによって滴定を行う。このようにして、ウィルスに対するＤＮＡ複合体 の最適比を決定する。第２段階において、細胞を減少していく種々の濃度のウィ ルス／ＤＮＡ　？１合体混合物（複合体に対するウィルスの比は一定）で処理し 、最適濃度を決定する。好ましくは、このウィルスはアデノウィルスであって、 核酸に対する親和性を有する物質に対するアデノウィルスのモル比は約ｌ＝１か ら約１　：　１００である。

好ましい態様に関して、複合体が実質的に電気的中性である限り、ポリカチオン の長さは重要ではない。ポリリジン鎖長の好ましい範囲は約２０から約１０００ リジンモノマーである。しかしながら、所定の長さのＤＮＡに対し臨界的なポリ カチオンの長さはない。ＤＮＡが６．　ｏｏｏｂｐから成り、１２．０００の負 電荷を有する場合、ＤＮＡモル当たりのポリカチオン量は、例えば、ポリリジン ２００ては６０分子 ポリリジン４００では３０分子または ポリリジン１００では１２０分子等となる。

当業者はありきたりの実験さえすればポリカチオンの長さおよびポリカチオン量 の別の組み合わせを選択することができる。

本発明の複合体は希釈溶液の形態で存在する核酸および抗体結合ポリカチオンを 混合する事により調製することができる。開＾複合体は生理的塩濃度で調製する ことができる。別の可能性としては高塩濃度（約２　Ｍ　ＮａＣ１）を使用し、 次にゆっ（り希釈するか透析することにより生理的条件に調整する。核酸成分、 抗体−ポリカチオン結合体およびウィルスを混合する際の最良の順番は個々の予 備試験によって決定する。

本発明はもう一つの側面においては、細胞を本発明の複合体と接触させ、複合体 を取り込ませた後、そのエンドソームから複合体を放出させるという高等真核細 胞へ核酸を導入するための方法に関する。

また本発明はもう一つの側面においては、治療的に活性な核酸、好ましくは遺伝 子構築物の一部分として、およびポリカチオンを介して結合される抗体から成る 複合体を活性成分として含有する医薬製剤に関する。好ましくは、この製剤は凍 結乾燥状態の形態においてまたは深い凍結状態の好適な緩衝液中に存在し、ウィ ルス調製物は使用直前に複合体溶液と混合される。もしかすると、ウィルスは医 薬製剤中にすでに含まれていてもよく、その場合は深い凍結状態にある。任意の 不活性な医薬的に許容しうる担体、例えば、塩溶液またはリン酸緩衝液、または ＤＮＡ複合体が本発明の枠組み内で使用されるのに適した溶解性を有するような 担体を使用することができる。医薬製剤の処方するための方法はＲｅｍｉｎｉｎ ｇｔｏｎ’　ＳＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１９８０ が参照される。

おそらく、トランスフェクションに必要な成分、即ち、ＤＮＡ　、ウィルス調製 物および抗体結合体または結合パートナ−１さらにインターナライジング因子結 合体および遊離ポリカチオンはたぶん本発明の別の対象であるトランスフェクシ ョンキットの成分として適当な緩衝液中で個別にまたは部分的に分別して保存さ れる。本発明のトランスフェクションキットには、本発明による高等真核細胞へ のトランスフェクションに必要とされる物質を含む試験管、アンプル等のような １以上の容器を含む担体が含まれる。このようなトランスフェクションキットで は第一の容器に１以上の異なるＤＮＡが含まれる。第二の容器にはトランスフェ クションキットをモジュールシステムとして使用することを可能にする１以上の 異なるインターナライジング因子結合体が含まれる。各成分がすぐに使用できる 調製物として存在するか、または使用直前に混合するよう別々にしであるかは特 定の用途ばかりてはなく、安定性試験を使用して決まりきまった方法で調査する ことができる複合体の安定性にも依存している。

治療目的のためには、調製物は全身的、好ましくは静脈注射で投与される。この 型の投与のための標的器官には、例えば、肝臓、膵臓、肺、骨髄および腫瘍があ る。

最近、マウスの筋肉繊維に遺伝子を運搬するためにミオブラスト（未成熟筋肉細 胞）を使用できる可能性が示された。ミオブラストは血液中に遺伝子産物を分泌 することが示されているので、この方法は筋ジストロフィーに関連する欠陥のよ うな筋肉細胞の遺伝的欠陥の治療以外にも非常に広く応用しつる。従って、作製 したミオブラストは、血液中で作用するかまたは血液によって輸送される遺伝子 産物を運搬するために使用してもよい。

局所的適用の例には肺組織（注入用の液体または吸入用のエアロゾルとして本発 明の複合体を使用する）、肝臓、筋肉組織または腫瘍への直接的注射、胃−消化 管への局所的投与等がある。医薬組成物を投与するための別の方法にはパイル・ ダクト・システムがある。この投与方法はパイル・ダクト上の肝細胞膜への直接 的接近が可能であり、その結果血液構成物との相互作用を回避できる。

また、体外での治療的応用も可能であり、その場合治療した細胞、例えば骨髄細 胞、肝細胞またはミオブラストは体内に戻される（例えば、ボンダー（Ｐｏｎｄ ｅｒ）等、＋９９１、ダワン（Ｄｈａｗａｎ）等、１９９１）。本発明のその他 の体外の応用には、いわゆるガンワクチンに関するものである。この治療的可能 性の原理は患者から腫瘍細胞を単離し、この細胞にサイトカインをコードするＤ ＮＡをトランスフェクションするものである。次の段階において、この細胞を場 合によっては、例えば照射によって不活性化し、その結果複製は行わないがサイ トカインは発現するようにする。それから、この遺伝的に修正した細胞をそれを とってきた元の患者にワクチンの形で投与する。ワクチン部位周辺の領域におい て、分泌されたサイトカインが細胞毒性Ｔ細胞を活性化することにより部分的に 免役系を活性化する。これらの活性化した細胞は体の他の部分においてもその活 性を行使し、未処理の腫瘍細胞でさえも攻撃することができる。このようにして 腫瘍再発および転移発達という危険が軽減される。遺伝子治療にガンワクチンを 使用するための好適な操作はロゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等、１９９２ に記載されている。ロゼンバーグによって提唱されたレトロウィルスベクターの 代わりに、本発明の遺伝子転移システムを使用することができる。

アデノウィルス−抗体−ポリカチオン／ＤＮＡ複合体の遺伝子転移に関する能力 を測定する為に、レポーター遺伝子としてホチナス・ビラリス・ルシフェラーゼ をコードする遺伝子を含むプラスミド（デ・ウェット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９ ８７）をＤＮＡとして使用した。複合体のための標的細胞としてはＨｅＬａ細胞 を使用した；これらの細胞は決まった量のアデノウィルスに対する細胞表面受容 体を有している（フィリブフン（Ｐｈｉ　１ｉｐｓｏｎ）等、１９６８）。本発 明の結合体の成分（ウィルス、抗体−ポリリジン−結合体、ＤＮＡ　）を−緒に 使用する場合、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の発現に関して高い値が得ら れた（第３図）：比較実験では、アデノウィルスが非複合体化プラスミド−ＤＮ Ａの転移をわずかしか増加させないことが分かった。また、抗体結合ポリリジン （ウィルスとの結合無し）と複合体を形成するＤＮＡはＨｅＬａ細胞中にうまく 取り込まれないことも分かった。これとは極めて対照的に、ＤＮＡが抗体を介し て結合することによってアデノウィルスと相互作用することができる場合は高い 遺伝子発現の値が得られた。この効果は複合体化の前にピリオンを熱処理する時 に停止した。この処理はウィルスの構造的統合性を破壊することなしにウィルス の取り込み機能を選択的に除外するので（デファー（Ｄｅｆｅｒ）等、１９９０ ）　、これらの実験から遺伝子転移の成功に基本的に寄与しているのはアデノウ ィルスの特異的取り込み機能であるということが結論付けられる。

また、特異的な非ポリリジン結合モノクローナル抗体によるキメラアデノウィル スの表面上の外来エピトープに対する競争もまた正味の遺伝子発現の減少をもた らすことが分かった。それゆえに、複合体による機能的遺伝子転移の達成に本質 的に必要なものは、抗体結合ＤＮＡと対応するアデノウィルス表面エピトープと の間の特異的相互作用である。ポリリジン−複合ＤＮＡがアデノウィルスによっ て標的細胞中に評価できるほど転移されないというごとも分かった。このことは 、複合体の遺伝子転移能力がＤＮＡの濃縮に基づくものではなく、レポーター遺 伝子のピリオンに対する抗体仲介結合に依存していることを示している。

これに従って、ポリリジン結合抗体によって認識されるエピトープを有しないウ ィルスを使用しても、このエピトープを有するウィルスによって達成される高い 遺伝子発現値を達成することはできない。しかしながら、このウィルスは遺伝子 転移の範囲をバックグランドレベル以上まで達成することができた。アデノウィ ルスは液相を通しての細胞の高分子の細胞の取り込みを非特異的に増強すること ができることが分かっているので（デファー（Ｄｅｆｅｒ）等、１９９の、この 結果は予想されていなかった。この非特異的輸送が抗体−ポリリジン／ＤＮＡ複 合体に結合することができる特異的ウィルスよりも有意に低いレポーター遺伝子 発現をもたらすという事実は、複合体の成分の特異的結合の重要性を証明してい る。

