KR20020028879A - 아데노바이러스 타입 35의 적어도 하나의 구성성분을포함하는 아데노바이러스 유래 유전자 전달체 - Google Patents

아데노바이러스 타입 35의 적어도 하나의 구성성분을포함하는 아데노바이러스 유래 유전자 전달체 Download PDF

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Abstract

혈청형들은 그것의 천연 친화성에서 차이가 있다. 아데노바이러스 혈청형(2, 4, 5 및 7) 모두는 폐 상피 조직 및 다른 호흡 조직에 천연 친화성을 갖는다. 반면에, 혈청형(40 및 41)은 위장관에 천연 친화성을 갖는다. 상기한 표현형들은 적어도 캡시드 단백질(펜톤-계열, 헥손), 세포 결합을 할 수 있는는 단백질(섬유 단백질) 및 아데노바이러스 복제에 관련한 단백질에서 다르다. 혈청형 중 친화성 및 캡시드 단백질에서 이런 차이는 캡시드 단백질의 변형에 의한 아데노바이러스 친화성을 다시 이끌 목적의 많은 연구 노력을 야기해 왔다.

Description

아데노바이러스 타입 35의 적어도 하나의 구성성분을 포함하는 아데노바이러스 유래 유전자 전달체{Adenovirus Derived Gene Delivery Vehicles Comprising At least One Element of Adenovirus Type 35}
인간 유전자 요법용 유전자-전달 벡터의 개발에 유용한 아데노바이러스의 수많은 특징들이 있다:
아데노바이러스 게놈은 잘 특성화되어 있다. 이는 약 36000 염기쌍의 선형 이중 가닥 DNA 분자로 이루어진다. 아데노바이러스 DNA는 혈청형에 따라 정확한 길이를 갖는 약 90-140 염기쌍의 동일한 역 말단 반복부(ITR: Inverted Terminal Repeats)을 함유한다. 복제의 바이러스성 근원은 게놈 말단에서 정확하게 ITRs 내에 있다;
아데노바이러스의 생물학은 상세하게 특성화되어 있다;
아데노바이러스는 면역-수용성 개체에 심각한 인간 병리학과 관련이 없다.
바이러스는 숙주 세포로 그의 DNA를 삽입하는데 매우 효과적이다; 바이러스는 광범위한 세포에 영향을 줄 수 있고 다양한 숙주-범위를 가진다;
바이러스는 다량의 높은 바이러스 역가로 제조될 수 있다;
바이러스는 바이러스성 게놈의 초기-영역 1(E1)을 삭제함으로써 복제 결함이 부여될 수 있다(Brody 등, 1994). 유전자 요법에서 현재 사용되는 대부분의 아데노바이러스성 벡터는 E1 영역에 결실을 가지는데, 여기에 원하는 유전적 정보가 삽입될 수 있다.
이러한 특징에 기초하여, 인간 표적 세포로 생체에서(in vivo) 유전자를 전달하기 위한 바람직한 방법은 유전자 전달체로서 아데노바이러스성 벡터를 사용하는 것이다.
그러나, 인간에 있어서 아데노바이러스성 벡터의 치료적 사용과 관련된 단점이 여전히 남아있다. 주요한 단점은 아데노바이러스에 대항하는 개체군 (population) 사이에 광범위하게 선재(先在)하는 면역이 있다는 것이다. 널리 보고되어 온 바에 따르면, 야생형의 아데노바이러스에 노출되는 것은 인간에게는 매우 일반적이다(Wadell에 의해 정리됨, 1984). 이러한 노출은 대부분의 아데노바이러스, 실질적으로 노출된 아데노바이러스 뿐만 아니라 유사한 (중화) 에피토프를 갖는 아데노바이러스에 대한 면역 반응을 일으킨다. 인간에 선재하는 항체의 이같은 현상은 바이러스에 대한 강한 2차적 체액성 및 세포성 면역반응과 결합하여 재조합 아데노바이러스성 벡터를 이용한 유전자 전달에 심각한 영향을 미칠 수 있다.
현재까지 인간 아데노바이러스의 6가지 다른 서브그룹이 제안되어 왔는데,이는 전체적으로 51개의 독특한 아데노바이러스 혈청형(표 1 참조)을 포함한다. 혈청형은 동물 항혈청(말, 토끼)과 정량적 중화에 의하여 결정되는 것처럼 그의 면역적 특이성에 기초하여 정의된다. 중화가 두 바이러스 사이에서 교차 반응의 정도를 나타낸다면, 혈청형의 특이성은 A)적혈구응집반응-억제 상의 교차 반응의 부족으로 나타나는 바와 같이 적혈구 응집소는 관련되지 않는지, 또는 B) DNA에 실질적인 생물 물리적/생화학적 차이가 존재하는지에 의해 예측된다(Francki 등, 1991). 마지막(42-51)에 동정된 9가지 혈청형은 HIV-감염 환자로부터 처음 분리되었다 (Hierholzer 등, 1988; Schnurr 등 1993). 잘 이해되지 않는 이유때문에, 대부분의 이러한 면역-손상 환자는 면역-수용성 개체로부터 거의 또는 전혀 분리되지 않는 아데노바이러스를 퍼트린다(Hierholzer 등, 1988, 1992; Khoo 등, 1995; De Jong 등, 1998).
대부분의 개인들은 아데노바이러스, 특히, 잘 조사된 아데노바이러스 혈청형 5 및 2(Ad5 및 Ad2) 또는 면역학적으로 연관된 혈청형에 미리 노출된 적이 있다. 중요하게, 이들 두 혈청형은 인간의 유전자 요법에 사용되기 위하여 가장 광범위하게 연구되기도 한다. 상기한 바와 같이, 유전자 전달체가 제공되는 개인이 머지 않아 이러한 매체에 중화반응을 일으킬 것이기 때문에, 유전자 전달체를 제조하기 위한 이들 아데노바이러스 또는 교차-면역 아데노바이러스의 유용성은 심각하게 방해될 수 있다.
따라서, 항체 중화반응을 감소시키거나 회피할 수 있는 그리고/또는 선재하는 면역을 일으키지 않는 유전자 전달체, 바람직하게는 아데노바이러스에 기초한전달체 제공을 위한 유전자 요법 분야에서의 요구가 있다. 따라서, 본 발명은 유전자가 전달될 숙주에 의하여 아데노바이러스성 구성성분에 대항하는 중화 활성을 감소시키거나 회피할 수 있는, 적어도 하나 이상의 아데노바이러스성 혈청형 35 구성성분 또는 이들의 기능성 등가체(equivalents) 및 관심의 유전자를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다. 본 발명의 목적을 위하여 아데노바이러스 35(구성성분)의 기능성 등가체/동족체(homologue)는, 아데노바이러스 35처럼, 처음으로 투여되는 숙주 중 10% 미만에 선재하는 면역에 접하게 되거나, 또는 투여되는 숙주의 약 90% 이상에서 면역 반응을 감소시키거나 회피하도록 할 수 있는 아데노바이러스 (구성성분)이다. 이러한 아데노바이러스의 전형적인 예는 아데노바이러스 혈청형 34, 26, 및 48이다. 유전자 전달체는 아데노바이러스 35 또는 이들의 기능성 동족체에 기초할 것이지만, 아데노바이러스 35 또는 이들의 기능성 동족체로부터의 하나 이상의 구성성분을 포함하기만 하면, 이러한 아데노바이러스 2 또는 아데노바이러스 5에 기초한 유전자 전달체에 대항하여 면역반응을 감소시키도록 하는 아데노바이러스 2 또는 5의 골격처럼 다른 골격에 기초할 수도 있다. 물론 유전자 전달체는 아데노바이러스 35 구성성분 또는 이들의 기능성 동족체에 의하여 이러한 유전자 전달체에 대항하여 면역을 일으킬수 있는 구성성분과 교체되기만 한다면, 단점을 적게 가지고, 바람직하게는 이러한 단점을 피할 수 있는, 다른 (아데노)바이러스 유래의 구성성분을 포함할 수도 있다. 본 발명에서, 유전자 전달체는 숙주 세포에 대하여 관심의 핵산을 전달할 수 있는 모든 매개체이다. 본 발명에 따르면, 이는 이러한 매개체에 대항하는 면역 반응에 대한 장점을 가져야만 하는, 아데노바이러스 구성성분 35 또는 이러한 구성성분의 기능성 등가체를 포함하여야만 한다. 기본적으로, 매개체를 구성하는 모든 다른 구성성분은 이들이 상기 핵산을 전달할 수 있기만 하다면 당 기술분야에 공지되거나 개발되는 모든 구성성분이 될 수 있다. 원칙적으로, 당업자는 아데노바이러스 분야에 적용되어 왔거나 적용할 수 있는 모든 아데노바이러스 생성물 또는 생성 시스템을 사용하고/사용하거나 제조할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 생성물은 아데노바이러스 5와 같이 유용한 팩키징 세포(packaging cell)에서 제조될 수 있고, 전형적으로는 아데노바이러스 35에 기초한 벡터가 아데노바이러스 2 및/또는 5와 같은 다른 아데노바이러스의 것과 같은 방식으로 사용되거나 그리고/또는 제조될 수 있다. 최소 벡터, 팩키징 시스템, 세포내 증폭, 벡터 및 플라스미드 기초 시스템의 가능성에 대한 우수한 개요는 본 출원인의 다른 출원(PCT/NL99/00235 및 PCT/NL96/00244)에서 발견될 수 있다. 비-바이러스성 전달 시스템도 바이러스성 전달 시스템에서처럼 본 발명에 따른 성분으로 제공될 수 있다. 양 시스템은 많은 다른 조립(set-up)으로 당업계에 공지되어 있어, 여기서 더 이상의 상술을 필요로 하지 않는다. 많은 다른 시스템과 이들의 특성에 대한 고찰은 Robbins와 Ghivizzani(1998) 및 Prince(1998)에서 찾아볼 수 있다.
일반적으로 유전자 전달체는 흥미있는 핵산을 함유한다. 흥미있는 핵산은 유전자, 유전자의 기능성 부분(여기서 유전자는 발현될 수 있는 모든 핵산임), 또는 모든 핵산 수준의 전사된 유전자 또는 유전자의 전구체(DNA 및/또는 RNA; 단일 또는 이중 가닥)가 될 수 있다. 흥미있는 유전자는 당 기술분야에 공지되어 있고 전형적으로는 TPA, EPO, 사이토킨, 항체, 또는 이들의 유도체 등과 같은 치료적 유전자를 코드화하는 것을 포함한다. 유전자 요법에 적용될 치료적 단백질의 개요는 아래에 나열된다.
종양-특이적 항원, 사이토킨 등과 같은 면역-자극 인자 등;
다음 예에 제한되지는 않으나, 엔도스타틴, 안지오스타틴, ATF-BPTI CDT-6, 우성 음성 VEGF-돌연변이 등의 항-혈관생성 인자;
다음 예에 제한되지는 않으나, VEGF, 섬유모세포 성장인자, 질소 산화물 신타제, C-형 나트륨 배설촉진 펩타이드 등의 혈관생성 인자;
용해성 CD40, FasL, IL-12, IL-10, IL-4, IL-13과 같은 염증 억제 단백질, CD4, CD5, CD7, CD52, IL-2, IL-1, IL-6, TNF 등에 대한 방출된 단일 가닥 항체, 또는 항 반응성 T-세포 상의 T-세포 수용체에 대하여 방출된 단일 가닥 항체. 또한, PML의 우성 음성 돌연변이은 면역 반응을 억제하는데 사용될 수 있다.
또한, 염증 촉진 사이토킨의 길항제, 예를 들면, IL-1RA(수용체 길항제) 및, sIL-1RI, sIL-1RII, sTNFRI, 및 sTNFRII와 같은 용해성 수용체가 사용될 수 있다. ceNOS, Bc13, cactus, 및 IkBα, β, 또는 γ와 같이 유전자를 억제하는 성장 및/또는 면역 반응 억제 유전자 및 닭 빈혈 바이러스의 VP3 단백질과 같이 세포자멸를 유도하는 단백질이 사용될 수 있다. 또한, HSV-TK, 시토신 디아미나제, 니트로리덕타제, 및 리나머라제(linamerase)와 같은 자살 유전자가 사용될 수 있다.
흥미있는 핵산은 숙주 세포에 존재하는 핵산 서열과 함께 혼성화되어, 이에 따른 상기 핵산의 발현, 전사 또는 해독을 억제하게 되는 핵산이 될 수 있다. 이는 또한 공동 억제를 통하여 차단될 수 있다. 간단히 말하면, 흥미있는 핵산은 세포에 의한 반응을 유도하기 위하여 그 세포에 제공하기를 원하는 어떤 핵산이든지 될 수 있으며, 상기 반응은 단백질, 이러한 생성의 억제, 세포 소멸, 괴사, 증폭, 분화 등이 될 수 있다.
본 발명은 제일 먼저 치료적 용도를 위한 아데노바이러스 35 또는 이들의 기능성 동족체를 개시하며, 이로 인하여 본 발명은 아데노바이러스 35 또는 이들의 기능성 동족체 또는 이들로부터 유도된 키메라 바이러스, 또는 의약적 용도를 위한 상기 바이러스, 동족체, 키메라에 기초한 유전자 전달체를 제공하기도 한다. 본 발명의 혈청형, 아데노바이러스 타입(형; type) 35는 당업계에 그 자체가 공지되어 있다. 그것은 후천성 면역 결실 증후군 및 다른 면역 결실 장애를 갖는 환자로부터 분리되었던 드문 그룹 B 아데노바이러스이다 (Flomenberg 등 1987; De Jong 등 1983). Ad 35는 병원성 특징에 대하여 보다 완전히 특성화된 서브그룹 C(Ad2 및 Ad5 포함)와 다르다는 것을 알 수 있었다(Basler 등, 1996). 이러한 차이는 Ad 35 게놈의 E3 영역의 차이와 관련될 수 있다는 것이 제시되어 왔다(Basler 등, 1996). Ad35의 DNA는 부분적으로 클론되거나 지도화되어 왔다(Kang 등, 1989a 및 b; Valderrama-Leon 등, 1985).
아데노바이러스 34 및 35와 같은 B형 아데노바이러스 혈청형은 다른 혈청형과 다른 E3 영역을 가진다. 전형적으로, 이 영역은 아데노바이러스성 생성물에 대한 면역반응을 억제할 때 포함된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 전달체를 제공함으로써, 면역반응을 감소시키거나 피하는데 포함된 성분은 아데노바이러스 35 E3 발현 생성물 또는 이들을 코드하는 유전자 또는 둘 중 하나 또는 이들 모두의 기능성 대등체로 이루어진다.
면역반응에 포함되는 아데노바이러스의 다른 부분은 캡시드, 특히, 펜톤 및/또는 헥손 단백질이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 전달체를 제공할 수도 있고, 이로 인하여 상기 성분은 섬유, 펜톤 및/또는 헥손 단백질 또는 이 중 적어도 하나 이상을 코드하는 유전자와 같은 아데노바이러스 35 캡시드 단백질 또는 이들의 기능성 부분으로 이루어진다. 면역반응에 관련되는 전체 단백질이 아데노바이러스 35(또는 이들의 기능성 동족체) 기원이라는 것이 필수적이지는 않다. 아데노바이러스 섬유, 펜톤, 또는 헥손 단백질의 일부를 다른 섬유, 펜톤, 또는 헥손으로 삽입하는 것은 매우 가능성이 크다. 따라서, 키메라 단백질이 얻어진다.
특정 아데노바이러스의 펜톤, 다른 것으로부터의 헥손, 섬유, 다른 아데노바이러스로부터의 E3 영역을 가지는 것이 또한 가능하다. 본 발명에 따르면, 이들을 코드하는 유전자나 단백질 중 적어도 하나 이상은 아데노바이러스 35 또는 이들의 기능성 동족체로부터의 구성성분으로 이루어져야만 하며, 이에 따라 이 구성성분은 숙주의 면역 반응에 효과를 가진다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 전달을 제공하는데, 이는 하나 이상의 다른 아데노바이러스와 아데노바이러스 35의 키메라이다. 이 방법으로, 생성된 바이러스를 다른 면에서 면역 반응 만으로 변형할 수도 있다. 감염에 책임이 있는 성분으로 감염의 효능을 향상시킬 수 있고; 팩키징 세포의 복제를 향상시키거나; 그 친화성(tropism)을 변화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 아데노바이러스 35와는 다른 친화성을 갖는 본발명에 따른 유전자 전달체를 제공하는 것이다. 물론, 바람직하게는 유전자 전달체가 숙주 세포의 서브세트 즉, 표적 세포에 우세하게 전달될 정도로 친화성이 변화되어야 한다. 아데노바이러스성 또는 다른 유전자 전달체의 본 발명에서 적용될 수 있는 친화성의 변화 및 다른 변화는 출원인의 다른 출원(98204482.8, 99200624.7, 및 98202297.2)에 기재되어 있다. 물론 본 출원은 본 발명의 유전자 전달체 및/또는 키메라 등을 얻기에 유용한 그리고/또는 필수적인 어떤 그리고 모든 빌딩 블록(building block)을 또한 제공한다. 이는 PER.C6(ECACC 기탁번호 96022940)와 같은 팩키징 세포 또는 이에 기초하나, Ad35 또는 이들의 기능성 동족체를 위해 수용성된 세포를 포함한다; 흥미있는 유전자 및 ITR 등으로 이루어진 벡터 뿐만 아니라 헬퍼 구조체 또는 팩키징 세포와 같은 아데노바이러스 35 또는 이들의 기능성 동족체의 기능성 부분을 코드하는 모든 핵산을 포함한다.
전형적으로, 참고자료로 여기에 병합된, 본 출원인의 출원(PCT/NL96/00244) 은 발명된 유전자 전달체에 도달하기 유용하고 필수적인 성분을 개시한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 전달체, 또는 바이러스, 본 발명에 따른 이들의 동족체 또는 키메라의 기능성 부분를 하나 이상 코드하는 핵산을 제공할 수도 있다. 본 발명에 따르면, 생성된 유전자 전달체에서 끝나게 될 기능을 코드하는 이러한 구성성분은, 유전자가 전달될 숙주에 의하여 아데노바이러스성 구성성분에 대항하여 중화 활성을 감소시키거나 회피할 수 있는 아데노바이러스 혈청형 35 구성성분 또는 이들의 기능성 대등체 중 하나 이상을 코드화하는 핵산에 의하여 코드화되거나 또는 구성되어야만 한다. 전형적으로, 흥미있는 유전자는 이러한 핵산이이러한 유전자를 가진다거나 흥미있는 유전자를 그 안에 삽입시키기 위한 부위를 가진다는 것을 의미하는 동일한 핵산 상에 존재할 것이다.
만약 핵산이 팩키징 신호도 팩키징되는 것이라면, 이러한 핵산은 전형적으로는 하나 이상의 ITR로 이루어질 수 있다. 그러나, 상기한 바와 같이 본 발명의 모든 필수적이고 유용한 구성성분 및/또는 빌딩 블록은 본 출원인의 출원 (PCT/NL96/00244)에서 발견될 수 있다. 아데노바이러스성 유전자 전달체를 제조하는 분야에서 보다 향상된 조합은 상기한 PCT/NL99/00235에 기재된 본 출원인의 플라스미드 시스템이다. 상기 시스템은 한 구체예에서, 유전자 전달체에 삽입될 핵산의 모든 구성성분을 함께 포함하는, 어댑터 플라스미드 및 더 긴 플라스미드의 동족체 재조합으로서 작용한다. 이러한 방법은 여기서 발명된 유전자 전달체 및 이들의 구성성분에 적용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산으로 이루어지는 두 핵산의 하나 이상의 세트의 일부로서, 동족체 재조합을 위하여 유용하거나 이를 위하여 디자인된 핵산의 영역을 더 포함하는 본 발명에 따른 핵산을 제공할 수도 있고, 그리하여 상기 핵산의 조합이 서로 단일 동종성 재조합될 수 있어 기능성 유전자 전달체를 코드화하는 핵산을 만든다. 빈(empty) 팩키징 세포(여기서 본 발명에 따른 유전자 전달체를 만들기 위하여 팩키징되는 벡터가 삽입되거나 제조되어야만 함) 및 팩키징될 본 발명에 따른 벡터로 이루어진 세포가 모두 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 핵산의 세트으로 이루어진 세포, 바람직하게는 팩키징에 따라 핵산이 없거나 본 발명에 따른 핵산의 세트가 없는 아데노바이러스 복제를 위하여 필수적인 구성성분을 보완하는 세포도 포함한다. 본 발명에서, E1-제거된 아데노바이러스 35 벡터는 아데노바이러스 5 단백질을 트란스로(in trans) 제공하는 세포 상 복제를 가능하게 한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 아데노바이러스 35 E1 단백질을 트란스로 제공할 수 있는 세포를 더 제공한다. 전형적으로, 이러한 세포는 망막이나 신장으로부터 유도된 인간 세포이다. 암니오사이트(amniocytes)와 같은 태아 세포는 E1 보충 세포주의 성장에 특히 적합하다고 보여져 왔다. 따라서, 이러한 세포는 본 발명에 바람직하다. E1 단백질에 의한 혈청형 특이적 보충은 E1 영역에 의하여 코드화되는 하나 또는 그 이상의 단백질에 기인할 수 있다. 따라서, 보충적 세포주에서 적어도 혈청형 특이적 단백질을 트란스로 제공하는 것이 필수적이다. E1-제거된 아데노바이러스의 효과적인 보충을 위하여 필수적인 비혈청형 특이적 E1 단백질이 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 35의 E1B 영역으로부터 적어도 하나의 E1B 영역은 벡터에 기초한 E1-제거된 아데노바이러스 35를 보충하기 위하여 트란스로 제공되는 것이다. 구체예 중 하나에서는, 하나 또는 그 이상의 혈청형 특이 E1-단백질을 코드화하는 핵산이 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940)로부터 생겨나는 세포 또는 PER.C6 세포 안으로, 또는 Ad 35으로부터 나온 구성성분과 보충적인 유사한 팩키징 세포나 이들의 기능성 동족체 안으로 도입된다. 이미 언급된 바와 같이, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 전달체를 제조하기 위한 방법 또한 포함하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 핵산을 발현시키고, 그리고 생성된 유전자 전달체를 얻는 단계로 이루어진다. 이는 적절한 핵산으로 빈 팩키징 세포를 채우는 것에 관한 것이다. 물론채워진 세포의 구성 또한 본 발명에 따른 유전자 전달체를 생성하기 위한 방법을 제공하는 본 발명의 일부이며, 상기 방법은 적절한 배지에서 본 발명에 따른 채워진 팩키징 세포(생산자 세포)를 배양하고, 그리고, 생성된 유전자 전달체를 얻는 단계로 이루어진다.
