BR112021015676A2 - Composições de anticorpo lym-1 e lym-2 e construções car aprimoradas - Google Patents

Composições de anticorpo lym-1 e lym-2 e construções car aprimoradas Download PDF

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Peisheng Hu
Long Zheng
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Abstract

composições de anticorpo lym-1 e lym-2e construções car aprimoradas. são fornecidos aqui novos anticorpos e células receptoras de antígeno quimérico (car) que compreendem os domínios de ligação de antígeno destes anticorpos. também são fornecidas composições compreendendo os mesmos, vetor ou plasmídeo que codifica os anticorpos e cars e métodos para produzir os mesmos ou usar os mesmos para detectar ou tratar câncer e kits para realizar os referidos métodos.

Description

“COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO LYM-1 E LYM-2 E CONSTRUÇÕES CAR APRIMORADAS”
RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS DE PATENTE CORRELATOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119 (e) para os pedidos provisórios US com os números de série 62/806.632; 62/815.961 e 62/924.151, depositado em 15 de fevereiro de 2019; 8 de março de 2019 e 21 de outubro de 2019, respectivamente, cada um incorporado por referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[0002] A presente divulgação se refere geralmente ao campo da imunologia humana, especificamente à imunoterapia do câncer.
[0003] A seguinte discussão dos antecedentes é fornecida meramente para ajudar o leitor na compreensão da divulgação e não é admitida para descrever ou constituir a técnica anterior à presente divulgação. Ao longo da presente divulgação, várias publicações são referenciadas por um numeral arábico, cujas citações bibliográficas completas são encontradas imediatamente antes das Reivindicações. Estas referências, bem como a literatura técnica e de patentes aqui referenciadas na presente invenção, são incorporadas por referência.
[0004] O Lym-1 e o Lym-2 são dirigidos contra moléculas HLA-DR de MHC de classe II que são conhecidas por serem expressas principalmente na superfície de células B humanas, células dendríticas e linfomas derivados de células B e leucemia.
[0005] Anticorpos monoclonais de murinos Lym-1 e Lym-2 (Epstein AL, et all, 1987, Cancer Res. 47: 830-840) foram originalmente desenvolvidos para ter como alvo o antígeno HLA-Dr expresso na superfície celular da maioria das doenças malignas de células B humanas. (Rose et all, 1996, Cancer Immunol Immunother 43(1): 26-30) posteriormente identificaram o epítopo de ligação a Lym-1 que é um sítio descontínuo na cadeia leve do HLA-Dr humano. O Lym-2 não é competitivo com Lym-1 e, portanto, se liga a um epítopo diferente no antígeno de HLA-Dr. O Lym-1 foi testado no homem como um produto farmacêutico radiomarcado I-131 e anticorpo nu para o tratamento de linfoma difuso de células grandes e considerado eficaz e seguro DeNardo SJ et all, 1988, Antibody, Immunoconjugates, e Radiopharmaceuticals 1:17-33; DeNardo, S.J. et all,1988, Int. J. Cancer 3:96-101; e Hu E. et all, 1989, Hematologic Oncology 7:155-166). Ao contrário dos anticorpos contra outros antígenos de células B, como CD19 e CD20, o Lym-1, mas não o Lym-2, produz apoptose de células tumorais após a ligação devido à localização do antígeno em microdomínios lipídicos de membrana (lipid rafts) na superfície de células de linfoma humano (Epstein AL, et all, 1987, Cancer Res. 47: 830-840). Além disso, os antígenos de Lym-1 e Lym-2 não são eliminados ou internalizados em nenhum grau e são expressos apenas em células B circulantes normais e ligadas a linfonodos a ¼ da concentração em comparação com células de linfoma.
SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO
[0006] Devido às características acima mencionadas, Lym-1 e Lym- 2 são anticorpos alvos ideais que podem ser usados para o tratamento de leucemia e linfomas positivos para antígeno. Mais recentemente, Lym-1 e Lym-2 foram usados para gerar células T CAR humanas eficazes e foram patenteados como novas composições de matéria para a imunoterapia dessas doenças malignas. Esta divulgação demonstra que Lym-1 e Lym-2 humanizados recentemente produzidos, que têm uma afinidade mais baixa para o antígeno do que os anticorpos parentais, podem ser usados para gerar células T CAR humanas clinicamente eficazes para o tratamento de doenças malignas de células B e são eficazes contra tumores positivos para antígeno metastático quando heterotransplantados em camundongos NSG. Esses dados fornecem informações críticas sobre o uso potencial dessas construções de anticorpos humanizados para a geração de células T CAR humanas capazes de tratar pacientes com tumores de células B.
[0007] Devido aos resultados sem precedentes obtidos recentemente em linfomas de células B e leucemia usando tratamento autólogo com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) geneticamente modificado, vários laboratórios começaram a aplicar esta abordagem a tumores sólidos. As células modificadas por CAR combinam a especificidade de alvo independente de HLA de um anticorpo monoclonal com a atividade citolítica, proliferação e propriedades de homing de células T ativadas, mas não respondem à supressão do ponto de verificação. Devido à sua capacidade de matar os alvos que expressam o antígeno diretamente, os CAR são altamente tóxicos para quaisquer células ou tecidos positivos para o antígeno, tornando-se um requisito para construir CARs com anticorpos altamente específicos. Em um aspecto, são divulgados na presente invenção novos anticorpos, CARs e métodos de seu uso diagnosticamente e terapeuticamente tendo os perfis de segurança e eficácia pretendidos.
[0008] Em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos compreendendo, ou consistindo essencialmente em ou ainda consistindo adicionalmente em uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 ou 6 ou um equivalente de cada uma das mesmas; e/ou uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 ou 8 ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em outro aspecto, é divulgado aqui um anticorpo compreendendo, ou consistindo essencialmente em ou ainda consistindo adicionalmente em: uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou um equivalente da mesma; e/ou uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou um equivalente da mesma.
[0009] Em um aspecto, o anticorpo da presente divulgação é um anticorpo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. As regiões constantes dos anticorpos também podem ser variadas. Por exemplo, os anticorpos podem ser fornecidos com regiões Fc de qualquer isótipo: IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ou IgM. Em uma modalidade, a região constante do anticorpo da presente divulgação é uma região constante de IgG1 ou uma região constante de Ig kappa. Em um aspecto particular, o anticorpo da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir em um marcador detectável ou um marcador de purificação. É fornecido aqui também um método de produção dos anticorpos da presente divulgação compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em cultivar a célula isolada descrita acima, em que a célula isolada é opcionalmente uma célula de mamífero.
[0010] Além disso, são fornecidos aqui fragmentos de ligação ao antígeno do anticorpo divulgado. Em alguns dos aspectos dos anticorpos fornecidos na presente invenção, o fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, F(ab)’2, Fab’, scFv e Fv. Em um aspecto adicional, esta divulgação fornece anticorpos isolados ou fragmentos dos mesmos, conforme divulgado na presente invenção e um marcador detectável ou de purificação, sozinho ou em combinação com um antígeno ou fragmento do mesmo. É ainda fornecida na presente invenção uma célula ex vivo compreendendo ou consistindo essencialmente ou ainda consistindo neste complexo de antígeno/ anticorpo.
[0011] Esta divulgação fornece polipeptídeos compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 ou um equivalente de cada uma das mesmas. É ainda fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em, a sequência de aminoácidos dos anticorpos divulgados na presente invenção ou um fragmento dos mesmos, bem como polinucleotídeos isolados que os codificam.
[0012] Ainda são fornecidos adicionalmente os ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos e fragmentos dos mesmos, conforme divulgado na presente invenção. Em um aspecto, as sequências de ácidos nucleicos isolados compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistem adicionalmente nas SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9 e 11 ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em um aspecto, as sequências de polinucleotídeos são operativamente ligadas a um elemento promotor e/ou potencializador. Elas também podem ser combinadas com um vetor ou célula hospedeira apropriada e/ou um veículo adequado para uso diagnóstico ou terapêutico. Em um aspecto, os ácidos nucleicos estão contidos com uma célula hospedeira para a produção recombinante de polipeptídeos e proteínas. As células hospedeiras podem ser eucarióticas ou procarióticas.
[0013] Aspectos da divulgação se referem a um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste em: (a) um domínio de ligação de antígeno de qualquer um dos anticorpos divulgados aqui; (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana, e (d) e um domínio intracelular; Em um aspecto, o CAR compreende adicionalmente ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma ou mais regiões de sinalização coestimulatória. Em outro aspecto, o CAR da presente divulgação é um CAR de primeira geração, um CAR de segunda geração, um CAR de terceira geração ou um CAR de quarta geração.
[0014] Também é fornecido na presente invenção um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste em: (a) um domínio de ligação de antígeno (por exemplo, de um anticorpo anti-Lym), (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana e (d) um domínio(s) DAP 10 e/ou DAP 12. Em um aspecto adicional, o CAR também compreende pelo menos um epítopo de 10 aminoácidos “AVPPQQWALS” inserido diretamente após o domínio de ligação de antígeno. O domínio de ligação de antígeno pode ser de qualquer espécie apropriada, por exemplo, mamífero, murino, rato ou humano, por exemplo.
[0015] Esta divulgação fornece uma construção de CAR, a construção compreendendo, consistindo essencialmente em ou ainda consistindo adicionalmente em: (a) um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-Lym, um anticorpo anti- Lym humanizado ou anticorpo anti-CD19, (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana e (d) um domínio de sinalização intracelular compreendendo um ou mais de um domínio transmembrana de DAP10 e/ou DAP12. Exemplos não limitantes dos anticorpos incluem anticorpos anti-Lym-1, anti-huLym-1 ou Lym2, anti-Lym-2 ou anticorpos anti-CD19 que podem ser de qualquer espécie apropriada. As construções podem compreender adicionalmente, ou consistir essencialmente em, ou ainda consistir em, um ou mais polipeptídeos ligantes, elementos de ligação (a) a (d), acima. Em um aspecto adicional, os CARs compreendem adicionalmente, consistem essencialmente em, ou ainda consistem adicionalmente em um peptídeo líder localizado no terminal amina do domínio de ligação de antígeno. Em uma modalidade, o domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça um CD8 α ou de uma IgG1. Em outro aspecto, o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de CD8 α. Em um aspecto adicional, o CAR também compreende pelo menos um epítopo de 10 aminoácidos “AVPPQQWALS” inserido diretamente após o domínio de ligação de antígeno. O domínio de ligação de antígeno pode ser de qualquer espécie apropriada, por exemplo, mamífero, murino, rato ou humano, por exemplo.
[0016] Em modalidades específicas, o CAR compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um domínio de ligação de antígeno de qualquer um dos anticorpos da presente divulgação ou fragmento (por exemplo, scFv) do mesmo, um domínio de dobradiça de CD8 α ou um domínio de dobradiça de IgG1, um domínio transmembrana de CD8 α e um domínio transmembrana de DAP 10 e/ou DAP 12. Em um outro aspecto, o CAR compreende um domínio transmembrana de DAP 10 e DAP 12.
[0017] Em um aspecto particular, o anticorpo ou CAR da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir em um marcador detectável ou um marcador de purificação.
[0018] Em outra modalidade, o CAR da presente divulgação compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um domínio de dobradiça de CD8 α ou de IgG1, o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de CD 28 ou CD8 α, uma ou mais regiões de sinalizações coestimulatórias são selecionadas a partir de CD27, CD28, 4- IBB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à função linfocitária-1 (LFA-1), CD2, CD7, CD27, LIGHT, NKG2C e B7-H3; e o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização de CD3 zeta.
[0019] Também é fornecido na presente invenção um método de produção do CAR (por exemplo, anti-Lym CAR ou anti-CD19) que expressa células compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em introduzir uma população de células imunes com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR aqui divulgado; e seleção de uma subpopulação de células imunes que foram transduzidas com sucesso com a dita sequência de ácidos nucleicos da etapa (i), produzindo assim as células que expressam CAR.
[0020] Aspectos da presente divulgação se referem a uma célula isolada compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em um CAR da presente divulgação e métodos de produção de tais células.
[0021] Também é fornecido na presente invenção um vetor que compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente na sequência de ácidos nucleicos isolada que codifica o anticorpo ou o CAR da presente divulgação. Em um aspecto, a presente divulgação fornece um vetor que compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente na sequência de ácidos nucleicos isolada que codifica o dito anticorpo ou a construção CAR.
[0022] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma composição compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em um veículo e um ou mais dentre o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno, o polipeptídeo, o CAR, o ácido nucleico isolado, o vetor e/ou a célula isolada da presente divulgação.
[0023] Ainda outros aspectos do método da divulgação se referem a métodos de inibir o crescimento de um tumor e/ou tratar um câncer e/ou prevenir a recaída do câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em administrar ao sujeito uma quantidade eficaz das células que expressam CAR (por exemplo, anti-Lym ou CD19) aqui fornecidas, uma quantidade eficaz do anticorpo, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno do mesmo e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo fornecido aqui. Em um aspecto, o CAR expressa o domínio de ligação de antígeno direcionado ao antígeno expresso no câncer ou célula tumoral a ser tratada ou inibida. Em um aspecto, as células que expressam CAR são autólogas ou alogênicas para o sujeito a ser tratado e, opcionalmente, são uma terapia de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha ou quinta linha. Em outro aspecto, o tumor ou célula cancerosa expressa ou superexpressa o antígeno ao qual o CAR se liga, por exemplo, CD19, Lym1 e/ou Lym2.
Em um aspecto adicional, o câncer ou tumor é selecionado do grupo de um carcinoma, um sarcoma ou uma leucemia. Em um aspecto particular, o tumor ou câncer é linfoma de células B ou leucemia. Em uma modalidade, o tumor é um tumor sólido. O tumor sólido pode ser um melanoma, um carcinoma do cólon, um carcinoma da mama e/ou um tumor cerebral. Em um aspecto, o câncer a ser tratado é um carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, câncer cervical, câncer hepatocelular, mesotelioma, glioblastoma, mieloma, linfoma, leucemia, adenoma, adenocarcinoma, glioma, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, oligodendrocitoma, meningioma ou melanoma.
[0024] Os métodos são úteis para tratar sujeitos como humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos, gibões, chimpanzés, orangotangos, macacos, macacos do gênero macaca e semelhantes), animais domésticos (por exemplo, cães e gatos), animais de pecuária (por exemplo, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos) e animais experimentais (por exemplo, camundongo, rato, coelho, porquinho da índia). Um mamífero pode ter qualquer idade ou qualquer estágio de desenvolvimento (por exemplo, um adulto, adolescente, criança, bebê ou um mamífero no útero). Um mamífero pode ser macho ou fêmea. Em certas modalidades, o sujeito tem ou é suspeito de ter um distúrbio neoplásico, neoplasia, tumor, malignidade ou câncer.
[0025] Os métodos divulgados na presente invenção podem compreender adicional ou alternativamente, consistir essencialmente ou ainda consistir adicionalmente em administrar ao sujeito uma terapia antitumoral diferente da terapia CAR.
[0026] Esta divulgação também se refere a métodos para inibir a proliferação de células cancerosas ou células-tronco cancerosas compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em contatar as células com uma quantidade eficaz das células que expressam CAR, uma quantidade eficaz do anticorpo, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo da presente divulgação. O CAR pode ser um CAR que expressa anti-Lym-1, anti-Lym- 2 ou anti-CD19.
[0027] Além disso, são fornecidos aqui métodos para determinar se um sujeito tem probabilidade de responder ou não é provável de responder à terapia, compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em contatar uma amostra isolada do paciente com o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno, e/ou o polipeptídeo da presente divulgação, e detectar um complexo de anticorpo-célula, um complexo de fragmento de ligação de antígeno-célula e/ou um complexo de polipeptídeo-célula na amostra, em que a presença do complexo indica que o sujeito provavelmente responderá à terapia e a ausência de complexo indica que o sujeito provavelmente não responderá à terapia. O anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno e/ou o polipeptídeo podem ser marcados de forma detectável. Também são divulgados na presente invenção métodos compreendendo adicional ou alternativamente consistindo essencialmente em ou ainda consistindo adicionalmente em administrar uma quantidade eficaz do anticorpo ou do CAR da divulgação ao sujeito que é determinado que provavelmente responderá à terapia.
[0028] Esta divulgação se refere ainda a métodos para monitorar a terapia em um sujeito, compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em contatar uma amostra isolada do sujeito com o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da presente divulgação, e detectar um complexo de anticorpo - célula na amostra. O dito método pode ser realizado antes e/ou após a administração de uma quantidade eficaz de células que expressam CAR, uma quantidade eficaz do anticorpo, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo da presente divulgação ao sujeito. O CAR pode ser um CAR que expressa anti-Lym-1, anti-Lym-2 ou anti-CD19. Em um aspecto, o CAR, o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é marcado de forma detectável. Em outro aspecto, a amostra compreende um ou mais dentre expectoração, soro, plasma, linfa, fluido cístico, urina, fezes, fluido cefalorraquidiano, fluido ascítico, sangue ou um tecido.
[0029] Também são fornecidos na presente invenção kits para realizar os métodos da presente divulgação, bem como instruções para realizar os métodos da presente divulgação. O kit compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um ou mais dentre o anticorpo, o CAR, o fragmento de ligação de antígeno, o polipeptídeo, o ácido nucleico isolado, o vetor, a célula isolada e/ou a composição da presente divulgação e instruções de uso.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] FIG. 1 - Dois anticorpos Lym-1 humanizados têm capacidades de ligação distintas contra células positivas para epítopo. Cinco × 105 células Raji foram incubadas com concentrações crescentes de 0,013 a 1300 nM dos anticorpos indicados. Após detecção com IgG anti-humano de cabra conjugada com (AF488), a intensidade média de fluorescência (MFI - “mean fluorescence intensity”) foi quantificada por citometria de fluxo.
[0031] FIG. 2 - Produção bem-sucedida de células T CAR. No dia 10, as preparações de células T CAR foram marcadas com anticorpo anti- Lym-1-biotina, seguido pela detecção com APC-Estreptavidina. As células T simuladas serviram como controle negativo.
[0032] FIGS. 3A - 3C - Ambas as células T-CAR com base em Lym- 1 humanizados induziram remissão completa em xenoenxertos de Raji. Um milhão de células Raji/Luc-eGFP foram injetadas i.v. em camundongos NSG machos de 8 a 10 semanas de idade (Dia 0). A atividade da luciferase foi medida no Dia 6 para avaliar a carga tumoral pré-tratamento. (FIG. 3A) No Dia 7, dez milhões de células T Mock e CAR (50% de CAR positivas) em 100 µL de PBS foram injetadas i.v., em grupos gerados aleatoriamente de camundongos com tumor (n = 5). (FIG. 3B) A radiação média da bioluminescência das imagens Dorsal e Ventral são quantificadas e somadas. (FIG. 3C) Gráfico de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida de camundongos dos grupos de controle e experimental.
[0033] FIG. 4 - Produção de um anticorpo Lym-1 humanizado funcional. Cinco × 105 células ARH-77 foram incubadas com concentrações crescentes de 2,218 a 266 nM dos anticorpos indicados. Após detecção com IgG anti-humano de cabra conjugada com (AF488), a intensidade média de fluorescência (MFI - “mean fluorescence intensity”) foi quantificada por citometria de fluxo.
[0034] FIG. 5 - Produção bem-sucedida de células T-CAR huLym-1 e huLym-2. No Dia 10, as preparações de células T CAR foram marcadas com biotina-Proteína-L, seguido pela detecção com APC-Estreptavidina. As células T simuladas serviram como controle negativo.
[0035] FIG. 6 - huLym-2CAR exibiu citotoxicidade aumentada contra linhagens de células positivas para epítopo. Células T Mock ou CAR foram incubadas com ARH-77 eGFP/Luc em razões de efetor/alvo (E/T) de 2 a 0,25. A citotoxicidade foi medida 17 horas após a cocultura com base na atividade da luciferase.
[0036] FIG. 7 - Representação esquemática de construções de células T CAR com base em 41BB3z e DAP10-12.
[0037] FIG. 8 - Produção bem-sucedida de células T CAR. No dia 10, as preparações de células T CAR foram marcadas com anticorpo biotina-anti-Lym-1, seguido pela detecção com APC-estreptavidina. As células T simuladas serviram como controle negativo.
[0038] FIGS. 9A - 9B - Expressão genética estável e proliferação celular de células T CAR transduzidas por huLym-1-B-DAP. As células T humanas primárias foram ativadas no Dia 0 com Dynabeads anti- CD3/CD28 e transduzidas com cada construção no Dia 3. Um milhão de células T em cada grupo foram reestimuladas com anti-CD3/CD28 no Dia 7 e Dia 14. (FIG. 9A) Os números absolutos de células nas preparações de células simuladas e T CAR foram contados no Dia 4, Dia 7, Dia 8 e Dia 12. (FIG. 9B) A expressão de CAR foi medida no Dia 7, Dia 14 e Dia 21.
[0039] FIG. 10 - Citotoxicidade induzida por epítopos contra células Raji. Células T Mock ou CAR foram incubadas com Raji-eGFP/Luc em razões de efetor/alvo (E/T) de 2 a 0,25. A citotoxicidade foi medida 17 horas após a cocultura com base na atividade da luciferase.
[0040] FIGS. 11A - 11D Imageamento bioluminescente dorsal da carga do tumor e mudança de peso em camundongos simulados e tratados com CAR. Um milhão de células Raji/Luc-eGFP foram injetadas i.v. em camundongos NSG machos de 8 a 10 semanas de idade (dia 0). A atividade da luciferase foi medida no dia 7 para avaliar a carga tumoral pré-tratamento. No dia 8, um milhão de células Mock e T CAR em 100 µL de PBS foram injetadas i.v., em grupos gerados aleatoriamente de camundongos com tumor (n = 5). (FIG. 11A) Exemplo de imagens bioluminescentes. (FIG. 11B) Gráfico de Kaplan-Meier de sobrevida de camundongos. (FIG. 11C) A radiação média da bioluminescência das imagens Dorsal e Ventral são quantificadas e somadas. (FIG. 11D) Gráfico de peso de camundongos tratados ao longo do tempo. O peso corporal de cada camundongo no dia 0 foi usado como referência para calcular a variação percentual do peso. O peso do camundongo foi medido duas vezes por semana por uma balança digital.
[0041] FIG. 12 - Mostra um experimento em que células T DAP CD19 CAR são usadas para tratar linfoma de Raji disseminado em camundongos NSG. Os camundongos foram injetados com Raji i.v. e 8 dias depois, foram tratados com 1 milhão de células T CAR de huLym-1 DAP, CD19 de segunda geração ou CD19 DAP. Os camundongos foram então imageados por bioluminescência semanalmente e isso mostra que todas as células T CD19 CAR com construções de segunda geração morreram, mas aquelas que receberam construções CD19 DAP CAR ainda estavam vivas em 21 dias, embora ainda tivessem tumor com esta dose.
[0042] FIGS. 13A - 13C - Ambos Lym-1 e huLym-1-B CAR com domínio intracelular 4-1BB3z erradicam o tumor Raji in vivo. (FIG. 13A) representação esquemática de esquema de estudo in vivo. (FIG. 13B)
Imagens de bioluminescência de camundongos NSG inoculados com 106 Raji-eGFP/Luc no dia 0, seguido por tratamento de 5x106 células T mock, células T Lym-1-BB3z CAR, células T huLym-1-B-BB3z CAR ou 100 µl de PBS no dia 6. O sinal bioluminescente da imagem dorsal e ventral de cada camundongo NSG foi somado e plotado ao longo do tempo. (n = 5 camundongos/grupo, dados não mostrados). (FIG. 13C) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier (*p < 0,001 por teste de log-rank.)
[0043] FIGS. 14A - 14F - Impacto do domínio de sinalização intracelular na expansão das células T huLym-1-B CAR. (FIG. 14A) Expansão in vitro de células T Mock ou CAR positivas após transdução e reestimulação (resultados agrupados de cinco doadores). (FIG. 14B) Expressão de CAR em preparações de células T nos dias indicados. As células T foram reativadas com 𝛼estimulador à base de anticorpo - CD2/CD3/CD28 no dia 7 e no dia 14. (FIG. 14C) Expansão in vitro de células T Mock ou CAR positivas após transdução e reestimulação (resultados agrupados de 3 doadores). (FIG. 14D) Expressão de CAR em preparações de células T nos dias indicados. As células T foram reativadas com 𝛼estimulador à base de CD2/CD3/CD28 nos dias 7 e 14 (resultados representativos de 3 doadores). (FIG. 14E) Expansão in vitro de células T Mock ou CAR positivas após transdução e reestimulação (resultados agrupados de 3 doadores). (FIG. 14F) Expressão de CAR em preparações de células T nos dias indicados. As células T foram reativadas com estimulador à base de 𝛼-CD2/CD3/CD28 no dia 7 e no dia 14 (resultados representativos de cinco doadores).
[0044] FIGS. 15A - 15B - A sinalização tônica dependente de ligante é o mecanismo dominante para proliferação deficiente em células T huLym-1-B-BB3z CAR. (FIG. 15A) Células T transduzidas simuladas ou CAR do Dia 9 foram avaliadas quanto à coloração de anexina V e células mortas (Sytox-Green) (resultados representativos de dois doadores). (FIG. 15B) Células T CD19-BB3zCAR foram pré-marcadas com corante vermelho distante de células traço e, em seguida, cocultivadas de um dia para o outro com Células T Mock ou CAR indicadas na razão de 1:1. As células T CD19-BB3zCAR foram então submetidas a coloração com Anexina V e Sytox-Green para medir o potencial fratricida por células T huLym-1-B-BB3z ou huLym-1-B-DAP CAR (resultados representativos de dois doadores).
[0045] FIGS. 16A - 16B - As células T huLym-1-B-DAP CAR exibiram morte celular induzida por ativação reduzida. Células Mock, huLym-1-B-BB3z e T huLym-1-B-DAP CAR foram cultivadas na presença de um estimulador a-CD2/3/28, ou com células K562 ou células Raji de um dia para o outro. Células Mock e T CAR foram então submetidas a coloração com Anexina V e Sytox Green (corante de células mortas). (FIG. 16A) plotagem representativa de um dos três doadores. (FIG. 16B) A porcentagem de células positivas para anexina V em células vivas foi quantificada pela seguinte fórmula: Q3/(Q3+Q4) (agrupadas a partir de três doadores, *P < 0,05 por teste-t de student. Os gráficos de barras mostram a média ± SD (desvio padrão))
[0046] FIGS. 17A - 17C - huLym-1-B-DAP mostrou função efetora contra um painel de linhagens de células de linfoma B e de leucemia. (FIG. 17A) Citocinas liberadas de Mock, huLym-1-B-DAP e huLym-1-B- BB3z quando cocultivadas de um dia para o outro com um painel de linhagens de células de linfoma B humano em uma razão de 1:1 de efetor para alvo. A quantificação de citocinas secretadas é normalizada para células pg/10000 (GM-CSF) ou células ng/10000 (IL-2 e INF-𝛾) (n = 3 repetições técnicas. Resultados representativos de dois doadores). (FIG. 17B) Para medir a citotoxicidade de Mock, huLym-1-B-DAP e huLym-1- B-BB3z, as células tumorais foram pré-marcadas com corante de ermelho distante de células traço e, em seguida, cocultivadas com células efetoras a uma razão de 1:1; As células tumorais vivas em cada ponto de tempo foram bloqueadas. (FIG. 17C) A porcentagem de células tumorais vivas foi quantificada e representada graficamente. A porcentagem de lise é calculada como (% de tumor em 1h -% de tumor em 48h)/(% de tumor em 1h) (n = 3 réplicas técnicas e resultados representativos de dois doadores são mostrados. Os gráficos de barras mostram a média ± SD).
[0047] FIGS. 18A - 18B - O epítopo de Lym-1 não se infrarregula significativamente na presença de células T huLym-1-B-DAP CAR. T Mock, huLym-1-B-DAP e CD19-BB3z foram cocultivadas com um painel de linhagens de células de linfoma B e de leucemia na razão de 1:2. Após a cocultura de um dia para o outro, as linhagens de células B foram marcadas com anticorpos contra CD22, Lym-1 e CD19.
[0048] FIGS. 19A - 19D - Os domínios de sinalização de CAR não afetam a modulação do antígeno. (FIG. 19A) Células T Mock, CD19- BB3z, CD19-DAP, huLym-1-B-BB3z e huLym-1-B-DAP CAR foram cocultivadas de um dia para o outro com células Raji-eGFP/Luc na razão de aproximadamente 1:2. A expressão do antígeno CD19 e do epítopo de Lym-1 nas células Raji vivas residuais foi então medida por anticorpos monoclonais conjugados com fluoróforo por meio de citometria de fluxo. (FIG. 19B) Gráficos de dispersão da intensidade média de fluorescência (MFI) do epítopo de Lym-1 e expressão do antígeno CD19 nas células Raji residuais. (FIG. 19C) Porcentagem e (FIG. 19D) concentração de células Raji vivas após cocultura de um dia para o outro (n = 3 repetições técnicas, representativas de dois doadores).
[0049] FIGS. 20A - 20F - Sobrevida livre de tumor mediada por huLym-1-B-DAP CAR em uma dose mais baixa. (FIG. 20A) Células T Mock e CD19-DAP foram cocultivadas de um dia para o outro com células Raji-eGFP/Luc na razão de 1:2. A expressão do antígeno CD19 e do epítopo de Lym-1 foi então medida por anticorpos monoclonais conjugados com fluoróforo por meio de citometria de fluxo (representativo de três repetições). (FIG. 20B) Protocolo esquemático para o estudo in vivo. (FIG. 20C) Imagens de bioluminescência de camundongos NSG inoculados com 106 células Raji-eGFP/Luc no dia 0, seguido pelo tratamento de células T Mock, huLym-1-B-DAP, CD19-BB3z ou CD19- DAP CAR na dose indicada no dia 8 (n = 5 camundongos por grupo). (FIG. 20D) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier (ns = não significativo pelo teste de log-rank (Mantel-Cox)). (FIG. 20E) Imagens de bioluminescência de camundongos NSG inoculados com 106 células Raji-eGFP/Luc no dia
0, seguido pelo tratamento de 106 células T Mock, CD19-BB3z ou CD19- DAP CAR no dia 8 (n = 5 camundongos por grupo). Este experimento foi realizado lado a lado com a da FIG. 25E e exibe o uso do mesmo grupo de controle de T Mock. (FIG. 20F) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier (P= 0,002 pelo teste de log-rank (Mantel-Cox)).
[0050] FIGS. 21A - 21C - Seleção de huLym-1-B como candidato para o desenvolvimento de CAR. (FIG. 21A) Capacidade de ligação de um painel de 12 anticorpos Lym-1 humanizados contra células Raji. Todos os anticorpos foram expressos na isoforma de IgG1 humana. huLym-1- 60 tem a mesma sequência que chLym-1. hu51 é um controle de isótipo produzido internamente para IgG1 humana. As células Raji foram incubadas com a concentração indicada por 30 minutos seguido por detecção de IgG anti-humana de cabra conjugada com AF-488. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi avaliada por citometria de fluxo para comparar a ligação diferencial dos anticorpos. (FIG. 21B) Capacidade de ligação de huLym-1-B e Lym-1 quimérico (chLym-1) em células Raji produzida internamente por meio de citometria de fluxo. O secundário usado aqui foi anticorpo monoclonal de IgG anti-humana de camundongo conjugado com APC. (FIG. 21C) Ligação de chLym-1 e huLym-1-B contra um painel de linhagem de células positivas e negativas para chLym-1. Para essas medições, um anticorpo monoclonal de IgG anti-humana de camundongo conjugado a APC foi usado como secundário.
[0051] FIGS. 22A - 22H - Células T Lym-1 e huLym-1-B CAR com domínios de sinalização de BB3z‐CD3z são citotóxicas em cultura, apesar da proliferação deficiente. (FIG. 22A) Representação esquemática de construções CAR. Tag 261 é um epítopo linear de 10 aminoácidos derivado do fator de crescimento de placenta humana (FIG. 22B) Cronograma de produção e expansão de T CAR. (FIG. 22C) Análise de citometria de fluxo da expressão de CAR em células T humanas primárias transduzidas ou mock no dia 7; a expressão de CAR foi medida por um anticorpo conjugado com Dylight 650 contra tag 261. (FIG. 22D)
Citotoxicidade de células T CAR contra linhagens de células negativas (K562) e positivas (Raji) de epítopo de Lym-1 no efetor indicado para a razão de alvo (E: T); Células T CAR do dia 9 foram usadas para medir a citotoxicidade. Nenhuma reestimulação foi realizada no dia 7 neste ensaio (n = 3 réplicas técnicas, representativas de 3 dadores). (FIG. 22E) Expansão de alteração em potência de dez de células T positivas para CAR ou mock cocultivadas in vivo a partir dos dias 7-14 (resultados agrupados de 6 doadores. ns - não significativo, *P < 0,001 por teste-t de student). (FIG. 22F) Plotagens representativas mostrando fosforilação de CD3 no dia 9 (sem estimulação no dia 7; n = 3 doadores) (FIG. 22G) expressão de CAR representativo e de receptores inibitórios no dia 7 e no dia 14 antes de reestimulação. (FIG. 22H) Quantificação da porcentagem de receptores inibitórios em células T mock ou positivas para CAR, agrupadas a partir de 3 doadores (* P <0,05 por teste-t de student. Os gráficos de dispersão e de barra mostram a média ± SD).
[0052] FIGS. 23A - 23G - A proliferação deficiente de células T huLym‐1‐B‐BB3zCAR estão associadas a epítopos Lym-1 fracamente expressos em células T e é mediada por ITAM CD3. (FIG. 23A) Apresentação de duas mutações de aminoácidos na CDR3 de cadeia pesada variável de huLym-1-B para gerar anticorpo huLym-1-Bmut ou huLym-1-Bmut-BB3zCAR; Mutação de tirosina (Y) para fenilalanina (F) em todos os três ITAMs da parte de CD3 no CAR para eliminar a atividade de huLym-1-B- BB3z (huLym-1-BBB3zY-F). (FIG. 23B) A capacidade de ligação de chLym-1, huLym-1-B e huLym-1-Bmut contra células Raji. O secundário usado aqui foi IgG anti-humana de cabra conjugado com AF- 488; ED50 é anotado em cada curva. (FIG. 23C) Meio milhão de células T ativadas foram coradas com 10 g/100l de anticorpos indicados seguidos de detecção com APC-anti-huIgG. A intensidade média de fluorescência foi calculada e plotada; os gráficos de dispersão mostram o meio de MFI. Cada ponto colorido representa um doador. (FIG. 23D) Expansão de alteração em potência de dez de células T mock, huLym-1- BBB3zY-F, e huLym-1-Bmut-BB3z CAR positivas do dia 7 ao dia 14
(resultados agrupados de 3 doadores. ns, não significativo por teste-t de student, gráfico de dispersão mostra média ± SD). (FIG. 23E) Plotagens representativas mostrando fosforilação de CD3 no dia 9; A expressão de CAR foi detectada por anticorpo anti-261tag conjugado com Dylight 650 (n = 2 doadores). (FIG. 23F) Plotagem representativa de expressão de CAR e PD-1 e LAG-3 no dia 7 e no dia 14. (FIG. 23G) Quantificação da porcentagem de PD-1 e LAG-3 em células T mock ou positivas para CAR, agrupadas de três doadores (* P < 0,05 por teste-t de student. Os gráficos de barras mostram a média ± SD).