プラスミドＤＮＡとポリリジン結合体の相互作用は、ＤＮＡ分子に有意な構造変 化をもたらし、そのもっとも顕著なものは直径８０から１００　ｎｍのトロイド 構造への収縮によって特徴付けられる（ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等、１９９１ ａ　’）。ウィルスの直径は７０から８００ｍの水準である（フィリプフン（Ｐ ｈ山ｐｓ叩）　、＋９８３）。それゆえに、立体的考察に基づき、抗体−ポリリ ジン−複合体化ＤＮＡに対するアデノウィルスの最適比はせいぜい１　：ｌであ ると考えられる。さらに、受容体仲介エンドサイト−シスの最初の取り込み段階 か行われる被覆ピットの直径は約１００　ｎｍである（ターネル（Ｄａｒｎｅｌ ｌ）等、１９７５）。この事実に基づき、このサイズを超えるマルチマーはその 取り込み能力を制限されると考えられた。本発明の範囲内でこれらの相関関係が 分析される一方、抗体−ポリリジン−複合体化ＤＮＡに対して過剰のモルのアデ ノウィルスの使用によってレポーター遺伝子の最大の発現がｌ　：ｌの比で達成 されることが示された（第４図）。それゆえに、行われた実験の範囲内において 、最適結合体は単一の抗体−ポリリジン／ＤＮＡ結合ドメインと共に単一のアゾ ノウイルスインターナライジングドメインから成るものであることが分かった。

次に、この最適比率を有するアデノウィルス−抗体−ポリカチオン結合体の遺伝 子転移効率を調へた。複合体の対数的希釈物を標的細胞に添加すると、レポータ ー遺伝子の発現も対応して対数的に減少したが（第５図）、本ベクターシステム を使用する１０６個のＨｅＬａ細胞に対して１０７個の［ｌＮＡ分子を適用する とレポーター遺伝子の検出可能な発現が生じたことは注目される。意外にも、そ れゆえにアデノウィルス−ポリカチオン−ＤＮＡ複合体の形態で細胞光たりたっ た１０個のＤＮＡ分子を用いて外来遺伝子の効率的発現が達成された。

それゆえに、ＤＮＡ取り込みの規模に関して、本発明の結合体は細胞光たり約５ ゜ｏ、　ｏｏｏ個の数のＤＮＡ分子を必要とするＤＮＡ遺伝子転移ベクターより も明らかに優れていることが示される（フェルブナ−（Ｆｅ１．ｇｎｅｒ）等、 １９８７、フェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｔ）等、１９８９、マーター（Ｍａｕｒ ｅｒ）、１９８９）、これらの方法は大多数のＤＮＡを細胞の標的領域、すなわ ちサイドシルに効率的に輸送するので（フェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｔ）等、１ ９８９、マロン（Ｍａｌｏｎｅ）等、１９８９、ロイター化ｏｙｔｅｒ）等、１ ９８２）　、本発明の結合体の効率はおそらく細胞質への外来ＤＮＡの放出の増 加に排他的に基づくものではおそらくない：遺伝子輸送の経路上の別のメカニズ ムもまた促進されているかもしれない。

アデノウィルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体の立体配置において、アデノウィル ス部分はエンドソームを破壊するための試剤および複合体のりガント下メインと しての両方の作用をする。それゆえに、所定の標的細胞に対する複合体の遺伝子 転移効率は、アデノウィルス細胞表面受容体の相対的数を反映するはずである。

大量のアデノウィルス受容体を存する（フィリブフン（Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ）等 、１９６８）　Ｈｅ罰細胞株およびＫＢ細胞株は両方ともアデノウィルス−ポリ リジン−ＤＮＡ複合体によって遺伝子転移に関して対応するような高い接近性を 示した（第６図）。対照的に、細胞株ＭＲＣ−５（ブリジャス（Ｐｒｅｃｉｏｕ ｓ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）　１９８５）および１（ＢＥ　１の特徴 である比較的少数のアデノウィルス受容体は、細胞中への複合体による低遺伝子 転移効率に反映している。

アデノウィルスに加えて別の細胞表面リガンド（インターナライジング因子）を 含む３成分複合体は、トランスフェリンまたはアデノウィルスリガンドドメイン のみを有する結合体よりも有意に高い水準を示した（第７Ａ図）。この増加の規 模は、明らかにトランスフェリン−ポリリジン−ＤＮＡ複合体とアデノウィルス −ポリリジン−ＤＮＡ複合体の相加的効果に基づくものではない。３成分複合体 はアデノウィルスまたはトランスフェリン取り込みメカニズムで取り込むことが できるので、この明らかな相互作用によって、アデノウィルスドメインが、おそ らくアデノウィルスによってもたらされるエンドサイト−シスに基づく両方の経 路による細胞への侵入を可能にしていると考えることができる。エンドソームが 破壊されるとき３成分複合体のアデノウィルス・ドメインの選択的協同作用を示 すために、アデノウィルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体に対して異なる受容性を 有する細胞株に組み合わせ複合体を作用させた（第７Ｂ図）。上皮呼吸管細胞株 はＨｅ目細胞と比べてＡｄｐＬ−ＤＮＡ複合体によって達成される遺伝子転移の 値が非常に低く（第６図）、これはこの細胞株に特徴的であるアデノウィルス受 容体の細胞表面密度が比較的低いことを反映している。これとは明確に対照的に 、３成分ＡｄｐＬ／Ｔｆ９Ｌ複合体の使用はＨｅＬａ細胞で見られる水準に匹敵 する水準の遺伝子発現をもたらした。３成分複合体による遺伝子転移に関するこ の細胞株の受容性は、アデノウィルスドメインがトランスフェリンメカニズムに より取り込まれるという考え方と一致する一方で、エンドソームの破壊を引き起 こすことによって遺伝子転移を増強するものである。これにより、結合体の構築 の際にアデノウィルスまたは他のウィルスのエンドソモリチック性を利用し、そ の事により細胞分泌小胞系から逃れることが可能になるという可能性が生ずる。

本発明の範囲内において、本発明の複合体による呼吸管上皮への遺伝子の直接的 生体内転移を薩歯類モデルにおいて証明した。これは本発明を使用して呼吸器管 上皮における一時的遺伝子発現を達成できることを支持する。組織で（ｉｎ　５ ｉｔＵ）で呼吸器官細胞の遺伝的修正を達成できることにより、呼吸器管上皮の 疾患のための遺伝子治療の戦略の可能性を開いた。実行した試験において、トラ ンスフェリン−ポリリジン−ＤＮＡ　ｆｆ１合体は低水準のレポーター遺伝子の 発現を示した。

これはこの型の結合体がエンドソームの中に閉じ込められているはずだという事 実と一致する。アデノウィルスポリリジン２成分複合体は存意に高い遺伝子発現 をもたらした。さらに、これは組み合わせ複合体ｈＴｆｐＬ／ＡｄｐＬにおいて 第２のインターナライジング因子の使用により増加した。正味の遺伝子発現がト ランスフェリン効率と一致するかとうかを調べるために、各種の型の複合体でト ランスフェリンした細胞の割合を測定した。その結果、そのような一致があるこ とが分かった；初代培養物中ｈＴｆｐＬで修正した呼吸器管上皮は１％以下のト ランスフェリン頻度であったが、ＡｄｐＬ複合体は２０から３０％の範囲の頻度 を示し、さらに組み合わせ複合体は５０％以上の修正細胞を示した。

薩歯類モデルにおいて生体内で行った実験は初代培養物で得られた結果と一致し た。１ａｃＺ組み合わせ複合体で処理したラット由来の組織学的肺切片の実験は 多数の陽性細胞を含むβ−ガラクトシダーゼ活性の不均等なゾーンを示した。こ の陽性領域は呼吸器管の細気管支および末梢領域と関連があった。

図面の簡単な説明 第１図：アデノウィルスキャブノド上に外来エピトープを含むアデノウィルス− ポリカチオン−ＤＮＡ複合体の模式図。

第２図二キメターアデノウィルスＡｄ５−Ｐ２Ｏ３の調製。

第３図・アデノウィルス−ポリカチオン−ＤＮＡ複合体を用いたＨｅＬａ細胞へ の遺伝子転移。

第４図：アデノウィルスおよびポリリジン−抗体−複合体化ＤＮＡの最適比の測 定。

第５図：アデノウイルスーポリ力チオンーＤＮＡ複合体によって達成される遺伝 子転移の測定。

第６図：アデノウィルスーポリ力チオンーＤＮＡ複合体によって仲介される各種 の真核細胞への遺伝子転移。

第７図：アデノウィルスおよびヒトトランスフェリン結合体を含む組み合わせ複 合体によって仲介される遺伝子転移。

Ａ：Ｈｅｌ、ａ細胞における組み合わせ複合体と２成分複合体の効率の比較。

Ｂ：組み合わせ複合体による遺伝子転移の効率に関するＨｅＬａ細胞および１（ ＢＥＩ細胞の比較。

第８図：ヘクフンサブユニットの三次元的表示；部位特異的突然変異誘発によっ て得られるＡＤ５ヘクソンフン子配列配列中ける可能な挿入部位。

第９図：初代呼吸器管上皮細胞培養物のトランスフェクション。正味の遺伝子転 移の相対的水準。

第１Ｏ図：初代呼吸器管上皮細胞培養物のトランスフェクション。トランスフェ リンの相対的頻度。

第１１図：生体内における気管内経路を介した遺伝子転移。生体内における正味 の遺伝子転移の相対的水準。

第１２図：生体内における気管内経路を介した遺伝子転移。呼吸器管上皮におけ る外来遺伝子発現の位置の特定。

第１３図：キメラアデノウィルス−レクチン−ポリリジンＤＮＡ　１合体の生体 内での適用。

実施例 実施例１ 抗体−ポリリジン結合体の調製 ｌ）キメラアデノウィルスＡｄ−Ｐ２０２の調製Ａｄ５ヘクソンフン子に変化を 与えるために、最初にこの遺伝子をサブクローニングする必要があった。プラス ミドｐＥｃｏＲＩＡ−Ａｄ５（バーフナ−（Ｂｅｒｋｎｅｒ）およびシャープ（ Ｓｈａｒｐ）　、１９８３）はマツプ−１ニツト（ｆｆＬｕ、　）０から７６に 相当するアデノウィルスゲノムの左部分を含んでいる。ヘクフン遺伝子は１ｌＬ ｕ、　５２とＩｎ、＋１．６０の間である。

