DE112020002641T9

DE112020002641T9 - M1-Virusmutante und deren Verwendung

Info

Publication number: DE112020002641T9
Application number: DE112020002641.8T
Authority: DE
Inventors: Guangmei Yan; Yuan Lin; Li Guo; Ziqing Lin; Guang'en Wu
Original assignee: Guangzhou Virotech Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Virotech Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2020-05-31
Publication date: 2022-10-06
Also published as: CN113939304B; DE112020002641T5; JP2022535010A; CN112011519A; WO2020239118A1; AU2020285291A1; JP2024086728A; JP7457037B2; US20220315903A1; CN113939304A

Abstract

Es wird ein M1 -Virus bereitgestellt. Weiterhin sind eine Reihe von Verwendungen des Virus vorgesehen. Die Verwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf virale Vektoren, Anti-Tumor-Agenzien und pharmazeutische Zusammensetzungen. Das Virus kann das Wachstum verschiedener Tumorzellen wirksam inhibieren und weist gleichzeitig Tumorgerichtete Eigenschaften auf und ist für normale Zellen nicht toxisch. Besagtes Virus kann mittels intravenöser Injektion verabreicht werden, was eine einfache Handhabung ermöglicht.

Description

Technisches Feld
Die vorliegende Offenlegung betrifft den Bereich der biologischen Arzneimittel und bezieht sich insbesondere auf eine M1-Virusmutante und deren Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Genetisch und epigenetisch bedingte Veränderungen in normalen Zellen führen dazu, dass sich normale Zellen in bösartige Tumorzellen verwandeln. Dieser komplexe pathologische Prozess bestimmt die Vielfalt der Mechanismen bei der Entstehung, Erhaltung und Metastasierung verschiedener Tumore (1-3). Die chirurgische Entfernung, Chemo- und Strahlentherapie sind konventionelle Methoden zur Behandlung von Tumoren, wobei die chirurgische Entfernung leicht zu einem Wiederauftreten des Tumors führt und die Chemo- und Strahlentherapie starke toxische Wirkungen und Nebenwirkungen hervorruft (4). Zielgerichtete Therapien und Tumorimmuntherapien, einschließlich der IL-2-Kontrolle, der adoptiven Zelltherapie und der Regulierung von Immun-Checkpoints wie PD-1, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, haben in der klinischen Behandlung gewisse Erfolge erzielt. Die zielgerichteten Therapien sind jedoch anfällig für Arzneimittelresistenzen, und die Immuntherapie hat eine niedrige Ansprechrate und kann zu schwerwiegenden immunassoziierten Nebenwirkungen führen (5, 6). Daher ist es dringend erforderlich, weitere neuartige Krebstherapien zu entwickeln, die eine geringe Toxizität und hohe Wirksamkeit aufweisen und nur in geringem Maße Arzneimittelresistenzen verursachen.
Onkolytische Viren töten nicht nur Tumorzellen ab, sondern warnen auch das Immunsystem des Wirts vor dem Vorhandensein von Krebs. Die Virotherapie ist eine Therapie, die auf den Eigenschaften der onkolytischen Viren beruht, die mit höherer Wahrscheinlichkeit Krebsgewebe angreifen als gesundes Gewebe. Im Jahr 2005 genehmigte die chinesische Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde die Vermarktung der ersten onkolytischen Virotherapie mit dem Handelsnamen Oncorine. Dies ist ein genetisch modifiziertes Virus, das bevorzugt Tumorzellen angreift und zur Behandlung von Kopf- und Halstumoren eingesetzt wurde. Im Jahr 2015 genehmigte die US-Arzneimittelbehörde (FDA) die Melanomtherapie T-VEC, bei der genetisch veränderte Herpesviren zum Einsatz kommen, und im folgenden Jahr wurde sie in Australien und der Europäischen Union zugelassen. Darüber hinaus werden auch einige onkolytische Viren erforscht. Obwohl die Virotherapie in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte gemacht hat, steht sie noch immer vor zahlreichen Schwierigkeiten.
Zunächst ist die Wirksamkeit betroffen. Die onkolytischen Viren weisen eine begrenzte Anti-Tumor-Wirkung oder ein begrenztes Anti-Tumor-Spektrum auf. Viele onkolytische Viren können Tumorzellen nicht gut inhibieren oder abtöten und müssen in Kombination mit anderen chemotherapeutischen Arzneimitteln oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren oder als Ergänzung zur Strahlentherapie verwendet werden. Zum Beispiel hat ein M1-Virus, das in einer chinesischen Patentanmeldung 201410425510.3 offengelegt ist, bei Verwendung als Antitumormedikament eine signifikante Wirkung auf Darmkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs und Brustkrebs, eine geringere Wirkung auf Bauchspeicheldrüsenkrebs, Nasopharynxkarzinom, Prostatakrebs und Melanom, eine viel geringere Wirkung auf Gliome, Gebärmutterhalskrebs und Lungenkrebs und die geringste Wirkung auf Magenkrebs.
Zweitens ist die Sicherheit betroffen. Bestimmte Viren sind für den menschlichen Körper gefährlich, und die gefährlichen Viren müssen modifiziert und abgeschwächt werden, bevor sie in der Virotherapie eingesetzt werden können. Selbst wenn die onkolytischen Viren modifiziert und abgeschwächt sind, können sie immer noch zu „Escape Viren“ werden, d. h. zu Viren, die sich nach ihrer Freisetzung wieder verändern oder an vorhandene Krankheitserreger im Körper des Patienten gebunden werden, um schnell gesundes Gewebe zu infizieren.
Des Weiteren ist die Zuführung von Viren betroffen. Das heißt, wie führt man die Viren zu einer Läsion zu. Bei den meisten bestehenden onkolytischen Virotherapien, wie z. B. der von der US-amerikanischen Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde (FDA) zugelassenen Melanomtherapie T-VEC, werden die onkolytischen Viren in ein Tumorgewebe injiziert. Läsionen und Mikrometastasen vieler solider Tumore können jedoch nicht direkt injiziert werden, oder nicht-solide Tumore wie hämatologische Tumore sind im ganzen Körper verteilt, ohne dass es eine feste Injektionsstelle gibt. Es ist schwierig, die vorhandenen Virotherapien für diese Arten von Tumoren zu adaptieren.
Daher stellt die Entwicklung onkolytischer Viren nach wie vor eine große Herausforderung dar.
Alphaviren gehören zur Familie der Togaviridae, einer Klasse von einzelsträngigen RNA-Viren mit einer Hüllstruktur. In der Literatur wird berichtet, dass das zu den Alphaviren gehörende Chikungunya-Virus ein für den Menschen pathogenes und hochtoxisches Virus ist, das nach einer Infektion Fieber, Hautausschlag, Arthritis und sogar tödliche Enzephalitis verursacht (7, 8). Es wird berichtet, dass ein anderes Virus, beispielsweise ein venezolanisches Pferdeenzephalitis-Virus, das zum Alphavirus gehört, als Vektor für die Transduktion dendritischer Zellen zur Behandlung von Tumoren verwendet werden kann (9), jedoch hat dieses Enzephalitis-Virus beim Menschen Fieber, Krämpfe, Fehlgeburten und sogar den Tod verursacht (10).
M1-Virus (Alphavirus M1) gehört zu den Alphaviren (Alphavirus) . Es wurde 1964 aus Culex-Mücken auf der Insel Hainan, China, isoliert, und eine Methode zur Isolierung des Virus wurde in der Literatur beschrieben (11). Das M1-Virus gehört zu den Getah-ähnlichen Viren und seine Homologie mit dem Getah-Virus beträgt bis zu 97,8 % (12). Im Jahr 2008 wurde das gesamte Genom eines M1-Stammes sequenziert (13). Gemäß dem Patent CN 201410425510.3 hat das M1-Virus eine onkolytische Wirkung, aber das Antitumorspektrum und die Antitumorstärke der bestehenden Wildtyp-M1-Viren müssen verbessert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
In einigen Ausführungsformen wird ein M1-Virus bereitgestellt. Ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus ist nicht M; und/oder ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des Hüllproteins E2 ist nicht E oder K.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins (Nicht-Strukturprotein 3) des M1-Virus: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H; und/oder ist der Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des Hüllproteins E2 (Hüllprotein 2): M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des in dem M1-Virus enthaltenen NS3-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer als SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 18 angegebenen Aminosäuresequenz auf; und/oder weist eine Aminosäuresequenz des in dem M1-Virus enthaltenen E2-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 31 angegeben ist, auf. In einigen Ausführungsformen wird ein M1-Virus bereitgestellt. Ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins, kodiert durch eine Nukleotidsequenz des M1-Virus, ist nicht M; und/oder ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins, ist nicht E oder K.
In einigen Ausführungsformen weist die Nukleotidsequenz des M1-Virus mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer M1-Sequenz, die als SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 15 oder Genebank Zugangsnummer EU015061.1 oder Genebank Zugangsnummer EF011023.1 oder CCTCC V201423 angegeben ist, auf.
In einigen Ausführungsformen ist, vorzugsweise, der Aminosäurerest entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H; und/oder der Aminosäurerest entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins ist: M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H.
In einigen Ausführungsformen weist das M1-Virus eine Mutation relativ zu einem Wildtyp-M1-Virus oder einem Pseudo-Wildtyp-M1-Virus auf.
In einigen Ausführungsformen weist das M1-Virus eine Mutation auf relativ zu einem M1-Virus, aufweisend eine Sequenz, die als SEQ ID NO: 5 angegeben ist, oder relativ zu einem M1-Virus, aufweisend eine Sequenz, die als SEQ ID NO: 15 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen ist die Mutation: M358G, M358A, M358L, M358I, M358V, M358P, M358S, M358Q, M358T, M358C, M358N, M358F, M358Y, M358W, M358D, M358E, M358K, M358R oder M358H auf dem NS3-Protein; und/oder K4M, K4G, K4A, K4L, K4I, K4V, K4P, K4S, K4Q, K4T, K4C, K4N, K4F, K4Y, K4W, K4D, K4R, K4H, E4M, E4G, E4A, E4L, E4I, E4V, E4P, E4S, E4Q, E4T, E4C, E4N, E4F, E4Y, E4W, E4D, E4R oder E4H auf dem E2-Protein.
In einigen Ausführungsformen wird das M1-Virus durch die Mutation eines Aminosäurerestes erhalten, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus, aufweisend die Sequenz, die als SEQ ID NO: 5 angegeben ist, zu: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H; und/oder die Mutation eines Aminosäurerests an der 4-ten Stelle des E2 zu: M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H.
In einigen Ausführungsformen wird das M1-Virus durch die Mutation eines Aminosäurerestes M, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus, aufweisend der Sequenz, die als SEQ ID NO: 15 angegeben ist, zu L; und/oder durch die Mutation eines Aminosäurerestes E, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins zu D erhalten.
In einigen Ausführungsformen wird eine Nukleotidsequenz bereitgestellt, die eines der oben beschriebenen M1-Viren enthält.
In einigen Ausführungsformen wird eine Aminosäuresequenz bereitgestellt, entsprechend dem NS3-Protein eines M1-Virus. Ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle der Aminosäuresequenz, ist nicht M.
In einigen Ausführungsformen ist vorzugsweise der Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H.
In einigen Ausführungsformen weist die dem NS3 des M1-Virus entsprechende Aminosäuresequenz mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 18 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen ist weiterhin eine Aminosäuresequenz bereitgestellt, entsprechend dem E2-Protein eines M1-Virus. Ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle der Aminosäuresequenz, ist nicht E oder K.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle, M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H.
In einigen Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz, entsprechend dem E2-Protein des M1-Virus, mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 31 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen wird weiterhin eine Nukleotidsequenz zur Kodierung der dem NS3-Protein des M1-Virus entsprechenden Aminosäuresequenz bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen wird weiterhin eine Nukleotidsequenz zur Kodierung der dem E2-Protein des M1-Virus entsprechenden Aminosäuresequenz bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen wird weiterhin ein Vektor bereitgestellt. Der Vektor enthält eine Nukleinsäure zur Kodierung des E2-Proteins und/oder des NS3-Proteins eines M1-Virus; ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins, ist nicht M; und ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins, ist nicht E oder K.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäurerest entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäurerest entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins: M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des NS3-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 18 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des E2-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 31 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen enthält der Vektor weiterhin eine kodierende Sequenz des NS1-Proteins, des NS2-Proteins, des NS4-Proteins, des C-Proteins, des E3-Proteins, des 6K-Proteins und/oder des E1-Proteins des M1-Virus.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des NS1-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 16 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des NS2-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 17 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des NS4-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 19 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des C-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 20 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des E3-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 11 oder SEQ ID NO: 30 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des 6K-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 32 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen weist eine Aminosäuresequenz des E1-Proteins mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität (Identität) mit einer Aminosäuresequenz auf, die als SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 33 angegeben ist.
In einigen Ausführungsformen enthält der Vektor weiterhin exogene Gene relativ zum M1-Virus.
In einigen Ausführungsformen exprimieren die exogenen Gene Anti-Tumor-assoziierte Moleküle.
In einigen Ausführungsformen ist der Vektor aus Viren ausgewählt.
In einigen Ausführungsformen ist der Vektor ausgewählt aus einem Retrovirus, einem Newcastle-Krankheit-Virus, einem Tollwutvirus, einem Vesikulare Stomatitis Virus, einem Maraba-Virus, einem Alphavirus, einem Newcastle-Krankheit-Virus, einem Reovirus, einem Adenovirus, einem Adeno-assoziierten Virus, einem Herpes-Simplex-Virus, einem Vaccinia-Virus und einem Masernvirus.
In einigen Ausführungsformen ist der Vektor aus Plasmiden ausgewählt.
In einigen Ausführungsformen ist ein Vektor bereitgestellt. Der Vektor enthält die oben beschriebene Nukleotidsequenz.
In einigen Ausführungsformen wird der Vektor aus Plasmiden ausgewählt.
In einigen Ausführungsformen wird ein Virusvektor bereitgestellt. Das Virus ist ein beliebiges, oben beschriebenes M1-Virus.
In einigen Ausführungsformen sind in den Vektor exogene Gene eingefügt.
In einigen Ausführungsformen exprimieren die exogenen Gene Anti-Tumor-assoziierte Moleküle.
In einigen Ausführungsformen ist weiterhin eine Verwendung des M1-Virus oder der hergestellten Nukleotidsequenz oder der Aminosäuresequenz des NS3-Proteins des M1-Virus oder der Aminosäuresequenz des E2-Proteins des M1-Virus oder der Nukleotidsequenz, entsprechend dem NS3-Protein oder dem E2-Protein, oder des Vektors oder des Virusvektors bei der Herstellung eines Anti-Tumor-Arzneimittels bereitgestellt.
In einigen Ausführungsformen ist weiterhin ein Anti-Tumor-Agens bereitgestellt. Das Anti-Tumor-Agens enthält das M1-Virus oder die Nukleotidsequenz oder die Aminosäuresequenz des NS3-Proteins des M1-Virus oder die Aminosäuresequenz des E2-Proteins des M1-Virus oder die Nukleotidsequenz oder den Vektor oder den Virusvektor.
In einigen Ausführungsformen wird weiterhin eine Zusammensetzung bereitgestellt. Die Zusammensetzung enthält eine wirksame Menge des M1-Virus oder der Nukleotidsequenz oder der Aminosäuresequenz des NS3-Proteins des M1-Virus oder der Aminosäuresequenz des E2-Proteins des M1-Virus oder des Vektors oder des Virusvektors und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin einen Immun-Checkpoint-Inhibitor.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin ein chemotherapeutisches Agens.
Selbstverständlich kann das M1-Virus in einigen Ausführungsformen auch wahlweise den Immun-Checkpoint-Inhibitor und/oder das chemotherapeutische Agens nicht enthalten. In einer Ausführungsform der vorliegenden Offenlegung hat das M1-Virus in einem Fall, in dem kein anderes Anti-Krebs-Agens (z. B. ein chemotherapeutisches Agens, ein Immun-Checkpoint-Inhibitor und andere vorhandene Substanzen oder Hilfsmittel, die eine tumorinhibierende Wirkung haben) vorhanden ist, eine hohe tumorinhibierende Wirkung, wenn es allein verwendet wird.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 10¹ Viruspartikel oder PFUs.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 10¹ bis 10³⁰ Viruspartikel oder PFUs.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰, 10²¹ oder 10²² Viruspartikel oder PFUs.
In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung 2×10⁶ Viruspartikel oder PFUs.
In einigen Ausführungsformen wird die Zusammensetzung zur Abwehr eines Tumors verwendet.
In einigen Ausführungsformen ist eine Darreichungsform des Anti-Tumor-Agens oder der Zusammensetzung ausgewählt aus: einer Injektion, einer Tablette, einer Kapsel, einem Kit und einem Pflaster.
In einigen Ausführungsformen ist die Darreichungsform eine Injektion.
In einigen Ausführungsformen ist bei der Verwendung des Anti-Tumor-Agens oder der Zusammensetzung der Tumor aus einem soliden Tumor und einem hämatologischen Tumor ausgewählt.
In einigen Ausführungsformen ist der solide Tumor ausgewählt aus einem oder mehreren von Leberkrebs, kolorektalem Krebs, Blasenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Prostatakrebs, einem Gliom, Melanom, Pankreaskrebs, Nasopharynxkarzinom, Lungenkrebs, Magenkrebs, Nebennierenrindenkarzinom, akzessorisches Nierenrindenkarzinom, Analkrebs, Blinddarmkrebs, Astrozytom, atypisches Teratom, rhabdoider Tumor, Basalzellkarzinom, Cholangiokarzinom, Blasenkrebs, Knochenkrebs, Hirntumor, Bronchialtumor, Burkitt-Lymphom, Karzinoidtumor, Herztumor, Cholangiokarzinom, Chordom, Dickdarmkarzinom, Kraniopharyngiom, duktales Karzinom in situ, Keimtumor, Endometriumkrebs, Ependymom, Ösophaguskarzinom, olfaktorisches Neuroblastom, Keimzelltumor, extragonadaler Keimzelltumor, Retinoblastom, Eileiterkarzinom, Gallenblasenkarzinom, Kopf- und Halskrebs, Hypopharynxkarzinom, Kaposi-Sarkom, Nierenkrebs, Langenhanssche Zellhistiozytose, Kehlkopfkrebs, Lippenkrebs, Mundhöhlenkrebs, Merkel-Zellkarzinom, malignes Mesotheliom, multiples endokrines Neoplasiesyndrom, Mycosis fungoides, Karzinom der Nasenhöhle und der Nasennebenhöhlen, Neuroblastom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, neuroendokriner Tumor der Bauchspeicheldrüse, Inselzelltumor, Papillomatose, Paragangliom, Karzinom der Nasennebenhöhlen und der Nasenhöhle, Karzinom der Nebenschilddrüse, Karzinom des Penis, Kehlkopfkrebs, Hypophysentumor, pleuropulmonales Blastom, primäres Peritonealkarzinom, Retinoblastom, Speicheldrüsentumor, Sarkom, Sezary-Syndrom, Hautkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Dünndarmkarzinom, Weichteilsarkom, Plattenepithelkarzinom, Hodenkrebs, Thymom und Thymuskarzinom, Schilddrüsenkrebs, Harnröhrenkrebs, Gebärmutterkrebs, Endometrium- und Gebärmuttersarkom, Vaginalkrebs, ein Gefäßtumor, Vulvakrebs und solitäres Myelom.
In einigen Ausfürhungsformen ist der hämatologische Tumor ausgewählt aus einem oder mehreren von akuter B-Zell-Lymphoblastenleukämie (BALL), akuter T-Zell-Lymphoblastenleukämie (TALL), akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), chronischer myelogener Leukämie (CML), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), B-Zell-Promyelozytenleukämie, blastischem plasmazytoiden dendritischen Zellneoplasma, Burkitt-Lymphom, diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom, follikuläres Lymphom, Haarzell-Leukämie, kleinzelliges oder großzellig-follikuläres Lymphom, MALT-Lymphom, Mantelzell-Lymphom, Marginalzonen-Lymphom, multiples Myelom, Non-Hodgkin-Lymphom, plasmablastisches Lymphom, plasmazytoides dendritisches Zellneoplasma, Waldenstrom-Makroglobulinämie und Prä-Leukämie.
In einigen Ausführungsformen ist der Tumor ausgewählt aus einem oder mehreren von Leberkrebs, Darmkrebs, Blasenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Prostatakrebs, Gliom, Melanom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Nasopharynxkarzinom, Lungenkrebs und Magenkrebs.
In einigen Ausführungsformen kann das erhaltene M1-Virus eine Vielzahl von Tumoren wirksam behandeln, darunter: Leberkrebs, Darmkrebs, Blasenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Prostatakrebs, ein Gliom, Melanom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Nasopharynxkarzinom, Lungenkrebs und Magenkrebs. In-vitro-Experimente belegen, dass das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung die Apoptose einer Vielzahl von Tumorzellen induzieren kann; und In-vivo-Experimente belegen, dass das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung das Wachstum von Leberkrebs und Darmkrebs in vivo signifikant inhibiert. Egal ob in vivo oder in vitro, das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung hat eine höhere Wirksamkeit verglichen mit dem Wildtyp-Virus im Allgemeinen.
In einigen Ausführungsformen weist das erhaltene M1-Virus eine gute Selektivität und Sicherheit auf. Zellexperimentelle Ergebnisse zeigen, dass das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung selektiv Tumorzellen abtöten kann und für normale Zellen nicht toxisch ist, was darauf hinweist, dass das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung auf Tumore abzielt; Tierexperimentelle Ergebnisse zeigen, dass das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung nach der Injektion in die Schwanzvene das Gewicht und den mentalen Zustand der Nacktmaus nicht beeinträchtigt und nicht auf normale Organe verteilt wird, was darauf hinweist, dass das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung sicher ist.
In einigen Ausführungsformen inhibiert das erhaltene M1-Virus das Wachstum von Tumoren signifikant, wenn es durch intratumorale oder intravenöse Injektion verabreicht wird. Im Vergleich zur Intratumor-Injektion existierender kommerziell erhältlicher onkolytischer Viren erfordert diese Verabreichung speziell geschulte Ärzte oder Krankenschwestern, hat eine geringe Patientenakzeptanz und ist für tiefe Organtumore und Mikrometastasen nicht geeignet. Das M1-Virus der vorliegenden Offenbarung kann jedoch durch intravenöse Injektion zur Behandlung verabreicht werden, was darauf hindeutet, dass das M1-Virus der vorliegenden Offenlegung bei klinischen Anwendungen bequemer und praktikabler ist und einen breiteren Anwendungsbereich hat.
Sofern der Kontext nichts anderes erfordert, sind die Wörter „enthalten“ und „einschließen“ in der vorliegenden Offenlegung so zu verstehen, dass sie die beschriebenen Schritte oder Elemente oder Ansammlungen von Schritten und Elementen beinhalten, aber keine anderen Schritte oder Elemente oder Ansammlungen von Schritten und Elementen ausschließen; das heißt, die Wörter sind offene Beschränkungen.
In einigen Ausführungsformen enthält das M1-Virus beispielsweise „Mutationen von ...“, wobei sich das „enthalten“ darauf bezieht, dass die Mutationen neben den beschriebenen Mutationen auch andere Mutationen (insbesondere eine stille Mutation) enthalten können (z. B. des Aminosäurerestes an der 358-ten Stelle des Nichtstrukturproteins NS3 und/oder des Aminosäurerestes an der 4-ten Stelle des Strukturproteins E2), wie z.B. Mutationen, die die Funktionen des Virus nicht beeinträchtigen; oder einige Mutationen, die bestimmte Fähigkeiten verbessern oder die Toxizität verringern oder die Stabilität des Virus verbessern, ohne die grundlegenden Funktionen des mutierten M1 zu beeinträchtigen und zu stören.
In einigen Ausführungsformen weist das M1-Virus Doppelstellen-Mutationen auf: M358L auf dem NS3-Protein und eine der Mutationen K4N, K4D, E4N oder E4D auf dem E2-Protein. Dies bedeutet, dass die Mutante nur diese Mutationen aufweist und keine anderen Mutationen hat.
In einigen Ausführungsformen ist ein Wildtyp-M1-Virus, entsprechend dem M1-Virus, ein Virus mit der Hinterlegungsnummer CCTCC V201423 (insbesondere beschrieben in einem chinesischen Patent 104814984A ).
In einigen Ausführungsformen weist eine genomische Sequenz des Wildtyp-M1-Virus, entsprechend dem M1-Virus, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % Identität mit einer genomischen Sequenz des Virus mit der Hinterlegungsnummer CCTCC V201423 (beschrieben im chinesischen Patent 104814984A ) auf.
In einigen Ausführungsformen wird ein Wildtyp-M1-Virus, entsprechend dem M1-Virus, als Genbank-Zugangsnummer EU015061.1 oder EF011023.1 angegeben (vorbehaltlich der Angaben zum Antragsdatum/Prioritätsdatum).
In einigen Ausführungsformen weist eine genomische Sequenz des Wildtyp-M1-Virus, entsprechend dem M1-Virus, eine Identität von mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % mit einer genomischen Sequenz der Genebank Accession No. EU015061.1 oder EF011023.1 (vorbehaltlich der Angaben zum Antragsdatum/Prioritätsdatum) oder einem von Zhai YG (13) gemeldeten Virus auf und gilt als Virus, das wahrscheinlich von demselben Stamm wie CCTCC V201423 abgeleitet ist.
In einigen Ausführungsformen ist das oben beschriebene Protein ein isoliertes Polypeptid.
In einigen Ausführungsformen ist die oben beschriebene Nukleinsäure ein isoliertes Polynukleotid.
In einigen Ausführungsformen ist das oben beschriebene M1-Virus ein isoliertes Virus.
Figurenliste