물론 본 발명에 따른 방법에 의하여 얻어지는 어떠한 생성된 유전자 전달체도 본 발명의 일부가 되며, 특히 완전한 바이러스 및 아데노바이러스의 키메라로부터 유도된 본 발명에 따른 유전자 전달체도 본 발명의 일부가 된다. 정상적으로는 아데노바이러스성 유전자 전달체가 숙주 게놈으로 합치되지 않는다는 것이 잘 알려져 있다. 숙주 세포에서 유전자의 장기간 발현을 위하여, 이러한 기능을 가지는 키메라를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 키메라는 본 출원인의 다른 출원 PCT/NL98/00731에 개시되어 있다. 아데노바이러스와 완전한 바이러스의 이러한 키메라의 매우 좋은 예는 상기 완전한 바이러스가 아데노 관련 바이러스인 것이다. 상기한 바와 같이 이와 결합할 수도 있는 다른 유용한 키메라는 변형된 친화성을 갖는 (전체 단백질 또는 이들의 부분 또는 이 둘 모두를 바꾸는) 키메라이다. 이들의 매우 좋은 예는, 예를 들어 Ad 2 또는 Ad 5로부터의 구성성분을 가지는 Ad 35 및 Ad 16의 키메라이고, 상기 Ad 16의 친화성 결정부 또는 이의 기능성 대등체가 활액세포(synoviocyte) 및/또는 민무늬 근육세포로 유전자 전달체를 향하게 하기 위하여 사용된다 (여기서 참고자료로 편입된 본 출원인의 다른 출원 98204482.8 및 99200624.7 참조). 수지상 돌기 세포(DC)와 조혈 모세포(HSC)는 Ad2 또는 Ad5 유도된 유전자 전달체로 쉽게 형질도입되지 않는다. 본 발명은 DC와 HSC 세포의 증가된 형질도입 성능을 갖는 유전자 전달체를 제공한다. 이러한 유전자 전달체는 Ad35 아데노바이러스의 조직 친화성 결정부로 이루어진다. 따라서, 본 발명은 수지상 돌기 세포 및/또는 조혈 모세포를 형질 도입하기 위한 아데노바이러스 35 캡시드의 조직 친화성 결정부의 용도를 더 제공한다. 다른 B-타입 아데노바이러스도 적합하다. 조직 친화성 결정부는 적어도 섬유 단백질의 두부(knob) 및/또는 줄기(shaft)를 포함한다. 물론 섬유 단백질에서 조직 친화성에 책임이 있는 아미노산 서열을 결정하는 것은 당업자에게 매우 가능한 일이다. 이러한 지식은 이러한 아미노산 서열로 이루어지는 키메라 단백질을 발명하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 키메라 단백질 또한 본 발명의 일부가 된다. DC 세포는 매우 효율적인 항원 발현 세포이다. 이러한 세포로 유전자 전달체를 삽입하기 위하여 숙주의 면역 시스템은 특이적인 항원을 향하여 시작될 수 있다. 이러한 항원은 DC에 전달되는 핵산에 의하여 또는 유전자 전달체의 단백질 그 자체에 의하여 코드화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 백신으로서 숙주 면역 시스템를 빠져나가는 능력을 가지는 유전자 전달체를 제공하기도 한다. 면역 시스템을 빠져 나갈 수 있는 벡터는 표적 세포를 효율적으로 찾을 만큼 충분히 길고, 이와 동시에 항원 발현 세포에 특이적인 항원을 전달할 수 있어, 특이적 항원(들)을 향한 효율적 면역 반응을 유발시키거나 자극하게 된다. 면역반응을 더 조절하기 위하여, 유전자 전달체는 면역반응을 조절할 수 있는 단백질을 코드화하는 단백질 및/또는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 단백질의 예는 인터루킨, 유착분자, 공동 자극 단백질, 인터페론 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 유전자 전달체로이루어진 백신을 제공한다. 또한, 본 발명은 혈청형 35 아데노바이러스의 조직 친화성 결정부를 포함하는 벡터, DC 및/또는 HSC를 효과적으로 형질도입하는 능력을 가진 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 HSC 및/또는 DC세포의 형질도입을 위한 이러한 전달체의 용도를 제공한다. 유사한 조직 친화성이 혈청형 B, 특히 혈청형 11의 다른 아데노바이러스 중에서도 발견되며, 이 또한 본 발명의 일부이다. 물론, 조직 친화성 결정부를 갖는 다른 유전자 전달체를 제공하여, 향상된 DC 및/또는 HSC 형질 도입 능력을 갖는 이러한 전달체를 제공하는 것 또한 가능하다. 따라서, 이러한 유전자 전달체도 본 발명의 일부가 된다.
본 발명에 따른 유전자 전달체는 숙주 세포에 대한 흥미있는 핵산 또는 유전자를 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 전형적으로 의약적 용도가 될 수 있다. 이러한 용도는 본 발명에 포함된다. 이러한 용도에 적합한 조성물은 본 발명의 일부이기도 하다. 투여량당 또는 감염당(m.o.i) 존재할 필요가 있는 유전자 전달체의 양은 처리 조건, 개체에 대한 투여 경로(전형적으로는 비경구적), 및 감염의 효율성 등에 의존될 것이다. 투여량 발견 연구는 당업계에 잘 알려져 있고, 다른 (아데노바이러스) 유전자 전달체와 함께 이미 수행된 것이 본 발명에 따른 유전자 전달체의 적정 투여량을 발견하는 지침으로서 전형적으로 사용될 수 있다. 전형적으로 이는 또한 원하지 않는 부위에 매체에 의한 감염을 방지하는 적절한 수단, 적절한 투여수단, 적절한 부형제 등을 발견할 수 있는 곳이기도 하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 유전자 전달체 및 적절한 부형제 뿐만 아니라 아데노바이러스, 이들의 키메라, 또는 본 발명에 따른 이들의 기능성 동족체 및 적절한 부형제로 이루어지는 약제학적 조제물을 제공한다.
본 발명은 유전자 요법 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 바이러스로부터 유래된 구성성분, 더 구체적으로는 아데노바이러스의 구성성분을 포함하는 유전자 요법에 관한 것이다. 아데노바이러스는 숙주에 유전자를 전달하는 적절한 매개체로서 제안되어 왔다.
도 1은 시험된 각각의 인간 wt 아데노바이러스의 중화에 대해 양성인 혈청 샘플의 퍼센트를 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 VP/CCID50 비와 중화 퍼센트 간에는 상관관계가 없음을 보여주는 그래프이다.
도 3은 Ad35 (Kang et al., 1989) 및 재조합 Ad35-기초 바이러스를 만들기 위해 생성된 클론들의 부분적 제한 지도의 계략도이다.
도 4는 아데노바이러스 혈청형에 대해 중화 활성을 보이는 퍼센트 혈청 샘플들을 나타내는 막대 그래프이다. 혈청은 벨기에 및 영국의 건강한 지원자들로부터 유래된 것이었다.
도 5는 아데노바이러스 혈청형 5, 11, 26, 34, 35, 48 및 49에 대해 중화 활성을 보이는 퍼센트 혈청 샘플들을 나타내는 막대 그래프이다. 혈청은 유럽 및 미국의 5곳의 상이한 위치에서 유래된 것이었다.
도 6a 내지 도 6h는 인간 아데노바이러스 35의 서열이다. 본문에 설명된 바와 같이, 바이러스의 말단부의 뉴클레오티드 서열은 명확히 결정되지는 않았다.
도 7은 pAdApt의 지도이다.
도 8은 pIPspAdapt의 지도이다.
도 9는 pIPspAdapt1의 지도이다.
도 10은 pIPspAdapt3의 지도이다.
도 11은 pAdApt35IP3의 지도이다.
도 12는 pAdApt35IP1의 지도이다.
도 13은 pWE.Ad35.pIX-rITR를 구성하기 위해 행해진 단계들의 계략도이다.
도 14는 pWE.Ad35.pIX-rITR의 지도이다.
도 15는 pRSV.Ad35-E1의 지도이다.
도 16은 PGKneopA의 지도이다.
도 17은 pRSVpNeo의 지도이다.
도 18은 pRSVhbvNeo의 지도이다.
도 19는 인간 TF-1 세포들에서 그린 형광 단백질(GFP) 발현에 대한 유동세포주수(flow cytometric) 분석을 나타낸다. 비-형질도입된 TF-1 세포들을 1%의 배경 수준을 준비하기 위해 사용하였다. Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib17, Ad5.Fib40-L, Ad5.Fib35, 및 Ad5.Fib51로 형질도입된 세포들에서 GFP 발현이 나타나 있다.
도 20은 초기 인간 섬유아세포-유사 스트로마의 형질도입을 나타낸다. 세포들을 상이한 키메라 섬유 바이러스들에 2시간 노출시킨 후, 48시간째에 분석하였다. 유동 세포주수기를 사용하여 트랜스-유전자: 그린 형광 단백질 (GFP)에 대해 양성으로 확인된 세포들의 퍼센트가 도시되어 있다. 비-형질도입된 스트로마 세포들을 1%의 배경 수준을 준비하기 위해 사용하였다. 상이한 실험들 (n=3)의 결과들을 ±표준편차로 나타내었다.
도 21은 초기 인간 섬유아세포-유사 스트로마, CD34+세포들 및 CD34+Lin-세포들의 형질도입을 나타낸다. 세포들을 상이한 키메라 섬유 바이러스들에 2시간 노출시킨 후, 5일째에 분석하였다. 유동 세포주수기를 사용하여 트랜스-유전자: 그린 형광 단백질 (GFP)에 대해 양성으로 확인된 세포들의 퍼센트가 도시되어 있다. 비-형질도입된 스트로마 세포들을 1%의 배경 수준을 준비하기 위해 사용하였다. 또한, GFP 양성 경우의 수를 분석된 총 경우의 수로 나눈 것이 또한 도시되어 있다 (괄호내에).
도 22a는 Ad5.Fib51로 CD34+세포들의 형질도입 후에 GFP 양성 세포들의 유동 세포주수 분석을 나타낸다. R2-R7에서 게이트된 모든 세포들은 CD34에 모두 양성이나, 초기 분화 마커들 CD33, CD38 및 CD71 (Lin)의 발현에서도 다르다. R2에서 세포들은 CD33, CD38, CD71에 음성인 반면에, R7에서 세포들은 이 마커들에 양성이다. Ad5.Fib51의 특이성을 증명하기 위해, GFP 양성 세포들의 퍼센트를 91% (R2)에서 15% (R7)로 급락함이 증명된 R2-R7에서 결정되었다.
도 22b는 도 22a (X-축은 R2-R7)하에서 보여진 바와 동일한 실험이나 다른 Ad 섬유 키메라 바이러스들에서 Ad5.Fib35 및 Ad5.Fib16이 Ad5.Fib51과 유사하게 행동한다는 것을 보여준다.
도 23은 Ad35 섬유 서열을 갖는 Adfib16, Ad5.fib35 및 Ad5fib51의 키메라 섬유 단백질의 배열을 나타낸다.
도 24는 원시 인간 골수 세포들 및 줄기세포들에 아데노바이러스 노출의 독성을 나타낸다. 세포 배양물을 아데노바이러스 형질도입 직전 및 형질도입 후 5일째에 계수하였다. 0일째에 비교하여 회복된 원시 인간 골수 세포들 (CD34+) 및 HSC들 (CD34+Lin-)의 퍼센트가 도시되어 있다.
도 25는 세포당 100 또는 1000 바이러스 입자들의 바이러스 투여량에서 미성숙 DCs의 형질도입을 나타낸다. 시험된 바이러스는 Ad5 및 혈청형 12 (Ad.Fib12), 16 (Ad.Fib16), 28 (Ad.Fib28), 32 (Ad.Fib32)의 섬유, 40 (Ad.Fib40-L), 49 (Ad.Fib49), 51 (Ad.Fib51)의 긴 섬유를 지닌 Ad5 기초 벡터들이다. 루시페라제 트랜스-유전자 발현은 단백질의 ㎍당 상대적인 광단위로 표현된다.
도 26은 세포당 Ad5 또는 섬유 키메라 벡터 Ad5.Fib16, Ad5.Fib40-L 또는 Ad5.Fib51의 10000 바이러스 입자로 형질도입된 비성숙 및 성숙 DCs의 LacZ 발현의 유동 세포주수 분석을 나타낸다. 양성을 나타낸 세포들의 퍼센트가 각 히스토그램의 상부 왼쪽 구석에 도시되어 있다.
도 27은 세포당 1000 또는 5000 바이러스 입자들로 형질도입 후 48시간에 측정된 인간 미성숙 DCs에서 루시페라제 트랜스-유전자 발현을 나타낸다. 시험된 바이러스는 서브그룹 B 구성원들 (혈청형 11, 16, 35 및 51)의 섬유를 지닌 섬유 키메라 바이러스였다.
도 28은 세포당 Ad5, Ad5.Fib16 및 Ad5.Fib35의 1000 바이러스 입자들로 형질도입 후 48시간에 그린 형광 단백질 (GFP) 발현을 나타낸다. 비-형질도입된 세포들을 약 1%의 배경 수준을 준비하기 위해 사용하였다.
도 29는 마우스 및 침팬치 DCs의 형질도입을 나타낸다.
형질도입 후 48시간에 마우스에서 측정된 루시페라제 트랜스-유전자 발현은 단백질의 ㎍당 상대적인 광단위로 표현된다. 침팬치 DCs는 형질도입 후 48시간에 유동 세포주수기를 사용하여 측정되었다. GFP 발현은 Ad5.Fib35 (66%)에 대비하여 Ad(35)의 열등한 형질도입을 증명한다.
도 30은 PER.C6의 온도 의존 성장을 나타낸다.
PER.C6 세포들은 10% 소 태아 혈청 (FBS, Gibco BRL) 및 10mM MgCl2로 보충된 둘베코 변형된 이글 배지에서 32℃, 37℃ 또는 39℃, 10% CO2하에 배양하였다. 0일째, 총 1×106PER.C6 세포들을 25cm2조직 배양 플라스크 (Nunc) 마다 접종했고 그리고 세포들을 32℃, 37℃ 또는 39℃에서 배양하였다. 1-8일째, 세포들을 계수하였다. 39℃에서 PER.C6 배양물의 성장 속도 및 최종 세포 밀도는 37℃의 것에 필적하였다. 32℃에서 PER.C6 배양물의 성장 속도 및 최종 세포 밀도는 37℃ 또는 39℃의 것에 비하여 약간 줄었다.
PER.C6 세포들을 25cm2조직 배양 플라스크 (Nunc) 마다 1×106의 세포 밀도로 32℃, 37℃ 또는 39℃에서 접종하였다. 지정된 시점들에서, 세포들을 Burker 세포 계수기에서 계수하였다. PER.C6은 32, 37 및 39℃에서 잘 자란다.
도 31은 pcDNA3, pcDNA3wtE2A 또는 pcDNA3ts125E2A로 형질전환된 PER.C6 세포들에서 DBP 수준들을 나타낸다.
동일 양의 전체-세포 추출물들을 10% 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분획화하였다. 단백질들을 이모빌론(Immobilon)-P 막들 상으로 전달시키고 그리고 DBP 단백질을 ECL 검출 시스템에서 αDBP 모노클로날 B6을 사용하여 가시화하였다. pcDNA3ts125E2A 트랜스펙션으로부터 유래된 모든 세포주들은 72-kDa E2A-코드화된 DBP 단백질 (왼쪽 패널, 레인 4-14; 중간 패널, 레인 1-13; 오른쪽 패널, 레인 1-12)를 발현한다. 이에 대비하여, pcDNAwtE2A 트랜스펙션으로부터 유래된 세포주만 DBP 단백질을 발현하지 않았다 (왼쪽 패널, 레인 2). 음성 대조구인 pcDNA3 트랜스펙션으로부터 유래된 세포주의 추출물 (왼쪽 패널, 레인 1)에서는 DBP 단백질이 검출되지 않았다. pcDNA3ts125로 순간적으로 트랜스펙션된 PER.C6 세포 유래의 추출물 (왼쪽 패널, 레인 3)을 웨스턴 블로팅에서 양성 대조구로 이용하였다. 이들 데이터는 wtE2A의 구성적 발현이 세포들에 독성이라는 것과 E2A의 ts125 돌연변이를 사용하여 이 독성을 회피할 수 있다는 것을 확인한다.
도 32는 PER.C6ts125E2A C5-9의 현탁 성장을 나타낸다.
tsE2A 발현 세포중 PER.C6tsE2A.C5-9를 혈청이 없는 Ex-cellTM에 현탁하여 배양하였다. 지정된 시점들에, 세포들을 Burker 세포 계수기로 계수하였다. 8 독립 배양의 결과가 도시되어 있다. PER.C6tsE2A는 혈청이 없는 Ex-cellTM배지에서 현탁액으로 잘 자란다.
도 33은 PER.C6 및 PER.C6tsEA 성장 곡선을 나타낸다.
PER.C6 세포들 또는 PER.C6ts125E2A (c8-4) 세포들을 각각 37℃ 또는 39℃에서 배양하였다. 0일째, 총 1×106의 세포들을 25cm2조직 배양 플라스크 마다 접종하였다. 지정된 시점들에서, 세포들을 계수하였다. 37℃에서 PER.C6 세포들의 성장은 39℃에서 PER.C6ts125E2A c8-4의 성장에 필적한다. 이것은 ts125E2A의 구성적 과발현은 39℃의 비-허용 온도에서 세포들의 성장에 대한 해로운 효과갖지 않는다는 것을 보여준다.
도 34는 PER.C6ts125E2A의 안정성을 나타낸다.
여러번의 계대를 위하여, PER.C6ts125E2A 세포주 클론 8-4은 G418 없는 배지에서 39℃에서 배양하였다. 다른 계대 횟수로부터의 전체-세포 추출물의 동등 양을 10% 겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분획화했다. 단백질들을 이모빌론-P 막들 상으로 전달시키고 그리고 DBP 단백질을 ECL 검출 시스템에서 αDBP 모노클로날 B6을 사용하여 가시화하였다. ts125E2A 코드화된 DBP의 발현은 약 40 세포 배가(doubling)와 동등한, 적어도 16 계대에 적합하다. 이 배양 기간 동안 DBP 수준의 감소는 관찰되지 않았는데, 이것은 ts125E2A의 발현은 심지어 G418 선택 과정이 없는 데도 안정하다.
도 35a 및 도 35b는 히그로마이신 내성 PER.C6/tTA 및 PER/E2A/tTA 세포들에서 tTA 활성을 나타낸다.
16 독립 히그로마이신 내성 PER.C6/tTA 세포 콜로니들 및 23 독립 히그로마이신 내성 PER/E2A/tTA 세포 콜로니들은 서브-컨플루어시(sub-confluency)로 10cm2웰에서 성장되었고 그리고 2㎍의 pUHC 13-3 (7×tet0 프로모터의 조절하의 리포터유전자 루시페라제를 함유하는 플라스미드)로 트랜스펙션되었다. 배양물의 반은 tTA의 활성을 저해하는 독시사이클린을 함유하는 배지에서 유지되었다. 트랜스펙션 후 48시간에 세포들을 수확하고 루시페라제 활성을 측정하였다. 루시페라제 활성은 ㎍ 단백질당 상대적 광단위 (RLU)로 표시된다.