２．３ｋｂｐのＨｉｎｄｌｌ１１５ｓｔｌ断片は変化を起こすべきヘクフン遺伝 子の部分を含んでいる。多数のＨｉｎｄｌｌｌおよび５ｓｔｌ部位がｐＨｃｏＲ ＩＡ−Ａｄ５中に含まれているので元のプラスミド中で修正したヘクフン遺伝子 を組み立てることができるようにするためにいくつかの中間プラスミドを構築す る必要があった。５ａｌｌ／ＢａｍＨＩ断片甑ｕ、　４６−６０　）は付加的な Ｈｉｎｄｌｌｌまたは５ｓｔｌ部位を全く含まないヘクフン遺伝子を含む。最初 に、５ｓｔｌまたはＨｉｎｄ１１１部位を含まないｐ１４２と称するベクター（ ＰｖｕｌＩによる制限消化およびＥｃｏＲｌ　リンカ−の挿入によって市販のプ ラスミドｐｌＢＩ２４（ＩＢｌ、　Ｉｎｃ、）から誘導したもの）を用いてアデ ノウィルスをｕｕ、０から７６まて再クローニングした。それからｍ、　ｕ、　 ２６の５ａ１１部位をＸｂａｌ断片（＋ＴＬ　ｕ、　３．７−２９）を欠失させ ることにより除外した；生成したベクターを１）１４１−１２と命名する。最後 に、所望のＨｉｎｄｌｌｌ　１５ｓｔｌ断片をＭ１３ｍｐ１８にクローニングし 、突然変異の用意ができた。キュンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、１９８５に記載の方 法を用いて生成したクローンの１つを用いて部位特異的突然変異誘発を行った。

ヘクフン遺伝子のコドン１８８がら１９４を除外し、この位置に一度だけしか生 じない唯一のＰｍ１１部位を導入した。それから得られたクローン（１６７−１ ）をＰｍ１１で切断しマイコプラズマ・ニュウモニアエ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ 　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＰＩ−タンパク質のアミノ酸９１４−９２８をコード する二本鎖オリゴヌクレオチドを挿入した（イナミネ（Ｉｎａｍｉｎｅ）等、１ ９８８）。円配列はその調製方法は以後に述べるモノクローナル抗体３０１によ って認識されるエピトープを含んでいる。修正したＨｉｎｄｌｌｌ　１５ｓｔｌ 断片をｐ１６７−１から単離し、元のプラスミドｐＥｃｏＲＩＡ−Ａｄ５にライ ゲーションして戻した。Ａｄ−Ｐ２Ｏ３の調製を第２図に示す。

２）キメラアデノウィルスに対する特異性を有するモノクローナル抗体（ＭＰ３ ０１）の調製 ａ）免疫化 標準法によってモノクローナル抗体を調製した。

マイコプラズマ・ニュウモニアエＭ−１２９株（ＡＴＣＣ＃２９３４２）を抗原 として使用した。培養フラスコ中ての培養後（）（Ｈｕ）等、１９７７）　、Ｐ ＢＳて３回洗浄し、マイコプラズマ・ニュウモニアエを回収して、０．５ｍｌの ＰＢＳに懸濁した。ＩＯμｇの抗原を免疫化のために使用した二辺下の手順に従 って３匹の雌の週令約６週のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。

１次免疫化：マウス当たり完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ）アジュバント 巾約１０μｇの抗原を腹腔内縁路で投与した。

２次免疫化：１次免疫化から３週間後、マウス当たり不完全フロインドアジュバ ント巾約１０μｇの抗原を皮下経路で投与した。

３次免疫化、２次免疫化から２週間後、マウス当たり不完全フロインドアジュバ ント巾約ｌＯμｇの抗原を腹腔内縁路で投与した。

１週間後、血清試料をマウスから採取し、血清力価を測定した。最も高い力価を 有するマウスに対し、尻尾から１０μｇの抗原をｉ、ｖ、注射て投与した。３日 後、このマウスの肝細胞を採取しハイブリドーマとの融合に使用した。

ｂ）融合 ケラ−（ＫＯｈｌｅｒ）およびミルンユタイン（Ｍｉ　１５ｔｅｉｎ）、１９７ ５の方法を使用してＰＥＧ４０００（無血清培養培地中５０％）の存在下、約１ ０８個の牌細胞を約１０’個のＳＰ２１０ＡｇｌＪ株のミエローマ細胞（ＡＴＣ ＣＣＲ１，−１５８１）と融合した。それからこの細胞をＨＡＴ選択培地中２ａ 間、次いてＩＩＴ培地中で１週間、最後に通常の培養培地（１０％ＦＣ３および ペニンジンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）中で培養した。ラジオイ ムノソルベント検定法（ＲＩＡ　）により抗体産生クローンに関するスクリーニ ングを行い、マイコプラズマ・ニュウモニアエｐｔタンパク質に対する特異性を ウェスタンプロットを使用して測定した。「軟寒天」法を使用して単一のクロー ンを得た。

Ｃ）アデノウィルスＡｄ−Ｐ２０２の中和効果に関するモノクローナル抗体ＭＰ ３０１の試験モノクローナル抗体ＭＰ３０１がウィルスの細胞へ感染する能力を 中和するかどうかを決定するために、Ａｄ−Ｐ２Ｏ３の力価を標的細胞としてＨ ｅＬａ細胞（９６穴プレート上で２％ＦＣ５／ＤＭＩＥＭ中約５０％の実密度） を使用して、抗体の添加ありの場合を１回およびなしの場合を１回測定した。各 種の希釈率のＡｄ−Ｐ２Ｏ３を調製し抗体とともにまたはそれなしでＨｅＬａ− 力価プレートに与えた。このプレートを３７℃、５％Ｃ０２下で４８時間インキ ュベートし、クリスタルバイオレットで染色し、ＩＣ５０（約５０％の細胞分解 が起こるときの阻害濃度）を測定した。抗体ありまたはなしでｌ：２０４８の力 価が得られた。

ｄ）ＭＰ３０１−ポリリジン結合体の調製モノクローナル抗体のポリリジンへの 結合は、ワグナ−（Ｗａｇ口ｅｒ）等、１９９０およびＥＰ−Ａｌ　３８８７５ ８に記載の方法を使用して行った。

１ｍｌの２００　ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓ　（ｐ）１７．９　）中の２０．６ｎｍｏ ｌ　（３，３ｍｇ）のモノクローナル抗体ＭＰ３０１をＳＰＤＰ（ｌｏｏｎｍｏ ｌ）の５ｍＭエタノール溶液で処理した。室温で３時間後、修飾された抗体をセ ファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過し、それによって６２ｎｍｏｌのジチオ ピリジンリンカ−で修飾された１９ｎｍｏｌの抗体を得た。修飾された抗体をア ルゴン大気下、１００　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐｉｆ７．９　）中、３−メルカ プトプロピオネート修飾ポリリジン（２２ｎｍＯＩ、平均鎖長３００リジンモノ マー、ＦＩＴＣ標識、５６ｎｍｏｌメルカプトプロピオネートリンカ−で修飾） と反応させた。Ｍｏｎｏ　Ｓ　ＨＲ５カラム（ファルマンア）上の陽イオン交換 クロマトグラフィーによって結合体を単離した。（勾配＝２０から１００％緩衝 液。緩衝液Ａ：５０蜆　１１ＥＰＥｓ　（ｐＨ７，９）　；緩衝液Ｂ：３Ｍ塩化 ナトリウムを含む緩衝液Ａ）生成物分画は１．６５Ｍと２Ｍの間の塩濃度で溶出 した。Ｉ（ＢＳ　（２０ｍ！ｉｔ　１（ＥＰＥＳ　（ｐＨ７，３）　、１５０　 ｎＩＭＮａＣＩ）に対する透析で９°Ｉ　ｎｍｏｌＭＰ３０１および９．８μｍ ｏｌポリリジンから成る結合体が生成した。

実施例２ 真核細胞におけるアデノウィルス−ポリカチオン−ＤＮＡ複合体による遺伝子転 移本実施例で行われる実験では、特異的および非特異的複合体成分の各種の組み 合わせをＨｅＬａ細胞およびその他の細胞中ヘレポーター遺伝子を輸送する能力 に関して検定した。