[0053] FIGS. 24A - 24G - Substituição de BB3z pela sinalização com DAP abordou o problema de proliferação de células ThuLym-1-B CAR. (FIG. 24A) O painel à esquerda ilustra os aminoácidos de consenso (AA) de ITIM e ITAM, e o painel à direita mostra o AA de ITAM(s) em DAP12 e CD3; Shade destaca a presença do consenso de ITIM no ITAM de DAP12. (FIG. 24B) Representação esquemática de huLym-1-B CAR com BB3z ou DAP como domínio de sinalização intracelular. (FIG. 24C) expansão in vitro de células Tmock, huLym-1-B-DAP e huLym-1-B-BB3z CAR positivas do dia 7 ao 14 (resultados agrupados de 5 doadores. ns, não significativo pelo teste-t de student). (FIG. 24D) Plotagens representativas mostrando fosforilação de CD3 (p-CD3) no dia 9 (representante de três doadores). (FIG. 24E) Quantificação de p-CD3 em células T mock e positivas para CAR (n = 3 doadores). (FIG. 24F) CAR representativo e expressão de receptores inibitórios no dia 7 e no dia 14 (n = 3 doadores, * P <0,05 por teste-t de student). (FIG. 24G) Quantificação da porcentagem de receptores inibitórios em células T mock e positivas para CAR (agrupadas de três doadores; ns, não significativo; * P < 0,05 por teste-t de student. Os gráficos de dispersão e de barra mostram a média ± SD)
[0054] FIGS. 25A - 25F - células T huLym-1-B-DAP CAR medeiam eficácia antitumor superior do que suas contrapartes BB3z in vivo. (FIG. 25A) Citotoxicidade de células mock, huLym-1-B-DAP ou huLym-1-B- BB3z contra células positivas (Raji, painel à esquerda) ou negativas
(K562, painel à direita) para Lym-1. (FIG. 25B) Liberação de citocinas de mock, huLym-1-B-DAP ou huLym-1-B-BB3z quando cocultivadas com K562 ou Raji na razão de 1:1 de efetor para alvo. A quantificação de citocinas secretadas é normalizada para pg/10.000 células (GM-CSF) ou ng/10.000 células (IL-2 e INF-) (n = 3 repetições técnicas. Resultados representativos de três doadores). (FIG. 25C) Representação esquemática do estudo in vivo com protocolo modificado. (FIG. 25D, FIG. 25E) Imagens de bioluminescência de camundongos NSG inoculados com 106 células Raji-eGFP/Luc no dia 0, seguido por tratamento com 1x106 células T mock, huLym-1-B-DAP ou huLym-1-B- BB3z CAR no dia 8 (n = 5 camundongos por grupo). Dois estudos independentes de diferentes doadores. (FIG. 25F) Curva de Kaplan-Meier de sobrevida (P = 0,000325 por teste de log-rank (Mantel-Cox). Reunidos a partir de dois estudos independentes. Os gráficos de barras mostram a média ± SD).
[0055] FIGS. 26A - 26D - epítopos Lym-1 não infrarregulam a resposta a células ThuLym-1-B- DAP CAR. (FIG. 26A) células T Mock, CD19-BB3z e huLym-1-B- DAP CAR foram cocultivadas de um dia para o outro com células Raji-eGFP/Luc na razão de 1:2, a expressão do antígeno Cd19 e do epítopo de Lym-1 foram então medidas por anticorpos monoclonais conjugados com fluoróforo por meio de citometria de fluxo. (Representante de três réplicas). (FIG. 26B) Gráficos de dispersão da intensidade média de fluorescência (MFI) de expressão de epítopo de Lym- 1 e do antígeno CD19 em Raji (n = 3 repetições técnicas). (FIG. 26C) camundongos NSG inoculados com 106 Raji-eGFP/Luc no dia 0, seguido por tratamento de 1x106 células T mock, CD19-BB3z ou huLym-1-B-DAP CAR no dia 8. No dia 16, as amostras de medula óssea foram coletadas e avaliadas para a expressão de epítopos Lym-1 e do antígeno CD19 por anticorpos monoclonais conjugados com fluoróforos via citometria de fluxo. (FIG. 26D) Gráfico de dispersão da intensidade média de fluorescência (MFI) da expressão de epítopos Lym-1 e de antígeno CD19 em Raji. (n = 5 camundongos por grupo, * P < 0,001; ns, não significativo por teste deKruskal-Wallis. Os gráficos de dispersão mostram a média ±
SD). DESCRIÇÃO DETALHADA
[0056] Deve ser entendido que a presente divulgação não está limitada a aspectos particulares descritos que, como tal, é claro, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada na presente invenção tem a finalidade de descrever aspectos particulares apenas e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente divulgação será limitado apenas pelas Reivindicações anexas. Além disso, ao longo e dentro da presente divulgação, várias publicações técnicas e de patentes são referenciadas por uma citação ou um numeral arábico, cujas citações completas são encontradas imediatamente antes das Reivindicações. As divulgações dessas publicações são incorporadas na presente invenção por referência para descrever melhor o estado da técnica.
[0057] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm os mesmos significados como comumente entendidos por uma pessoa versada na técnica à qual esta tecnologia pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos na presente invenção possam ser usados na prática ou teste da presente tecnologia, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações técnicas e de patentes citadas na presente invenção são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente tecnologia não tem o direito de antecipar tal divulgação em virtude de invenção anterior.
[0058] A prática da presente tecnologia irá empregar, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de cultura de tecidos, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que fazem parte dos conhecimentos da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook e Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et. al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et. al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et. al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames e Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller e Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer e Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); and Herzenberg et. al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology.
[0059] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 1,0 ou 0,1, conforme apropriado, ou alternativamente por uma variação de +/- 15%, ou alternativamente 10%, ou alternativamente 5%, ou alternativamente 2%. Deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que todas as designações numéricas são precedidas do termo “cerca de”. Também deve ser entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que os reagentes descritos na presente invenção são meramente exemplificadores e que equivalentes dos mesmos são conhecidos na técnica.
[0060] Deve ser inferido sem recitação explícita e a menos que de outra forma pretendido, que quando a presente tecnologia se refere a um polipeptídeo, proteína, polinucleotídeo ou anticorpo, um equivalente ou um equivalente biologicamente de tal é pretendido dentro do escopo da presente tecnologia.
Definições
[0061] Como usado no relatório descritivo e nas Reivindicações, as formas singulares “um”, “uma” e “o, a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma pluralidade de células, incluindo as misturas das mesmas.
[0062] Como usado na presente invenção, o termo “animal” se refere a organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui, por exemplo, mamíferos e pássaros. O termo “mamífero” inclui mamíferos humanos e não humanos.
[0063] Os termos “sujeito”, “hospedeiro”, “indivíduo” e “paciente” são usados indistintamente na presente invenção para se referir a animais, normalmente animais mamíferos. Qualquer mamífero adequado pode ser tratado por um método, célula ou composição aqui descrita. Exemplos não limitantes de mamíferos incluem humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos, gibões, chimpanzés, orangotangos, macacos, macacos do gênero macaca e semelhantes), animais domésticos (por exemplo, cães e gatos), animais de pecuária (por exemplo, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos) e animais experimentais (por exemplo, camundongo, rato, coelho, porquinho da índia). Em algumas modalidades um mamífero é um ser humano. Um mamífero pode ter qualquer idade ou qualquer estágio de desenvolvimento (por exemplo, um adulto, adolescente, criança, bebê ou um mamífero no útero). Um mamífero pode ser macho ou fêmea. Um mamífero pode ser uma fêmea prenhe ou grávida. Em algumas modalidades um sujeito é um ser humano. Em algumas modalidades, um sujeito tem ou é suspeito de ter um câncer ou distúrbio neoplásico.
[0064] As “células eucarióticas” compreendem todos os reinos de vida, exceto monera. Elas podem ser facilmente distinguidas por meio de um núcleo ligado à membrana. Animais, plantas, fungos e protistas são eucariotas ou organismos cujas células são organizadas em estruturas complexas por membranas internas e um citoesqueleto. A estrutura mais característica ligada à membrana é o núcleo. A menos que especificamente recitado, o termo “hospedeiro” inclui um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, levedura, planta superior, inseto e células de mamífero. Exemplos não limitantes de células eucarióticas ou hospedeiros incluem símios, bovinos, porcinos, murinos, ratos, aves, reptilianos e humanos.
[0065] As “células procarióticas” geralmente não têm núcleo ou qualquer outra organela ligada à membrana e são divididas em dois domínios, bactérias e arquebactérias. Além do DNA cromossômico, essas células também podem conter informações genéticas em um loop circular denominado epissoma. As células bacterianas são muito pequenas, aproximadamente do tamanho de uma mitocôndria animal (cerca de 1-2 μm de diâmetro e 10 μm de comprimento). As células procarióticas apresentam três formas principais: em forma de bastonete, esférica e espiral. Em vez de passar por processos de replicação elaborados, como os eucariotas, as células bacterianas se dividem por fissão binária. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a bactérias tipo Bacilo, bactéria E. coli e bactéria Salmonella.
[0066] Como usado na presente invenção, o termo “anticorpo” se refere coletivamente a imunoglobulinas ou moléculas semelhantes a imunoglobulinas, incluindo a título de exemplo e sem limitação, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, combinações das mesmas e moléculas semelhantes produzidas durante uma resposta imune em quaisquer vertebrados, por exemplo, em mamíferos como humanos, cabras, coelhos e camundongos, bem como em espécies não mamíferas, como imunoglobulinas de tubarão. A menos que especificamente indicado de outra forma, o termo “anticorpo” inclui imunoglobulinas intactas e “fragmentos de anticorpo” ou “fragmentos de ligação ao antígeno” que se ligam especificamente a uma molécula de interesse (ou um grupo de moléculas de interesse altamente semelhantes) para a exclusão substancial de ligação a outras moléculas (por exemplo, anticorpos e fragmentos de anticorpos que têm uma constante de ligação para a molécula de interesse que é pelo menos 103 M-1 maior, pelo menos 104 M-1 maior ou pelo menos 105 M-1 maior do que uma constante de ligação para outras moléculas em uma amostra biológica). O termo “anticorpo” também inclui formas geneticamente modificadas, como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos de murino humanizados), anticorpos heteroconjugados (como anticorpos biespecíficos). Ver, também, Pierce Catalog and Handbook (1994-1995) (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J. (1997) Immunology, 3º Ed., W.H. Freeman & Co., New York. Um “fragmento de ligação de antígeno” de um anticorpo é uma parte de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno alvo do anticorpo.
[0067] Em termos de estrutura de anticorpo, uma imunoglobulina tem cadeias pesadas (H) e cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Existem dois tipos de cadeia leve, lambda (λ) e kappa (). Existem cinco classes principais de cadeia pesada (ou isótipos) que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável (as regiões também são conhecidas como “domínios”). As regiões constantes dos anticorpos também podem ser variadas. Por exemplo, os anticorpos podem ser fornecidos com regiões Fc de qualquer isótipo: IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ou IgM. Exemplos não limitantes de sequências de região constante incluem: SEQ ID NOs: 19-27 ou um equivalente de cada uma das mesmas
[0068] Em combinação, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve ligam-se especificamente ao antígeno. As regiões variáveis da cadeia leve e pesada contêm uma região de “estrutura” interrompida por três regiões hipervariáveis, também chamadas de “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. A extensão da região de estrutura e as
CDRs foram definidas (Ver, Kabat et all, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, que é incorporada na presente invenção por referência). O banco de dados de Kabat agora é mantido online. As sequências das regiões de estrutura de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de estrutura de um anticorpo, que são as regiões de estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, em grande parte adota uma conformação de β- folha e as CDRs formam laços que se conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de β-folha. Assim, as regiões de estrutura atuam para formar uma estrutura que fornece o posicionamento das CDRs na orientação correta por interações não covalentes entre cadeias. Exemplos não limitantes de CDRs de Lym1 e Lym2 são fornecidos no Pedido US nº 15/173.534.
[0069] As CDRs são principalmente responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do terminal N, e também são tipicamente identificados pela cadeia em que a CDR particular está localizada (regiões de cadeia pesada marcadas como CDHR e regiões de cadeia leve marcadas como CDLR). Assim, uma CDHR3 é a CDR3 do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo em que se encontra, enquanto uma CDLR1 é a CDR1 do domínio variável de cadeia leve do anticorpo no qual se encontra. Um anticorpo TNT terá uma sequência de região de VH específica e de região de VL única para o antígeno relevante TNT e, portanto, as sequências de CDR específicas. Os anticorpos com diferentes especificidades (ou seja, diferentes locais de combinação para diferentes antígenos) têm diferentes CDRs. Embora sejam as CDRs que variam de anticorpo para anticorpo, apenas um número limitado de posições de aminoácidos dentro das CDRs está diretamente envolvido na ligação ao antígeno. Essas posições dentro das CDRs são chamadas de resíduos de determinação de especificidade (SDRs).
[0070] O termo “humanizado”, quando usado em referência a um anticorpo, significa que a sequência de aminoácidos do anticorpo tem resíduos de aminoácidos não humanos (por exemplo, camundongo, rato, cabra, coelho, etc.) de uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que se ligam especificamente ao antígeno pretendido em uma molécula de imunoglobulina humana receptora e um ou mais resíduos de aminoácidos humanos na região de estrutura Fv (FR), que são resíduos de aminoácidos que flanqueiam as CDRs. Esses anticorpos tipicamente têm imunogenicidade reduzida e, portanto, uma meia-vida mais longa em humanos, em comparação com o anticorpo parental não humano a partir do qual uma ou mais CDRs foram obtidas ou nas quais elas se baseiam.
[0071] Como usado na presente invenção, o termo “antígeno” se refere a um composto, composição ou substância que pode ser especificamente ligada pelos produtos de imunidade humoral ou celular específica, como uma molécula de anticorpo ou receptor de células T. Os antígenos podem ser qualquer tipo de molécula, incluindo, por exemplo, haptenos, metabólitos intermediários simples, açúcares (por exemplo, oligossacarídeos), lipídeos e hormônios, bem como macromoléculas, como carboidratos complexos (por exemplo, polissacarídeos), fosfolipídeos e proteínas. As categorias comuns de antígenos incluem, mas sem limitação, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, protozoários e outros antígenos parasitários, antígenos tumorais, antígenos envolvidos em doenças autoimunes, alergia e rejeição de enxerto, toxinas e outros antígenos diversos.
[0072] Como usado na presente invenção, o termo “domínio de ligação de antígeno” se refere a qualquer proteína ou domínio de polipeptídeo que pode se ligar especificamente a um alvo de antígeno.
[0073] O termo “receptor de antígeno quimérico” (CAR - “chimeric antigen receptor”), como usado na presente invenção, se refere a uma proteína fundida que compreende um domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno, um domínio transmembrana derivado de um polipeptídeo diferente de um polipeptídeo do qual o domínio extracelular é derivado, e pelo menos um domínio intracelular. O “receptor de antígeno quimérico (CAR)” às vezes é chamado de “receptor quimérico”, “corpo T” ou “receptor imunológico quimérico (CIR)”. O “domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que pode se ligar a um determinado antígeno. O “domínio intracelular” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por funcionar como um domínio que transmite um sinal para causar ativação ou inibição de um processo biológico em uma célula. Em certas modalidades, o domínio intracelular pode compreender, alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda compreender adicionalmente um ou mais domínios de sinalização coestimuladores, além do domínio de sinalização primário. O “domínio transmembrana” significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por abranger a membrana celular e que pode funcionar para ligar os domínios extracelular e de sinalização. Um receptor de antígeno quimérico pode opcionalmente compreender um “domínio de dobradiça” que serve como um ligante entre os domínios extracelular e transmembrana. Exemplos não limitantes de tais domínios são fornecidos na presente invenção, por exemplo:
[0074] Domínio de dobradiça: Sequência de dobradiça de cadeia pesada de IgG1:
[0075] CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC
GTGCCCG
[0076] Domínio transmembrana: Região transmembrana de CD28:
[0077] TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTA
TAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
[0078] Domínio intracelular: Região de sinalização coestimulatória de 4-1BB:
[0079] AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACC
ATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGAGGAAGATGGCTGTAGCTG CCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
[0080] Domínio intracelular: Região de sinalização coestimulatória CD28:
[0081] AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGA
ACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCT ATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
[0082] Domínio intracelular: Região de sinalização de CD3 zeta:
[0083] AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACC
AGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGA GGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGG GGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACT GCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGG CGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCA GTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCC CCCTCGCTAA
[0084] Outras modalidades de cada componente de domínio exemplificador incluem outras proteínas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, 90% de identidade de sequência, com maior preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com as proteínas codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos divulgadas acima. Além disso, exemplos não limitantes de tais domínios são fornecidos aqui.
[0085] Como usado na presente invenção, um “CAR de primeira geração” se refere a um CAR compreendendo um domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno, um domínio transmembrana derivado de um polipeptídeo diferente de um polipeptídeo do qual o domínio extracelular é derivado, e pelo menos um domínio intracelular. Um “CAR de segunda geração” se refere a um CAR de primeira geração compreendendo adicionalmente um domínio de coestimulação (por exemplo, 4-1BB ou CD28). Um “CAR de terceira geração” se refere a um CAR de primeira geração compreendendo adicionalmente dois domínios de coestimulação (por exemplo, CD27, CD28, ICOS, 4-1BB ou OX40). Um
“CAR de quarta geração” (também conhecido como “TRUCK”) se refere a uma célula T de CAR, posteriormente projetada para secretar um fator adicional (por exemplo, citocina pró-inflamatória IL-12). Uma revisão dessas tecnologias de CAR e terapia celular é encontrada em Maus, M. et. al. Clin. Cancer Res. 22 (3): 1875-84 (2016).
[0086] Como usado na presente invenção, o termo “peptídeo sinal” ou “polipeptídeo sinal” é destinado a uma sequência de aminoácidos geralmente presente na extremidade N-terminal de polipeptídeos ou proteínas secretoras ou de membrana recentemente sintetizados. Ele atua para direcionar o polipeptídeo através ou para dentro de uma membrana celular e é então subsequentemente removido. Exemplos de tais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes são aqueles descritos nas Patentes US nºs. 8.853.381 e 5.958.736.
[0087] Como usado na presente invenção em referência a um polinucleotídeo regulador, o termo “operativamente ligado” se refere a uma associação entre o polinucleotídeo regulador e a sequência de polinucleotídeos à qual está ligado de modo que, quando uma proteína específica se liga ao polinucleotídeo regulador, o polinucleotídeo ligado é transcrito.
[0088] Uma “composição” normalmente se destina a uma combinação de agente ativo, por exemplo, uma célula T CAR ou uma célula NK CAR, um anticorpo, um composto e um veículo de ocorrência natural ou não natural, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou ativo, tal como um adjuvante, diluente, ligante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou semelhantes e incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos também incluem excipientes farmacêuticos e proteínas aditivas, peptídeos, aminoácidos, lipídeos e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra-oligossacarídeos e oligossacarídeos; açúcares derivatizados, como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e semelhantes; e polissacáridos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em combinação,
compreendendo isoladamente ou em combinação 1 a 99,99% em peso ou volume. Excipientes de proteína exemplificadores incluem albumina de soro, como albumina de soro humano (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e semelhantes. Componentes de aminoácido/anticorpo representativos, que também podem funcionar em uma capacidade de tamponamento, incluem alanina, arginina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e semelhantes. Excipientes de carboidratos também se destinam ao escopo desta tecnologia, exemplos dos quais incluem, mas não estão limitados a monossacarídeos, como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacarídeos, como lactose, sacarose, trealose, celobiose e semelhantes; polissacarídeos, como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e semelhantes; e alditóis, como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e mioinositol.
[0089] As composições usadas de acordo com a divulgação, incluindo células, tratamentos, terapias, agentes, fármacos e formulações farmacêuticas podem ser embaladas na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. O termo “dose unitária” ou “dosagem” se refere a unidades fisicamente discretas adequadas para uso em um sujeito, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição calculada para produzir as respostas pretendidas em associação com sua administração, ou seja, a via e o regime apropriados. A quantidade a ser administrada, tanto em número de tratamentos quanto em dose unitária, depende do resultado e/ou da proteção pretendida. Quantidades precisas da composição também dependem do julgamento do praticante e são peculiares a cada indivíduo. Os fatores que afetam a dose incluem o estado físico e clínico do sujeito, a via de administração, o objetivo pretendido do tratamento (alívio dos sintomas versus cura) e a potência, estabilidade e toxicidade da composição específica. Após a formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, como o tipo de soluções injetáveis aqui descritas.
[0090] O termo “sequência de consenso”, como usado na presente invenção, se refere a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que é determinada pelo alinhamento de uma série de sequências múltiplas e que define uma sequência idealizada que representa a escolha predominante de aminoácido ou base em cada posição correspondente das sequências múltiplas. Dependendo das sequências da série de sequências múltiplas, a sequência de consenso para a série pode diferir de cada uma das sequências por zero, uma, algumas ou mais substituições. Além disso, dependendo das sequências da série de sequências múltiplas, mais de uma sequência de consenso pode ser determinada para a série. A geração de sequências de consenso foi submetida a análises matemáticas intensivas. Vários programas de software podem ser usados para determinar uma sequência de consenso.
[0091] Como usado na presente invenção, o termo “domínio de dobradiça de CD8 α” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou, alternativamente, pelo menos 90% de identidade de sequência, ou alternativamente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de domínio de dobradiça de CD8 α como mostrado aqui. As sequências de exemplo de domínio de dobradiça de CD8 α para humanos, camundongos e outras espécies são fornecidas em Pinto, R.D. et. al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177. As sequências associadas ao domínio de dobradiça de CD8 α são fornecidas em Pinto, R.D. et. al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177. Exemplos não limitantes de tais incluem: domínio de dobradiça de CD8 alfa humano;
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY domínio de dobradiça de CD8 alfa de camundongo;
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY domínio de dobradiça Cat CD8 alfa; PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY e equivalentes de cada um dos mesmos.
[0092] Como usado na presente invenção, o termo “domínio transmembrana de CD8 α” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou alternativamente pelo menos 90% de identidade de sequência ou, alternativamente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de domínio transmembrana de CD8 α como mostrado aqui. As sequências de fragmentos associadas às posições de aminoácidos 183 a 203 da cadeia CD8 alfa de glicoproteína de superfície de células T humanas (sequência de referência NCBI: NP_001759.3), ou as posições de aminoácidos 197 a 217 da cadeia CD8 alfa de glicoproteína de superfície de células T de camundongo (sequência de referência NCBI: NP_001074579.1), e as posições de aminoácidos 190 a 210 da cadeia CD8 alfa da glicoproteína de superfície de células T de rato (sequência de referência NCBI: NP_ 113726.1) fornecem sequências de exemplo adicionais do domínio transmembrana de CD8 α. As sequências associadas a cada um dos NCBI listados são fornecidas da seguinte forma: domínio transmembrana de CD8 alfa humano: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT; Domínio transmembrana de CD8 alfa de camundongo: IWAPLAGICVALLLSLIITLI; Domínio transmembrana de CD8 alfa de rato: IWAPLAGICAVLLLSLVITLI e equivalentes de cada um dos mesmos.
[0093] Como usado na presente invenção, o termo “domínio transmembrana de CD28” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, pelo menos 90% de identidade de sequência ou, alternativamente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de domínio transmembrana de CD28 como mostrado aqui. As sequências de fragmentos associadas aos números de acesso do GenBank: XM_006712862.2 e XM_009444056.1 fornecem sequências de exemplo adicionais, não limitantes do domínio transmembrana de CD28. As sequências associadas a cada um dos números de acesso listados são incorporadas aqui.
[0094] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimulatória de 4-1BB” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou alternativamente 90% de identidade de sequência, ou alternativamente pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimulatória de 4-1BB como mostrado aqui. As sequências de exemplo da região de sinalização coestimulatória de 4-1BB são fornecidas na Publicação do Pedido de Patente US nº 2013/0266551 A1 (depositado como Pedido US nº 13/826.258). A sequência da região de sinalização coestimulatória de 4- 1BB associada divulgada no Pedido US nº 13/826.258 é divulgada como segue:
[0095] A região de sinalização coestimulatória de 4-1BB: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL, e equivalentes de cada um dos mesmos.
[0096] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimulatória de CD28” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou alternativamente 90% de identidade de sequência ou, alternativamente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimulatória de CD28 mostrada na presente invenção. A região coestimulatória de CD28 compreende um domínio transmembrana e um domínio intracelular. As sequências de exemplo de domínio de sinalização coestimulatória CD28 são fornecidas na Patente US n° 5.686.281; Geiger, T.L. et. al. (2001) Blood 98:2364- 2371; Hombach, A. et. al. (2001) J Immunol. 167:6123-6131; Maher, J. et. al. (2002) Nat Biotechnol. 20:70-75; Haynes, N.M. et. al. (2002) J Immunol. 169:5780-5786; Haynes, N.M. et. al. (2002) Blood 100:3155-
3163. Os exemplos não limitantes incluem os resíduos 114-220 da sequência de CD28 abaixo: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV
AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG
GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS, e equivalentes dos mesmos.
[0097] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimulatória de ICOS” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, 90% de identidade de sequência, com maior preferência, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimulatória de ICOS como mostrado aqui. As sequências de exemplo não limitantes da região de sinalização coestimulatória de ICOS são fornecidas na Publicação US nº 2015/0017141A1 na sequência de polinucleotídeos exemplificadora fornecida abaixo.
[0098] Região de sinalização coestimulatória de ICOS:
[0099] ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGG
TGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCA CAGATGTGACCCTA
[0100] Como usado na presente invenção, o termo “região de sinalização coestimulatória OX40” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente, pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou alternativamente 90% de identidade de sequência, ou alternativamente pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimulatória OX40 como mostrado aqui. As sequências de exemplo não limitantes da região de sinalização coestimulatória de OX40 são divulgadas na Publicação US 2012/20148552A1, e incluem a sequência exemplificadora fornecida abaixo.
[0101] Região de sinalização coestimulatória de OX40:
[0102] AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT
GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC
[0103] Como usado na presente invenção, o termo “domínio de sinalização de CD3 zeta” se refere a um fragmento de proteína específico associado a este nome e a quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, ou alternativamente 90% de identidade de sequência, ou alternativamente pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de domínio de sinalização de CD3 zeta como mostrado aqui. As sequências de exemplo do domínio de sinalização zeta de CD3 são fornecidas no pedido US nº 13/826,258 (publicado como US 2013/0266551). A sequência associada ao domínio de sinalização de CD3 zeta é listada da seguinte forma:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP
RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQALPPR, e equivalentes dos mesmos.
[0104] Como usado na presente invenção, os termos “T2A” e “peptídeo 2A” são usados indistintamente para se referir a qualquer peptídeo 2A ou fragmento do mesmo, qualquer peptídeo semelhante a 2A ou fragmento do mesmo, ou um peptídeo artificial compreendendo os aminoácidos necessários em uma de peptídeos relativamente curta (da ordem de 20 aminoácidos de comprimento, dependendo do vírus de origem) contendo o motivo de polipeptídeo de consenso D-V/I-E-X-N-P- G-P, em que X se refere a qualquer aminoácido geralmente considerado como autoclivável.
[0105] Como usado na presente invenção, o termo “gene suicida” é um gene capaz de induzir a apoptose celular; exemplos não limitantes incluem HSV-TK (timidina quinase do vírus Herpes simplex), citosina desaminase, nitro-redutase, carboxilesterase, citocromo P450 ou PNP (Nucleosídeo fosforilase de purina), EGFR truncado ou caspase induzível (“iCasp”). Os genes suicidas podem funcionar ao longo de uma variedade de vias e, em alguns casos, podem ser induzidos por um agente de indução, como uma pequena molécula. Por exemplo, o gene suicida iCasp compreende a parte de uma proteína caspase operativamente ligada a uma proteína otimizada para se ligar a um agente de indução; a introdução do agente de indução em uma célula que compreende o gene suicida resulta na ativação da caspase e na subsequente apoptose da dita célula.
[0106] Como usado na presente invenção, o termo “mecanismo de troca para controlar a expressão e/ou ativação do CAR” se refere a um domínio extracelular, transmembrana e intracelular, no qual o domínio extracelular compreende um elemento de ligação específico do alvo que compreende um domínio de ligação marcador, ou tag que é específica para uma molécula diferente do antígeno alvo que é expresso na célula alvo ou por uma célula alvo. A especificidade de CAR é fornecida por uma segunda construção que compreende um domínio de ligação de antígeno alvo e um domínio que é reconhecido pelo marcador ou se liga ao marcador, domínio de ligação ou tag no CAR. Ver, por exemplo, WO
2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9.233.125, US 2016/0129109. Desta forma, uma célula T que expressa o CAR pode ser administrada a um sujeito, mas não pode ligar seu antígeno alvo até que a segunda composição compreendendo um domínio de ligação específico seja administrada.
[0107] Como usado na presente invenção, o termo “célula B” se refere a um tipo de linfócito na imunidade humoral do sistema imunológico adaptativo. As células B funcionam principalmente para produzir anticorpos, atuam como células apresentadoras de antígenos, liberam citocinas e desenvolvem células B de memória após ativação por interação com o antígeno. As células B se distinguem de outros linfócitos, como as células T, pela presença de um receptor de células B na superfície celular. As células B podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. Exemplos não limitantes de linhagens de células B comercialmente disponíveis incluem as linhagens AHH-1 (ATCC® CRL-8146™), BC-1 (ATCC® CRL-2230™), BC-2 (ATCC® CRL- 2231™), BC-3 (ATCC® CRL-2277™), CA46 (ATCC® CRL-1648™), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™), DS-1 (ATCC® CRL-11102™), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85™), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), Toledo (ATCC CRL-2631), Pfiffer (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262), JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), e SUP-B15 (ATCC CRL- 1929). Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a linhagens de células derivadas de linfomas anaplásicos e de células grandes, por exemplo, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR- 786, SU-DHL-1, -2, -4, -5,-6,-7,-8,-9,-10 e -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U- 937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; linfomas de Hodgkin, por exemplo, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, SU/RH-HD-l. Fontes exemplificadoras não limitantes para tais linhagens de células comercialmente disponíveis incluem Type Culture Collection, ou ATCC, (/ e o German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/).
[0108] Como usado na presente invenção, o termo “célula T” se refere a um tipo de linfócito que amadurece no timo.
As células T desempenham um papel importante na imunidade mediada por células e se distinguem de outros linfócitos, como as células B, pela presença de um receptor de células T na superfície celular.
As células T podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. “Célula T” inclui todos os tipos de células imunes que expressam CD3, incluindo células T auxiliares (células CD4+), células T citotóxicas (células CD8+), células T assassinas naturais, células T reguladoras (Treg) e células T gama-delta.
Uma “célula citotóxica” inclui células T CD8+, células assassinas naturais (NK) e neutrófilos, cujas células são capazes de mediar as respostas de citotoxicidade.
Exemplos não limitantes de linhagens de células T comercialmente disponíveis incluem as linhagens BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™), linhagem de células T humanas citotóxicas TALL-104 (ATCC # CRL-11386). Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a linhagens de células T maduras, por exemplo, como Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 e T34; e linhagens de células T imaturas, por exemplo, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 a T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL- 107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3 e -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL-1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL- 119); e linhagens de linfoma cutâneo de células T, por exemplo, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB- 162). As linhagens de células de leucemia Null, incluindo, mas não se limitando a REH, NALL-1, KM-3, L92-221, são uma outra fonte comercialmente disponível de células imunes, assim como as linhagens de células derivadas de outras leucemias e linfomas, como K562 eritroleucemia, leucemia monocítica THP-1, linfoma U937, eritroleucemia HEL, leucemia HL60, leucemia HMC-1, leucemia KG-1, mieloma U266. Fontes exemplificadoras não limitantes para tais linhagens de células comercialmente disponíveis incluem Type Culture Collection, ou ATCC, (http://www.atcc.org/) e o German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/).
[0109] Como usado na presente invenção, o termo “célula NK”, também conhecido como célula assassina natural, se refere a um tipo de linfócito que se origina na medula óssea e desempenha um papel crítico no sistema imunológico inato. As células NK fornecem respostas imunológicas rápidas contra células infectadas por vírus, células de tumor ou outras células estressadas, mesmo na ausência de anticorpos e complexo de histocompatibilidade principal nas superfícies celulares. As células NK podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. Exemplos não limitantes de linhagens de células NK comerciais incluem as linhagens NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™). Outros exemplos incluem, mas não estão limitados às linhagens NK HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, e YT. Fontes exemplificadoras não limitantes para tais linhagens de células comercialmente disponíveis incluem Type Culture Collection, ou ATCC, (http://www.atcc.org/) e o German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/).
[0110] Como usado na presente invenção, o termo “CRISPR” se refere a uma técnica de manipulação genética específica de sequência que se baseia na via de repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas e agrupadas. CRISPR pode ser usado para realizar edição de genes e/ou regulação de genes, bem como simplesmente direcionar proteínas para uma localização genômica específica. “Edição de genes” se refere a um tipo de engenharia genética em que a sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo alvo é alterada através da introdução de deleções, inserções, quebras de fita simples ou dupla, ou substituições de bases na sequência de polinucleotídeos. Em alguns aspectos, a edição de genes mediada por CRISPR utiliza as vias de união de extremidade não homóloga (NHEJ) ou recombinação homóloga para realizar as edições. A regulação gênica se refere a aumentar ou diminuir a produção de produtos gênicos específicos, como proteínas ou RNA.
[0111] O termo “gRNA” ou “RNA guia”, como usado na presente invenção, se refere às sequências de RNA guia usadas para direcionar sequências de polinucleotídeos específicos para edição de genes empregando a técnica de CRISPR. As técnicas de concepção de gRNAs e polinucleotídeos terapêuticos doadores para a especificidade do alvo são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, Doench, J., et. al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et. al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38, and Graham, D., et. al. Genome Biol. 2015; 16: 260. O gRNA compreende ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em um polinucleotídeo de fusão compreendendo CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA de transativação trans (tracrRNA); ou um polinucleotídeo compreendendo CRISPR RNA (crRNA) e CRIPSPR RNA de transativação (tracrRNA). Em alguns aspectos, um gRNA é sintético (Kelley, M. et. al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83).
[0112] O termo “Cas9” se refere a uma endonuclease associada a CRISPR referida por este nome. Cas9s exemplificadoras não limitantes incluem Cas9 de Staphylococcus aureus, Cas9 de nuclease morta e ortólogos e equivalentes biológicos de cada um dos mesmos. Os ortólogos incluem, mas não estão limitados a Cas9 de Streptococcus pyogenes (“spCas9”), Cas 9 de Streptococcus thermophiles, Legionella pneumophilia, Neisseria lactamica, Neisseria meningitides, Francisella novicida; e Cpf1 (que executa funções de corte análogas a Cas9) de várias espécies bacterianas, incluindo Acidaminococcus spp. e Francisella novicida U112.
[0113] Como usado na presente invenção, os termos “sequência de ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados indistintamente para se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não está limitado a, DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina ou outras bases naturais, químicas ou bases de nucleotídeos bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas.
[0114] O termo “codifica” conforme aplicado a sequências de ácidos nucleicos se refere a um polinucleotídeo que é dito “codificar” um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. A cadeia antissentido é o complemento de um tal ácido nucleico, e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir da mesma.
[0115] Como usado na presente invenção, o termo peptídeo sinal ou polipeptídeo sinal significa uma sequência de aminoácidos geralmente presente na extremidade N-terminal de polipeptídeos ou proteínas secretoras ou de membrana recentemente sintetizados. Ele atua para direcionar o polipeptídeo através ou para dentro de uma membrana celular e é então subsequentemente removido. Exemplos de tais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos são aqueles descritos nas Patentes US nºs. 8.853.381 e 5.958.736.
[0116] Como usado na presente invenção, o termo “vetor” se refere a uma construção de ácido nucleico destinada à transferência entre diferentes hospedeiros, incluindo, mas não se limitando a um plasmídeo, um vírus, um cosmídeo, um fago, um BAC, um YAC, etc. Um “vetor viral” é definido como um vírus ou partícula viral produzido de forma recombinante que compreende um polinucleotídeo a ser aplicado em uma célula hospedeira, seja in vivo, ex vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, os vetores de plasmídeo podem ser preparados a partir de vetores disponíveis comercialmente. Em outras modalidades, os vetores virais podem ser produzidos a partir de baculovírus, retrovírus, adenovírus, AAVs, etc. de acordo com técnicas conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o vetor viral é um vetor lentiviral. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores de adenovírus, vetores de vírus adenoassociados, vetores de alfavírus e semelhantes. Os vetores com base no vírus do mosaico infeccioso do tabaco (TMV - “tobacco mosaic virus”) podem ser usados para fabricar proteínas e foi relatado que expressam Griffithsin em folhas de tabaco (O’Keefe et. al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104). Os vetores Alfavírus, como os vetores com base no vírus Semliki Forest e os vetores com base no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso em terapia genética e imunoterapia. Ver, Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 and Ying et. al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827. Em aspectos em que a transferência de genes é mediada por um vetor retroviral, uma construção de vetor se refere ao polinucleotídeo que compreende o genoma retroviral ou parte do mesmo, e um gene de interesse, como um polinucleotídeo que codifica um CAR. Detalhes adicionais quanto aos métodos modernos de vetores para uso na transferência de genes podem ser encontrados, por exemplo, em Kotterman et. al. (2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17. Os vetores que contêm um promotor e um local de clonagem no qual um polinucleotídeo pode ser operativamente ligado são bem conhecidos na técnica. Esses vetores são capazes de transcrever RNA in vitro ou in vivo e estão comercialmente disponíveis em fontes como Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.) e Promega Biotech (Madison, Wis.).