상기한 바와 같이, 아데노바이러스 중 가장 광범위하게 연구된 혈청형은 숙주 세포에 부가적 유전 물질을 전달하기에 이상적으로 적합하지는 않다. 이는 이들 혈청형에 대항하는 개체군 중 선재하는 면역에 일부 기인한다. 바이러스에 대항하는 강한 제2의 체액성 및 세포성 면역 반응과 결합하여, 인간에게 선재하는 항체의 존재는 아데노바이러스 유전자 요법에 영향을 줄 것이다.
본 발명은 유전자 요법 벡터로서 적어도 매우 적합한 아데노바이러스의 혈청형 구성성분 및 이들의 기능성 동족체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 많은 개체로부터 얻은 혈청에 대항하는 공지된 모든 아데노바이러스 혈청형의 자동화된 고-작업 처리율 스크리닝 또한 개시한다. 놀랍게도, 하나의 특정 혈청형, 아데노바이러스 35(Ad35)에 대항하여 측정되었던 혈청 중 어느 것에서도 중화작용이 발견되지 않았다. 이는 본 발명의 혈청형을 사람에 대한 유전자 요법을 위한 벡터 시스템으로서 매우 유용하게 한다. 이러한 벡터 시스템은 선재하는 면역의 고유한 문제없이 인간 세포에 유전자 물질을 효율적으로 전달할 수 있다.
전형적으로, 바이러스는 아데노바이러스 벡터(전형적으로는 플라스미드, 코스미드, 또는 배큘로바이러스 벡터)를 사용하여 제조된다. 물론 이러한 벡터도 본 발명의 일부가 된다. 본 발명은 또한 E1 영역의 불활성 또는 결실에 의하여 복제의 결함을 일으켜 왔던 아데노바이러스 유래 벡터를 제공한다. 물론, 흥미있는 유전자도 예를 들면, 벡터가 유래된 원래의 아데노바이러스의 E1 부위에 삽입될 수 있다. 본 발명의 모든 면에서, 아데노바이러스는 하기의 둘 중 하나는 프로모터에 결찰되거나, 또는 둘 다 결찰되지 않은 이종성 유전자의 삽입 및 E1 영역의 결실을 가질 수 있다. 또한, 아데노바이러스는 프로모터에 결찰된 이종성 유전자의 삽입 및 E2, E3, 또는 E4 영역의 결실을 함유할 수 있다. 이 경우, E2 및/또는 E4 보충적 세포주은 재조합 아데노바이러스를 제조하는데 요구된다.
유전자 요법에 사용되는 재조합 아데노바이러스의 제조를 위하여 Ad35 그 자체의 사용을 선택할 수 있다. 선택적으로, 이러한 재조합 아데노바이러스에서 본 발명의 혈청형으로부터 유래된 구성성분을 사용하는 것을 선택할 수 있다. 예를 들면, 다른 혈청형으로부터의 원하는 성질을 결합시킨 키메라 아데노바이러스를 개발할 수도 있다. 어떤 혈청형은 어느 정도 제한된 숙주 범위를 가지지만, 면역 생성이 더 작은 장점을 가지고, 일부는 다른 방식 범주이다. 일부는 제한된 독성을 가지는 문제가 있지만, 광범위한 숙주 범위 및/또는 감소된 면역 생성을 갖는다. 이러한 키메라 아데노바이러스는 당업계에 공지되고, 이들은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 따라서, 한 구체예에서 본 발명은 최소한 본 혈청형의 아데노바이러스 게놈의 일부를 포함하고, 이를 선재하는 면역 부재에 제공하고, 그리고 적어도 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터 나온 아데노바이러스 게놈 일부를 키메라 아데노바이러스로 되게하는 키메라 아데노바이러스를 제공한다. 이러한 식으로, 제조된 키메라 아데노바이러스는 본 발명에 따른 혈청형의 선재 면역의 부재를 다른 혈청형의 다른 특징에 결합하는 것이다. 이러한 특징은 온도 안정성, 조립, 장착(anchoring), 재배향된(redirected) 감염, 생성율, 재배향되거나 향상된 감염,표적 세포에서 DNA의 안정성, 등이 될 수 있다.
일반적으로, 팩키징 세포는 아데노바이러스의 충분한 양을 제조하기 위하여 필요할 것이다. 유전자 요법 목적을 위한 재조합 아데노바이러스의 생성을 위하여, 몇몇 세포주이 유용하다. 이들은 공지된 세포주인 PER.C6(ECACC 기탁번호 96022940), 911, 293, 및 E1 A549를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 중요한 특징은 아데노바이러스를 제조하기 위한 수단이다. 전형적으로, 임상적 투여가 복제 수용성 아데노바이러스를 함유하도록 하는 아데노바이러스 배치(batch)를 원하지 않는다. 따라서, 일반적으로 아데노바이러스 벡터에 아데노바이러스 게놈으로부터 나온 다수의 (그러나 최소 하나 이상의) 유전자를 생략하고, 벡터가 키메라 아데노바이러스 제조를 유도하는 세포의 게놈에 이들 유전자를 공급하는 것이 바람직하다. 이러한 세포는 일반적으로 팩키징 세포로 불린다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 아데노바이러스성 벡터에 존재하지 않는 아데노바이러스 생성을 위하여 필수적인 모든 구성성분을 트란스로 함유하는, 본 발명에 따른 아데노바이러스(유전자 전달체)를 제조하기 위한 팩키징 세포를 제공한다. 전형적으로, 벡터와 팩키징 세포는 모든 필수 구성성분을 가진다는 점에서, 그러나, 재조합에 의하여 복제 수용성 바이러스를 이끄는 중복되는 구성성분을 가지지 않는다는 점에서 서로 수용성되어야만 한다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 본 발명에 따른 팩키징 세포로 이루어져, 필수적으로 재조합을 이끄는 서열 겹침이 없어 상기 세포와 상기 벡터 사이에 복제 경쟁적 아데노바이러스를 제조하게 하는 부분의 키트를 제공하기도 한다.
따라서, 본 발명은 실질적으로 자연적인 면역이 존재하지 않는 아데노바이러스 혈청형에 대항하여 이 혈청형으로부터 유래된 구성성분을 벡터에 제공하고, 그리고 바이러스 입자의 생성을 가능하게 하고 본 발명에 따른 팩키징 세포 내 상기 벡터를 감염시키는 단계로 이루어지는 처치시 선재하는 체액성 면역을 피하게 될 아데노바이러스 제조방법을 제공하는 것이다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 치료적 적용을 위하여 생체내 투여되는 아데노바이러스를 향하여 자연적으로 존재하거나 유도된, 중화 숙주 활성을 극복하기 위한 본 발명의 아데노바이러스성 혈청형의 용도를 개시한다. 새 혈청형의 필요성은 하기의 관찰에 의하여 강조된다: 1) 재조합 아데노바이러스 혈청형 5의 반복된 전신성(systemic) 전달은 재조합 아데노바이러스 혈청형 5에 대항하는 중화 항체의 고 역가 형성 때문에 실패하고(Schulick 등 1997), 2) 선재하는 체액성 면역이 개체군에 광범위하게 퍼진다.
다른 면에서, 본 발명은 백신화 목적을 위한 아데노바이러스 혈청형 35의 용도 또는 본 발명의 유전자 전달체의 용도를 제공한다. 이러한 용도는 숙주의 적어도 부분적으로는 바람직하지 않은 면역 반응을 방해한다. 바람직하지 않은 면역 반응의 예는 유전자 전달체 또는 아데노바이러스 혈청형 35에 대한 면역 반응을 일으키고 그리고/또는 유전자 전달체 또는 아데노바이러스 35에 대한 면역 반응을 증가시키는 것이지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 관점은, 또 다른 용도가 다른 서브그룹에 속하는 Ad 벡터로이루어지는 것이다. 따라서, 본 발명의 이러한 관점은 유전자 요법 목적을 위한 아데노바이러스의 투여를 반복하지 못하는 것을 회피하게 한다.
실시예 1
인간 혈청에서 중화 활성을 감지하기 위한 고-작업처리(throughput) 검사
모든 아데노바이러스 혈청형에 대한 중화 항체의 존재를 위하여 다량의 인간 혈청을 스크리닝할 수 있도록, 자동화된 96-웰(wells) 검사가 진행되었다.
인간 혈청
100명의 피험자가 선정되었다. 지원자(남성 50%, 여성 50%)는 인종제한 없이 20세에서 60세 사이의 건강한 사람이었다. 모든 지원자는 공지된 동의서에 서명하였다. 직업적으로 아데노바이러스 연구에 종사하는 사람은 제외되었다.
약 60㎖의 혈액이 건조 시험관에 모였다. 채취 후 2 시간 내에, 혈액은 2500 rpm에서 10분 동안 원심분리되었다. 약 30㎖ 혈청이 폴리프로필렌 시험관으로 전달되고 다음 사용 때까지 -20℃에서 냉동 보관되었다.
혈청은 해동되어, 56℃에서 10분 동안 열처리-불활성화되었고, 그 다음 냉동/해동의 반복 사이클을 방지하기 위하여 분배되었다. 일부는 약 70개의 96-웰판을 채우기에 충분한 양으로 배지(DMEM, Gibco BRL)에서 2배 희석의 5단계를 만드는데 사용되었다. 희석되지 않은 그리고 희석된 혈청 부분이 깊은 웰 플레이트로피펫에 의하여 옮겨지고, 프로그램화된 플레이트 메이트를 사용하여 96-웰 플레이트 안으로 100㎕ 분취량으로 분배되었다. 상기 플레이트는 아래의 표에 따라 8개의 다른 혈청으로 이배수로(100㎕/웰수) 로딩되었다:
S1/2 S1/4 S1/8 S1/16 S1/32 S5/2 S5/4 S5/8 S5/16 S5/32 - -
S1/2 S1/4 S1/8 S1/16 S1/32 S5/2 S5/4 S5/8 S5/16 S5/32 - -
S2/2 S2/4 S2/8 S2/16 S2/32 S6/2 S6/4 S6/8 S6/16 S6/32 - -
S2/2 S2/4 S2/8 S2/16 S2/32 S6/2 S6/4 S6/8 S6/16 S6/32 - -
S3/2 S3/4 S3/8 S3/16 S3/32 S7/2 S7/4 S7/8 S7/16 S7/32 - -
S3/2 S3/4 S3/8 S3/16 S3/32 S7/2 S7/4 S7/8 S7/16 S7/32 - -
S4/2 S4/4 S3/8 S3/16 S3/32 S8/2 S8/4 S8/8 S8/16 S8/32 - -
S4/2 S4/4 S3/8 S3/16 S3/32 S8/2 S8/4 S8/8 S8/16 S8/32 - -
1열 및 6열에서 S1/2 내지 S8/2은 1×희석된 혈청을 나타내고, Sx/4, Sx/8, Sx/16, 및 Sx/32는 연속적으로 두배씩 희석된 것을 나타낸다. 마지막 플레이트는 음성 대조군으로서 태아 송아지 혈청 100㎕로 채워진 네개의 웰을 또한 함유한다. 플레이트는 다음 사용될 때까지 -20℃에서 보존된다.
인간 아데노바이러스 스톡(stock)의 제조
모든 공지된 인간 아데노바이러스의 원형은 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940)(Fallaux 등, 1998)로 담긴 T25 프라스크 상에 접종되어 완전한 CPE 상에서 얻었다. 조(粗) 용해물(lysate)의 1-2㎖를 냉동/해동한 후 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940)로 T80 플라스크를 접종하기 위하여 사용되었고, 바이러스는 완전한 CPE에서 얻어졌다. 바이러스의 양 뿐만 아니라 접종과 CPE 발생 사이의 시간표가, 새 배양을 재감염시키고 혈청형 사이에서 구분되게 하기 위하여 요구된다. 아데노바이러스 스톡는 냉동/해동에 의하여 준비되었고, PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940)로 3-4 T175 ㎠ 삼층 플라스크를 접종하기 위하여 사용되었다. CPE 발생시, 세포는 상기 플라스크를 가볍게 두드림으로서 얻어져 펠렛화되었고, 바이러스는 다음과 같이 두 단계 CsCl 구배에 의하여 분리 및 정제되었다. 세포 펠렛은 10mM NaPO4완충액(pH 7.2) 50㎖에 용해시키고, -20℃에서 해동되었다. 37℃에서 해동시킨 후, 나트륨 디옥시콜레이트(5% w/v) 5.6㎖가 첨가되었다. 용액은 서서히 혼합되고, 세포를 완전히 용해시키기 위하여 37℃에서 5-15분 동안 배양되었다. 용액을 균질화시킨 후, 1M MgCl21875㎕가 첨가되었다. 375㎕ DNAse(10㎎/㎖) 첨가한 후, 용액은 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 세포 이물질은 상온에서 종결없이 30분 동안 1880×g로 원심분리하여 제거되었다. 상징액은 프레온(3×)으로 추출하여 단백질로부터 연속적으로 정제되었다. 정제된 상징액은 1M 트리스/HCl 완충된 세슘클로라이드 블록구배(범위: 1.2/1.4 gr/㎖) 상에 로딩되어 10℃에서 2.5시간 동안 21000 rpm에서 원심분리되었다. 1.33 gr/㎖의 세슘클로라이드의 1M 트리스/HCl 완충된 연속 구배를 사용하여 제2차 정제가 실시된 후 바이러스 밴드가 분리되었다. 상기 바이러스는 10℃에서 17시간 동안 55000 rpm에서 원심분리되었다. 상기 바이러스 밴드가 분리되고 슈크로스(50% w/v)가 최종 농도 1%로 첨가되었다. 과량의 세슘클로라이드는 CaCl2(0.9mM), MgCl2(0.5mM), 및 증가하는 농도의 슈크로스(1, 2, 5%)으로 추가되는 1.5 ltr PBS에 대한 투석 슬라이드(슬라이드-a-라이저, 10000kDa 절단, Pierce, USA)에서 투석(상온에서 1시간 동안 세번)으로 제거되었다. 투석 후, 바이러스는 바이러스가 -85℃에서 보존되는 25 및 100㎕의 부분에 나뉜 다음 슬라이드-a-라이저로부터 제거된다.
밀리리터당 바이러스 입자의 수를 결정하기 위하여, Shabram 등(1997)에 의하여 개시된 바와 같이 바이러스 배치 50㎕를 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 바이러스는 0 내지 600mM 범위의 NaCl 구배를 사용하여 용출하였다. 표 I에 나타난 바와 같이, NaCl 농도에 의하여 바이러스는 혈청형 중에서 유의적으로 다르게 용출되었다.
대부분의 인간 아데노바이러스는 약간의 예외를 가지고 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940)에 잘 복제되었다. 아데노바이러스 타입 8 및 40은 911-E4 세포(He 등, 1998)에 성장되었다. 정제된 스톡는 5×1010와 5×1012바이러스 입자/㎖(VP/㎖; 표 1 참조) 사이를 함유하였다.
정제된 인간 아데노바이러스 스톡의 역가측정
아데노바이러스는 중화 검사의 길이, 5일 동안 완전한 CPE를 얻기 위하여 필요한 바이러스의 양을 결정하기 위하여 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940) 상에서 역가 측정되었다. 여기에, 100㎕ 배지가 96-웰 플레이트의 각 웰 안으로 분배되었다. 104, 105, 106, 또는 107배로 미리 희석된 아데노바이러스 스톡 25㎕가 96-웰 플레이트의 2번째 컬럼에 첨가되어, 피펫에 의하여 10번 위 아래로 혼합되었다. 그 다음 25㎕를 컬럼 2로부터 컬럼3으로 가져와서 다시 혼합하였다. 이는 컬럼 11까지 반복되었고, 그 후 컬럼 11로부터 25㎕가 제거되었다. 5 단계의 연속적 희석이 사전 희석된 스톡로부터 우선 얻어졌다. 그 다음, 3×104PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940)가 100㎕ 부피로 첨가되었고, 상기 플레이트는 5 내지 6일 동안37℃, 5% CO2에서 배양되었다. CPE는 현미경으로 관찰되었다. Road & Muensch 방법이 세포 배양 억제량 50%(CCID50: cell culture inhibiting dose 50%)를 계산하기 위하여 사용되었다.
MTT 검사(Promega)를 사용하여 분석되는 비슷한 플레이트가 장치되었다. 이 검사에서, 산 세포는 색도계 염료에 의하여 정량화시켰다. 여기에, 20㎕ MTT(PBS 중 7.5 mg/㎖)가 웰에 첨가되고, 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 배양되었다. 상징액이 제거되었고, 20:1 이소프로판올/트리톤-X100 용액 100㎕가 상기 웰에 첨가되었다. 플레이트는 침전된 염료를 안정제시키기 위하여 3-5분 동안 96-웰의 쉐이커 상에 두었다. 흡광도는 540nm 및 690nm(배경)에서 측정되었다. 이 검사에 의하여 진행중인 CPE와 완전한 CPE를 갖는 웰이 구별될 수 있다.
중화 검사
희석된 인간의 혈청 샘플을 갖는 96-웰 플레이트가 37℃, 5% CO2에서 해동되었다. 50㎕ 당 200 CCID50에 희석된 아데노바이러스 스톡이 제조되었고, 50㎕ 부분이 혈청을 갖는 플레이트의 1-11 컬럼에 첨가되었다. 플레이트는 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음, 6×105/㎖에서 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940) 50㎕가 모든 웰에 분배되었고, 37℃, 5% CO2에서 하루 동안 배양되었다. 상징액은 각 열에서 새 피펫 팁을 사용하여 제거되고, 새 배지 200㎕가 혈청의 독성적 효과를 피하기 위하여 모든 웰에 첨가되었다. 플레이트는 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 더 배양되었다. 또한, 비슷한 대조 플레이트는 A열 및 B열에서 시험될 각 혈청형에 특이적이고 토끼에서 구한 희석된 양성 대조 혈청으로, C열 및 D열에는 음성 대조 혈청(FCS)으로, 두 배씩 장치하였다. 또한, E-H열에는 각각 역가가 측정될 각 바이러스의 200 CCID50으로 출발하는 5배 희석 단계로 상기한 바와 같이 실시되었다. 5일 째, 대조 플레이트 중 하나가 현미경으로 그리고 MTT 검사로 분석되었다. 실험적 역가는 현미경적으로 관찰되는 대조 역가측정 플레이트로부터 계산되었다. 만약 CPE가 완성된 것이 발견된다면, 즉 MTT에 의하여 분석된 대조 역가측정 실험에서 제1의 희석이 완전한 세포 사멸을 나타낸다면, 모든 검사 플레이트는 가공 처리되었다. 만약 그렇지 않으면, 검사는 완전한 CPE가 명확해질 때까지 하루 또는 그 이상 동안 진행되고, 그 후 모든 플레이트가 가공처리된다. 대부분의 경우, 검사는 5일 뒤에 종결된다. Ad1, 5, 33, 39, 42, 및 43을 위하여, 검사는 6일 동안 남겨지고, Ad2를 위해서는 8일동안 남겨진다.
혈청 샘플은 가장 높은 혈청 농도에서 최대의 방어가 혈청없는 대조군에 비하여 40%로 나타날 때, 비-중화로 간주된다. 100명의 건강한 지원자로부터 얻은 혈청에 대한 44 원형 아데노바이러스의 분석 결과는 도 1에 나타내었다. 예상된 바와 같이 Ad2 및 Ad5에 대한 중화 항체를 함유한 혈청 샘플의 비율은 매우 높았다. 이는 더 낮은 번호의 아데노바이러스 대부분에서도 진실로 나타난다. 놀랍게도, 혈청 샘플 중 어느 것도 아데노바이러스 혈청형 35에 대한 중화 항체를 함유하지 않았다. 또한, 혈청형 26, 34, 및 48에 대한 중화 항체 역가를 갖는 개체의 수는 매우 낮았다. 따라서, 상기한 다른 혈청형 중 하나 또는 Ad35에 기초한 E1-결실 재조합아데노바이러스는 중화 항체에 의한 바이러스의 제거에 대하여 Ad5에 기초한 재조합 벡터와 비교하여 중요한 장점을 가진다.
또한, 다른 혈청형 중 하나 또는 Ad35의 캡시드 단백질의 상응하는 (부분)에 의하여 교체된 숙주의 면역 반응에 포함되는 캡시드 단백질(의 일부)를 갖는 Ad5-기저 벡터는 인간 혈청의 대부분에 의하여 거의 또는 전혀 중화되지 않을 것이다.