1 zeigt die Nukleotidsequenzierung der mutierten Stellen von 4 mutierten Viren (rM1-NS3M, rM1-E2M, rM1-N3E2M und rM1-c6v1). 1A zeigt die Nukleotidsequenzierung von Aminosäureresten in der Nähe der 358-ten Stelle des NS3-Proteins. Eine Nukleotidsequenz an dieser Stelle des Wildtyps ist CCA, und eine entsprechende Aminosäure ist M; eine Nukleotidsequenz der Mutante ist CCC, und eine entsprechende Aminosäure ist L; und 1B zeigt die Nukleotidsequenzierung von Aminosäureresten in der Nähe der 4-ten Stelle des E2-Proteins. Eine Nukleotidsequenz an dieser Stelle des Wildtyps ist AAA oder GAA, und eine entsprechende Aminosäure ist K oder E; und eine Nukleotidsequenz der Mutante istAAC oder GAC, und eine entsprechende Aminosäure ist N oder D.
2 zeigt die verstärkte onkolytische Wirkung von ortsgerichteten Virenmutanten (rM1-NS3M, rM1-E2M und rM1-N3E2M) auf eine HCT 116-Zelllinie:
2A zeigt die Zellmorphologie der HCT 116-Zellen, die mit 1 MOI für 48 Stunden infiziert wurden; 2B zeigt den Vergleich der Überlebensraten der mit rM1-WT, rM1-NS3M, rM1-E2M und rM1-N3E2M-Viren in 0,001 bis 10 MOI für 72 Stunden durch ein MTT-Verfahren infizierten Zellen.
3 zeigt Sicherheits- und Wirksamkeitstests eines rM1-N3E2M-Virus an einem Tiermodell. Eine Nacktmaus trägt subkutan einen HCT116-Tumor und erhält 14 Tage nach der Tumorinokulation das Virus durch intravenöse Injektion; das Volumen des Tumors und das Gewicht der Nacktmaus werden wiederholt gemessen und mittels ANOVA statistisch ausgewertet, und wenn *p<0,05, weist das Ergebnis statistische Signifikanz auf. 3A zeigt Wachstumsveränderungen des Tumors im subkutanen tumortragenden Nacktmausmodell, und 3B zeigt Gewichtsveränderungen der Nacktmaus im subkutanen tumortragenden Nacktmausmodell.
4 zeigt, dass nach einer Infektion mit dem rM1-N3E2M-Virus die Expression des Apoptoseindexes CI-casp3 im Tumorgewebe hochreguliert und die Expression des Zellproliferationsindexes Ki67 herunterreguliert wird. Nachdem subkutane, tumortragende Nacktmausmodelle 3 Tage lang mit rM1-WT und rM1-N3E2M behandelt wurden, wurde Tumorgewebe entnommen und die Expression von CI-casp3 und Ki67 mittels immunhistochemischer Färbung nachgewiesen.
5 zeigt, dass ein rM1-N3E2M-Virus in normalen Organen und Geweben keine toxische Läsion hervorruft.
6 zeigt die Ergebnisse des Sicherheits- und Wirksamkeitsexperiments eines M1-c6v1-Virus an einem Tiermodell: eine C57 BL/6-Maus trägt subkutan einen B16-F10-Tumor und wird 11 Tage nach der Tumorinokulation durch intravenöse Injektion mit dem Virus behandelt; das Volumen des Tumors und das Gewicht der nackten Maus werden wiederholt gemessen und einerANOVA-Statistik unterzogen, und wenn *p<0,05, weist das Ergebnis statistische Signifikanz auf. 6A zeigt die Wachstumsveränderungen des Tumors im subkutanen tumortragenden Mausmodell, und 6B zeigt die Gewichtsveränderungen der nackten Maus im subkutanen tumortragenden Mausmodell.
7A bis 7Z zeigen die Sequenzierung von mutanten Stellen verschiedener ortsgerichteter Mutantenstämme eines M1-Virus: 7A zeigt rM1-WT (E2-4K) (AAA); 7B zeigt einen mutierten Stamm (E2-4L, AAA→CTG); 7C zeigt einen mutierten Stamm (E2-4I, AAA→ATT); 7D zeigt einen mutierten Stamm (E2-4V, AAA→GTG); 7E zeigt einen mutierten Stamm (E2-4S, AAA→AGC); 7F zeigt einen mutierten Stamm (E2-4C, AAA→TGC); 7G zeigt einen mutierten Stamm (E2-4L, AAA→CTG); 7H zeigt einen mutierten Stamm (E2-4D, AAA→GAT); 7I zeigt rM1-WT (NS3-358M, ATG);
7J zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358G, ATG→GGC); 7K zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358A, ATG→GCG); 7L zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358L, ATG→CTG); 7M zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358I, ATG→ATT); 7N zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358V, ATG→GTG); 7O zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358P, ATG→CCG); 7P zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358S, ATG→AGC); 7Q zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358Q, ATG→CAG); 7R zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358T, ATG→ACC); 7S zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358C, ATG→TGC); 7T zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358N, ATG→AAC);
7U zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358F, ATG→TTT); 7V zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358Y, ATG→TAT); 7W zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358D, ATG→GAT); 7X zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358K, ATG→AAA); 7Y zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358R, ATG→CGT); und 7Z zeigt einen mutierten Stamm (NS3-358H, ATG→CAT).
8A bis 8Z zeigen die Abtötungskurven verschiedener ortsgerichteter (Einzelpunktmutanten) Mutantenstämme eines M1-Virus auf HCT 116: 8A zeigt eine Abtötungs-Kurve von rM-WT (E2-4K); 8B zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes E2-4L; 8C zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes E2-4I; 8D zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes E2-4V; 8E zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes E2-4S; 8F zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes E2-4C; 8G zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes E2-4M; 8H zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes E2-4D; 8I zeigt eine Abtötungs-Kurve von rM-WT (NS3-358M); 8J zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358G; 8K zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358A; 8L zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358L; 8M zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358I; 8N zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358V; 8O zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358P; 8P zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358S; 8Q zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358Q; 8R zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358T; 8S zeigt eine Abtötungs-Kurve eines mutierten Stammes NS3-358C; 8T zeigt eine Abtötungs-Kurve des mutierten Stammes NS3-358N; 8U zeigt eine Abtötungs-Kurve des mutierten Stammes NS3-358F; 8V zeigt eine Abtötungs-Kurve des mutierten Stammes NS3-358Y; 8W zeigt eine Abtötungs-Kurve des mutierten Stammes NS3-358D; 8X zeigt eine Abtötungs-Kurve des mutierten Stammes NS3-358K; 8Y zeigt eine Abtötungs-Kurve des mutierten Stammes NS3-358R; und 8Z zeigt eine Abtötungs-Kurve des mutierten Stammes NS3-358H.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die technischen Lösungen der vorliegenden Offenlegung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen weiter beschrieben, die den Schutzbereich der vorliegenden Offenlegung nicht einschränken sollen. Einige nicht wesentliche Änderungen und Anpassungen, die von anderen auf der Grundlage des Konzepts der vorliegenden Offenbarung vorgenommen wurden, fallen unter den Schutzbereich der vorliegenden Offenbarung.
Definition
Sofern nicht anders definiert, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die in der vorliegenden Offenlegung verwendet werden, dieselbe Bedeutung auf, wie sie von Fachleuten der Fachwelt, zu der die vorliegende Offenlegung gehört, gemeinhin verstanden werden.
Sofern nicht anders angegeben, handelt es sich bei der Mutation im Sinne der vorliegenden Offenlegung um eine natürliche Mutation, eine obligatorische Mutation oder eine selektive Mutation, die eine Genveränderung, eine Sequenzvergrößerung oder - deletion oder eine teilweise Substitution beinhaltet, aber nicht darauf beschränkt ist.
Es sei darauf hingewiesen, dass die „Mutation“ in der vorliegenden Offenlegung eine künstliche Mutation (induzierte Mutation oder Gentechnik) an einer bestimmten Stelle eines Wildtyp-Virusstamms beinhaltet. Es ist in der Fachwelt wohlbekannt, dass Wildtyp und Mutante relativ zueinander sind und dass Wildtyp-Virusstämme selbst Unterschiede in den Nukleotid-oder Aminosäuresequenzen aufweisen.
Der hier verwendete Begriff „und/oder“ bezieht sich auf alle möglichen Kombinationen von einem oder mehreren der aufgeführten Gegenstände. Wenn der Begriff „und/oder“ in einer Liste von zwei oder mehr Gegenständen verwendet wird, bedeutet er, dass jeder der aufgelisteten Gegenstände einzeln oder eine beliebige Kombination von zwei oder mehr der aufgelisteten Gegenstände verwendet werden kann. Wenn beispielsweise eine Zusammensetzung, eine Kombination oder eine Struktur so beschrieben wird, dass sie die Bestandteile A, B, C und/oder D beinhaltet (oder enthält), kann die Zusammensetzung nur A enthalten, nur B enthalten, nur C enthalten, nur D enthalten, eine Kombination von A und B enthalten, eine Kombination von A und C enthalten, eine Kombination von A und D enthalten, eine Kombination aus B und C enthalten, eine Kombination aus B und D enthalten, eine Kombination aus C und D enthalten, eine Kombination aus A, B und C enthalten, eine Kombination aus A, B und D enthalten, eine Kombination aus A, C und D enthalten, eine Kombination aus B, C und D enthalten oder eine Kombination aus A, B, C und D enthalten.
Hier bezieht sich zum Beispiel M358G des NS3-Proteins auf eine M358G-Mutation eines Aminosäurerests an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins eines M1-Virus, und der Aminosäurerest mutiert von M zu G; und zum Beispiel bezieht sich „M358A“ auf eine M358A-Mutation des Aminosäurerests an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus, und der Aminosäurerest mutiert von M zu A. Das Andere ist das gleiche.