[0117] Como usado na presente invenção, o termo “célula isolada” geralmente se refere a uma célula que é substancialmente separada de outras células de um tecido. O termo inclui células procarióticas e eucarióticas.
[0118] “Células imunológicas” inclui, por exemplo, glóbulos brancos (leucócitos) que são derivados de células-tronco hematopoéticas (HSC - “hematopoietic stem cells”) produzidas na medula óssea, linfócitos (células T, células B, células assassinas naturais (NK - “natural killer”)) e células derivadas de mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas). “Célula T” inclui todos os tipos de células imunes que expressam CD3, incluindo células T auxiliares (células CD4+), células T citotóxicas (células CD8+), células T assassinas naturais, células T reguladoras (Treg) e células T gama-delta. Uma “célula citotóxica” inclui células T CD8+, células assassinas naturais (NK) e neutrófilos, cujas células são capazes de mediar as respostas de citotoxicidade.
[0119] Como usado na presente invenção, a frase “resposta imune” ou seu equivalente “resposta imunológica” se refere ao desenvolvimento de uma resposta mediada por células (por exemplo, mediada por células T específicas para antígenos ou seus produtos de secreção). Uma resposta imune celular é induzida pela apresentação de epítopos de polipeptídeos em associação com moléculas MHC de Classe I ou Classe II, para tratar ou prevenir uma infecção viral, expandir células B-reg específicas do antígeno, TC1, células T auxiliares CD4+ e/ou células T citotóxicas CD8+ e/ou células T autorreguladoras e células de “memória” de células B de doenças geradas. A resposta também pode envolver a ativação de outros componentes. Em alguns aspectos, o termo “resposta imune” pode ser usado para abranger a formação de uma rede reguladora de células imunes. Assim, o termo “formação de rede reguladora” pode se referir a uma resposta imune desencadeada de modo que uma célula imune, de preferência uma célula T, com maior preferência uma célula T reguladora, desencadeie uma diferenciação adicional de outras células imunes, como, mas não se limitando a, células B ou células apresentadoras de antígeno - exemplos não limitantes das quais incluem células dendríticas, monócitos e macrófagos. Em certas modalidades, a formação da rede reguladora envolve células B sendo diferenciadas em células B reguladoras; em certas modalidades, a formação da rede reguladora envolve a formação de células apresentadoras de antígeno tolerogênicas.
[0120] O termo “transduzir” ou “transdução” conforme aplicado à produção de células receptoras de antígeno quimérico se refere ao processo pelo qual uma sequência de nucleotídeos estranha é introduzida em uma célula. Em algumas modalidades, esta transdução é feita por meio de um vetor.
[0121] Como usado na presente invenção, o termo “autólogo”, em referência a células, se refere a células que são isoladas e infundidas de volta no mesmo sujeito (receptor ou hospedeiro). “Alogênico” se refere a células não autólogas.
[0122] Uma “quantidade efetiva” ou “quantidade eficaz” se refere à quantidade de um agente (por exemplo, uma célula HLA-DR CAR), ou quantidades combinadas de dois ou mais agentes, que, quando administrada para o tratamento de um mamífero ou outro sujeito, é suficiente para efetuar tal tratamento para a doença. A “quantidade eficaz” irá variar dependendo do(s) agente(s), da doença e sua gravidade e da idade, peso, etc., do sujeito em tratamento.
[0123] Como usado na presente invenção, um “câncer” é um estado de doença caracterizado pela presença em um sujeito de células que demonstram replicação descontrolada anormal e, pode ser usado de indistintamente com o termo “tumor”.
[0124] Um “tumor sólido” é uma massa de tecido anormal que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados de acordo com o tipo de células que os formam. Exemplos de tumores sólidos incluem sarcomas, carcinomas e linfomas.
[0125] O termo “linfoma de células B ou leucemia” se refere a um tipo de câncer que se forma em problemas do sistema linfático ou da medula óssea e sofreu uma transformação maligna que torna as células dentro do câncer patológicas para o organismo hospedeiro com a capacidade de invadir ou se espalhar para outras partes do corpo.
[0126] Como usado na presente invenção, o termo “compreendendo” se destina a significar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, mas não excluem outros. “Consistindo essencialmente em” quando usado para definir composições e métodos, deve significar a exclusão de outros elementos de qualquer significado essencial para a combinação para o uso pretendido. Por exemplo, uma composição que consiste essencialmente nos elementos conforme definido na presente invenção não excluiria traços de contaminantes do método de isolamento e purificação e veículos farmaceuticamente aceitáveis, como solução salina tamponada com fosfato, conservantes e semelhantes. “Consistindo em” deve significar a exclusão de mais do que elementos traços de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administrar as composições aqui divulgadas. Os aspectos definidos por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo da presente divulgação.
[0127] Como usado na presente invenção, o termo “marcador detectável” se refere a pelo menos um marcador capaz de, direta ou indiretamente, produzir um sinal detectável. Uma lista não exaustiva deste marcador inclui enzimas que produzem um sinal detectável, por exemplo, por colorimetria, fluorescência, luminescência, como peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose-6- fosfato desidrogenase, cromóforos como corantes fluorescentes, luminescentes, grupos com densidade eletrônica detectada por microscopia eletrônica ou por sua propriedade elétrica, como condutividade, amperometria, voltametria, impedância, grupos detectáveis, por exemplo, cujas moléculas são de tamanho suficiente para induzir modificações detectáveis em suas propriedades físicas e/ou químicas, tal a detecção pode ser realizada por métodos ópticos, como difração, ressonância de plásmons de superfície, variação de superfície, a alteração do ângulo de contato ou métodos físicos, como espectroscopia de força atômica, efeito de túnel ou moléculas radioativas, como 32P, 35S ou 125I.
[0128] Como usado na presente invenção, o termo “marcador de purificação” se refere a pelo menos um marcador útil para purificação ou identificação. Uma lista não exaustiva deste marcador inclui His, lacZ, GST, proteína de ligação à maltose, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, cherry, tioredoxina, poli(NANP), V5, Snap, HA, proteína de ligação à quitina, Softag 1, Softag 3, Strep ou proteína S. O marcador de fluorescência direto ou indireto adequado compreende FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, cherry, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, Biotina, Digoxigenina, Tamra, Texas Red, rodamina, fluores Alexa, FITC, TRITC ou qualquer outro corante fluorescente ou hapteno.
[0129] Como usado na presente invenção, o termo “expressão” se refere ao processo pelo qual os polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir o splicing do mRNA em uma célula eucariótica. O nível de expressão de um gene pode ser determinado medindo a quantidade de mRNA ou proteína em uma amostra de célula ou tecido. Em um aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado ao nível de expressão desse gene de uma amostra de controle ou de referência. Em outro aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado ao nível de expressão desse gene da mesma amostra após a administração de um composto.
[0130] Como usado na presente invenção, “homologia” ou “idêntico”, porcentagem de “identidade” ou “similaridade”, quando usado no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, por exemplo, pelo menos 60% de identidade, de preferência, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou identidade maior sobre uma região especificada (por exemplo, sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo descrito na presente invenção ou sequência de aminoácidos de um anticorpo descrito na presente invenção). A homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para efeitos de comparação.
Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nessa posição.
Um grau de homologia entre as sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências.
O alinhamento e a porcentagem de homologia ou de identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et all, eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrão são usados para alinhamento.
Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão.
Em particular, os programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; espectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções CDS do GenBank + SwissProtein + SPupdate + PIR.
Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
Os termos “homologia” ou “idêntico”, “porcentagem de identidade” ou “similaridade” também se referem a, ou podem ser aplicados a, o complemento de uma sequência de teste.
Os termos também incluem sequências que possuem deleções e/ou adições, bem como aquelas que possuem substituições.
Conforme descrito na presente invenção, os algoritmos preferidos podem ser responsáveis por lacunas e semelhantes.
De preferência, a identidade existe sobre uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou com maior preferência sobre uma região que tem pelo menos 50 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento.
Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos de 40% de identidade ou, alternativamente, menos de 25% de identidade, com uma das sequências aqui divulgadas.
[0131] A frase “primeira linha” ou “segunda linha” ou “terceira linha” se refere à ordem de tratamento recebida por um paciente. Os regimes de terapia de primeira linha são tratamentos administrados em primeiro lugar, enquanto a terapia de segunda ou de terceira linha é administrada após a terapia de primeira linha ou após a terapia de segunda linha, respectivamente. O National Cancer Institute define a terapia de primeira linha como “o primeiro tratamento para uma doença ou condição”. Em pacientes com câncer, o tratamento primário pode ser cirurgia, quimioterapia, radioterapia ou uma combinação dessas terapias. A terapia de primeira linha também é referida aos versados na técnica como “terapia primária e tratamento primário”. Consulte o site do National Cancer Institute em www.cancer.gov, visitado pela última vez em 01 de maio de 2008. Normalmente, um paciente recebe um regime de quimioterapia subsequente porque o paciente não apresentou uma resposta clínica ou subclínica positiva à terapia de primeira linha ou a terapia de primeira linha foi interrompida.
[0132] Em um aspecto, o termo “equivalente” ou “equivalente biológico” de um anticorpo significa a capacidade do anticorpo de se ligar seletivamente à sua proteína epítopo ou fragmento da mesma, conforme medido por ELISA ou outros métodos adequados. Anticorpos biologicamente equivalentes incluem, mas sem limitação, aqueles anticorpos, peptídeos, fragmentos de anticorpos, variantes de anticorpos, derivados de anticorpos e miméticos de anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência.
[0133] Deve ser inferido sem recitação explícita e a menos que de outra forma pretendido, que quando a presente divulgação se refere a um polipeptídeo, proteína, polinucleotídeo, anticorpo ou fragmento dos mesmos, um equivalente ou equivalente biologicamente de tal é pretendido dentro do escopo da presente tecnologia. Como usado na presente invenção, o termo “equivalente biológico do mesmo” se destina a ser sinônimo de “equivalente do mesmo” quando se refere a uma proteína, anticorpo de referência ou fragmento dos mesmos, polipeptídeo ou ácido nucleico, se destina àqueles com homologia mínima, embora ainda mantendo a estrutura ou funcionalidade pretendida. A menos que especificamente recitado aqui, está contemplado que qualquer um dos mencionados acima também inclui equivalentes dos mesmos. Por exemplo, um equivalente pretende pelo menos cerca de 70% de homologia ou identidade, ou pelo menos 80% de homologia ou identidade e, alternativamente, ou pelo menos cerca de 85%, ou alternativamente, pelo menos cerca de 90%, ou alternativamente pelo menos cerca de 95%, ou alternativamente pelo menos 98% de homologia ou identidade e/ou exibe atividade biológica substancialmente equivalente à proteína, polipeptídeo, anticorpo de referência ou fragmento dos mesmos ou ácido nucleico de referência. Alternativamente, quando se refere a polinucleotídeos, um equivalente dos mesmos é um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo de referência ou seu complemento.
[0134] A frase “polipeptídeo equivalente” ou “fragmento de peptídeo equivalente” se refere à proteína, polinucleotídeo ou fragmento de peptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo exemplificado ou seu complemento do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo exemplificado, sob alto rigor e/ou que exibem atividade biológica semelhante in vivo, por exemplo, aproximadamente 100%, ou alternativamente, acima de 90% ou alternativamente acima de 85% ou alternativamente acima de 70%, em comparação com a atividade biológica padrão ou de controle. Modalidades adicionais dentro do escopo da presente divulgação são identificadas por ter mais de 60%, ou alternativamente, mais de 65%, ou alternativamente, mais de 70%, ou alternativamente, mais de 75%, ou alternativamente, mais de 80%, ou alternativamente, mais de 85%, ou alternativamente, mais de 90%, ou alternativamente, mais de 95%, ou alternativamente mais de 97%, ou alternativamente, mais de 98% ou 99% de homologia de sequência. A homologia percentual pode ser determinada por comparação de sequência usando programas como o BLAST executado em condições apropriadas. Em um aspecto, o programa é executado sob os parâmetros padrão.
[0135] Um polinucleotídeo ou região de polinucleotídeo (ou um polipeptídeo ou região de polipeptídeo) tendo uma certa porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de “identidade de sequência” com outra sequência significa que, quando alinhada, essa porcentagem de bases (ou aminoácidos) é a mesma em comparação com as duas sequências. O alinhamento e a porcentagem de homologia ou de identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et all, eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrão são usados para alinhamento. Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão. Em particular, os programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; espectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções CDS do GenBank + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
[0136] “Hibridização” se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligações de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson-Crick, ligação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira específica de sequência. O complexo pode compreender duas fitas formando uma estrutura de duplexo, três ou mais fitas formando um complexo de fitas múltiplas, uma única fita auto-hibridizante ou qualquer combinação destas. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa de um processo mais extenso, como o início de uma reação de PCR ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma ribozima.
[0137] Exemplos de condições de hibridização rigorosas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 25 °C a cerca de 37 °C; concentrações de tampão de hibridização de cerca de 6x SSC a cerca de 10x SSC; concentrações de formamida de cerca de 0% a cerca de 25%; e soluções de lavagem de cerca de 4x SSC a cerca de 8x SSC. Exemplos de condições de hibridização moderadas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 40 °C a cerca de 50 °C; concentrações de tampão de cerca de 9x SSC a cerca de 2x SSC; concentrações de formamida de cerca de 30% a cerca de 50%; e soluções de lavagem de cerca de 5x SSC a cerca de 2x SSC. Exemplos de condições rigorosas elevadas incluem: temperaturas de incubação de cerca de 55 °C a cerca de 68 °C; concentrações de tampão de cerca de 1x SSC a cerca de 0,1x SSC; concentrações de formamida de cerca de 55% a cerca de 75%; e soluções de lavagem de cerca de 1x SSC, 0,1x SSC ou água desionizada. Em geral, os tempos de incubação de hibridação são de 5 minutos a 24 horas, com 1, 2 ou mais etapas de lavagem, e os tempos de incubação de lavagem são de cerca de 1, 2 ou 15 minutos. SSC é NaCl 0,15 M e tampão de citrato 15 mM. Entende-se que equivalentes de SSC usando outros sistemas tampão podem ser empregados.
[0138] Uma “célula normal correspondente ao tipo de tecido tumoral” se refere a uma célula normal de um mesmo tipo de tecido que o tecido tumoral. Um exemplo não limitante é uma célula pulmonar normal de um paciente com tumor no pulmão ou uma célula normal do cólon de um paciente com tumor no cólon.
[0139] O termo “isolado”, como usado na presente invenção, se refere a moléculas ou materiais biológicos ou celulares sendo substancialmente isentos de outros materiais. Em um aspecto, o termo
“isolado” se refere a ácido nucleico, como DNA ou RNA, ou proteína ou polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou derivado do mesmo), ou célula ou organelo celular, ou tecido ou órgão, separado de outros DNAs ou RNAs, ou proteínas ou polipeptídeos, ou células ou organelas celulares, ou tecidos ou órgãos, respectivamente, que estão presentes na fonte natural. O termo “isolado” também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente. Além disso, um “ácido nucleico isolado” se destina a incluir fragmentos de ácido nucleico que não ocorrem naturalmente como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado” também é usado na presente invenção para se referir a polipeptídeos que são isolados de outras proteínas celulares e se destina a abranger polipeptídeos purificados e recombinantes. O termo “isolado” também é usado na presente invenção para se referir a células ou tecidos que são isolados de outras células ou tecidos e se destina a abranger células ou tecidos cultivados e manipulados.
[0140] Como usado na presente invenção, o termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo produzido por um único clone de linfócitos B ou por uma célula na qual os genes da cadeia leve e pesada de um único anticorpo foram transfectados. Os anticorpos monoclonais são produzidos por métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, produzindo células híbridas formadoras de anticorpos a partir de uma fusão de células de mieloma com células do baço imunológico. Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos monoclonais humanizados.
[0141] Os termos “proteína”, “peptídeo” e “polipeptídeo” são usados indistintamente e em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de duas ou mais subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que podem compreender uma sequência de proteína ou de peptídeo. Como usado na presente invenção, o termo “aminoácido” se refere a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D e L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
[0142] Os termos “polinucleotídeo” e “oligonucleotídeo” são usados indistintamente e se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e pode desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes não são exemplos limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, primer, EST ou SAGE tag), exons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, RNAi, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e primers. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presente, as modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes de não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. O termo também se refere a moléculas de fita simples- ou dupla-. A menos que especificado ou exigido de outra forma, qualquer aspecto desta tecnologia que seja um polinucleotídeo abrange tanto a forma de fita dupla- como cada uma das duas formas de fita simples- complementares conhecidas ou previstas para compor a forma de fita dupla-.
[0143] Como usado na presente invenção, o termo “purificado” não requer pureza absoluta; em vez disso, é um termo relativo. Assim, por exemplo, um ácido nucleico purificado, peptídeo, proteína, complexos biológicos ou outro composto ativo é aquele que é isolado no todo ou em parte de proteínas ou outros contaminantes. Geralmente, os peptídeos, proteínas, complexos biológicos ou outros compostos ativos substancialmente purificados para uso na divulgação compreendem mais de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes em uma preparação antes da mistura ou formulação do peptídeo, proteína, complexo biológico ou outro composto ativo com um veículo farmacêutico, excipiente, tampão, agente de intensificação da absorção, estabilizante, conservante, adjuvante ou outro coingrediente farmacêutico em uma formulação farmacêutica completa para administração terapêutica. Mais tipicamente, o peptídeo, proteína, complexo biológico ou outro composto ativo é purificado para representar mais de 90%, muitas vezes mais de 95% de todas as espécies macromoleculares presentes em uma preparação purificada antes da mistura com outros ingredientes de formulação. Em outros casos, a preparação purificada pode ser essencialmente homogênea, em que outras espécies macromoleculares não são detectáveis por técnicas convencionais.
[0144] Como usado na presente invenção, o termo “ligação específica” significa o contato entre um anticorpo e um antígeno com uma afinidade de ligação de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, os anticorpos se ligam com afinidades de pelo menos cerca de 10-7 M, e de preferência 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M ou 10-12 M.
[0145] Como usado na presente invenção, o termo “proteína recombinante” se refere a um polipeptídeo que é produzido por técnicas de DNA recombinante, em que geralmente, o DNA que codifica o polipeptídeo é inserido em um vetor de expressão adequado que por sua vez é usado para transformar uma célula hospedeira para produzir a proteína heteróloga.
[0146] Como usado na presente invenção, “tratar” ou “tratamento” de uma doença em um sujeito se refere a (1) prevenir que os sintomas ou doença ocorram em um sujeito que está predisposto ou ainda não apresenta sintomas da doença; (2) inibir a doença ou interromper seu desenvolvimento; ou (3) melhorar ou causar regressão da doença ou dos sintomas da doença. Conforme entendido na técnica, “tratamento” é uma abordagem para obter resultados benéficos ou pretendidos, incluindo resultados clínicos. Para os fins da presente tecnologia, os resultados benéficos ou pretendidos podem incluir um ou mais, mas não estão limitados a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estado estabilizado (ou seja, sem agravamento) de uma condição (incluindo doença), atraso ou desaceleração da condição (incluindo doença), progressão, melhoria ou paliação da condição (incluindo doença), estados e remissão (seja parcial ou total), sejam detectáveis ou indetectáveis. Quando a doença é câncer, os seguintes desfechos clínicos são exemplos não limitantes de tratamento: redução na carga do tumor, desaceleração do crescimento do tumor, sobrevida global mais longa, tempo mais longo para a progressão do tumor, inibição da metástase ou redução da metástase do tumor. Em um aspecto, o tratamento exclui a profilaxia.
[0147] Como usado na presente invenção, o termo “superexpressa” em relação a uma célula, um tecido ou um órgão expressa uma proteína em uma quantidade que é maior que a quantidade que é produzida em uma célula de controle, uma questão de controle ou um órgão. Uma proteína que é superexpressa pode ser endógena para a célula hospedeira ou exógena para a célula hospedeira.
[0148] Como usado na presente invenção, o termo “sequência de ligante” se refere a qualquer sequência de aminoácidos que compreende 1 a 10, ou alternativamente, 8 aminoácidos ou, alternativamente, 6 aminoácidos ou, alternativamente, 5 aminoácidos que podem ser repetidos de 1 a 10, ou alternativamente a cerca de 8, ou alternativamente a cerca de 6, ou alternativamente cerca de 5 ou 4 ou alternativamente 3 ou, alternativamente, 2 vezes. Por exemplo, o ligante pode compreender até 15 resíduos de aminoácidos consistindo em um pentapeptídeo repetido três vezes. Exemplos não limitantes de sequências de ligante são conhecidos na técnica, por exemplo, GGGGSGGGGSGGGG (e equivalentes dos mesmos); o tripeptídeo EFM; ou Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met e equivalentes de cada um dos mesmos. Em um aspecto, a sequência de ligante é um ligante de polipeptídeo flexível (Glicine4Serina)3 que compreende três cópias de gly-gly-gly-gly-ser e equivalentes dos mesmos.
[0149] Como usado na presente invenção, o termo “potencializador”, como usado na presente invenção, denota elementos de sequência que aumentam, aprimoram ou melhoram a transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos independentemente da sua localização e orientação em relação à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Um potencializador pode potencializar a transcrição de um único promotor ou simultaneamente de mais de um promotor. Contanto que esta funcionalidade de aprimorar a transcrição seja retida ou substancialmente retida (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade de tipo selvagem, ou seja, a atividade de uma sequência de comprimento completo), quaisquer variantes truncadas, mutadas ou de outra forma modificadas de uma sequência potencializadora de tipo selvagem também estão dentro da definição acima.
[0150] O termo “promotor”, como usado na presente invenção, se refere a qualquer sequência que regula a expressão de uma sequência de codificação, como um gene. Os promotores podem ser constitutivos, indutíveis, reprimíveis ou específicos do tecido, por exemplo. Um “promotor” é uma sequência de controle que é uma região de uma sequência de polinucleotídeos na qual a iniciação e a taxa de transcrição são controladas. Ele pode conter elementos genéticos nos quais as proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como a RNA polimerase e outros fatores de transcrição.
[0151] Como usado na presente invenção, o termo “WPRE” ou “Elemento Regulador Pós-transcricional do Vírus da Hepatite da Marmota (WHP - “Woodchuck Hepatitis Virus”)” se refere a um fragmento de nucleotídeo específico associado a este nome e a quaisquer outras moléculas que tenham função biológica análoga que compartilhe pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, 90% de identidade de sequência, com maior preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de WPRE como mostrado na presente invenção. Por exemplo, WPRE se refere a uma região semelhante ao elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite B humano (HBVPRE - “hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element”) presente na sequência genômica do vírus da hepatite da marmota (nº. de Acesso GenBank J04514), e que os 592 nucleotídeos da posição 1093 a 1684 desta sequência genômica corresponde à região reguladora pós- transcricional (Donello, J.E. et. al. (1998) Journal of Virology 72:5085- 5092). A análise usando vetores retrovirais revelou que o WPRE inserido na região não traduzida do terminal 3’ de um gene de interesse aumenta a quantidade de proteína produzida em 5 a 8 vezes. Também foi relatado que a introdução de WPRE suprime a degradação do mRNA (Zufferey, R. et. al. (1999) Journal of Virology 73:2886-2892). Em um sentido amplo, elementos como WPRE que aumentam a eficiência da tradução de aminoácidos por meio da estabilização de mRNAs também são considerados potencializadores.
[0152] O termo “contato” significa ligação direta ou indireta ou interação entre dois ou mais. Um exemplo particular de interação direta é a ligação. Um exemplo particular de uma interação indireta é quando uma entidade atua sobre uma molécula intermediária, que por sua vez atua sobre a segunda entidade referenciada. O contato, como usado na presente invenção, inclui em solução, em fase sólida, in vitro, ex vivo, em uma célula e in vivo. O contato in vivo pode ser referido como administrando ou administração.
[0153] O termo “introduzir” aplicado a métodos de produção de células modificadas, como células receptoras de antígeno quiméricas, se refere ao processo pelo qual um agente estranho (ou seja, extrínseco ou extracelular) é introduzido em uma célula hospedeira, produzindo, assim, uma célula que compreende o agente estranho. Os métodos de introdução de ácidos nucleicos incluem, mas não estão limitados a transdução, transferência de gene retroviral, transfecção, eletroporação, transformação, infecção viral e outras técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a transdução é feita por meio de um vetor (por exemplo, um vetor viral). Em algumas modalidades, a transfecção é feita por meio de um veículo químico, complexo de DNA/lipossoma ou micela (por exemplo, Lipofectamina (Invitrogen)). Em algumas modalidades, a infecção viral é feita através da infecção das células com uma partícula viral compreendendo o polinucleotídeo de interesse (por exemplo, AAV). Em algumas modalidades, a introdução compreende adicionalmente edição de genes mediada por CRISPR ou edição de genes mediada por nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição (TALEN). Métodos de introdução de agentes estranhos de ácidos não nucleicos (por exemplo, fatores solúveis, citocinas, proteínas, peptídeos, enzimas, fatores de crescimento, moléculas de sinalização, inibidores de moléculas pequenas) incluem, mas não estão limitados a cultura das células na presença do agente estranho, contato das células com o agente, contato das células com uma composição que compreende o agente e um excipiente, e contato das células com vesículas ou partículas virais que compreendem o agente.
[0154] O termo “cultivo” se refere ao cultivo de células em um meio de cultura sob condições que favorecem a expansão e proliferação da célula. O termo “meio de cultura” ou “meio” é reconhecido na técnica e se refere geralmente a qualquer substância ou preparação usada para o cultivo de células vivas. O termo “meio”, conforme usado em referência a uma cultura de células, inclui os componentes do ambiente que circunda as células. Os meios podem ser sólidos, líquidos, gasosos ou uma mistura de fases e materiais.
Os meios incluem meios de crescimento líquidos, bem como meios líquidos que não sustentam o crescimento celular.
Os meios também incluem meios gelatinosos, como ágar, agarose, gelatina e matrizes de colágeno.
Meios gasosos exemplificadores incluem a fase gasosa à qual as células que crescem em uma placa de Petri ou outro suporte sólido ou semissólido são expostas.
O termo “meio” também se refere ao material que se destina ao uso em uma cultura de células, mesmo que ainda não tenha sido contatado com as células.
Em outras palavras, um líquido rico em nutrientes preparado para cultura é um meio.
Da mesma forma, uma mistura de pó que quando misturada com água ou outro líquido se torna adequada para cultura de células pode ser denominada um “meio em pó”. “Meio definido” se refere a meios que são feitos de componentes quimicamente definidos (geralmente purificados). “Meios definidos” não contêm extratos biológicos mal caracterizados, como extrato de levedura e caldo de carne. “Meio rico” inclui meios que são projetados para apoiar o crescimento da maioria ou de todas as formas viáveis de uma espécie em particular.
O meio rico geralmente inclui extratos biológicos complexos.
Um “meio adequado para o crescimento de uma cultura de alta densidade” é qualquer meio que permite que uma cultura de células atinja uma OD600 de 3 ou maior quando outras condições (como temperatura e taxa de transferência de oxigênio) permitem tal crescimento.
O termo “meio basal” se refere a um meio que promove o crescimento de muitos tipos de microrganismos que não requerem suplementos nutricionais especiais.
A maioria dos meios basais geralmente compreende quatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carboidratos, sais inorgânicos e vitaminas.
Um meio basal geralmente serve como base para um meio mais complexo, ao qual são adicionados suplementos como soro, tampões, fatores de crescimento, lipídeos e semelhantes.
Em um aspecto, o meio de crescimento pode ser um meio complexo com os fatores de crescimento necessários para suportar o crescimento e a expansão das células da divulgação, enquanto mantém sua capacidade de autorrenovação.
Exemplos de meios basais incluem, mas sem limitação, meio basal de Eagles, meio essencial mínimo, meio de Eagle modificado por Dulbecco, meio 199, misturas de nutrientes Ham’s F-10 e Ham’s F-12, McCoy’s 5A, MEM da Dulbecco/F- I 2, RPMI 1640 e meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM).
[0155] Como usado na presente invenção, “uma população de células” significa uma coleção de mais de uma célula que é idêntica (clonal) ou não idêntica em fenótipo e/ou genótipo.
[0156] Como usado na presente invenção, a população de células “substancialmente homogênea” é uma população com pelo menos 70%, ou alternativamente pelo menos 75%, ou alternativamente pelo menos 80%, ou alternativamente pelo menos 85%, ou alternativamente pelo menos 90%, ou alternativamente pelo menos 95% ou, alternativamente, pelo menos 98% de fenótipo idêntico, conforme medido por marcadores pré-selecionados, traços fenotípicos ou genômicos. Em um aspecto, a população é uma população clonal.
[0157] Como usado na presente invenção, a população “heterogênea” de células é uma população com até 69%, ou alternativamente até 60%, ou alternativamente até 50%, ou alternativamente até 40%, ou alternativamente até 30%, ou alternativamente até a 20%, ou alternativamente até 10%, ou alternativamente até 5%, ou alternativamente até 4%, ou alternativamente até 3%, ou alternativamente até 2%, ou alternativamente até 61%, ou alternativamente até 0,5% de fenótipo idêntico, conforme medido por marcadores pré-selecionados, traços fenotípicos ou genômicos.
[0158] “Crioprotetores” são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, por exemplo, sacarose, trealose e glicerol. Um crioprotetor exibindo baixa toxicidade em sistemas biológicos é geralmente usado.
[0159] Lista de Abreviações CAR: receptor de antígeno quimérico
HLA: antígeno de linfócitos de histocompatibilidade Ip: intraperitoneal IRES: sítio de entrada ribossômica interna MFI: intensidade média de fluorescência MOI: multiplicidade de infecção PBMC: células mononucleares de sangue periférico PBS: solução salina tamponada com fosfato scFv: fragmento variável de cadeia única WPRE: elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota
MODO PARA REALIZAÇÃO DA DIVULGAÇÃO
[0160] As células T CAR são células T autólogas geneticamente modificadas nas quais fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFv) ou ligantes são anexados ao domínio de sinalização de células T capazes de facilitar a ativação de células T (Maher, J. (2012) ISRN Oncol. 2012:278093; Curran, K.J. et. al. (2012) J. Gene Med. 14:405-415; Fedorov, V.D. et. al. (2014) Cancer J. 20:160-165; Barrett, D.M. et. al. (2014) Annu. Rev. Med. 65:333-347). Os CARs combinam a especificidade de alvo independente de HLA de um anticorpo monoclonal com a atividade citolítica e propriedades de homing de células T ativadas. Essas propriedades permitem o reconhecimento de células-alvo com expressão reduzida de HLA ou vias de processamento de antígeno infrarreguladas, dois métodos comuns que os tumores empregam para evitar a resposta imune do hospedeiro (Jakobsen, M.K. et. al. (1995) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 17:222-228; Lou, Y. et. al.
(2008) Clin. Cancer Res. 14:1494–1501; Singh, R. et. al. (2007) Cancer Res. 67:1887–1892). As células T modificadas por CAR têm se mostrado uma grande promessa em ambientes pré-clínicos e clínicos como novas terapêuticas em várias doenças, incluindo câncer.
[0161] Esta divulgação fornece anticorpos específicos para Lym1 e Lym2 e métodos e composições relacionados ao uso e produção dos mesmos. Além disso, a presente divulgação fornece células como receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio de ligação de antígeno específico para Lym1, Lym2 ou CD19, que em algum aspecto é o domínio de ligação de antígeno do anticorpo da presente divulgação e métodos e composições relacionados ao uso e produção dos mesmos.
[0162] Consistente com esses princípios e descobertas, esta divulgação fornece as seguintes modalidades.
Anticorpos e Fragmentos dos Mesmos
[0163] A estrutura geral dos anticorpos é conhecida na técnica e será apenas brevemente resumida na presente invenção. Um monômero de imunoglobulina compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves conectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é emparelhada com uma das cadeias leves às quais está diretamente ligada por meio de uma ligação de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região constante (que varia dependendo do isótipo de anticorpo) e uma região variável. A região variável compreende três regiões hipervariáveis (ou regiões determinantes de complementaridade) que são designadas CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e que são suportadas dentro de regiões de estrutura. Cada cadeia leve compreende uma região constante e uma região variável, com a região variável compreendendo três regiões hipervariáveis (designadas CDRL1, CDRL2 e CDRL3) suportadas por regiões de estrutura de uma maneira análoga à região variável da cadeia pesada.
[0164] As regiões hipervariáveis de cada par de cadeias pesadas e leves cooperam mutuamente para fornecer um sítio de ligação ao antígeno que é capaz de se ligar a um antígeno alvo. A especificidade de ligação de um par de cadeias pesadas e leves é definida pela sequência de CDR1, CDR2 e CDR3 das cadeias pesadas e leves. Assim, uma vez que um conjunto de sequências de CDR (ou seja, a sequência de CDR1, CDR2 e CDR3 para as cadeias pesadas e leves) é determinado, o que dá origem a uma especificidade de ligação particular, o conjunto de sequências de CDR pode, em princípio, ser inserido em posições apropriadas dentro de quaisquer outras regiões de estrutura do anticorpo ligadas a quaisquer regiões constantes do anticorpo, a fim de fornecer um anticorpo diferente com a mesma especificidade de ligação ao antígeno.
[0165] Em uma modalidade, a divulgação fornece um anticorpo isolado compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) e uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC), em que o anticorpo se liga a um epítopo de Lym1 ou Lym2.
[0166] Consistente com esses princípios e descobertas, esta divulgação fornece as seguintes modalidades. Um anticorpo compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em: uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 ou 6 ou um equivalente de cada uma das mesmas; e/ou uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 ou 8 ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em um aspecto, a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em outro aspecto, a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em um aspecto adicional, a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em ainda um aspecto adicional, a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, ou um equivalente de cada uma das mesmas. Também são fornecidos aqui anticorpos com certos aminoácidos mutados, cujas sequências são aqui divulgadas.
[0167] Em uma modalidade particular, o anticorpo compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em, uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou um equivalente da mesma; e/ou uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou um equivalente da mesma.
[0168] Em um aspecto, o anticorpo da presente divulgação é um anticorpo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. As regiões constantes dos anticorpos também podem ser variadas. Por exemplo, os anticorpos podem ser fornecidos com regiões Fc de qualquer isótipo: IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ou IgM. Exemplos não limitativos de sequências de região constante incluem: SEQ ID NOS: 19-27 ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em uma modalidade, a região constante do anticorpo da presente divulgação é uma região constante de IgG1 ou uma região constante de Ig kappa. Em algumas modalidades, as composições relacionadas à imunoglobulina da presente tecnologia compreendem uma região constante de cadeia pesada que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica às SEQ ID NOS: 19-27.
[0169] Um equivalente compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de aminoácido com um polipeptídeo ou um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor com o complemento de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
[0170] Também é fornecido na presente invenção um anticorpo que compete pela ligação com qualquer um dos anticorpos divulgados na presente invenção. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou humanizado. Em certos aspectos, os anticorpos da presente divulgação são policlonais, ou seja, uma mistura de vários tipos de anticorpos com diferentes sequências de aminoácidos. Em um aspecto, os anticorpos da presente divulgação possuem uma afinidade de ligação de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, os anticorpos se ligam com afinidades de pelo menos cerca de 10-7 M, e alternativamente de pelo menos cerca de 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M ou 10-12 M.
[0171] Em algumas modalidades, a sequência de CDRH1 da região variável de cadeia pesada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da região de CDHR1 de qualquer uma das sequências de HC divulgadas na presente invenção ou equivalentes das mesmas, seguido por mais 50 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 40 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 30 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 20 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 10 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 5 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 4, ou 3, ou 2 ou 1 aminoácido no terminal carbóxi.
[0172] Em algumas modalidades, a sequência de CDRH2 da região variável de cadeia pesada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da região de CDHR2 de qualquer uma das sequências de HC divulgadas na presente invenção ou equivalentes das mesmas, seguido por mais 50 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 40 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 30 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 20 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 10 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 5 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 4, ou 3, ou 2 ou 1 aminoácido no terminal carbóxi.
[0173] Em algumas modalidades, a sequência de CDRH3 da região variável de cadeia pesada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da região de CDHR3 de qualquer uma das sequências de HC divulgadas na presente invenção ou equivalentes das mesmas, seguido por mais 50 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 40 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 30 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 20 aminoácidos, ou alternativamente cerca de
10 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 5 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 4, ou 3, ou 2 ou 1 aminoácido no terminal carbóxi.