抗体結合ポリリジンとのＤＮＡ　（７）複合体化は、ＩＩＢｓ（１５０ｍＭ　Ｎ ａＣ１，２０ｍＭ　ＨＥＰＨ３、ｐｌ＋７．３）中、６７ｚｇ（７）精製したｐ Ｒ３ＶＬ−ＤＮＡを最終容量３５０ｕｌとなるように希釈し、これを最終審ｆｆ １１５０μｌの同し緩衝液中で、９．５μｇのＭＰ３０１ｐＬで精製することに よって行った。（ｐＲ３ＶＬはラウス　ザルコーマ　ウィルスＬＴＲエンハンサ ー／プロモーターの調節下にあるフォチナス　ビラリスルシフェラーゼ遺伝子を 含み（ウチダ（Ｕｃｈｉｄａ）　等、１９７７、デ　ウェット（Ｄｅ　Ｗｅｔ） 等、１９８７）　、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ分解標準法（マニアチス０ＪａｎｉａＬｉ ｓ））　、次にＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ平衡密度勾配遠心法、ブタノール−１による 脱色そして３５０　μＩＩＩＢＳ（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，２０ａ％ｌ　ｔ＋Ｅ ＰＥｓ　、　ｐＨ７，３）中のｌｏｍＭのトリス／　ｔ＋ｃＩ（ｐＨ７，５）　 、Ｉ　ｍＭのＥＤＴＡの溶液に対する透析で調製した）。抗体結合ポリリジンの 量は輸送されるＤＮへの電気的中和を達成するのに必要な量の計算に基づく。ポ リリジン−抗体複合体化ＤＮＡを１ｌＢｓ中で希釈して、最終濃度が１ｍｌ当た り２　ＸＩＯ”ＤＮＡ分子にした。アデノウィルスＰ２Ｏ２−Ａｄ５は、２％Ｆ Ｃ８を補った水冷ＤＭＥＭ中で、最終濃度が１ｍｌ当たり２Ｘ１０”ウィルス粒 子となるよう希釈した。等容量の抗体−ポリリジンＤＮＡおよびウィルスを混合 し、室温で３０分間インキュベートした。遺伝子転移のために使用される標的細 胞は６〇−■織培養プレート中で５％ＦＣ３、＋００１．Ｕ、ベニノリン／ｍｌ およびｌＯＯμｇストレプトマイ／ン／ｍｌを補ったＤＭＥＭ培地中で生育した １１ｅＬａ細胞（３００，０００細胞）であった。

ｔ（ｃＬａ細胞との比較のため、細胞株ｔ＋ＢＥＩ　ＫＢ　（ＡＴＣＣＮｏ、Ｃ ＣＬ　１７）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　１７１　）の評価ら行 った。呼吸器系細胞株１１８ＥＩをウィルムフン（Ｗｉｌｌｕｍｓｏｎ）等、１ ９８９に記載されたようにＦＩ２−７Ｘ培地中で培養した。ＫＢおよびＭＲＣ− ５をイーグル最小基礎培地／１０％熱失活ＦＣ３／ｍｌ当たり１００国際単位の ペニシリン／ｍｌ当たり１００μｇのストレプトマイシン／１０ｍＭ非必須アミ ノ酸／２ＩｒＩＭグルタミン中で培養した。

トランスフェクション培地に移す前にプレートを４℃で３０分間冷却し、培地を 除去した後、１ｍｌのトランスフェクション培地を添加して細胞を４℃で２時間 インキュベートした。このステップはＤＮＡ　１合体が細胞に取り込まれること 無しに細胞に結合されることを目的として行った。この結合ステップの後、液相 中の何らかの非結合反応成分を除去するためにプレートを水冷２％ＦＣ３／ＤＭ ＥＭで３回洗浄した。２ｍｌの水冷２　Ｘ　Ｆｅ２　／ＤＭＥＭの添加後、プレ ートをゆっくり加熱した。次いでプレートをインキュベーター中に１６時間装い た（３７℃、５％Ｃ０７）。レポーター遺伝子の発現を測定するために、細胞分 解物を調製し、総タンパク質含量を標準化してセンテ（Ｚｅｎｋｅ）等、１９９ ０に記載されているようにルシフェラーゼ活性を正確に測定した（ルミノメータ −は、ルシフェラーゼｌピコグラムが５０．０００光単位全土ずるように校正し た）。

ｐＲｓｖｔ、レポータープラスミドＤＮＡを予めポリリジン抗体結合体と複合体 を形成していないアデノウィルスＰ２Ｏ２−Ａｄ５と組み合わせた（ＤＮＡ＋Ｐ ２Ｏ２−Ａｄ５）。さらに、抗体結合ポリリジンと複合体を形成したｐＲ３ＶＬ −ＤＮＡを特異的ウィルスの非存在下で検定しくＤＮＡ＋ＭＰ３０１ｐＬ）、こ れら２つの反応培地を複合体成分の全組み合わせを含む反応培地と比較した（Ｄ ＮＡ＋ＭＰ３０１ｐＬ＋Ｐ２Ｏ２Ａｄ５）。同様に、複合体形成の前に熱で失活 させた（５０℃、３０分）特異的抗体を用いることによって複合体の遺伝子転移 能力を検定した（ＤＮＡ＋ＭＰ３０１ｐＬ＋Ｐ２Ｏ２−Ａｄ５）。ポリリジン結 合抗体ＭＰ３０１および１０倍モル過剰量の非ポリリシン結合ＭＰ３０１存在下 （ＤＮＡ＋ＭＰ３０１ｐＬ＋ＭＰ３０１＋Ｐ２Ｏ２−Ａｄ５）、またはＭＰ３０ １ｐＬおよび１０倍モル過剰量の非結合非関連モノクローナル抗体、抗ラットＩ ｇＧの存在下（ＤＮＡ＋ＭＰ３０１　ｐＬ４抗ラットＩｇＧ　＋Ｐ２Ｏ２−Ａｄ ５　）特異的アデノウィルスを用いて競争実験を行った。さらに、特異的ウィル スとのインキュベーション前に、レポータープラスミドＤＮＡを抗体結合ポリリ ジンと等モル量の非結合ポリリジン（４μｇ）と複合体を形成させた（ＤＮＡ＋ ｐＬ＋Ｐ２Ｏ２−Ａｄ５　）。ＭＰ３０１によって認識されるエピトープを欠く アデノウィルスＷｒ３００を用いた複合体形成反応を、特異的ウィルスＰ２Ｏ２ −Ａｄ５の場合と全く同様に行った。実験は全部で３回行った。結果を第３図に 示す。データは平均値±ＳＥＭで示されている。点線の平行線は未処理の１１ｅ Ｌａ細胞のハックグランドシグナルを示す。ＨｅＬａ細胞と比較した細胞株１１ ＢＥＩ、　ＫＢおよびＭＲＣ−５て得られた結果は第６図に示される。

実施例３ 遺伝子転移に関するアデノウィルスと抗体−ポリリジン／ＤＮＡの最適比の決定 第４図に結果を示した本実施例で行った実験では、ＨｅＬａ細胞への遺伝子転移 を許す能力に関して各種の割合の複合体成分を有するアデノウィルス−抗体−ポ リジノン／ＤＮＡ複合体を試験した。複合体形成反応は、異なる量の特異的アデ ノウィルスＰ２Ｏ２−Ａｄ５と共に、抗体−ポリリジン結合体と複合体を形成し た２、５　Ｘ１０１０個のＤＮＡ分子を使用したこと以外は実施例２の場合と同 様に行った。細胞の培養、細胞への複合体の適用、細胞のインキュベーションお よびレポーター遺伝子発現の測定も実施例２の場合と同様に行った。示されてい るデータは４回の異なる実験からの平均値±ＳＥＭを表す。

実施例４ アデノウィルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体の遺伝子転移の性能の測定実施例２ の場合と全く同様に調製した複合体の限定希釈物に関して、それらが１１ｅＬａ 細胞におけるレポーター遺伝子の検出可能な発現を可能にする点においてどのく らい有効であるかを調へるために試験した。複合体形成後、２　％　Ｆｅ２　／ ＤＭＥＭ中の複合体の対数的希釈物を調製した。各種の希釈物１ｍｌずつを５　 Ｘ１０３個のＨｅＬａ細胞を含む６０ｎｖｎ組織培養皿に添加した。１時間のイ ンキュベート後（３７℃、５％ＣＯ＋　）　、３　ｍｌの５％ＦＣ３／ＤＭＥＭ を添加し、プレートをさらに同条件下で１６時間インキュベートした。レポータ ー遺伝子の発現は実施例２の場合と同様に測定した。第５図に示されているルシ フェラーゼ発現の値は３または４回の実験からの平均値±ＳＥＭに相当している 。点線の平行線は未処理の１１ｅＬａ細胞のバッググランドフグナルを示す。

実施例５ 子転移 アデノウィルスおよびヒトトランスフェリンドメインの組み合わせを含む３成分 複合体を調製するために、エピトープ結合アデノウィルスＰ２Ｏ２−Ａｄ５　（ ２，５Ｘ１０１０粒子）を７５０μＩの２％ＦＣ３／ＤＭＥＭ中に希釈し、２５ ０μＩＨＢＳで希釈したポリリジンモノクローナル抗体ＭＰ３０１ｐＬｙｓ　（ ２μｇ）と混合した。室温で３０分間のインキュベーションを行った。それから ２５０μｌのＨＢＳで希釈したプラスミドＤＮＡｐＲ３ＶＬ　（６μｇ）をこの 混合物に添加し、室温でさらに３０分間インキュベートした。生じるアデノウィ ルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体は全ポリリジン含有量に基づき不完全に収縮し たＤＮＡを有すると予想される。ＤＮＡの収縮を完全なものにし、ヒトトランス フェリン部分を複合体に寄与せしめるために、２５０μｌの１ｌＢｓ中に希釈し たヒトトランスフェリンポリリジン結合体（ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等、１９ ９０）（９μｇ）をアデノウィルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体に添加した。最 後に、室温で３０分間のインキュベーションを行った。形成された組み合わせ複 合体の特異的結合を達成するために生じる組み合わせ複合体を組織培養細胞とイ ンキュベートした（４℃、２時間）。それからこのプレートを水冷２％ＦＣ３／ ＤＭＥＭて３回洗浄し、２ｍｌの２％ＦＣ３／ＤＭＥＭを添加した後、１６時間 インキュベートし直した（３７℃、５８　Ｃｏ□）。レポーター遺伝子の発現の 評価を以前と同様に行った。

