KR101261869B1 - 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 형성능을 가진 재조합 트레일을 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트레일을 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것으로 보다 구체적으로, 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 형성기능을 가진 재조합 트레일을 세포내에서 생산할 수 있는 유전자 전달체 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 전달체 및 이를 포함하는 항암제는 암세포의 성장을 억제하고 암세포의 자가사멸을 유도하는 효능을 가지고 있고 아데노바이러스 복제에 관여하는 E1 및 E3 유전자가 제거되어 감염성이 없으므로 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

트레일, 세포사멸, 유전자 전달체

Description

이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 형성능을 가진 재조합 트레일을 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 전달체{A gene delivering vector comprising the gene encoding soluble and secretable homotrimer forming recombinant human TRAIL}

도 1은 분비성 삼중체형 TRAIL(stTRAIL) 생성을 위한 아데노바이러스 제조형 셔틀벡터(pAdloxTRAIL)의 유전자 지도를 나타낸 그림이다.

도 2는 아데노바이러스 제조용 셔틀벡터(pAdloxTRAIL) 클론 중 가장 우수한 활성을 가진 클론의 선별결과를 나타낸 결과로, 293T 세포에 각각 선별된 셔틀벡터 클론을 2일간 감염시킨 후 얻어진 세포 배양액을 회수하여 1/2, 1/4, 1/8 및 1/16으로 배지를 희석한 후 뇌종양 세포주에 각각 처리하여 뇌종양세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다:

pAdloxTRAIL(#1 및 #2) : 선별된 셔틀벡터 클론;

U373 : TRAIL 저항성 세포주;

T98G 및 U87-MG : TRAIL 민감성 세포주;

Mock : pAdlox 대조군; 및

pGT2 : pGT2 운반체 대조군.

도 3은 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일을 생산하는 복제 불능 아데노바이러스 유전자 전달체(Ad-stTRAIL)의 제작과정, 유전자지도 및 DNA 염기서열 분석을 나타낸 결과로, 도 3A는 Ad-stTRAIL 유전자 전달체 제작과정을 나타낸 그림이고, 도 3B는Ad-stTRAIL 유전자 전달체의 유전자지도 및 DNA 염기서열 분석을 나타낸 그림이다.

도 4는 Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 다양한 종류의 암에 처리하여 유도된 항암효과를 나타낸 결과로, Ad-stTRAIL을 50 MOI로 처리한 다음 세포의 생존율(%)을 MTS 법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다:

HeLa : 자궁암 세포주;

MDA-MB-231 : 유방암 세포주;

A549 : 폐암 세포주;

HCT116 : 결장암 세포주; 및

U-87MG : 뇌종양 세포주.

도 5는 Ad-stTRAIL 유전자 전달체의 뇌종양 세포주에 대한 항암효능 및 감염된 세포내에서 분비되는 삼중체형 트레일 발현을 나타낸 결과로, 도 5A는 뇌종양 세포주 U87-MG(2×10⁵개)에 각각 1, 10, 50 및 100 MOI의 감염비율로 아데노바이러스를 감염시키거나 재조합 단백질 트레일을 1, 10, 20 및 80 (ng/ml)으로 처리한 후 뇌종양세포에서의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다:

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체;

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터;

rhTRAIL : 재조합 단백질 트레일; 및

MOI : 세포에 감염되는 바이러스 비율(multiplicity of infection).

도 5B는 뇌종양 세포주 U87-MG(2×10⁵개)에 각각 1, 10, 50 및 100 MOI의 감염비율로 아데노바이러스를 3일간 감염시킨 후 얻어진 배지에서 분비된 삼중체형 트레일 농도를 96-웰 플레이트용 면역효소방법으로 측정하여 나타낸 그래프이다:

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체; 및

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터.

도 6은 Ad-stTRAIL 유전자 전달체에 의하여 유도되는 뇌종양세포의 세포사멸을 어넥신-V 형광염색법을 이용한 FACS 분석으로 나타낸 그래프이다:

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체;

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터; 및

rhTRAIL : 재조합 단백질 트레일.

도 7은 Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 면역결핍마우스에서 형성된 뇌종양조직에 투여한 다음 유도되는 항암효능 및 종양조직의 H&E 및 TUNEL 염색으로 나타낸 결과로, 도 7A는 종양 이식 후 종양 직경이 3~5 mm가 되었을때 아데노바이러스 투여 후 종양 부피(mm³)를 측정(장축×단축²×1/2)하여 나타낸 그래프이다:

HBS : 대조군(투여시 이용된 생리식염수);

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체;

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터; 및

rhTRAIL : 재조합 단백질 트레일.

도 7B는 뇌종양조직의 조직학적 상태를 각각 H&E 및 TUNEL 방법으로 염색하여 나타낸 그림이다:

HBS : 대조군(투여시 이용된 생리식염수);

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체; 및

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터.

도 8은 Ad-stTRAIL 유전자 전달체와 자연형 트레일의 항암효능을 비교하여 나타낸 결과로, 도 8A는 아데노바이러스로 감염시킨 감염 세포 및 비감염 세포를 혼합하여 면역결핍마우스에 이식한 후 감염 세포뿐만 아니라 비감염 세포 및 조직에서 유도되는 종양사멸을 종양크기로 측정하여 나타낸 그래프이다:

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체;

Ad-flTRAIL : 자연형 트레일을 포함하는 재조합 아데노바이러스; 및

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터.