[0174] Em algumas modalidades, a sequência de CDRL1 da região variável de cadeia leve compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da região de CDLR1 de qualquer uma das sequências de LC divulgadas na presente invenção ou equivalentes das mesmas, seguido por mais 50 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 40 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 30 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 20 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 10 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 5 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 4, ou 3, ou 2 ou 1 aminoácido no terminal carbóxi.
[0175] Em algumas modalidades, a sequência de CDRL2 da região variável de cadeia leve compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da região de CDLR2 de qualquer uma das sequências de LC divulgadas na presente invenção ou equivalentes das mesmas, seguido por mais 50 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 40 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 30 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 20 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 10 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 5 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 4, ou 3, ou 2 ou 1 aminoácido no terminal carbóxi.
[0176] Em algumas modalidades, a sequência de CDRL3 da região variável de cadeia leve compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de aminoácidos da região de CDLR3 de qualquer uma das sequências de LC divulgadas na presente invenção ou equivalentes das mesmas, seguido por mais 50 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 40 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 30 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 20 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 10 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 5 aminoácidos, ou alternativamente cerca de 4, ou 3, ou 2 ou 1 aminoácido no terminal carbóxi.
[0177] Em outro aspecto da presente tecnologia, o anticorpo inclui uma ou mais das seguintes características: (a) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma ou mais CDRs que são pelo menos 85% idênticas a uma CDR de um domínio variável de cadeia leve de qualquer uma das sequências de cadeia leve divulgadas; (b) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma ou mais CDRs que são pelo menos 85% idênticas a uma CDR de um domínio variável de cadeia pesada de qualquer uma das sequências de cadeia pesada divulgadas; (c) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve é pelo menos 85% idêntica a um domínio variável de cadeia leve de qualquer uma das sequências de cadeia leve divulgadas; (d) a sequência de domínio variável de imunoglobulina de HC é pelo menos 85% idêntica a um domínio variável de cadeia pesada de qualquer uma das sequências de cadeia leve divulgadas; e (e) o anticorpo se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por qualquer uma das sequências divulgadas. Em um aspecto em que a CDR é mutada, o domínio de ligação de antígeno equivalente deve reter o aminoácido que é alterado da versão parental ou de tipo selvagem.
[0178] Em outros aspectos, um ou mais resíduos de aminoácidos em uma CDR dos anticorpos fornecidos na presente invenção são substituídos por outro aminoácido. A substituição pode ser “conservativa” no sentido de ser uma substituição dentro da mesma família de aminoácidos. Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos nas seguintes quatro famílias e as substituições conservativas ocorrerão dentro dessas famílias: 1) Aminoácidos com cadeias laterais básicas: lisina, arginina, histidina; 2) Aminoácidos com cadeias laterais ácidas: ácido aspártico, ácido glutâmico; 3) Aminoácidos com cadeias laterais polares não carregadas: asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina; 4) Aminoácidos com cadeias laterais não polares: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano, cisteína.
[0179] Em outro aspecto, um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou deletados de uma ou mais CDRs de um anticorpo. Tais adições ou deleções ocorrem nos terminais N ou C da CDR ou em uma posição dentro da CDR.
[0180] Variando-se a sequência de aminoácidos das CDRs de um anticorpo por adição, deleção ou substituição de aminoácidos, vários efeitos podem ser obtidos, como afinidade de ligação aumentada para o antígeno alvo. Em um aspecto em que a CDR é mutada, o domínio de ligação de antígeno equivalente deve reter o aminoácido que é alterado da versão parental ou de tipo selvagem.
[0181] Deve ser apreciado que os anticorpos da presente divulgação compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em tais sequências CDR variadas, ainda se ligam a Lym1 ou Lym2 com especificidade e perfis de sensibilidade semelhantes aos dos anticorpos divulgados. Isso pode ser testado por meio de ensaios de ligação.
[0182] Em alguns dos aspectos dos anticorpos fornecidos na presente invenção, as sequências de domínio variável de HC e LC são componentes da mesma cadeia de polipeptídeos. Em alguns dos aspectos dos anticorpos fornecidos na presente invenção, as sequências de domínio variável de HC e de LC são componentes de diferentes cadeias de polipeptídeos.
[0183] Em algum aspecto, os anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistem adicionalmente em uma região constante de cadeia pesada que é pelo menos 80% idêntica a qualquer uma daquelas aqui divulgadas.
[0184] Em algum aspecto, os anticorpos compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistem adicionalmente em uma região constante de cadeia leve que é pelo menos 80% idêntica a qualquer uma daquelas aqui divulgadas.
[0185] Em um aspecto particular, o anticorpo da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir em um marcador detectável ou um marcador de purificação.
[0186] Além disso, são fornecidos aqui fragmentos de ligação ao antígeno do anticorpo divulgado. Em alguns dos aspectos dos anticorpos fornecidos na presente invenção, o fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, F(ab)’2, Fab’, scFv e Fv.
[0187] Em alguns aspectos dos anticorpos fornecidos na presente invenção, o anticorpo contém modificações estruturais para facilitar a rápida ligação e absorção celular e/ou liberação lenta. Em algum aspecto, o anticorpo contém uma deleção na região constante de cadeia pesada de CH2 do anticorpo para facilitar a ligação rápida e a absorção celular e/ou liberação lenta. Em alguns aspectos, um fragmento Fab é usado para facilitar a ligação rápida e absorção celular e/ou liberação lenta. Em algum aspecto, um fragmento F(ab)’2 é usado para facilitar a ligação rápida e absorção celular e/ou liberação lenta.
[0188] Os anticorpos, fragmentos e equivalentes dos mesmos podem ser combinados com um veículo, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável ou outros agentes para fornecer uma formulação para uso e/ou armazenamento.
Métodos para Preparação de Anticorpos
[0189] É fornecido aqui um método de produção dos anticorpos da presente divulgação compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em cultivar a célula isolada descrita acima, em que a célula isolada é opcionalmente uma célula de mamífero.
[0190] Os anticorpos, sua fabricação e usos são bem conhecidos e divulgados, por exemplo, em Harlow, E. e Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. Os anticorpos podem ser gerados com o uso dos métodos padrão conhecidos na técnica. Exemplos de anticorpos incluem (mas não estão limitados a) anticorpos monoclonais, de cadeia simples e fragmentos funcionais de anticorpos. Os métodos para gerar tais anticorpos são conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Collarini et. al. (2009) J. Immunol. 183(10):6338-6345, Carter, P. et. al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89,4285-4289, and Baldi L. et. al. (2005) Biotechnol. Prog. 21:148–153.
[0191] Os anticorpos podem ser produzidos em uma variedade de hospedeiros, por exemplo, cabras, coelhos, ratos, camundongos, humanos e outros. Em um aspecto, os anticorpos são preparados pela expressão de um polinucleotídeo que codifica as CDRs, por exemplo, a cadeia pesada e as cadeias leves, conforme divulgado na presente invenção, em uma célula hospedeira, cultivando as células e expressando então a purificação dos anticorpos expressos pelos polinucleotídeos. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em um vetor e podem compreender adicionalmente sequências reguladoras, por exemplo, promotores e potencializadores selecionados para o sistema de expressão, operativamente ligados ao polinucleotídeo que codifica as CDRs do anticorpo anti-DCKL1.
[0192] Os anticorpos podem ser preparados por injeção com um antígeno alvo ou um fragmento ou oligopeptídeo do mesmo que tenha propriedades imunogênicas. Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser adicionados e usados para aumentar uma resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, mas não estão limitados a géis minerais de Freund, como hidróxido de alumínio e substâncias ativas de superfície como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de Keyhole Limpet e dinitrofenol. Entre os adjuvantes usados em humanos, BCG (Bacillo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são particularmente úteis. Esta divulgação também fornece o polipeptídeo isolado e um adjuvante.
[0193] Em certos aspectos, os anticorpos da presente divulgação são policlonais, isto é, uma mistura de vários tipos de anticorpos com diferentes sequências de aminoácidos. Em um aspecto, o anticorpo policlonal compreende uma mistura de vários tipos de anticorpos com diferentes CDRs. Como tal, uma mistura de células que produzem diferentes anticorpos é cultivada, e um anticorpo purificado a partir da cultura resultante pode ser usado (ver WO 2004/061104).
[0194] Produção de Anticorpos Monoclonais: Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo por linhagens de células contínuas em cultura. Essas técnicas incluem, mas sem limitação, a técnica de hibridoma (Veja, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)); a técnica do trioma; a técnica de hibridoma de células B humanas (ver, por exemplo, Kozbor, et all, Immunol. Today 4: 72 (1983)) e a técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (ver, por por exemplo, Cole, et all, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)). Os anticorpos monoclonais humanos podem ser utilizados na prática da presente tecnologia e podem ser produzidos usando hibridomas humanos (ver, por exemplo, Cote, et all, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030 (1983)) ou pela transformação de células B humanas com o vírus Epstein Barr in vitro (ver, por exemplo, Cole, et all, Alan R. Liss,
Inc., pp. 77-96 (1985)). Por exemplo, uma população de ácidos nucleicos que codificam regiões de anticorpos pode ser isolada. A PCR utilizando primers derivados de sequências que codificam regiões conservadas de anticorpos é usada para amplificar sequências que codificam partes de anticorpos da população e, em seguida, reconstruir DNAs que codificam anticorpos ou fragmentos dos mesmos, como domínios variáveis, a partir das sequências amplificadas. Essas sequências amplificadas também podem ser fundidas a DNAs que codificam outras proteínas - por exemplo, um revestimento de bacteriófago ou uma proteína de superfície celular bacteriana - para expressão e exibição dos polipeptídeos de fusão em fagos ou bactérias. As sequências amplificadas podem então ser expressas e ainda selecionadas ou isoladas com base, por exemplo, na afinidade do anticorpo expresso ou fragmento do mesmo para um antígeno ou epítopo presente no polipeptídeo de Lym1 ou Lym2.
[0195] Alternativamente, os hibridomas que expressam anticorpos monoclonais podem ser preparados por imunização de um sujeito, por exemplo, com um polipeptídeo isolado compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente na sequência de aminoácidos de qualquer um dos anticorpos aqui divulgados ou um fragmento do mesmo e, em seguida, isolar hibridomas do baço do sujeito usando métodos de rotina. Ver, por exemplo, Milstein et all, (Galfre e Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)). O rastreio dos hibridomas com o uso dos métodos padrão irá produzir anticorpos monoclonais de especificidade variada (ou seja, para diferentes epítopos) e afinidade. Um anticorpo monoclonal selecionado com as propriedades pretendidas, por exemplo, uma ligação de Lym1 ou Lym2, pode ser (i) usado conforme expresso pelo hibridoma, (ii) ligado a uma molécula tal como polietileno glicol (PEG) para alterar suas propriedades, ou (iii) um cDNA que codifica o anticorpo monoclonal pode ser isolado, sequenciado e manipulado de várias maneiras. Em um aspecto, o anticorpo monoclonal é produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em, um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada. As técnicas de hibridoma incluem aquelas conhecidas na técnica e ensinadas em Harlow et all, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 349 (1988); Hammerling et all, Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981).
[0196] Técnica de Exibição de Fago: Como observado acima, os anticorpos da presente divulgação podem ser produzidos através da aplicação de DNA recombinante e tecnologia de exibição de fago. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados usando vários métodos de exibição de fago conhecidos na técnica. Em métodos de exibição de fago, os domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de uma partícula de fago que carrega sequências de polinucleotídeos que os codificam. O fago com uma propriedade de ligação pretendida é selecionado a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, de humano ou murino) selecionando diretamente com um antígeno, tipicamente um antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou grânulo. Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo fd e M13 com Fab, Fv ou domínios de anticorpo de Fv estabilizado com dissulfeto são fundidos de forma recombinante com o gene III do fago ou à proteína do gene VIII. Além disso, os métodos podem ser adaptados para a construção de bibliotecas de expressão de Fab (Ver, por exemplo, Huse, et all, Science 246: 1275-1281, 1989) para permitir a identificação rápida e eficaz de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade pretendida para um polipeptídeo Lym1 ou Lym2, por exemplo, um polipeptídeo ou derivados, fragmentos, análogos ou homólogos dos mesmos. Outros exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para produzir os anticorpos humanizados isolados da presente divulgação incluem aqueles divulgados em Huston et all, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5879-5883 (1988); Chaudhary et all, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1066-1070 (1990); Brinkman et all, J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et all, J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et all, Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et all, Gene 187: 9-18 (1997); Burton et all, Advances in Immunology 57: 191- 280 (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; WO 96/06213; WO 92/01047 (Medical Research Council et. al.); WO 97/08320 (Morphosys); WO 92/01047 (CAT/MRC); WO 91/17271 (Affymax); patentes US nºs. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717,
5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637,
5.780.225, 5.658.727 e 5.733.743.
[0197] Métodos úteis para exibir polipeptídeos na superfície de partículas de bacteriófago ao anexar os polipeptídeos através das ligações de dissulfeto foram descritas por Lohning, Patente US n°. 6.753.136. Conforme descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões de codificação do anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno pretendido, e expressas em qualquer hospedeiro pretendido, incluindo células de mamífero, células de insetos, células vegetais, leveduras e bactérias. Por exemplo, as técnicas para produzir recombinantemente os fragmentos Fab, Fab′ e F(ab′)2 também podem ser empregues com o uso dos métodos conhecidos na técnica, como os divulgados no documento WO 92/22324; Mullinax et all, BioTechniques 12: 864-869 (1992); Sawai et all, AJRI 34: 26-34 (1995); e Better et all, Science 240: 1041-1043 (1988).
[0198] Geralmente, os anticorpos híbridos ou fragmentos de anticorpos híbridos que são clonados em um vetor de exibição podem ser selecionados contra o antígeno apropriado, a fim de identificar variantes que mantiveram boa atividade de ligação, porque o anticorpo ou fragmento de anticorpo estará presente na superfície da partícula de fago ou fagomídeo. Ver por exemplo, Barbas III et all, Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001). No entanto, outros formatos de vetor podem ser usados para este processo, como a clonagem da biblioteca de fragmentos de anticorpo em um vetor de fago lítico (sistemas T7 modificados ou Lambda Zap) para seleção e/ou triagem.
[0199] Métodos Alternativos de Produção de Anticorpos: Os anticorpos também podem ser produzidos induzindo produção in vivo na população de linfócitos ou por triagem de bibliotecas de imunoglobulinas recombinantes ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos (Orlandi et all, PNAS 86: 3833-3837 (1989); Winter, G. et all, Nature, 349: 293-299 (1991)).
[0200] Alternativamente, as técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser utilizadas. Os anticorpos de cadeia simples (scFvs) compreendem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve conectada com um peptídeo ligante (tipicamente cerca de 5 a 25 aminoácidos de comprimento). Exemplos não limitantes de tais técnicas são divulgados em Carter, P. et. al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89,4285-4289, and Baldi L. et. al. (2005) Biotechnol. Prog. 21:148–153. No scFv, as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser derivadas do mesmo anticorpo ou de anticorpos diferentes. O scFvs pode ser sintetizado usando técnicas recombinantes, por exemplo, pela expressão de um vetor que codifica o scFv em um organismo hospedeiro, como E. coli. O DNA que codifica scFv pode ser obtido realizando a amplificação com o uso de um DNA parcial que codifica a sequência de aminoácidos inteira ou pretendida de uma sequência de aminoácidos de DNA selecionado a partir de um DNA que codifica a cadeia pesada ou a região variável de cadeia pesada do anticorpo acima mencionado e um DNA que codifica a cadeia leve ou a região variável de cadeia leve da mesma como um modelo, por PCR com o uso de um par de primers que define ambas as extremidades do mesmo, e adicionalmente realizando a amplificação combinando um DNA que codifica uma parte de ligante de polipeptídeo e um par de primers que define ambas as extremidades dos mesmos, de modo a ligar ambas as extremidades do ligante à cadeia pesada e à cadeia leve, respectivamente. Um vetor de expressão contendo o DNA que codifica scFv e um hospedeiro transformado pelo vetor de expressão pode ser obtido de acordo com métodos convencionais conhecidos na técnica.
[0201] Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser gerados, por exemplo, os fragmentos F(ab′)2 que podem ser produzidos por digestão com pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados reduzindo as pontes de dissulfeto dos fragmentos F(ab′)2. Alternativamente, as bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas para permitir a identificação rápida e fácil dos fragmentos Fab monoclonais com a especificidade pretendida (Huse et all, Science, 256: 1275-1281 (1989)).
[0202] Modificações de Anticorpo. Os anticorpos da presente divulgação podem ser multimerizados para aumentar a afinidade para um antígeno. O anticorpo a ser multimerizado pode ser um tipo de anticorpo ou uma pluralidade de anticorpos que reconhecem uma pluralidade de epítopos do mesmo antígeno. Como um método de multimerização do anticorpo, a ligação do domínio de IgG CH3 a duas moléculas de scFv, ligação a estreptavidina, introdução de um motivo hélice-volta-hélice e semelhantes podem ser exemplificados.
[0203] As composições de anticorpos aqui divulgadas podem estar na forma de um conjugado formado entre qualquer um desses anticorpos e outro agente (imunoconjugado). Em um aspecto, os anticorpos divulgados na presente invenção são conjugados com material radioativo. Em outro aspecto, os anticorpos aqui divulgados podem ser ligados a vários tipos de moléculas, como polietileno glicol (PEG).
[0204] Triagem de Anticorpos. Vários imunoensaios podem ser usados para o rastreio para identificar anticorpos com a especificidade pretendida. Numerosos protocolos para ligação competitiva ou ensaios imunorradiométricos usando anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidades estabelecidas são bem conhecidos na técnica. Tais imunoensaios envolvem tipicamente a medição da formação de complexo entre Lym1 ou Lym2, ou qualquer fragmento ou oligopeptídeo do mesmo e seu anticorpo específico. Um imunoensaio de base monoclonal de dois sítios utilizando anticorpos monoclonais específicos para dois epítopos de Lym1 ou Lym2 não interferentes pode ser usado, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser empregado (Maddox et all, J. Exp. Med., 158: 1211-1216 (1983)).
[0205] A triagem de imuno-histoquímica automatizada (IHC) de anticorpos potenciais pode ser realizada com o uso de um Ventana Medical Systems, Inc (VMSI) Discovery XT e tecido humano fixado em formalina e embebido em parafina em lâminas de vidro. As amostras de tecido passam primeiro pela desparafinização, recuperação do antígeno, seguida pela adição do anticorpo potencial e um anticorpo de detecção. O anticorpo de detecção é visualizado com o uso de um reagente de detecção de cromogênio de VMSI. As lâminas coradas são examinadas manualmente ao microscópio. As amostras com um padrão de coloração de anticorpo primário correto são selecionadas como candidatos potenciais.
[0206] Purificação de Anticorpos. Os anticorpos aqui divulgados podem ser purificados até a homogeneidade. A separação e a purificação dos anticorpos podem ser realizadas empregando métodos convencionais de separação e purificação de proteínas.
[0207] Apenas a título de exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado selecionando e combinando apropriadamente o uso de colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa, eletroforese de focagem isoelétrica e semelhantes. Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et. al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
[0208] Exemplos de cromatografia incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia de adsorção. Em um aspecto, a cromatografia pode ser realizada empregando cromatografia líquida, como HPLC ou FPLC.
[0209] Em um aspecto, uma coluna de Proteína A ou uma coluna de Proteína G pode ser usada em cromatografia de afinidade. Outras colunas exemplificadoras incluem uma coluna de Proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) e semelhantes.
Polipeptídeos e Polinucleotídeos Isolados
[0210] Esta divulgação fornece polipeptídeos compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 ou um equivalente de cada uma das mesmas. É ainda fornecido um polipeptídeo isolado compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente na sequência de aminoácidos dos anticorpos divulgados na presente invenção ou um fragmento dos mesmos, bem como polinucleotídeos isolados que os codificam.
[0211] Ainda são fornecidos adicionalmente os ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos e fragmentos dos mesmos, conforme divulgado na presente invenção. Em um aspecto, as sequências de ácidos nucleicos isolados compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistem adicionalmente nas SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9 e 11 ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em um aspecto, as sequências de polinucleotídeos são operativamente ligadas a um elemento promotor e/ou potencializador. Elas também podem ser combinadas com um vetor ou célula hospedeira apropriada e/ou um veículo adequado para uso diagnóstico ou terapêutico. Em um aspecto, os ácidos nucleicos estão contidos com uma célula hospedeira para a produção recombinante de polipeptídeos e proteínas. As células hospedeiras podem ser eucarióticas ou procarióticas.
[0212] Em um aspecto, os polipeptídeos ou polinucleotídeos isolados compreendem adicional ou alternativamente consistem essencialmente em, ou ainda consistem adicionalmente em um marcador ou marcador de seleção e/ou sequências de polipeptídeos contíguas (por exemplo, proteína transportadora de hemocianina de keyhole limpet (KLH)) ou no caso de polinucleotídeos, polinucleotídeos que codificam a sequência, operativamente acoplados ao polipeptídeo ou polinucleotídeo. Os polipeptídeos ou polinucleotídeos podem ser combinados com vários veículos, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. Além disso, são fornecidas células hospedeiras, por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, bactérias, leveduras, mamíferos (rato, símio, hamster ou humano), compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente nos polipeptídeos ou polinucleotídeos isolados. As células hospedeiras podem ser combinadas com um veículo.
Receptores de Antígenos Quiméricos
[0213] É fornecido na presente invenção um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em: (a) um domínio de ligação de antígeno de qualquer um dos anticorpos divulgados aqui; (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana, e (d) e um domínio intracelular; Em um aspecto, o CAR compreende adicionalmente ou, alternativamente, consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em uma ou mais regiões de sinalização coestimulatória. Em outro aspecto, o CAR da presente divulgação é um CAR de primeira geração, um CAR de segunda geração, um CAR de terceira geração ou um CAR de quarta geração. Em um aspecto particular, o anticorpo da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir em um marcador detectável ou um marcador de purificação.
[0214] A presente divulgação fornece CARs que se ligam a Lym1 ou Lym2 compreendendo, consistindo, ou consistindo essencialmente em uma parte de ativação celular compreendendo um domínio extracelular, transmembrana e intracelular. O domínio extracelular compreende um elemento de ligação específico de alvo, de outra forma referido como o domínio de ligação de antígeno. O domínio intracelular ou domínio citoplasmático compreende pelo menos uma região de sinalização coestimulatória e uma parte de cadeia zeta. Em um aspecto, o CAR da presente divulgação é codificado pela sequência de aminoácidos que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente nas SEQ ID NOS: 14, 16 ou 18 ou um equivalente de cada uma das mesmas. Em outro aspecto, o CAR da presente divulgação compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente na sequência de polinucleotídeo das SEQ ID NOS: 13, 15 ou 17 ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0215] Domínio Espaçador: Os CARs podem opcionalmente compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente ou ainda consistir adicionalmente em um domínio espaçador de até 300 aminoácidos, de preferência, 10 a 100 aminoácidos, com maior preferência, 25 a 50 aminoácidos. Por exemplo, o espaçador pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos. Um domínio espaçador pode compreender, por exemplo, uma parte de um domínio de Fc humano, um domínio de CH3 ou a região de dobradiça de qualquer imunoglobulina, tal como IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, ou variantes das mesmas. Por exemplo, algumas modalidades podem compreender uma dobradiça de IgG4 com ou sem uma mutação S228P, L235E e/ou N297Q (de acordo com a numeração de Kabat). Espaçadores adicionais incluem,
mas sem limitação, regiões de dobradiça de CD4, CD8 e CD28.
[0216] Domínio de Ligação de Antígeno: Em certos aspectos, a presente divulgação fornece um CAR que compreende, consiste ou, alternativamente, consiste essencialmente de um domínio de ligação de antígeno do mesmo específico para qualquer um dos anticorpos fornecidos na presente invenção. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de antígeno compreende, consiste ou consiste essencialmente em um fragmento do anticorpo específico de alvo (ou seja, um anticorpo anti- Lym1 ou anti-Lym2), por exemplo, um scFv. O CAR da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir adicionalmente em um domínio de ligação de antígeno derivado de um anticorpo contra MUC-16 ou um anticorpo contra mesotelina.
[0217] Uma região de scFv pode compreender as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e cadeias leve (VL) de imunoglobulinas, conectado a um peptídeo ligante curto. O peptídeo ligante pode ser de 1 a 50 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante é rico em glicina, embora também possa conter serina ou treonina.
[0218] Domínio Transmembrana. O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou sintética. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembrana de uso particular nesta divulgação podem ser derivadas de CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR. Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. De preferência, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Opcionalmente, um ligante oligo-
ou polipeptídico curto, de preferência, entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR. Um dupleto de glicina- serina fornece um ligante particularmente adequado.
[0219] Domínio Citoplasmático. O domínio citoplasmático ou domínio de sinalização intracelular do CAR é responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras tradicionais de uma célula imune na qual um CAR foi colocado. O domínio de sinalização intracelular se refere a uma parte de uma proteína que transduz o sinal da função efetora e direciona a célula imune para realizar sua função específica. Um domínio de sinalização inteiro ou uma parte truncada do mesmo pode ser usado, desde que a parte truncada seja suficiente para transduzir o sinal da função efetora. As sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e correceptores, bem como os derivados ou variantes dos mesmos, podem funcionar como domínios de sinalização intracelular para uso em um CAR. Domínios de sinalização intracelular de uso particular nesta divulgação podem ser derivados de FcR, TCR, CD3, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização do CAR compreende, ou consiste essencialmente no mesmo, ou consiste em um domínio de sinalização de CD3 ζ.
[0220] Uma vez que os sinais gerados por meio de TCR são insuficientes isolados para a ativação completa de uma célula T, um sinal secundário ou coestimulador também pode ser necessário. Assim, a região intracelular de pelo menos uma molécula de sinalização coestimulatória, incluindo, mas não se limitando a CD27, CD28, 4- IBB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD- 1, ICOS, antígeno associado à função linfocitária 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ou um ligante que se liga especificamente a CD83, também podem ser incluídos no domínio citoplasmático de CAR. Os CARs da presente divulgação podem compreender, ou consistir essencialmente nos mesmos, ou consistir em um ou mais domínios coestimulatórios. Por exemplo, um CAR pode compreender, ou consistir essencialmente do mesmo, ou consistir em um, dois ou mais domínios coestimulatórios, além de um domínio de sinalização (por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 ζ).
[0221] Em algumas modalidades, a parte de ativação celular do receptor de antígeno quimérico é um domínio de sinalização de células T compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente numa ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas selecionados do grupo consistindo em proteína CD8, proteína CD28, proteína 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, CD27, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e proteína CD3-zeta.
[0222] Em modalidades específicas, o CAR compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um domínio de ligação de antígeno de qualquer um dos anticorpos da presente divulgação ou fragmento (por exemplo, scFv) do mesmo, um CD8 α ou um domínio de dobradiça de IgG1, um domínio transmembrana de CD8 α, pelo menos uma região de sinalização coestimulatória e um domínio de sinalização de CD3 zeta. Em outras modalidades, a região de sinalização coestimulatória compreende ou alternativamente consiste essencialmente na mesma ou ainda consiste adicionalmente em uma ou ambas dentre uma região de sinalização coestimulatória de CD28 e uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB.
[0223] Em uma modalidade particular, o CAR compreende adicional ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um polipeptídeo ligante localizado entre a região variável de HC e a região variável de LC. Em um aspecto, o polipeptídeo ligante do CAR compreende ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo ou ainda consiste num polipeptídeo da sequência (GGGGS)n em que n é um número inteiro de 1 a 6.
[0224] Em algumas modalidades, o CAR pode compreender adicionalmente ou consistir essencialmente no mesmo ou consistir num marcador detectável ou marcador de purificação.
[0225] Mecanismos de Troca. Em algumas modalidades, o CAR também pode compreender, ou consistir essencialmente do mesmo, ou consistir em um mecanismo de troca para controlar a expressão e/ou ativação de CAR. Por exemplo, um CAR pode compreender, consistir ou consistir essencialmente em um domínio extracelular, transmembrana e intracelular, em que o domínio extracelular compreende um elemento de ligação específico de alvo que compreende um domínio de ligação marcador, ou tag que é específico para uma molécula diferente do antígeno alvo que é expresso na célula alvo ou por uma célula alvo. Em tais modalidades, a especificidade de CAR é fornecida por uma segunda construção que compreende, consiste ou consiste essencialmente em um domínio de ligação de antígeno alvo e um domínio que é reconhecido ou se liga ao domínio de ligação marcador, ou tag no CAR. Ver, por exemplo, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9.233.125, US 2016/0129109. Desta forma, uma célula T que expressa o CAR pode ser administrada a um sujeito, mas não pode ligar seu antígeno alvo até que a segunda composição compreendendo um domínio de ligação específico seja administrada.
[0226] Os CARs da presente divulgação podem, da mesma, forma exigir multimerização a fim de ativar sua função de sinalização (ver, por exemplo, documentos US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360) e/ou um sinal exógeno, como um fármaco de molécula pequena (documento US 2016/0166613, Yung et all, Science, 2015) a fim de induzir uma resposta de células T.
[0227] Além disso, os CARs divulgados podem compreender, ou consistir essencialmente nos mesmos, ou consistir em uma “troca suicida” para induzir a morte celular das células T CAR após o tratamento (Buddee et all, PLoS One, 2013) ou para infrarregular a expressão de CAR após ligação ao antígeno alvo (WO 2016/011210).
Células DAP CAR
[0228] Em um aspecto, são fornecidos na presente invenção novos receptores de antígenos quiméricos (CARs) que redirecionam a função das células efetoras em uma maneira dependente de DAP10 e/ou DAP12 específico de epítopo. Os novos CARs foram avaliados com o domínio de reconhecimento de huLym-1-B, um anticorpo Lym-1 humanizado, em camundongos portadores de um xenoenxerto de linfoma de Burkitt positivo para Lym-1. Verificou-se que esta nova construção, designada huLym-1-B-DAP CAR, após a transdução de células T humanas primárias exibiu a proliferação aumentada de células in vitro, significativamente menos toxicidade in vivo e controle de tumor superior em comparação com células T Lym-1-41BB3zCAR de segunda geração. Assim, os CARs da presente divulgação são projetados para aprimorar o uso clínico de células T CAR humanas para o tratamento de uma variedade de cânceres humanos e doenças relacionadas, reduzindo os efeitos colaterais prejudiciais do tratamento e aprimorando a citotoxicidade antitumoral. Embora os CARs anti-Lym sejam exemplificadores, outros domínios de ligação ao antígeno podem ser substituídos pelo domínio de ligação de antígeno Lym, por exemplo, anti- CD 19. Outros domínios de ligação de antígeno incluem, por exemplo, anti-CD-20, anti-HER, anti-EGFR, anti-IL13, anti-mesothelin, anti- CD123, anti-BCMA, anti-MUC1, anti-CD38, anti-CD138, anti-CD70, anti-EpCAM, anti-CD133, anti-CEA, anti-CD5 anti-GD2, anti-PSMA, receptor de hormônio antiluteinizante (LHR), anti-B7-H4, anti-HLA, anti- HLA-G, bem como aqueles descritos nos documentos PCT/US2016 /0243573; PCT/US2016/0243613; e PCT/US2016/0243543.
[0229] Para demonstrar a utilidade clínica das construções de células T DAP CAR, uma construção de células T DAP CAR huLym-1 foi preparada usando os sítios de ligação de cadeia única do anticorpo Lym- 1 de murino anteriormente mostrado para direcionar malignidades de células B humanas, como linfomas de Burkitt, linfomas difusos e foliculares e um subconjunto de leucemia linfoblástica crônica de células B. (Rose LM et all, 1996, Cancer Immunol Immunother 43(1): 26-30) mostraram que Lym-1 de murino se ligou a um epítopo descontínuo na cadeia leve da molécula de HLA-Dr expressa em uma ampla variedade de tumores de células B humanas. Foi considerado um bom alvo para a terapia com células T CAR, uma vez que apenas as células B normais expressam este antígeno, mas ao contrário de outros alvos de células B, como CD19, CD20 e CD22, elas expressam cerca de ¼ do número de sítios de ligação em comparação com o expresso em malignidades de células B (Epstein AL et all, 1987, Cancer Res. 47:830-840). Além disso, o antígeno humano HLA-Dr reconhecido por Lym-1 não é liberado nem internalizado, permitindo uma ligação boa e estável à superfície das células de linfoma humano. Também foi extensivamente estudado no homem como um anticorpo radiomarcado com I-131 para a imageamento e tratamento de tumores positivos para Lym-1 e mostrou-se seguro mesmo em doses terapêuticas de I-131 (DeNardo SJ et al., 1988, Antibody, Immunoconjugates, e Radiopharmaceuticals 1:17-33; DeNardo, S.J. et al., 1988, Int. J. Cancer 3:96-101). Finalmente, um estudo clínico conduzido por Hu et. al. (Hu E et al., 1989, Hematologic Oncology 7:155-166) usando Lym-1 nu não mostrou toxicidade evidente, como hipogamaglobulemia observada em pacientes atualmente tratados com anti-CD20 (Rituxan).
[0230] Conforme revisado recentemente em June et. al. (June CH et al., 2018, Science 359:1361-1365), as células T CAR que foram projetadas a partir da compreensão inicial do Requerente, os mecanismos de sinalização do receptor de células T foram notavelmente bem- sucedidos para o tratamento de doenças malignas hematopoiéticas humanas. Apesar dos sucessos iniciais, incluindo a aprovação do FDA de produtos de células T anti-CD19 CAR, como Yescarta e Kymiriah, os aprimoramentos na estrutura básica e no alvo desses reagentes estão sendo intensamente estudados. As principais toxicidades associadas às terapias com células T CAR têm, até certo ponto, limitado seu uso e requerem um gerenciamento cuidadoso do paciente. A toxicidade mais comum, a síndrome de liberação de citocinas (CRS - “cytokine release syndrome”), é causada por uma resposta inflamatória sistêmica causada por citocinas liberadas por células T CAR infundidas. A CRS pode levar a disfunção orgânica reversível generalizada e requer intervenção precoce para hipotensão e tratamento de infecções concomitantes. Além disso, o bloqueio do receptor de IL-6 com tocilizumabe continua sendo a principal terapia farmacológica para CRS. Além disso, a terapia com células T CAR pode causar encefalopatia global, bem como defeitos localizados, como afasia, tremor, ataxia, hemiparesia e paralisia dos nervos cranianos (Brudno JN e Kochenderfer JN (2016) Blood 127:3321-3330). As opções de tratamento incluem o uso de corticosteroides, especialmente para os pacientes que não respondem ao tocilizumabe.
[0231] Avaliado por Srivastava e Riddell (Srivastava S and Riddell SR (2015) Trends in Immunology 36 (8):494-502), vários investigadores abordaram as questões de eficácia e toxicidade. Especificamente, os investigadores investigaram (A) o uso de mecanismos de desencadeamento de divisão usando dois sítios de reconhecimento nas células T CAR, um ligado ao CD3Θ e o outro ligado ao motivo 41BB para aprimorar a especificidade e segurança; (B) a alteração da configuração do scFv para otimizar restrições especiais entre a célula T citotóxica e a célula alvo de tumor; (C) produção de células T CAR expressas condicionalmente; (D) o uso de diferentes tipos de células para produzir as células T CAR, como as células T de memória e as células NK, entre outras; (D) o uso de acoplador de antígeno de célula T (TAC) para imitar o complexo TCR-CD3:correceptor (Helsen CW et. al. (2018) Nature Communications 9 (1): 3049); e (E) outros motivos coestimulatórios para sinalização, como ICOS (Guedan S. et all, (2018) JCI insight 3 (1)). Embora o método de TAC seja promissor, ele requer o uso de sequências DaRPin para se conectar ao CD3, complicando sua biologia molecular. No entanto, esses estudos e aqueles mostrados abaixo agora pela primeira vez, mostraram que o CRC e outras toxicidades das terapias com células T CAR não são necessárias para a eficácia ideal das células T CAR in vivo. Em resumo, os métodos para desacoplar o CRC e outras toxicidades comuns vistas hoje durante as terapias com células T CAR podem ser possíveis e podem alterar a percepção do requerente dessas terapias desprovidas de toxicidades potencialmente fatais. Para trabalhos futuros com células T CAR, métodos e abordagens para aumentar a segurança e eficácia de terapias de células T receptoras quiméricas são revisados por Li and Zhao (Li H et al., (2017) Protein & Cell 8(8):573-589). Para a terapia de tumor sólido, outras questões vêm à tona, conforme descrito por D’Alocia et. al. (D’Aloia MM et all, (2018) Cell Death and Disease 9: 282-293) em que parâmetros adicionais para o sucesso precisam ser alcançados acima do necessário para o tratamento da medula óssea e leucemias e linfomas circulantes. Especificamente, a migração e a penetração através da vasculatura do tumor, a persistência da proliferação até encontrar o antígeno e a resistência a um microambiente tumoral supressor precisam ser abordadas para que as células T CAR administradas por via intravenosa funcionem de forma eficaz uma vez que finalmente entrem no tumor.