Hier bezieht sich zum Beispiel K4M des E2-Proteins auf eine K4M-Mutation eines Aminosäurerests an der 4-ten Stelle des E2-Proteins des M1-Virus, und der Aminosäurerest mutiert von K zu M; und zum Beispiel bezieht sich K4A des E2-Proteins auf eine K4A-Mutation des Aminosäurerests an der 4-ten Stelle des E2-Proteins des M1-Virus, und der Aminosäurerest mutiert von K zu A. Das Andere ist das gleiche. Tabelle 1: Liste der Aminosäuren

Name	Abkürzung		Strukturformel
Glycin	Gly	G
Alanin	Ala	A
Leucin	Leu	L
Isoleucin	IIe	I
Valin	Val	V
Prolin	Pro	P
Serin	Ser	S
Glutamin	Gln	Q
Threonin	Thr	T
Cystein	Cys	C
Asparagin	Asn	N
Methionin	Met	M
Phenylalanin	Phe	F
Tyrosin	Tyr	Y
Tryptophan	Trp	W
Asparaginsäure	Asp	D
Glutaminsäure	Glu	E
Lysin	Lys	K
Arginin	Arg	R
Histidin	His	H

NS3-Protein: Nichtstrukturprotein 3.
E2-Protein: Hüllprotein 2.

Die Anzahl der verschiedenen Sequenzen ist in der nachstehenden Tabelle A aufgeführt: Tabelle A

	Sequenz Name (220)	Sequenz Nr.
PCR Primer	Mutanten-Protein NS3 F primer	(SEQ ID NO: 1)
	Mutanten-Protein NS3 R primer	(SEQ ID NO: 2)
	Mutanten-Protein E2 F primer	(SEQ ID NO: 3)
	Mutanten-Protein E2 R primer	(SEQ ID NO: 4)
Künstlich synthetisiertes M1-Virus gemäß einem Sequenzierungsergebnis von CCTCC V201423	Genom	(SEQ ID NO: 5)
	NS1-Protein	(SEQ ID NO: 6)
	NS2-Protein	(SEQ ID NO: 7)
	NS3-Protein	(SEQ ID NO: 8)
	NS4-Protein	SEQ ID NO: 9)
	C-Protein	(SEQ ID NO: 10)
	E3-Protein	(SEQ ID NO: 11)
	E2-Protein	(SEQ ID NO: 12)
	6K-Protein	(SEQ ID NO: 13)
	E1-Protein	(SEQ ID NO: 14)
M1-c6 Virus	Genom	(SEQ ID NO: 15)
	NS1-Protein	(SEQ ID NO: 16)
	NS2-Protein	(SEQ ID NO: 17)
	NS3-Protein	(SEQ ID NO: 18)
	NS4-Protein	(SEQ ID NO: 19)
	C-Protein	(SEQ ID NO: 20)
	E3-Protein	(SEQ ID NO: 30)
	E2-Protein	(SEQ ID NO: 31)
	6K-Protein	(SEQ ID NO: 32)
	E1-Protein	(SEQ ID NO: 33)
Primer für ortsgerichtete Mutationen	5173	(SEQ ID NO: 21)
	5230	(SEQ ID NO: 22)
	4907	(SEQ ID NO: 23)
	5298	(SEQ ID NO: 24)
	7104	(SEQ ID NO: 25)
	9420	(SEQ ID NO: 26)
	9510	(SEQ ID NO: 27)
	9486	(SEQ ID NO: 28)
	10521	(SEQ ID NO: 29)

Wildtyp-M1-Virus: Es handelt sich um ein in der Natur entstandenes Virusindividuum, dessen entsprechendes Genom ein Wildtyp-Genom ist. Das Wildtyp-Genom kann an bestimmten Stellen eine Diversität aufweisen. Beispielsweise ist ein Aminosäurerest an der 4-ten Stelle des E2-Proteins des bekannten Wildtyp-M1-Virus E oder K.
Pseudo-Wildtyp-M1-Virus: Bezieht sich auf ein M1-Virus, dessen Sequenz nicht genau mit der des bekannten Wildtyp-M1-Virus übereinstimmt und dessen biologische Eigenschaften sich nicht wesentlich von denen des bekannten Wildtyp-M1-Virus unterscheiden.
In einigen Ausführungsformen kann das Wildtyp-M1-Virus beispielsweise ein M1-Virus mit der Hinterlegungsnummer CCTCC V201423 oder ein monoklonales M1-c6-Virus sein, oder es kann sich beispielsweise um EU015061.1 oder EF011023.1 handeln.
In einigen Ausführungsformen können zum Beispiel Mutationen an einer oder mehreren der folgenden Stellen ausgehend vom Wildtyp auftreten: an Aminosäureresten an der 2-ten Stelle und/oder der 786-ten Stelle des Nichtstrukturproteins NS2; an Aminosäureresten an der 30-ten Stelle und/oder der 393-ten Stelle des Nichtstrukturproteins NS3; an einem Aminosäurerest an der 381-ten Stelle des Nichtstrukturproteins NS3; an einem Aminosäurerest an der 154-ten Stelle des Strukturproteins C; und an einem Aminosäurerest an der 246-ten Stelle des Strukturproteins E2.
rM1-WT: bezieht sich auf ein M1-Virus mit einer Genomsequenz, die als SEQ ID NO: 5 angegeben ist, und es enthält eine NS1-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 6 angegeben ist; eine NS2-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 7 angegeben ist; eine NS3-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 8 angegeben ist; eine NS4-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 9 angegeben ist; eine C-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 10 angegeben ist; eine E3-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 11 angegeben ist; eine E2-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 12 angegeben ist; eine 6K-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 13 angegeben ist; und eine E1-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 14 angegeben ist. Ein Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des im M1-Virus enthaltenen NS3-Proteins ist M, und ein Aminosäurerest an der 4-ten Stelle des E2-Proteins ist K.
rM1-NS3M: ein rekombinantes M1-Virus, das durch eine M358L-Mutation (d. h. M mutiert zu L) eines Aminosäurerests an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins ausgehend von rM1-WT gewonnen wird.
rM1-E2M: ein rekombinantes M1-Virus, das durch eine K4N-Mutation (d. h. K mutiert zu N) eines Aminosäurerests an der 4-ten Stelle des E2-Proteins auf der Basis von rM1-WT gewonnen wird.
rM1-N3E2M: ein rekombinantes M1-Virus, das durch eine M358L-Mutation (d. h. M mutiert zu L) eines Aminosäurerests an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins ausgehend von rM1-WT und eine K4N-Mutation (d. h. K mutiert zu N) eines Aminosäurerests an der vierten Stelle des E2-Proteins erhalten wird.
M1-c6: bezieht sich auf ein M1-Virus mit einer Genomsequenz, die als SEQ ID NO: 15 angegeben ist, und es enthält eine NS1-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 16 angegeben ist; eine NS2-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 17 angegeben ist; eine NS3-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 18 angegeben ist; eine NS4-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 19 angegeben ist; eine C-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 20 angegeben ist; eine E3-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 30 angegeben ist; eine E2-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 31 angegeben ist; eine 6K-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 32 angegeben ist; und eine E1-Protein Sequenz, die als SEQ ID NO: 33 angegeben ist. Ein Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus ist M, und ein Aminosäurerest an der vierten Stelle des E2-Proteins ist E.
M1-c6v1: ein rekombinantes M1-c6-Virus, das durch eine M358L-Mutation (d. h. M mutiert zu L) eines Aminosäurerests an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins ausgehend von M1-c6 und eine E4D-Mutation (d. h. E mutiert zu D) eines Aminosäurerests an der 4-ten Stelle des E2-Proteins erhalten wird.
Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins: Im derzeit bekannten Wildtyp des M1-Virus ist diese Stelle die 358-ste im NS3-Protein. Eine Sequenz von 3 Aminosäureresten stromaufwärts des N-Terminus ist YET, und eine Sequenz von 3 Aminosäureresten stromabwärts des C-Terminus ist EVV. Die Zahl „358“ sollte nicht als absolute Einschränkung angesehen werden, und ob sich ein bestimmter Aminosäurerest (z. B. ein varianter Aminosäurerest) an dieser Stelle befindet, sollte basierend auf einer funktionellen Domäne oder einem Motiv bestimmt werden, in der/dem sich der Aminosäurerest befindet. Es ist beispielsweise nicht ausgeschlossen, dass in Sequenzen anderer Pseudo-Wildtyp-M1-Viren diese Stelle in der Primärstruktur des NS3-Proteins nicht notwendigerweise an der Position 358 zu finden ist. Zu diesem Zeitpunkt sollte „358“ nicht als absolute Einschränkung angesehen werden, und ob der spezifische Aminosäurerest zu dem Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins der vorliegenden Offenbarung gehört, sollte basierend auf einer funktionellen Domäne oder einem Motiv bestimmt werden, wo sich der Aminosäurerest befindet.
Aminosäurerest an der 4-ten Stelle des E2-Proteins: Im derzeit bekannten M1-Wildtyp-Virus ist diese Stelle die 4-ten im E2-Protein. Eine Sequenz von 3 Aminosäureresten stromaufwärts des N-terminalen ist SVT, und eine Sequenz von 3 Aminosäureresten stromabwärts des C-terminalen ist HFN. Die Zahl „4“ sollte nicht als absolute Einschränkung angesehen werden, und ob sich ein bestimmter Aminosäurerest (z. B. ein varianter Aminosäurerest) an dieser Stelle befindet, sollte basierend auf einer funktionellen Domäne oder einem Motiv bestimmt werden, in der/dem sich der Aminosäurerest befindet. Es ist beispielsweise nicht ausgeschlossen, dass in Sequenzen anderer Pseudo-Wildtyp-M1-Viren diese Stelle nicht notwendigerweise an vierter Stelle in der Primärstruktur des E2-Proteins zu finden ist. Zu diesem Zeitpunkt sollte „4“ nicht als absolute Einschränkung angesehen werden, und ob der spezifische Aminosäurerest zu dem Aminosäurerest an der 4-ten Stelle des E2-Proteins der vorliegenden Offenlegung gehört, sollte basierend auf einer funktionellen Domäne oder einem Motiv bestimmt werden, wo sich der Aminosäurerest befindet.
Pharmazeutisch verträglicher Träger: bezieht sich auf eine molekulare Einheit oder eine Zusammensetzung, die bei Verabreichung an Menschen keine allergischen oder ähnlichen unerwünschten Reaktionen hervorruft. Die pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhalten alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Zwischenmedien, Beschichtungen, Verdünnungsmittel, antibakterielle Mittel, antimykotische Mittel, isotonische Mittel, Mittel zur Verzögerung der Absorption, Puffer, Trägerlösungen, Suspensionen, Kolloide, usw. Die Verwendung dieser Medien und Reagenzien für Wirkstoffe von Arzneimitteln ist in der Fachwelt gut bekannt. Es wird erwartet, dass der pharmazeutisch akzeptable Träger in einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet wird, es sei denn, ein herkömmliches Medium oder Mittel ist mit einem Wirkstoff unverträglich.
Immun-Checkpoint-Inhibitor: Er bezieht sich auf Moleküle, die ein oder mehrere Checkpoint-Proteine ganz oder teilweise reduzieren, inhibieren, stören oder regulieren. Die Checkpoint-Proteine regulieren und kontrollieren die Aktivierung und die Funktionen von T-Zellen. Die bekannten Checkpoint-Proteine umfassen zum Beispiel CTLA-4 und seine Liganden CD80 und CD86 sowie PD1 und seine Liganden PDL1 und PDL2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012). Diese Proteine sind für die Co-Stimulation oder Inhibierung von Interaktionen der T-Zell-Antwort verantwortlich. Die Immun-Checkpoint-Proteine regulieren und kontrollieren und erhalten die Toleranz sowie die Dauer und Bandbreite der physiologischen Immunantwort. Die Immun-Checkpoint-Inhibitoren beinhalten Antikörper oder sind von Antikörpern abgeleitet.
Chemotherapeutisches Agens: eine Verbindung, die zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden kann.
Behandlung: Sie bezieht sich auf die Linderung von Symptomen, die vorübergehende oder dauerhafte Beseitigung der Ursache von Symptomen oder die Verhinderung oder Verlangsamung der Symptome einer bestimmten Krankheit oder Störung.
Wirksame Menge: Sie bezieht sich auf die Menge eines Alphavirus oder eines Proteasom-Inhibitors, die in der vorliegenden Offenlegung verwendet wird, die für einen gewünschten therapeutischen Effekt erforderlich ist. Die genaue benötigte Menge variiert je nach Objekt und den folgenden Faktoren: behandelte Spezies, Alter und allgemeiner Zustand des behandelten Objekts, Schweregrad der behandelten Krankheit, verabreichter Wirkstoff, Verfahren der Verabreichung usw. In einer gegebenen Situation kann der Fachmann jedoch die Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Offenlegung gemäß der Schwere der Symptome, der Häufigkeit des Wiederauftretens und der physiologischen Reaktion auf eine therapeutische Behandlung anpassen.
Beispiel 1 Konstruktion und Identifizierung von ortsgerichteten M1-Mutantenvirusstämmen
Material:

1. Klonierung: TOP10 kompetente Zellen, Plasmid-Mikroextraktionskits, DNA-Produktrückgewinnungskits; Gibson Assembly Master Mix; Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase.
2. Restriktionsendonukleasen Spel, Swal, Xhol, Apal und Xbal.
3. Die ortsgerichteten Mutations-Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt:

Name	Sequenz
5173	TTGACCAGACCGTCCCGTCACTAGTAAGTCCCAGAAAGTACATACAGCA(SEQ ID NO: 21)
5230	ACTTCCAGGGTTTCGTAGGTCGT (SEQ IDNO: 22)
4907	ACTCCAAGATGCTAACGAGCAGATCTGCCTGTACGCCCTAGGGGAGAC (SEQ ID NO: 23)
5298	ACGACCTACGAAACCCTGGAAGT (SEQ ID NO: 24)
7104	CTGACTTCATCATAGCACCGAATTTAAATCTTGTACCGGTAGGTAGATGCACACTCGT (SEQ ID NO: 25)
9420	CGGGCTACTACGACCTGCTCGAGGCCACGATGACGTGTAACAACAGTGCACGCC (SEQ ID NO: 26)
9510	TTGTAGACATTGAAGTGGTTCGTCACACTGCGACGGTGGCGTGCACTGTTGTTACACG (SEQ ID NO: 27)
9486	TGACGAACCACTTCAATGTCTACAA (SEQ ID NO: 28)
10521	GGTTTGCCTTCAGTTGTCAGCTGGGCCCACAAGCGCACGGGTGGG (SEQ ID NO: 29)

4. Vollgenom-Plasmide des Wildtyp-M1-Virus: pBR-M1-WT ist ein Plasmidvektor, der ein M1-Vollgenom enthält, das eine als SEQ ID NO: 5 angegeben Sequenz aufweist. Ein Vollgenom wird gemäß der als SEQ ID NO: 5 angegebenen Sequenz synthetisiert, und die M1-Sequenz wird zwischen Clal- und EcoRI-Spaltstellen eines pBR322-Vektors (der mit mehreren Klonierungsstellen versehen ist) durch eine rekombinante DNA-Technologie kloniert, um den pBR-M1-WT-Vektor zu bilden. Ein pBR-M1-c6-Vektor wird durch ein ähnliches Verfahren konstruiert, wobei M1-c6 ein M1-Virus mit einer als SEQ ID NO: 15 angegebenen Sequenz ist, ein Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-c6-Virus M ist und ein Aminosäurerest an der vierten Stelle des E2-Proteins E ist.
5. Vollgenom-Plasmide mutierter Viren: Mutationen werden in die pBR-M1-WT-Vektoren durch eine ortsgerichtete Mutationstechnologie eingeführt, um pBR-M1-NS3M (d. h. eine M358L-Mutation eines Aminosäurerests an der 358-ten Stelle des enthaltenen NS3-Proteins), pBR-M1-E2M (d. h. eine K4N-Mutation eines Aminosäurerests an der vierten Stelle des E2-Proteins) und pBR-M1-N3E2M (d. h. eine M358L-Mutation eines Aminosäurerestes an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins und eine K4N-Mutation eines Aminosäurerestes an der 4-ten Stelle des E2-Proteins); Mutationen werden in pBR-M1-c6 eingeführt, um pBR-M1-c6v1 zu bilden (d.h. eine M358L-Mutation eines Aminosäurerestes an der 358-ten Stelle des enthaltenen NS3-Proteins und eine E4D-Mutation des Aminosäurerestes an der 4-ten Stelle des E2-Proteins).
6. DH5α-kompetente Zellen, hochreine Plasmid-Mikroextraktionskits, JM110-kompetente Zellen und Lipofectamine RNA iMAX-Transfektionsreagenz.
7. RNA-Extraktion: TRIzol; Chloroform, Isopropanol und wasserfreies Ethanol.
8. Reverse Transkription: Zufälliges Hexamer, dNTP, MMLV und RNaseOUT.
9. PCR: Q5-High-Fidelity-Enzyme und die in Tabelle 3 aufgeführten PCR-Primer. Die Primer werden von Invitrogen synthetisiert.
10. Agarosegel-DNA-Rückgewinnungs-Kits.
11. DNA-Elektrophorese: Agarose, SYBR-Grün und DNA-Marker.

Mutantes Protein	Vorwärts-Primer (F)	Reverser-Primer (R)
NS3	GCTCCTCCTTTCCATTGC (SEQ ID NO: 1)	TTCTTCTCTTTCTTGGTGCC (SEQ ID NO: 2)
E2	TGATGATGTGCGTCTTAGC C (SEQ ID NO: 3)	ATCGTGCCTCGAATAGCG (SEQ ID NO: 4)

Verfahren:
1. Konstruktion von Vektoren für Volllängen-Genplasmide von Viren
pBR-M1-WT- und pBR-M1-c6-Bakterien wurden in 5 mL LB-Medien gegeben und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Die Plasmide wurden mit einem Plasmid-Mikroextraktionskit extrahiert, und die DNA-Konzentration der Plasmide wurde mit Nanodrop gemessen. Ein PCR-Amplifikationssystem ist in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 PCR-Amplifikationssystem für die ortsgerichtete Mutation

Reagenz Volumen (µL)

2x Phanta Max Puffer 25

dNTP Mix (10 mM jedes) 1

DNA 1

Vorwärts Primer 1

Reverser Primer 1

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (1 U/µl) 1

ddH₂O 20
Reaktionsbedingungen: Die Vordegeneration erfolgte bei 98°C für 3 min; die Amplifikation erfolgte bei 98°C für 15 s, bei 58°C für 15 s bzw. bei 72°C für 45 s und wurde 35 Mal zyklisiert; die Verlängerung erfolgte bei 72°C für 5 min, und nach Abschluss der Reaktion wurde das System auf 4°C abgekühlt. Das Vorhandensein von Produkten und die korrekte Größe wurden mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese bestimmt.
Enzymspaltung von Vektorplasmiden: Es wurden Enzymspaltungssysteme für die in Tabelle 5 aufgeführten NS3- und E2-Mutationen hergestellt: Tabelle 5 Restriktives Endonuklease-Enzym-Spaltungssystem

NS3 E2

pBR-M1-WT pBR-M1-WT

1 µg 1 µg

10x Puffer 2µL 10x Puffer 2µL

Spel 1µL apal IµL

Swal 1µL Xhol 1µL

ddH₂O 6µL ddH₂O 6µL
Die Systeme reagierten 1 Stunde lang bei 37°C; die Plasmide wurden nach der Enzymspaltung mit einem Kit wiedergewonnen, und die Konzentration wurde gemessen.
Der Vektor und die PCR-Fragmente wurden mit einem Gibson Assembly Master Mix Kit assembliert. Reaktionssystem: PCR-Fragment 1 + PCR-Fragment 2 + Plasmide + 2x Mix + H2O = 1 + 1 + 1 + 10 + 7 (µL). Reaktionsbedingungen: 50°C, 1 h.
Transformation und Klonierung: 100 µl kompetente DH5α-Zellen wurden mit 10 µl Konjugaten transformiert und auf einer Ampicillin-resistenten Platte selektiert. Die Klone wurden für die Sequenzierung der Proben ausgewählt. Durch eine NS3-Mutation auf Plasmiden des Vektors mit einer E2-Mutation wurde ein doppelstelliges mutiertes Virus erhalten.
2. Herstellung von ortsgerichteten Virenmutanten
pBR-M1-NS3M, pBR-M1-E2M, pBR-M1-N3E2M und pBR-M1-c6v1-Bakterien wurden in 5 ml LB-Medium beimpft und über Nacht bei 37° geschüttelt. Die Plasmide wurden mit einem Kit extrahiert, und die Konzentration wurde gemessen. JM110 wurden transformiert (die Transformationseffizienz der kompetenten JM110-Zellen war relativ gering, es wurde eine relativ große Menge an Plasmiden benötigt, um 100 µl kompetente Zellen zu transformieren, 300 µl LB-Lösung wurde hinzugefügt, und nach einer Erholungsphase von 1 Stunde wurden die Zellen auf eine Platte aufgetragen) und auf einer Ampicillin-resistenten Platte selektiert. Monoklone wurden selektiert und in 500 µl LB/Ampicillin-Medium gegeben, die Bakterien wurden 12 h bei 37°C geschüttelt, das Kultursystem wurde verstärkt, und die Bakterien wurden 14 bis 16 h bei 37°C geschüttelt. Wenn die Konzentration der Bakterienlösung angemessen war, wurden die Bakterien mit Glycerin in einer Endkonzentration von 15 bis 30 % gelagert. Die Plasmide wurden mit einem endotoxinfreien Plasmidextraktionskit extrahiert, und die Konzentration wurde gemessen. Eine Xbal-Endonuklease zur Linearisierung von Plasmiden ist in Tabelle 6 aufgeführt: Tabelle 6 Plasmid-Linearisierungsenzym-Spaltungssystem

Reagenz Volumen (µL)

10x Puffer 10

Xbal 5

DNA (10 µg) x

ddH₂O 85-x

Das System wurde auf zwei Röhrchen aufgeteilt und bei 37°C für 2 h zur Reaktion gebracht. Proteinase K-Verdau: Proteinase K (20 mg/ml) wurde 10-fach verdünnt, 2,5 µl der verdünnten Proteinase K wurden in jedes Röhrchen gegeben, 5 µl 10%iges SDS wurde hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 50°C inkubiert. Die nach der Enzymspaltung linearisierten Plasmide wurden mit einem Kit wiedergewonnen, und die DNA-Konzentration wurde gemessen. In-vitro-Transkription: Die Reaktion wurde bei 37°C für 2 h durchgeführt, nach der Reaktion wurden die Produkte nicht kryokonserviert und direkt im nächsten Arbeitsgang verwendet. Ein System ist in Tabelle 7 dargestellt: Tabelle 7 In-vitro-Transkriptionssystem

Reagenz	Probenvolumen (µL)
SP6 Transkription 5x Puffer	4
rNTPs (100 mM) (A + C + U + G)	1 + 1 + 1 + 0.6
Linearisiertes DNA-Matrize (1 to 2 µg)	8.4
Ribo m⁷G Cap Analog, 40 mM	2
Enzym Mix	2
Totales Volumen	20

Entfernung der DNA-Matrize: RQ1 RNase-freie DNase (1 U/µL) wurde in die DNA-Matrize mit 1 U/µg zugegeben und bei 37°C für 15 Minuten umgesetzt. RNA-Transfektion: Vero-Zellen wurden einen Tag im Voraus in eine 6-Well-Platte mit 3×105 Zellen/Well beimpft und mit 1,5 mL Vollmedium kultiviert; 125 µL Opti-MEM wurden gleichmäßig mit 3,75 µL LipomRNA vermischt, 125 µL Opti-MEM wurden gleichmäßig mit 2. 5 µg RNA, dann wurden beide in ein Röhrchen gegeben und gleichmäßig gemischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen; ein Komplex aus RNA und dem Transfektionsreagenz wurde in die Zellkulturschale gegeben; ob die zytopathische Morphologie auftrat, wurde in den nächsten 2 bis 4 Tagen beobachtet, ein Überstand wurde gesammelt, und das Virus wurde mit Vero-Zellen amplifiziert.
3. RNA-Extraktion nach dem TRIzol-Verfahren
Die Zellen wurden durch Pipettieren mit TRIzol vollständig lysiert. Wenn Ausfällungen auftraten, wurde die Zelllösung 10 Minuten lang bei 12.000 g und 4°C zentrifugiert und ein Überstand gesammelt. 200 µl Chloroform wurden zugegeben, die Mischung wurde kräftig geschüttelt und gleichmäßig gemischt, und die Mischung wurde 3 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 12 000 g und 4°C zentrifugiert, etwa 500 µl der oberen wässrigen Phase wurden in ein neues EP-Röhrchen gesaugt. Es wurden 500 µl Isopropanol zugegeben, das Gemisch wurde vorsichtig durch Umdrehen gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 12 000 g und 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde abgenommen. Die Präzipitate wurden mit 500 µl vorgekühltem 75 %igem Ethanol gewaschen, das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 12 000 g und 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die RNA-Präzipitate in einer angemessenen Menge DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst. Die RNA-Konzentration wurde mit einem Nanodrop gemessen.
4. Reverse Transkription
Die reverse Transkription wurde mit der MMLV-Reverse-Transkriptase durchgeführt: Tabelle 8

Volumen (µL)

50 µM zufällig Hexamer 1

10 mM dNTP 1

RNA (1 to 5 µg) x

DEPC-behandeltes Wasser 10-x
Verschiedene in Tabelle 8 aufgeführte Reaktionskomponenten wurden zugegeben, und das System wurde 5 Minuten lang bei 65°C vordegeneriert und sofort für 2 bis 3 Minuten auf Eis gelegt;
4 µL der 5x-Puffer-Reaktionslösung, 2 µL RNaseOUT-Regent, 1 µL DTT und 1 µL Reverse Transkriptase MMLV wurden hinzugefügt, und das System reagierte bei 25°C für 10 Minuten, bei 37°C für 50 Minuten und bei 70°C für 15 Minuten.
5. PCR
Revers transkribierte cDNA wurde 2- bis 5-fach verdünnt, und die DNA wurde einer PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Q5-High-Fidelity-Enzyms unterzogen (das Genom von M1 wurde in 10 Fragmente aufgeteilt und amplifiziert): Tabelle 9

Volumen (µL)

2x Mix 25

10 µM F 1

10 µM R 1

cDNA 1

ddH₂O 22
Reaktionsbedingungen: Vordegeneration erfolgte bei 98°C für 30 s; die Amplifikation erfolgte bei 98°C für 10 s, bei 58°C für 30 s und bei 72°C für 1 min und wurde 35-mal durchlaufen; die Verlängerung erfolgte bei 72°C für 2 min, und nach Abschluss der Reaktion wurde das System auf 4°C abgekühlt.
Nachweis der PCR-Produkte mittels 1%iger Agarosegel-Elektrophorese: 0.5 g Agarosegel wurden gewogen und in 50 mL Wasser gegeben, die Mischung wurde erhitzt, um das Agarosegel gründlich aufzulösen, nachdem die Mischung auf etwa 50°C abgekühlt war, wurde ein SYBR-Grün-Farbstoff im Verhältnis 1/10000 zugegeben, die Mischung wurde in eine Gelpräparationsplatte gegossen, ein Kamm wurde eingesetzt; Nach dem vollständigen Erstarren wurde die Mischung in einen Elektrophorese-Tank mit 5 µl/Vertiefung gegeben und einer Elektrophorese bei einer Spannung von 100 V für etwa 40 Minuten unterzogen; und die DNA-Produkte wurden mit einem Tanon-Imager beobachtet und fotografiert. Tabelle 10

Volumen (µL)

5x Puffer 4

Vector 1

Exnase 2

DNA (10 to 100 ng) x

ddH₂O 13-x
6. Die PCR-Produkte wurden zur Sequenzierung an Thermo Scientific geschickt.
Ergebnisse:
Wie in 1 dargestellt, zeigt der Vergleich der Gensequenzen, dass alle ortsgerichtet mutierten Viren erfolgreich konstruiert wurden und entsprechend die folgenden vier mutierten Viren sind:

(1) rM1-NS3M: ein Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins eines M1-Virus, aufweisend eine als SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz, mutiert von Methionin (M) zu Leucin (L);
(2) rM1-E2M: ein Aminosäurerest an der 4-ten Stelle des E2-Proteins eines M1-Virus, aufweisend eine als SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz, mutiert von Lysin (K) zu Asparagin (N);
(3) rM1-N3E2M: ein Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins eines M1-Virus, aufweisend eine als SEQ ID NO: 5 angegebenen Sequenz mutiert von Methionin (M) zu Leucin (L); und ein Aminosäurerest an der 4-ten Stelle des E2-Proteins des M1-Virus mutiert von Lysin (K) zu Asparagin (N); und
(4) rM1-c6v1: ein Aminosäurerest an der 358-ten Stelle des NS3-Proteins eines M1-Virus (d.h. M1-c6), aufweisend eine als SEQ ID NO: 15 angegebene Sequenz mutiert von Methionin (M) zu Leucin (L), und ein Aminosäurerest an der 4-ten Stelle des E2-Proteins mutiert von Glutaminsäure (E) zu Asparaginsäure (D).