표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 실험에서 각 바이러스를 위하여 얻어진 CCID50 및 ml당 바이러스 입자로부터 계산된 VP/CCID50 비는 매우 다양하고, 로그 0.4 내지 5 범위에 있다. 이는 바이러스의 복제 효율 차이 및 PER.C6 세포(ECACC 기탁번호 96022940)의 다른 감염 효능에 의하여 유발되는 것 같다. 또한, 배치 품질의 차이는 중요한 역할을 할 수 있다. 높은 VP/CCID50 비율은 5일 동안 CPE를 얻기 위하여 웰에 더 많은 바이러스가 넣어졌다는 것을 의미한다. 결과적으로, 중화 연구의 결과는 더 많은 (불활성) 바이러스 입자가 항체에 의하여 가려질 수 있기 때문에 한 쪽으로 치우쳐질 수 있다. 이러한 현상이 일어날 지 아닐지를 체크하기 위하여, VP/CCID50 비율은 검사에서 양성으로 발견된 혈청 샘플의 비율에 대하여 작성되었다(도 2). 그래프는 검사에서의 바이러스 양과 혈청에서의 중화 사이에 어떠한 음성적 관련도 없다는 것을 명백하게 보여준다.
실시예 2
재조합 바이러스의 생성 및 아데노바이러스 유전자의 용이한 조작을 위한 Ad5 플라스미드 벡터의 생성
pBr/Ad.Bam-rITR(ECACC 기탁 P97082122)
ITR 서열의 둔단 말단 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 야생형 아데노바이러스 타입 5(Ad5) DNA가 과량의 dNTPs 존재 하에서 클레노우(Klenow) 효소로 처리되었다. 클레노우 효소의 불활성 및 페놀/클로로포름 추출에 의한 정제, 이어지는 에탄올 침전화 후, 상기 DNA는 BamHI로 소화되었다. 이 DNA 제제를 더 이상의 정제없이 하기와 같이 제조된 pBr322 유래 벡터와의 결찰(ligation) 반응에 사용하였다: pBr322 DNA는 EcoRV 및 BamHI로 소화되고, TSAP 효소(BITC Technologies)로 처리하여 인을 제거하고, LMP 아가로스 겔(SeaPlaque GTG) 상에 정제하였다. 수용성E.coliDH5α(Life Thchn.)로의 형질전환 및 앰피실린 내성 콜로니의 분석 후, Ad5의 BamHI 부위로부터 우측 ITR로 연장된 삽입물을 위하여 예상되는 바와 같은 소화 경향을 나타내는 하나의 클론을 선택하였다.
우측 ITR에서 클로닝 경계(border)의 서열을 분석하여 ITR의 대부분의 3'G 잔부가 결실되었다는 것을 알아내었고, ITR의 나머지가 올바르다는 것이 발견되었다. 상기 결실 G 잔부는 복제 동안 다른 ITR에 의하여 보상된다.
pBr/Ad.Sal-rITR(ECACC 기탁 P97082119)
pBr/Ad.Sal-rITR는 BamHI 및 SalI으로 소화되었다. 아데노바이러스 삽입물을 포함하는 벡터 단편이 LMP 아가로스(SeaPlaque GTG)에서 분리되고, Ad5 DNA로부터 얻은 SalI-BamHI 단편에 결찰시키고, Geneclean II 키트(Bio 101, Inc.)로 정제하였다. 하나의 클론이 선택되어 Ad5 서열의 통합성이 제한 효소 분석에 의하여 결정되었다. 클론 pBr/Ad.Sal-rITR은 bp 16746 이하에서 SalI 부위로부터 아데노 타입 5 서열을 함유하고, rITR(대부분의 3'G 잔부가 결실된)을 포함한다.
pBr/Ad.Cla-Bam(ECACC 기탁 P97082117)
wt 아데노 타입 5 DNA는 ClaI 및 BamHI으로 소화되고, 20.6 kb 단편이 전기 용출법에 의하여 겔로부터 분리되었다. pBr322는 같은 효소로 소화되고, Geneclean에 의하여 아가로스 겔로부터 정제되었다. 양 단편이 결찰되고, 수용성 DH5α로 형질전환되었다. 생성된 클론 pBr/Ad.Cla-Bam은 제한효소 소화에 의하여 분석되었고 bp 919부터 bp 21566까지 아데노바이러스 서열을 갖는 삽입물을 함유하는 것으로 나타났다.
pBr/Ad.AflII-Bam(ECACC 기탁 P97082114)
클론 pBr/Ad.Cla-Bam이 EcoRI(pBr322 중)와 함께 결찰되고, AflII로 부분적으로 소화되었다. 65℃에서 20초 동안 AflII를 열처리 불활성화시킨 후, 단편의 단부는 클레노우 효소로 채워졌다. 그 다음, DNA는 PacI 부위 (5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3')를 함유하는 둔단 이중 가닥화된 올리고 링커에 결찰시켰다. 이 링커는 하기의 두 올리고뉴클레오타이드를 어닐링(anneal)시킨 다음 클레노우 효소로 둔단시킴으로서 제조되었다: 5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' 및 5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3'. 완충제를 변화시키기 위하여 결찰된 DNA를 침전시킨 후, 결찰은 올리고의 콘카타미어(concatameres)를 제거하기 위하여 과량의 PacI 효소로 소화되었다. bp 3534부터 bp 21566까지 Ad5 서열을 함유하는 22016 bp의 부분 단편 및 벡터 서열이 LMP 아가로스(SeaPlaque GTG)에서 분리되고, 재결찰되어 수용성 DH5α로 형질전환되었다. PacI 부위를 함유한 것으로 발견되고 큰 아데노 단편을 가진 하나의 클론이 선택되어 (결실된) AflII 부위에 PacI 링커의 바른 삽입을 입증하기 위하여 5' 단부에서 서열화되었다.
pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 (ECACC 기탁 P97082120) 및 pBr/Ad.Bam-rITRpac#8 (ECACC 기탁 P97082121)
클론 pBr/Ad.Bam-rITR에서 Ad5의 ITR 근처에 PacI 부위를 삽입시키기 위하여, 약 190 뉴클레오티드를 pBr322 골격의 ClaI 부위와 ITR 서열 서두 사이에서 제거하였다. 이는 다음과 같이 실시되었다: pBr/Ad.Bam-rITR을 ClaI으로 소화시키고, 뉴클레아제 Bal31로 여러 시간(2', 5'. 10'. 및 15') 동안 처리하였다. 뉴클레오티드 제거를 연장시킨 뒤, 동일한 완충제와 조건을 사용하는, pBr322 DNA 상에서 별도로 반응시켰다(ClaI 부위에서 소화시키기도 함). Bal31 효소는 75℃에서 10초간 배양되어 불활성화되었고, DNA는 침전되어 더 작은 부피 TE 완충액에 재현탁되었다. 둔단 단부를 확인하기 위하여, DNA는 과량의 dNTPs 존재 하에서 T4 DNA 폴리머라제로 더 처리되었다. (대조구) pBr322 DNA를 SalI로 소화시킨 후, 10' 또는 15' 동안 처리된 샘플에서 만족스러운 분해(~150 bp)가 관찰되었다. 그 다음, 10' 또는 15' 처리된 pBr/Ad.Bam-rITR 샘플은 상기한 둔단 PacI 링커에 결찰되었다 (pBr/Ad.AflII-Bam 참조). 결찰은 침전화에 의하여 정제되었고, 과량의 PacI으로 소화되고, LMP 아가로스 겔 상 링커로부터 분리되었다. 재결찰 후, DNA는 수용성 DH5α로 형질전환되고, 콜로니는 분석되었다. 대략 원하는 길이의 결실을 보이는 10개의 클론이 선택되었고, 이들이 T-트랙 서열화기(T7 서열화 키트, Pharmacia, Biotech)에 의하여 더 분석되었다. 2개의 클론은 rITR의 하류에 삽입된 PacI 링커와 함께 발견되었다. PacI으로 소화 후, 클론 #2는 ITR에 부착된 28 bp를 가지고,클론 #8은 27 bp를 가진다.
pWE/Ad.AflII-rITR(ECACC 기탁 P97082116)
코스미드 벡터 pWE15(Clonetech)는 더 큰 Ad5 삽입물에 클론되도록 사용되었다. 먼저, 단일한 PacI 부위를 함유하는 링커는 pWE.pac를 생성하는 pWE15의 EcoRI 부위에 삽입되었다. 이의 말단에, pBr/Ad.AflII-BamHI가 그의 EcoRI 돌출 단부와 함께 사용되었다. 그 다음, 생겨난 단편은 아가로스 겔로부터 전기적 용출법으로 분리되었다: pWE.pac가 PacI로 소화되었고, pBr/AflII-Bam가 PacI 및 BamHI로 소화되었고, pBr/Ad.Bam-rITR#2가 BamHI 및 PacI로 소화되었다. 이들 단편은 함께 결찰되고, 제조자의 지시에 따라 λ파지 팩키징 추출물(Stratagene)을 이용하여 팩키징되었다. 숙주 박테리아로 감염시킨 후, 콜로니는 플레이트 상에서 성장되고, 완전한 삽입체 존재를 위하여 분석되었다. pWE/Ad.AflII-rITR은 3534 bp 이하(AflII 부위)의 모든 아데노바이러스 타입 5를 함유하고, rITR(대부분의 3'G 잔부가 결실된)을 포함한다.
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) (ECACC 기탁 P97082115)
아데노 5 wt DNA를 과량의 dNTPs 존재하에서 클레노우 효소로 처리하고, 이어서 SalI으로 소화시켰다. 생성된 단편 중 둘은, 좌측 ITR-Sal(9.4) 및 Sal(16.7)-우측 ITR로 지정되어, 각각 LMP 아가로스(SeaPlaque GTG)에서 분리되었다. pBr322 DNA는 EcoRV 및 SalI로 소화되고, 포스파타제로 처리되었다(Life Technologies). 벡터 단편은 Geneclean 방법(Bio 101, Inc.)으로 분리되어, Ad5 SalI 단편에 결찰되었다. 9.4kb 단편을 갖는 결찰이 콜로니에 삽입체를 주었다. 클로닝 경계의 분석 및 서열화 후, 완전한 ITR 서열을 함유하고, bp 9462에서 SalI 부위로 연장된 클론이 선택되었다.
pBr/Ad.lITR-Sal(16.7) (ECACC 기탁 P97082118)
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4)이 SalI로 소화되고 인이 제거되었다(TSAP, Life Technologies). Ad5의 제3 SalI 부위까지 이 클론을 연장시키기 위하여, pBr/Ad.Cla-Bam은 BamHI로 선형화되고, SalI으로 부분적으로 소화되었다. 9462-16746로부터 아데노바이러스 서열을 함유하는 7.3kb SalI 단편이 LMP 아가로스 겔에서 분리되었고, SalI-소화된 pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) 벡터 단편에 결찰되었다.
pWE/Ad.AflII-EcoRI
pWE.pac을 ClaI로 소화시키고, 5' 돌출 단부를 클레노우 효소로 채웠다. DNA는 PacI로 소화시키고, 아가로스 겔로부터 분리하였다. pWE/AflII-rITR은 EcoRI로 소화시키고, 클레노우 효소로 처리한 후 PacI로 소화시켰다. 아데노바이러스 서열을 함유하는 24kb 큰 단편이 아가로스 겔로부터 분리되어, Clontech 사의 Ligation Expresstm키트를 사용하여 ClaI-소화되고 둔단된 pWE.pac 벡터에 결찰되었다. 스트라타진(Stratagene)으로부터 초수용성 XL10-Gold 세포의 형질 전환 후, 원하는 삽입체를 함유하는 클론이 동정되었다. pWE/AflII-EcoRI는 bp 3534-27336 Ad5 서열을 함유한다.
pWE/Ad.AflII-rITRsp 생성
벡터 pWE/Ad.AflII-rITR의 3' ITR은 말단 G-뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 또한, PacI 부위는 우측 ITR로부터 거의 30bp 떨어진 위치에 있다. 이들 특성 모두는 3' ITR에서 복제의 불충분한 개시때문에 바이러스 생성 효율을 감소시킬 수 있다. 바이러스 생성 동안, 어댑터 플라스미드에서 좌측 ITR은 손상되지 않고, 동종 재조합 후 바이러스 DNA의 복제를 가능하게 한다.
3'ITR에서의 복제 개시 효율을 향상시키기 위하여, pWE/Ad.AflII-rITR은 하기한 바와 같이 변형된다: pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 구조체은 먼저 PacI으로 소화되고, 그 다음 부분적으로 AvrII로 소화되고, 17.8 kb 벡터 함유 단편이 분리되어, SAP 효소를 사용하여 인을 제거하였다(Boehringer Mannheim). 이 단편은 뉴클레오티드 35464로부터 3'ITR까지 아데노서열이 부족하다. 주형으로 pWE/Ad.AflII-rITR로부터의 DNA 및 프라이머로서 ITR-EPH:
5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' 및
Ad101: 5'-TGA TTC ACA TCG GTC AGT GC-3'
를 사용하여, 630 bp PCR 단편이 상응하는 3' Ad5 서열을 제조하였다. 이 PCR 단편은 벡터 PCR2.1(인비트로젠)에 클론되고, PCR 단편을 함유한 클론이 분리되고 DNA의 정확한 증폭을 점검하기 위하여 서열화되었다. PCR 클론은 pacI/부분적 AvrII 소화된 pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 단편 생성 pBr/Ad.Bam-rITRsp로 결찰되었다. 그 다음 이 구조체은 아데노서열 3534 내지 35938에 상응하는 삽입물을 갖는 코스미드 클론(상기한 바처럼)을 제조하기 위하여 사용되었다. 이 클론은 pWE/AflII-rITRsp로 명명되었다.
pWE/Ad.AflII-rITRΔE2A 생성
pWE/Ad.AflII-rITR(ECACC 기탁 P97082116)로부터 E2A 코딩 서열의 결실은 다음과 같이 실시되었다.
좌측과 우측에서 E2A 코딩영역을 측면에 둔 아데노바이러스 서열은 제조자의 지시에 따라 Expand PCR 시스템(Boehringer)으로 PCR 반응에서 플라스미드 pBr/Ad.Sal.rITR(ECACC 기탁 P97082119)로부터 조작되었다. 아래 프라이머가 사용되었다: 우측 측면 서열(Ad5 뉴클레오티드 24033 내지 25180에 해당됨):
ΔE2A.SnaBI: 5'-GGC GTA CGT AGC CCT GTC GAA AG-3'
ΔE2A.DBP-출발: 5'-CCAATG CATTCG AAG TAC TTC CTT CTC CTA TAG GC-3'
증폭된 DNA 단편은 SnaBI 및 NsiI로 소화된다(NsiI 부위는 프라이머 ΔE2A.DBP-출발의 줄친 부분에 생긴다).
좌측면 서열(Ad5 뉴클레오티드 21557 내지 22442에 해당됨):
ΔE2A.DBP-종결: 5'-CCAATG CATACG GCG CAG ACG G-3'
ΔE2A.BamHI: 5'-GAG GTG GAT CCC ATG GAC GAG-3'
증폭된 DNA는 BamHI 및 NsiI로 소화된다(NsiI 부위는 프라이머 ΔE2A.DBP-종결의 줄친 부분에 생긴다).
이어서, 소화된 DNA 단편은 SnaBI/BamHI 소화된 pBr/Ad.Sal-rITR로 결찰되었다. 서열화로 플라스미드 pBr/Ad.Sal-r-ITRΔE2A에서 단일한 NsiI 부위를 갖는 DBP 코딩 영역의 정확한 교체를 확인하였다. 단일한 NsiI 부위는 재조합 벡터에 의하여 형질도입될 유전자를 위하여 발현 카세트를 도입하는데 사용될 수 있다.
E2A 코딩 서열의 결실은 상부 가닥에서 24048 부위에 L4 유전자를 코드하는100K의 스플라이스 어셉터 부위가 원형 그대로 남을 정도로 실시되었다. 또한, E2A 코드 서열의 왼손 부위에서 원래의 L3-RNAs 및 E2A-RNA의 폴리 아데닐화 신호는 원형대로 남아 있었다. 이는 아데노바이러스의 생존동안 100K L4-단백질을 코드하는 유전자 및 L3-유전자의 바른 표현을 보장하는 것이다.
다음, 플라스미드 pWE/Ad.AflII-rITRΔE2A가 생성되었다. 플라스미드 pBr/Ad.Sal-rITRΔE2A가 BamHI 및 SpeI로 소화되었다. E2A 코드 영역이 단일한 NsiI 부위에 의하여 치환된 3.9-Kb 단편이 분리되었다. pWE/Ad.AflII-rITR가 BamHI 및 SpeI로 소화되었다. 35Kb DNA 단편으로부터 E2A 코드 서열을 함유하는 BamHI/SpeI 단편이 제거되어 상기 단편이 분리되었다. 단편은 제조자의 지시(Stratagene)에 따라 λ파지-팩키징 추출물을 사용하여 결찰되고 팩키징되어져서, 플라스미드 pWE/Ad.AflII-rITRΔE2A를 제공하였다.
이 코스미드 클론은 기능적 E2A 유전자 생성물을 발현하는 팩키징 세포 상으로 소화된 수용체 플라스미드와 함께 PacI 소화된 DNA의 동시 감염에 의하여 E2A가 결실된 아데노바이러스 벡터를 형성하는 데 사용될 수 있다.
어댑터 플라스미드의 제조
팩키징 세포의 재조합 아데노바이러스 및 E1 서열 간의 서열 겹침이 없는 것은 새로운 재조합 바이러스의 안전하고, RCA-없는 생성 및 증식에 필수적이다. 어댑터 플라스미드 pMLPI.TK(PCT/NL96/00244에 개시됨)는 본 발명의 향상된 팩키징 세포주과 결합한 본 발명에 따른 용도를 위하여 구성된 어댑터 플라스미드의 예이다. 이 플라스미드는 출발물질로서 새로운 벡터를 만들기 위하여 사용되고, 여기서특이 프로모터와 유전자 서열로 이루어지는 핵산 분자는 쉽게 교체될 수 있다.
우선, PCR 단편이 하기 프라이머를 갖는 pZipΔMo+PyF101(N-) 주형 DNA (PCT/NL96/00195에 개시됨)로부터 형성되었다: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' 및 LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. DNA 폴리머라제(Boehringer Mannheim)는 하기 온도 사이클로 제조자의 지시에 따라 사용되었다: 95℃에서 5', 55℃에서 3', 그리고, 72℃에서 1'로 한 사이클, 95℃에서 1', 60℃에서 1', 72℃에서 1'로 30 사이클, 이어서 72℃에서 10' 한번. PCR 제품은 BamHI로 소화시키고, PvuII 및 BamHI로 소화된 pMLP10(Levrero 등, 1991) 벡터로 결찰시킴으로써 벡터 pLTR10을 형성하였다. 이 벡터는 돌연변이 폴리오마 바이러스(PyF101)로부터 인핸서에 의하여 교체된 야생형 인핸서를 갖는 Mo-MuLV LTR의 일부로 이루어진 프로모터로 이어지는 bp 1 내지 bp 454의 아데노바이러스 서열을 함유한다. 포로모터 단편은 L420으로 지정되었다. 다음은 쥐과의 HSA 유전자의 코드 영역이 삽입되었다. pLTR10은 BstBI으로 소화된 다음 클레노우 효소 처리되고, NcoI로 소화되었다. HSA 유전자는 하기의 프라이머를 사용하여 pUC18-HSA(Kay 등, 1990) 상에서의 PCR 증폭에 의하여 얻어졌다: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' 및 HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. 269 bp 증폭된 단편은 NcoI 및 BglII 부위를 사용하는 셔틀 벡터에 서브클론되었다. 서열화는 HSA 우전자의 바른 코드 서열의 삽입을 확인시켜주었지만, 여분의 TAG 삽입이 바로 TAG 종결 코돈으로 이어진다는 것을 나타내었다. 그 다음 TAG 복제를 포함하는 HSA 코딩 영역은 NcoI(점착성)-SalI(둔단) 단편으로 잘려서, pLTR10으로부터 3.5kb NcoI(점착성)/BstBI(둔단) 단편으로 클로닝되어, pLTR-HSA10을 생성한다.
마지막으로, 좌측 ITR, 팩키징 신호, L420 프로모터, 및 HSA 유전자를 함유한 단편은 벡터 pMLPI 안으로 삽입된 후 pLTR-HSA10은 EcoRI 및 BamHI로 소화된다. 같은 효소에 의하여 TK는 소화되고, 이로 인하여 프로모터와 유전자 서열이 교체된다. 이로 인하여 프로모터와 유전자 서열 주위의 다양한 제한 효소를 위한 용이한 인식 부위를 함유하는 새 어댑터 플라스미드 pAd/L420-HSA가 생성된다. SnaBI 및 AvrII는 프로모터 서열을 바꿀 수 있는 HpaI, NheI, KpnI, HindIII와 결합될 수 있고, 반면, 뒷부분은 이 구조체의 유전자를 대체하는 HSA 코딩영역으로부터 ClaI 또는 BamHI 부위 3'과 결합될 수 있다.