第７Ａ図は、ヒトトランスフェリン−ポリリジン−ＤＮＡ　１合体（ｈＴｆｐＬ ）　、アデノウィルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体（ＡｄｐＬ）および３成分複 合体によって生じるＨｅＬａ細胞での遺伝子発現の相対値を示す。第７Ｂ図は、 ＨｅＬａ細胞およびＨＢＥ＋細胞の３成分複合体（ＡｄｐＬ／ｈＴＴ　ｐＬ）に よる遺伝子転移に関する相対的感受性を示す。

実施例に れらの実験では、ヒトアデノウィルス性肺疾患に好適な動物モデルであることが 分かっているラットのシグモドン　ヒスピダス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ　ｈｉｓｐｉ ｄｕｓ）　（ｒコツトン　ラット」）を使用した（バンニ（Ｐａｃｉｎｉ）等、 １９８４）。さらに、先の実施例で記載した２成分および３成分複合体を使用し た。

ａ）呼吸器管上皮細胞の初代培養物のトランスフェクション従来法によって初代 培養物を調製した（ヴアン　スコツト（Ｖａｎ　５ｃｏｔｔ）等、１９８６）。

分離した細胞を収穫し、ＦＩ２−７Ｘ培地で３回洗浄したのち、皿当たり５刈ｏ ５細胞の密度になるように３ｃｍ組織培養皿にブレーティングした。細胞をＦ１ ２−７Ｘ培地中に保持し、５０から７５％の集密度に達したときに遺伝子転移実 験のために使用し、通常これに２から３日を要した。遺伝子転移実験のためには 、複合体を直接細胞に添加し２４時間インキュベートシた。これらの実験には、 ｐｃＭＶ　ＤＮＡを使用した。プラスミドｐＳＴＣＸ５５６のＢＡＭＩＩＩ挿入 物を除去しくセバーン（Ｓｅｖｅｒｎｅ）等、１９８８）、このプラスミドをク レノーフラグメントで処理し、さらに、ルシフェラーゼをコードする配列または β−ガラクトシダーゼをコードする配列を含むプラスミドｐＲ３ＶＬ由来のｌ＋ １ｎｄｌｌｌ　１５ｓｐｌおよびクレノーフラグメント処理断片を使用すること によって（マグレガー（ＭｃＧｒｅｇｏｒ）およびカスキー（Ｃａｓｋｅｙ）、 １９８９）プラスミドＩＩｃＭ’Ｖを調製し、生成したプラスミドをｐｃＭＶＬ およびｌ）ＣＭＶβ−ｇａｌと命名した。複合体の形成はｐＲ３Ｖｌ、と同様に 行−）た。

ｉ）正味の遺伝子転移の相対的水準 これらの実験のために、レポータープラスミドｐｏａｖｔ、を使用した。２４時 間後、細胞のルシフェラーゼ遺伝子発現を検定した。結果は第９図に示される。

下の軸は未修正細胞の測定値を示し、Ｙ軸は細胞分解物から得られた２５μｇの 総タンパク質当たりの全土位としてルシフェラーゼ遺伝子発現を示す。実験は各 々３−４回行い、結果はその平均値上ＳＥＭで示されている。

１１）相対的トランスフェンヨン頻度 これらの実験ではレポーターＤＮＡとしてプラスミドｐｃＭＶβ−ｇａｌを使用 した。細胞は先に説明したようにトランスフェクションされ、２４時間後、マグ レガー（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ）等、１９８９　に記載された方法を用いて染色す ることによりレポーター遺伝子の発現を測定した。この結果を第１０図に示す（ 倍率：３２０Ｘ）。Ａ：ｈＴｆｐＬ、Ｂ：ＡｄｐＬ、　Ｃ：ｈＴｆｐＬ／Ａｄｐ Ｌ。

ｂ）生体内での気管支経路を介した遺伝子転移動物にメトキシフルランで麻酔を かりた。首の腹側を垂直に切断した後、気管を四角く切りだした。４５°の角度 に位置させた動物中の気管全体に複合体（２５０−３００μｌ：３μｇプラスミ ドＤＮＡ　）を直接注入した。動物をｃｏ２て殺し、その気管と肺を組織中で（ ｉｎ　５ｉｔｕ）冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ　）でリンスした後にまとめて収穫し た。ルシフェラーゼ試験のために肺組織を抽出緩衝液中でホモジナイズし、その 分解物を総タンパク質含量に対して標準化を行い、上述したようにルシフェラー ゼ遺伝子発現を測定した。

ｉ）生体内での正味の遺伝子転移の相対的水準トランスフェクションから２４時 間後、ルシフェラーゼ発現を測定した。結果を第１１図に示す。特定された全土 位は肺分解物から得られた１２５０１１ｇの総タンパク質に相当する。実験は各 々３から４回行い、結果は平均値±ＳＥＭで示されている。

ｉｉ）呼吸器管上皮における外来遺伝子発現の位置の特定このテストのために、 レポーターＤＮＡとしてプラスミドｐＣＭｖβ−ｇａｌを使用した。

組み合わせ複合体ｈＴｆｐＬ／ＡｄｐＬを使用した。注入から２４時間後、収穫 した肺の凍結断片１４μｇについてＸ−ｇａｌによる染色およびニュウクリア・ ファースト・レッドによる逆染色によってレポーター遺伝子の発現を検定した。

染色を第１２図に示す（倍率・６００　ｘ）。これらは１ａｃＺレポータープラ スミドを含むｐＲｃ／Ｒ３Ｖまたは１）ＣＭＶβ−ｇａｌと命名される非関連非 １ａｃＺプラスミドを含むｈＴｆｐＬ／ＡｄｐＬ複合体で処理されたラットのト ランスフェクションの結果を示している。Ａ　：　ｐＲｃ／Ｒ３Ｖを含む複合体 で処理した気管支の例；Ｂ：ｐＣＭＢβ−ｇａｌを含む複合体で処理した気管支 の例；Ｃ：ｐＲＣ／Ｒ３Ｖを含む複合体で処理した末梢呼吸気管領域の例；Ｄ： ｐＣＭＶβ−ｇａｌを含む複合体で処理した末梢呼吸器管領域の例；Ｅ：ｐＣＭ Ｖβ−ｇａｌを含む複合体で処理した肺由来のβ−ガラクトシダーゼ陽性領域の 拡大図（倍率：１０００Ｘ）。

実施例７ 肺領域に対する特異性を有する結合体の構築呼吸器管上皮の繊毛化切片に対する 選択的結合を考えて結合体を構築した。このような結合体の構築は（この特定の 例と同様に一般にも）、結合体の構造におけるリガンド候補の結合特性の確認を 必要とする。一つの候補としてＳＮＡレクチンを選択した。

先の実施例の場合のように、キメラアデノウィルスＰ２Ｏ２（２ＸＩＯ”粒子） を２５０　μＩ　ＨＢＳ中で抗体ポリリジン結合体ＭＰ３０１ｐＬ　（１，２５ μｇ）と混合し、室温テ３０分間インキュベートした。次いて、レポータープラ スミドｐｃＭＶＬ　（１２５μｍのＨＢＳ中６μｇ）を添加し、室温でさらに３ ０分間インキュベーションを続けた。６２．５μｍのＨＢＳ中における市販のビ オチン化レクチンＳＮＡ　（Ｅ−Ｙ　Ｌａｂ　、サンマチオ、ＣＡ：２．８μｇ ）をストレプトアビジン−ポリリジン（６２，５μｌ　ＨＢＳ中１．３５μｇ） と混合し、５ＮＡ−ポリリジンを形成させるために室温で３０分間静置しておい た。この５ＮＡ−ポリリジンを５ＮＡ−アデノウィルス−ポリリジンＤＮＡ複合 体を形成するために上記反応混合物と混合した。比較として、先に述べた実施例 の記載と同様にしてＳＮＡリガンドを含まない複合体を調製した。

ｂ）肺におけるレクチン複合体の生体内使用繊毛を有するヒト呼吸器管上皮細胞 に対するレクチンＳＮＡの細胞特異的属性は本実験において動物モデルとして使 用される白イタチにその相当物が見られる。

体重的１．５ｋｇの雄を使用した。各動物に、ａ）で調製した複合体を４倍量に おいて使用した。動物に麻酔をかけ、複合体を気管内視鏡を用いて右肺の中央葉 に導入した。２４時間後、異なる肺領域を収穫し、ホモジナイズしてルシフェラ ーゼ活性を検定した。検定した肺の領域には複合体を投与した時に複合体が接触 しない部分（肺左上部分、左上肝葉の柔組織、気管の低部）および複合体が接触 する部分（右中央肝葉、右中央肝葉の柔組織）が含まれる。また、第１３図に見 られるように、複合体と接触した領域はルシフェラーゼ発現を示したが（右中央 肝葉、右中央肝葉の柔組織、第２および第３のバー）、他の領域（気管の低部、 第１のバー：左上肝葉の柔組織、第４のバー；肺左上部分、第５のバー）は発現 を示さなかった。