Schlussfolgerungen:
4 mutierten Viren rM1-NS3M, rM1-E2M, rM1-N3E2M und rM1-c6v1 werden durch ortsgerichtete Mutation hergestellt. Die mutierten Viren rM1-NS3M, rM1-E2M und rM1-N3E2M werden ausgehend von ortsgerichteten Mutationen des M1-Virus, aufweisend die als SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz, erhalten; und rM1-c6v1 wird ausgehend von ortsgerichteten Mutationen des M1-Virus (M1-c6), aufweisend die als SEQ ID NO: 15 angegebene Sequenz, erhalten.
Beispiel 2 Antitumoreffekte von vier Mutanten M1-Viren auf eine Vielzahl von Tumorzellen
1. Experimentelle Materialien und Instrumente
1.1 Wichtigste Arzneimittel, Reagenzien und Zubereitungen
Wichtigste Arzneimittel und Reagenzien:

• M1-Viren: rM1-WT, rM1-NS3M, rM1-E2M, rM1-N3E2M, M1-c6, und M1-c6v1
• Zellzählungs-Kit-8 (CCK-8), erworben von Dojindo China Co., Ltd. (Gegenstand Nr.: CK-04)
• Kaliumchlorid wurde von Merck Chemicals (Shanghai) Co., Ltd. (Chargen-Nr.: K46837809603)
• Kaliumdihydrogenphosphat wurde von Merck Chemicals (Shanghai) Co., Ltd. (Chargen-Nr.: AM1217539805)
• Natriumbicarbonat wurde von Merck Chemicals (Shanghai) Co., Ltd. (Chargen-Nr.: K49804023804)
• Dinatriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat, erworben von Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipient Manufacturing Co., Ltd. (Chargen-Nr.: 20170402)
• Wasserfreies Kalziumchlorid, erworben von Hebei Huachen Pharmaceutical Co, Ltd. (Chargen-Nr.: 171009)
• Magnesiumchlorid-Hexahydrat, erworben von Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipient Manufacturing Co., Ltd. (Chargen-Nr.: 20170807)
• Mannitol von France Roquette (Chargennummer: E939X)
• Trehalose gekauft von U.S. Pfanstiehl (Chargen-Nr.: 36358A)
• Humanes Serumalbumin, erworben von Shenzhen Weiguang Biological Products Co., Ltd (Chargen-Nr.: 20171144B)

1.2 Hauptinstrumente

Tabelle 11: Wichtigste Versuchsinstrumente

Instrument	Hersteller	Model
Invertiertes Mikroskop	Nikon	ECLIPSE Ti-S
Biologische Sicherheitswerkbank	Thermo Fisher (Suzhou) Instruments	1374
Instrument zur Zellzählung und - analyse	Chemometec	Nucleocounter NC200
Elektrisch beheiztes thermostatisches Wasserbad	Shanghai Yiheng Technology Instrument	HWS-24
Desktop-Computer	Dell	OptiPlext 3020
Kühlschrank	Panasonic	BCD-Z51WZ
Zellinkubator	Thermo Fisher	3111
Absorptionsmessgerät für Mikroplatten	Biotek	ELX800
Saubere Bank	Suzhou Antai	SW-CJ-2FD
Zentrifuge	Jintan Kexi Instruments	80-2

2. Herkunft der Versuchszellen
Die Zellen wurden von ATCC oder National Collection of Authenticated Cell Cultures erworben.
3. Experimentelle Verfahren
• Zellkultur
Geeignete Kulturbedingungen wurden gemäß den Anweisungen für die verschiedenen Zellen ausgewählt, und die Zellvermehrung und -passage wurde gemäß den Passageverhältnissen der Anweisungen durchgeführt.
• Experimentelle Gruppierung und Verarbeitung

Es wurden inhibitorische Wirkungen von M1-c6v1 auf das Wachstum verschiedener Zellen festgestellt. Die spezifische Gruppierung und Verarbeitung ist in Tabelle 12 aufgeführt. Tabelle 12 Gruppierung und Auswertung eines Experiments zur inhibierenden Wirkung von M1-c6v1 auf das Wachstum von Zellen

Gruppe	Verarbeitung
Leere Kontrolle	ohne Zellen + Hilfsstofflösungen
Lösungsmittel Kontrolle	Hilfsstofflösungen
Positive Kontrolle	15 mg/mL oder 20 mg/mL 5-Fu Lösung
Positive Lösungsmittel Kontrolle	1xPBS
M1-c6v1	M1-c6v1 in verschiedenen Konzentrationen

Nach der Subkultivierung in die logarithmische Wachstumsphase wurden die Zellen aufgeschlossen, die Zellen wurden in einer entsprechenden Dichte in eine 48-Well-Platte beimpft, die Experimente wurden gemäß den oben genannten Gruppen eingestellt, für jede Gruppe wurden 3 duplizierte Wells bereitgestellt, und die leere Kontrollgruppe wurde nicht mit den Zellen beimpft. Nachdem die Zellen 24 Stunden lang adhärent kultiviert wurden, wurde die Probe zugegeben, die Kultivierung wurde 72 Stunden lang fortgesetzt, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde am Endpunkt festgestellt.
• Nachweis der Lebensfähigkeit von Zellen durch ein CCK-8-Verfahren
Die ursprünglichen Kulturlösungen in der 48-Well-Platte wurden entfernt, ein Farbentwicklungsmittel (100 % Vollmedium + 10 % CCK-8-Lösung) wurde langsam entlang der Wand in einer Menge von 200 µl/Well zugegeben, und nachdem die Zellen 0,5 bis 3 Stunden lang bei 37 °C kultiviert wurden, wurden die Absorptionswerte der verschiedenen Wells bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Absorptions-Mikroplattenlesegerät ermittelt.
• Berechnung der medianen inhibitorischen Konzentration (IC50) der M1-Viren gegen verschiedene Zellen
Zellwachstumsinhibitionsraten der verschiedenen Wells wurden gemäß den festgestellten Absorptionswerten der verschiedenen Wells mit der Formel Zellwachstumsinhibitionsrate (IR)=(Mittelwert OD_Negative-OD_Experiment)/(Mittelwert OD_Negative- Mittelwert OD_Leer)×100% berechnet, Zellwachstumsinhibitionskurven wurden mit der GraphPad Prism 7. 0 Software gezeichnet, und ein medianer inhibitorischer Konzentrationswert (IC50) von M1-c6v1 oder rM1-c6 gegen Tumorzellen wurde durch eine logarithmische (Inhibitor) vs. Reaktion - variable Steigung (vier Parameter) Analysegleichung berechnet.
• Nachweis der Zellaktivität durch MTT
Die Zellen wurden in eine 24-Well-Platte mit 20.000 Zellen/Well und 500 µl Medium pro Well beimpft, und die Zellen wurden 24 Stunden lang adhärent kultiviert. Die Wildtyp- und die mutierten Viren wurden in einem 10-fachen Verhältnis verdünnt, und die Viren wurden in 10 MOI in die 24-Well-Platte gegeben. Nachdem die Zellen 72 Stunden lang mit den Viren infiziert worden waren, wurden 50 µl MTT in jeden Well gegeben und gleichmäßig mit den Zellen vermischt, und die 24-Well-Platte wurde für 2 bis 4 Stunden in den Inkubator gestellt. Der Überstand wurde vorsichtig abgesaugt, 500 µl DMSO wurden in jeden Well gegeben, um das bläulich-violette kristalline Formazan aufzulösen, das auf einem mikroporösen Oszillator gründlich aufgelöst und gemischt wurde, und die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 570 nm mit dem Mikroplattenlesegerät ermittelt. Der Versuch wurde mindestens 3 mal wiederholt. Die Absorptionswerte der verschiedenen Gruppen wurden gemäß der leeren Kontrollgruppe normalisiert, die relative Zellüberlebensrate jeder Verarbeitungsgruppe wurde berechnet, und es wurde eine Überlebenskurve der Zellen erstellt.
• Statistische Verarbeitung
Alle Experimente wurden zwei- oder mehrmalig separat wiederholt, und die Versuchsergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung aufgezeichnet.
4. Experimentelle Ergebnisse
Wie in 2A gezeigt, wird unter dem Mikroskop beobachtet, dass die infizierten Zellen nach der Infektion mit den rM1-NS3M- und rM1-E2M-Viren Läsionen aufweisen, was darauf hinweist, dass eine Einzelstellen-Mutation unabhängig die Replikation und die onkolytische Wirkung des M1-Virus in Tumorzellen verbessern kann. Im Vergleich zu den Wildtyp- und den Einzelstellen-mutanten Viren beträgt die Infektionsrate nach der Infektion der Zellen mit dem rM1-N3E2M-Zwei-Stellen-Mutantenvirus mehr als 90%, und die meisten Zellen weisen Läsionen auf. Das Verfahren vergleicht weiterhin die Abtötungswirkung von rM1-WT, rM1-NS3M, rM1-E2M und rM1-N3E2M auf HCT-116-Zellen durch das MTT-Verfahren. In Übereinstimmung mit der Beobachtung unter dem Mikroskop verschieben sich die Dosis-Wirkungs-Kurven der rM1-NS3M- und rM1-E2M-Viren nach links, die EC50-Verschiebung ist gemäß der Berechnung um das 80- bzw. 60-fache erhöht, die Dosis-Wirkungs-Kurve des rM1-N3E2M-Virus verschiebt sich in größerem Maße nach links, und die EC50-Verschiebung ist um das 7.600-fache erhöht (siehe 2B), was darauf hindeutet, dass zwei mutante Stellen die onkolytische Wirkung des Virus synergistisch erhöhen.

Die onkolytischen Wirkungen und die Sicherheit von rM1-WT und 3 M1-Virusmutanten, d.h. rM1-NS3M, rM1-E2M und rM1-N3E2M, werden unter Verwendung von weiteren Tumorzellen und normalen Zellen verglichen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 13 bis Tabelle 15 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die 3 M1-Virusmutanten im Vergleich zum rM1-WT-Virus in unterschiedlichem Maße verbesserte onkolytische Wirkungen haben und nicht offensichtlich toxisch für die nachgewiesenen normalen Zellen sind. Tabelle 13 Abtötungseffekt von rM1-NS3M auf Tumorzellen (angegeben als Überlebensrate in % der Tumorzellen)

Zelllinie	Krankheitsquelle	Überlebensrate % der rM1-WT-Gruppe	Überlebensrate % der rM1-NS3M-Gruppe
HCT-8	Kolorektaler Krebs	64.1	10.7
SW620	Kolorektales Adenokarzinom	21.7	6.8
SW480	Kolorektaler Krebs	55.3	8.1
HCT-15	Kolorektales Adenokarzinom	29.3	19.8
Huh-7	Leberkrebs	30.9	10.8

Tabelle 14 Abtötungseffekt von rM1-E2M auf Tumorzellen (angegeben als Überlebensrate in % der Tumorzellen)

Zelllinie	Krankheitsquelle	Überlebensrate % der rM1-WTGruppe	Überlebensrate % der rM1-E2M-Gruppe
HCT-8	Kolorektaler Krebs	64.1	9.4
SW620	Kolorektales Adenokarzinom	21.7	6.9
SW480	Kolorektaler Krebs	55.3	7.2
HCT-15	Kolorektales Adenokarzinom	29.3	15.2
Huh-7	Leberkrebs	30.9	8.5

Tabelle 15 Abtötungseffekt von rM1-N3E2M auf Tumorzellen (angegeben als Überlebensrate in % der Tumorzellen)

Zelllinie	Krankheitsquelle	Überlebensrate % der rM1-WT-Gruppe	Überlebensrate % der rM1-N3E2M-Gruppe
HCT-8	Kolorektaler Krebs	64.1	8.7
SW620	Kolorektaler Krebs	21.7	10.3
SW480	Kolorektaler Krebs	55.3	19.6
Huh-7	Leberkrebs	30.9	6.9
SK-HEP-1	Leberkrebs	85.9	44.6
MDA-MB-231	Brustkrebs	17.0	3.0
MDA-MB-435S	Brustkrebs	38.0	4.0
BT-20	Brustkrebs	20.0	8.0
BT549	Brustkrebs	98.0	65.0
T47D	Brustkrebs	22.0	3.0
ZR-75-1	Brustkrebs	81.0	42.0
SW1990	Bauchspeicheldrüsenkrebs	32.9	16.1
MIA PACA-2	Bauchspeicheldrüsenkrebs	45.2	27.7
BxPC-3	Bauchspeicheldrüsenkrebs	23.9	10.1
ScaBER	Harnblasenkrebs	6.7	6.6
SK-BR-3	Brustkrebs	6.0	5.0
MDA-MB-468	Brustkrebs	7.0	2.0
L-02	Normale Hepatozyten	101.6	92.6
NCM460	Normale kolorektale Zellen	102.8	87.9

In ähnlicher Weise werden die onkolytischen Wirkungen und die Sicherheit der M1-c6- und M1-c6v1-Virusmutanten unter Verwendung verschiedener Tumorzelllinien und normaler Zellen verglichen; die Ergebnisse sind in Tabelle 16 aufgeführt. M1-c6v1 hat einen signifikanten Abtötungseffekt auf die Mehrheit der bösartigen Tumorzellen. M1-c6v1 hat auch einen signifikanten Abtötungseffekt auf die Mehrheit der bösartigen Tumorzellen von Mäusen. Verglichen mit dem Abtötungseffekt (IC50) von M1-c6 ist der IC50 von M1-c6v1 um das 1,3- bis 20,5-fache niedriger als der IC50 von M1-c6, was darauf hinweist, dass die onkolytische Wirkung von M1-c6v1 im Allgemeinen besser ist als die von M1-c6. Tabelle 16 Abtötungseffekte von M1-c6v1 und rM1-c6 auf bösartige Tumorzellen

Nr	Tumor-Typ	Zell Name	C50 (MOI) von M1-c6v1 Mittelwert ± Standardabweichung	IC50 (MOI) von M1-c6 Mittelwert ± Standardabweichung
1	Menschliche Leberkrebszelle	Hep 3B	< 0.001	< 0.001
2		Hep G2	< 0.001	< 0.001
3		PLC	< 0.001	< 0.001
4		SNU-387	0.0103 ± 0.0063	0.0499 ± 0.0186
5		SNU-423	0.0479 ± 0.0150	0.0619 ± 0.0068
6		SNU-449	0.2054 ± 0.1898	0.3806 ± 0.4177
7		SNU-475	< 0.001	0.0041 ± 0.0031
9	Menschliche Lungenkrebszelle	SHP-77	0.0574 ± 0.0420	0.0861 ± 0.0607
10	Menschliche Dickdarmkrebszelle	HCT 116	0.0350 ± 0.0426	0.7181 ± 0.7789
11		HCT-8	0.0174 ± 0.0062	0.0365 ± 0.0188
12	Menschliches Blasentransitionszell karzinom	UM-UC-3	0.01450 ± 0.0233	0.0233 ± 0.0090
13	Osteosarkom-Zelle	MNNG/ HOS CI #5	< 0.001	< 0.001
15	Menschliche Gebärmutterhalskreb szellen	C-33 A	4.77×10^-6 ± 4.52×10^-7	3.61×10^-6 ± 2.19×10^-6
16	Menschliche maligne Melanomzellen	A-375	0.1360 ± 0.0713	0.7155 ± 0.6710
17	Menschliche Gliomzellen	U87MG	0.0007 ± 0.0014	0.0003 ± 0.0006
18	Murine Leberkrebszellen	Hepa1-6	0.0202 ± 0.0081	0.0181 ± 0.0077
19	Murine Brustkrebszellen	4T1	0.7666 ± 2.2841	1.1892 ± 1.7708
21	Murine - Darmkrebszelle	MC38	< 0.001	< 0.001
22	Murine - Darmkrebszelle	C26	0.0089 ± +0.0086	0.0257 ± 0.038
23	Murine Hautmelanom-Zelle	B16-F10	< 0.01	< 0.01