[0232] As células T CAR construídas com DAP, conforme divulgado na presente invenção, permitem a proliferação mesmo para células T CAR que não respondem a métodos padrão de estimulação e crescimento celular e é mostrado ser um produto mais potente (requer 10x menos células) e exibe menos toxicidade (perda mínima de peso) do que as construções de segunda geração usando os mesmos epítopos de ligação. Devido a esses atributos, as células T DAP CAR podem ser uma etapa importante na geração de terapias celulares seguras e bem-sucedidas para doenças malignas hematopoiéticas humanas e, possivelmente, tumores sólidos.
Receptores de Antígenos Quiméricos
[0233] É fornecido na presente invenção um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em: (a) um domínio de ligação de antígeno (por exemplo, de um anticorpo anti-Lym (por exemplo, um anticorpo anti-
Lym humanizado) ou anticorpo anti-CD19), (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana, e (d) um domínio de sinalização intracelular DAP 10 e/ou DAP 12. O anticorpo anti-Lym humanizado anti-Lym pode ser um anticorpo anti-Lym1 ou anti-Lym 2, por exemplo, um anticorpo anti-Lym1 humano ou anti-Lym2 humano. Em um aspecto adicional, o anticorpo é um anticorpo anti-CD19 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em outro aspecto, o domínio de dobradiça compreende um domínio de dobradiça de CD8 α ou um domínio de dobradiça de IgG. O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou sintética. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembrana de uso particular nesta divulgação podem ser derivadas de CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR. Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. De preferência, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, de preferência, entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR. Um dupleto de glicina- serina fornece um ligante particularmente adequado. Em uma modalidade específica, o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de CD8 α. Os elementos podem ser de qualquer espécie, por exemplo, de humano ou de murino. Em um aspecto particular, o CAR da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir em um marcador detectável ou um marcador de purificação. Em um aspecto adicional, os CAR compreendem adicionalmente um peptídeo sinal.
[0234] Em um aspecto, o CAR da presente divulgação compreende a sequência de aminoácidos que compreende ou alternativamente consiste essencialmente ou ainda consiste adicionalmente em sequências de aminoácidos de CAR mostradas abaixo, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0235] Os CARs podem opcionalmente compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir adicionalmente em um domínio espaçador de até 300 aminoácidos, de preferência, 10 a 100 aminoácidos, com maior preferência, 25 a 50 aminoácidos. Por exemplo, o espaçador pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos.
[0236] Em certos aspectos, a presente divulgação fornece um CAR que compreende, consiste ou, alternativamente, consiste essencialmente no mesmo em um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo anti- CD19 ou de um anticorpo Lym-1 ou Lym-2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de antígeno compreende, consiste ou consiste essencialmente em um fragmento do anticorpo específico de alvo (por exemplo, um anti-CD19, um anticorpo anti-Lym1 ou anti-Lym2), por exemplo, um scFv.
[0237] Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno é uma região de scFv. Uma região de scFv pode compreender as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e cadeias leve (VL) de imunoglobulinas, conectado a um peptídeo ligante curto. O peptídeo ligante pode ser de 1 a 50 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante é rico em glicina, embora também possa conter serina ou treonina.
[0238] Em modalidades específicas, o CAR compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um domínio de ligação de antígeno de qualquer um dos anticorpos da presente divulgação ou fragmento (por exemplo, scFv) do mesmo, um domínio de dobradiça de CD8 α ou um domínio de dobradiça de IgG1, um domínio transmembrana de CD8 α e um domínio transmembrana de DAP 10 e/ou DAP 12. Em um outro aspecto, o CAR compreende um domínio DAP 10 e/ou DAP 12.
[0239] Em uma modalidade particular, o CAR compreende adicional ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste adicionalmente em um polipeptídeo ligante localizado entre a região variável de HC e a região variável de LC do anticorpo. Em um aspecto, o polipeptídeo ligante do CAR compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste em um polipeptídeo da sequência (GGGGS)n em que n é um número inteiro de 1 a 6.
[0240] Em algumas modalidades, o CAR pode compreender adicionalmente, ou consistir essencialmente do mesmo, ou consistir em um marcador detectável ou marcador de purificação.
[0241] Mecanismos de Troca. Em algumas modalidades, o CAR também pode compreender, ou consistir essencialmente do mesmo, ou consistir em um mecanismo de troca para controlar a expressão e/ou ativação de CAR. Por exemplo, um CAR pode compreender, consistir ou consistir essencialmente em um domínio extracelular, transmembrana e intracelular, em que o domínio extracelular compreende um elemento de ligação específico de alvo que compreende um domínio de ligação marcador, ou tag que é específico para uma molécula diferente do antígeno alvo que é expresso na célula alvo ou por uma célula alvo. Em tais modalidades, a especificidade de CAR é fornecida por uma segunda construção que compreende, consiste ou consiste essencialmente em um domínio de ligação de antígeno alvo e um domínio que é reconhecido ou se liga ao domínio de ligação marcador, ou tag no CAR. Ver, por exemplo, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9.233.125, US 2016/0129109. Desta forma, uma célula T que expressa o CAR pode ser administrada a um sujeito, mas não pode ligar seu antígeno alvo até que a segunda composição compreendendo um domínio de ligação específico seja administrada.
[0242] Os CARs da presente divulgação podem, da mesma forma, exigir multimerização a fim de ativar sua função de sinalização (ver, por exemplo, documentos US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360) e/ou um sinal exógeno, como um fármaco de molécula pequena (documento US 2016/0166613, Yung et all, Science, 2015) a fim de induzir uma resposta de células T.
[0243] Além disso, os CARs divulgados podem compreender, ou consistir essencialmente nos mesmos, ou consistir em uma “troca suicida” para induzir a morte celular das células T do CAR após o tratamento ou para infrarregular a expressão de CAR após a ligação ao antígeno alvo (WO 2016/011210).
Células Isoladas
[0244] Também é fornecido na presente invenção um método de produção de células que expressam anti-Lym CAR compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em introduzir em uma população de células imunes, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR aqui divulgado; e seleção de uma subpopulação de células imunes que foram transduzidas com sucesso com a sequência de ácidos nucleicos, produzindo assim células que expressam anti-Lym CAR.
[0245] Aspectos da presente divulgação se referem a uma célula isolada compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em um CAR da presente divulgação e métodos de produção de tais células. A célula é uma célula procariótica ou eucariótica. Em um aspecto, a célula é uma célula T ou uma célula NK. A célula eucariótica pode ser de qualquer espécie preferida, por exemplo, uma célula animal, uma célula de mamífero, como uma célula humana, felina ou canina.
[0246] Em algum aspecto da presente divulgação, a população de células isoladas transduzidas com a sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR, como descrito na presente invenção, é uma população de células precursoras de NK e/ou células precursoras de células T. A transdução de células precursoras resulta em uma população de células de longa vida capaz de se diferenciar em células T CAR e/ou células CAR NK. Os precursores de células T incluem, mas não estão limitados a HSCs; HSCs de longo prazo; MPPs; CLPs; LMPPs/ELPs; DN1s; DN2s; DN3s; DN4s; DPs. Os precursores de NK incluem, mas não estão limitados a células HSCs, HSCs de longo prazo, MPPs, CMPs, GMPs, pró- NK, pré-NK e iNK. Em um aspecto específico, a população de células isoladas inclui células T maduras e precursores de células T para fornecer células T CAR efetoras de vida curta e precursores de células T CAR de vida longa para transplante no sujeito. Em outro aspecto, a população de células isoladas inclui tanto células NK maduras quanto precursores de NK para fornecer células CAR NK efetoras de vida curta e precursores de CAR NK de vida longa para transplante no sujeito.
[0247] Em modalidades específicas, a célula isolada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em um CAR exógeno compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em, um domínio de ligação de antígeno do anticorpo fornecido na presente invenção, um domínio de dobradiça de CD8 α, um domínio transmembrana de CD8 α, uma região de sinalização coestimulatória de CD28 e/ou uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB e um domínio de sinalização de CD3 zeta.
[0248] Em outro aspecto, o CAR compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em: (a) um domínio de ligação de antígeno (por exemplo, de um anticorpo anti-Lym ou anticorpo anti-CD19), (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana e (d) um domínio de sinalização intracelular de DAP 10 e/ou DAP 12. O anticorpo anti-Lym pode ser um anticorpo anti-Lym1 ou anti-Lym 2, por exemplo, um anticorpo anti-Lym1 humano ou um anti- Lym2 humano. Em um aspecto adicional, o anticorpo é um anticorpo anti-CD19 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em outro aspecto, o domínio de dobradiça compreende um domínio de dobradiça CD8 α ou um domínio de dobradiça de IgG. O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou sintética. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembrana de uso particular nesta divulgação podem ser derivadas de CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR. Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. De preferência, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, de preferência, entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR. Um dupleto de glicina-serina fornece um ligante particularmente adequado. Em uma modalidade específica, o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de CD8 α. Os elementos podem ser de qualquer espécie, por exemplo, de humano ou de murino. Em um aspecto particular, o CAR da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir em um marcador detectável ou um marcador de purificação. Em um aspecto adicional, os CAR compreendem adicionalmente um peptídeo sinal.
[0249] Em certas modalidades, a célula isolada é uma célula T, por exemplo, uma célula T de animal, uma célula T de mamífero, uma célula T de felino, uma célula T de canino ou uma célula T de humano. Em certas modalidades, a célula isolada é uma célula NK, por exemplo, uma célula NK de animal, uma célula NK de mamífero, uma célula NK de felino, uma célula NK de canino ou uma célula NK de humano.
[0250] Em algumas modalidades, as células T que expressam os CARs divulgados podem ser ainda modificadas para reduzir ou eliminar a expressão de TCRs endógenos. A redução ou eliminação de TCRs endógenos pode reduzir os efeitos fora do alvo e aumentar a eficácia das células T. As células T estavelmente sem expressão de um TCR funcional podem ser produzidas com o uso de uma variedade de abordagens. As células T internalizam, classificam e degradam todo o receptor de células T como um complexo, com meia-vida de cerca de 10 horas em células T em repouso e 3 horas em células T estimuladas (von Essen, M. et. al.
2004. J. Immunol. 173:384-393). O funcionamento adequado do complexo de TCR requer a razão estequiométrica adequada das proteínas que compõem o complexo de TCR. A função de TCR também requer duas proteínas de TCRzeta funcionais com motivos ITAM. A ativação de TCR após o acoplamento de seu ligante de peptídeo MHC requer o acoplamento de vários TCRs na mesma célula T, que todos devem sinalizar adequadamente. Assim, se um complexo de TCR é desestabilizado com proteínas que não se associam adequadamente ou não podem sinalizar de forma otimizada, a célula T não se tornará ativada o suficiente para iniciar uma resposta celular.
[0251] Consequentemente, em algumas modalidades, a expressão de TCR pode ser eliminada usando interferência de RNA (por exemplo, shRNA, siRNA, miRNA, etc.), CRISPR ou outros métodos que têm como alvo os ácidos nucleicos que codificam TCRs específicos (por exemplo, TCR-α e TCR-β) e/ou cadeias CD3 em células T primárias. Ao bloquear a expressão de uma ou mais dessas proteínas, a célula T não produzirá mais um ou mais dos componentes-chave do complexo de TCR, desestabilizando assim o complexo de TCR e evitando a expressão da superfície celular de um TCR funcional. Mesmo que alguns complexos de TCR possam ser reciclados para a superfície da célula quando a interferência de RNA é usada, o RNA (por exemplo, shRNA, siRNA, miRNA, etc.) irá prevenir nova produção de proteínas de TCR, resultando na degradação e remoção de todo o complexo de TCR, resultando na produção de uma célula T com uma deficiência estável na expressão funcional de TCR.
[0252] A expressão de RNAs inibidores (por exemplo, shRNA, siRNA, miRNA, etc.) em células T primárias pode ser alcançada usando qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, um sistema de expressão lentiviral. Embora os lentivírus sejam úteis para direcionar as células T primárias em repouso, nem todas as células T expressarão os shRNAs. Algumas dessas células T podem não expressar quantidades suficientes de RNAs para permitir a inibição suficiente da expressão de TCR para alterar a atividade funcional da célula T. Assim, as células T que retêm a expressão de TCR moderada a alta após a transdução viral podem ser removidas, por exemplo, por classificação de células ou técnicas de separação, de modo que as células T restantes sejam deficientes em TCR ou CD3 de superfície celular, permitindo a expansão de uma população isolada de células T deficientes na expressão de TCR ou CD3 funcional.
[0253] A expressão de CRISPR em células T primárias pode ser alcançada usando sistemas CRISPR/Cas convencionais e RNAs guia específicos para os TCRs alvos. Sistemas de expressão adequados, por exemplo, sistemas de expressão lentiviral ou adenoviral são conhecidos na técnica. Semelhante à liberação de RNAs inibidores, o sistema CRISPR pode ser usado para ter como alvo especificamente as células T primárias em repouso ou outras células imunes adequadas para terapia com células de CAR. Além disso, na medida em que a edição de CRISPR não tem sucesso, as células podem ser selecionadas para o sucesso de acordo com os métodos divulgados acima. Por exemplo, como observado acima, as células T que retêm a expressão de TCR de moderada a alta após a transdução viral podem ser removidas, por exemplo, por técnicas de classificação ou de separação de células, de modo que as células T restantes sejam deficientes em TCR ou CD3 de superfície celular, permitindo a expansão de uma população isolada de células T deficientes na expressão de TCR ou CD3 funcional. É ainda apreciado que uma construção de edição de CRISPR pode ser útil tanto na eliminação do TCR endógeno quanto na eliminação das construções CAR aqui divulgadas. Consequentemente, é apreciado que um sistema de CRISPR pode ser projetado para realizar um ou ambos os objetivos.
[0254] Embora muitas das técnicas acima sejam descritas com respeito às células T, é apreciado que os usos e métodos de geração e modificação descritos na presente invenção e ao longo da presente divulgação não estão limitados a células T, mas podem ser expandidos para qualquer célula relevante, incluindo por não limitado a células imunes, como células B, células NK e células-tronco relevantes.
[0255] Fontes de Células Isoladas: Antes da expansão e modificação genética das células aqui divulgadas, as células podem ser obtidas de um sujeito - por exemplo, em modalidades que envolvem terapia autóloga - ou uma cultura comercialmente disponível, que estão disponíveis junto à American Type Culture Collection (ATCC), por exemplo.
[0256] As células podem ser obtidas de uma série de fontes em um sujeito, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodos, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascite, derrame pleural, tecido do baço e tumores.
[0257] Os métodos de isolamento de células relevantes são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados ao presente pedido; um método exemplificador é descrito nos exemplos abaixo. Os métodos de isolamento para uso em relação a esta divulgação incluem, mas sem limitação, Life Technologies Dynabeads® System; STEMcell Technologies EasySep™, RoboSep™, RosetteSep™, SepMate™; Kits de separação de células Miltenyi Biotec MACS™ e outros kits de separação e isolamento de células disponíveis comercialmente. Subpopulações particulares de células imunes e precursores podem ser isoladas através do uso de seleção de células ativadas por fluorescência (FACS - “fluorescence-activated cell sorting”), grânulos ou outros agentes de ligação disponíveis em tais kits específicos para marcadores únicos de superfície celular. Por exemplo, MACS™ CD4+ e CD8+ MicroBeads podem ser usados para isolar células T CD4+ e CD8+.
[0258] Alternativamente, as células podem ser obtidas através de culturas de células comercialmente disponíveis, incluindo, mas não se limitando a, para células T, as linhagens BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™); e, para as células NK, linhagens NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™).
[0259] Em alguns aspectos, o sujeito pode ser administrado com um regime de condicionamento para induzir a mobilização de células precursoras no sangue periférico antes de obter as células do sujeito. Por exemplo, pode ser administrada a um sujeito uma quantidade eficaz de pelo menos um dentre fator estimulador de colônia de granulócitos (G- CSF - “granulocyte colony-stimulating factor”), filgrastim (Neupogen), sargramostim (Leukine), pegfilgrastim (Neulasta) e mozobil (Plerixafor) até duas semanas antes ou simultaneamente com o isolamento de células do sujeito. As células precursoras mobilizadas podem ser obtidas a partir do sujeito por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, leucaferese, 1 a 14 dias após a administração do regime de condicionamento.
[0260] Ativação e Expansão para Células T. Quer antes ou depois da modificação genética das células T para expressar um CAR desejável, as células podem ser ativadas e expandidas com o uso dos métodos geralmente conhecidos, como aqueles descritos nas Patentes US nºs.
6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466;
6.905.681; 7, 144.575; 7.067.318; 7, 172.869; 7.232.566; 7, 175.843;
5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041. A estimulação com o antígeno Lym1 ou Lym2 ex vivo pode ativar e expandir a subpopulação de células que expressam CAR selecionadas. Alternativamente, as células podem ser ativadas in vivo por interação com o antígeno de Lym1 ou
Lym2.
[0261] Os métodos de ativação de células relevantes são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados ao presente pedido; um método exemplificador é descrito nos exemplos abaixo. Os métodos de isolamento para uso em relação a esta divulgação incluem, mas não estão limitados a kits de ativação e expansão Life Technologies Dynabeads® System; Kits de ativação BD Biosciences Phosflow™, kits de ativação/expansão Miltenyi Biotec MACS™ e outros kits de células disponíveis comercialmente específicos para frações de ativação da célula relevante. Subpopulações particulares de células imunes podem ser ativadas ou expandidas através do uso de grânulos ou outros agentes disponíveis em tais kits. Por exemplo, α-CD3/α-CD28 Dynabeads® podem ser usados para ativar e expandir uma população de células T isoladas.
[0262] Também é divulgada na presente invenção uma célula isolada compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente no anticorpo, no CAR, no ácido nucleico isolado e/ou no vetor da presente divulgação.
Polinucleotídeos e Vetores
[0263] Os CARs podem ser preparados usando vetores. Aspectos da presente divulgação se referem a uma sequência de ácidos nucleicos isolada que codifica os CARs divulgados na presente invenção e vetores compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em uma sequência de ácidos nucleicos isolada que codifica o CAR e seu complemento e equivalentes de cada um dos mesmos.
[0264] A preparação de vetores exemplificadores e a geração de células que expressam CAR usando os ditos vetores são discutidas em detalhes nos exemplos abaixo. Em resumo, a expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos que codificam CARs é tipicamente alcançada ligando operativamente um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CAR ou partes do mesmo a um promotor e incorporando a construção em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para eucariótas de replicação e integração.
[0265] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos isolada codifica um CAR compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em um domínio de ligação de antígeno do anticorpo aqui fornecido, um domínio de dobradiça de CD8 α, um domínio transmembrana de CD8 α, uma região de sinalização coestimulatória CD28 e/ou uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB e um domínio de sinalização de CD3 zeta. Em modalidades específicas, a sequência de ácidos nucleicos isolada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente na mesma, ou ainda consiste adicionalmente em, sequências que codificam (a) um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo da presente divulgação seguido por (b) um domínio de dobradiça de CD8 α, (c) um domínio transmembrana de CD8 α seguido por (d) uma região de sinalização coestimulatória de CD28 e/ou uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB seguida por (e) um domínio de sinalização de CD3 zeta.
[0266] Em outro aspecto, o CAR compreende, ou consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em: (a) um domínio de ligação de antígeno (por exemplo, de um anticorpo anti-Lym ou anticorpo anti-CD19), (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana e (d) um domínio de DAP 10 e/ou DAP 12. O anticorpo anti-Lym pode ser um anticorpo anti-Lym1 ou anti-Lym 2, por exemplo, um anticorpo anti-Lym1 humano ou um anti-Lym2 humano. Em um aspecto adicional, o anticorpo é um anticorpo anti-CD19 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em outro aspecto, o domínio de dobradiça compreende um domínio de dobradiça de CD8 α ou um domínio de dobradiça de IgG. O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou sintética. Em um aspecto, um peptídeo compreendendo a sequência AVPPQQWALS é inserido após o domínio de ligação de antígeno. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembrana de uso particular nesta divulgação podem ser derivadas de CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR. Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. De preferência, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, de preferência, entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR. Um dupleto de glicina- serina fornece um ligante particularmente adequado. Em uma modalidade específica, o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de CD8 α. Os elementos podem ser de qualquer espécie, por exemplo, de humano ou de murino. Em um aspecto particular, o CAR da presente divulgação pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir em um marcador detectável ou um marcador de purificação. Em um aspecto adicional, os CAR compreendem adicionalmente um peptídeo sinal.
[0267] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos isolada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente na mesma, ou ainda consiste adicionalmente numa sequência de consenso Kozak a montante da sequência que codifica o domínio de ligação de antígeno do anticorpo ou um potencializador. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado compreende, ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste adicionalmente em um polinucleotídeo que confere resistência a antibióticos. Em uma modalidade particular, o ácido nucleico isolado que codifica o CAR compreende adicional ou alternativamente consiste essencialmente no mesmo, ou ainda consiste adicionalmente em um mecanismo de troca para controlar a expressão e/ou ativação do CAR.
[0268] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos isolada compreende, ou alternativamente consiste essencialmente na mesma, ou ainda consiste em um peptídeo sinal que codifica a sequência de polinucleotídeos localizada a montante do domínio de ligação de antígeno do anticorpo.
[0269] Em uma modalidade particular, a sequência de ácidos nucleicos isolada compreende ou alternativamente consiste essencialmente na mesma ou ainda consiste adicionalmente em uma sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo autoclivante 2A (T2A) localizado a montante do domínio de ligação de antígeno do anticorpo.
[0270] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos isolada está compreendida em um vetor. Em certas modalidades, o vetor é um plasmídeo. Em outras modalidades, o vetor é um vetor de lentivírus. Em modalidades específicas, o vetor é um vetor lentiviral.
[0271] A preparação de vetores exemplificadores e a geração de células que expressam CAR usando os ditos vetores são discutidas em detalhes nos exemplos abaixo. Em resumo, a expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos que codificam CARs é tipicamente alcançada ligando operativamente um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CAR ou partes do mesmo a um promotor e incorporando a construção em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para eucariótas de replicação e integração. Os métodos para a produção de células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et. al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).
[0272] Em vários aspectos, o vetor é derivado de, ou baseado em, um vírus de tipo selvagem. Em outros aspectos, o vetor é derivado de, ou baseado em, um lentivírus de tipo selvagem. Exemplos de tais, incluem,
sem limitação, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV), vírus da imunodeficiência símia (SIV) e vírus da imunodeficiência felina (FIV). Alternativamente, é contemplado que outro retrovírus pode ser usado como uma base para uma estrutura de vetor, tal como o vírus da leucemia murina (MLV). Será evidente que um vetor viral de acordo com a divulgação não precisa ser confinado aos componentes de um vírus específico. O vetor viral pode compreender componentes derivados de dois ou mais vírus diferentes e também pode compreender componentes sintéticos. Os componentes do vetor podem ser manipulados para obter as características pretendidas, como a especificidade da célula alvo.
[0273] Os vetores recombinantes da presente divulgação podem ser derivados de primatas e não primatas. Exemplos de lentivírus de primatas incluem o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (AIDS) e o vírus da imunodeficiência símia (SIV). O grupo lentiviral de não primata inclui o protótipo “vírus lento” do vírus visna/maedi (VMV), bem como o vírus da artrite-encefalite caprina relacionado (CAEV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e o vírus da imunodeficiência felina descrito mais recentemente (FIV) e vírus da imunodeficiência bovina (BIV). Os vetores lentivirais recombinantes da técnica anterior são conhecidos na técnica, por exemplo, ver as Patentes US nºs. 6.924.123; 7.056.699;
7.419.829 e 7.442.551, aqui incorporadas por referência.
[0274] A Patente US nº. 6.924.123 divulga que certa sequência retroviral facilita a integração no genoma da célula alvo. Esta patente ensina que cada genoma retroviral compreende genes chamados gag, pol e env que codificam proteínas e enzimas de vírion. Esses genes são flanqueados em ambas as extremidades por regiões chamadas de repetições terminais longas (LTRs). As LTRs são responsáveis pela integração e transcrição pró-viral. Eles também servem como sequências potencializadoras-promotoras. Em outras palavras, as LTRs podem controlar a expressão dos genes virais. A encapsidação dos RNAs retrovirais ocorre em virtude de uma sequência de psi localizada na extremidade 5’ do genoma viral. As próprios LTRs são sequências idênticas que podem ser divididas em três elementos, chamados U3, R e U5. U3 é derivado da sequência única da extremidade 3’ do RNA. R é derivado de uma sequência repetida em ambas as extremidades do RNA, e U5 é derivado da sequência única da extremidade 5’ do RNA. Os tamanhos dos três elementos podem variar consideravelmente entre os diferentes retrovírus. Para o genoma viral, o sítio da adição poli (A) (terminação) está no limite entre R e U5 em LTR do lado direito. U3 contém a maioria dos elementos de controle da transcrição do pró-vírus, que incluem o promotor e múltiplas sequências potencializadoras responsivas às proteínas celulares e, em alguns casos, ativadoras da transcrição viral.
[0275] No que diz respeito aos próprios genes estruturais gag, pol e env, o gag codifica a proteína estrutural interna do vírus. A proteína Gag é processada proteoliticamente nas proteínas maduras MA (matriz), CA (capsídeo) e NC (nucleocapsídeo). O gene pol codifica a transcriptase reversa (RT), que contém DNA polimerase, associada a RNase H e integrase (IN), que medeia a replicação do genoma.
[0276] Para a produção de partículas de vetor viral, o genoma de RNA de vetor é expresso a partir de uma construção de DNA que o codifica, em uma célula hospedeira. Os componentes das partículas não codificadas pelo genoma do vetor são fornecidos em trans por sequências de ácidos nucleicos adicionais (o “sistema de empacotamento”, que geralmente inclui um ou ambos os genes gag/pol e env) expressos na célula hospedeira. O conjunto de sequências necessárias para a produção das partículas do vetor viral pode ser introduzido na célula hospedeira por transfecção transitória, ou pode ser integrado no genoma da célula hospedeira, ou pode ser fornecido em uma mistura de várias maneiras. As técnicas envolvidas são conhecidas dos versados na técnica.
[0277] Os vetores retrovirais para uso nesta divulgação incluem,
mas não estão limitados ao sistema “ViraPower” versões 4, 6 e 6.2 da série pLenti da Invitrogen. Fabricado pela Lentigen Corp; pHIV-7-GFP, gerado laboratório e usado pelo City of Hope Research Institute; Vetor lentiviral “Lenti-X”, pLVX, fabricado por Clontech; pLKO.1-puro, fabricado por Sigma-Aldrich; pLemiR, fabricado pela Open Biosystems; e pLV, laboratório gerado e usado pela Charité Medical School, Institute of Virology (CBF), Berlin, Alemanha.
[0278] Independentemente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira ou, de outra forma, expor uma célula ao inibidor da presente divulgação, a fim de confirmar a presença da sequência de DNA recombinante na célula hospedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de “Biologia molecular” bem conhecidos dos versados na técnica, como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; ensaios “bioquímicos”, como a detecção da presença ou ausência de um determinado peptídeo, por exemplo, por meios imunológicos (ELlSAs e Western blots) ou por ensaios aqui descritos para identificar os agentes que se enquadram no escopo da divulgação.
[0279] Vetor de Empacotamento e Linhagens de Células: Os CARs podem ser empacotados em um sistema de empacotamento lentiviral ou retroviral com o uso de um vetor de empacotamento e linhagens de células. O vetor de empacotamento de plasmídeo inclui, mas não está limitado a vetor retroviral, vetor lentiviral, vetor adenoviral e vetor viral adenoassociado. O vetor de empacotamento contém elementos e sequências que facilitam a liberação de materiais genéticos nas células. Por exemplo, as construções retrovirais são plasmídeos de empacotamento que compreendem pelo menos uma sequência de DNA auxiliar retroviral derivada de um genoma retroviral incompetente para replicação que codifica em trans todas as proteínas do vírion necessárias para empacotar um vetor retroviral incompetente para replicação, e para produzir proteínas do vírion capazes de empacotar o vetor retroviral incompetente para replicação em titulações elevadas, sem a produção de vírus auxiliares competente para replicação.
A sequência de DNA retroviral não apresenta a região que codifica o potencializador e/ou promotor nativo da 5′ LTR viral do vírus, e não apresenta a sequência de função psi responsável pelo empacotamento do genoma auxiliar e da 3′ LTR, mas codifica um sítio de poliadenilação estranho, por exemplo, o sítio de poliadenilação SV40 e um potencializador e/ou promotor estranho que dirige a transcrição eficiente em um tipo de célula onde a produção de vírus é pretendida.
O retrovírus é um vírus da leucemia, como o vírus da Leucemia Murina Moloney (MMLV), o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou o vírus da Leucemia do Macaco Gibão (GALV). O potencializador e promotor estrangeiro podem ser o potencializador e o promotor imediato (IE) do citomegalovírus humano (HCMV), o potencializador e promotor (região U3) do vírus do sarcoma murino de Moloney (MMSV), a região U3 do vírus do sarcoma de Rous (RSV), a região U3 do vírus de formação de foco do baço (SFFV), ou o potencializador de HCMV IE unido ao promotor nativo do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV). O plasmídeo de empacotamento retroviral pode consistir em duas sequências de DNA auxiliar retroviral codificadas por vetores de expressão com base em plasmídeo, por exemplo, onde uma primeira sequência auxiliar contém um cDNA que codifica as proteínas gag e pol de MMLV ou GALV ecotrópico e uma segunda sequência auxiliar contém um cDNA que codifica a proteína env.
O gene Env, que determina a faixa de hospedeiros, pode ser derivado dos genes que codificam as proteínas xenotrópicas, anfotrópicas, ecotrópicas, politrópicas (formadoras de foco de mink) ou proteínas env de vírus leucemia murina 10A1, ou o Vírus de Leucemia de Macaco Gibão (proteína env GALV, proteína env do vírus da imunodeficiência humano (gp160), proteína G do vírus do estomatito vesicular (VSV), produtos do gene env da leucemia de células T humanas (HTLV) tipo I e II, gene do envelope quimérico derivado de combinações de um ou mais dos genes env ou genes de envelope quiméricos mencionados anteriormente que codificam o citoplasma e a transmembrana dos produtos do gene env acima mencionados e um anticorpo monoclonal dirigido contra uma molécula de superfície específica em uma célula alvo pretendida.
[0280] No processo de empacotamento, os plasmídeos de empacotamento e os vetores retrovirais são transitoriamente cotransfectados em uma primeira população de células de mamíferos que são capazes de produzir vírus, como células de rim embrionário humano, por exemplo, células 293 (ATCC n°. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.) para produzir sobrenadantes contendo retrovírus recombinantes de alta titulação. Em outro método da divulgação, esta primeira população de células transfectadas transitoriamente é então cocultivada com células- alvo de mamíferos, por exemplo, linfócitos humanos, para transduzir as células-alvo com o gene estranho em altas eficiências. Em ainda outro método da divulgação, os sobrenadantes da primeira população de células transfectadas transitoriamente descritas acima são incubados com células-alvo de mamífero, por exemplo, linfócitos humanos ou células-tronco hematopoiéticas, para transduzir as células-alvo com o gene estranho em altas eficiências.
[0281] Em outro aspecto, os plasmídeos de empacotamento são expressos de forma estável em uma primeira população de células de mamíferos que são capazes de produzir vírus, como células de rim embrionário humano, por exemplo, as células 293. Os vetores retrovirais ou lentivirais são introduzidos nas células por cotransfecção com um marcador selecionável ou infecção com vírus pseudotipado. Em ambos os casos, os vetores se integram. Alternativamente, os vetores podem ser introduzidos em um plasmídeo mantido de forma epissomal. São produzidos sobrenadantes contendo retrovírus recombinantes de alta titulação.
Métodos de Tratamento e Diagnóstico
[0282] Em um aspecto, é fornecida na presente invenção uma composição que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste adicionalmente em um veículo e um ou mais dentre o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno, o polipeptídeo, o CAR, o ácido nucleico isolado, o vetor e/ou a célula isolada da presente divulgação. Os anticorpos e polinucleotídeos, vetores ou células hospedeiras da presente divulgação também podem ser ligados a muitos veículos diferentes. Assim, esta divulgação também fornece composições contendo os anticorpos e outra substância, ativa ou inerte. Exemplos de veículos bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para os fins da divulgação. Os versados na técnica conhecerão outros veículos adequados para a ligação de anticorpos, ou serão capazes de averiguá-los, usando experimentação de rotina. As seções congeladas do tumor podem ser coradas com huLym- 1 ou huLym-2 para demonstrar a positividade do tumor para o antígeno antes do paciente entrar em tratamento com células T ou anticorpo huLym-1 ou huLym-2 CAR. Ambos os antígenos Lym-1 e Lym-2 são destruídos por inclusão de parafina nas seções, portanto, as seções congeladas precisarão ser realizadas.
[0283] O anticorpo da presente divulgação ou os fragmentos do mesmo podem ser usados para tratar tumores e cânceres. As células que expressam anti-Lym CAR fornecidas na presente invenção, o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo e/ou o polipeptídeo fornecido na presente invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação com diluentes, produtos terapêuticos anticâncer conhecidos e/ou com outros componentes, como citocinas ou outras populações de células que são imunoestimuladoras. Elas podem ser administradas como uma terapia de primeira linha, uma terapia de segunda linha, uma terapia de terceira linha ou terapia adicional. Como tal, o anticorpo divulgado pode ser combinado com outras terapias (por exemplo, quimioterapia, radiação, cirurgia, etc.). Exemplos não limitantes de terapias adicionais incluem produtos quimioterápicos ou biológicos. Para alterar o microambiente tumoral para que as células T CAR ou anticorpos da presente divulgação sejam mais eficazes, os inibidores de checkpoint podem ser úteis antes ou durante a terapia com células T CAR e/ou anticorpos. Outros exemplos não limitantes de terapias adicionais incluem métodos para excluir ou inibir células supressoras, como células T reguladoras (Treg) e as células supressoras derivadas de mieloides (MDSC - “myeloid derived suppressor cells”), também serão úteis. As Treg podem ser deletadas por ciclofosfamida em dose baixa e MDSC por quimioterapia com fluoruracila (5-FU) em dose baixa ou por métodos ainda desconhecidos. Além disso, outros exemplos não limitantes de terapias adicionais incluem a suprarregulação do antígeno que pode tornar as células tumorais mais suscetíveis à terapia com células T CAR. A suprarregulação de HLA-DR pode ser realizada pelo uso de inibidores da histona desacetilase (HDAC), tratamento com IL-12, CpG (agonistas de TLR9) e agonistas da via do estimulador de genes do interferon (STING). Os regimes de tratamento apropriados serão determinados pelo médico assistente ou veterinário.
[0284] As células que expressam anti-Lym CAR aqui fornecidas, o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo e/ou o polipeptídeo da presente divulgação podem ser administrados isoladamente ou em combinação com diluentes, produtos terapêuticos anticâncer conhecidos e/ou com outros componentes como citocinas ou outras populações de células que são imunoestimulantes.
[0285] Em uma modalidade, é divulgado aqui um método para inibir o crescimento de um tumor e/ou tratar um câncer e/ou prevenir a recaída do câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente na administração ao sujeito, uma quantidade eficaz das células que expressam CAR aqui fornecidas, uma quantidade eficaz do anticorpo, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno do mesmo e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo aqui fornecido. Em um aspecto, as células que expressam
CAR são autólogas ou alogênicas para o sujeito a ser tratado e, opcionalmente, são uma terapia de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha ou quinta linha.
[0286] Em outro aspecto, o tumor ou célula cancerosa expressa ou superexpressa CD 19, Lym1 e/ou Lym2. Em um outro aspecto, o câncer ou tumor é selecionado do grupo de um carcinoma, sarcoma, linfoma ou leucemia. Em um aspecto particular, o tumor ou câncer é linfoma de células B ou leucemia. Em uma modalidade, o tumor é um tumor sólido. O tumor sólido pode ser um melanoma, um carcinoma do cólon, um carcinoma da mama e/ou um tumor cerebral. Em um aspecto, o câncer a ser tratado é um carcinoma, sarcoma, neuroblastoma, câncer cervical, câncer hepatocelular, mesotelioma, glioblastoma, mieloma, linfoma, leucemia, adenoma, adenocarcinoma, glioma, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, oligodendrocitoma, meningioma ou melanoma.