Ｃ）リガンドの特異性の検定 これに平行して、レクチン結合体の結合の特異性に関して調べた。抗レクチン抗 体は使用できないので、トランスフェリン／レクチン−ポリリジン／ＤＮＡ複合 体を調製し、−次抗トランスフェリン抗体との結合を行い、次いで、二次ホース ーラデッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体でバックアップした。この結 合体は繊毛細胞集団の頂上部分に検出されたが、試験計画のために特異的結合に 関しては明確な結論は得られなかった。

引用文献： アンダーマン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）Ｊ、Ｆ、、　１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ２６．４０１−４０９アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、　Ｐ、等、１９８２ ．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５７．１１３０１−１１３０４アブラハム ソン（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ）、　Ｄ、　Ｒ，等、１９８１．　Ｊ、Ｃｅ１１　 Ｂｉｏｌ、、　９１．２７０−２８０アサダークボタ（Ａｓａｄａ−Ｋｕｂｏｔ ａ）、　Ｋ等、１９８３．　Ｅｘｐ、Ｐａｔｈｏｌ、、　２３．９５−１０１ア スコリ（Ａｓｃｏｌ　ｉ）、　ｋ等、１９７Ｂ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 　２５３．７８３２−７８３８アツノユウエル（Ａｓｈｗｅｌ　Ｉ）、　Ｇ、等 、１９８２．　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５１．５３１−５ ５４バークナ−（Ｂｅｒｋｎｅｒ）、　Ｋ、　Ｌ、およびシャープ（Ｓｈａｒｐ ）、Ｐ、Ａ、、　１９８３．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

Ｉｌ、　６００３−６０２０ バーフナ−（Ｂｅｒｋｎｅｒ）、に、Ｌ、、　１９８Ｂ、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ　６．６１６−６２９バーンズ（Ｂｅｒｎｓ）、に、　１．、　＋９９ ０．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｅｄ、フィールズ（Ｆ ｉｅｌｄｓ）、　Ｂ、　Ｎ、、ナイブ（Ｋｎｉｐｅ）、　Ｄ、　Ｍ、等編、レー ベンプレス、ニューヨー乞１７４３−１カーペンタ−（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ）、 Ｇ、、　１９８４．　Ｃｅ１１、３７．３５７−３５８チエン（Ｃｈｅｎｇ）、 　Ｓ−Ｙ、等、＋９８０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 　７７、３４２５−３４２９コツトン（Ｃｏｔｔｅｎ）、）ｔ、レングル・ロー ルド（Ｌａｅｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ）、Ｆ、、　カーラポス（Ｋｉｒｌａｐ ｐｏｓ）、　、　Ｈ，、ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）、　Ｅ、、メクトラー（Ｍｅ ｃｈｔｌｅｒ）、　Ｋ、　、センテ（Ｚｅｎｋｅ）、ＭＬ　、バーブ（Ｂｅｕｇ ）、　Ｈ，、およびバーンステイル（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ）、Ｍ、Ｌ、、　１９ ９０゜Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７．４０３３−４０ ３７シリベルト（Ｃｉｌｉｂｅｒｔｏ）、Ｇ、等、Ｃｅ１１．１９８５．４１． ５３１−５４０ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）、Ｊ、、ｏディツシュ（Ｌｏｄｉｓ ｈ）、１（、、バルチモア（Ｂａｌａｔ　ｉｍｏｒｅ）＋　Ｄ、。

＋９７５．　Ｍｏ１．Ｃｅ１１　Ｂｉｏｌ、、ターネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）、　 Ｊ、編、フリーマン、ニューヨーク、５６７ デービス（Ｄａｖｉｓ）、　Ｂ、　Ｄ、およびダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ） 、　１９８０．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　３゜Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｅｄ、 デービス、Ｂ、Ｄ、等１、ハーバ−・アンド・ロー　ステライゼーション・アン ド・ディスインフエクション、１２６４−１２７４デフｙ　（Ｄｅｆｅｒ）、Ｃ ，、ベリン（Ｄｅｌ　ｉｎ）、　Ｉｔ、カイレットーボヘーデイン（Ｃａｉ　１ １ｅｔ−Ｂｏｕｄｉｎ）、Ｉｔ　およびホーランガー（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ）、 　Ｐｌ、　１９９０．　Ｊ、Ｂｉｒｏｌ、　６４．３６６１−デウエット（Ｄｅ 　Ｗｅｔ）、　Ｊｌ、ウッド（Ｗｏｏｄ）、　Ｋ、、デル力（ＤｅＬｕｃａ）、 　Ｍ、、ヘリンスキー（）ｌｅｔｉｎｓｋｉ）、　Ｄ、およびサブラｖ＝（Ｓｕ ｂｒａｍａｎｉ）、Ｓ、、　１９８７．　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７． ７２ダルベラ：＋（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）、Ｒ，、１９８０，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ、　３編、デービス（Ｄａｖｉｓ）、　Ｂ、　Ｄ、等編、ハーバ−・アン ド・ロー、Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　８５３−８８４エ グリチス（Ｅｇｌｉｔｉｓ）およびアンダーマン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、　１９ ８８．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　６、６０８−６１４ フェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｒ）、　Ｐ、　Ｌ、、ガデク（Ｇａｄｅｋ）、　Ｔ 、　Ｒ，、ホルム（Ｈｏ１ｍ）、Ｌ、　Ｃ１−７ン（Ｒｏｍａｎ）、　Ｒ，、チ ャン（Ｃｈａｎ）、■、ウエンツ（Ｗｅｎｚ）、　Ｉｔ　、ノースロップ（Ｎｏ ｒｔｈｒｏｐ）Ｊ、　Ｐ、、リンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）、　Ｇ、　Ｍ、お よびダニエルセン（Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ）、Ｉｔ、　１９８７、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．７４１３−７４１７フエルグナー（ Ｆｅｌｇｎｅｒ）、　ｐ、　１．　、　ホルム（Ｈｏｌｎ＋）、　Ｍ、およびチ アン（Ｃｈａｎ）、Ｈ，、１９８９Ｐｒｏｃ、Ｗｅｓｔ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 Ｓｏｃ、３２．１１５フイールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）、　Ｂ、　Ｎ、およびナイブ （Ｋｎｉｐｅ）、Ｄ、Ｉｔ、　１９９０．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　第２編レーベン プレス、ニューヨーク ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）、Ｈ，Ｓ、、　１９８０．　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ、第３編、デービス（Ｄａｖｉｓ）、　Ｂ、Ｄ、等編、ハーバ−・ア ンド・ロー、ピコルナウィルス、１０９５−１１１７ゲーセン（Ｇｅｙｓｅｎ） 　等、１９８４．　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１． ３９９８ゲーセン（Ｇｅｙｓｅｎ）　等、１９８５．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２．１７８ゲーセン（Ｇｅｙｓｅｎ）　等、１９ ８６．　Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２３．７０９゜デーセン（Ｇｅｙｓｅｎ ）　等、１９８７．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、　１０２．２５９゜ゴ ールドシュタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）、　Ｊ、　Ｌ、等、１９８２．　Ｃ１ １ｎ、Ｒｅｓ、、　３０．４１７−４２６ゴールドシユタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅ ｉｎ）、　Ｊ、　Ｌ、等、１９７９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ、　７６グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、　Ｍ、等、１９８９．　Ｃｅ１１５ ８．２１５−２２３バースト（Ｈｅａｒｓｔ）、　Ｊ、　Ｅ、およびサーリー（ Ｔｈｉｒｙ）、Ｌ、、　１９７７、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、４゜ヘル デイン（）！ｅｌｄｉｎ）、　Ｃ−Ｈ，等、１９８２．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、２５７．４２１６−４２２１ヘルスコウイツツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ） 、　１．、１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２９．２１９ヒズカ０１ｉｚｕｋａ） 、　Ｎ、等、１９８１．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅｆｆＬ、　２５６．４５９１− ４５９７ホランド（Ｉｌｏｌｌａｎｄ）、Ｊ、Ｊ、、　１９９０．　Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ、第２編、フィールド（Ｆｉｅｌｄｓ）、　Ｂ、　Ｎ、　。

ナイブ（Ｋｎｉｐｅ）、　Ｄ、　ＩｉＬ等編　、レーベンプレス　、ニューヨー ク、欠陥ウィルスゲノム、１５１−１６５ ホルウィッツ（ｌ（ｏｒｗｉｔｚ）、！ｉＬＳ、、　＋９９０．　Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ、第２編、フィールド（Ｆｉｅｌｄｓ）、　Ｂ、Ｎｏ、ナイブ（Ｋｎｉｐｅ ）、　Ｄ、ＷＬ等編　、レーベンプレス　、ニューヨーク、アデノウィルスとそ の複製、＋６７９−１７２１ホサン（Ｈｏｓａｎｇ）、　）Ｊ、　等、＋９８７ ．　ＥＭＢＯＪ、、　６．１１９７−１２０２フアン（Ｈｕａｎｇ）、Ａ、Ｓ、 、　１９８７．ウィルス複製の分子的基礎、Ｈｓｇ、　Ｂｅｒｃｏｆｆ、　Ｒ， Ｐ、。