5. Experimentelle Schlussfolgerungen
Die mutanten Stämme rM1-NS3M, rM1-E2M, rM1-N3E2M und M1-c6v1 haben signifikante Abtötungseffekte auf die Mehrheit der bösartigen Tumorzellen der menschlichen und murinen bösartigen Tumoren.
Beispiel 3 Studie zur In-vivo-Wirksamkeit und -Sicherheit des rM1-N3E2M-Virus
Material:

1. rM1-N3E2M und rM1-WT Viren
2. Kolorektale Krebszelllinien HCT 116
3. 30 weibliche BALB/c-nu/nu-Nacktmäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen

Verfahren:
1. Weibliche Nacktmäuse im Alter von 4 bis 6 Wochen wurden gekauft, eine ausreichende Anzahl von HCT 116-Zellen wurde im Voraus kultiviert, die verdauten Zellen wurden mit aseptischem PBS resuspendiert, gezählt und zu Zellsuspensionen aufbereitet, und die HCT 116-Zellen wurden in einer Menge von 5×10⁶ Zellen/100 µL subkutan in den Rücken der Nacktmäuse injiziert. Nachdem die Tumore auf etwa 50 mm³ angewachsen waren, wurden die Nacktmäuse nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt, und die Verabreichung erfolgte an 6 aufeinanderfolgenden Tagen. Länge und Breite des Tumors wurden alle drei Tage gemessen, das Volumen (Volumen=(Länge×Breite²)/2) der Tumore wurde berechnet und die Wachstumskurven wurden erstellt. Das Tumorgewebe und normale Organe wie Leber, Herz, Gehirn und Lunge wurden am dritten Tag nach der Verabreichung isoliert und für immunhistochemische Experimente mit 4% Paraformaldehyd fixiert.
2. Immunhistochemisches Experiment: Das Tumorgewebe und die normalen Organe der Nacktmäuse wurden ausgewählt und mit 4% Paraformaldehyd fixiert, und die Proben wurden an Guge Biotechnology zum Nachweis der Menge von Cleaved-Caspase 3 und Ki67 geliefert.
Ergebnisse:
1. Es wurden subkutane Tumormodelle an BALB/c-Nacktmäusen konstruiert, und die Verabreichung (intravenöse Injektion) wurde 6 mal hintereinander durchgeführt, wobei der Überlebenszustand der Nacktmäuse beobachtet wurde. Es zeigt sich, dass sich das Gewicht der Nacktmäuse in den Verabreichungsgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht signifikant verändert (siehe 3B) und der mentale Zustand gut ist, was darauf hindeutet, dass die rM1-N3E2M-Virusmutante bis zu einem gewissen Grad eine gute Sicherheit aufweist. Im Vergleich zur Kontrollgruppe sind die Tumorvolumina der Nacktmäuse in den rM1-N3E2M-Verabreichungsgruppen deutlich reduziert (siehe 3A), was darauf hindeutet, dass das rM1-N3E2M-Virus die Tumorzellen erreichen und abtöten kann, um das Wachstum des Tumors zu inhibieren.
2. Um die inhibitorische Wirkung von rM1-N3E2M auf das Wachstum eines Tumors in vivo zu untersuchen, wurde das Tumorgewebe nach dreitägiger Verabreichung seziert und die gespaltene Caspase-3 (Cl-casp3) und Ki67 immunhistochemisch gefärbt. CI-casp3 ist ein Marker für Apoptose, und seine Expressionsmenge zeigt den Grad der Apoptose und Nekrose von Tumorzellen an. Ki67 ist ein Marker für die Proliferation, und seine Expressionsmenge zeigt die Proliferationsfähigkeit der Tumorzellen an. Wie in 4 dargestellt, weist die braune Farbe auf positive Signale hin. Das rM1-N3E2M-Virus kann eine signifikante Hochregulierung der Expression von CI-casp3 und eine Herunterregulierung der Expression von Ki67 bewirken, was darauf hindeutet, dass es gleichzeitig die Apoptose von Tumorzellen und einen malignen Phänotyp der schnellen Proliferation der Tumorzellen auslösen kann.
3. Die Sicherheit einer onkolytischen Virotherapie ist sehr wichtig. Es ist erwiesen, dass das rM1-N3E2M-Virus für normale Zelllinien sicher ist, aber seine Sicherheit in vivo muss weiterhin untersucht werden. Die wichtigsten Organe, einschließlich Herz, Gehirn, Leber, Lunge, Dickdarm, Arthrose und andere Gewebe der Versuchstiere verschiedener Gruppen, wurden am dritten Tag nach der Verabreichung des subkutanen Tumormodells der Nacktmaus isoliert, und die Expression des rM1-N3E2M-Virusproteins wurde mit einem immunhistochemischen Verfahren untersucht. Das rM1-N3E2M-Virus wurde durch kontinuierliche Weitergabe an eine kolorektale Krebszelllinie gewonnen, und daher wurde auch untersucht, ob sich das Virus neben wichtigen Organen wie Herz und Gehirn auch in Kolonepithelzellen der Mäuse repliziert. Darüber hinaus wird berichtet, dass eine Reihe von Alphaviren Arthritis verursachen können, und daher wurde untersucht, ob sich die beiden experimentellen Viren in Gelenkgeweben replizierten. Aus 5 geht hervor, dass sich die Viren nicht replizieren und sich die Zellmorphologien verschiedener Organe nicht verändern, was beweist, dass das rM1-N3E2M-Virus in den immundefizienten Nacktmäusen sicher ist.
Schlussfolgerungen:
Die Tierversuche belegen, dass das rM1-N3E2M-Virus eine wirksame Rolle bei der Resistenz gegen einen Tumor in vivo spielen und das Wachstum des Tumors inhibieren kann; rM1-N3E2M induziert die Apoptose eines Tumorgewebes und inhibiert einen bösartigen Phänotyp der Tumorzellen; während der Experimente verändern sich die Gewichte der Nacktmäuse nicht signifikant, die Virusreplikation wird in den normalen Geweben und Organen nicht entdeckt, und daher ist die Sicherheit von rM1-N3E2M gut.
Beispiel 4 Wirksame Inhibierung des M1-c6v1-Virus gegen einen Tumor in vivo
Material:

1. M1-c6v1- und M1-c6-Viren
2. Murine Melanom-Zellen B16-F10
3. 40 weibliche C57 BL/6-Mäuse im Alter von 5 bis 6 Wochen

Verfahren: Es wurden weibliche C57 BL/6-Mäuse im Alter von 5 bis 6 Wochen erworben, eine ausreichende Anzahl von B16-F10-Zellen wurde im Voraus kultiviert, die verdauten Zellen wurden mit aseptischem PBS resuspendiert, gezählt und nach Bedarf zu Zellsuspensionen verarbeitet, und die B16-F10-Zellen wurden in einer Menge von 5×10⁴ Zellen/100 µL subkutan in den Rücken der Mäuse injiziert. Nachdem die Tumore auf etwa 60 mm³ angewachsen waren, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt, und die intratumorale Injektion wurde an 7 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Die Längen und Breiten der Tumore wurden alle drei Tage gemessen, die Volumina (Volumen=(Länge×Breite²)/2) der Tumore wurden berechnet und die Wachstumskurven ermittelt.
Ergebnisse: Es wurden subkutane Tumormodelle an C57 BL/6 Mäusen konstruiert, und nach der intratumoralen Injektion an 7 aufeinanderfolgenden Tagen wurde der Überlebenszustand der Mäuse beobachtet. Es wurde festgestellt, dass sich das Gewicht der Mäuse in den Verabreichungsgruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht signifikant verändert (siehe 6B) und der mentale Zustand gut ist, was darauf hindeutet, dass das mutante M1-c6v1-Virus zu einem gewissen Grad sicher ist. Verglichen mit der Kontrollgruppe und der M1-c6-Verabreichungsgruppe sind die Tumorvolumina der Mäuse in den M1-c6v1-Verabreichungsgruppen deutlich reduziert (siehe 6A), was darauf hindeutet, dass das M1-c6v1-Virus die Tumorzellen abtöten kann, um das Wachstum des Tumors zu inhibieren.
Schlussfolgerungen:
Die Tierversuche belegen, dass das M1-c6v1-Virus eine wirksame Rolle bei der Resistenz gegen einen Tumor in vivo spielen und das Wachstum des Tumors inhibieren kann; während der Experimente verändert sich das Gewicht der Mäuse nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass die Sicherheit von M1-c6v1 gut ist.
Beispiel 5 Konstruktion, Identifizierung und Wirksamkeitstests von M1-ortsgerichteten mutanten Virusstämmen
Vorgang der Punktmutation:
Eine Reihe von ortsgerichteten Mutationen wurde ausgehend von rM1-WT-Viren mit der als SEQ ID NO: 5 angegebenen Genomsequenz (von GenScript Biotech Co, Ltd.), und pBR-M1-E2-4K, pBR-M1-E2-4L, pBR-M1-E2-4I, pBR-M1-E2-4V, pBR-M1-E2-4S, pBR-M1-E2-4C, pBR-M1-E2-4L, und pBR-M1-E2-4D Plasmiden durchgeführt; und pBR-M1-NS3-358M, pBR-M1-NS3-358G, pBR-M1-NS3-358A, pBR-M1-NS3-358L, pBR-M1-NS3-358I, pBR-M1-NS3-358V, pBR-M1-NS3-358P, pBR-M1-NS3-358S, pBR-M1-NS3-358Q, pBR-M1-NS3-358T, pBR-M1-NS3-358C, pBR-M1-NS3-358N, pBR-M1-NS3-358F, pBR-M1-NS3-358Y, pBR-M1-NS3-358D, pBR-M1-NS3-358K, pBR-M1-NS3-358R, und pBR-M1-NS3-358H wurden jeweils erhalten.
5.1 Reagenzien und Verbrauchsmaterial
Wichtigste Arzneimittel und Reagenzien

• DMEM/F12 (Gibco, 11320-033)
• MEM (Gibco, C11095500BT)
• DMEM (Corning, 10-013-CVRC)
• Kälberserum von Neugeborenen (Hangzhou Tianhang Biotechnology, 22011-8615)
• Fötales Kälberserum (Corning, 35-081-CV)
• Protease K (Tiangen, RT403)
• Trypsin (Thermo, 25200-072)
• Lipofectamine Messenger MAX Transfektionsreagenz (Thermo, LMRNA003)
• Opti-MEM I Reduziertes Serum-Medium (1x) (Thermo, 31985-070)
• Restriktionsendonuklease Xbal (NEB, R0145S)
• Ribo m⁷G CapAnalogon (Promega, P1711)
• DNA-Reinigungs- und Rückgewinnungskit (Tiangen, DP209)
• PBS (Gibco, 20012027)
• RiboMAX™ Hochskaliertes RNA-Produktionssystem (Promega, P1280)
• Goscript™ Reverses Transkriptions System (Promega, A5001)
• Extraktionskit für die gesamte RNA (Promega, LS1040)
• Virusproduktion Serumfreies Medium (VP-SFM) (Gibco, 11681-020)
• GlutaMax I (100x) (Gibco, 35050061)
• MEM NEAA (100x) (Gibco, 11140050)
• Primer für E2-Sequenzierung (GENEWIZ, Bestell Nr.80-423889537)
• Primer für N3-Sequenzierung (GENEWIZ, Bestell Nr. 80-429401706 und 80-426066909) Zubereitung der wichtigsten Lösungen
• Zubereitung einer VP-SFM-Lösung

10 mL 100x MEM NEAA und 20 mL 100x GlutaMax I wurden in 1 L VP-SFM gegeben, das Gemisch wurde gleichmäßig gemischt und zur späteren Verwendung bei 4°C gelagert.
5.2 Instrumente und Ausrüstung

Tabelle 17 Wichtigste Versuchsinstrumente

Instrument	Hersteller	Model
Umgekehrtes Mikroskop	Nikon	Eclipse TS2R
Biologische Sicherheitswerkbank	Thermo	1374
Elektrisch beheiztes thermostatisches Wasserbad	Shanghai Yiheng Technology Instrument	HWS-24
Tischcomputer	Dell	OptiPlext 3020
Kühlschrank	Panasonic	BCD-Z51WZ
Zell-Inkubator	Thermo	3111
Absorptionsmessgerät für Mikroplatten	Biotek	ELX800
Saubere Bank	Suzhou Antai	SW-CJ-2FD
Zentrifuge	Jintai Kexi Instruments	80-2
Gekühlte Tischzentrifuge	Eppendorf	5424R
Zellzähler	Nexcelom	Auto T4
Niedertourige Tischzentrifuge	Shanghai Anting	TDL-80-2B
Thermocycler	ABI	Simpliamp

5.3 Experimentelle Zellen

Tabelle 18 Herkunft der Versuchszellen

Nr.	Tumor-Typ	Zellname	Zellenherkunft (Banke-Level, Datensatz-Nr.)	Medium
1	Afrikanischer Grüner Affe Nierenzelle	Vero	Produktionszellenbank, 3020014-01	3% NBS DMEM/F12
2	Menschliche Dickdarmkrebszelle	HCT-116	Master-Zellbank, Master 20170505	10% FBS DMEM
3	Hamster-NierenZelle	BHK-21	Arbeits-Zellbank, 20170331-071/100	10% FBS MEM

5.4. Testvorgehen
5.4.1 Bau der originalen Saatgutviren
(1) Linearisierung von Plasmiden
Tabelle 19 Plasmid-Linearisierungssystem

Komponenten Zugabemenge (µL)

10x Schnellverdau-Puffer 10

Xbal 10

Plasmide (10 µg) + Wasser 80

A. das System wurde gemäß Tabelle 19 in einem PCR-Gefäß hergestellt, und das Gefäß wurde zur Inkubation bei 37°C für 1 h in ein PCR-Gerät gestellt; und
B. Jedem Röhrchen wurden 5 µl Protease K zugesetzt, und das Röhrchen wurde zur Inkubation bei 50°C für 30 Minuten in das PCR-Instrument gestellt.

(2) Reinigung und Rückgewinnung von DNA

A. 500 µl BL wurden in eine Adsorptionssäule gegeben und 1 Minute lang bei 12.000 rpm zentrifugiert;
B. linearisierte Plasmide wurden in ein 1,5-mL-EP-Röhrchen übertragen, 500 µl PB hinzugefügt und die Mischung gleichmäßig gemischt;
C. Das Gemisch wurde in die Adsorptionssäule überführt, 2 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und 1 Minute lang bei 12.000 U/min zentrifugiert, und das Filtrat wurde abgenommen;
D. 600 µl PW wurden zugegeben, das Gemisch wurde 2 Minuten lang stehen gelassen und 1 Minute lang bei 12 000 U/min zentrifugiert, und das Filtrat wurde entfernt;
E. Schritt D wurde wiederholt;
F. Ein Filtrat wurde entfernt, das leere Röhrchen wurde 2 Minuten lang bei 12.000 rpm zentrifugiert, der Deckel geöffnet und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet;
G. 30 µl keimfreies DEPC-behandeltes Wasser wurde hinzugefügt, das Gemisch wurde 1 Minute lang stehen gelassen und zweimal eluiert, und ein Filtrat wurde gesammelt; und
H. DNA wurde quantifiziert.