[0287] Os métodos são úteis para tratar sujeitos como humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos, gibões, chimpanzés, orangotangos, macacos, macacos do gênero macaca e semelhantes), animais domésticos (por exemplo, cães e gatos), animais de pecuária (por exemplo, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos) e animais experimentais (por exemplo, camundongo, rato, coelho, porquinho da índia). Um mamífero pode ter qualquer idade ou qualquer estágio de desenvolvimento (por exemplo, um adulto, adolescente, criança, bebê ou um mamífero no útero). Um mamífero pode ser macho ou fêmea. Em certas modalidades, o sujeito tem ou é suspeito de ter um distúrbio neoplásico, neoplasia, tumor, malignidade ou câncer.
[0288] Os métodos divulgados na presente invenção podem compreender adicionalmente ou, alternativamente, consistir essencialmente em, ou ainda consistir adicionalmente em administrar ao sujeito uma terapia antitumoral diferente da terapia CAR.
[0289] Portanto, os aspectos do método da presente divulgação se referem a métodos para inibir o crescimento de um tumor em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou para tratar um paciente com câncer em necessidade do mesmo.
[0290] Esta divulgação também se refere a métodos para inibir a proliferação de células cancerosas ou células-tronco cancerosas compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em contatar as células com uma quantidade eficaz das células que expressam anti-Lym CAR, uma quantidade eficaz do anticorpo, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo da presente divulgação.
[0291] Além disso, são fornecidos aqui métodos para determinar se um sujeito tem probabilidade de responder ou não é provável de responder à terapia, compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em contatar uma amostra isolada do paciente com o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno, e/ou o polipeptídeo da presente divulgação, e detectar um complexo de anticorpo-célula, um complexo de fragmento de ligação de antígeno-célula e/ou um complexo de polipeptídeo-célula na amostra, em que a presença do complexo indica que o sujeito provavelmente responderá à terapia e a ausência de complexo indica que o sujeito provavelmente não responderá à terapia. O anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno e/ou o polipeptídeo podem ser marcados de forma detectável.
[0292] Também são divulgados na presente invenção métodos compreendendo adicional ou alternativamente consistindo essencialmente em ou ainda consistindo adicionalmente em administrar uma quantidade eficaz do anticorpo ou do CAR da divulgação ao sujeito que é determinado que provavelmente responderá à terapia.
[0293] A terapia aqui divulgada pode ser uma terapia de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha ou quinta linha.
[0294] Esta divulgação se refere ainda a métodos para monitorar a terapia em um sujeito, compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em contatar uma amostra isolada do sujeito com o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da presente divulgação, e detectar um complexo de anticorpo - célula na amostra. O método pode ser realizado antes e/ou após a administração de uma quantidade eficaz das células que expressam CAR, uma quantidade eficaz do anticorpo, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo da presente divulgação para o sujeito. Em um aspecto, o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo é marcado de forma detectável. Em outro aspecto, a amostra compreende um ou mais dentre expectoração, soro, plasma, linfa, fluido cístico, urina, fezes, fluido cefalorraquidiano, fluido ascítico, sangue ou um tecido.
[0295] Em um aspecto adicional, é fornecido aqui um método para estimular uma resposta imune a um câncer ou população de células tumorais, o método compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em administrar ao sujeito o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e/ou o polipeptídeo da presente divulgação em uma quantidade eficaz para estimular a resposta imune. Em um aspecto, o sujeito tem, teve ou está com necessidade de tratamento para câncer ou tumor. Em outro aspecto, o câncer é caracterizado como sendo hiporresponsivo. Em um aspecto adicional, um método para estimular uma resposta imune a um câncer ou célula tumoral é fornecido, o método compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em contatar a população de células-alvo com o anticorpo da divulgação, em que o contato é in vitro ou in vivo. Um exemplo particular de interação direta é a ligação. Um exemplo particular de uma interação indireta é quando uma entidade atua sobre uma molécula intermediária, que por sua vez atua sobre a segunda entidade referenciada. O contato, como usado na presente invenção, inclui em solução, em fase sólida, in vitro, ex vivo, em uma célula e in vivo. O contato in vivo pode ser referido como administrando ou administração. Em outro aspecto, o câncer ou tumor é caracterizado como sendo hiporresponsivo. Em um aspecto, o anticorpo é selecionado para ligação específica ao câncer ou célula tumoral. As células podem ser de qualquer espécie, por exemplo, um mamífero ou uma célula humana. Elas podem ser isoladas de um sujeito (por exemplo, de uma biópsia) ou de uma célula em cultura. Em outro aspecto, o câncer ou células tumorais expressam ou superexpressam Lym1 ou Lym2.
[0296] Também é fornecido na presente invenção um método para fornecer imunidade antitumoral em um sujeito, o método compreendendo ou alternativamente consistindo essencialmente ou ainda consistindo adicionalmente em administrar ao sujeito as células que expressam CAR fornecidas na presente invenção, o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo e/ou o polipeptídeo em uma quantidade eficaz para fornecer imunidade ao sujeito. As células que expressam CAR fornecidas na presente invenção, o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo e/ou o polipeptídeo são fornecidos para evitar que os sintomas ou câncer ocorram em um sujeito que está predisposto ou ainda não apresenta sintomas do câncer.
[0297] Em algumas modalidades, as células que expressam CAR fornecidas na presente invenção, o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno do mesmo e/ou o polipeptídeo podem ser aplicados ou administrados em uma cavidade formada pela ressecção de tecido tumoral (ou seja, aplicação intracavitária) ou diretamente em um tumor antes da ressecção (ou seja, aplicação intratumoral). Em algumas modalidades, o anticorpo divulgado pode ser administrado por via intravenosa, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou por outros meios adequados de administração.
[0298] As composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser administradas de uma maneira apropriada para a doença a ser tratada ou prevenida. A quantidade e a frequência de administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente e o tipo e gravidade da doença do paciente, embora as dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.
[0299] Para os métodos acima, uma quantidade eficaz é administrada e a administração da célula ou população serve para atenuar qualquer sintoma ou prevenir o surgimento de sintomas adicionais. Quando a administração tem o propósito de prevenir ou reduzir a probabilidade de recorrência ou metástase do câncer, a célula ou as composições podem ser administradas antes de qualquer sintoma visível ou detectável. As vias de administração incluem, mas sem limitação, oral (como um comprimido, cápsula ou suspensão), tópica, transdérmica, intranasal, vaginal, retal, intravenosa subcutânea, intra- arterial, intramuscular, intraóssea, intraperitoneal, epidural e intratecal.
[0300] Os métodos fornecem um ou mais dos seguintes: (1) prevenir que os sintomas ou doença ocorram em um sujeito que está predisposto ou ainda não apresenta sintomas da doença; (2) inibir a doença ou interromper seu desenvolvimento; ou (3) melhorar ou causar regressão ou recidiva da doença ou dos sintomas da doença. Conforme entendido na técnica, “tratamento” é uma abordagem para obter resultados benéficos ou pretendidos, incluindo resultados clínicos. Para os fins da presente tecnologia, os resultados benéficos ou pretendidos podem incluir um ou mais, mas não estão limitados a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estado estabilizado (ou seja, sem agravamento) de uma condição (incluindo doença), atraso ou desaceleração da condição (incluindo doença), progressão, melhoria ou paliação da condição (incluindo doença), estados e remissão (seja parcial ou total), sejam detectáveis ou indetectáveis. Os tratamentos contendo as composições e métodos divulgados podem ser terapia de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha, quinta linha e se destinam a ser usados como uma terapia única ou em combinação com outras terapias apropriadas, por exemplo, recessão cirúrgica, quimioterapia, radiação. Em um aspecto, o tratamento exclui a profilaxia.
Kits
[0301] Em um aspecto particular, a presente divulgação fornece kits para realizar os métodos da presente divulgação, bem como instruções para realizar os métodos da presente divulgação. O kit compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou ainda consiste em um ou mais dentre o anticorpo, o CAR, o fragmento de ligação de antígeno, o polipeptídeo, o ácido nucleico isolado, o vetor, a célula isolada e/ou a composição da presente divulgação e instruções de uso.
[0302] Os kits são úteis para detectar a presença de polipeptídeos Lym1 ou Lym2 em uma amostra biológica, por exemplo, qualquer fluido corporal incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, expectoração, soro, plasma, linfa, fluido cístico, urina, fezes, fluido cerebrospinal, fluido ácido ou sangue e incluindo amostras de biópsia de tecido corporal. As amostras de teste também podem ser uma célula tumoral, uma célula normal adjacente a um tumor, uma célula normal correspondente ao tipo de tecido tumoral, uma célula sanguínea, um linfócito de sangue periférico ou combinações dos mesmos. A amostra de teste usada no método descrito acima irá variar com base no formato do ensaio, natureza do método de detecção e os tecidos, células ou extratos usados como a amostra a ser testada. Os métodos para a preparação de extratos de proteína ou extratos de membrana de células são conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados de modo a obter uma amostra que seja compatível com o sistema utilizado.
[0303] Os componentes do kit (por exemplo, reagentes) podem ser empacotados em um recipiente adequado. O kit também pode compreender, ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir adicionalmente em, por exemplo, um agente tamponante, um conservante ou um agente estabilizante de proteína. O kit pode compreender adicional ou alternativamente consistir essencialmente em, ou ainda consistir adicionalmente em componentes necessários para detectar o marcador detectável, por exemplo, uma enzima ou um substrato. O kit também pode conter uma amostra de controle ou uma série de amostras de controle, que podem ser analisadas e comparadas com a amostra de teste. Cada componente do kit pode ser colocado dentro de um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de um único pacote, junto com instruções para interpretar os resultados dos ensaios realizados com o uso do kit. Os kits da presente divulgação podem conter um produto escrito no, ou dentro do, recipiente do kit. O produto escrito descreve como usar os reagentes contidos no kit.
[0304] Conforme adequado, estes componentes de kit sugeridos podem ser embalados de uma maneira usual para uso por aqueles versados na técnica. Por exemplo, estes componentes de kit sugeridos podem ser fornecidos em solução ou como uma dispersão líquida ou semelhante.
Métodos Experimentais: Experimento nº. 1 Caracterização de anticorpos Lym-1 e Lym-2 humanizados
[0305] Dois anticorpos Lym-1 humanizados e um anticorpo Lym-2 humanizado foram produzidos por enxerto de CDR. Os anticorpos humanizados mostraram menor capacidade de ligação do que seus anticorpos quiméricos parentais (FIG.1 e FIG. 4).
Expressão e avaliação funcional de células T humanas primárias transduzidas por huLym-1-A in vitro
[0306] huLym-1-A, huLym-1-B e huLym-2 CAR podem ser expressos em células T humanas primárias, conforme detectado por anticorpo anti-Lym-1 idiótipo ou Proteína-L (FIG.2 e FIG.5). A morte específica do epítopo mediada por huLym-2CAR contra ARH-77 é mostrada na FIG. 4.
Células T huLym-1CAR induziram remissão completa em xenoenxertos de Raji
[0307] Em camundongos tratados com células T Lym-1 e huLym-1 CAR, apenas a bioluminescência de fundo foi detectada e o efeito antitumoral foi durável ao longo do experimento de 60 dias (FIG. 3A-FIG. 3C). Nos cinco camundongos que receberam células T e PBS com transdução simulada, a carga do tumor progrediu e todos os camundongos foram sacrificados no dia 27 devido à paralisia da perna traseira, com sobrevida média de 20 dias. (FIG. 3A, FIG. 3C).
Linhagens de Células
[0308] A linhagem de células ARH-77 foi adquirida junto à American Type Tissue Collection (ATCC, Manassas, VA). A linhagem de células ARH-77 eGFP/Luc foi gerada em laboratório por meio da transdução de ARH-77 parental com o vírus eGFP/Luc. As células Raji/Luc-GFP foram um presente de Dr. Yvonne Y. Chen da Universidade da Califórnia, em Los Angeles. Todas as linhagens de células foram cultivadas em RPMI- 1640 suplementado com 10% de FCS dialisado (dFCS, Hyclone, Logan, UT), 2% de Glutamina e 1% de Pen/Strep (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). As células HEK-293 LTV (Cell Biolabs Inc, San Diego, CA) utilizadas para a produção de lentivírus foram cultivadas em DMEM (Corning, Manassas, VA) suplementado com 10% de dFCS, 2% de Glutamina e 1% de Pen/Strep. As células de linfoma T humano Jurkat foram obtidas da ATCC e mantidas em cultura em meio RPMI-1640 contendo 10% de FCS, 1% de glutamina e 1% de Pen/Strep.
Caracterização de Anticorpo Humanizado
[0309] As capacidades de ligação de Lym-1 e Lym-2 humanizados foram avaliadas contra as linhagens de células Raji e ARH-77, respectivamente, por análise de citometria de fluxo. Em cada situação, 5
× 105 as células-alvo em 100 µl de tampão de lavagem foram incubadas com concentrações crescentes de anticorpos a 4 °C por 30 min. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de lavagem (2% de FBS, PBS) antes de adicionar 2 ug de IgG anti-humana de cabra de conjugado com (AF488) (Thermo-fisher). As células marcadas foram então incubadas a 4 ºC por mais 30 min. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi medida e quantificada por citometria de fluxo.
Construção e preparação de vetores de lentivírus
[0310] Os genes codificador para Lym-1-41BB3zCAR, huLym-1-A- 41BB3zCAR, huLym-1-B-41BB3zCAR e huLym-2-41BB3zCAR foram ligados ao vetor lentiviral pLVX-EF1α-IRES-Zsgreen (Clontech, Mountain View, Mountain View, CA) por meio dos sítios de restrição EcoRI e MluI. O lentivírus foi produzido por cotransfecção transitória dos vetores de transferência de CAR consistindo nos plasmídeos de empacotamento psPAX2 e pMD2.G (Addgene) e na linhagem de células HEK-293LTV. Os sobrenadantes contendo partículas virais foram coletados 24 e 48 horas após a transfecção e foram combinados, filtrados e concentrados por ultracentrifugação. O vírus sedimentado foi então ressuspenso em PBS suplementado com BSA a 1% e trealose a 7%, dividido em alíquotas e armazenado a -80 ºC. Os títulos virais foram medidos por transdução de 106 células T Jurkat com diluições em série de 10 vezes de vetor de vírus. Quarenta e oito horas após a transdução, as células foram marcadas com anticorpo idiótipo anti-Lym-1 marcado com biotina desenvolvido em laboratório ou Protein L biotinilada (Genescript) e detectada por estreptavidina conjugada com APC (BioLegend). As células transduzidas positivamente em uma faixa de 10 ~ 20% foram usadas para calcular as unidades de transdução (TU - “transducing units”) de vírus pela seguinte fórmula: TU/mL = (106 células semeadas × % de células positivas × 1.000)/μl de vetor de vírus.
Isolamento e transdução de células T primárias
[0311] As preparações de revestimento leucocitário humano foram adquiridas de Zenbio Inc. (Research Triangle Park, NC) e utilizadas para obter células mononucleares de sangue primárias (PBMCs) para procedimentos de transdução. As PBMCs foram isoladas usando Ficoll- Paque (Life Technologies, Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante seguido por procedimentos de isolamento de células T com o uso de um kit de seleção negativa de células T (Stem Cell Technologies, Seattle, WA). As células isoladas foram então cultivadas em meio de células T (43% de Clicks, 43% de RPMI 1640, 2% de Glutamax, 10% de dFCS, 1% de solução de aminoácidos não essenciais e 1% de solução de Pen/Strep). Três dias antes da transdução, as células T foram ativadas pela adição de esferas anti-CD3/CD28 (Life Technologies, Inc.) em uma razão de 1:1 e, em seguida, transduzidas por centrifugação a 800 g por 90 min com lentivírus (MOI = 15) e Lentiblast (OZ Bioscience, San Diego, CA). A transdução foi realizada uma vez, seguida por uma mudança de meio após 24 horas, após o que as células foram transferidas para placas G- Rex de 24 poços (Wilson Wolf, St Paul, MN) suplementadas com meio de células T recém-preparado. As células T foram utilizadas para os ensaios no Dia 10 após a transdução. A eficiência da transdução do vírus CAR foi avaliada por citometria de fluxo no Dia 10 usando anticorpo anti-Lym-1 idiótipo biotinilado seguido por detecção com estreptavidina conjugada com APC. Transduções de mock foram conduzidas como controles negativos, conforme descrito acima, mas na ausência de um vetor de vírus viável.
Citotoxicidade
[0312] As preparações de células T CAR efetoras transduzidas foram ajustadas para serem 50% positivas para células T CAR pela adição de células T Mock. Estas preparações ajustadas foram incubadas com 0,1 milhão de células Raji Luc/eGFP com razões de células T CAR para alvos de 2:1, 1:1, 0,5:1 e 0,25:1, cada uma em placas de 96 poços de fundo plano por 24 horas na ausência de citocinas adicionadas. Leituras luminescentes de células Raji sem células efetoras foram usadas como controles. Diluições em série de duas vezes de 0,2 milhões de Raji Luc/eGFP foram usadas para gerar uma curva padrão para correlacionar células vivas a leituras luminescentes. O número de células-alvo vivas após incubações de 24 horas foi calculado correlacionando as leituras do sinal luminescente com a curva padrão. A porcentagem de lise celular foi calculada pela seguinte fórmula: #𝑅𝑎𝑗𝑖 𝑛𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒−#𝑅𝑎𝑗𝑖 𝑛𝑜 𝑒𝑓𝑒𝑡𝑜𝑟 % de Lise = ( ) × 100% #𝑅𝑎𝑗𝑖 𝑛𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 Estudos de xenoenxerto de Raji/Luc-eGFP em camundongos NOD Scid-IL2Rgammanull (NSG)
[0313] Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da USC (Protocolo nº 20585). Camundongos NSG machos com oito semanas de idade adquiridos junto à Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) foram alojados no biotério da USC em gaiolas estéreis. Um milhão de células Raji/Luc-GFP em 100 µl de PBS foram injetadas por via intravenosa (i.v.) através da veia lateral da cauda com o uso de uma seringa de insulina (designado como Dia 0). A atividade da luciferase foi medida no dia 7 por meio de imageamento de bioluminescência para avaliar a carga do tumor. No Dia 8, 1 milhão de células T Mock, Lym-1-41BB3zCAR, huLym-1-B-41BB3zCAR e huLym-1-B-DAPCAR foram preparados em 100 µl de PBS e injetadas i.v. usando seringas de insulina. O peso corporal do camundongo foi medido duas vezes por semana, e a progressão do tumor foi monitorada por imagens de bioluminescência com o uso de um sistema de imageamento IVIS junto à USC Core Molecular Imaging Center.
Experimento nº: 2
Linhagens de células
[0314] As células Raji/Luc-GFP foram um presente de Dr. Yvonne Y. Chen da Universidade da Califórnia, em Los Angeles. Todas as linhagens de células foram cultivadas em RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS dialisado (dFCS, Hyclone, Logan, UT), 2% de Glutamina e 1% de Pen/Strep (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). As células HEK-293 LTV (Cell Biolabs Inc, San Diego, CA) utilizadas para a produção de lentivírus foram cultivadas em DMEM (Corning, Manassas, VA) suplementado com 10% de dFCS, 2% de Glutamina e 1% de Pen/Strep. As células de linfoma T humano Jurkat foram obtidas na American Type Tissue Collection (Manassas, Va) e mantidas em cultura em meio RPMI-1640 contendo 10% de FCS, 1% de glutamina e 1% de Pen/Strep.
Construção e preparação de vetores de lentivírus
[0315] O gene de codificação para Lym-1-41BB3zCAR, huLym-1-B- 41BB3zCAR e huLym-1-B-DAPCAR, foram ligados ao vetor lentiviral pLVX-EF1α-IRES-Zsgreen (Clontech, Mountain View, CA) através dos sítos de restrição EcoRI e MluI. O lentivírus foi produzido por cotransfecção transitória dos vetores de transferência de CAR consistindo em plasmídeos de empacotamento, psPAX2 e pMD2.G (Addgene) e células HEK-293LTV(8). Os sobrenadantes contendo partículas virais foram coletados 24 e 48 horas após a transfecção e foram combinados, filtrados e concentrados por ultracentrifugação. O vírus sedimentado foi então ressuspenso em PBS suplementado com BSA a 1% e trealose a 7%, dividido em alíquotas e armazenado a -80 ºC. Os títulos virais foram medidos por transdução de 106 células T Jurkat com diluições em série de 10 vezes de vetor de vírus. Quarenta e oito horas após a transdução, as células foram marcadas com anticorpo idiótipo anti-Lym-1 marcado com biotina desenvolvido no laboratório do requerente e detectado por estreptavidina conjugada com APC (BioLegend). As células transduzidas positivamente em uma faixa de 10 ~ 20% foram usadas para calcular as unidades de transdução (TU - “transducing units”) de vírus pela seguinte fórmula: TU/mL = (106 células semeadas × % de células positivas ×
1.000)/μl de vetor de vírus.
Isolamento e transdução de células T primárias
[0316] As preparações de revestimento leucocitário humano foram adquiridas de Zenbio Inc. (Research Triangle Park, NC) e utilizadas para obter células mononucleares de sangue primárias (PBMCs) para procedimentos de transdução. As PBMCs foram isoladas usando Ficoll- Paque (Life Technologies, Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante seguido por procedimentos de isolamento de células T com o uso de um kit de seleção negativa de células T (Stem Cell Technologies, Seattle, WA). As células isoladas foram então cultivadas em meio de células T (43% de Clicks, 43% de RPMI 1640, 2% de Glutamax, 10% de dFCS, 1% de solução de aminoácidos não essenciais e 1% de solução de Pen/Strep). Três dias antes da transdução, as células T foram ativadas pela adição de esferas CD3/CD28 (Life Technologies, Inc.) em uma razão de 1:1 e, em seguida, transduzidas por centrifugação a 800 g por 90 min com lentivírus (MOI = 15) e Lentiblast (OZ Bioscience, San Diego, CA). A transdução foi realizada uma vez, seguida por uma mudança de meio após 24 horas, após o que as células foram transferidas para placas G- Rex de 24 poços (Wilson Wolf, St Paul, MN) suplementadas com meio de células T fresco. As células T foram utilizadas para os ensaios no Dia 10 após a transdução. A eficiência da transdução do vírus CAR foi avaliada por citometria de fluxo no Dia 10 usando anticorpo anti-Lym-1 idiótipo biotinilado seguido por detecção com estreptavidina conjugada com APC. Transduções de mock foram conduzidas como controles negativos, conforme descrito acima, mas na ausência de um vetor de vírus viável.
Citotoxicidade
[0317] As preparações de células T CAR efetoras transduzidas foram ajustadas para serem 50% positivas para células T CAR pela adição de células T Mock. Estas preparações ajustadas foram incubadas com 0,1 milhão de células Raji Luc/eGFP com razões de células T CAR para alvos de 2:1, 1:1, 0,5:1 e 0,25:1, cada uma em placas de 96 poços de fundo plano por 24 horas na ausência de citocinas adicionadas. Leituras luminescentes de células Raji sem células efetoras foram usadas como controles. Diluições em série de duas vezes de 0,2 milhões de Raji Luc/eGFP foram usadas para gerar uma curva padrão para correlacionar células vivas a leituras luminescentes. O número de célulasalvo vivas após incubações de 24 horas foi calculado correlacionando as leituras do sinal luminescente com a curva padrão. A porcentagem de lise celular foi calculada pela seguinte fórmula: #𝑅𝑎𝑗𝑖 𝑛𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒−#𝑅𝑎𝑗𝑖 𝑛𝑜 𝑒𝑓𝑒𝑡𝑜𝑟
[0318] % de Lise = ( ) × 100% #𝑅𝑎𝑗𝑖 𝑛𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 Estudos de xenoenxerto de Raji/Luc-eGFP em camundongos NOD Scid-IL2Rgammanull (NSG)
[0319] Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da USC (Protocolo nº 20585). Camundongos NSG machos com oito semanas de idade adquiridos junto à Jackson Laboratories foram alojados no biotério da USC em gaiolas estéreis. Um milhão de células Raji/Luc-GFP em 100 µl de PBS foram injetadas por via intravenosa (i.v.) através da veia lateral da cauda com o uso de uma seringa de insulina (designado como Dia 0). A atividade da luciferase foi medida no dia 7 por meio de imageamento de bioluminescência para avaliar a carga do tumor. No Dia 8, 1 milhão de células T Mock, Lym-1-41BB3zCAR, huLym-1-B-41BB3zCAR e huLym- 1-B-DAPCAR foram preparados em 100 µl de PBS e injetadas i.v. usando seringas de insulina. O peso corporal do camundongo foi medido duas vezes por semana, e a progressão do tumor foi monitorada por imagens de bioluminescência com o uso de um sistema de imageamento IVIS junto à USC Core Molecular Imaging Center.
Expressão e avaliação funcional de células T humanas primárias transduzidas por huLym-1-B-DAPCAR in vitro
[0320] A construção de huLym-1-B-DAPCAR era composta por uma dobradiça de CD8a e domínio transmembrana (TM) que permite a ancoragem de membrana celular seguida pela região citoplasmática de DAP10 e DAP12 na orientação de DAP10-DAP12 (FIG.7). A especificidade da célula T CAR é dirigida por scFv obtido do anticorpo huLym-1-B. Esta nova construção foi expressa com sucesso em células T humanas primárias, conforme detectado por um anticorpo anti-Lym-1 idiótipo (FIG. 8) e exerce citotoxicidade contra a linhagem de células Raji Lym-1 positiva, uma linhagem de células de linfoma de Burkitt africano positiva para EBV (FIG. 10). Mais importantemente, as células T transduzidas com DAPCAR tinham perfis de proliferação semelhantes às células T mock e retiveram a expressão do transgene após estimulação repetida com esferas anti-CD3/CD28 (FIGS. 9A-9B). Significativamente, no entanto, as células T CAR com base em 41BB3z mostraram uma diminuição progressiva na população positiva para CAR (FIGS. 9A-9B).
As células T huLym-1-B-DAPCAR exibiram controle de tumor superior em xenoenxertos Raji
[0321] Os efeitos antitumorais de diferentes construções foram avaliados no modelo de xenoenxerto de Raji eGFP/Luc. Para esses estudos, um número 10 vezes menor de células T CAR foi usado para que as diferenças na potência de cada grupo pudessem ser melhor avaliadas. Os resultados desses estudos in vivo são mostrados na Figura 10 e mostram o seguinte. Todos os camundongos no grupo de células T Mock sucumbiram à progressão do tumor no dia 22 (FIGS. 11A-11D). Por outro lado, os camundongos nos grupos tratados com células T CAR mostraram melhora significativa e taxas de sobrevida (FIG. 11B). Para o grupo de Lym-1-41BB3z de murino, no entanto, o tumor progrediu após o dia 21 (FIG. 11A) e finalmente causou paralisia da perna traseira. Neste grupo, apenas dois camundongos sobreviveram ao Dia 44 (FIG. 11B). Nos camundongos tratados com células T huLym-1-B-41BB3zCAR, a progressão drástica do tumor foi observada após o dia 21, mas um camundongo desenvolveu paralisia da perna traseira no dia 42 e 2/4 dos camundongos tinham carga tumoral muito alta no dia 44, como evidenciado por imageamento com bioluminescência (FIGS. 11A-11C). Em contraste, as células T huLym-1-B-DAP CAR induziram um controle do tumor mais consistente e nenhum camundongo desenvolveu paralisia da perna traseira no dia 44 (FIGS. 11A-11C). Além disso, houve perda de peso significativamente menor no huLym-1-B-DAPCAR em comparação com os grupos tratados com células T CAR de segunda geração usando o domínio de sinalização 4-1BB-CD3ζ (5 vs 20% de perda de peso). Estes resultados sugerem uma vida mais segura e eficaz desta nova construção DAP em comparação com células T CAR com base na segunda geração.
Experimento nº: 3
[0322] Este experimento demonstra a utilidade de uma parte de sinalização DAP para células T CAR e o desenvolvimento de uma modalidade de terapia celular para tratar tumores positivos para Lym-1.
Camundongos
[0323] Os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da USC (IACUC 20585) e envolveram camundongos NSG de 8-13 semanas de idade (fêmeas e machos) adquiridos junto à Jackson Laboratories ou criados nas instalações de animais USC sob IACUC 20697.
Citocinas e Anticorpos
[0324] Os anticorpos anti-261tag chLym-1, IL-7-Fc, IL-15-Fc e
Dylight 650 foram desenvolvidos e preparados no laboratório do Requerente. Os anticorpos comerciais usados foram: IgG anti-humana de cabra conjugado com Alexa 488 (H+L) (ThermoFisher, nº de Catálogo A- 11013), Alexa Fluor 647 anti-human IgG Fc (Biolegend, nº de Catálogo 409320), CD3𝜁 fosforilado com ficoeritrina (PE) anti-humana (pY142) (BD Sciences, nº de Catálogo 558448), CD22 de camundongo anti-humano de PE (Biolegend, nº de Catálogo 302506), CD19 anti-humano de camundongo PE (Biolegend, nº de Catálogo 302254), PD-1 anti-humano de camundongo PE (Biolegend, nº de Catálogo 329906 ), LAG-3 anti- humana de camundongo PE (Biolegend, nº de Catálogo 369306).
Reagentes
[0325] Os reagentes usados para conduzir esses estudos incluem: RPMI-1640 (Genesee Scientific, Lote nº0519108), DMEM (Genesee Scientific, Lote nº05191016), Soro fetal bovino dialisado (dFCS) (Hyclone, nº de Catálogo SH30079.03), GlutaMAX (ThermoFisher, nº de Catálogo 35050-061), Penicilina/estreptomicina (Corning, nº de Catálogo 30-002- CI), aminoácidos não essenciais (Genesee Scientific, nº de Catálogo 25- 536), meio Click (SIGMA, nº de Catálogo C5572-500ML), EcoRI (NEB, nº de Catálogo R3101M), MluI (NEB, nº de Catálogo R3198L), psPAX2 (Addgene,nº de Catálogo 12260), pMD2.G (Addgene, nº de Catálogo 12259), Xfect (Clontech, nº de Catálogo 631418), Ficoll-Paque (Life Technologies, nº de Catálogo GE17-1440-02), Kit de isolamento de células T humanas EasySep (STEMCELL, nº de Catálogo 19051), di- hidrato de D-(+)-Trealose (SIGMA, nº de Catálogo 90210-50G), Lentiblast (OZBiosciences, nº de Catálogo LB01500), Placas G-Rex de 24 poços (Wilson Wolf,nº de Catálogo 80240M), Dynabeads humano T-ativador CD3/CD28 (ThermoFisher, nº de Catálogo 11131D), ativator de células T ImmunoCult humana CD3/CD28/CD2 (STEM CELL, nº de Catálogo 10970), kit ELISA IL-2 (ThermoFisher, nº de Catálogo EH2IL2 ), kit ELISA GM-CSF (ThermoFisher, nº de Catálogo EHGMCSF), e kit ELISA INF-
gamma (ThermoFisher, nº de Catálogo EHIFN), Tampão de erupção de permeabilização de coloração intracelular (Biolegend, nº de Catálogo 421002), e tampão FluoroFix (Biolegend, nº de Catálogo 422101), Sytox Verde (ThermoFisher, nº de Catálogo S7020), Contas de contagem absolutas CountBright (ThermoFisher, nº de Catálogo C36950).
Células
[0326] As linhagens de células Jurkat, K562, Daudi, Karpas-299, B35M, BALL-1, Chevallier e Raji foram obtidas junto à American Type Culture Collection (ATCC). As linhagens de células de linfoma humano SU-DHL-6(Epstein AL et al, 1974, 1851-72 doi 10.1002/1097- 0142(197412)34:6<1851::aid-cncr2820340602>3.0.co;2-4), SU-DHL- 10(1851-72 doi 10.1002/1097-0142(197412)34:6<1851::aid- cncr2820340602>3.0.co;2-4)e NU-DHL-1(Epstein AL et al, 1985, 619-27 doi 10.1002/ijc.2910350509) foram desenvolvidas internamente pelo Requerente. As células Raji-eGFP/Luc foram um presente de Dr. Yvonne Y. Chen da Universidade da Califórnia, em Los Angeles. Todas as linhagens de linfoma foram cultivadas em RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro dialisado (dFCS), 1% de GlutaMAX e 1% de penicilina/estreptomicina. As células HEK-293 LTV (Cell Biolabs, nº de Catálogo LTV-100) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de dFCS, 1% de GlutaMax, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de penicilina/estreptomicina. As células T humanas primárias foram enriquecidas a partir de casacos leucocitários humanos (Zen-Bio, CAR nº SER-BC-SDS) e cultivadas em meio de células T (43% de meio de Click, 43% de RPMI-1640, 10% de dFCS, 2% de GlutaMAX, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de penicilina/estreptomicina) suplementada com 50ng/mL de IL-7-Fc e 100ng/mL de IL-15-Fc. Todas as linhagens de células utilizadas foram rotineiramente testadas para contaminação por micoplasma usando o kit de detecção MycoFluor Mycoplasma (ThermoFisher, nº de Catálogo M7006).
Estudos de ligação de Lym-1 humanizado
[0327] FIG. 21A, FIG. 21B e FIG. 23B: Anticorpos em concentrações variando de 0,013 nM a 1300 nM em 100 µl foram incubados com 0,2 milhões de células Raji a 4 ºC por 30 minutos, seguido por três lavagens com tampão de lavagem (2% de FBS em PBS). Os anticorpos ligados foram então incubados durante 30 minutos com anticorpo secundário de IgG anti-humana (H+L) de cabra conjugada com Alexa Fluor (AF) 488 a uma concentração de 5 ug/mL ou por Fc de IgG anti-humana conjugado com AF 647 a 5 𝜇l por amostra. As células foram lavadas duas vezes e submetidas a análise de citometria de fluxo. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi registrada e plotada para avaliar a ligação do anticorpo. Para coloração na FIG.1c e 3c, 10 𝜇g dos anticorpos foram incubados com 0,2 milhões de células em 100 𝜇l a 4 ºC por 30 minutos. Depois de lavar como acima, 5 𝜇1 de Fc de IgG anti-humana conjugado com AF-647 foram adicionados às células em resíduos de tampão de lavagem para detecção. As amostras foram avaliadas com o uso de um citômetro de fluxo Attune (ThermoFisher) e analisadas usando o software Flowjo (BD).
Construção de vetores e preparação de lentivírus
[0328] Os genes de codificação para CAR foram sintetizados por Tecnologias Integradas de DNA (IDT) e ligados ao vetor lentiviral pLVX- EF1α-IRES-Zs verde (Clontech) através de sítios de restrição EcoRI e MluI. Para todas as construções CAR, um epítopo de 10 aminoácidos ‘‘AVPPQQWALS’’ (261-tag) derivado do fator de crescimento da placenta humana foi inserido diretamente após a sequência de scFv. O lentivírus foi produzido por transfecção transitória de HEK-293LTV seguindo um protocolo Xfect como descrito anteriormente (Zheng L et al, 2017, doi
10.3390/ijms18122773). Resumidamente, os vetores de transferência isoladamente com psPAX2 e pMD2.G (razão molar de 2:1:1) foram misturados e cotransfectados para células HEK-293LTV. Os sobrenadantes contendo partículas virais foram coletados 24 e 48 horas após a transfecção e foram combinados, filtrados e concentrados por ultracentrifugação a 20.000g por 2h. O vírus sedimentado foi então ressuspenso em PBS suplementado com BSA a 1% e trealose a 7%, dividido em alíquotas e armazenado a -80 ºC. Os títulos virais foram medidos por transdução de 106 células T Jurkat com diluições em série de 10 vezes de vetor de vírus. Quarenta e oito horas após a transdução, as células Jurkat foram lavadas e analisadas quanto à expressão do transgene por citometria de fluxo. As células transduzidas positivamente em uma faixa de 10 ~ 20% foram usadas para calcular as unidades de transdução (TU) de vírus pela seguinte fórmula: TU/mL = (106 células semeadas × % de células positivas × 1.000)/μl de vetor de vírus.