핵산 분자의 쉬운 교체가 가능하도록 구성되는 다른 어댑터 플라스미드는 pAd/L420-HSA 중의 유전자 및 폴리 A 서열, 프로모터를 CMV 프로모터와 교체함으로써 제조된다. 이 목적을 위하여, pAd/L420-HSA는 AvrII 및 BglII로 소화된 다음 둔단 단부를 얻기 위하여 클레노우로 처리되었다. pBr322 벡터와 아데노바이러스 서열을 갖는 5.1kb 단편이 분리되어, HhaI 및 AvrII로 소화시켜 얻은 pcDNA1/amp(인비트로겐)으로부터 나온 둔단 1570bp 단편에 결찰된 다음, T4 DNA 폴리머라제로 처리되었다. 이 어댑터 플라스미드는 pAd5/CLIP으로 명명되었다. pAd5/CLIP에서 좌측 ITR로부터의 벡터 서열을 제거할 수 있기 위하여, 이 플라스미드는 부분적으로EcoRI로 소화되고, 선형 단편이 분리되었다. 5'-TTAAGTCGAC-3' 서열의 올리고는 그 자체에 결합되어 SalI 부위 및 EcoRI 돌출부와 링커를 만든다. 링커는 부분적으로소화된 pAd5/CLIP 벡터에 결찰되고, pAd5/CLIP에서 좌측 아데노바이러스 ITR의 상류 EcoRI 부위 23bp에 삽입된 링커를 가짐으로써 pAd5/Clipsal이 되는 클론이 선택된다. 마찬가지로, pAd5/CLIP 중의 EcoRI 부위는 5'-AATTGTCTTAACCGCAATT-3' 서열을 갖는 링커의 삽입에 의하여 PacI 부위로 변화되었다. pAd5/CLIP 벡터는 EcoRI로 부분적으로 소화되고, 인 제거되어, EcoRI 돌출부와 함께 PacI 링커에 결찰된다. 결찰 혼합물은 콘카테머(concatemer)를 제거하기 위하여 PacI로 소화되고, 아가로스 겔로부터 분리되어 재결찰되었다. 생성된 벡터는 pAd5/Clippac으로 명명되었다. 이들 변화는 플라스미드 벡터 서열로부터 좌측 ITR을 분리하기 위하여 더 큰 유연성을 부여시켰다. 벡터 pAd5/L420-HSA는 좌측 ITR의 상류 SalI 또는 PacI 부위를 생성하기 위하여 변형될 수도 있다. 이에 관하여, pAd5/L420-HSA는 EcoRI로 소화되고, 상기한 PacI 링커에 결찰되었다. 결찰 혼합물은 PacI로 소화되고, 콘카테머된 링커를 제거하기 위하여 아가로스 겔로부터 선형 DNA를 분리시킨 후 결찰되었다. 이로 인하여 어댑터 플라스미드 pAd5/L420-HSApac이 생성되었다. 이 구조체는 다음과 같이 pAd5/L420-HSAsal을 제조하기 위하여 사용되었다: pAd5/L420-HSApac은 ScaI 및 BsrGI로 소화되었고, 벡터 단편은 동일 효소로 pAd/Clipsal를 소화시킨 후 분리된 0.3 kb 단편에 결찰되었다.
어댑터 플라스미드 pAdMire 및 pAdApt의 생성
폴리링커 서열만을 보유하고 프로모터 또는 폴리A 서열을 포함하지 않는 어댑터 플라스미드를 생성하기 위해서, pAd5/L420-HSApac를 AvrII 및 BglII로 소화시켰다. 벡터 단편을 동일한 제한 효소로 소화시킨 링커 올리고뉴클레오티드에 결찰시켰다. 다음의 서열의 올리고를 어닐링하여 링커를 제조하였다:
PLL-1: 5'-GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACC GGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GAT CTG G-3' 및
PLL-2: 5'-CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATC CGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAG GGA TGG C-3'.
어닐링된 링커들을 AvrII 및 BGlII로 소화시키고, 제조자 지시에 따라 컬럼 정제(Qiaquick 뉴클레오티드 제거 키트)에 의해 소형 말단으로부터 분리하였다. 그리고 나서 링커를 AvrII/BglII 소화된 pAd5/L420-HSApac 단편에 결찰하였다. 혼입된 링커를 갖는 AdMire로 명명된 클론을 선택하고 삽입물의 온전성을 점검하기 위해서 서열화하였다. 어댑터 플라스미드 AdMire는 수용성 발현 카세트의 용이한 삽입을 가능하게 한다.
인간 세포에서 고 발현 수준을 중개하는 인간 CMV 프로모터를 함유하는 어댑터 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다: pAd5/L420-HSApac를 AvrII로 소화하고, 5' 돌출 말단을 클레노우 효소를 사용하여 충전하였다. HindIII로의 두번째 소화는 L420 프로모터 서열의 제거를 야기하였다. 벡터 단편을 분리하고 CMV 프로모터 서열을 함유하는 PCR 단편에 결찰하였다. 다음의 프라이머로 pCMVLacI(Stratagene)로부터 CMV 서열의 증폭후에 이 PCR 단편을 얻었다:
CMVplus: 5'-GATCGGTACCACTGCAGTGGTCAATATTGGCCATTAGCC-3' 및
CMVminA: 5'-GATCAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGC-3'.
PCR 단편을 PstI(CMVplus에서 밑줄 친)로 소화한 후에, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 3'-돌출 단부를 제거하였다. 그리고 나서, DNA를 HindIII(CMVminA에서 밑줄 친)로 소화하고, AvrII 및 HindIII로 소화된 상기 pAd5/L420-HSApac 벡터 단편으로 결찰하였다. 생성되는 플라스미드를 pAd5/CMV-HSApac로 명명하였다. 그리고 나서, 이 플라스미드를 HindIII 및 BamHI로 소화하고, 벡터 단편을 분리하고 그리고 HindIII 및 BglII로 AdMire를 소화시킨 후 얻어진 폴리링커 서열에 결찰하였다. 생성되는 플라스미드를 pAdApt로 명명하였다. 어댑터 플라스미드 pAdApt는 인간 CMV 프로모터의 뉴클레오티드-735에서 +95를 함유한다(Boshart et al., 1985). 좌측 ITR의 상류에 PacI 부위를 대신한 SalI 부위를 함유하는 이 어댑터 플라스미드의 두번째 형태는, ScaI로 소화되고 BsrGI로 부분적으로 소화된 pAdApt 내에 pAd5/Clipsal에서 유래한 0.7kb ScaI-BsrGI 단편을 삽입하여 제조되었다. 이 클론을 pAdApt.sal로 명명하였다.
Ad5에 기초한 재조합 아데노바이러스의 생성
상기한 어댑터 플라스미드 및 pWe/Ad.AflII-rITR 또는 pWE/Ad.AflII-rITrsp 구조체을 사용하여 RCA가 없는 재조합 아데노바이러스를 매우 효율적으로 생성할 수 있다. 일반적으로, 요구되는 발현 카세트내의 요구되는 트랜스-유전자 (transgene)를 함유하는 어댑터 플라스미드를 3' 및/또는 5' 말단에서 벡터 서열로부터 삽입물을 유리시키는 적합한 효소로 소화한다. 아데노바이러스성 보충적 플라스미드 pWE/Ad.AflII-rITR 또는 pWE/Ad.AflII-rITRsp를 벡터 플라스미드로부터 아데노 서열을 유리시키는 PacI로 소화하였다. 비-제한적인 예로서 AdApt-LacZ의 생성이 기재된다. 어댑터 플라스미드 pAdApt-LacZ를 다음과 같이 생성하였다. E.coli LacZ 유전자를 다음의 프라이머가 있는 플라스미드 pMLP.nlsLacZ(EP95-202 213)로부터 PCR에 의해 증폭하였다: 5'-GGGGTGGCCAGGGTACCTCTAGGCTTTT GCAA-3' 및 5'-GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC-3'. 다음의 증폭 프로그램에서 공급자 지시에 따라 Ex Taq(Takara)로 PCR 반응을 수행하였다: 5분 94℃, 1사이클; 45초 94℃ 및 30초 60℃ 및 2분 72℃, 5 사이클; 45초 94℃ 및 30초 65℃ 및 2분 72℃, 25사이클; 10분 72; 45초 94℃ 및 30초 60℃ 및 2분 72℃, 5사이클, 1사이클. 그리고 나서, PCR 생성물을 KpnI 및 BamHI로 소화하고, 소화된 DNA 단편을 KpnI/BamHI 소화된 pcDNA3 (Invitrogen) 내로 결찰하여 pcDNA3.nlsLacZ를 생성하였다. 그리고 나서 구조체 pcDNA3.nlsLacZ를 KpnI 및 BamHI로 소화하고, 진클린 스핀(geneclean spin) 키트(Bio 101, Inc.)를 사용하여 겔에서 3kb LacZ 단편을 분리하였다. pAdApt를 KpnI 및 BamHI로 또한 소화하고, 선형 벡터를 상기한 바와 같이 겔에서 분리하였다. 두 분리된 단편들을 결찰하고, LacZ 삽입물을 함유한 한 클론을 선택하였다. 구조체 pAdApt-LacZ를 SalI로 소화하고, 진클린 스핀 키트로 정제하고 나서, PacI로 소화하였다. pWE/Ad.AflII-rITRsp를 PacI로 소화하였다. 효소를 비활성화 하기 위해서 두 소화 혼합물을 65℃로 30'에 대해 처리하였다. 농도를 측정하기 위해서 샘플들을 겔상에 위치시켰다. 2.5x106PER.C6 세포들(ECACC 기탁 번호 96022940)을 10% FBS 및 10mM MgCl이 있는 DMEM내의 T25 플라스크에 접종하였다. 다음날, 제조자 지침에 따라 리포펙타민(lifofectamine) 트랜스펙션 시약(Life Technologies Inc.)을 사용하여 각 플라스미드의 4㎍을 PER.C6 세포(ECACC deposit 번호 96022940)로 트랜스펙션시켰다. 다음날, 배지를 신선한 배양 배지로 교환하고, 세포를 다시 37℃, 10% CO2에서 배양하였다. 다시 24시간 후에, 세포들을 트립신화하고, T80 플라스크에 접종하고, 37℃, 10% CO2에서 배양하였다. T80 플라스크에 접종 6일 후에 완전한 CPE를 얻었다. 세포들을 배지에서 수확하고, 1회 냉동/해동 사이클하였다. 이 방식으로 얻어진 미가공 용해물을 바이러스 혼합물을 플라크 정제하는데 사용하였다. 10개의 플라크를 선택하고, 24 웰 플레이트에서 확장시키고, A459 세포의 감염 후에 LacZ 발현에 대해 시험하였다. 10개의 모든 플라크에서 유래한 바이러스는 LacZ를 발현하였다.
실시예 3
키메라 재조합 아데노바이러스의 생성
헥손 키메라 Ad5-기초 아데노바이러스의 생성
인간 혈청중의 중화항체들은 주로 헥손 단백질에 향하고 펜톤 단백질로의 더 짧은 연장에 향해진다. 여러 혈청형의 헥손 단백질들은 바이러스 외부에 노출된다고 예상되는 루프내에 존재하는 매우 가변적인 영역을 나타낸다(Athappilly et al., 1994; J. Mol. Biol. 242, 430-455). 대부분 형태의 특이 항원결정기는 이와 같은 고도로 가변적인 영역들에 배치되어 있다(Toogood et al., 1989; J. Gen Virol. 70, 3203-3214). 그러므로 헥손 서열(의 일부)를 다른 혈청형의 대응 서열로 치환하는 것은 Ad5에 대한 (기존의) 중화항체를 회피하는 효과적인 전략이다. 아데노바이러스 혈청형 5의 헥손 코드화 서열은 뉴클레오티드 18841 및 21697 사이에 위치한다. 선택적인 아데노바이러스 혈청형으로부터 아데노바이러스 혈청형 5 골격으로의 헥손 코드화 서열의 용이한 교환을 촉진하기위해, 우선 셔틀 벡터가 생성된다. pBr/Ad.Eco-PmeI를 코드화하는 이 서브클론은 우선 플라스미드 pBr322를 EciRI 및 EcoRV로 소화시키고 pWE/Ad.AflⅡ-Eco로부터 14kb PmeⅠ-EcoR를 삽입하여 생성된다. 이 셔틀 벡터에서, 1430 bpSanDI 단편을 pBr/Ad.Eco-PmeⅠ△SanDI를 제공하기 위해 SanDI로 소화시키고 재결찰하여 결실하였다. 제거된 단편은 독특한 SpeI와 MunI 부위를 포함한다. pBr/Ad.Eco-PmeI△SanDI로부터 헥손을 코드화하는 아데노바이러스 혈청형 5 DNA를 제거하였다. 여기까지, 헥손 플래킹 서열들은 PCR 증폭되고 함께 결찰됨에 의해 헥손 코드화 영역을 대치하는 독특한 제한부위를 생성한다. 이들 PCR 반응에 대해 4개의 다른 올리고뉴클레오티드들이 요구되었다: △hex1~ △hex4.
△hex1: 5'-CCT GGT GCT GCC AAC AGC-3'
△hex2: 5'-CCG GAT CC A CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3'
△hex3: 5'-CCG GAT C C A ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA AC-3'
△hex4: 5'-GAG AAG GGC ATG GAG GCT G-3'
올리고뉴클레오티드 △hex1과 △hex2를 사용하여 얻은 ±1100 bp의 증폭된 DAN 생성물을 BamHI와 FseI로 소화시켰다. 올리고뉴클레오티드 △hex3과 △hex4를 사용하여 얻은 ±1600 bp의 증폭된 DAN 생성물을 BamHI와 SbfI로 소화시켰다. 이들소화된 PCR 단편들을 순차적으로 아가로스 겔로부터 정제하고 그리고 T4 리가제 효소를 사용한 3-부분에서 FseI와 SbfI로 소화된 pBr/Ad.Eco-PmeI △SanDI에 결찰시켰다. 생성된 구조체는 코드화된 pBr/Ad.Eco-Pme△Hexon였다. 이 구조체는 정확한 뉴클레오티드 서열을 독특한 제한 부위 MunI 및 SpeI의 존재를 확인하기 위해 부분적으로 서열화된다.
pBr/Ad.Eco-Pme△Hexon은 각각 헥손 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 독특한 제한 부위 MunI 및 SepI를 도입하는 프라이머를 이용하여 상이한 혈청형으로부터 바이러스 DNA에서 증폭된 이종성 헥손 서열을 도입하기 위한 셔틀 벡터로 작용한다. 건강한 개인들의, NAB의 역가가 없거나 또는 매우 낮은 혈청형으로부터 헥손 서열을 포함하는 Ad5 기초 벡터들을 생성하기 위해, Ad35, Ad34, Ad26 및 Ad48의 헥손 서열을 다음의 프라이머들을 사용하여 증폭하였다:
Hex-up2: 5'-GACTAGTCAAGATGGCYACCCCHTCGATGATG-3' 및
Hex-do2: 5'-GCTGGCCAATTGTTATGTKGTKGCGTTRCOGGC-3'.
이들 프라이머들은 간행된 헥손 코팅영역의 서열을 사용하여 고안하였다(예를 들면, Ad2, Ad3, Ad5, Ad7, Ad16, Ad40 및 Ad41의 헥손 서열은 Genbank로부터 얻을 수 있다). 변성된(degenerated) 뉴클레오티드는 혈청형들간의 변형이 나타난 위치에 혼입되었다.
PCR 산물을 SpeI 와 MunI로 소화시키고 동일한 효소로 소화된 pBR/Ad.Eco-Pme△Hexon 구조체로 클론하였다.
변형된 헥손 서열들은, XX가 헥손 서열을 증폭하기 위해 사용된 혈청형을 의미할 때, pWE/AD.AflII-rITRHexXX를 생성하는 AscI 단편의 교환에 의해 구조체 pWE/AD.AflII-rITRHexXX에 순차적으로 도입되었다. 그 다음, pWE/Ad.AflII-rITRHexXX 구조체를 Ad5 재조합 바이러스들에 대해, 상기와 동일한 방법으로 바이러스를 제조하기 위해 사용하였다.
펜톤 키메라 Ad5-기초 재조합 바이러스의 생성
아데노바이러스 타입 5 펜톤 유전자는 서열 14156과 15869 사이에 위치한다. 펜톤 염기는 표적 세포로 바이러스의 내부이행(internalisation)을 조정하는 아데노바이러스 캡시드 단백질이다. 적어도 몇몇의 혈청형(C와 B형)들은 세포 표면위의 인테그린(integrin)과 펜톤중의 RGD 서열의 상호작용에 의해 이것을 달성하는 것으로 보인다. 그러나, F형 아데노바이러스는 RGD 서열을 갖지 않으며 A 및 D 그룹의 대부분의 바이러스의 경우는 펜톤 서열이 알려져 있지 않다. 그러므로, 펜톤은 표적 세포 특이성에 관련되지 않는다. 더우기, 캡시드 단백질로서, 펜톤 단백질은 아데노바이러스의 면역유전성과 관련된다.(Gahery-Segardet al., 1998). 그러므로, 헥손 서열의 대치 이외에, Ad5 펜톤 서열을 혈청형으로부터 역가가 없거나 낮은 NAB가 존재하는 펜톤 서열로 대치하는 것은, 헥손 단독의 대체보다 더 효과적으로 아데노바이러스성 벡터의 클리어런스(clearence)를 방지할 것이다. 펜톤 서열의 대치는 또한 감염 특이성에 영향을 미칠 수 있다.
Ad5에 이종성 단백질 서열의 도입을 가능하도록 하기 위해, 본 발명자들은 상기의 플라스미드-기초 시스템(계)을 사용하였다. 우선, 구조체 pWE/Ad.AflII-EcoRI의 7.2 kb NheI-EcoRV 단편을 동일 효소로 소화된 pBr322에 삽입시켜 펜톤 서열의 셔틀 벡터를 제조하였다. 생성된 벡터를 pBr/XN으로 명명하였다. 이것으로부터 플라스미드 Ad5 펜톤 서열을 삭제하고, 다른 혈청형으로부터 새로운 펜톤 서열을 도입하는데 사용되는 독특한 제한 부위로 치환하였다. pBr/XN 중의 펜톤의 좌측 서열을 다음의 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭시켰다:
DP5-F:5'-CTG TTG CTG CTG CTA ATA GC-3' 및
DP5-R:5'-CGCGGA TCC TGT ACAACT AAG GGG AAT ACA AG-3'
DP5-R은 우측 서열에 결찰시키기 위한 BamHI 부위(밑줄부분)을 가지며 또한 앞의 Ad5 펜톤 영역의 5'말단에 독특한 BsrGI 부위(굵은체)를 도입한다.
우측 서열은 다음을 이용하여 증폭되었다:
DP3-F: 5'-CGCGGA TCC CTT AAGGCA AGC ATG TCC ATC CTT-3' 및
DP3-3R: 5'-AAA ACA CGT TTT ACG CGT CGA CCT TTC-3'
DP3-F는 좌측 서열에 결찰시키기 위한 BamHI 부위(밑줄부분)을 가지며 또한 앞의 Ad5 펜톤 영역의 3'말단에 독특한 AflII 부위(굵은체)를 도입한다.
생성된 두개의 PCR 단편들을 BamHI로 소화시키고 함께 결찰시켰다. 그 후, 이 결찰 혼합물을 AvrII 및 BglII로 소화시켰다. 또한, pBr/XN을 AvrII와 BglII로 소화시켰고 벡터 단편을 소화 결찰된 PCR 단편들로 결찰시켰다. 생성된 클론을 pBr/Ad. △penton으로 명명하였다. Ad35, Ad34, Ad26 및 Ad48로부터 펜톤 클로닝 서열들을 PCR 증폭시켜 5' 및 3' 말단이 각각 BsrGI 및 AflII 부위를 포함하도록 하였다. 여기서 다음의 프라이머들이 사용되었다:
Ad34 및 Ad35의 경우:
P3-for: 5'-GCT CGA TGT ACA ATG AGG ATA CGA GCC GTG CTA-3'
P3-rev: 5'-GCTCCGA CTT AAG TTA GAA AGT GCG GCT TGA AAG-3'
Ad26 및 Ad48의 경우:
P17F: 5'-GCT CGA TGT ACA ATG AGG CGT GCG GTG GTG TCT TC-3'
P17R: 5'-GCT CGA CTT AAG TTA GAA GGT GCG ACT GGA AAG C-3'
증폭된 PCR 산물들을 BfrI 및 BsrGI으로 소화시키고 동일한 효소로 소화된 pBr/Ad.△penton으로 코드화시켰다. pBr/Ad.△penton에 이들 이종 펜톤 서열들을 도입하여 pBr/Ad.△pentonXX라고 명명된 구조체를 생성하였고, 여기서 XX는 삽입된 펜톤 서열을 증폭하기 위해 사용된 혈청형에 해당하는 혈청형의 수를 나타낸다. 순차적으로 새로운 펜톤 서열들을 변형된 헥손을 갖는 pWE/Ad.AfllII-rITR 벡터에 도입시켰다. 예를 들면, Ad35의 펜톤 서열들은 일반적인 FseI 단편의 교환에 의해 구조체 pWE/Ad.AflII-rITRHex35로 도입시켰다. 펜톤과 헥손 서열들의 다른 조합들 또한 만들었다. 변형된 헥손 및 펜톤 서열들을 갖는 바이러스들을 PER.C6 세포에서 어댑터 플라스미드로 동시-트랜스펙션을 이용하여 상기와 같이 제조하였다(ECACC 수탁번호 96022940). 그밖에, 펜톤 서열을 pWE/Ad. AflII-rITR 구조체에 도입하였다. 후자의 구조체는 오직 변형된 펜톤만을 포함하며, 이들 구조체들로부터 생성된 바이러스들은 아데노바이러스의 중화에 대한 펜톤 서열들의 기여를 연구하기 위해 및 감염 효율 및 특이성에 대한 가능한 변화를 분석하기 위해 사용될 것이다.