(3) In-vitro-Transkription

Tabelle 20 Vorbereitung des In-vitro-Transkriptionssystems

Reagenz	Hinzugefügte Menge (µL)
SP6 Transkription 5x Puffer	8
rNTPs (100 mM) (A + C + U + G)	2 + 2 + 2 + 1.2
Linearisierte DNA-Vorlage (1 bis 2 µg) + Wasser	16.8
Ribo m⁷G Cap Analogon, 40 mM	4
Enzym Mix	4
Totales Volumen	40

A. das System wurde gemäß Tabelle 20 in einem PCR-Gefäß hergestellt, und das Gefäß wurde zur Inkubation bei 37°C für 2 h in ein PCR-Gerät gestellt; und
B. RQ1 RNase-Free DNase (1 µL/1 µg DNA) wurde hinzugefügt, und das Röhrchen wurde zur Inkubation bei 37°C für 15 Minuten in das PCR-Instrument gestellt.

(4) RNA-Transfektion
A. Kultivierung der Zellen
Geeignete Kulturbedingungen wurden gemäß den Anweisungen für die verschiedenen Zellen ausgewählt, und die Zellvermehrung und Weitergabe erfolgte gemäß den Weitergabeverhältnissen der Anweisungen. Nach der Subkultivierung bis zur logarithmischen Wachstumsphase wurden die Zellen aufgeschlossen und die Vero-Zellen in einer Dichte von 4×10⁵/Kolben in T25-Kulturflaschen beimpft, in den Zellbrutschrank gestellt und 24 Stunden lang einer adhärenten Kultivierung unterzogen.
B. Transfektion
250 µL Opti-MEM-Medium und 7,5 µL MessengerMAX wurden in ein 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen gegeben, 125 µL Opti-MEM-Medium und die gesamte RNA wurden in ein anderes Zentrifugenröhrchen gegeben, die Lösungen in den beiden Röhrchen wurden gleichmäßig gemischt und tropfenweise zu den Vero-Zellen gegeben, und die Zellen wurden zur Kultivierung in den Virusbrutschrank gelegt.
(5) Entnahme von Viren
Die Zellmorphologie und das Auftreten von Fluoreszenz wurden jeden Tag beobachtet. Wenn die Fluoreszenz deutlich zunahm, wurden die Zellen fotografiert, und wenn mehr als 90 % der Zellen aufschwammen, wurde ein Überstand aus Vero-Zellen gesammelt und 5 Minuten lang bei 4.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde in Kryokonservierungsröhrchen abgefüllt, als ursprüngliche Saatgutmenge verwendet und in flüssigem Stickstoff gelagert.
5.4.2 Sequenzierung von Saatgutmengen-Viren
(1) Extraktion von RNA

A. die mit flüssigem Stickstoff gelagerte Probe der Saatgutmenge wurde entnommen und aufgetaut;
B. 100 µl der Probe wurden aufgesaugt und in ein 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen gegeben;
C. 300 µl Lysat wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde aufgewirbelt, transitorisch zentrifugiert und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen;
D. 300 µl Verdünnungsmittel wurden zugegeben, das Gemisch wurde aufgewirbelt, transitorisch zentrifugiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen;
E. 350 µl wasserfreies Ethanol wurden zugegeben, das Gemisch wurde aufgewirbelt, transitorisch zentrifugiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen;
F. Das Gemisch wurde in eine Zentrifugensäule (in einem Kit) überführt, beladen und einer Säulenchromatographie in zwei Durchgängen unterzogen. Das Gemisch wurde 1 Minute lang bei 12.000 U/min zentrifugiert, und das Filtrat wurde entfernt;
G. 600 µl RNA-Waschlösung wurden zugegeben, das Gemisch wurde 1 Minute lang bei 12 000 U/min zentrifugiert, und das Filtrat wurde entfernt; und
H. 50 µl der DNase I-Inkubationslösung (Tabelle 21) wurden in die Mitte eines Adsorptionsfilms gegeben und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen;

Reagenz	Volumen / µL
10x DNase I-Puffer	5
DNase I	5
Nuklease-freies Wasser	40

I. 600 µl RNA-Waschlösung wurden zugegeben, das Gemisch wurde 1 Minute lang bei 12 000 U/min zentrifugiert, ein Filtrat wurde entfernt, das Gemisch wurde zweimal gewaschen, und ein Filtrat wurde entfernt. Die Zentrifugensäule wurde erneut auf ein Sammelröhrchen gesetzt und 2 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert; und
J. die Zentrifugensäule wurde in ein Elutionsröhrchen überführt, 50 µl nukleasefreies Wasser wurden in die Mitte eines Films der Zentrifugensäule gegeben, 2 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und 1 min bei 12 000 U/min zentrifugiert, und die RNA wurde bei -80°C gelagert.

(2) Reverse Transkription, wie Tabelle 22:

Tabelle 22 Reverse Transkription RT-PCR Zweischritt-Reaktionssystem

Komponenten	Volumen (µL)	Notiz
RNA-Matrize	10	Erster Schritt:
		1. 70°C, 5min
Oligo	1.5	2. 5 Minuten lang auf eine Eisbox zum schnellen Abkühlen legen
		3. Durchgangszentrifuge
5x Reaktionspuffer	4.0	Zweiter Schritt:
MgC12	2.0	4. Gleichmäßig mischen und 17 µL der Reaktionsmischung in jede Probe geben
dNTP-Mischung (10 mM)	1.0
Ribonuklease-Inhibitor	0.5
Ribonuklease-Inhibitor	0.5	5. Reagieren bei 25°C für 5 min, bei 42°C für 1 h und bei 70°C für 5 min und lagern bei 4°C
RTase	1.0

(3) PCR-Amplifikation

A. Die im vorherigen Schritt gewonnene cDNA wurde als Vorlage für die PCR der Fragmente verwendet. Ein Reaktionssystem ist in Tabelle 23 dargestellt:

Komponenten	Volumen (µL)
Q5-High-Fidelity-2x-Master-Mix	25
cDNA-Vorlage	1.0
H2O	20
Vorwärts-/Rückwärts-Primerpaar (je 10 µM)	4

B. Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 24 aufgeführt:

Temperatur	Zeit	Anzahl der Zyklen
98°C	2 min	1 Zyklus
98°C	10s	30 Zyklen
60°C	20 s
72°C	1 min
72°C	10 min	1 Zyklus

(4) Sequenzierung
Die Sequenzierungsergebnisse sind in 7 dargestellt. Verschiedene mutante Viren erreichten wie erwartet eine ortsgerichtete Mutation.
5.4.3 Einrichtung einer Virus-Arbeitsbank
(1) Kultivierung von Zellen, Beimpfung von Viren und Sammlung von Proben
Geeignete Kulturbedingungen wurden gemäß den Anweisungen für verschiedene Zellen ausgewählt, und die Zellvermehrung und Weitergabe erfolgte gemäß den Weitergabeverhältnissen der Anweisungen. Nach der Subkultur bis zur logarithmischen Wachstumsphase wurden die Zellen verdaut, in T25-Kulturflaschen mit 6×105 Zellen/Flasche beimpft und 24 Stunden lang einer adhärenten Kultivierung unterzogen;
Nachdem die Zellen 24 Stunden lang adhärent kultiviert wurden, wurde das ursprüngliche Medium abgesaugt, ein mit 20 µl Saatgutviren gemischtes VP-SFM-Viruskulturmedium hinzugefügt und in den Virusinkubator gestellt, um zu warten, bis die Zellen Viren produzieren. Die Zellmorphologie und das Auftreten von Fluoreszenz wurden alle 24 Stunden beobachtet. Wenn mehr als 90 % der Zellen aufschwammen, wurden die Zellen für die Aufzeichnung fotografiert, und der Überstand der Vero-Zellen wurde gesammelt und 5 Minuten lang bei 4.000 U/min zentrifugiert. 100 µl des Überstands wurden in ein 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen gegeben und als Probe für den Virustiternachweis verwendet, und der Rest wurde in Kryokonservierungsröhrchen (ca. 1,5 mL/Röhrchen) abgefüllt und mit flüssigem Stickstoff gelagert.
(2) Nachweis des Virustiters

① BHK-21-Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit 1.500 Zellen/Well kultiviert und bei 37°C unter einer 5%igen CO2-Erkrankung kultiviert. Nach dem Ausbringen wurden die Zellen innerhalb von 12 bis 36 Stunden verwendet.
② eine entsprechende Menge MEM-Basismedium wurde in einen Ladeschlitz gegossen, das Medium wurde in eine 96-Well-Platte mit 180 µl/Well gegeben und als Verdünnungsmittel für die spätere Verwendung verwendet. Die MEM-Verdünnungsmittel wurden gemäß der Anzahl der zu detektierenden Proben zubereitet, wobei für jede Probe 2 Verdoppelungen und für eine Referenzprobe 4 Verdoppelungen zubereitet wurden;
③ die zu detektierenden Proben wurden 15 bis 30 Sekunden lang in einem Vortex-Oszillator gründlich geschüttelt. 20 µl der zu detektierenden Probe wurden in die Wells der ersten Säule von „②“ gegeben. Das Gemisch wurde gleichmäßig gemischt, und 20 µl des Gemischs wurden in die Wells der nächsten Säule gesaugt. Die Probe wurde allmählich verdünnt, bis die Wells der achten Säule erreicht waren. Die Spitze sollte für den Betrieb jeder Säule gewechselt werden, die zu detektierende verdünnte Probe wurde auf einem Mikroplattenmischer fixiert und 3 Minuten lang bei 3.000 rpm oszilliert;
④ die verdünnte Viruslösung wurde den Zellen mit 20 µl/Well zugegeben, 10-3 bis 10-8 Viruslösungen wurden den Zellen in der 96-Well-Platte zugegeben, und jede Platte wurde für den Nachweis von zwei Proben verwendet;
⑤ Nach dem Laden der Proben wurden die Zellen 5 Tage lang bei 37°C unter einer 5%igen CO₂-Bedingung kultiviert (wobei der Tag des Virusladevorgangs als erster Tag gilt);
⑥ 5 Tage später wurde unter dem Mikroskop beobachtet und aufgezeichnet, ob die Zellen einen zytopathischen Effekt (CPE) aufwiesen; und
⑦ Die CCID50-Werte wurden nach dem Spearman-Karber-Verfahren berechnet. Ig(CCID50×20/1000)=L-D(S-0,5), wobei L für den Logarithmus der maximalen Verdünnung, -1, steht; D für die Differenz zwischen den Logarithmen der Verdünnung, 1, und S für die Summe der Anteile positiver Wells (Summe der Anzahl der CPE / 8)

Die Ergebnisse des Titer-Nachweises für die Viren der Arbeitscharge sind in Tabelle 25 aufgeführt. Tabelle 25 Titerergebnisse von Viren der Arbeitscharge

Nr.	Virusstamm	Virustiter CCID50 / mL	Nr.	Virusstamm	CCID50 / mL
1	E2-4K	2.00×10⁷	2	E2-4L	2.67×10⁶
3	E2-4I	1.84×10⁶	4	E2-4V	2.00×10⁶
5	E2-4S	5.83×10⁶	6	E2-4C	2.00×10⁶
7	E2-4M	5.21×10⁵	8	E2-4D	5.21×10⁷
9	NS3-358M	2.00×10⁷	10	NS3-358G	2.93×10⁷
11	NS3-358A	5.00×10⁶	12	NS3-358L	5.21×10⁷
13	NS3-358I	3.28×10⁷	14	NS3-358V	1.85×10⁷
15	NS3-358P	2.11×10⁷	16	NS3-358S	2.93×10⁵
17	NS3-358Q	2.20×10⁷	18	NS3-358T	3.75×10⁵
19	NS3-358C	2.46×10⁵	20	NS3-358N	9.26×10⁶
21	NS3-358F	8.89×10⁶	22	NS3-358Y	2.11×10⁶
23	NS3-358D	6.67×10⁶	24	NS3-358K	7.78×10⁷
25	NS3-358R	5.83×10⁶	26	NS3-358H	8.89×10⁶

5.4.4 Abtötungseffekte der Viren auf HCT 116-Zellen
(1) Beimpfung von Zellen und Verabreichung

Die Zellvermehrung und -Weitergabe erfolgte gemäß den Kulturbedingungen und Weitergabeverhältnissen der Anweisungen für verschiedenen Zellen. Nachdem die Zellen bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert wurden, wurden sie verdaut und in eine 48-Well-Platte mit einer Dichte von 10.000 Zellen/Well beimpft, wobei das Gesamtvolumen jeder Well 200 µL betrug; leere Kontrollgruppen, negative Kontrollgruppen und mehrere Gradienten der Viren: ① 0. 1 ② 1 ③ 10 MOI-Versuchsgruppen (3 Duplikate für jede Gruppe, siehe Tabelle 26, Abis H in der Tabelle repräsentieren verschiedene Viren) wurden eingestellt, die Leer-Kontrollgruppen wurden nicht mit Zellen geimpft, und die Negativ-Kontrollgruppen wurden mit VP-SEM in der Menge geimpft, die der Beimpfungsdosis der Viren entspricht. Tabelle 26 Entwurf einer 48-Well-Platte

Leer-Kontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Leer-Kontrolle
Leer-Kontrolle	A①	A②	A③	B①	B②	B③	Leer-Kontrolle
Leer-Kontrolle	C①	C②	C③	D①	D②	D③	Leer-Kontrolle
Leer-Kontrolle	E①	E②	E③	F①	F②	F③	Leer-Kontrolle
Leer-Kontrolle	G①	G②	G③	H①	H②	H③	Leer-Kontrolle
Leer-Kontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Negativkontrolle	Leer-Kontrolle

Nach dem Einbringen der Viren wurden die Zellen 72 Stunden lang kultiviert, die Zellmorphologie wurde am Endpunkt unter dem Mikroskop beobachtet und für die Aufzeichnung fotografiert, die Lebensfähigkeit der Zellen wurde ermittelt und die IC50 der verschiedenen Viren auf den ermittelten Zellen berechnet.
(2) Nachweis der Lebensfähigkeit von Zellen durch ein CCK-8-Verfahren
Die ursprüngliche Kulturlösung in der 48-Well-Platte wurde entfernt, ein Farbentwicklungsmittel (90 % komplettes Medium + 10 % CCK-8-Lösung) wurde langsam entlang der Wand mit 200 µl/Vertiefung zugegeben, und nachdem die Zellen 0,5 bis 3 Stunden lang bei 37 °C kultiviert wurden, wurden die Absorptionswerte der verschiedenen Vertiefungen bei einer Wellenlänge von 450 nm mit dem Absorptions-Mikroplattenlesegerät ermittelt.
(3) Berechnung der medianen inhibitorischen Konzentrationen (IC50) der Viren gegen verschiedene Zellen
Zellwachstum Inhibitionsraten von verschiedenen Wells wurden gemäß den festgestellten Absorptionswerten von verschiedenen Wells durch eine Formel von Zellwachstum Inhibitionsrate (IR)=(Mittelwert OD_{Lösungsmittel}-OD_Experiment)/(Mittelwert OD_{Lösungsmittel} - Mittelwert OD_Leer)×100% berechnet, Zellwachstum Inhibitionskurven wurden durch die Verwendung von GraphPad Prism 8.0 Software gezeichnet, und mediane inhibitorische Konzentration (IC50) Werte von verschiedenen Viren gegen Tumorzellen wurden durch eine log (Inhibitor) vs. Reaktion - variable Steigung (vier Parameter) Analyse Gleichung berechnet.
Abtötungskurven verschiedener ortsgerichteter Mutantenstämme des M1-Virus sind in 8A bis 8Z dargestellt (Hinweis: Jede Kurve in den Figuren steht für ein unabhängiges Experiment, die x-Achse für den MOI der Virusinfektion und die y-Achse für die Inhibitionsrate).
Literaturverzeichnis