도 8B는 상기와 같이 이식된 종양을 3일 후 회수하여 종양조직을 분쇄한 후 caspase-3 검출용 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다:

No virus : 감염되지 않은 뇌종양조직 분쇄액;

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체로 감염된 뇌종양조직 분쇄액;

Ad-flTRAIL : 자연형 트레일을 포함하는 재조합 아데노바이러스로 감염된 뇌 종양조직 분쇄액; 및

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터로 감염된 뇌종양조직 분쇄액.

도 8C는 상기의 분쇄된 조직을 Caspase-3 단일클론 항체를 이용하여 웨스턴-블랏을 수행하여 나타낸 그림이다:

Ad-stTRAIL : 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체로 감염된 뇌종양조직 분쇄액;

Ad-flTRAIL : 자연형 트레일을 포함하는 재조합 아데노바이러스로 감염된 뇌종양조직 분쇄액; 및

Ad-Ψ5 : 재조합 아데노바이러스 모체 벡터로 감염된 뇌종양조직 분쇄액.

본 발명은 트레일을 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 전달체에 관한 것으로 보다 상세하게는 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 형성기능을 가진 재조합 트레일을 세포내에서 생산할 수 있는 유전자 전달체 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다.

트레일(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)은 형질전환 세포뿐 만 아니라 다양한 암세포의 세포사멸을 유도 및 정상세포에서는 손상을 주지 않아 항암치료제 개발에 중요한 기술로서 이용되고 있다(Walczak, et al., Nat. Med. 5, 157-163, 1999).

지금까지, 항암치료는 외과적 수술, 방사선 치료, 약물 치료, 면역촉진제를 이용한 신체 면역기능을 향상시키는 방법 및 호르몬을 이용하는 방법 등이 이용되고 있지만 그 부작용으로 인하여 새롭고 안전한 치료법이 요구되어져 왔다. 특히, 재조합 단백질 트레일을 이용한 항암치료제 개발은 미국에서 이미 상업적으로 임상 개발이 진행중에 있다(http://www.gene.com/gene/pipeline/status/oncology/ apo2l/index.jsp).

반면에, 재조합 단백질 트레일은 혈장내 반감기(1.3 시간)가 짧아 5시간 이내에 체내에서 완전히 소멸되는 단점을 가지고 있다. 특히, 이러한 단점으로 인하여 재조합 단백질 트레일의 유효한 항암효능을 유지하기 위해서는 다량의 재조합 단백질 트레일을 반복적으로 투여해야만 한다고 보고되었다(Walczak, et al., Nat. Med. 5, 157-163, 1999). 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해서는 트레일 유전자를 생체내에 전달하여 트레일 단백질을 생성하는 유전자 전달체 개발이 요구되고 있다. 이러한 유전자 전달체 개발에 있어서 해결해야 할 가장 큰 요인은 효율적으로 유전자를 치료대상 세포의 핵내로 전달하는 과정이다. 일반적으로, 유전자의 핵내 전달은 엔도사이토시스(Endocytosis) 과정을 거쳐 세포내로 이동시킨 후 핵내로 전달하는 것이다. 그러나, DNA 자체로 이루어진 유전자는 세포를 통과하는 과정 중에 파괴되어 그 효율이 매우 떨어지므로 인체에 감염성이 있는 바이러스 유전 자 운반체를 이용하면 전달과정 중의 손실을 최소화하면서 유전자를 효과적으로 도입할 수 있다. 구체적으로는 치료 유전자를 유전자 재조합 방법으로 아데노바이러스 DNA에 삽입하여 제작한 재조합 아데노바이러스를 생체외에서 대량생산한 후 인체에 직접적으로 감염시킴으로써 세포내로 유전자를 효율적으로 전달하게 된다. 특히, 복제 불능 아데노바이러스는 인체에 해를 주지 않으면서 세포의 핵내에 유전자를 전달하는 특별한 기전을 가지고 있으며, 다른 바이러스보다 전달 효율이 뛰어나기 때문에 유전자치료의 운반체로 유용하게 사용되어져 왔다(Anas El-Aneed, J. Controlled Release, 94, 1-14, 2004).

지금까지는 자연형 트레일 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 이용한 유전자 전달체들이 제작되어 그 항암효능을 세포 수준 및 마우스를 이용한 종양이식 동물모델에서 확인되어져 왔다(Griffith, T. S. 및 Broghammer, E. T. Molecular Therapy, 4, 257-266, 2001; 및 Lin, et al., Molecular Therapy, 8, 441-448, 2003). 그러나, 상기의 자연형 트레일 재조합 아데노바이러스는 막단백질 구조를 가지므로 그 효능에 있어서 매우 제한적일 수밖에 없다. 비록, 체내의 메탈로프로테아제(metalloproteinase)에 의하여 세포막에 붙어있는 부위가 분리되면서 이동성 트레일이 형성되지만, 이러한 자연형 트레일은 항암 효능을 증가시키지 못하는 것으로 알려지고 있다(Kim, M. H., Billiar, T. R 및 Seol, D. W. Biochem. Biophys. Res. Commun. 321, 930-935, 2004). 이에 본 발명자들은, 이미 본 발명자들에 의하여 개발된 이동성 있는 분비가능한 삼중체형 트레일 발현 카세트를 이용하여 자연형 트레일의 단점을 극복하고자 하였다.