プレナムプレス、ニューヨークおよびロンドン、ウィルス感染における欠陥阻害 （ＩＤ）粒子の働き、＋９１−１９４フーバー（ｌｌｕｅｂｅｒｓ）、　Ｈ，お よびフィンチ（Ｆｉｎｃｈ）、Ｃ，、１９８７，Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　 ６７、５２フ（ｔａｕ）、　Ｐ、　Ｃ，、：］リア（Ｃｏｌｌｉｅｒ）、Ａ、Ｍ 、、およびベースマン（Ｂａｓｅｍａｎ）、　Ｊ、　Ｂ、　、　＋９７V゜ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１４５．１３２８ −１３４３イマムラ（Ｉｍａｍｕｒａ）、　Ｋ、等、＋９８７．　Ｊ、　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、、　１３９．２９８９−２９９２イナミネ（Ｉｎａｍｉｎｅ）、Ｊ、 Ｍ、、ローチェル（Ｌｏｅｃｈｅｌ）、　Ｓ、およびフ（Ｈｕ）、Ｐ、Ｃ，、１ ９８８゜Ｇｅｎｅ　７３．１７５−１８３ カブラン（Ｋａｐｌａｎ）、　Ｊ、等、１９７９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ、 　２５４．７３２３−７３２８クロースナー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ）、　Ｒ，Ｄ、 等、１９８３．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ、　２５８．４７１５−４７２４クロ ースナー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ）、　Ｒ，Ｄ、等、１９８３．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．２２６３−２２クン（Ｋｕｈｎ）ル、Ｃ １等、１９８２．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｕ　Ｓｃｉ、、　７．２９９− ３０２キニッケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｔ、Ａ、、１９８５．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２．４８８−４９２クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ ）、　Ｋ、等、１９８２．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 １９８２．７９．６４６１−６４６S レドリー（Ｌｅｄｌｅｙ）、　Ｆ、　Ｄ、　等、１９Ｂ９．　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、７ｂ　ＩＩ−Ｊ　レム（Ｒｅ高■j およびＧ、リード（Ｒｅｅｄ）編（ＶＣＩ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈ ａｆｔ、ウィルヘルム）ｐｐ、４０１〜４５７ ０イタ−（Ｌｏｙｔｅｒ）、　Ａ、　、スカンゴス（Ｓｃａｎｇｏｓ）、　Ｇ、 　Ａ、およびラドル（Ｒｕｄｄｌｅ）、　Ｆ、　Ｈ，。

１９８２、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．４２２マ グレガ−（ＭｃＧｒｅｇｏｒ）、　Ｇ、　Ｒ，およびカスキー（Ｃａｓｋｅｙ） 、Ｃ，Ｔ、、　１９８９．　Ｎｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７．２３ ６５ マリム（Ｍａｌ　ｉｍ）、　Ｉｔ等、１９８９．　Ｃｅ１１５８．２０５−２１ ４Ｔローン（Ｍａｌｏｎｅ）、　Ｒ，Ｗ、　、フェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｒ） 、　Ｐ、　Ｌ、およびパーマ（Ｖｅｒｍａ）、　ｌ。

）ｔ、１９８９．　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．６ ０７７マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ、、フリッシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ） 、Ｅ、Ｆ、およびサンブルーフ（ＳａＩｌｌｂｒｏｏｋ）、　Ｊ、　（１９８２ ）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ垂窒奄獅■@Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　４７４マーシヤル（Ｍａｒｓｈａｌｌ） 、Ｓ、、　１９８５．　Ｊ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｕ、　２５０．４１３３−４１４ ４マサグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、　Ｊ、等、１９８６．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、、　１２８．２１６−２２２モーラ−（Ｍａｕｒｅｒ）、Ｒ，Ａ 、、　１９８９．　Ｆｏｃｕｓ　１１．２５マクルアー（ＭｃＣＩｕｒｅ）、　 Ｍ、　０．　、ツマフェルト（Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ）、　）ｉＬん、マーシュ （Ｍａｒｓｈ）。

ｋおよびウニイス（Ｗｅｉｓｓ）、Ｒ，Ａ、、　１９９０．　Ｊ、　Ｇｅｎｅｒ ａｌ　Ｖｉｒｏｌ、　７１．７６７−７７３メルマン（Ｍｅｌ　１ｍａｎ）、　 １．　Ｓ、等、１９８４．　Ｊ、　Ｃｅ１１　Ｂｉｏｌ、、　９８．１１７０− １１７７ミゼル（Ｍｉｚｅｌ）、　Ｓ、　Ｂ、等、１９８７．　＋９８７．　Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３８．２９０６−２９１２バツチ一二（Ｐａｃｉｎ ｉ）、　Ｄ、　Ｌ、等、１９８４．　Ｊ、１ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１５０．９ ２−９７パスタン（Ｐａｓｔａｎ）、　１．　、セス（Ｓｅｔｈ）、　Ｐ、　、 フィッツジエラルド（Ｆｉ　ｔｚＧｅｒａｌｄ）、　Ｄ、およびウィリングアム （Ｗｉ　Ｉ　ｌ　ｉｎｇｈａｍ）、　Ｉｔ　、　１９８６．細胞へのウィルスの 付着と侵入、クロウエル（Ｃｒｏｗｅｌ　１）、　Ｒ，Ｌ、およびロンバーブ・ ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏ１ｍ）、　Ｌ　、　（Ａｍ、　Ｓｏｃ、　ｆｏｒ 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、ワシントンＤＣ）　１４１−１４６フイリツプソン （Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ）、Ｌ、、ｏブルーフ・ホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏ１ ｍ）、　Ｋ、およびピータ−マン（Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ）、Ｕ、、１９６８．　 ＪＪｉｒｏｌ、　２．１０６４−１０７５フイリツプソン（Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ ）、　１５．、１９８３．　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｎ ｗｎｕｎｏｌ、　１０X．２ ボンダー（Ｐｏｎｄｅｒ）、　Ｋ、　Ｐ、等、＋９９１．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８．１２１７−１２２１ポスナー（Ｐｏｓｎｅ ｒ）、　Ｂ、　！、等、１９８２．　Ｊ、Ｃｅ１１　Ｂｉｏｌ、、　９３．５６ ０−５６７ブリシヤス（Ｐｒｅｃｉｏｕｓ）、　Ｂ、およびラッセル（Ｒｕｓｓ ｅｌｌ）、Ｗ、Ｃ，、１９８５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：実践アプローチ、Ｂ、Ｗ、 Ｊ、メイ（Ｍａｈｙ）編、（ＩＲＬブレス、オックスフォード、ワシントン　Ｄ Ｃ）　ｐｐ、　１９３−２０５０パーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｍ−Ｉｔ等、１９ ８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３２．１１４８−１１５１ラツセル（Ｒｕｓｓｅｌ　 ｌ）、　Ｗ、　Ｃ，等、１９８１．　Ｊ、　Ｇｅｎ−Ｖｉｒｏｌ、、　５６．３ ９３−４０８リヨーダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）、　Ｊ、　Ｒ，等、１９８９．５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２４５．１０６６−１０７３シヤルチ（Ｓｃｈａｌｃｈ）、　Ｄ 、　Ｓ、等、１９８６．　Ｈｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１１８．１５９０− １５９７セネツト（Ｓｅｎｎｅｔｔ）、　Ｃ，等、１９８１．　Ａｎｎｕ、Ｒｅ ｖ、Ｂｉｎｃｈｅｕ、　５０．１０５３−１０８６セス（Ｓｅｔｈ）等、Ｍｏ１ ．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４：１５２８−１５３３（１９８４）スライ（Ｓｌｙ ）、Ｗ、等、＋９８２．　Ｊ、Ｃｅ１１　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１８．６７−８ ５スミス（Ｓ＋ｎｉ　ｔｈ）、　Ｋ、　Ａ、等、１９８５．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２．８６４−８６７ストール（Ｓｔａｈｌ） 、　Ｐ、　Ｄ、等、＋９７８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　７５．１３９９−１４０３サレンジヤー（Ｓｕｌ　ｌｅｎｇｅｒ）、　Ｂ、 　Ａ、等、＋９９０．　Ｃｅ１１６３．６０１−６０８スベンソン（Ｓｖｅｎｓ ｓｏｎ）、Ｕ、、　１９８５．　ＪＪｉｏｌ、、　５５．４４２−４４９トロノ （Ｔｒｏｎｏ）、　Ｄｌ等、１９８９．　Ｃｅ１１５９．１１３−１２０ウチダ （Ｕｃｈｉｄａ）、　Ｙ、　、ツカダ（Ｔｓｕｋａｄａ）、　Ｕ、およびスギモ リ（Ｓｕｇｉｍｏｒｉ）、Ｔ、　１９７７、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８２．１４２５−１４３３バレリオ（Ｖａｌｅｒｉｏ）、　 Ｄ、等、１９８４．　Ｇｅｎｅ、　３１．１４７−１５３ヴアン　スコツト（Ｖ ａｎ　５ｃｏｔｔ）、　Ｉｔ　Ｒ，等、１９８６．　Ｅｘｐ、Ｌｕｎｇ　Ｒｅｓ 、　１１．７５−９４ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）、　Ｅ、　、センテ（Ｚｅｎｋ ｅ）、　Ｍ、　、コツトン（Ｃｏｔｔｅｎ）、！ｔ、バーブ（Ｂｅｕｇ）、　Ｈ ９およびバーンスチール（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ）、ｌｔＬ、、　１９９０．　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８７、３４１０−３４１４ ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）、　Ｅ、　、　Ｄ　ットン（Ｃｏｔｔｅｎ）、　！ｔ 、ホスナーカーｏｉｓｎｅｒ）、　Ｒ，およびバーンスチール（Ｂｉｒｎｓｔｉ ｅｌ）、　隨し、、　１９９１ａ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　８８．４２５５−ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）、　Ｅ９．コツトン（Ｃｏ ｔｔｅｎ）、　ＩｉＬ、メクトラ−（Ｍｅｃｈｔｌｅｒ）、　Ｋ、、カーラポス （Ｋｉｒｌａｐｐｏｓ）、　Ｈ，およびバーンスチール（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ） 、！ｉＬＬ、、　１９９１ｂ、　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　２．２２６−２３１ワオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、　Ｆ、等、１９８７．　 Ｊ、　Ｃｅ１１　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１３０．２５５−２６１ワトソン（Ｗａ ｔｓｏｎ）、　Ｊ、　Ｄ、等、１９８７．　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｇｅｎｅ、ベンジャミン／カミングスＰｕｂ１．　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｉｎｃ、 、　６７６−６７７ウイルムセン（Ｗｉ　ｌ　ｌ＋ｕｎｓｅｎ）、　Ｊ、　Ｊ、 　、デービス（Ｄａｖｉｓ）、　Ｃ，Ｗ、およびポーチ＋　−（Ｂｏｕｃｈｅｒ ）、Ｒ，Ｃ，、１９８９，ＡｕＪ、　Ｐｔ＋ｙｓｉｏ１．２５６．　Ｃｌ０３３ −Ｃ１０４４ウツド（Ｗｏｏｄ）、　Ｗ、　１．等、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ 、　３１２．３３０−３３７つ（Ｗｕ）、　Ｇ、　Ｙ、およびつ（Ｗｕ）、Ｃ， Ｈ，、１９８７，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２．４４２９−４４３２ザメ クニク（Ｚａｍｅｃｎｉｋ）、　Ｐ、　Ｃ，、グツドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈ ｉｌｄ）、　Ｊ、　、ワグナ（Ｔａｇｕｃｈｉ）、Ｙ、およびサリン（Ｓａｒｉ ｎ）、Ｐ、Ｓ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　８３．４１４３−センテ（Ｚｅｎｋｅ）、Ｍ−、スタインレイン（Ｓｔｅｉ ｎｌｅｉｎ）、　Ｐ、　、ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）、　Ｅ、、コツトン（Ｃｏ ｔｔｅｎ）、　Ｉｔ　、バーブ（Ｂｅｕｇ）＋　Ｈ−およびバーンスチール（Ｂ ｉｒｎｓｔｉｅｌ）、　！Ｌ　Ｌ。