1. Greenman C, Stephens P, Smith R, et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes. Nature 446: 153-158, 2007.
2. Wood LD, Parsons DW, Jones S, et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science 318: 1108-1113, 2007.
3. Pavet V, Portal MM, Moulin JC, Herbrecht R, and Gronemeyer H. Towards novel paradigms for cancer therapy. Oncogene 30: 1-20, 2011.
4. Workenhe ST and Mossman KL. Oncolytic virotherapy and immunogenic cancer cell death: sharpening the sword for improved cancer treatment strategies. Mol Ther 22: 251-256, 2014.
5. Sun Q1, Barz M2, De Geest BG3, et al. Nanomedicine and macroscale materials in immuno-oncology. Chemical Society 2018 Nov 22.
6. Tran E1, Robbins PF1, Rosenberg SA. ‚Final common pathway‘ of human cancer immunotherapy: targeting random somatic mutations. Nature Immunology 2017 Feb 15; 18(3): 255-262.
7. Das T, Jaffar-Bandjee MC, Hoarau JJ, et al. Chikungunya fever: CNS infection and pathologies of a re-emerging arbovirus. Prog Neurobiol 91: 121-129, 2010.
8. Kelvin AA. Outbreak of Chikungunya in the Republic of Congo and the global picture. J Infect Dev Ctries 5: 441-444, 2011.
9. Moran TP, Burgents JE, Long B, et al. Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-overexpressing tumors in wild-type mice. Vaccine 25: 6604-6612, 2007.
10. Weaver SC, Salas R, Rico-Hesse R, et al. Re-emergence of epidemic Venezuelan equine encephalomyelitis in South America. VEE Study Group. Lancet 348: 436-440, 1996.
11. Li XD, Qiu FX, Yang H, Rao YN, and Calisher CH. Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island, China, and results of a serosurvey. SoutheastAsian J Trop Med Public Health 23: 730-734, 1992.
12. Wen JS, Zhao WZ, Liu JW, et al. Genomic analysis of a Chinese isolate of Getah-like virus and its phylogenetic relationship with other Alphaviruses. Virus Genes 35: 597-603, 2007.
13. Zhai YG, Wang HY, Sun XH, et al. Complete sequence characterization of isolates of Getah virus (genus Alphavirus, family Togaviridae) from China. J Gen Virol 89: 1446-1456, 2008.
14. Charlotte Rafaluk, Gunther Jansen, Hinrich Schulenburg, and Gerrit Joop. When experimental selection for virulence leads to loss of virulence. Trends Parasitol. 2015 Sep; 31 (9): 426-34.
15. José Luis Martinez, Fernando Baquero and Dan I Andersson. Beyond serial passages:new methods for predicting the emergence of resistance to novel antibiotics. Current Opinion in Pharmacology 2011, 11: 439-445.

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Zitierte Patentliteratur

CN 201410425510 [0004, 0009]
CN 104814984 A [0075, 0076]

Claims

Ein M1-Virus, wobei ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus, nicht M ist; und/oder ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des Hüllproteins E2, nicht E oder K ist.
Das M1-Virus gemäß Anspruch 1, wobei der Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H ist; und/oder der Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des Hüllproteins E2: M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H ist.
Das M1-Virus gemäß Anspruch 1, wobei eine Aminosäuresequenz des in dem M1-Virus enthaltenen NS3-Proteins mindestens 90% oder mindestens 91% oder mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% oder mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% oder mindestens 99,5% oder mindestens 99,8% oder mindestens 99. 9% oder 100% Sequenzidentität mit einer als SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 18 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist; und/oder eine Aminosäuresequenz des im M1-Virus enthaltenen E2-Proteins mindestens 90% oder mindestens 91% oder mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% oder mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% oder mindestens 99. 5% oder mindestens 99,8% oder mindestens 99,9% oder 100% Sequenzidentität mit einer als SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 31 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist.
Ein M1-Virus, wobei ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins, kodiert durch eine Nukleotidsequenz des M1-Virus, nicht M ist; und/oder ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins, nicht E oder K ist; die Nukleotidsequenz des M1-Virus vorzugsweise mindestens 90% oder mindestens 91% oder mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% oder mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% oder mindestens 99. 5% oder mindestens 99,8% oder mindestens 99,9% oder 100% Sequenzidentität mit einer als SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 15 oder Genebank Zugangsnummer EU015061.1 oder Genebank Zugangsnummer EF011023.1 oder CCTCC V201423 angegebenen M1-Sequenz aufweist; der Aminosäurerest vorzugsweise, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H ist; und/oder der Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins: M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H ist; das M1-Virus vorzugsweise eine Mutation der Aminosäurestelle relativ zu einem Wildtyp-M1-Virus oder einem Pseudo-Wildtyp-M1-Virus aufweist; das M1-Virus vorzugsweise eine Mutation von der Aminosäurestelle relativ zu einem M1-Virus aufweist, aufweisend eine als SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz oder ein M1-Virus, aufweisend eine als SEQ ID NO: 15 angegebene Sequenz; die Mutation vorzugsweise: M358G, M358A, M358L, M358I, M358V, M358P, M358S, M358Q, M358T, M358C, M358N, M358F, M358Y, M358W, M358D, M358E, M358K, M358R oder M358H auf dem NS3-Protein ist; und/oder K4M, K4G, K4A, K4L, K4I, K4V, K4P, K4S, K4Q, K4T, K4C, K4N, K4F, K4Y, K4W, K4D, K4R, K4H, E4M, E4G, E4A, E4L, E4I, E4V, E4P, E4S, E4Q, E4T, E4C, E4N, E4F, E4Y, E4W, E4D, E4R oder E4H auf dem E2-Protein; das M1-Virus vorzugsweise durch eine Mutation eines Aminosäurerestes M, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus erhalten wird, aufweisend die als SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz zu: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H; und/oder eine Mutation eines Aminosäurerests K an der 4-ten Stelle des E2-Proteins zu: M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H; und der Aminosäurerest M vorzugsweise, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins des M1-Virus, zu L mutiert relativ zu dem M1-Virus, aufweisend die als SEQ ID NO: 15 angegebene Sequenz; und/oder der Aminosäurerest E, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins, mutiert zu D.
Eine Nukleotidsequenz, die das M1-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Eine Aminosäuresequenz, entsprechend dem NS3-Protein eines M1-Virus, wobei ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle der Aminosäuresequenz, nicht M ist; der Aminosäurerest, vorzugsweise entsprechend der 358-ten Stelle: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H ist; und vorzugsweise die dem NS3-Protein des M1-Virus, entsprechende Aminosäuresequenz mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die als SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 18 angegeben ist.
Eine Aminosäuresequenz, entsprechend dem E2-Protein eines M1-Virus, wobei ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle der Aminosäuresequenz, nicht E oder K ist; der Aminosäurerest vorzugsweise an der 4-ten Stelle M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H ist; und die Aminosäuresequenz vorzugsweise, entsprechend dem E2-Protein des M1-Virus, mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die als SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 31 angegeben ist.
Eine Nukleotidsequenz zur Kodierung der Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 6.
Eine Nukleotidsequenz zur Kodierung der Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 7.
Ein Vektor, der eine Nukleinsäure zur Kodierung des E2-Proteins eines M1-Virus und/oder des NS3-Proteins enthält, wobei ein Aminosäurerest, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins, nicht M ist; und ein Aminosäurerest, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins, nicht E oder K ist; der Aminosäurerest vorzugsweise, entsprechend der 358-ten Stelle des NS3-Proteins: G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, E, K, R oder H ist; der Aminosäurerest vorzugsweise, entsprechend der 4-ten Stelle des E2-Proteins: M, G, A, L, I, V, P, S, Q, T, C, N, F, Y, W, D, R oder H ist; eine Aminosäurensequenz des NS3-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäurensequenz, die als SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 18 angegeben ist; eine Aminosäuresequenz des E2-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 31 angegeben ist; der Vektor vorzugsweise weiterhin eine kodierende Sequenz des NS1-Proteins, des NS2-Proteins, des NS4-Proteins, des C-Proteins, des E3-Proteins, des 6K-Proteins und/oder des E1-Proteins des M1-Virus enthält; eine Aminosäuresequenz des NS1-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 16 angegeben ist; eine Aminosäuresequenz des NS2-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 17 angegeben ist; eine Aminosäuresequenz des NS4-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 19 angegeben ist; eine Aminosäuresequenz des C-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 20 angegeben ist; eine Aminosäuresequenz des E3-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 11 oder SEQ ID NO: 30 angegeben ist; eine Aminosäuresequenz des 6K-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 32 angegeben ist; eine Aminosäuresequenz des E1-Proteins vorzugsweise, aufweisend mindestens 90 % oder mindestens 91 % oder mindestens 92 % oder mindestens 93 % oder mindestens 94 % oder mindestens 95 % oder mindestens 96 % oder mindestens 97 % oder mindestens 98 % oder mindestens 99 % oder mindestens 99,5 % oder mindestens 99,8 % oder mindestens 99,9 % oder 100 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 33 angegeben ist; der Vektor vorzugsweise außerdem exogene Gene, relativ zum M1-Virus, enthält; die exogenen Gene vorzugsweise Anti-Tumor-assoziierte Moleküle exprimieren; der Vektor vorzugsweise aus Viren ausgewählt ist; der Vektor vorzugsweise ausgewählt ist aus einem Retrovirus, einem Newcastle-Krankheit Virus, einem Tollwutvirus, einem vesikulären Stomatitisvirus, einem Maraba-Virus, einem Alphavirus, einem Newcastle-Krankheit Virus, einem Reovirus, einem Adenovirus, einem Adeno-assoziierten Virus, einem Herpes-Simplex-Virus, einem Vaccinia-Virus oder einem Masernvirus; und der Vektor vorzugsweise aus Plasmiden ausgewählt ist.
Ein Vektor, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 5 oder Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei der Vektor vorzugsweise aus Plasmiden ausgewählt ist.
Ein Virusvektor, wobei das Virus das M1-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 ist; der Vektor vorzugsweise mit exogenen Genen inseriert ist; und die exogenen Gene vorzugsweise Anti-Tumor-assoziierte Moleküle exprimieren.
Eine Verwendung des M1-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, oder der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 5, oder der Aminosäuresequenz des NS3-Proteins gemäß Anspruch 6, oder der Aminosäuresequenz des E2-Proteins gemäß Anspruch 7, oder der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 8 oder 9, oder des Vektors gemäß Anspruch 10, oder des Vektors gemäß Anspruch 11, oder des Virusvektors gemäß Anspruch 12 bei der Herstellung eines Anti-Tumor-Arzneimittels.
Ein Anti-Tumor-Agens, enthaltend das M1-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, oder die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 5, oder die Aminosäuresequenz des NS3-Proteins gemäß Anspruch 6, oder die Aminosäuresequenz des E2-Proteins gemäß Anspruch 7, oder die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 8 oder 9, oder den Vektor gemäß Anspruch 10, oder den Vektor gemäß Anspruch 11, oder den Virusvektor gemäß Anspruch 12.
Eine Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wirksame Menge des M1-Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 5 oder die Aminosäuresequenz des NS3-Proteins gemäß Anspruch 6 oder die Aminosäuresequenz des E2-Proteins gemäß Anspruch 7 oder die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 8 oder 9 oder den Vektor gemäß Anspruch 10 oder den Vektor gemäß Anspruch 11 oder den Virusvektor gemäß Anspruch 12 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält, wobei die Zusammensetzung vorzugsweise weiterhin einen Immun-Checkpoint-Inhibitor enthält; die Zusammensetzung vorzugsweise weiterhin ein chemotherapeutisches Agens enthält; die Zusammensetzung vorzugsweise mindestens 10¹ Viruspartikel oder PFUs enthält; die Zusammensetzung vorzugsweise 10¹ bis 10³⁰ Viruspartikel oder PFUs enthält; die Zusammensetzungen vorzugsweise 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰, 10²¹ oder 10²² Viruspartikel oder PFUs enthält; die Zusammensetzung vorzugsweise 2×10⁶ Viruspartikel oder PFUs enthält; und die Zusammensetzung vorzugsweise zur Abwehr eines Tumors verwendet wird.
Das Anti-Tumor-Agens gemäß Anspruch 14 oder die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei eine Darreichungsform ausgewählt ist aus: einer Injektion, einer Tablette, einer Kapsel, einem Kit und einem Pflaster; und die Darreichungsform vorzugsweise eine Injektion ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 13 oder das Anti-Tumor-Agens gemäß Anspruch 14 oder die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei der Tumor ausgewählt ist aus einem soliden Tumor und einem hämatologischen Tumor; der solide Tumor vorzugsweise ausgewählt ist aus einem oder mehreren von Leberkrebs, kolorektalem Krebs, Blasenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Prostatakrebs, einem Gliom, Melanom, Pankreaskrebs, Nasopharynxkarzinom, Lungenkrebs, Magenkrebs, Nebennierenrindenkarzinom, akzessorisches Nierenrindenkarzinom, Analkrebs, Blinddarmkrebs, Astrozytom, atypisches Teratom, rhabdoider Tumor, Basalzellkarzinom, Cholangiokarzinom, Blasenkrebs, Knochenkrebs, Hirntumor, Bronchialtumor, Burkitt-Lymphom, Karzinoidtumor, Herztumor, Cholangiokarzinom, Chordom, Dickdarmkarzinom, Kraniopharyngiom, duktales Karzinom in situ, Keimtumor, Endometriumkrebs, Ependymom, Ösophaguskarzinom, olfaktorisches Neuroblastom, Keimzelltumor, extragonadaler Keimzelltumor, Retinoblastom, Eileiterkarzinom, Gallenblasenkarzinom, Kopf- und Halskrebs, Hypopharynxkarzinom, Kaposi-Sarkom, Nierenkrebs, Langenhanssche Zellhistiozytose, Kehlkopfkrebs, Lippenkrebs, Mundhöhlenkrebs, Merkel-Zellkarzinom, malignes Mesotheliom, multiples endokrines Neoplasiesyndrom, Mycosis fungoides, Karzinom der Nasenhöhle und der Nasennebenhöhlen, Neuroblastom, nichtkleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, neuroendokriner Tumor der Bauchspeicheldrüse, Inselzelltumor, Papillomatose, Paragangliom, Karzinom der Nasennebenhöhlen und der Nasenhöhle, Karzinom der Nebenschilddrüse, Karzinom des Penis, Kehlkopfkrebs, Hypophysentumor, pleuropulmonales Blastom, primäres Peritonealkarzinom, Retinoblastom, Speicheldrüsentumor, Sarkom, Sezary-Syndrom, Hautkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Dünndarmkarzinom, Weichteilsarkom, Plattenepithelkarzinom, Hodenkrebs, Thymom und Thymuskarzinom, Schilddrüsenkrebs, Harnröhrenkrebs, Gebärmutterkrebs, Endometrium- und Gebärmuttersarkom, Vaginalkrebs, ein Gefäßtumor, Vulvakrebs und solitäres Myelom; der hämatologische Tumor vorzugsweise ausgewählt ist aus einer oder mehreren von akuter B-Zell-Lymphoblastenleukämie (BALL), akuter T-Zell-Lymphoblastenleukämie (TALL), akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), chronischer myelogener Leukämie (CML), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), B-Zell-Promyelozytenleukämie, blastischem plasmazytoiden dendritischen Zellneoplasma, Burkitt-Lymphom, diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom, follikuläres Lymphom, Haarzell-Leukämie, kleinzelliges oder großzellig-follikuläres Lymphom, MALT-Lymphom, Mantelzell-Lymphom, Marginalzonen-Lymphom, multiples Myelom, Non-Hodgkin-Lymphom, plasmablastisches Lymphom, plasmazytoides dendritisches Zellneoplasma, Waldenstrom-Makroglobulinämie und Prä-Leukämie; und der Tumor mehr vorzugsweise ausgewählt ist aus einem oder mehreren von Leberkrebs, Darmkrebs, Blasenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Prostatakrebs, Gliom, Melanom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Nasopharynxkarzinom, Lungenkrebs und Magenkrebs.