복제 불능 아데노바이러스(replication-incompetent adenovirus) 유전자 전달체는 현재 임상 개발이 거의 완료된 가장 제품화 가능성이 있는 제형이다. 세계 최초 유전자 치료제인 젠다이신(Gendicine, Shenzhen Sibiono GeneTech사, 중국) 역시 복제 불능 아데노바이러스를 이용하여 종양억제 P53 유전자를 전달하도록 제작되어 중국내에서 이미 시판중에 있다(The Genesis of Gendicine, Biopharm International, May 2004, 1쪽 ~ 4쪽). 또한, 유사한 형태의 P53 유전자 전달 아데노바이러스인 에드백신(Advexin) 역시 미국내에서 3상 임상 시험을 종료한 후 현재 신약허가를 준비하고 있다고 알려져 있다. 또한, 에드백신(Advexin)은 미국 인트로젠(Introgen)사에 의해서도 개발되고 있고 다양한 암종에서 항암효능이 확인되었으며, 이미 임상 1상에서 안전성이 확인되었다(Merritt, et al., Seminar in Oncology, 28, 105-114, 2001 및 Lang, et al., J. Clinical Oncology, 21, 2508-2518, 2003).

한편, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)를 이용한 유전자 전달체 시스템은 복제 불능 아데노바이러스가 체액성 면역 반응을 유도하거나, 체내 이미 존재하는 항체로 인한 유전자 전달 효율 저하를 극복하고자 개발된 것으로, 아데노바이러스의 복제에 관여하는 Rep와 Cap 유전자를 가지고 있지 않아 체내에 전달시 면역반응과 독성을 나타내지 않는다고 알려져 있다(Samulski, et al., EMBO J, 10, 3941-3950, 1991).

그러나, 상기와 같은 유일한 장점 외에 AAV 유전자 전달 시스템은,

1) 게놈 크기가 36 kb에 달하기 때문에 다양한 크기의 치료 유전자를 삽입 가능한 아데노바이러스에 비해(Cusack, J.C. Jr 및 Tanabe, K.K., Surg. Oncol. Clin. N. Am., 11, 497-519, 2002), AAV는 그 크기가 작아 삽입될 수 있는 유전자의 크기가 4.5-5 kb 미만으로 제한되어 있어 효율적인 유전자 조작으로 인한 개량형 유전자 전달 시스템 확립이 어렵고,

2) 아데노바이러스와 달리, 아직까지 높은 역가를 생산하는 패키징 세포주(예를 들면, 아데노바이러스의 경우 293 세포주가 존재함)가 확립되지 않아 제조방법이 번거롭고 까다로우며 그 생산 효율 또한 매우 낮고,

3) 헬퍼 바이러스(helper virus)로 이용되고 있는 아데노바이러스의 오염에 의한 안정성 문제 및 제거의 어려움이 있고(Anas E1-Aneed, J. Controlled Release, 94, 1-14, 2004),

4) 아데노바이러스가 다양한 조직세포에 감염될 수 있는데 반해, AAV는 AAV 특이적 접합체로 인하여 특정 장기(간, 폐 및 근육 등)에 대한 장기 특이성이 존재하고(Maheshrien, N., et al., Nature Biotechnology, 24, 198-204, 2006),

5) 치료 유전자의 전달효율이 낮고(Buller, R.M., et al., J. Virol., 40, 241-247, 1981 및 Janik, J.E., et al., Virology, 168, 320-329, 1989),

6) 비록 안전하게 염색체 19번에 삽입된다고는 하지만, 원치않은 부위에 삽입되어 이 삽입에 의한 발암 가능성이 항시 존재하는 단점을 가지고 있다.

상기와 같은 많은 단점 때문에 AAV는 아데노바이러스에 비해 유전자 전달체로서 적합하지 않다.

이에, 본 발명자들은 항암효능을 효과적으로 증진시키기 위하여 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일 유전자가 복제 불능 아데노바이러스를 제작한 후, 다양한 종양세포에 감염시켜 종양세포 특이적인 사멸유도를 확인하고, 자연형 트레일보다 우수한 항암효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체(homotrimer) 형성기능을 가진 재조합 트레일을 세포내에서 생산하여 암 세포를 사멸시키는 복제 불능 아데노바이러스 및 이를 포함하는 항암제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 형성능을 가진 재조합 트레일을 코딩하는 유전자를 포함하는 셔틀벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 셔틀벡터가 도입되어 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 트레일을 생산하는 복제 불능 아데노바이러스를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 아데노바이러스를 활성성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 형성능을 가진 재조합 트레일을 코딩하는 유전자를 포함하는 셔틀벡터를 제공한다.

본 발명자들은 아데노바이러스 패키징 신호(서열번호 5), 인간 유전자 고발현 프로모터, 아데닌다중화(polyadenylation, poly-A) 신호(서열번호 6)로 구성되는 아데노바이러스 제조용 셔틀벡터인 pAdlox(Stephen Hardy, et al., J. Virology, 71, 1842-1849, 1997)와 기존 pGT2SEC(CV)ILZ TRAIL(M.-H. Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 321, 930-935, 2004)로부터 절단하여 분리한 인간 단백질 분비 신호(SS, secretion signal, 서열번호 3), 퓨린(Furin)-특이적 절단부위 위치(서열번호 7), 삼중체 형성을 유도하는 단백질 다중화 형성 모티브(서열번호 4) 및 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일 유전자(서열번호 1)로 구성된 발현 카세트를 접합시켜 아데노바이러스 제조용 셔틀벡터 pAdloxTRAIL을 제작하였다(도 1 참조). 특히, 본 발명에 있어서 상기 인간 유전자 고발현 프로모터는 CMV외에도 RSV 또는 베타-엑틴이 사용될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다(Kenji Kawabata, et al., Molecular Therapy 12, 537-554, 2005). 또한, 본 발명의 분비 신호(SS, secreat signal)는 서열번호 3 이외에 다른 분비 신호 예를 들면, 소의 프롤락틴 분비 신호(Bovine prolactin secretion signal, S. Gorman et al., Molecular Brain Research 44, 143-146, 1997)가 사용될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