섬유 키메라 Ad5-기초 바이러스의 생성
아데노바이러스 감염은 두 캡시드 단백질 섬유와 펜톤에 의해 전달된다. 바이러스가 세포에 결합하는 것은 세포 표면 위의 수용체와 돌출 섬유 단백질의 상호작용에 의해 달성된다. 펜텐 단백질과 세포 표면 위의 인터그린과의 상호작용 후 내면화가 일어난다. 서브그룹 C 및 B 의 적어도 몇몇 아데노바이러스들은 세포 결합을 위해 다양한 수용체를 사용하는 것을 나타내었으며, 그러므로 다른 세포 타입에서 다른 감염 효율을 갖는다. 그러므로 캡시드 중의 섬유를 변화시킴에 의해 아데노바이러스의 감염 스펙트럼을 변화시키는 것이 가능하다. 아데노바이러스 혈청형 5의 섬유 코드화 서열은 뉴클레오티드 31042 와 32787 사이에 위치한다. 아데노바이러스 혈청형 5 DNA 코드화 섬유를 제거하기 위해, 본 발명자들은 pBr/Ad.Bam-rITR 구조체로 시작하였다. 우선, 이 구조체로부터 NdeI 부위를 제거하였다. 이를 위해, pBr322 플라스미드 DNA를 NdeI로 소화하고, 그 후 클레노우 효소를 사용하여 돌출된 말단을 채웠다. 그 다음, pBr322 플라스미드를 재결찰하고, NdeI로 소화하고E.coliDH5α로 형질전환시켰다. 생성된 pBr/△NdeI 플라스미드를 ScaI와 SalI로 소화시키고 생성된 3198 bp 벡터 단편을 pBr/Ad.BamrITR로부터 유도된 ScaI-SalI 단편에 결찰시켜 독특한 NdeI 부위를 포함하는 플라스미드 pBr/Ad.Bam-rITR △NdeI를 생성하였다. 그 다음, 올리고뉴클레오티드로 PCR을 실시하였다
NY-up: 5'-CGACAT ATGTAGATG CATTAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3' 및
NY-down:5'-GGA GAC CAC TGC CAT GTT-3'
증폭동안, 양쪽의 NdeI(굵은체) 및 NsiI 제한 부위(밑줄부분)를 증폭된 섬유 DNA의 클로닝의 촉진을 위해 도입하였다. 증폭은 각각 94 ℃에서 45초, 60 ℃에서 1분, 및 72 ℃에서 45초의 25 사이클로 구성되었다. PCR 반응은 뉴클레오티드 NY-up 또는 NY-down 25 pmol, dNTP 2mM, MgCl21.5 mM을 갖는 PCR 완충액, 및 엘롱가제 열안정 폴리머라제 1 유니트로 구성되었다(Gibco, The Netherlands). PCR 산물의 1/10은 아기로스 겔에서 이동하였고, 이것은 ±2200 bp의 예상된 DNA 단편이 증폭되었다는 것을 설명한다. 이 PCR 단편을 진클린 키트 시스템(Bio101 Inc.)을 사용하여 순차적으로 정제하였다. 그 후, PCR 산물 뿐만 아니라 pBr/Ad.BamprITR△NdeI 구조체 모두를 제한 효소 NdeI와 SbfI로 소화하였다. PCR 단편을 이어서 T4 리가제 효소를 사용하여 NdeI 와 SbfI 소화된 pBr/Ad.BamprlTR△NdeI로 클론하여, pBr/Ad.BamR△Fib를 생성하였다. 이 플라스미드는 제거된 섬유 서열 대신 삽입된 독특한 NdeI 및 NnsI 부위를 통한 어느 PCR 증폭된 섬유 서열의 삽입을 허용한다. 바이러스들은, 어댑터 플라스미드, PacI와 EcoRI로 소화된 구조체 pBr/Ad.AflII-EcoRI와 그 안에 이종 섬유 서열이 삽입되어진 pBr/Ad. BamR△Fib 구조체를 사용한, 특허 제 PCT/NL96/00244에 기재된 팩키징 세포에서 이중 동종 재조합에 의해 생성될 수 있다. 바이러스 생성 효율의 증가를 위해, 구조체 pBr/Ad. BamR△Fib를 우측 ITR의 PacI 부위를 생성하도록 변형시켰다. 여기서, pBr/Ad. BamR△Fib는 AvrII로 소화되었고 5 kb 아데노 단편은 단리되고 대응하는 AvrII 단편을 대치하는 상기 pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 벡터에 도입되었다. 생성된 구조체를 pBr/Ad.BamR△fib.pac로 명명하였다. 일단, 이종 섬유 서열이 pBr/Ad.BamR △fib.pac에 도입되면, 섬유 변형 우측 아데노바이러스 유전자는 pWE/Ad.AflII-rITR에 대해 상기와 같이 큰 코스미드 유전자로 도입된다. 이와 같은 큰 코스미드유전자는 오직 하나의 동종 재조합에 의해 아데노바이러스가 생성되는 것을 허용한다. 변형된 섬유들을 갖는 Ad5-기초 바이러스들이 제조되었고, 기재되었다(nos. 98294482.8 및 99200624.7). 그밖에, 본 발명의 혈청형의 헥손 및 펜톤 서열들은 선택된 표적 세포를 매우 효과적으로 감염시키는 바이러스를 생성하는 바람직한 섬유 서열과 결합한다. 예를 들면, 민무니근육 세포, 내피세포, 신체기관의 모든 활액세포들은 서브그룹 B 바이러스의 섬유, 특히 아데노바이러스 타입 16을 갖는 Ad5 기초 바이러스에 의해 매우 잘 감염된다. 특정 서열이 플라스미드의 Ad5 골격으로부터 삭제되고 기타 혈청형의 대응하는 서열로 대치될 수 있는 상기의 예는 본 시스템의 유연성을 나타낸다. 이것은 다양한 혈청형으로터 캡시드 유전자의 어느 조합도 만들 수 있음을 기재한 방법으로 증명된다. 그러므로, 키메라 재조합 Ad5-기초 아데노바이러스를, 중화에 덜 민감한 바이러스를 제조하는 원하는 헥손 및 펜톤 서열로, 및 특정 표적 조직에 효과적인 감염을 허용하는 원하는 섬유 서열로 고안하였다.
실시예 4
Ad35 재조합 바이러스들을 생성하기 위한 플라스미드-기초 시스템의 구성
Ad35의 부분적 제한 지도는 이미 간행되어 있다(Valderrama-leon et al., 1985; Kang et al., 1989; Li et al., 1991). Ad35를 기초로 한 재조합 아데노바이러스를 생성하기 위한 기능성 플라스미드-기초 시스템은 다음으로 이루어진다.
1. 좌측 ITR로 이루어지며 Ad35로부터 유도된 서열 및 이종 발현 카세트의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 부위를 팩키징하며 및 E1 서열이 결실된 어댑터플라스미드. 추가로, 어댑터 플라스미즈는 pIX 프로모터를 포함하는 E1B 코드화 영역의 Ad35 서열 3' 및 두번째 뉴클레오티드로 어댑터 플라스미드의 동종 재조합을 유도하는데 충분한 코드화 서열을 포함한다.
2. 어댑터 플라스미드와 동종인 서열 및 재조합 바이러스의 복제 및 팩키징에 필요한 서열로 이루어진 두번째 뉴클레오티드, 즉 팩키징 세포에 존재하지 않는 초기, 중간 및 말기 유전자.
3. Ad35의 E1 기능을 보충할 수 있는 적어도 기능적인 E1 단백질을 제공하는 팩키징 세포.
Ad35 DNA를 정제된 바이러스 배치로부터 다음과 같이 분리하였다. 바이러스 원액(Ad35: 3.26 x 1012VP/ml) 100 ㎕에 10x DNAse 완충액 10 ㎕(130 mM Tris-HCl pH 7.5; 1.2 M CaCl2; 50 mM MgCl2)를 첨가하였다. DNAse I (Roche Diagnostics) 10 ㎕ 10 mgr/ml를 첨가한 후, 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 0.5 M EDTA 2.5 ㎕, 20 % SDS 3.2 ㎕ 및 ProteinaseK(Roche Diagnostics; 20 mgr/ml) 1.5 ㎕를 첨가한 후, 샘플을 1시간 동안 50 ℃에서 배양시켰다. 그 다음, 바이러스성 DAN를 진클린 스핀 키트(Bio101 Inc.)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. DNA를 무균 MilliQ 워터 25 ㎕를 사용하여 스핀 칼럼에서 용출하였다. DNA 단편의 크기와 단편들의 수는 Kang et al.(1989)에 따라 사용될 것이다. Ad35 DNA를 EcoRI로 소화시키고 진클린 스핀 키트(Bio101 Inc.)을 사용하여 겔로부터 세개의 단편들(약 22.3(A), 7.3(B) 및 6kb(C))을 분리하였다. pBr322를 EcoRI 또는 EcoRI및 EcoRV를 사용하여 분리시키고 소화된 단편들을 겔로부터 분리하고 Tsap 효소(Gibco BRL)로 탈인산화시켰다. 그 후, 6kb Ad35 C 단편을 pBr322xEcoRI 단편으로 결찰시키고 ITR-포함 Ad35 단편(EcoRI-B)를 pBr322 xEcoRI/EcoRV 단편으로 결찰하였다. 결찰물을 16℃에서 밤새 배양시키고 DH5α수용성 박테리아로 형질전환시켰다(Life Techn.). 생성된 콜로니들의 미니프래프(minipreps)를 제한 분석으로 Ad 35 단편들의 정확한 삽입에 대해 분석하였다. 6 kb 및 7.3 kb 단편들 모두 pBr322에 정확히 삽입되었음을 확인하였다. 6kb 단편을 배열 pBr/Ad35-Eco6.0+와 pBr/Ad35-Eco6.0-모두에서 분리하였다. 여기서 +는 pBr322에 대해 5' to 3' 배열을 의미한다. 7.3 kb Ad35 B 삽입물, 즉 pBr/Ad35-Eco7.3, 을 갖는 클론을 3'ITR의 정확한 결찰을 확인하기 위해 부분적으로 서열화하였다. ITR은 아래 가닥에 5'-CATCATCAAT...-3' 서열을 갖는다. 그 후, pBr/Ad35-Eco7.3은 6kb Ad35 단편을 삽입함에 의해 5' 말단으로 연장되었다. 여기서, pBr/Ad35-Eco7.3 은 EcoRI로 소화되었고 탈인산화시켰다. 겔로부터 단편을 분리하고 6kb Ad35 EcoRI 단편으로 결찰시켰다. 변형 후 삽입의 정확한 배열에 대해 시험하였고 하나의 클론, 즉 pBr/Ad35-Ecol13.3을 선택하였다.
그 다음, 이 단편을 wt Ad35의 SalI으로 소화한 후 얻어진 ~ 5.4 kb SalI D 단편으로 연장하였다. 여기서, pBr322 골격에 있는 SalI 부위는 pBr/Ad35-Ecol13.3을 SalI로 소화하고 점착성 말단을 클레노우 처리 및 재결찰로 채움으로써 제거하였다. 아데노바이러스 삽입중 단일 SalI 부위를 포함하는 하나의 클론을 선택하였다. 그 후, 이 클론, 즉 pBr△sal/Ad35-Eco13.3을 pBr322 골격에 존재하는 AatII로 선형화시키고 AatII 보충 말단으로 SalI 링커에 결찰시켰다. 그 다음, DNA를 과잉의 SalI로 소화시키고 선형 단편을 분리하고 Ad35로부터의 5.4kb SalI-D 단편에 결찰시켰다. pBr/Ad35-Eco13.3에 정확한 배열의 삽입된 SalI 단편을 포함하는 하나의 클론을 선택하였다. 생성된 클론 pBr/Ad35.Sal2-rITR은 우측 ITR을 포함하는 Ad35의 3' ~17kb을 포함한다. 바이러스 생성시에 우측 ITR의 유리를 가능하게 하기 위해, 우측 ITR에 측면으로 접해있는 NotI 부위를 PCR로 도입하였다. 또한, 22.3 kb의 Ad35 EcoRI-A 단편을 pBr322xEcoRI/EcoRV에 클론시켰다. 하나의 클론, 즉 pBr/Ad35-EcoA 3'를 외관상으로 5' 말단의 7kb의 삭제를 갖도록 선택하였다. 이것은 Ad35 wt DNA에 9.4kb 및 서열 상류의 1.5 kb에서 SalI 부위를 포함한다. pBr322 골격에서 SalI 부위와 독특한 NdeI 부위를 사용하여, 이 클론은 NotI 제한 부위가 링커의 삽입에 의해 Ad35의 5' 말단에 생성되는 방법으로 Ad35의 첫번째 SalI로부터 약 5kb Ad35 단편의 삽입에 의해 5' 말단으로 연장된다. 이 클론, 즉 pBr/Ad35.pIX-EcoA는 왼쪽 말단 서열(ITR, 팩키징 서열 및 E1)을 포함하지 않으며 3' 말단에, 이것은 클론pBr/Ad35.Sal2-rITR과 약 3.5 kb의 겹침을 갖는다.
어댑터 플라스미드를 생성하기 위해, Ad35를 SalI로 소화하고 ~ 9.4kb의 좌측말단 B 단편을 분리하였다. pBr322를 EcoRV 및 SalI로 소화시키고, 겔로부터 분리하고 Tsap 효소로 탈인산화하였다. 두 단편 모두를 결찰하고 정확한 삽입과 정확한 좌측 ITR의 정확한 서열을 갖는 클론을 선택하였다. 바이러스 생성시에 좌측 ITR의 유리를 가능하게 하기 위해, 좌측 ITR에 측면으로 접해있는 NotI 부위를 PCR로 도입하였다. 이 클론으로부터 E1 서열을 제거하고 PCR을 사용하여 폴리링커 서열로 대치시켰다. 폴리링커 서열은 선택된 유전자에 발현 카세트를 도입하기 위해 사용되었다.
재조합 Ad35 쿨론들을 도 3에 나타낸 바와 같이, REP.C6 세포들을 어댑터 플라스미드, pBr/Ad35.pIX-EcoA 및 pBr/Ad35.Sal2-rITR로 트랜스펙션하여 생성하였다. 동종 재조합은 재조합 바이러스를 생성한다.
실시예 5
Ad35에 대한 중화활성(NA)의 보급은 다양한 지질학적 위치의 인간 혈청에서 낮다
실시예 1에서, 본 발명자들은 벨기에의 한 지역에서 인간 혈청중 중화활성(NA)의 분석을 기재하였다. 놀랍게도, 시험된 44개 아데노바이러스 혈청형증 하나의 혈청형, Ad35는 조사된 100개의 혈청중 어느 것도 중화시키지 않았다. 또한, 겨우 몇개의 혈청형, Ad26, Ad34 및 Ad48 만이 시험된 혈청중 8 개 이하에서 중화된다는 것을 발견하였다. 이 분석은 또한, 미리 시험되지 않은 아데노바이러스의 다른 혈청형으로도 확장되었고, 처음 스크린으로부터의 혈청형의 선택을 사용하여 다른 지역의 혈청들로 확장될 수 있었다.
여기서, 아데노바이러스를 증폭시키고, 정제시키고 및 실시예 1에 기재된 CPE-억제 분석에서 중화에 대해 시험하였다. 실시예 1과 동일한 배치의 혈청을 사용하여, 아데노바이러스 혈청형 7B, 11, 14 18 및 44/1876을 중화에 대해 시험하였다. 이들 바이러스들은 각각 혈청의 59, 13, 30, 98 및 54 %에서 중화되었다. 그러므로, 이들 시리즈의 Ad11은 비교적 낮은 빈도로 중화되었다.
아데노바이러스 혈청형에 대한 NA의 보급(prevalence) 뿐만 아니라 인간 조직으로부터 아데노바이러스 혈청형의 분리의 빈도는 지리적 위치에 따라 다르다는 것이 알려져 있으므로, 본 발명자들은 추가로 다른 지역의 혈청에 대한 아데노바이러스 혈청형의 선택하여 시험하였다. 인간의 혈청은 유럽(영국의 브리스톨과 네덜란드의 라이덴)의 추가 두곳 및 미국의(캘리포니아의 스텐포드 및 뉴욕의 그레이트 넥) 추가 두곳으로부터 얻었다. Ad2, Ad5, Ad27, Ad30, Ad38, Ad43 뿐만 아니라 첫번째 스크린에서 혈청의 20% 이하로 중화된 것으로 발견된 아데노바이러스들을 영국 혈청에 대해 중화 시험을 하였다. 이 실험의 결과를 도 4에 나타내었다. 아데노바이러스 혈청형 2 및 5는 인간 혈청에서 높은 확률로 다시 중화되었다. 첫번째 스크린에서 혈청의 낮은 퍼센트가 중화되었던 혈청형의 몇몇은 영국의 혈청에서 높은 퍼센트로, 예를 들면, Ad26 (7 % 대 30 %), Ad28 (13 % 대 50 %), Ad34 (5 % 대 27 %) 및 Ad48 (8 % 대 32 %)로 중화되었다. 첫번째 스크린에서 혈청의 낮은 퍼센트가 중화되었던 Ad11 및 Ad49에 대한 중화는 두번째 스크린에서도 낮은 퍼센트의 혈청에서 발견되었다(각각 13 % 대 5%, 및 20 % 대 11 %). 첫번째 스크린의 어느 혈청에서도 중화되지 않았던 Ad35는 영국의 혈청에서 낮은 퍼센트(8%)로 중화되었음이 발견되었다. 영국의 인간 혈청의 NA의 증대는 혈청형 Ad11과 Ad35에서 가장 낮았다.
추가의 분석을 위해, 미국의 두곳과 뉴질랜드로부터 혈청을 얻었다. 도 5는 이들 자료와 선행 자료로부터 얻은 자료의 개요를 나타낸다. Ad5, Ad11 및 Ad35를제외하고, 모든 혈청에서 모든 바이러스가 시험된 것은 아니다. 인간 혈청의 포괄적인 스크린으로부터의 전체적인 결론은 Ad35에 대한 중화활성의 보급이 서양을 통해 모든 혈청형에서 가장 낮다는 것이다: 평균 인간 혈청의 7%가 중화활성을 포함한다(5 개의 다른 위치).
또 다른 B-군 아데노바이러스, A11 역시 인간 혈청의 낮은 퍼센트만이 중화된다(5 개의 다른 지역에서 평균 11 %). 아데노바이러스 타입 5 는 5개의 다른 위치에서 얻어진 인간 혈청의 56%에서 중화된다. 비록 모든 혈청을 시험하지 않았으나, D-군 혈청형 49 또한 유럽과 미국의 한곳의 샘플에서 비교적 낮은 빈도로 중화되었다(평균 14%).
상기 중화 시험에서, 혈청은 가장 높은 혈청 농도를 갖는 웰에서 비-중화로 판단되며, CPE의 최대 보호는 혈청 없는 대조군(대조구)과 비교하여 40 %이다. 보호는 다음과 같이 산출된다:
실시예 1의 기재와 같이, 혈청을 4배 ~ 64배로 희석한 5개의 다른 희석 영역에서 플레이트시켰다. 그러므로, 낮은 역가(즉, 가장 높은 혈청 농도에서만 중화)와 높은 역가(즉, 가장 낮은 혈청 농도를 갖는 웰에서 중화) 사이의 구별이 가능하다. NA에서 Ad35를 포함하는 혈청은 겨우 15 % 만이 고역가를 가진 반면, Ad5의 중화 활성을 포함한다고 알려진 본 발명의 스크린에 사용된 인간 혈청중, 70 %가 고역가로 전환되었다. A11에 대해 NA의 양성을 갖는 혈청들 중 오직 8% 만이 고역가를 가졌다. 그러므로, Ad35, Ad11 및 Ad49에 대한 NA의 빈도는 Ad5와 비교하여 낮을 뿐만 아니라 이들 바이러스에 대해 NA를 함유하는 혈청에 대해서도, 대부분은 낮은 역가를 갖는다. 그러므로, Ad11, Ad35, 또는 Ad49를 기초로 하는 아데노바이러스성 벡터들은, 유전자 치료 매개체로서 또는 생체내에서 백신화 벡터로 사용될 때 또는 중화활성에 의해 감염 효율이 방해되는 어느 작용에서, Ad5 기초 벡터들 보다 명백한 이점을 갖는다.