Isolamento, Transdução, Expansão e Análise de Células T Primárias
[0329] As preparações de casaco leucocitário humano foram adquiridas junto à Zenbio Inc. e usadas para obter células mononucleares de sangue primárias (PBMCs) para enriquecimento de células T. As PBMCs foram isoladas usando Ficoll-Paque seguido por isolamento de células T usando o Kit de isolamento de células T EasySep Humano de acordo com os protocolos dos fabricantes. As células isoladas foram então cultivadas em meio de células T. No dia 0, as células T foram ativadas pela adição do ativador T humano Dynabeads CD3/CD28 a uma razão de 1:1, e no dia 3 transduzidas por centrifugação a 1200 g por 45 min com lentivírus (MOI = 10) e Lentiblast. A transdução foi realizada uma vez, seguida por uma alteração de meio após 24 horas, após o que as células foram transferidas para placas G-Rex de 24 poços suplementadas com meio de células T recém-preparado. A eficiência de transdução foi avaliada por citometria de fluxo no dia 7 usando anticorpo anti-261tag conjugado com Dylight 650. Para a reestimulação, no dia 7, 20 μl de ativador de células T CD3/CD28/CD2 humano ImmunoCult foram adicionados com um milhão de células T em 2 ml de meio de células T e no dia 9, 5 ml de meio de células T foram adicionados. No dia 12, aproximadamente 5 ml de meio acima das células decantadas foram removidos e 5 ml de meio de células T recém-preparadas foram adicionados. No dia 14, a reestimulação adicional pode ser realizada com o mesmo procedimento no dia 7. ImmunoCult foi usado para reestimulação porque, nas mãos do Requerente, o estimulador dynabeads de CD3/CD28 promoveu a expansão de principalmente células T CD4+, enquanto o ativador de células T CD3/CD28/CD2 humana ImmunoCult levou a uma expansão equilibrada de células T CD4+ e CD8+. Para todas as contagens de células, foi utilizado o contador automático de células Countess (Invitrogen). A expressão de PD-1 e LAG- 3 em Células T Mock ou CAR foi avaliada nos dias 7 e 14 antes da reestimulação. Meio milhão de células foram incubadas com anticorpo anti-261tag conjugado com Dylight 650 e PD-1 ou anti-LAG-3 anti- humana conjugado com PE. As células marcadas foram então submetidas a análise de fluxo. “Células T mock” se refere a células T que foram realizadas através dos procedimentos acima, exceto que nenhum vírus foi adicionado na etapa de transdução no dia 3.
Ensaio de Citotoxicidade
[0330] Ensaios de citotoxicidade com base em luminescência: As células T CAR do dia 9, não reestimuladas no dia 7, foram ajustadas para 50% positivas para células T CAR pela adição de células T Mock. Estas preparações ajustadas foram incubadas com 0,1 milhão de células-alvo em várias proporções de células T CAR em placas de 96 poços de fundo plano por 24h sem a adição de citocinas. Leituras luminescentes de células-alvo sem células efetoras foram usadas como controle. Diluições em série de duas vezes de 0,2 milhões de células-alvo foram usadas para gerar uma curva padrão para correlacionar células vivas a leituras luminescentes. O número de células-alvo vivas após 24 horas de incubação foi calculado correlacionando as leituras do sinal luminescente com a curva padrão. A porcentagem de lise celular foi calculada pela seguinte fórmula: #Raji no controle−#Raji no efetor Lise% = ( ) × 100%. #Raji no controle
[0331] Ensaios de citotoxicidade com base em citometria de fluxo: Dois x 105 células T CAR foram incubadas com células-alvo em uma razão de 1:1 em placas de 24 poços. A porcentagem de células-alvo vivas em 1 h e 48 h após a mistura foi registrada e usada para calcular a% de lise pela seguinte fórmula: % de células−alvo vivas em 1h−% de células−alvo vivas em 48h Lise % = ( )× % de células−alvo vivas em 1h 100%.
Ensaios de secreção de citocinas
[0332] As células T Mock ou CAR do dia 9, não reestimuladas no dia 7, foram usadas para ensaios de secreção de citocinas. Dois x 105 as células efetoras e as células-alvo foram cocultivadas na ausência de citocinas adicionadas a uma razão de 1:1 em placas de 96 poços por 24 horas. Os sobrenadantes foram coletados e submetidos à medição de ensaio imunoenzimático (ELISA) de acordo com as instruções do fabricante.
CD3-𝜻 Ensaio de Fosforilação
[0333] Meio milhão de Células T Mock ou CAR do dia 9, não estimuladas no dia 7, foram fixadas e então coradas com 2 μg de anticorpo anti-261 tag conjugado com Dylight. As células marcadas foram permeabilizadas de acordo com as instruções do fabricante. As células permeabilizadas foram então coradas com anticorpo CD3 anti- humano fosforilado conjugado com PE𝜁 a 5 μl por amostra. As amostras foram lavadas e submetidas à análise de citometria de fluxo.
Experimentos de Infrarregulação de Antígeno
[0334] Experimentos ex vivo: Células T Mock ou CAR do dia 9, não reestimuladas no dia 7, foram usadas para este ensaio. As células tumorais (4x105) foram cocultivadas com 2x105 células T CAR em uma razão de E:T de 1:2 em 2 ml de meio de células T sem suplemento de citocinas por 24h. Cem µl de meio com células foram coletados e corados para CD22, Lym-1, CD19 e Sytox verde. Para Raji-eGFP/Luc, em vez de usar CD22, o GFP foi usado para identificar células tumorais. Após incubação à temperatura ambiente durante 20 min, 400 µl de PBS e 25 µl de microesferas de contagem foram adicionados a cada tubo. As amostras foram então submetidas a análise de citometria de fluxo. A intensidade média de fluorescência foi quantificada pelo software Flowjo.
Estudos de xenoenxerto Raji/Luc-eGFP em camundongos NOD Scid- IL2Rgammanull (NSG)
[0335] Um milhão de células Raji/Luc-GFP em 100 µl de PBS foram injetadas i.v. através da veia lateral da cauda (designada como dia 0). A atividade de luciferase foi medida no dia 6 por meio de imageamento de bioluminescência (BLI) para avaliar a carga do tumor. No mesmo dia, cinco milhões de células T Mock ou T CAR foram preparadas em 100 µl de PBS e injetadas i.v. usando seringas de insulina. A progressão do tumor foi monitorada por bioluminescência nos dias indicados com o uso de um Xenogen IVIS 200 no USC Molecular Imaging Center ou IVIS Lumina Series III no USC Translational Research Laboratory. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano vaporizado e administrados com D-luciferina (50mg/kg) por meio de injeção intraperitoneal antes do imageamento. Em alguns experimentos, conforme especificado nas legendas das figuras, a primeira medição BLI foi realizada no dia 7, seguida pela injeção com quantidade variável de células T Mock ou CAR no dia 8. Em todos os estudos, as células T Mock ou CAR do dia 9 (sem reestimulação no dia 7) foram usadas e a paralisia da perna traseira foi usada como ponto final para a eutanásia. Os dados de sobrevida são mostrados por gráficos de Kaplan-Meier e analisados pelo teste de log-rank.
Análise Estatística
[0336] Os gráficos foram traçados usando o software GraphPad Prism. Os dados foram analisados por meio do software SPSS (IBM). O método de análise estatística é indicado nas legendas das figuras. Salvo indicação em contrário, os dados são apresentados como médias ± SD, e p < 0,05 foi considerado significativo.
Resultados Seleção de anticorpo Lym-1 humanizado
[0337] O requerente demonstrou que as células T Lym-1-B-BB3z CAR induziram a remissão completa em camundongos com tumores Raji disseminados.(Zheng L et al, 2017, doi 10.3390/ijms18122773) Devido a esses resultados promissores, a humanização do anticorpo foi realizada para reduzir a imunogenicidade potencial do Lym-1 ScFv quando usado nas células T CAR para estudos futuros em pacientes. A humanização foi terceirizada para Oak BioScience e um painel de 12 anticorpos humanizados foi fornecido a nós (FIG. 21A). A capacidade de ligação desses anticorpos em células Raji foi medida por citometria de fluxo e o anticorpo huLym-1-B que apresentou a maior ligação em cada concentração testada foi escolhido para o desenvolvimento de células T CAR (FIG. 21A). O requerente, em seguida, produziu o anticorpo huLym- 1-B usando expressão transitória com a sequência fornecida internamente para auxiliar nessas avaliações. Em comparação com chLym-1, huLym-1-B se liga a células Raji com MFI reduzido e uma ED50 aproximadamente 2 vezes maior (FIG. 21B). Semelhante à sua ligação às células Raji, huLym-1-B mostra MFI ligeiramente menor que chLym-1 na maioria das linhagens de células positivas para Lym-1 (FIG. 21C). Tanto chLym-1 quanto huLym-1-B não se ligaram a células K562 indicando que huLym-1-B retém especificidade semelhante à do anticorpo Lym-1 parental (FIG. 21C).
As células T huLym-1-BB3zCAR são Altamente Funcionais, mas Apresentam Expansão Deficiente
[0338] Para gerar CAR contra o epítopo de Lym-1, os ScFvs derivados de Lym-1 ou huLym-1-B foram fundidos a uma estrutura de CAR de 2º geração convencional com domínios de sinalização de 4-1BB e CD3𝜁 (FIG. 22A). Um epítopo de 10 aminoácidos “AVPPQQWALS”‘ (261- tag) derivado do fator de crescimento de placenta humana foi inserido entre a dobradiça de ScFv e CD8a para permitir a detecção de CAR com o uso de um anticorpo interno (anticorpo anti-261 tag conjugado com Dylight 650) (FIG. 22A). Ambas as construções foram expressas com sucesso em células T primárias humanas com eficiência de transdução comparável (FIG. 22C). O requerente avaliou a seguir a citotoxicidade específica do epítopo de células T Lym-1- e huLym-1-B-BB3z CAR em linhagens de células K562-eGFP/Luc negativas para Lym-1 e Raji- eGFP/Luc positivas para Lym-1. As células T que expressam T Lym-1- ou huLym-1-B-BB3z CAR lisaram Raji eficientemente após a cocultura de um dia para o outro, enquanto a citotoxicidade aumentada não foi observada quando cocultivadas com células K562, indicando citotoxicidade específica de epítopo das duas células T CAR (FIG. 22D). Além disso, as células T Lym-1- e huLym-1-B-BB3z CAR, com uma dose de 5 milhões, erradicaram tumores de Raji-eGFP/Luc disseminados em camundongos NSG e levaram à sobrevida livre de tumor por pelo menos 60 dias (FIG. 13). No entanto, em resposta à estimulação de 𝛼- CD2/CD3/CD28, células T Lym-1- e huLym-1-B-BB3z CAR exibiram expansão deficiente (FIG. 22E). Dos dias 7 a 14, as células T Mock aumentaram aproximadamente 30 vezes, em comparação com menos que uma média de aumento de 4 vezes para as células T Lym-1- e huLym- 1-B-BB3z CAR (FIG. 22E). Além disso, o aumento da de CD3𝜁 foi observado em células positivas para Lym-1- e huLym-1-B-BB3z CAR, mas não em células T não transduzidas na mesma preparação, indicando ativação fraca de células CAR transduzidas (FIG. 22F, FIG. 22G). Consistente com estes resultados, as células T positivas para huLym-1- B-BB3z CAR também manifestaram expressão aumentada de PD-1 e LAG-3 (FIG. 22H, FIG. 22I). A fosforilação potencializada de CD3𝜁 e a expressão de receptores inibidores em células T CAR sugeriram que a proliferação deficiente surgiu do aumento da ativação do nível basal, ou seja, da sinalização tônica. Embora as células T huLym-1-B-BB3z CAR tenham mostrado forte atividade in vitro e in vivo, a proliferação limitada desafiaria a produção de células T huLym-1-B-BB3z CAR para aplicação clínica uma vez que a extensa expansão ex vivo é necessária para gerar doses terapêuticas ideais.
A Expansão Ex Vivo Deficiente das células T huLym-1-B-BB3z CAR é Dependente do Antígeno
[0339] As células T CD19-BB3z CAR consistindo em FMC63 ScFv foram geradas no laboratório do Requerente, uma construção com a mesma estrutura de CAR que huLym-1-B-BB3z, não mostrou a expansão deficiente observada com preparações de células T huLym-1-B-BB3z CAR.(Zheng L et al, 2017, doi 10.3390/ijms18122773) Esta diferença sugere que a causa envolve huLym-1-B ScFv. Lym-1 reconhece um epítopo conformacional em vários subtipos de HLA-DR(Rose LM et al, 1999, 789-97), mas a ligação de Lym-1 em células T humanas não foi relatada. O requerente postulou que a expressão esparsa do epítopo de Lym-1 anteriormente não relatada em células T ativadas pode ser suficiente para induzir a sinalização tônica dependente de ligante ou levar ao fratricídio mediado por CAR, qualquer um dos quais poderia causar expansão deficiente de células T huLym-1-B-BB3z CAR. Para testar esta hipótese, a ligação de Lym-1 e huLym-1-B às células T ativadas foi cuidadosamente avaliada e uma pequena, mas real, quantidade de ligação foi detectada (FIG. 23C). Para testar adicionalmente essa hipótese, duas construções CAR foram geradas. Em uma construção, duas mutações pontuais foram introduzidas na região de CDR3 dae cadeia pesada variável para interromper a capacidade de ligação de huLym-1-B e construir huLym-1-Bmut-BB3z CAR (FIG. 23A). A versão de anticorpo de huLym-1-B com as duas mutações em CDR3 (huLym-1-Bmut) também foi produzida. O huLym-1-Bmut tem aproximadamente uma ED50 25 vezes maior que huLym-1-B (ED50, 1,4x10-7 vs 5,9x10-9, FIG. 23B) quando medida contra células Raji e não mostrou ligação potencializada a células T em comparação com o isótipo (FIG. 23C). Embora a fosforilação de CD3ζ tenha sido encontrada em cerca de 5% das células T huLym-1-Bmut-BB3z CAR e PD-1 e LAG-3 tenham sido transitoriamente suprarreguladas no dia 7 (FIGS. 23E - 23G), as preparações de células T huLym-1-Bmut-BB3z CAR não exibiram expansão deficiente, sugerindo que o reconhecimento do epítopo era necessário para a deficiência (FIG. 23G).
[0340] Para determinar se a sinalização de CAR era necessária para impedir a expansão, uma segunda construção, huLym-1-B-BB3zY-F, foi gerada em que todas as 6 tirosinas nos três ITAMs do domínio CAR-CD3ζ foram convertidas em fenilalaninas (FIG. 23A). As células T HuLym-1-B- BB3zY-F CAR não tinham fosforilação de CD3ζ aumentada nem suprarregulação de PD-1 e LAG-3 e se expandiram tão eficientemente quanto as células T Mock, indicando que a sinalização envolvendo CAR- CD3ζ era necessária para a deficiência (FIG. 23G).
[0341] O requerente investigou em seguida se o fratricídio é uma causa substancial da expansão diminuída das células T huLym-1-B- BB3z CAR. O requerente descobriu que as células T huLym-1-B-BB3z CAR mostraram apoptose espontânea dramaticamente mais potencializada (~ 56%) do que a população negativa de CAR (~ 10%) na mesma preparação (FIG. 14A); além disso, o Requerente não observou apoptose acentuadamente aumentada de células T CD19-BB3z CAR quando foram cocultivadas de um dia para o outro com células T huLym- 1-B-BB3z CAR (FIG. 14B). Tomados em conjunto, esses resultados suportam a hipótese de que, em vez de fratricídio, a causa dominante da proliferação deficiente ex vivo da célula T huLym-1-B-BB3zCAR é a sinalização tônica de CAR dependente de ligante.
A Substituição de BB3z por DAP Permite Eficiência da Expansão ex vivo de células T huLym-1-B CAR
[0342] Em seguida, o requerente usou os domínios de sinalização de DAP para construir huLym-1-B-DAP CAR (FIG. 24A, FIG. 24B). HuLym-1-B-DAP CARs foram expressos com sucesso em células T primárias humanas com eficiência de transdução equivalente como huLym-1-BB3z CAR (FIG. 24D). Importantemente, a expansão ex vivo das células T huLym-1-B-DAP CAR não foi deficiente (FIG. 24C). Além disso, em comparação com as células T huLym-1-B-BB3z CAR, as células T huLym-1-B-DAPCAR não mostraram coloração espontânea potencializada de Anexina V em cultura (FIG. 14A) e exibiram menos AICD quando cultivadas com células Raji (FIG. 15). O requerente verificou que cerca de 10% das células T huLym-1-B-DAP CAR mostraram fosforilação de CD3ζ, em comparação com uma média de cerca de 30% em huLym-1-B-BB3z CAR (FIG. 24D, FIG. 24E). Consistente com os níveis basais de fosforilação de CD3ζ em células T huLym-1-B-DAP CAR, a expressão de PD-1 e LAG-3 também foi maior que das células T Mock, mas foram significativamente menores que das células T huLym-1-B-BB3z CAR no dia 14 (FIG. 24F, FIG. 24G). Juntos, esses dados demonstraram que as células T huLym-1-B-DAP CAR têm sinalização tônica diminuída e expansão normal.
As células T huLym-1-B-DAPCAR são Altamente Funcionais, Ambas In Vitro e In Vivo
[0343] Para avaliar a função efetora das células T huLym-1-B-DAP CAR in vitro, foram avaliadas a citotoxicidade e a liberação de citocinas em resposta a linhagens de células negativas (K562) e positivas (Raji) para o epítopo de Lym-1. As células T HuLym-1-B-DAP CAR lisaram as células Raji em proporção na razão de efetor para alvo aumentada, atingindo cerca de 80% de morte na razão de 2:1 após a cocultura de um dia para o outro (FIG. 25A). Nenhuma citotoxicidade potencializada foi evidente quando as células K562 foram usadas como células-alvo (FIG. 25A). Consistente com essas verificações, as células T huLym-1-B-DAP CAR também secretaram múltiplas citocinas quando cocultivadas com Raji, mas não com células K562 (FIG. 25B). Além disso, o Requerente avaliou a função das células T huLym-1-B-DAP CAR contra um painel de linfoma humano e linhagens de células B de leucemia com expressão variável do epítopo de Lym-1. Apesar da liberação de citocina altamente variável, as células T huLym-1-B-DAP CAR exibiram citotoxicidade equivalente (FIG. 16). Estes dados demonstraram que as células T huLym-1-B-DAP CAR retêm esta especificidade do anticorpo Lym-1 parental.
[0344] Em seguida, o requerente examinou a eficácia antitumoral in vivo de células T huLym-1-B-DAP CAR contra tumores de Raji disseminados em camundongos NSG. Para revelar melhor a função aprimorada conferida pelos domínios de sinalização de DAP, apenas 1 milhão de células T CAR foram injetadas em vez de 5 milhões de células e para aumentar a carga tumoral o tratamento de desafio foi dado no dia 8 após a injeção de células Raji em vez de no dia 6. Usando este protocolo modificado, um milhão de células T huLym-1-B-BB3z CAR foram incapazes de eliminar tumores de Raji e todos os camundongos sucumbiram à progressão do tumor no dia 51 (FIG. 25F, FIG. 25E, FIG. 25F). Em contraste, o tratamento com um milhão de células T huLym-1- B-DAP CAR levou a um controle durável do tumor e uma sobrevida significativamente melhor (FIG. 25F).
O Epítopo de Lym-1 Não se Infrarregula Rapidamente após o Envolvimento com huLym-1-B-DAP CAR
[0345] A recidiva é frequentemente observada no tratamento de malignidades de células B por células T CAR alvos de CD19 (CD19CAR) e essa infrarregulação representa um mecanismo importante que possibilita a resistência à terapia com CD19CAR. (Majzner RG et al, 2018, 1219-26 doi 10.1158/2159-8290.cd-18-0442 ) Uma estratégia para compensar o escape do antígeno é usar o alvo combinatório, como o CD22 alvo, que atualmente está sendo investigado na clínica.(Fry TJ et al, 2018, 20-8 doi 10.1038/nm.4441) Alternativamente, as células T CAR direcionadas contra antígenos que são menos propensos a infrarregular podem reduzir o escape de antígeno e aprimorar a eficácia terapêutica. Para determinar se as células T huLym-1-B-DAP CAR promovem a infrarregulação dos epítopos Lym-1, o requerente cocultivou as células Raji com células T Mock, huLym-1-B-DAP CAR ou CD19-BB3z CAR. Dentro de 24 horas, as células T huLym-1-B-DAP CAR e CD19-BB3z CAR inibiram o crescimento das células Raji (FIG. 26C, FIG. 26D). No entanto, houve notável infrarregulação do antígeno CD19 quando Raji foi cocultivado com células T CD19-BB3z CAR, enquanto nem a infrarregulação do epítopo CD19 nem de Lym-1 foi evidente quando cocultivado com células T huLym-1-B-DAP CAR (FIG. 26A, FIG. 26B). Resultados semelhantes foram obtidos a partir de um painel de linhagens de células de linfoma B humano (FIG. 17). Para determinar se a diferença foi devido ao uso do domínio de sinalização de DAP em vez do domínio BB3z, células T CD19-DAP CAR foram geradas e cocultivadas com Raji. A infrarregulação do antígeno CD19 em células Raji ainda ocorria (FIG. 18). Em contraste, a infrarregulação significativa do epítopo de Lym-1 não foi observada nas células Raji quando elas foram cocultivadas com células T huLym-1-B-BB3z ou huLym-1-B-DAP CAR (FIG. 18). Esses resultados indicam que a infrarregulação do alvo é atribuída a uma propriedade do antígeno, em vez do domínio de sinalização da construção
CAR.
[0346] Para avaliar a infrarregulação do epítopo in vivo, z expressão dos epítopos de CD19 e Lym-1 foi medida em células Raji obtidas da medula óssea de camundongos submetidos à terapia com células T CAR. Como visto ex vivo, uma infrarregulação significativa do antígeno CD19 em células Raji também foi observada quando camundongos NSG portadores de células Raji foram tratados com CAR CD19-BB3z (FIG. 26B). É importante ressaltar que nem o epítopo de Lym-1 nem o antígeno de CD19 foram infrarregulados durante o tratamento com células T CAR huLym-1-B-DAP (FIG. 26B). A eficácia antitumoral in vivo de células T huLym-1-B-DAP, CD19-BB3z e CD19-DAP CAR em camundongos NSG portadores de Raji disseminados também foi caracterizada em um protocolo em que no dia 0, 106 células Raji foram injetadas por via intravenosa, seguido por várias doses de células T Mock ou CAR no dia
8. Uma dose de tratamento com 2 milhões de células T huLym-1-B-DAP CAR levou à sobrevida livre de tumor por pelo menos 90 dias (FIG. 19B, FIG. 19C). Em contraste, a carga tumoral elevada existia na maioria dos camundongos NSG tratados com células T CD19-BB3z ou CD19-DAP CAR e todos os camundongos morreram no dia 79 na dose de 2 milhões de células (FIG. 19B, FIG. 19C). Além disso, neste modelo experimental, o aumento da dose de células T CD19 CAR para 5 milhões de células ainda não conseguiu atingir a sobrevida livre de tumor (FIG. 19B, FIG. 19C). Em resumo, verificou-se que o epítopo de Lym-1 não se infrarregula sob a pressão do tratamento de células T huLym-1-B-DAP CAR e esta característica pode ter contribuído para a eficácia superior in vivo das células T huLym-1-DAP CAR em comparação com as células T CD19- CAR.
Discussão
[0347] Os ensaios clínicos de células T CD19 CAR demonstraram a promessa de usar esta modalidade de terapia celular para tratar doenças malignas de células B resistentes e recidivantes. Apesar de suas altas taxas de resposta completa inicial, uma fração substancial de pacientes tratados recaem com tumores CD19-negativos ou CD19-baixos (Majzner RG et al., (2018), 1219-26 doi 10.1158/2159-8290.cd-18-0442), indicando a necessidade de identificar alvos eficazes adicionais. Aqui, o Requerente descreve o projeto e o desenvolvimento de células T CAR humanas projetadas direcionadas ao epítopo de Lym-1, que é altamente expresso na maioria dos linfomas e leucemias de células B humanas. (DeNardo GL et al., (1998), 239-54 doi 10.1089/cbr.1998.13.239; DeNardo GL et al., (1999), 1-11 doi 10.1089/hyb.1999.18.1) Ao substituir o domínio de sinalização 4-1BB3z convencional com DAP, o Requerente foi capaz de contornar a proliferação ex vivo deficiente de células T huLym-1-B-CAR induzida por interação sustentada de huLym- 1-B-CAR e epítopo de Lym-1 em células T (sinalização tônica). Além disso, as células T huLym-1-B-DAP CAR exibiram funções efetoras conduzidas por epítopo, conforme evidenciado pelo aumento de citotoxicidade in vitro, liberação de citocinas, bem como potente controle do tumor in vivo mesmo com doses reduzidas de células T CAR. Além disso, nem o epítopo de Lym-1 nem o antígeno de CD19 nas linhagens de células B se infrarregularam na presença de células T huLym-1-B-DAP CAR. Essas descobertas indicam que as células T huLym-1-B-DAP CAR parecem ser um produto de terapia celular promissor a ser explorado na clínica.
[0348] Durante o curso desses estudos, o Requerente observou a expansão deficiente de células T hLym-1-B-BB3z CAR que tem como alvo o epítopo de Lym-1, mas tal expansão limitada não foi encontrada em células T huLym-1-B-BB3z CAR com capacidade de ligação prejudicada (huLym-1-Bmut-BB3z) nem com atividade de CD3ζ ablacionada (huLym- 1-B-BB3zY-F). Estes dados sugeriram que a expansão limitada foi mediada pela ativação dependente de ligante da parte de sinalização de CD3ζ ITAMs na construção huLym-1-B-BB3z CAR. Esta observação é consistente com um relatório anterior de CAR de segunda geração com domínio de coestimulação de CD28 redirecionado contra GD2 (Long AH et al., (2015), 581-90 doi 10.1038/nm.3838) e ErbB2 (Zhao Y et al., (2009), 5563-74 doi 10.4049/jimmunol.0900447) onde a expansão limitada, morte celular induzida por ativação (AICD), exaustão progressiva e fraca eficácia in vivo foi atribuída à ativação irrestrita de CAR-CD3ζ. Em ambos os casos, a substituição do domínio de coestimulação de CD28 pelo domínio de sinalização de 4-1BB mitigou os efeitos adversos induzidos pela sinalização de CAR-CD3ζ crônica por meio de mecanismos não completamente compreendidos. Nas mãos do Requerente, no entanto, o domínio de coestimulação 4-1BB ainda resultou em uma preparação com fraca expansão in vitro de células T huLym-1-B-BB3z CAR.
[0349] Funções qualitativamente diferentes de ITAMs foram documentadas pela primeira vez por Combadiere et all, (Combadiere B et al., (1996), 2109-17) que relataram que a fosforilação do primeiro e do terceiro ITAMs em CD3ζ estimulou maior apoptose do que a fosforilação do segundo ITAM em células T. Consistente com esta observação, em um modelo de linfoma de células B de murino, Kochenderfer et all, demonstraram que as células T CD19 CAR anti-murino com primeiro e terceiro CAR-CD3𝜁 ITAMs mutados são resistentes à apoptose e podem mediar a eficácia anti-linfoma melhor do que o CD19CAR com 3 ITAMs funcionais. (Kochenderfer JN et al., (2010), 3875-86 doi 10.1182/blood- 2010-01-265041) Um estudo recente de Feucht et all, (Feucht J et al., (2018), doi 10.1038/s41591-018-0290-5) verificou que a ablação da função do segundo e terceiro ITAMs na parte CD3ζ de CD19CAR resultou em diferenciação de memória central preferencial, diminuição da exaustão de células T e aumento da persistência in vivo. Esses dados sugerem que cada ITAM é qualitativamente diferente e a seleção de ITAM(s) nos domínios de sinalização de CAR é uma abordagem para controlar o destino das células T do CAR.
[0350] Provas de outros (Long AH et al., (2015), 581-90 doi
10.1038/nm.3838; Zhao Y et al., (2009), 5563-74 doi 10.4049/ jimmunol.0900447.) e este relatório apoiou a hipótese de que a ativação crônica subótima de CAR-CD3ζ ITAMs é a causa de fenótipos aberrantes de células T CAR. O requerente, portanto, procurou mitigar esses efeitos adversos usando outros motivos contendo ITAM para substituir a parte CAR-CD3ζ, mantendo o potencial de ativação de células T. O requerente escolheu DAP12 porque tem motivos ITIM e ITAM no domínio intracelular que podem fornecer saída de sinal distinta em resposta à força diferencial de estímulos. (Peng Q et al., (2010), ra38 doi 10.1126/scisignal.2000500) DAP12 não tem domínios de reconhecimento na região extracelular. Seus receptores associados, como KIR2DS2 (Wang E et al., (2015), 815-26 doi
10.1158/2326-6066.cir-15-0054), TREM1 (Chen B et al., (2019), 1043- 55 doi 10.2217/imt-2019-0017)e NKp44 (Campbell KS et al., (2004), 899- 906) são responsáveis pelo reconhecimento do alvo e redirecionamento citolítico. Teng et all, (Teng MW et al., (2005), 38235-41 doi
10.1074/jbc.M505331200) e Wang et all, (Wang E et al., (2015), 815-26 doi 10.1158/2326-6066.cir-15-0054) demonstraram que a coexpressão ectópica de DAP12 com seus receptores modificados por scFv associados em células T de murino ou de humano mediou a erradicação de tumor de uma maneira específica para o antígeno, indicando que a ativação de DAP12 é suficiente para conduzir a citotoxicidade de células T. O mesmo conceito também foi demonstrado por um artigo recente usando TREM1 modificado com scFv como um correceptor para DAP12. (Chen B et al., (2019), 1043-55 doi 10.2217/imt-2019-0017) No projeto de construção de CAR do Requerente, em vez de usar um formato de múltiplas cadeias, o Requerente substituiu diretamente o domínio de sinalização de CD3ζ por DAP12 e usou DAP10 como coestimulação. O huLym-1-B-DAP CAR resultante abordou o problema de expansão in vitro que foi visto em huLym-1-B-BB3z e, mais importante, huLym-1-B-DAP CAR mediou significativamente melhor a eficácia in vivo do que huLym-1-B-BB3z CAR, embora os dois apresentassem citotoxicidade equivalente in vitro (FIG. 25). Esses resultados suportam ainda mais a conclusão de que a citotoxicidade in vitro é insuficiente para refletir na eficácia (Long AH et al., (2015), 581-90 doi 10.1038/nm.3838) in vivo e destaca o impacto do domínio de sinalização sobre a função in vivo das células T CAR.
[0351] Os resultados do requerente demonstram que o epítopo de Lym-1 não se infrarregula rapidamente após o envolvimento de CAR, ao contrário de CD19. Embora a trogocitose de células T CAR possa desempenhar um papel na infrarregulação do antígeno (Hamieh M et al., (2019), 112-6 doi 10.1038/s41586-019-1054-1), o requerente não observou a infrarregulação do epítopo de Lym-1 equivalente em um painel de linhagens de células de linfoma B humano quando cocultivadas com células T huLym-1-DAP CAR, sugerindo que a infrarregulação rápida do antígeno CD19 pode envolver outros mecanismos (FIG. 26; FIG. 18). A reticulação com o anticorpo anti-CD19 pode induzir a infrarregulação do antígeno CD19 por meio de endocitose mediada por receptor (Ingle GS et al., (2008), 46-58 doi 10.1111/j.1365-2141.2007.06883.x), indicando que a interação entre o antígeno de CD19CAR e CD19 pode contribuir para a infrarregulação do antígeno de CD19 de superfície. Embora a infrarregulação de CD19 em células tumorais sob a pressão de células T CD19CAR seja um processo reversível (Schneider D et al., (2017), 42 doi
10.1186/s40425-017-0246-1), a infrarregulação transitória do antígeno pode diminuir a eficácia antitumoral das células T CD19CAR e promover o escape imunológico do tumor (Hamieh M et al., (2019), 112-6 doi
10.1038/s41586-019-1054-1). Consistente com esta hipótese, nem CD19-BB3z nem CD19-DAP CAR foram capazes de induzir a sobrevida livre de tumor em uma dose de até 5 milhões no protocolo animal modificado, enquanto as células T huLym-1-B-DAP CAR mediaram um controle tumoral rápido e sustentado levando à sobrevida livre de tumor na dose mais baixa de 2 milhões de células (FIG. 19B, FIG. 19C). Curiosamente, o tratamento com CD19-DAP CAR induziu uma sobrevida significativamente melhor do que com o CD19-BB3z no nível de dose de 1 milhão de células (FIG. 19D), embora ambos os CARs tenham mostrado eficácia equivalente em doses de células mais altas (2 milhões e 5 milhões) (FIG. 19B, FIG. 19C). Deve-se notar, independentemente da dose de células T CAR, que nenhuma paralisia da perna traseira foi observada no CAR CD19-DAP antes do dia 41 (FIG. 19). Em contraste, o desenvolvimento anterior de paralisia da perna traseira (entre os dias 20 a 30) foi repetidamente visto em camundongos tratados com CD19-BB3z CAR (FIG. 19). Os mecanismos subjacentes e o significado dessa diferença ainda precisam ser investigados.
[0352] Em resumo, o trabalho do Requerente indica que as células T huLym-1-B-DAP CAR são promissoras para o tratamento de linfomas de células B positivas para Lym-1. A observação de que o domínio de sinalização de DAP pode contornar a proliferação deficiente induzida por sinalização dependente de ligante em CD3𝜁CAR baseado em manter uma eficácia antitumoral equivalente ou superior, destaca a importância da seleção do domínio de estimulação para o projeto do CAR e identifica um novo formato de estrutura do CAR para abordar efeitos adversos induzidos por sinalização tônica em células T. Além disso, os domínios de sinalização de DAP também podem aprimorar a função de outras preparações de células T CAR, mesmo se não houver evidência de sinalização tônica fraca. Finalmente, o relatório do Requerente sugere que a segmentação de um epítopo que não se infrarregula rapidamente após o envolvimento de CAR também pode contribuir para a eficácia sustentada das células T do CAR.
Modalidades
[0353] A seguinte modalidade descreve especificamente vários aspectos da presente divulgação.
[0354] Um anticorpo compreendendo: a. uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 ou 6 ou um equivalente de cada uma das mesmas; e/ou b. uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 ou 8 ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0355] O anticorpo, como descrito na presente invenção, em que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0356] O anticorpo, conforme descrito na presente invenção, em que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0357] O anticorpo, conforme descrito na presente invenção, em que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0358] O anticorpo, conforme descrito na presente invenção, em que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0359] Um anticorpo compreendendo: a. uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou um equivalente da mesma; e/ou b. uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou um equivalente da mesma.
[0360] O anticorpo como descrito na presente invenção, em que o anticorpo é um anticorpo de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM.
[0361] O anticorpo como descrito na presente invenção, em que o anticorpo compreende uma região constante.
[0362] O anticorpo como descrito na presente invenção, em que a região constante compreende uma região constante de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM.
[0363] O anticorpo, como descrito na presente invenção, em que a região constante é uma região constante de IgG1 ou uma região constante de Ig kappa.
[0364] Um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo conforme descrito na presente invenção.
[0365] O anticorpo como descrito na presente invenção, em que o anticorpo é um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou um anticorpo humanizado.
[0366] O anticorpo, como descrito na presente invenção, em que um equivalente compreende um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de aminoácidos com um polipeptídeo ou um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor com o complemento de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
[0367] Um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo como descrito na presente invenção.
[0368] O fragmento de ligação de antígeno, como descrito na presente invenção, em que o fragmento de ligação de antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, F(ab’)2, Fab’, scFv e Fv.
[0369] Um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 ou um equivalente de cada uma das mesmas.
[0370] Um receptor de Antígeno Quimérico (CAR) que compreende: (a) um domínio de ligação de antígeno do anticorpo, (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana e (d) um domínio de sinalização intracelular ou um domínio DAP.
[0371] Um receptor de Antígeno Quimérico (CAR) que compreende: (a) um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo, (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembrana e (d) um domínio DAP 10 e/ou DAP 12 intracelular. Em um aspecto, (d) compreende os domínios intracelulares DAP 10 e DAP 12. Em outro aspecto, o anticorpo é selecionado a partir de um anticorpo anti-Lym1, anti-Lym2 ou anti- CD19. Em um outro aspecto, o domínio de ligação de antígeno compreende um polipeptídeo ligante localizado entre o domínio variável HC e o domínio variável LC do anticorpo, por exemplo, um polipeptídeo da sequência (GGGGS)n em que n é um número inteiro de 1 a 6. O CAR pode compreender adicionalmente um polipeptídeo ligante localizado entre (a) a (d).
[0372] O CAR como descrito na presente invenção, compreendendo adicionalmente um polipeptídeo sinal localizado no terminal amina do domínio de ligação de antígeno do anticorpo.