이어, 본 발명의 셔틀벡터 클론을 숙주세포에 감염시킨 후 트레일이 발현된 배지를 뇌종양세포에 처리하여 세포 생존율(%)을 확인하여 pAdloxTRAIL(#2) 셔틀벡 터 클론이 이동성이 있으며 분비가능한 삼중체형 트레일 활성이 우수한 클론임을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명은 상기 셔틀벡터가 도입되어 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체를 생산하는 복제 불능 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명자들은 세포내에서 암세포에 특이적인 세포사멸을 유도하는 삼중체형 트레일 단백질을 생산할 수 있도록 인간 아데노바이러스 타입 5(human adenovirus type 5)에 존재하는 E1 및 E3 유전자를 제거하여 복제가 불가능하고 상동재조합(homologous recombination)이 수행될 수 있도록 loxP 유전자를 포함하는 복제 불능 아데노바이러스 모체 벡터 Ad-Ψ5를 이용하였다(도 3 참조).

이어, 본 발명자들은 활성이 우수한 아데노바이러스 제조용 셔틀벡터 pAdloxTRAIL(#2)와 아데노바이러스 모체 벡터인 Ad-Ψ5를 CRE8 세포주(loxP 사이에서 상동재조합을 유도하는 CRE 재조합효소 유전자가 항시 발현되는 세포주)에 함께 감염시킨 후 상동재조합(homologous recombination)을 유도함으로써 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일 아데노바이러스 유전자 전달체를 확보하였다(도 3A 참조).

이러한 과정을 통하여 얻어진 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체를 Ad-stTRAIL로 명명하였고, 본 발명의 Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 2006년 3월 21일에 한국 미생물 보존 센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM 10743P).

본 발명의 복제 불능 재조합 아데노바이러스를 대량으로 생산하기 위해서는 패키징 세포주가 필요한데, 패키징 세포주는 자신의 게놈내에 아데노바이러스의 복제에 관여하는 유전자(예: E1)를 포함하고 있어서 상기 유전자를 항시 발현시키는 특징을 가지고 있는 세포주이다. 사용가능한 패키징 세포주로는 293 세포주, PerC6 세포주(CruCell사, 미국) 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

이어, 본 발명의 아데노바이러스 Ad-stTRAIL로 감염시킨 세포 배양액을 회수하여 트레일 항체를 이용한 ELISA 반응을 수행한 결과, 아데노바이러스 감염비율(MOI)에 따라 트레일 단백질의 분비가 증가됨을 관찰하여 본 발명의 아데노바이러스로부터 삼중체형 트레일 단백질이 발현, 분비됨을 확인하였다(도 5B 참조).

아울러, 본 발명은 상기 아데노바이러스를 활성성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

본 발명자들은 상기 Ad-stTRAIL 유전자 전달체의 항암 효능을 확인하기 위하여 Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 각종 암세포 즉, 자궁암 세포주(HeLa), 유방암 세포주(MDA-MB-231), 폐암 세포주(A549), 결장암 세포주(HCT116) 및 뇌종양 세포주(U87-MG)에 감염시킨 후 MTS 색소분석을 이용하여 세포사멸 및 세포성장 억제를 유도하는지 조사하였다. 그 결과, 상기의 모든 세포주에서 세포 생존율이 40~60%로 감소함을 관찰하여 본 발명의 Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 거의 모든 암세포에서 세포사멸 유도 및 세포성장을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다(도 4 참조).

특히, 뇌종양 세포주를 대상으로 Ad-stTRAIL 유전자 전달체의 바이러스 감염비율(multiplicity of infection, MOI)에 따른 세포 생존율을 MTS 방법으로 측정한 결과, 재조합 단백질 트레일 및 Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 반응 농도별 세포 생존율에 있어서 유사한 효능이 있음을 확인하였다(도 5A 참조).

이어, 본 발명에서는 Ad-stTRAIL 유전자 전달체가 감염된 세포에서 유도되는 세포사멸에 대한 효능을 분석하기 위하여, 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)과 결합할 수 있는 형광물질이 접합된 어넥신 V(annexin V-FITC)과의 반응을 유세포분석기(flow cytometry, Beckon Dickinson사)로 측정하여 Ad-stTRAIL 유전자 전달체가 감염된 세포의 세포막 내에 존재하는 포스파티딜세린이 세포사멸로 인해 세포막 외부로 그 위치가 변하는지를 측정하였다. 그 결과, Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 재조합 단백질 트레일과 매우 유사하게 세포사멸을 유도함을 확인하였다(도 6 참조).

더불어, 본 발명자들은 상기 Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 뇌종양 세포가 이식된 면역결핍마우스(SCID)의 종양에 투여함으로써 종양사멸 및 종양성장 억제를 유도할 수 있는지 조사하였다. 그 결과, 상기 Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 양성대조군인 재조합 단백질 트레일보다 우수한 종양성장 억제를 보였으며, 음성대조군에 비하여 많은 세포사멸 신호를 유도하였다. 따라서, 본 발명의 Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 우수한 항암 효능을 가지고 있음이 확인하였다(도 7 참조).