、　１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ７．３６５５−３６５９Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、１９８０．７ツクＰｕｂ１．　Ｃｏ、、イースｌ−ン、 ＰＡ、オソル（Ｏｓｏｌ）編 ＦＩＧ−２ａ ＦＩＧ、２ｂ Ｔ８　Ｔム　１：２　１：１　２．１　ム：１　８：１ｈＴｆρＬ　ＡｄｐＬ　 ＡｄｐＬ／ｈＴｆρＬＦＩＧ、　７０ ＦＩＧ、　７７ ＦＩＧ、　７２　ａ ＦＩＧ、　１２　ｂ ＼ｔ Ｏ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：９１） （３１）優先権主張番号　８６４，７５８（３２）優先臼　１９９２年４月７日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　 ＡＵ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ。

（７１）出願人　ジェネンテック　インコーホレイテッドアメリカ合衆国　カリ フォルニア州 ９４０８０　サウス　サン　フランシスコ　ポイント　サン　プルーノ　ブール ヴアードＦＩ （７２）発明者　キュリール　ディヴイッドアメリカ合衆国　ノースカロライナ 州 ２７５１６　チャペル　ヒル　ウェスト　ウッド　ドライヴ　４０５ （７２）発明者　ヒユー　ピン　チュアンアメリカ合衆国　ノースカロライナ州 ２７５１６　チャペル　ヒル　ティンカーペルロード　７２９ （７２）発明者　ヴアーグカー　エルンストオーストリア　ア−２１０３ランゲ ンツエルスドルフ　ヴイーネル　シュトラーセ （７２）発明者　ビルンシュティール　マックス　エルオーストリア　ア−１１ ００ウィーン　グルンデッケルガッセ　４９ （７２）発明者　コツテン　マット オーストリア　ア−１１３０ウィーン　マキシングシュトラーセ　２２−２４− ３−８

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸と複合体を形成することができ、かつ、インターナライジング因子およ び核酸に対する親和性を有する物質から成る、高等真核細胞に核酸を導入するこ とを目的とする新規な結合体であって、該インターナライジング因子が抗体を介 して核酸に親和性を有する物質に結合するウイルスであり、該ウイルスが結合体 ／核酸複合体の一部として細胞に侵入し、かつ、細胞への侵入後複合体が存在す るエンドソームの）内容物を細胞質に放出しうることを特徴とする結合体。
2. ２．前記ウイルスの細胞への侵入およびエンドソームの内容物の放出という機能 に関与しない該ウイルスのタンバク質に前記抗体が結合することを特徴とする請 求項１記載の結合体。
3. ３．前記ウイルスがアデノウイルスであることを特徴とする請求項１または２記 載の結合体。
4. ４．前記抗体がヘクソン領域のエビトープに結合することを特徴とする請求項３ 記載の結合体。
5. ５．前記アデノウイルスがヘクソンタンパク質をコードする配列においてコドン １８８から１９４の代わりにマイコプラズマ・ニュウモニアエタンパク質Ｐｌの アミノ酸９１４から９２８をコードする配列を含むキメラウイルスであり、かつ 、該抗体がＰｌ領域に結合することを特徴とする請求項３および４記載の結合体 。
6. ６．前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２から５のい ずれか１項記載の結合体。
7. ７．前記核酸に対する親和性を有する物質がポリカチオンであることを特徴とす る請求項１から６のいずれか１項記載の結合体。
8. ８．前記ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする請求項７記載の結合 体。
9. ９．結合体として請求項１から８で定義される結合体の一つを含むことを特徴と する核酸、並びにインターナライジング因子および核酸に対する親和性を有する 物質からなる結合体の複合体。
10. １０．前記核酸が治療的に活性な遺伝子を含む遺伝子構築物をあることを特徴と する請求項９記載の複合体。
11. １１．前記遺伝子が遺伝子治療において活性を有する遺伝子またば遺伝子断片で あることを特徴とする請求項１０記載の複合体。
12. １２．前記遺伝子構築物が、特異的に細胞機能を阻害するＲＮＡ分子を転写しう る領域を含むことを特徴とする請求項１０記載の複合体。
13. １３．前記ウイルスがそれ自体細胞に対するインターナライジング因子であるこ とを特徴とする請求項９記載の複合体。
14. １４．前記結合体がそれ自体は細胞に対するインターナライジング因子ではない ウイルスを食み、かつ、前記複合体がさらにインターナライジング因子を含むこ とを特徴とする請求項９記載の複合体。
15. １５．前記複合体が、核酸に対する親和性を有する物質および高等真核細胞の表 面受容体に特異的なインターナライジング因子を有する第２の結合体をさらに含 むものであって、前記ウイルス結合体およびインターナライジング因子結合体が 核酸と複合体を形成することを特徴とする請求項９ないし１４に記載の複合体。
16. １６．前記第２の結合体の核酸に対する親和性を存する物質が有機性ポリカチオ ンであることを特徴とする請求項１５記載の複合体。
17. １７．前記ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする請求項１６記載の 複合体。
18. １８．前記第２のインターナライジング因子がトランスフェリンであることを特 徴とする請求項１５記載の複合体。
19. １９．前記第２のインターナライジング因子がレクチンであることを特徴とする 請求項１５記載の複合体。
20. ２０．細胞を請求項９から１９で定義される複合体の一つで処理することを特徴 とする高等真核細胞に核酸を導入するための方法。
21. ２１．活性成分として請求項９から１９で定義される複合体の一つを含む医薬組 成物。
22. ２２．２つ以上の容器を含むキャリヤーユニットであって、第１の容器は抗体に 結合した核酸に対する親和性を有する物質を含み、かっ、第２の容器は該抗体 が免疫反応を起こすウイルスであって、もし該ウイルスが核酸に対する親和性を 有する物質および核酸の複合体の一部である場合には高等真核細胞に侵入するこ とができ、かっ細胞への侵入後複合体が存在するエンドソームの内容物を細胞質 に放出させることができるウイルスを含むようなキャリヤーユニットを含むトラ ンスフェクションキット。
23. ２３．１つ以上の容器を含むキャリヤーユニットであって、第１の容器が、もし ウイルスが核酸に対する親和性を有する物質および核酸の複合体の一部である場 合には高等真核細胞に侵入することができるウイルスであって、かっ細胞への侵 入後複合体が存在するエンドソームの内容物を細胞質に放出することができる該 ウイルスに抗体を介して免疫学的に結合する、核酸に対する親和性を有する物質 を含んでいるようなキャリヤーユニットを含むトランスフェクションキット。
24. ２４．前記容器の１つが、さらに、高等真核細胞に対するインターナライジング 因子および核酸に対する親和性を有する物質から成る第２の結合体を含むことを 特徴とする請求項２２または２３記載のトランスフェクションキット。