[0373] O CAR, como descrito na presente invenção, compreendendo adicionalmente uma ou mais regiões de sinalização coestimulatória.
[0374] O CAR, como descrito na presente invenção, em que o domínio de dobradiça compreende um domínio de dobradiça de CD8 α ou de IgG1, o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana de CD28 ou CD8 α, uma ou mais regiões de sinalizações coestimulatórias são selecionadas a partir de CD27, CD28, 4- IBB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à função linfocitária-1 (LFA-1), CD2, CD7, CD27, LIGHT, NKG2C e B7-H3; e o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização de CD3 zeta.
[0375] O CAR, como descrito na presente invenção, compreende adicionalmente um polipeptídeo ligante localizado entre o domínio variável HC e o domínio variável LC.
[0376] O CAR descrito na presente invenção, em que o domínio DAP é DAP10 e/ou DAP12.
[0377] O CAR como descrito na presente invenção, compreendendo adicionalmente o peptídeo AVPPQQWALS inserido após os domínios variáveis HC e LC.
[0378] O anticorpo, como descrito na presente invenção, ou o CAR, como descrito na presente invenção, compreendendo adicionalmente um marcador detectável ou um marcador de purificação.
[0379] Uma sequência de ácidos nucleicos isolada, em que a sequência de ácidos nucleicos compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências aqui divulgadas na presente invenção, ou um equivalente de cada uma delas e, opcionalmente, ligada operativamente a um elemento promotor e/ou potencializador.
[0380] Uma sequência de ácidos nucleicos isolada que codifica o anticorpo ou CAR, como descrito na presente invenção.
[0381] A sequência de ácidos nucleicos isolada como descrito na presente invenção, compreendendo adicionalmente uma sequência de polinucleotídeo de peptídeo sinal localizada a montante do domínio de ligação de antígeno do anticorpo.
[0382] A sequência de ácidos nucleicos isolada, como descrito na presente invenção, em que o ácido nucleico isolado que codifica o CAR compreende adicionalmente uma sequência de polinucleotídeos de consenso Kozak localizada a montante do domínio de ligação de antígeno do anticorpo ou um potencializador.
[0383] A sequência de ácidos nucleicos isolada, como descrito na presente invenção, em que o ácido nucleico isolado que codifica o CAR compreende adicionalmente uma sequência de polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem 2A (T2A) localizado a montante do domínio de ligação de antígeno do anticorpo.
[0384] A sequência de ácidos nucleicos isolada, como descrito na presente invenção, em que o ácido nucleico isolado que codifica o CAR compreende adicionalmente uma sequência de polinucleotídeo que codifica resistência a antibióticos.
[0385] A sequência de ácidos nucleicos isolada, como descrito na presente invenção, em que o ácido nucleico isolado que codifica o CAR compreende adicionalmente um mecanismo de troca para controlar a expressão e/ou ativação de CAR.
[0386] Um vetor compreendendo a sequência de ácidos nucleicos isolada como descrito na presente invenção.
[0387] O vetor como descrito na presente invenção, em que o vetor é um plasmídeo ou um vetor viral.
[0388] O vetor, como descrito na presente invenção, em que o vetor é selecionado a partir de um grupo que consiste em um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral e um vetor viral adenoassociado.
[0389] O vetor como descrito na presente invenção, em que o vetor é um vetor CRISPR.
[0390] Uma célula isolada compreendendo o anticorpo e/ou o CAR e/ou o ácido nucleico isolado e/ou o vetor como descrito na presente invenção. Em um aspecto, a célula isolada é uma célula imune, por exemplo,
[0391] Uma composição que compreende um veículo e um ou mais dentre um anticorpo e/ou o fragmento de ligação de antígeno e/ou o polipeptídeo e/ou o CAR e/ou o ácido nucleico isolado e/ou o vetor e/ou o célula isolada como descrito na presente invenção.
[0392] Um método de produção do anticorpo, como descrito na presente invenção, que compreende a cultura da célula isolada, como descrito na presente invenção, em que a célula isolada é opcionalmente uma célula de mamífero.
[0393] Um método de produção de células que expressam anti-Lym CAR que compreende: a introdução de uma população de células imunes com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o anti-Lym que expressa CAR como descrito na presente invenção; e a seleção de uma subpopulação de células imunes que foram transduzidas com sucesso com a dita sequência de ácidos nucleicos. Em um aspecto, as células imunes são células T ou células NK. Em um aspecto, a população de células imunes foi modificada para reduzir ou eliminar a expressão de receptores de células imunes endógenas, por exemplo, em que a população de células imunes foi modificada com o uso de um método que emprega interferência de RNA ou CRISPR.
[0394] Um método para inibir o crescimento de um tumor e/ou tratar um câncer e/ou prevenir a recidiva do câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, que compreende a administração ao sujeito de uma ou mais de uma quantidade eficaz das células que expressam CAR geradas de acordo com um método como divulgado na presente invenção, uma quantidade eficaz do anticorpo como descrito na presente invenção, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno como descrito na presente invenção e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo como descrito na presente invenção. Esses métodos podem ser combinados com terapias convencionais, como ressecção de tumor ou quimioterapia tradicional.
[0395] Um método para inibir o crescimento de um tumor e/ou tratar um câncer e/ou prevenir a recidiva do câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, que compreende a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma ou mais das células que expressam CAR geradas de acordo com um método como descrito na presente invenção, uma quantidade eficaz do anticorpo como descrito na presente invenção, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno como descrito na presente invenção e/ou uma quantidade eficaz de um polipeptídeo como descrito na presente invenção em combinação com terapêutica anticâncer, inibidores de checkpoint, células T reguladoras (Treg), células supressoras derivadas de mieloide (MDSC), fluoruracila (5-FU), inibidores da histona desacetilase (HDAC), tratamento com IL-12, CpG (agonistas TLR9) e/ou estimulador de agonistas da via de genes do interferon (STING).
[0396] O método, como descrito na presente invenção, em que as células que expressam CAR são autólogas ou alogênicas para o sujeito a ser tratado e, opcionalmente, é uma terapia de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha ou quinta linha. Em um aspecto, em que o tumor ou célula cancerosa expressa ou superexpressa CD19, Lym1 e/ou Lym2. Em outro aspecto, o câncer ou tumor é selecionado do grupo de um carcinoma, um sarcoma ou uma leucemia. Em um aspecto adicional, o tumor ou câncer é linfoma de células B ou leucemia. Em um aspecto adicional, o tumor é um tumor sólido. Em outro aspecto, o tumor sólido é um melanoma, um carcinoma do cólon, um carcinoma da mama e/ou um tumor cerebral. Em outro aspecto, o sujeito é um humano, um animal, um primata não humano, um cachorro, um gato, uma ovelha, um camundongo, um cavalo ou uma vaca. Em um aspecto adicional, o método compreende adicionalmente a administração ao sujeito de uma terapia antitumoral diferente da terapia CAR.
[0397] Um método para inibir a proliferação de células cancerosas ou células-tronco cancerosas, que compreende o contato das células com uma quantidade eficaz das células que expressam CAR geradas de acordo com um método como descrito na presente invenção, uma quantidade eficaz do anticorpo como descrito na presente invenção, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno como descrito na presente invenção e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo como descrito na presente invenção.
[0398] Um método para determinar se é provável que um sujeito responda ou não seja submetido a terapia, que compreende o contato de uma amostra isolada do paciente com o anticorpo como descrito na presente invenção, o fragmento de ligação de antígeno como descrito na presente invenção e/ou o polipeptídeo como descrito na presente invenção, e detecção de um complexo de anticorpo-célula, um complexo de fragmento de ligação a antígeno-célula e/ou um complexo de polipeptídeo-célula na amostra, em que a presença do complexo indica que o sujeito provavelmente responderá à terapia e a ausência de complexo indica que o sujeito provavelmente não responderá à terapia. Em um aspecto, o anticorpo, o fragmento de ligação de antígeno e/ou o polipeptídeo é marcado de forma detectável.
[0399] O método, como descrito na presente invenção, compreendendo adicionalmente a administração de uma quantidade eficaz de um ou mais dentre anticorpo, como descrito na presente invenção, ou o CAR, como descrito na presente invenção, ao sujeito que provavelmente responderá à terapia. A terapia é uma terapia de primeira linha, segunda linha, terceira linha, quarta linha ou quinta linha.
[0400] Um método para monitorar a terapia em um sujeito que compreende o contato de uma amostra isolada do sujeito com o anticorpo aqui descrito ou o fragmento de ligação de antígeno do mesmo como descrito na presente invenção, e a detecção de um complexo de anticorpo- célula na amostra. Quando o anticorpo é um anticorpo anti-Lym, o método é realizado antes e/ou após a administração de uma quantidade eficaz de uma ou mais células que expressam anti-Lym CAR geradas como descrito na presente invenção, uma quantidade eficaz do anticorpo como descrito na presente invenção, uma quantidade eficaz do fragmento de ligação de antígeno como descrito na presente invenção e/ou uma quantidade eficaz do polipeptídeo como descrito na presente invenção. Em um aspecto, em que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é marcado de forma detectável. Em outro aspecto, a amostra compreende um ou mais dentre expectoração, soro, plasma, linfa, fluido cístico, urina, fezes, fluido cefalorraquidiano, fluido ascítico, sangue ou um tecido.
[0401] Um kit compreendendo um ou mais dentre o anticorpo como descrito na presente invenção, o CAR como descrito na presente invenção, o fragmento de ligação de antígeno como descrito na presente invenção, o polipeptídeo como descrito na presente invenção, o ácido nucleico isolado como descrito na presente invenção, o vetor como descrito na presente invenção, a célula isolada como descrito na presente invenção e/ou a composição como descrito na presente invenção e as instruções de uso. As instruções de uso fornecem instruções para conduzir um método como descrito na presente invenção.
Equivalentes
[0402] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm os mesmos significados como comumente entendidos por um elemento versado na técnica à qual esta tecnologia pertence.
[0403] A presente tecnologia descrita ilustrativamente na presente invenção pode ser praticada adequadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente divulgados na presente invenção. Assim, por exemplo, os termos “compreendendo”, “incluindo”, “contendo”, etc. devem ser lidos de forma expansiva e sem limitação. Além disso, os termos e expressões empregados na presente invenção foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da presente tecnologia reivindicada.
[0404] Assim, deve ser entendido que os materiais, métodos e exemplos fornecidos aqui são representativos dos aspectos preferidos, são exemplificadores, e não se destinam a ser limitações do escopo da presente tecnologia.
[0405] A presente tecnologia foi descrita amplamente e genericamente na presente invenção. Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéricos que se enquadram na divulgação genérica também fazem parte da presente tecnologia. Isso inclui a descrição genérica da presente tecnologia com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, independentemente do material excisado ser ou não especificamente citado na presente invenção.
[0406] Além disso, quando as características ou aspectos da presente tecnologia são descritos em termos de grupos de Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a presente tecnologia também é descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.
[0407] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorporados por referência em sua totalidade, na mesma medida como se cada um fosse incorporado por referência individualmente. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, irá controlar.
Outros aspectos são apresentados nas Reivindicações a seguir.
Listagem de Sequências SEQ ID NO: 1 VH huLym-1-A
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGA TCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTTAGCCTGACATCTTATG GCGTGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGCTGG TGGTCATTTGGAGCGACGGCAGCACCACCTACAACAGCGCCCTGAAGTC CCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAG ATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGCC ACTACGGCTCTACCCTGGCCTTTGCTTCTTGGGGCCAGGGCACACTGGT
CACAGTTTCTAGC SEQ ID NO: 2 aminoácidos de VH huLym-1-A
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWLV VIWSDGSTTYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASHYG
STLAFASWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 3 VL huLym-1-A
GATATTGTGCTGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCTTCTCCTGGAC AGAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCGTGAACATCTACAGCTACCT GGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCTCCTAAGCTGCTGGTGTA CAACGCCAAGATTCTGGCCGAGGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGC GGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCTGGCCTGCAGCCTGAGG ACGAGGCCGATTACTATTGCCAGCACCACTATGGCACCTTCACCTTCGG
CGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG SEQ ID NO: aminoácidos de VL huLym-1-A
DIVLTQSPSSLSASPGQRVTISCRASVNIYSYLAWYQQKPGQAPKLLVYNAKI
LAEGVPDRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDEADYYCQHHYGTFTFGGGTKL EIK 4
SEQ ID NO: 5 VH huLym-1-B
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCAGA TCTCTGAGACTGACCTGTACCGCCAGCGGCTTTAGCCTGACAAGCTATG GCGTGCACTGGGTCCGACAGCCTCCAGGCAAAGGACTGGAATGGCTGG CCGTGATTTGGAGCGACGGCAGCACCACATACAACAGCGCCCTGAAGTC CCGGCTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTACCTGCA GATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAG ACACTACGGCTCTACCCTGGCCTTTGCTTCTTGGGGCCAGGGCACACTG
GTCACCGTTTCTTCT SEQ ID NO: 6 aminoácidos de VH huLym-1-B
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLTCTASGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLAV IWSDGSTTYNSALKSRLTISKDNSKSQVYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYGS
TLAFASWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 7 VL huLym-1-B
GACATCCAAATGACCCAAAGCCCTTCCTCCCTAAGTGCGTCTGTCGGGG ATCGTGTGACCATAACGTGTAGAGCTTCCGTTAATATATACAGTTATTTGG CCTGGTATCAACAAAAACCAGGTAAGGCCCCAAATCTGCTTATTTACAAC GCAAAAATACTTGCTGAGGGCGTTCCATCTAGATTCAGCGGGAGTGGAA GTGGTACAGATTTTACGCTTACCATAAGTTCACTGCAACCTGAGGACTTC GCCTCTTACTACTGTCAACATCATTATGGGACGTTTACCTTTGGGCAAGG
GACTAAGGTGGAGATAAAG SEQ ID NO: 8 aminoácidos de VL huLym-1-B
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASVNIYSYLAWYQQKPGKAPNLLIYNAKI LAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQHHYGTFTFGQGTKVE
IK SEQ ID NO: 9 VH huLym-2
GAGGTGCAACTGGTCGAATCCGGTGGCGGCCTTATCCAACCCGGTCGG TCTCTTCGCTTGTCCTGTTCTGGTAGTGGCTTCACTTTCAGTAACTACTG GATGAACTGGGTCAGGCAGGCTCCCGGTAAGGGGTTGGAATGGGTAGG TGAAATCAGGTTCAAGTCTCATAACTATGCTACCCATTTTGCTGAAAGTGT TAAGGGACGTTTTACTATTAGCAGAGACGACTACAAGTCTGTAGTGTACC TTCAGATGAATTCACTCCGGTCCGAAGATACCGCCGTATATTACTGTACT CGGAGAATTGGTAACTCTGACTATGACTGGTGGTATTTTGACGTCTGGG
GCCAAGGCACTATGGTTACCGTCAGCTCA SEQ ID NO: 10 aminoácidos de VH huLym-2
EVQLVESGGGLIQPGRSLRLSCSGSGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVG EIRFKSHNYATHFAESVKGRFTISRDDYKSVVYLQMNSLRSEDTAVYYCTR
RIGNSDYDWWYFDVWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 11 VL huLym-2
GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGC GACAGAGTGACCATCACCTGTAAAGCCAGCCAGAACGTGGGCAACAACG TGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTA CAGCGCCAGCTACAGATACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAG CGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAG GACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACATACCCCTTCACCT
TCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 12 aminoácidos de VL huLym-2
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNVAWYQQKPGKVPKLLIYSAS YRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYNTYPFTFGQGTK
VEIK SEQ ID NO: 13 CAR huLym-1-A
ATGGCCCTGCCTGTTACGGCCCTGCTGCTCCCGCTGGCCCTTTTGTTGC ATGCAGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTG TGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTTA GCCTGACATCTTATGGCGTGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAG GACTGGAATGGCTGGTGGTCATTTGGAGCGACGGCAGCACCACCTACAA CAGCGCCCTGAAGTCCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACAGCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTG TACTATTGTGCCAGCCACTACGGCTCTACCCTGGCCTTTGCTTCTTGGG GCCAGGGCACACTGGTCACAGTTTCTAGCGGAGGCGGAGGATCAGGTG GCGGTGGATCTGGCGGTGGTGGTTCTGATATTGTGCTGACACAGAGCCC CAGCAGCCTGTCTGCTTCTCCTGGACAGAGAGTGACCATCAGCTGCAGA GCCAGCGTGAACATCTACAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCG GACAGGCTCCTAAGCTGCTGGTGTACAACGCCAAGATTCTGGCCGAGG GCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCT GACAATCTCTGGCCTGCAGCCTGAGGACGAGGCCGATTACTATTGCCAG CACCACTATGGCACCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCA AGACCACGACGCCAGCGCCTAGGCCACCAACACCGGCGCCCACCATCG CGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCG GGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTAC ATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGG TTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTC AAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTG TAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTG AAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAAC CAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTT GGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAA GGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGAT GGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGG GCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGG
ACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 14 aminoácidos de CAR huLym-1-A
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSLTS YGVHWVRQAPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCASHYGSTLAFASWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSDIVLTQSPSSLSASPGQRVTISCRASVNIYSYLAWYQQKPGQAPKLLVY NAKILAEGVPDRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDEADYYCQHHYGTFTFGGG TKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC RFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGH
DGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 15 CAR huLym-1-B
ATGGCCCTGCCTGTTACGGCCCTGCTGCTCCCGCTGGCCCTTTTGTTGC ATGCAGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGG TGCAGCCTGGCAGATCTCTGAGACTGACCTGTACCGCCAGCGGCTTTAG CCTGACAAGCTATGGCGTGCACTGGGTCCGACAGCCTCCAGGCAAAGG ACTGGAATGGCTGGCCGTGATTTGGAGCGACGGCAGCACCACATACAAC AGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGC CAGGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTG TACTATTGCGCCAGACACTACGGCTCTACCCTGGCCTTTGCTTCTTGGG GCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCAGGTG GCGGTGGATCTGGCGGTGGTGGTTCTGACATCCAAATGACCCAAAGCCC TTCCTCCCTAAGTGCGTCTGTCGGGGATCGTGTGACCATAACGTGTAGA GCTTCCGTTAATATATACAGTTATTTGGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGT AAGGCCCCAAATCTGCTTATTTACAACGCAAAAATACTTGCTGAGGGCGT TCCATCTAGATTCAGCGGGAGTGGAAGTGGTACAGATTTTACGCTTACCA TAAGTTCACTGCAACCTGAGGACTTCGCCTCTTACTACTGTCAACATCAT TATGGGACGTTTACCTTTGGGCAAGGGACTAAGGTGGAGATAAAGACCA CGACGCCAGCGCCTAGGCCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGC AGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGC GCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGG CGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCAC CCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAAC CATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGC CGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCA GCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCT ATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAA GAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGA ACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGA GGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTA
CGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 16 aminoácidos de CAR huLym-1-B
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLTCTASGFSLTS YGVHWVRQPPGKGLEWLAVIWSDGSTTYNSALKSRLTISKDNSKSQVYLQ MNSLRAEDTAVYYCARHYGSTLAFASWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASVNIYSYLAWYQQKPGKAPNLLIY NAKILAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQHHYGTFTFGQG TKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC RFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGH
DGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 17 CAR huLym-2
ATGGCCCTGCCTGTTACGGCCCTGCTGCTCCCGCTGGCTCTTTTGTTGC ATGCAGCCAGGCCGGAGGTGCAACTGGTCGAATCCGGTGGCGGCCTTA TCCAACCCGGTCGGTCTCTTCGCTTGTCCTGTTCTGGTAGTGGCTTCACT TTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCAGGCAGGCTCCCGGTAAGGGGT TGGAATGGGTAGGTGAAATCAGGTTCAAGTCTCATAACTATGCTACCCAT TTTGCTGAAAGTGTTAAGGGACGTTTTACTATTAGCAGAGACGACTACAA GTCTGTAGTGTACCTTCAGATGAATTCACTCCGGTCCGAAGATACCGCC GTATATTACTGTACTCGGAGAATTGGTAACTCTGACTATGACTGGTGGTA TTTTGACGTCTGGGGCCAAGGCACTATGGTTACCGTCAGCTCAGGAGGC GGAGGTTCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCTGAGATCGT GCTGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGT GACCATCACCTGTAAAGCCAGCCAGAACGTGGGCAACAACGTGGCCTG GTATCAGCAGAAACCTGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCC AGCTACAGATACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTG GCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGC CACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACATACCCCTTCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAGGCCGTTCCTCCACAGCAGTGGGCCCTG TCTACCACGACGCCAGCGCCTAGGCCACCACCAACACCGGCGCCCACC ATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGC GGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATA TCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTC ACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATA TATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGAT GGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGA GAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCC AGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGA TGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCC GAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGAT AAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGG AGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACC
AAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 18 aminoácidos de CAR huLym-2
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLIQPGRSLRLSCSGSGFTFSN YWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRFKSHNYATHFAESVKGRFTISRDDYKSV VYLQMNSLRSEDTAVYYCTRRIGNSDYDWWYFDVWGQGTMVTVSSGGG GSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNVAWYQQ KPGKVPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQ YNTYPFTFGQGTKVEIKAVPPQQWALSTTTPAPRPPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLL YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD
KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 19 Região constante de IgD humana, Uniprot: P01880
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQR TFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPE SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQE ERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLT WEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLN HPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNI LLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYT
CVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK SEQ ID NO: 20 Região constante de IgG1 humana, Uniprot: P01857
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 21 Região constante de IgG2 humana, Uniprot: P01859
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 22 Região constante de IgG3 humana, Uniprot: P01860
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTP LGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPP CPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFK WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVM
HEALHNRFTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 23 Região constante de IgM humana, Uniprot: P01871
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNV PLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGK QVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRG LTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTI SWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTH TDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPAD VFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGET
YTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY SEQ ID NO: 24 Região constante de IgG4 humana, Uniprot: P01861
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 25 Região constante de IgA1 humana, Uniprot: P01876
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTAR NFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCP VPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDA SGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCT AAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPK DVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKG
DTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY SEQ ID NO: 26 Região constante de IgA2 humana, Uniprot: P01877
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTAR NFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCP VPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSG KSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTA NITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQ ELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEA
LPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY SEQ ID NO: 27 Região constante Ig kappa humana, Uniprot: P01834
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN
RGEC SEQ ID NO: Sequência de DNA de estrutura 28 DAP-CAR
CCACGACGCCAGCGCCTAGGCCTCCAACACCAGCTCCAACAATCGCCA GCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCG GAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTG GGCCCCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATC ACCCTGTACTGCCTGTGTGCCCGGCCTAGAAGATCCCCTGCTCAGGATG GCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCAGAGGCTACTTCCTGGGCAGACT GGTTCCTAGAGGAAGAGGCGCTGCCGAAGCCGCCACAAGAAAGCAGAG AATCACCGAGACAGAGAGCCCCTACCAAGAGCTGCAGGGCCAGAGATC
CGACGTGTACAGCGACCTGAATACCCAGCGGCCTTACTACAAGTGA 1-135: Dobradiça CD8a 136-207: Transmembrana CD8a 208-276: DAP10 277-435: DAP12 SEQ ID NO: 29 Aminoácidos de estrutura DAP-CAR
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLA
GTCGVLLLSLVITLYCLCARPRRSPAQDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRG AAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK* 1-45: Dobradiça CD8a 46-69: Transmembrana CD8a 70-92: DAP10 93-144: DAP12 SEQ ID NO: 30 Sequência de DNA huLym-1-B-DAPCAR
ATGGCCCTGCCTGTTACGGCCCTGCTGCTCCCGCTGGCCCTTTTGTTGC ATGCAGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGG TGCAGCCTGGCAGATCTCTGAGACTGACCTGTACCGCCAGCGGCTTTAG CCTGACAAGCTATGGCGTGCACTGGGTCCGACAGCCTCCAGGCAAAGG ACTGGAATGGCTGGCCGTGATTTGGAGCGACGGCAGCACCACATACAAC AGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGC CAGGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTG TACTATTGCGCCAGACACTACGGCTCTACCCTGGCCTTTGCTTCTTGGG GCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGATCAGGTG GCGGTGGATCTGGCGGTGGTGGTTCTGACATCCAAATGACCCAAAGCCC TTCCTCCCTAAGTGCGTCTGTCGGGGATCGTGTGACCATAACGTGTAGA GCTTCCGTTAATATATACAGTTATTTGGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGT AAGGCCCCAAATCTGCTTATTTACAACGCAAAAATACTTGCTGAGGGCGT TCCATCTAGATTCAGCGGGAGTGGAAGTGGTACAGATTTTACGCTTACCA TAAGTTCACTGCAACCTGAGGACTTCGCCTCTTACTACTGTCAACATCAT TATGGGACGTTTACCTTTGGGCAAGGGACTAAGGTGGAGATAAAGACCA CGACGCCAGCGCCTAGGCCTCCAACACCAGCTCCAACAATCGCCAGCC AGCCTCTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGC CGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCC CCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCC TGTACTGCCTGTGTGCCCGGCCTAGAAGATCCCCTGCTCAGGATGGCAA GGTGTACATCAACATGCCCGGCAGAGGCTACTTCCTGGGCAGACTGGTT CCTAGAGGAAGAGGCGCTGCCGAAGCCGCCACAAGAAAGCAGAGAATC ACCGAGACAGAGAGCCCCTACCAAGAGCTGCAGGGCCAGAGATCCGAC
GTGTACAGCGACCTGAATACCCAGCGGCCTTACTACAAGTGA 1-63: Sequência líder CD8a 64-780: huLym-1-B ScFv 781-915: Dobradiça CD8a 916-987: Transmembrana CD8a 988-1056: DAP10 1057-1215: DAP12 SEQ ID NO: 31 Aminoácidos huLym-1-B-DAPCAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLTCTASGFSLTS YGVHWVRQPPGKGLEWLAVIWSDGSTTYNSALKSRLTISKDNSKSQVYLQ MNSLRAEDTAVYYCARHYGSTLAFASWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASVNIYSYLAWYQQKPGKAPNLLIY NAKILAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQHHYGTFTFGQG TKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI
WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLCARPRRSPAQDGKVYINMPGRGYFLGRLVP RGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK* 1-21: Sequência líder CD8a 22-260: huLym-1-B ScFv 261-305: Dobradiça CD8a 306-329: Transmembrana CD8a 330-352: DAP10 353-404: DAP12 SEQ ID NO: 32 Sequência de DNA Anti-CD19-261tag-BB3zCAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCC ACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTC TGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGAC ATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAA CTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTT CAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTG GAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCC GTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGCGGCGGAG GCTCCGGCGGCGGAGGAAGCGGCGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTG CAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTC ACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGA TTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGG GTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATC ATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCA AACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTG GTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCAGCCGTGCCCCCCCAGCAGTGGGCCCTGAGCACCACGACGCCAGC GCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTC CCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACA CGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGG CCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAG ACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCA GAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGC GCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAG CTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTG GCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAG GAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACA GTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGAT GGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC
TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA 1-63: Líder CD8a 64-789: FMC63 ScFv 790-819: 261tag 820-954: Dobradiça CD8a 955-1026: Transmembrana CD8a 1027-1152: 4-1BB 1153-1488: CD3z SEQ ID NO: 33 Anti-CD19-261tag-BB3zCAR-AA
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKY LNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIA TYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGL VAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSA LKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQG TSVTVSSAVPPQQWALSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAV HTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPV QTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNL
GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* 1-21: Líder CD8a 22-263: FMC63-ScFv 264-273: 261tag 274-318: Dobradiça CD8a 319-342: Transmembrana CD8a 343-384: 4-1BB 385-495: CD3z SEQ ID NO: 34 Sequências de DNA Anti-CD19-261tag-DAPCAR
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCC ACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTC TGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGAC ATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAA CTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTT CAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTG GAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCC GTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGG CTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGC AGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCA CATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATT CGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGT AGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCAT CAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAA CTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGT AGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCT CAGCCGTGCCCCCCCAGCAGTGGGCCCTGAGCACCACGACGCCAGCG CCTAGGCCTCCAACACCAGCTCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTC TGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAA GAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGG AACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCCTG TGTGCCCGGCCTAGAAGATCCCCTGCTCAGGATGGCAAGGTGTACATCA ACATGCCCGGCAGAGGCTACTTCCTGGGCAGACTGGTTCCTAGAGGAA GAGGCGCTGCCGAAGCCGCCACAAGAAAGCAGAGAATCACCGAGACAG AGAGCCCCTACCAAGAGCTGCAGGGCCAGAGATCCGACGTGTACAGCG
ACCTGAATACCCAGCGGCCTTACTACAAATGA 1-63: Líder CD8a 64-789: FMC63 ScFv 790-819: 261tag 820-954: Dobradiça CD8a 955-1026: Transmembrana CD8a 1027-1095: DAP10 1096-1254: DAP12 SEQ ID NO: Sequência 35 Anti-CD19-261tag-DAPCAR AA
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKY LNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIA TYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGL VAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSA LKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQG TSVTVSSAVPPQQWALSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAV HTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLCARPRRSPAQDGKVYIN
MPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLN TQRPYYK* 1-21: Líder CD8a 22-263: FMC63-ScFv 264-273: 261tag 274-318: Dobradiça CD8a 319-342: Transmembrana CD8a 343-365: DAP10 366-417: DAP12

Claims (35)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo, caracterizado por que compreende: (i) uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 ou 6 ou um equivalente de cada uma das mesmas; e/ou (ii) uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 ou 8 ou um equivalente de cada uma das mesmas.
2. Anticorpo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
3. Anticorpo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
4. Anticorpo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
5. Anticorpo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 e a sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, ou um equivalente de cada uma das mesmas.
6. Anticorpo, caracterizado por que compreende: (i) uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia pesada (HC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou um equivalente da mesma; e/ou (ii) uma sequência de domínio variável de imunoglobulina de cadeia leve (LC) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou um equivalente da mesma.
7. Fragmento de Ligação de Antígeno, caracterizado por que é do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6.
8. Polipeptídeo, caracterizado por que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 ou um equivalente de cada uma das mesmas.
9. Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), caracterizado por que compreende: (a) um domínio de ligação ao antígeno do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, (b) um domínio de dobradiça, (c) um domínio transmembranar e
(d) um domínio de sinalização intracelular ou um domínio DAP.
10. Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por que compreende ainda uma ou mais regiões de sinalização coestimulatória.
11. Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), de acordo com a Reivindicação 9 ou 10, caracterizado por que o domínio DAP é DAP10 e/ou DAP12.
12. Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 9 a 11, caracterizado por que compreende ainda o peptídeo AVPPQQWALS inserido após os domínios variáveis HC e LC.
13. Sequência de Ácido Nucleico Isolada, caracterizada por que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências aqui divulgadas, ou um equivalente de cada uma delas e, opcionalmente, ligada operativamente a um elemento promotor e/ou potencializador.
14. Sequência de Ácido Nucleico Isolada, caracterizada por que codifica o anticorpo conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, ou o CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12.
15. Vetor, caracterizado por que compreende a sequência de ácido nucleico isolado, conforme definida na Reivindicação 14.
16. Célula Isolada, caracterizada por que compreende o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, o CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12, o ácido nucleico isolado, conforme definido na Reivindicação 13 ou 14, e/ou o vetor, conforme definido na Reivindicação 15.
17. Célula Isolada, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizada por que a célula isolada é uma célula imunológica.
18. Célula Isolada, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizada por que a célula imune é uma célula T ou uma célula exterminadora natural (NK).
19. Composição, caracterizada por que compreende um transportador e um ou mais dos anticorpos, conforme definidos em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, o CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12, o ácido nucleico isolado, conforme definido na Reivindicação 13 ou 14, o vetor, conforme definido na Reivindicação 15 e/ou a célula isolada, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 16 a 18.
20. Método de Produção de Células in vitro, que expressam CAR, caracterizado por que compreende: (i) a introdução de uma população de células imunes com uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12; e (ii) a seleção de uma subpopulação de células imunes que foram transduzidas com sucesso com a referida sequência de ácido nucleico da etapa (i), produzindo assim células que expressam CAR.
21. Método de Produção de Células in vitro, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que as células imunes são células T ou células NK.
22. Método de Produção de Células in vitro, de acordo com a Reivindicação 20 ou 21, caracterizado por que a população de células imunes foi modificada para reduzir ou eliminar a expressão de receptores endógenos de células imunes.
23. Método de Inibição de Crescimento de Tumor e/ou Tratamento de Câncer e/ou Prevenção Recidiva de Câncer em Sujeito em Necessidade do Mesmo, caracterizado por que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, o domínio de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, ou o CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12.
24. Método de Inibição de Crescimento de Tumor e/ou Tratamento de Câncer e/ou Prevenção Recidiva de Câncer em Sujeito em Necessidade do Mesmo, de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por que compreende ainda administrar uma ou mais terapêuticas anticânceres, inibidores de ponto de verificação, células T reguladoras (Treg), células supressoras derivadas de mieloide (MDSC), fluoruracil (5-FU), inibidores de histona desacetilase (HDAC), tratamento de IL-12, CpG (agonistas de TLR9), e/ou estimulador de agonistas da via dos genes de interferon (STING).
25. Método de Inibição de Crescimento de Tumor e/ou Tratamento de Câncer e/ou Prevenção Recidiva de Câncer em Sujeito em Necessidade do Mesmo, de acordo com a Reivindicação 23 ou 24, caracterizado por que o tumor ou célula cancerígena expressa ou superexpressa Lym1 e/ou Lym2 ou CD19.
26. Método de Inibição de Proliferação de Células Cancerígenas ou Células-Tronco Cancerígenas, caracterizado por que compreende contatar as células com uma quantidade eficaz do anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, o domínio de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, ou o CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12.
27. Método Para Determinar se um Sujeito Provavelmente Responderá ou Deixará de Responder à Terapia, compreendendo contatar uma amostra isolada do paciente com o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, ou o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, caracterizado por que a presença do complexo entre o anticorpo, fragmento de ligação de antígeno ou polipeptídeo indica que o sujeito provavelmente responderá à terapia e a ausência de complexo indica que o sujeito provavelmente deixará de responder à terapia.
28. Método Para Monitorar Terapia em Sujeito, caracterizado por que compreende contatar uma amostra isolada do sujeito com um ou mais anticorpos, conforme definidos em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, ou o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8 e detectar um complexo na amostra.
29. Kit, caracterizado por que compreende um ou mais dos anticorpos, conforme definidos em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, o polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, ou o CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12 e as instruções de uso.
30. Uso de Anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, Domínio de Ligação de Antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, Polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, ou CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12, caracterizado por que é no fabrico de medicamentos para inibição de crescimento de tumor e/ou tratamento de câncer e/ou prevenção recidiva de câncer em sujeito em necessidade do mesmo.
31. Uso de Anticorpo, Domínio de Ligação de Antígeno, Polipeptídeo ou CAR, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que compreende ainda administrar uma ou mais terapêuticas anticânceres, inibidores de ponto de verificação, células T reguladoras (Treg), células supressoras derivadas de mieloide (MDSC), fluoruracil (5-FU), inibidores de histona desacetilase (HDAC), tratamento de IL-12, CpG (agonistas de TLR9), e/ou estimulador de agonistas da via dos genes de interferon (STING).
32. Uso de Anticorpo, Domínio de Ligação de Antígeno, Polipeptídeo ou CAR, de acordo com a Reivindicação 30 ou 31, caracterizado por que o tumor ou célula cancerígena expressa ou superexpressa Lym1 e/ou Lym2 ou CD19.
33. Uso de Anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, Domínio de Ligação de Antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, Polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, ou CAR, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 9 a 12, caracterizado por que é no fabrico de medicamentos para inibição de proliferação de células cancerígenas ou células-tronco cancerígenas.
34. Uso de Anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, Fragmento de Ligação de Antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, ou Polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, caracterizado por que é no fabrico de medicamentos para determinar se um sujeito provavelmente responderá ou deixará de responder à terapia, em que a presença do complexo entre o anticorpo, fragmento de ligação de antígeno ou polipeptídeo indica que o sujeito provavelmente responderá à terapia e a ausência de complexo indica que o sujeito provavelmente deixará de responder à terapia.
35. Uso de Anticorpo, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, Fragmento de Ligação de Antígeno, conforme definido na Reivindicação 7, ou Polipeptídeo, conforme definido na Reivindicação 8, caracterizado por que é no fabrico de medicamentos para monitorar terapia em sujeito.
Razão E/T
Mock T
Porcentagem de Mudança em Peso
Reestimulação Transdução
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