이하의 실시예들에서, 안정한 RCA-프리 Ad35-기초 벡터의 생성을 위한 벡터 시스템의 구성이 기재된다.
실시예 6
인간 아데노바이러스 타입 35의 서열
Ad35 바이러스들을 PER.C6세포에서 증폭시키고 DNA를 실시예 4의 기재에 따라 분리하였다. 전체 서열을 Qiagen Sequence Services(Qiagen GMBH, Germany)에서 생성하였다. 전체 바이러스성 DNA를 초음파에 의해 전단하고 DNA의 말단들은 T4 DNA 폴리머라제로 끝을 둔단으로 하였다. 전단된 둔단 단편들을 아가로스겔에서 크기에 따라 분류하여, 1.8 내지 2.2 kb의 DNA 단편들에 해당하는 겔 슬라이스들을 얻었다. DNA를 QIAquick 겔 추출 프로토콜에 의해 슬라이스겔로부터 정제하고 pUC19 플라스미드 클로닝 벡터의 숏건(shotgun) 라이브러리로 서브클론하였다. 표적 DNA 8배를 커버하는 96-웰 프레이트중의 클론의 분석을 전체 서열을 생성하기 위해 사용하였다. 서열화를 BigDyeTerminator chemistry 및 Amplitag Fs DNA 폴리머라제를 사용하여 퍼킨-엘머 9700 써모 싸이클러스에서 실시한 후, QUAGEN DyeEx96 Technology를 사용하여 서열 반응물을 정제시켰다. 그 다음, 서열 반응 생성물을 자동분리시키고 ABI 377 XL 96 레인 시퀀서에서 단편들을 검출하였다. 초기 서열 contig 서열 및 차이들은 표적 DNA 작업 판독에 의해 또는 PCR 산물의 직접 서열화에 의해 채워졌다. 숏건 라이브러리에 없는 것으로 밝혀진 바이러스의 말단은 바이러스성 DAN의 ProteinaseK 소화 후 ITR 서열에 결합되어 남아있는 pTP의 아미노산에 의한 클로닝 어려움 때문이다. 추가의 서열이 이들 영역의 서열 대부분을 해결하는 바이러스성 DNA에 계속되지만, 가장 말단 뉴클레오티드의 정확한 서열을 얻는 것은 어렵다. 5' 끝에서 얻어진 서열은 5'-CCAATAATATACCT..3'인 반면, 3' 말단에서 얻어진 서열은 5'-...AGGTATATTATTGATGATGGG-3'이었다. 대부분의 인간 아데노바이러스는 말단 서열 5'-CATCATCAATAATATACC-3'을 갖는다. 추가로, 말단 7 kb Ad35 EcoRI 단편을 pBr322로 클로닝한 후 얻은 Ad35 DNA의 3' 말단을 나타내는 클론은 또한 전형적인 CATCATCAATAAT... 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, Ad35는 전형적인 말단 서열을 가질 것이며, 바이러스성 DNA에서 직접 서열화하여 얻은 차이는 빗나간(run-off) 서열 진행에 관련된 인공물 및 pTP의 잔류 아미노산의 존재 때문이다.
정정된 말단 서열을 갖는 전체 서열을 도 6에 나타내었다. Ad5(유전자 뱅크 #M72360) 및 Ad7(부분서열 유전자뱅크 #X03000)을 갖는 서열 동질성 및 개방판독 프레임의 위치에서, 바이러스의 조직은 대부분의 인간 아데노바이러스, 특히 서브그룹B 바이러스의 조직과 동일하다. 게놈의 총 길이는 34794 염기쌍이다.
실시예 7
재조합 Ad35-기초 바이러스를 생성하기 위한 플라스미드-기초 벡터 시스템의 구성
재조합 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 기능적 플라스미드-기초 벡터는 다음의 구성성분들로 이루어진다:
1. 좌측 ITR로 이루어지며 Ad35로부터 유도된 서열 및 이종 발현 카세트의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 부위를 팩키징하며 및 E1 서열이 결실된 어댑터 플라스미드. 추가로, 어댑터 플라스미드는 pIX 프로모터를 포함하는 E1B 코드화 영역의 Ad35 서열 3' 및 두번째 헥산분자로 어댑터 플라스미드의 동종 재조합을 유도하는데 충분한 코드화 서열을 포함한다.
2. 어댑터 플라스미드와 동종인 서열 및 재조합 바이러스의 복제 및 팩키징에 필요한 서열로 이루어진 두번째 핵산분자, 즉 팩키징 세포에 존재하지 않는 초기, 중간 및 말기 유전자.
3. Ad35의 E1 기능을 보충할 수 있는, 적어도 기능적 E1 단백질을 제공하는 팩키징 세포.
보충 팩키징 세포에서 재조합 아데노바이러스를 생성하는 또 다른 방법은 선행기술에 알려져 있으며 본 발명의 범위에서 벗어남 없이 Ad35 바이러스에 적용될 수 있을 것이다. 예를 들면, 상기 개요에 따라, 플라스미드-기초 시스템의 구성은 아래에 상세히 기재하였다.
1) Ad35 어댑터 플라스미드의 구성
어댑터 플라스미드 pAdApt(도 7; 실시예 2에 기재)를, 연장된 폴리링커를 포함하고 및 플라스미드 벡터 서열로부터 아데노바이러스 삽입물의 이탈이 가능하도록 좌측 ITR부근의 편리한 독특한 제한 부위와 3' 말단에 아데노바이러스 서열을 갖는 어댑터 플라스미드를 얻기위해 변형하였다. 이들 플라스미드의 구성은 아래 상세히 기재하였다. 어댑터 플라스미드 pAdApt(실시예 2)를 SalI로 소화시키고 재결찰을 감소시키기 위해 새우 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. 다음의 두개의 인산화 및 어닐링된 올리고로 이루어진 링커: ExSalPacF 5'-TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT GGG TTC GAA TTA ATT AA-3'; 및 ExSalPacR 5'-TCG ATT AAT TAA TTC GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA-3';를 소화된 구조체에 직접 결찰시켰고, 그것에 의해 SalI 제한 부위가 Pi-PspI, SwaI 및 PacI로 교환되었다. 이 구조체를 pADAPT + ExSalPac 링커로 명명하였다. 또한, pAdApt의 좌측 ITR의 일부를 다음의 프라이머들을 사용하여 PCR로 증폭시켰다: PCLIPMSF: 5'-CCC CAA TTG GTC GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG -3' 및 pCLIPBSRGI: 5'- GCG AAA ATT GTC ACT TCC TGT G -3'. 증폭된 단편은 MunI 및 BsrGI로 소화시키고 pAD5/Clip(실시예 2)로 클론시켰으며, 이것은 EcoRI로 부분적으로 소화되었고 정제된 후 BsrGI로 소화됨에 의해, 죄측 ITR을 재-삽입하였고 시그널을 팩키징하였다. 제한 효소 분석 후, 구조체를 ScaI 와 SgrAI 로 소화시키고 800 bp 단편을 겔로부터 분리하고 ScaI/SgrAI 소화된 pADAPT+ExSalPac 링커로 삽입시켰다. 생성된 구조체는 pIPspSalAdapt로 명명되었고, SalI로 소화되었고, 탈인산화되고, 및 상기의 인산화 ExSalPacF/ExSalPacR 이중나선 링커에 결찰되었다. PacI 부위가 ITR에 가장 가까운 클론을 제한 분석으로 확인하였고 서열들은 서열분석으로 확인하였다.pIPspAdapt(도 8)로 명명된, 신규의 pAdApt 구조체는 PacI, PI-PspI 및 BstBI에 대한 인식 서열을 포함하는 ExSalPac 링커를 장착하며, 이들은 아데노바이러스 어댑터 구조체의 아데노바이러스 부분을 둘러싸며, 아데노바이러스 헬퍼 단편들로 동시트랜스펙션되기 전에 플라스미드 DAN를 선형화하는데 사용될 수 있다. 트란스 유전자 클로닝 순열(permutation)을 추가로 증가시키기 위해, 다수의 폴리링커 변이체들을 pIPspAdapt를 기초로 구성하였다. 이 목적을 위해, pIPspAdapt를 우선 EcoRI로 소화시키고 탈인산화시켰다. 다음의 두개의 인산화 및 어닐링된 올리고로 구성된 링커: Ecolinker+: 5'- AAT TCG GCG CGC CGT CGA CGA TAT CGA TAG CGG CCG C -3' 및 Ecolonker-: 5'-AAT TGC GGC CGC TAT CGA TAT CGT CGA CGG CGC GCC G-3'; 를 이 구조체에 결찰시켜, AscI, SalI, EcoRV, ClaI 및 NotI에 대한 제한 부위를 생성하였다. 이 링커의 두 배열을 얻었고 서열들을 제한분석과 서열분석으로 얻었다. 5' HindIII, KpnI, AgeI, XcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, NheI, HpaI, BamHI 및 XbaI의 순서의 폴리링커를 포함하는 플라스미드는 pIPspAdapt1(도 9)으로 명명하였고, HindIII, KpnI, AgeI, NotI, ClaI, EcoRV, SalI, AscI, EcoRI, NheI, HpaI, BamHI 및 XbaI 순서의 폴리링커를 포함하는 플라스미드는 pIPspAdapt2로 명명하였다.
다른 의미 또는 반대 의미 구조체의 클로닝이 용이하도록, 다음의 두개의 올리코뉴클레오티드로 이루어진 pIPspAdapt의 폴리링커와 반대의 링커를 고안하였다.: HindXba+ 5'-AGC TCT AGA GGA TCC GTT AAC GCT AGC GAA TTC ACC GGT ACC AAG CTT A-3'; HindXba- 5' -CTA GTA AGC TTG GTA CCG GTG AAT TCG CTA GCGTTA ACG GAT CCT CTA G-3'. 이 링커를 PiPspAsapt를 소화시키는 HindIII/XbaI로 결찰시키고 정확한 구조체를 분리하였다. 제한 효소분석과 서열화를 통해 확인하였다. 이 새로운 구조체, pIPspAsaptA를 EcoRI로 소화시키고 상기 Ecolinker를 이 구조체에 결찰시켰다. 이 링커, pIPspAdapt3(도 10)의 양 배열을 얻었고, 이것은 XbaI, BamHI, HapI, NheI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, AgeI, KpnI 및 HindIII의 순서의 폴리링커를 포함한다. 모든 서열들을 제한 효소 분석 및 서열화로 확인하였다.
그 다음 Ad35를 기초로 어댑터 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다.
좌측 ITR과 Ad35 wt 서열 뉴클레오티드 1 ~ 464(도 6)에 해당하는 팩키징 서열을 다음의 프라이머를 사용하여 wtAd35 DNA에서 PCR로 증폭하였다:
프라이머 35F1:
5'-CGG AAT TCT TAA TTA ATC GAC ATC ATC AAT AAT ATA CCT TAT AG-3'
프라이머 35R2:
5'-GGT GGT CCT AGG CTG ACA CCT ACG TAA AAA CAG-3'
증폭은 서열의 5' 말단에 PacI 부위 및, 3' 말단에 AvrII 부위를 도입한다. 증폭을 위해, 플라티늄 Pfx DNA 폴리머라제 효소(LTI)를 사용자 지침에 따라, 그러나 프라이머 0.6 μM과 최종농도 3%에 첨가된 DMSO와 함께 사용하였다. 증폭 프로그램은 다음과 같다: 94 ℃에서 2분(94 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초, 68 ℃에서 1분) 30사이클 후, 68 ℃에서 10분. PCR 산물을 사용법에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고 PacI 및 AvrII로 소화시켰다. 이 후, 소화된 단편을 진클린키트(Bio 101, Inc.)를 사용하여 겔로부터 정제하였다. Ad5-기초 어댑터 플라스미드 pIPspAdApt-3(도 10)을 AvrII로 소화하고 그 다음 PacI로 부분적으로 소화시키고, 5762bp 단편을 LMP 아가로스 겔 슬라이스에서 분리시키고 동일한 효소로 소화시킨 상기 PCR 단편으로 결찰시키고 전기적 수용성 DH10B 세포(LTI)로 형질전환시켰다. 생성된 클론을 pIPspAdApt3-Ad35lITR로 명명하였다.
동시에, Ad35 DNA의 두번째 피스를 다음의 프라이머들을 사용하여 증폭시켰다:
35F3: 5'-TGG TGG AGA TCT GGT GAG TAT TGG GAA AAC-3'
35R4: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGG GAA ATG CAA ATC TGT GAG G-3'
이 단편의 서열은 wtAd35(도 6)의 뉴클레오티드 3401 ~ 4669에 대응하며, E1B 55K 코딩 서열로부터 직접 3' 출발하는 서열의 1.3kb를 포함한다. 증폭과 정제는 좌측 ITR 및 팩키징 서열을 포함하는 단편에 대한 상기와 같이 행하였다. 그 다음, PCR 단편을 PacI로 소화시키고 SmaI 및 PacI로 소화된 pNEB193 벡터(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 서브클론하였다. 생성된 클론의 서열의 완전성을 서열분석으로 확인하였다. 그 다음, pNEB/Ad35pF3R4를 BglII 및 PacI로 소화시키고 QIAExII 키트를 사용하여 겔로부터 Ad35 삽입물을 분리하였다. pIPspAdApt3-Ad35lITR을 BglII로 소화시킨 다음 PacI로 부분적으로 소화시켰다. (벡터 서열, CMV 프로모터로서의 Ad35 ITR 및 팩키징 서열, 다중클로닝 영역 및 폴리A 시그널을 포함하는) 3624 bp 단편을 QIAExII 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 양쪽 단편들을 결찰하고 수용성 DH10B 세포(LTI)로 전환시켰다. 생성된 클론 pAdApt35IP3(도 11)은pIPspAsApt3로부터의 발현 카세트를 가지지만, Ad35 좌측 ITR과 팩키징 서열 및 Ad35의 뉴클레오티드 3401 ~ 4669에 해당하는 두번째 단편을 포함한다. 반대 배열에 다수의 클로닝 부위를 갖는 Ad35 어댑터 플라스미드의 두번째 변형을 다음과 같이 제조하였다:
pIPspAdapt1을 Nael과 BglII 및 CMV 프로모터의 일부를 포함하는 0.7 kbp 밴드로 소화시키고, MCS 및 SV40 폴리A를 분리하고 pAdApt35Ip1을 생성하는 pAdApt35IP3의 해당 부위에 삽입시켰다.(도 12).
그 다음, pAdApt35.LacZ 와 pAdApt35.Luc 어댑터 플라스미드를 (KpnI 및 BamHI로 소화된) pcDNA.Lac 및 (HindIII 및 BamHI로 소화된) pAdapt.Luc로부터의 트랜스유전자를 pAdApt35IP1의 해당 부위에 삽입하여 생성하였다. pcDNA.Lac 및 pAdapt.Luc의 생성은 WO99/55132에 기재되어 있다.
2) 코스미드 pWE.Ad35. pXI-rITR의 구성
도 13은 이하에 상세히 기재된 bp 3401 ~ 34794(우측 ITR의 말단)의 Ad35서열을 함유하는 코스미드 클론을 구성하기 위해 실시되는 여러 단계들을 나타낸다.
첫번째 PCR 단편(pIX-NdeI)를 다음의 프라이머 세트를 사용하여 생성하였다:
35F5: 5' -CGG AAT TCG CGG CCG CGG TGA GTA TTG GGA AAA C -3'
35R6: 5'-CGC CAG ATC GTC TAC AGA ACA G-3'
DNA 폴리머라제 Pwo(Roche)를 제작자 지침에 따라 사용하였으나, 두 프라이머의 최종 농도는 0.6μM였고 wt Ad35 DNA 50 ngr.을 사용하였다. 증폭은 다음과같이 실시되었다: 94 ℃에서 2분, 94 ℃ 30초에서 30사이클, 65 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1분 45초, 68 ℃에서 8분. TA 클로닝 벡터 PCR2.1에서 클로닝하기 위해, superTag 폴리머라제(HT Biotechnology LTD) 1 유니트로 최종 배양을 72 ℃에서 10분동안 실시하였다.
3370 bp 증폭된 단편은 5' 말단에 첨가된 NotI 부위를 갖는 bp3401 ~ 6772의 Ad35 서열을 함유한다. 단편들을 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다(LTI).
두번째 PCR 단편(NdeI-rITR)을 다음 프라이머들을 사용하여 생성하였다:
35F7: 5'-GAA TGC TGG CTT CAG TTG TAA TC-3'
35R8: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3'
증폭을 제작자 지침에 따라 pfx DNA 폴리머라제(LTI)를 사용하여, 그러나 양쪽 프라이머 0.6μM 및 주형으로서 wtAs35 DNA 10 ngr을 사용하여 실시하였다. 프로그램은 다음과 같았다:
94 ℃에서 3분, 94 ℃에서 30 초 5사이클, 40 ℃에서 45초, 68 ℃에서 2분 45초 후 94 ℃에서 30초 25사이클, 60 ℃에서 30초, 68 ℃에서 2분 45초. TA-클로닝 벡터 PCR2.1 1 에서 클로닝하기 위해, superTag 폴리머라제 1 유니트로 72 ℃에서 10분동안 최종 배양을 실시하였다. 뉴클레오티드 33178 에서 Ad35의 우측 ITR 말단까지 범위의 1.6 kb 증폭된 단편을 PCR 정제키트(LTI)를 사용하여 정제시켰다.
두개의 정제된 PCR 단편들을 TA-클로닝 키트(Invitrogen)의 PCR2.1 벡터에 결찰시키고 STBL-2 수용성 세포(LTI)로 전환시켰다. 예상된 삽입물을 갖는 클론들을 정확한 증폭을 확인하기 위해 서열화하였다. 다음, 두 단편들을 NotI 와 NdeI를사용하여 소화하여 벡터로부터 절단시키고 진클린 키트(Bio 101, Inc)를 사용하여 겔로부터 정제하였다. 코스미드 벡터 pWE15 (Clontech)를 NotI로 소화시키고, 탈인산화시키고 또한 겔로부터 정제시켰다. 이들 세개의 단편들을 결찰하고 STBL2 수용성 세포들(LTI)로 전환시켰다. 두개의 PCR 단편들을 포함하는 정확한 클론들중 하나를 이후 NdeI로 소화시키고 선형 단편들은 진클린 키트를 사용하여 겔로부터 정제시켰다. Ad35 wtDNA를 NdeI로 소화시키고 26.6 kb 단편을 제작사 지침에 따라 아가라제 효소(Roche)를 사용하여 LMP 겔로부터 정제시켰다. 이들 단편들을 함께 결찰하고 제조사의 프로토콜에 따라 λ파아지 팩키징 추출물(Stratagene)을 사용하여 팩키징하였다. STBL-2 세포로 감염후, 콜로니들을 플레이트에서 성장시키고 완전 삽입물의 존재를 분석하였다. 정확한 배열에 삽입되고 세개의 효소(NcoI, PvuII 및 ScaI)로 독립적으로 소화된 후 정확한 제한 패턴을 갖는 큰 단편을 갖는 하나의 클론을 선택하였다. 이 클론을 pWE.Ad35.pIX-rITR로 명명하였다. 이것은 bp3401 에서 말단까지 Ad35 서열을 가지며 NotI 부위가 측면에 접해있다.