더불어, 자연형 트레일을 생산하는 재조합 아데노바이러스 및 상기 Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 각각 뇌종양 세포주에 감염시킨 다음 감염되지 않은 세포들과 혼합한 후 비감염 세포의 사멸을 측정하기 위하여 면역결핍마우스에 이식하여 그 효능을 확인하였다. 그 결과, Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 대조군인 자연형 트 레일 재조합 아데노바이러스(Ad-flTRAIL)에 비하여 종양제거 정도가 우수함을 보였고, 높은 caspase-3의 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

따라서, 본 발명의 Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일의 특징을 가진 단백질을 발현 분비하고, 이 분비된 삼중체형 트레일에 의하여 뇌종양 세포주에 특이적으로 항암 효능을 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 항암제는 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일을 생산하는 복제 불능 아데노바이러스 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 항암제는 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제 성분을 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 항암제는 비경구 종양내 투여용 제형으로, 이를 제제화하기 위해 서는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

항암제는 환자를 치료하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 일회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 0. 1 ml 내지 10 ml이고 더욱 바람직하게는 1 ml 내지 5 ml이다. 항암제 내의 아데노바이러스 양은 1×10⁹개 내지 1×10¹²개 바이러스이고, 바람직하게는 1×10¹⁰개 내지 1×10¹¹개 바이러스이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일 유전자를 포함하는 아데노바이러스 제조용 셔틀 벡터의 제조

본 발명은 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체(homotrimer) 형태의 트레일(아미노산 114~281, 서열번호 2) 유전자(서열번호 1)를 포함하는 아데노바이러스 셔틀벡터를 제조하기 위하여, 공지의 pGT2SEC(CV)TRAIL 플라스미드(M.-H. Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 321, 930-935, 2004)를 Hind III 및 Xba I으로 절단하여 인간 단백질 분비 시그날, 퓨린 특이 절단부위 및 트레일(아미노산 114~281)을 포함하는 745bp 절편을 분리하였다. 이어, 상기의 DNA 절편을 아데노바이러스 패키징 시그날이 존재하며, 인간 유전자 고발현 프로모터와 다클론닝 부위, 아데닌다중화 신호 및 동일 재조합에 이용되는 loxP 위치가 포함된 공지의 플라스미드 pAdlox(Stephen Hardy, et al., J. Virology, 71, 1842-1849, 1997)의 Hind III 및 Xba I으로 절단된 부위에 삽입하여 아데노바이러스 제조용 셔틀벡터 pAdloxTRAIL(도 1 참조)의 접합 혼합물(ligation mix) 2개를 확보하였고, 이를 대장균(DH5α)에 삽입시킨 다음 형질 전환된 대장균 클론을 LB 아가 플레이트에서 확인하고, 각각 1개씩 2개의 클론을 확보하였다. 상기의 확보된 클론 중 이동성이 있고 분비가능한 삼중체형 트레일을 포함하는 우수한 클론을 선별하기 위하여, 2종의 아데노바이러스 제조용 셔틀벡터 클론(pAdloxTRAIL #1 및 pAdloxTRAIL #2)의 플라스미드 DNA를 plasmid mini kit(Qiagen사, 독일)을 이용하여 분리하였고, 이를 Hind III 및 Xba I으로 처리하여 TRAIL 발현 삽입인자(insert)를 확인하였다. 이어, 상기의 플라스미드 DNA(10 ㎍)를 숙주세포인 293T 세포(Qiagen사, 독일)에 Superfect 시약(Qiagen사, 독일)으로 형질도입한 다음 24시간이 경과된 후에 배양액를 수취하고, 이 배양액을 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 정제한 후, 발현된 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일을 포함하는 배양액 1 ml(희석 또는 희석되지 않은 배양액)를 24-웰 플레이트에서 배양된 3종의 뇌종양 세포에 각각 처리하여 2일 후에 세포 생존율(cell viability)를 측정하였다. 세포 생존율은 MTS법(Promega사, 미국)을 이용하였다. 3종의 뇌종양 세포는 트레일에 저항성을 갖는 U373-MG 또는 트레일에 반응성이 있는 T98G 및 U87-MG 세포주이며, 각각의 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, 미국)으로부터 입수하였다.

그 결과, pAdloxTRAIL #2 셔틀벡터 클론의 트레일 활성이 가장 우수하여 뇌종양 세포생존율이 가장 낮은 클론임을 확인하고(도 2 참조) 이를 이후의 실험을 위해 선별하였다.

< 실시예 2> 복제 불능 재조합 아데노바이러스 유전자 전달체( Ad - stTRAIL )의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 트레일 활성이 우수한 아데노바이러스 셔틀벡터 pAdloxTRAIL 2 ㎍과 Cla I으로 선형화된 공지의 아데노바이러스 모체 벡터 Ad-Ψ5(Stephen Hardy, et al., J. Virology, 71, 1842-1849, 1997) 5 ㎍을 EC(Effectene Complex, Qiagen사) 완충액에 300 ㎕ 부피로 혼합하였다. 이 혼합반응액을 상동 재조합을 유도하는 loxP 재조합 효소 기능이 있는 Cre8 세포주(Stephen Hardy, et al., J. Virology, 71, 1842-1849, 1997)에 직접 첨가하여 형질도입을 시켜서 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일을 생산하는 복제 불능 아데노바이러스를 제조하였다(도 3).

이어, 재조합 아데노바이러스를 확인하기 위하여 아데노바이러스 DNA를 Qiagen plasmid mini kit(Qiagen사, 독일)를 이용하여 분리한 후, DNA 염기서열 분석을 수행하여 삽입 유전자들이 원하는 재조합 유전자임을 확인한 후, 상기 아데노바이러스의 대량 증식을 위하여 293 세포에 감염시키고 세슘클로라이드(CsCl) 농도구배를 이용하여 2번 원심분리한 다음, 4% 수크로즈(Sucrose) 및 200 mM 염화나트륨이 포함된 트리스(Tris)-EDTA 완충액으로 투석시켜 항암효능 확인에 사용할 재 조합 아데노바이러스를 생산하였다. 또한, 감염가능 아데노바이러스 수를 나타내는 역가(titer)는 293 세포를 이용한 TCID₅₀ 방법(Qbiogene사의 Adenovator application manual의 TCID₅₀법, p53-54, 미국)으로 CPE(cytopathic effect)를 측정하여 결정하였고, 상기의 재조합 아데노바이러스를 Ad-stTRAIL로 명명하여 2006년 3월 21일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM 10743P).

< 실시예 3> Ad - stTRAIL 의 항암 효능 조사

본 발명에서는 Ad-stTRAIL이 각종 암세포에서 항암 효능을 나타내는지 확인하기 위하여 5종의 암세포주인 유방암 세포주(MDA-MB-231), 폐암 세포주(A549), 결장암 세포주(HCT116), 자궁암 세포주(HeLa) 또는 뇌종양 세포주(U87-MG)를 각각 10% FBS를 포함하는 배지에서 배양하여 사용하였다. 이때, 각 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, 미국)에서 분양받아 사용하였다.

본 발명자들은 5종의 암세포주를 대상으로 Ad-stTRAIL를 처리한 후 이로부터 생성된 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일이 암세포에 미치는 영향을 조사하였다. 우선, Ad-stTRAIL의 감염이 암세포 성장에 미치는 영향을 MTS 색소분석으로 측정하였다. 대략 2×10⁵개의 세포를 12-웰 플레이트상의 각 웰에 분주하여 12시간 배양한 다음, Ad-stTRAIL 또는 Ad-Ψ5(대조군)를 50 MOI(multiplicity of infection)의 농도로 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 이어, 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 각 웰에서 암세포를 분리한 다음 원심분리하여 세포를 회수한 후 배양액으로 현탁하였다. 현탁된 암세포의 100 ㎕를 96-웰 플레이드에 각각 분주한 다음 20 ㎕의 MTS 용액(Promega사, 미국)을 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 반응한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 감염시킨 5종의 모든 세포주에서는 세포 생존율이 40~60%로 감소되는 반면에, 아데노바이러스 모체 벡터인 Ad-Ψ5를 감염시킨 5종의 모든 암세포주에서는 세포 생존율에 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 Ad-stTRAIL는 거의 모든 암종의 세포주에서 세포사멸을 유도하고 세포성장을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다(도 4).

< 실시예 4> Ad - stTRAIL 의 뇌종양 세포주에 항암 효능 조사

뇌종양 세포인 U87-MG에 Ad-stTRAIL를 감염시킨 후 이로부터 발현 및 분비되는 삼중체형 트레일을 확인하고 암의 진행에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 약 2×10⁵개의 세포를 12-웰 플레이트상의 각 웰에 분주하여 12시간 배양한 다음 Ad-stTRAIL 및 Ad-Ψ5를 다양한 농도의 감염 바이러스 비율(1, 10, 50 및 100 MOI)로 각각 감염시켰고, 양성대조군으로는 재조합 단백질 트레일(rhTRAIL, R&D System사, 미국)을 이용하여 다양한 농도(1, 10, 20 및 80 ng/ml)로 첨가하였다. 37℃의 5% 이산화탄소 배양기에서 3일간 배양한 후 MTS 용액(Promega사, 미국)을 이용하여 세포의 생존율 분석을 수행하였다(도 5).

그 결과, Ad-stTRAIL 유전자 전달체 및 양성대조군인 재조합 단백질 트레일 모두에서 반응 농도에 따라 세포 생존율이 감소하는 항암 효능을 확인할 수 있었다(도 5A). 또한, 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일이 세포배양액으로 분비되는지를 확인하기 위하여, Ad-stTRAIL 유전자 전달체 및 Ad-Ψ5를 상기와 같이 각각 12-웰 플레이트상에서 감염시킨 다음 3일 동안 배양한 후 배양액을 회수하여 분비된 트레일을 96-웰 플레이트를 이용한 효소면역반응(ELISA)으로 확인하였다. 구체적으로, 트레일 단백질에 대한 단일클론 항체(항-인간 TRAIL/APO-II, Peprotech사, 미국)를 면역 플레이트에 흡착시킨 다음 회수된 배양액과 반응시키고, 트레일 단백질의 다중클론 항체 발색반응에 이용되는 바이오틴(biotin)이 접합된 2차 항체(바이오티닐화된 항-인간 TRAIL, Peprotech사, 미국)를 처리한 후 바이오틴과 결합하는 아비딘(avidin)에 결합된 페록시다제(peroxidase) 효소접합체(Avidin-HRP, BD Bioscience사, 미국)를 처리한 후 ABTS 발색제(Sigma사, 미국)를 이용하여 흡광도 405 nm에서 발색반응 정도를 측정하였다. 그 결과, 바이러스 감염비율(MOI)에 따라 분비되는 트레일의 양이 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 5).

따라서, 본 발명의 Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 뇌종양 세포주에 감염되면, 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일을 발현 및 분비시킴으로써 주위에 있는 뇌종양 세포를 사멸 및 성장을 억제하는 효능이 있음을 알 수 있다.

< 실시예 5> Ad - stTRAIL 유전자 전달체에 의해 유도되는 뇌종양 세포주의 세포사멸 조사

본 발명에서는 Ad-stTRAIL 유전자 전달체를 뇌종양 세포주인 U87-MG에 감염 시킨 후 유도되는 세포사멸을 조사하기 위하여, 어넥신(Annexin) V를 이용한 형광물질 염색법으로 분석하였다. 구체적으로, 세포에서 유도되는 세포사멸로 인해 세포막 내에 존재하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)이 세포막 외부로 그 위치가 변하는 현상을 이용하여 PS와 결합할 수 있는 형광물질이 접합된 어넥신 V (annexin V-FITC, BD Bioscience사, 미국)와의 반응을 유세포분석기(Flow cytometry, Beckon Dickinson사)로 측정하였다. 상기의 세포(2×10⁵개)를 각각 Ad-stTRAIL 유전자 전달체, Ad-Ψ5 및 재조합 단백질 트레일(rhTRAIL)과 반응시킨 다음 3일간 배양한 후 PBS 완충액으로 세포를 세척하였고, 이어 어넥신 V를 첨가하여 15분간 어두운 실온에서 반응시킨 후 FACS 분석기를 이용하여 488 nm에서 측정하였다(도 6 참조).

그 결과, Ad-stTRAIL 유전자 전달체 감염 세포의 세포사멸 정도가 재조합 단백질 트레일 처리 세포의 사멸정도와 유사함을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 따라서, Ad-stTRAIL 유전자 전달체가 감염된 세포에서는 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일에 의하여 뇌종양 세포주의 세포사멸이 유도됨을 알 수 있다.

< 실시예 6> 면역결핍 마우스에 이식된 뇌종양을 대상으로 Ad - stTRAIL 의 항암 효능 조사

마우스에 이식된 뇌종양을 대상으로 Ad-stTRAIL 투여시 종양사멸 및 종양성장 억제가 나타나는지 조사하기 위하여, 뇌종양 세포주 U87-MG를 면역결핍마우스 (SCID, Jackson Laboratory, 미국)의 왼쪽 가슴부위에 마리당 1×10⁶개의 세포를 이식한 다음 1주일 경과 후 형성된 종양에 Ad-Ψ5 또는 Ad-stTRAIL를 각각 1×10⁹ PFU로 처리하였고, 양성대조군은 재조합 단백질 트레일(3 ㎍)을 이용하여 혈관내로 투여하였다. 이어, 투여 후 3일 경과된 종양조직을 각각 분리하여 H&E 염색(도 7B) 및 형광염색법인 TUNEL 염색법(Promega사, 미국)으로 세포사멸에 의해 생성된 염색체 DNA 단편을 측정하였다(도 7C). 특히, 종양억제 정도는 종양크기를 측정하여 확인하였고, 종양사멸 현상은 종양조직내 세포사멸이 일어나는 정도를 나타내는 TUNEL 염색법으로 측정하였다.

그 결과, Ad-stTRAIL 유전자 전달체 투여군이 재조합 단백질 투여군보다 우수한 종양성장 억제효과를 보였고, TUNEL 염색법 결과에서도 재조합 단백질 투여군보다 많은 종양사멸 신호가 나타남을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

< 실시예 7> Ad - stTRAIL 과 Ad - flTRAIL 의 종양억제 활성 비교

이어, 본 발명자들은 Ad-stTRAIL가 감염된 세포에서 생성되는 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일의 특징을 확인하기 위하여, Ad-stTRAIL를 감염시킨 뇌종양 세포주 U87-MG와 비감염된 U87-MG를 1:4로 혼합한 후 면역결핍 마우스 가슴에 이식하여 종양크기의 증가를 관찰하였다. 양성대조군으로는 세포막 부착 단백질인 자연형 트레일(full length TRAIL, flTRAIL)을 포함하는 재조합 아데노바이러스 Ad-flTRAIL(Thomas S. Griffith and Elizabeth L. Broghammer, Molecular Therapy 4, 257-266, 2001)를 이용하였다. 구체적으로, Ad-stTRAIL과 Ad-flTRAIL을 각각 U87-MG에 감염시킨 후 비감염된 세포와 1:4로 혼합한 다음 2.5×10⁶개의 세포를 5주령 면역결핍 마우스(SCID)의 가슴 부위에 이식하여 종양크기의 변화를 측정하였고, 조직내 세포사멸 정도의 측정을 위하여 투여 후 7일된 종양조직을 분리하였다. 구체적으로, 종양조직을 실험용 칼을 이용하여 절개한 후, 10% 프로테아제 억제제(Protease inhibitor cocktail, Sigma, 미국)가 포함된 300 ㎕의 분쇄용액(25 mM Tris-HCl[pH7.4], 50 mM NaCl, 0.5% sodium-deoxycholate, 2% NP-40, 0.2% SDS)에 넣고 4℃에서 30분간 반응한 다음 12000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 수취하였다. 이렇게 분쇄된 분쇄물(lysate)을 대상으로 caspase-3 검출형광 ELISA 분석 및 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 단백질의 크기별로 분리한 후 caspase-3 항체(R&D systems, 미국)를 이용한 웨스턴-블랏을 수행하였다(도 8B 및 8C).

그 결과, Ad-stTRAIL 처리군에서는 양성대조군인 Ad-flTRAIL 처리군보다 현저하게 종양크기의 감소 및 활성 caspase-3 발현의 증가를 유도함을 확인할 수 있었다(도 8A). 이러한 결과는 첫째, 세포내 caspase-3 발현정도는 세포자가사멸(apoptosis)를 측정하는 척도중 하나이며 둘째, 자연형 막결합 TRAIL에 비하여 이동성이 있는 분비가능한 TRAIL은 비감염 종양세포를 대상으로 우수한 종양억제 현상을 보이는 것으로 보아, 본 발명의 Ad-stTRAIL을 감염시킨 세포부터 발현되는 이동성이 있는 분비가능한 삼중체형 트레일은 자연형 트레일에 비해 감염부위의 세포 뿐만 아니라 비감염 부위의 세포까지 쉽게 이동하여 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.

< 제제예 > 주사액제의 제조방법

본 발명의 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

4% 수크로즈(Sucrose) 및 200 mM 염화나트륨이 포함된 트리스(Tris)-EDTA 완충액을 병에 넣고 120℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다. 여기에 본 발명의 트레일을 생산하는 복제 불능 아데노바이러스( 10¹¹개 바이러스/1ml )를 첨가하였다.

본 발명의 Ad-stTRAIL 유전자 전달체는 암세포의 성장을 억제하고 암세포의 자가사멸을 유도하는 효능을 가지고 있을 뿐 아니라, 지금까지 연구된 세포막 부착 자연형 트레일(full length TRAIL, flTRAIL)에 비하여 쉽게 분비 및 이동할 수 있어 향상된 항암 효능을 나타내며 아데노바이러스 복제에 관여하는 E1 유전자가 제거되어 감염성이 없어 안전하기 때문에 인체에 직접 사용할 수 있어 암 환자를 대상으로하는 항암 유전자 치료제로 이용될 수 있다.

<110> Dong-A Pharmaceutical Co., <120> REPLICATION-INCOMPETENT ADENOVIRAL GENE DEVELOPING VECTOR PRODUCING SOLUBLE AND SECRETABLE HOMOTRIMER FORMING RECOMBINANT TRAIL <130> 6p-02-18 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 447 <212> DNA <213> TRAIL gene <400> 1 gtgagagaaa gaggtcctca gagagtagca gctcacataa ctgggaccag aggaagaagc 60 aacacattgt cttctccaaa ctccaagaat gaaaaggctc tgggccgcaa aataaactcc 120 tgggaatcat caaggagtgg gcattcattc ctgagcaact tgcacttgag gaatggtgaa 180 ctggtcatcc atgaaaaagg gttttactac atctattccc aaacatactt tcgatttcag 240 gaggaaataa aagaaaacac aaagaacgac aaacaaatgg tccaatatat ttacaaatac 300 acaagttatc ctgaccctat attgttgatg aaaagtgcta gaaatagttg ttggtctaaa 360 gatgcagaat atggactcta ttccatctat caagggggaa tatttgagct taaggaaaat 420 gacagaattt ttgtttctgt aacaaat 447 <210> 2 <211> 168 <212> PRT <213> TRAIL 114-281 amino acid <400> 2 Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr 1 5 10 15 Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys 20 25 30 Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His 35 40 45 Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His 50 55 60 Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln 65 70 75 80 Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr 85 90 95 Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser 115 120 125 Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe 130 135 140 Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser 145 150 155 160 Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 165 <210> 3 <211> 151 <212> DNA <213> secretion signal <400> 3 atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt 60 aagcttggta ccatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 120 tgcctgccct ggcttcatga gggcagtgcc t 151 <210> 4 <211> 99 <212> DNA <213> TFD gene <400> 4 agaatgaagc agatcgagga caaaattgag gaaatcctgt ccaagattta ccacatcgag 60 aacgagatcg cccggattaa gaaactcatt ggcgagagg 99 <210> 5 <211> 603 <212> DNA <213> adenovirus packaging signal <400> 5 ccagcgagta gagttttctc ctccgagccg ctccgacacc gggactcgag tgttgacatt 60 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 120 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 180 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 240 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 300 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 360 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 420 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 480 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 540 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 600 gta 603 <210> 6 <211> 209 <212> DNA <213> polyadenylation signal <400> 6 gcggccgctc gagcatgcat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct 60 ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc 120 ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 180 actgcattct agttgtggtt tgtccaaac 209 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Furin-specific restriction site <400> 7 ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctc 39

Claims (11)

1. 분비 신호 서열, 삼중체 형성 도메인 및 트레일(TRAIL)을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 포함하는 발현 카세트 및 인간 유전자 고발현 프로모터 및 loxP 유전자를 포함하고, 도 1에 개시된 개열지도를 갖는 복제 불능 아데노바이러스 제조용 셔틀벡터.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 분비 시그날 서열은 서열번호 3으로 기재되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
4. 제 1항에 있어서, 삼중체 형성 도메인은 서열번호 4로 기재되는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
5. 제 1항에 있어서, 상기 셔틀벡터는 아데노바이러스 복제에 필요한 E1과 E3 유전자를 제거한 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
6. 삭제
7. 1) 제 1항의 셔틀벡터와 아데노바이러스 모체 벡터인 Ad-Ψ5를 CRE8 세포주에 함께 감염시켜 상동 재조합을 유도하는 단계; 및

   2) 단계 1에서 유도된 재조합 아데노바이러스의 복제에 관여하는 E1 유전자를 발현하는 패키징 세포주에 감염시켜 대량복제하는 단계를 포함하는 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 트레일을 생산하는 복제 불능 아데노바이러스 대량생산방법.
8. 삭제
9. 제 7항의 단계 1에 의해 수득된 이동성이 있는 분비가능한 동형삼중체 트레일을 생산하는 수탁번호(KCCM 10743P)로 기탁된 복제 불능 아데노바이러스.
10. 제 9항의 아데노바이러스를 활성성분으로 포함하는 항암제.
11. 제 10항에 있어서, 상기 암은 자궁암, 유방암, 폐암 세포주, 결장암 및 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제.

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