3)PER.C6에서 Ad35 기초 재조합 바이러스들의 생성
야생형 Ad35 바이러스는 매우 높은 역가까지 PER.C6 에서 성장할 수 있다. 그러나, PER.C6에 존재하는 Ad5-E1 영역이 E1-결실 Ad35 재조합 바이러스를 보충할 수 있는지 여부는 알려지지 않았다. 이것을 시험하기 위해, REP.C6 세포를 상기의 어댑터 플라스미드 pDaApt35.LacZ와 큰 골격 단편pWE.Ad35.pIX-rITR으로 동시-트랜스펙션하였다. 우선, pAdApt35.LacZ를 PacI으로 소화시키고 pWE.Ad35.pIX-rITR을 NotI로 소화시켰다. 추가의 정제없이, 각 구조체 4 ㎍을 DMEM(LTI)과 혼합하고, 전날 T25 플라스크에 밀도 5 x 106세포로 접종된 REP.C6세포로, 리포펙타민(LTI)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 트랜스펙션하였다. 양성 대조구로서, PacI 소화된 pWE.Ad35.pIX-rITR DNA 6 ㎍을 E1 영역을 포함하는 바이러스성 게놈의 좌측 말단을 함유하는 Ad35 wt DNA로부터 분리한 6.7 kb NheI 단편으로 동시-트랜스펙션하였다. 다음날, 배지(10 % FBS와 10 mM MgCl2를 갖는 DMEM)를 새로 공급하고 세포들을 추가로 배양시켰다. 트랜스펙션 후 2일째에, 세포들을 트립신화하고 T80 플라스크로 옮겼다. 양성 대조구 플라스크는 트랜스펙션 후 5일째 CPE를 나타내었고, pWE.Ad35.pIX-rITR 구조체가 적어도 Ad35-E1 단백질들의 존재하에 기능성이라는 것을 나타낸다. Ad35 LacZ 어댑터 플라스미드와 pWE.Ad53.pIX-rITR을 사용한 트랜스펙션은 CPE를 제공하지 않았다. 이들 세포들은 10일째의 일단 배지에서 수확되고 그리고 바이러스를 방출하기 위해 냉동/해동되었다. 수확된 물질 4 ml를 REP.C6 세포를 갖는 T80 플라스크에 첨가하고 (80-컨플루언시로) 다른 5일 동안 배양하고 또 다른 5일동안 배양하였다. 이와 같은 수확/재-감염을 2번 반복하였으나 CPE와 관련된 바이러스에 대한 증거는 없었다. 이 실험으로부터, Ad5-E1 단백질은 Ad35 재조합 바이러스들을 보충할 수 없거나, 또는 충분하지 않지만, 어댑터 플라스미드 또는 pWE.Ad345.pIX-rITR 골격 플라스미드의 서열 겹침은 효과적인 재조합에 충분히 크지 않고 재조합 바이러스 게놈을 제공할 것이다. 양성 대조구 트랜스펙션을 6.7 kb 좌측말단 단편으로 실시하였고, 그러므로 서열 겹침은 약 3.5 kb 였다. 어댑터 플라스미드와 pWE.Ad35.pIX-rITR 단편은 1.3 kb의 서열 겹침을 가진다. 1.3 kb의서열 겹침이 효과적인 동종 재조합에 너무 작은지의 여부를 확인하기 위해, 상기와 동일한 공정을 사용하여, PacI 소화된 pWE.Ad35.pIX-rITR과 상기의 35F1 및 35R4로 생성한 Ad35 wtDNA의 PCR 단편으로 동시-트랜스펙션을 실시하였다. 그러므로, PCR 단편은 최대 bp4669의 좌측 말단 서열을 가지며, 그러므로 어댑터 플라스미드 pAdApt35.LacZ로서 pWE.Ad35.pIX-rITR를 갖는 동일한 겹침 서열을 갖지만 Ad35 E1 서열을 갖는다. PCR 칼럼 정제 이후, DNA를 가능한 완정한 주형 서열을 제거하기 위해 SalI로 소화시켰다. 소화된 PCR 산물에 의한 트랜스펙션은 단독으로 음성 대조구로서 작용한다. 트랜스펙션 4일 후, CPE가 PCR 산물 및 Ad35 pIX-rITR 단편으로 트란스펙트된 세포에서는 발생했으나, 음성 대조구에서는 발생하지 않았다. 이것은 1.3 kb 겹침 서열이 Ad35 E1 단백질의 존재하에 바이러스를 생성하기에 충분하다는 것을 나타낸다. 이들 실험으로부터, 본 발명자들은 적어도 하나의 Ad35.E1. 단백질의 존재가 Ad5 보충 세포주의 플라스미드 DNA로부터 재조합 Ad35 기초 벡터를 생성하는데 충분하다는 결론을 얻었다.
실시예 8
1)Ad35.E1. 발현 플라스미드의 구성
PER.C6 중의 Ad5-E1 단백질은 Ad35 재조합 바이러스들을 충분히 보충할 수 없으므로, Ad35 E1 단백질은 Ad35 보충 세포에 발현되거나 또는 Ad35 E1 단백질을 발현하는 새로운 팩키징 세포주는, 이배체 1차 인줄기세포 또는 아데노바이러스 E1 단백질을 발현하지 않는 수립된 세포주로부터 출발하여 제조되어야 한다.
우선, bp 468에서 bp 3400의 Ad35 E1 영역을 다음의 프라이머 세트를 사용하여 wtAd35 DNA로부터 증폭하였다.
35F11: 5'-GGG GTA CCG AAT TCT CGC TAG GGT ATT TAT ACC-3'
35F10: 5'-GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG-3'
이 PCR은 5'말단에 KpnI 및 EcoRI 부위를 도입하고 3' 말단에 SbfI과 XbaI 부위를 도입한다.
5 ngr 주형 DNA에서의 증폭을 Pwo DNA 폴리머라제(Roche)로 제작사 지침에 따라, 그러나, 최종 농도 0.6 μM에서 두 프라이머를 가지고 실행하였다. 프로그램은 다음과 같았다: 94 ℃에서 2분, 94 ℃에서 30초 5사이클, 56 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분 후 94 ℃에서 30초 25사이클, 60 ℃에서 30초, 및 72 ℃에서 2분 후, 72 ℃에서 10분. PCR 산물을 PCR 정제키트(LTI)를 사용하여 정제시키고 KpnI 및 XbaI로 소화시켰다. 소화된 PCR 단편을 발현벡터 pRSVhbvNeo(아래 참조)에 결찰시켰고, 또한 KpnI와 XbaI로 소화시켰다. 결찰을 제작사 지침에 따라 수용성 STBL-2 세포(LTI)에 형질전환시키고 콜로니들을 RSV 프로모터와 HBV 폴리A 사이에 있는 폴리링커로 Ad35E1 서열의 정확한 삽입에 대해 분석하였다. 생성된 클론을 pRSV.Ad35-E1으로 명명하였다(도 15). pRSV.Ad35-E1에 있는 Ad35 서열을 서열분석으로 확인하였다.
pRSVhbvNeo를 다음과 같이 생성하였다: pRc-RSV(Invitrogen)을 PvuII으로 소화시키고, TSAP 효소(LTI)로 탈인산화하고, 3kb 벡터 단편을 저융점 아가로스(LMP)에서 분리하였다. 플라스미드 pPGKneopA(도 16; WO96/35798에 기재)를 플라스미드를 선형화하도록 SspI로 완전히 소화시켰고 PvuII으로 부분적으로 소화시켰다.PvuII로 부분적으로 소화시킨 후, 생성된 단편들을 LMP 아가로스겔에서 분리하고 및 PGK 프로모터, 네오마이신 내성 유전자 및 HBV 폴리A를 함유하는, 2245 bp PvuII 단편에서 분리시켰다. 양쪽의 분리된 단편들을 PGKprom-neo-SV40ployA 카세트(도 17)로 대치된 SV40 prom-neo-SV40 polyA 발현 카세트를 갖는 발현 벡터 pRSV-pNeo를 제공하도록 결찰하였다. 이 플라미즈를 BGHpA를 HBVpA로 대치하도록 추가로 다음과 같이 변형시켰다: pRSVpNeo를 ScaI로 선형화시키고 XbaI로 추가로 소화시켰다. Amp 유전자 일부 및 RSV 프로모터 서열과 폴리링커 서열을 함유하는, 1145 bp 단편을 Genebank kit(Bio Inc. 101)를 사용하여 겔로부터 분리하였다. 그 다음, pRSVpNeo를 ScaI로 선형화시키고 추가로 EcoRI로 소화시키고, RGKneo 카세트를 함유하는 3704 bp 단편과 벡터 서열들을 상기와 같이 겔로부터 분리하였다. 각각 5' 말단과 3'말단에서 XbaI와 EcoRI에 의해 측면화되어 있는 HBV polyA 서열을 함유하는 세번째 단편을 다음의 프라이머 세트를 사용하여 pRSVpNeo에서 PCR 증폭으로 생성하였다:
HBV-F: 5'-GGC TCT AGA GAT CCT TCG CGG GAC GTC-3' 및
HBV-R: 5'-GGC GAA TTC ACT GCC TTC CAC CAA GC-3'.
다음 조건으로 제조사의 지시에 따라 엘롱가제 효소(LTI)로 증폭을 실시하였다: 94 ℃에서 30 초, 그 후 94 ℃에서 45초 5사이클, 42 ℃에서 1분 및 68 ℃에서 1분, 그 후 94 ℃에서 45초 30사이클, 65 ℃에서 1분 및 68 ℃에서 1분, 68 ℃에서 10분. 그 다음, 625 bp PCR 단편을 결찰하고 구조 pRSVhbvNeo(도 18)를 제공하도록 DH5α수용성 세포로 형질전환시켰다. 이 구조에서, RSV 발현 카세트의 전사조절 영역과 네오마이신 선택 마커를 종종 CMV와 SV40 전사조절 서열을 함유하는 아데노바이러스성 벡터와의 겹침을 줄이기 위해 변형시켰다.
2)Ad35-E1 발현 구조체과 공동트란스펙트된 PER.C6세포에서의 Ad35 재조합 바이러스의 생성
PER.C6 세포들을 T25 플라스크의 5 x 106세포의 밀도로 접종하고 다음날 다음을 함유하는 DNA 혼합물로 트랜스펙트하였다:
-PacI로 소화시킨 pAdApt35.LacZ 1 ㎍
-소화시키지 않은 pRSV.Ad35E1 5 ㎍
-NotI으로 소화시킨 pWE.Ad35.pIX-rITR 2 ㎍.
제조사의 지시에 따라 리포펙타민을 사용하여 트랜스펙션을 실시하였다. 트랜스펙션 혼합물을 세포에 첨가하고 5시간 후, 배지를 제거하고 새로운 배지로 교환하였다. 2일 후, 세포들을 T80 플라스크로 트랜스펙트하고 추가로 배양시켰다. 트랜스펙션 1 주일후, 배지 1ml를 A549 세포에 첨가하였고 다음날 세포들을 LacZ 발현을 위해 착색시켰다. 착색 2시간 후, 재조합 LacZ 발현 바이러스가 생성되었음을 나타내는 파란색 세포들이 뚜렷이 관찰되었다. 세포들을 추가로 배양시켰으나 CPE의 명백한 외관이 나타나지는 않았다. 그러나, 12일 후 단일층에 세포의 응집(clumps)이 나타났고 그 후 18일에 트랜스펙션 세포가 분리되었다. 그다음, 세포들과 배지를 수확하고, 1회 냉동-해동하였고 조 용해물 1 ml를 6-웰 플레이트에서 PER.C6 세포들을 감염시키기 위해 사용하였다. 감염 2일 후, 세포들을 LacZ 활성에 대해 착색하였다. 2 시간 후, 감염 세포들이 푸른색으로 착색되었다. wt 및/또는 복제 수용성 바이러스의 존재를 시험하기 위해, A549 세포들을 이들 바이러스로 감염시키고 추가로 배양하였다. CPE에 대한 사인이 발견되지 않았음은 복제 수용성 바이러스가 존재하지 않음을 나타낸다. 이들 실험들은 재조합 AdApt35.LacZ 바이러스가 Ad35-E1으로 동시-트랜스팩트된 PER.C6에서 제조되었음을 나타낸다.
3)Ad35 재조합 바이러스들이 Ad5 바이러스에 대한 중화활성을 함유하는 인간혈청에서 중화를 벗어남
그 다음, AdApt35.LacZ 바이러스들을 Ad5 바이러스에 대한 중화활성을 갖는 혈청의 존재중 감염을 조사하기 위해 사용하였다. 정제된 Ad5-기초 Lacz 바이러스가 NA에 대한 양성 대조구로서 작용하였다. 여기서, PER.C6 세포들은 2x105세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 다음날, Ad5에 대한 고 중화활성을 갖는 인간혈청 샘플을 5배 희석의 5단계로 배지에서 희석하였다. 그 다음, 희석된 혈청 0.5 ml을 AdApt5.LacZ 바이러스의 4x106바이러스 입자들과 배지 0.5 ml에서 배양 30분 후 혼합하였고, 혼합물 0.5 ml를 이중의 PER.C6 세포에 첨가하였다. AdApt35.LacZ 바이러스들의 경우, 희석된 혈청 샘플 0.5 ml를 AdApt35.LacZ 바이러스를 갖는 조 용해물 0.5 ml와 혼합하고 배양후, 이 혼합물 0.5 ml를 이중으로 PER.C6 세포에 첨가하였다. 혈청없이 배양된 바이러스 샘플을 감염의 양성 대조구로 사용하였다. 37 ℃에서 배양 2 시간 후, 배지를 최종 부피가 1ml가 되도록 첨가하고 세포들을 추가로 배양시켰다. 감염 2일 후, 세포들을 Lacz 활성에 대해 착색시켰다. 그 결과를 표 II에 나타내었다. 이들 결과로부터, AdApt5.LacZ 바이러스들은 효과적으로 중화된 반면, AdApt35.LacZ 바이러스들은 인간혈청의 존재와 무관하게 전염성으로 남은 것이 명백하다. 이것은 Ad5-기초 바이러스에 대해 NA를 갖는 인간 혈청중 재조합 Ad35-기초 바이러스가 중화를 벗어남을 증명한다.
실시예 9
헤모포이에틱(hemopoietic) CD34 Lin 줄기세포에 대한 세포형 특이성을 갖는 Ad5/섬유35 키메라 벡터
실시예 3에서, 본 발명자들은 다른 혈청형의 섬유 단백질을 장착한 Ad5 기초 아데노바이러스의 라이브러리의 생성을 기재하였다. 비-제한적 실시예로서 이 라이브러리를 사용하기 위해, 본 발명자들은 여기서 헤모포이에틱 줄기세포의 개선된 감염을 나타내는 섬유-변형된 아데노바이러스의 확인을 기재한다.
인간 골수, 제대혈, 또는 CD34 항원에 대해 양성이며 초기 분화 마커들, CD33, CD38 및 CD71(lin-)에 대해 음성인 유동 세포계수 표현형을 전달하는 유동 (mobilized) 말초혈액으로부터 분리한 세포들은 일반적으로 헤모포이에틱 줄기세포로 언급된다. 이들 세포들의 유전적 변형은 모든 헤모포이에틱 직계들이 이들 세포들로부터 유도되므로 가장 흥미있으며, 그러므로 HSC는 여러 후천적 또는 선천적 인간 헤모포이에틱 질병의 치료를 위한 표적세포이다. HSC의 유전적 변형을 위해 변형가능한 질병들의 예로서는 후를러병, 훈터병, 산필리포스병, 모기병, 가우처병, 파아버병, 나이만피크병, 크라베병, 메타크로마틱 로이코디스트로피, I-세포병, 심한 면역결실증, Jak-3 결실, 푸코시도스 결실, 탈라세미아, 및 에리트로포이에틱포피리아등이 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이들 헤모포이에틱병 이외에, 후천성 면역결실증(AIDS)과 헤모포이에틱 캔서를 예방 또는 치료하기 위한 전략들은 HSCs 또는 AIDS의 경우 CD4 양성 T 림포사이트와 같은 HSCs로부터 유도된 세포들의 유전적 변형을 기초로 한다. 그러므로, 상기 열거된 예들은 유전자 또는 단백질 결실에 대한 유전적 수준에서의 보상을 위해 DNA를 HSC로 도입하는 것을 의도한다. AIDS 또는 암에 대한 전략의 경우, HSC에 도입되어질 DNA는 항-바이러스성 유전자 또는 자살 유전자일 수 있다.
상기 열거된 예 이외에, 아데노바이러스 벡터를 사용한 HSCs의 효과적인 형질도입이 중요한 역할을 하는 여러 기타 분야가 있다. 예를 들면, 조직 엔지니어링 분야이다. 이 분야에서, 이것은 특정 직계에 대한 HSCs의 분화를 구동하는데 중요하다. 몇몇, 비-제한적 예는 T-세포 전구체 또는 내피세포 뿐만 아니라 생체외 골격형성, 연골형성, 피부형성이다. 바이오 반응기에서 골격, 연골 또는 피부의 생성은 골절 또는 척수병변 또는 심한 골격 손상 후 이식에 사용될 수 있다. 자연적으로 형질도입된 세포들은 또한 직접적으로 환자에게 재주입될 수 있다. HSCc로부터의 내피세포 전구체의 대량 생산은, 이들 내피세포 전구체들이 재주입 후, 허혈과 같은 심장맥손상 부위에 근거를 가질 수 있기 때문이다. 한편, HSCc로부터의 T-세포의 대량 생산은, 이들 T-세포 전구체들이 준비된 T-세포의 재주입 후 신체중의 특정 표적을 전멸시키기 위해, 생체외에서 준비될 수 있으므로 중요하다. 신체의 바람직한 표적은 종양들 또는 바이러스 감염된 세포들 일 수 있다.
상기 실시예들로부터, HSCs에 대한 효과적인 유전자 전달은 유전자 치료법분야에서 중요한 관심분야로 결론지을 수 있다. 그러므로, 생체내 뿐만 아니라 생체외에서 표적 HSCs에 가능한 아데노바이러스 혈청형 5 숙주세포 범위의 변경은 본 발명의 중요한 관심이다. 인간 HSCs에 대한 바람직한 감염 특성을 갖는 키메라 아데노바이러스를 확인하기 위해, 본 발명자들은 선택적인 혈청형들(혈청형 8, 9, 13, 16, 17, 32, 35, 45, 40-L, 51)로부터 섬유 분자를 전달하는 Ad5 기초 바이러스들의 라이브러리를 생성하였다. 이들 섬유 변형 라이브러리의 생성은 실시예 3에 기재되어 있다. Ad5는 참조에 따라 선택되었다. 이 라이브러리의 작은 패널을 인간 TF-1(erythroidleukemia, ATCC CRL-2003)에 대해 시험하고, 모든 생성된 키메라 바이러스들은 인간 1차 스트로마 세포들 및 인간 HSCs에서 시험하였다. 인간 TF-1 세포는 10% FCS 와 50ng/ml IL-3를 갖고 공급된 DMEM중 일상적으로 유지되었다(산도즈, 바젤, 스위스). 스트로마과 같은, 골수 아스피레이트(aspirate)로부터 분리한, 인간 1차 섬유아세포는 DMEM/10 % FCS에서 일상적으로 유지되었다. 접종 24 시간 후, 세포들을 2시간 동안, 모두 마커로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 갖는 Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib17, Ad5.Fib35, Ad5.Fib40-L, 또는 Ad5.Fib51 세포당 1000 바이러스 입자들에 노출시켰다. 2시간 후, 세포들을 PBS로 세척하고 바이러스를 첨가하지 않고 배지에 다시 접종하였다. TF-1 세포들을 24-웰 플레이트의 웰당 2 x 105세포 농도로 접종하고 2 시간 동안 다른 혈청형 아데노바이러스 1000 바이러스 입자들에 노출시켰다. 노출 2 시간 후, 세포를 세척하여 바이러스를 제거하였다. 양쪽 세포 타입들을 바이러스 노출 24시간 후 수확하고 유동 세포계수기를 사용하여GFP 발현에 대해 분석하였다. 도 19에 나타낸 TF-1 세포에 대한 결과는 혈청형 16, 35 또는 51로부터 섬유를 지니는 키메라 아데노바이러스가 Ad5 (서브그룹C), Ad5.Fib17 (서브그룹D), 또는 Ad5.Fib40-L (서브그룹F)와 비교하여 바람직한 감염 특성을 갖는다는 것을 증명한다. 1차 인간 스트로마를, 이들 세포들은 일반적으로 생체외 배양 조건에서 HSCs의 증폭과 유지를 허용하는 "공급자" 세포로서 사용되므로 시험하였다. TF-1 세포의 형질도입과 반대로, 섬유 혈청형 아데노바이러스중 어느 것도 인간 1차 스트로마를 효과적으로 형질도입할 수 없었다(도 20). 인간 섬유아세포류 1차 스트로마의 상당한 감염은, 이들 세포에 알려진 수용체 분자의 발현이 없다는 관찰에도 불구하고 오직 Ad5에서만 관찰되었다(표 Ⅲ 참조). 키메라 바이러스를 사용한 인간 스트로마의 감염이 없는 것은, 공동-배양 세팅에서, 키메라 아데노바이러스가 스트로마 "공급자" 세포에 의해 일차적으로 흡수되지 않을 것이므로 유리하다.
섬유 키메라 바이러스의 형질도입 능력을 시험하기 위해, 제대혈(3명의 개개인)의 풀(pool)을 줄기세포의 분리에 사용하였다. CD34+세포를 제조사로부터 공급된 프로토콜을 사용한 MACS 실험실 분리 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 단핵세포 조제로부터 분리하였다. CD34+중 2x105을 DMEM (혈청 없음; Gibco, Gaitherbug, MD) 150 ㎕ 부피에 접종하고, 키메라 아데노바이러스 (최종 바이러스 입자들/ 세포의 비율이 1000이 되도록) 10 ㎕를 첨가하였다. 시험된 키메라 아데노바이러스는 모두 마커로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 함유하는 Ad5, Ad5.Fib16,Ad5.Fib35, Ad5Fib17, Ad5.Fib51이었다. 세포들을 37℃에서 10% CO2의 습한 대기 중에서 2시간 동안 배양시켰다. 그 이후, 세포들을 DMEM 500 ㎕로 한번 세척하고 StemPro-34 SF 배지(Life Technoligies, Grand Island, NY) 500 ㎕에 재현탁시켰다.
그 다음, 세포들을 37 ℃에서 10 % CO2의 습한 대기 중에서, 조사된(20 Gy) 예비된 인간 골수 스트로마(ref.1)에 대해 24-웰 플레이트 (Greiner, Frickernhausen, 독일)에서 5일간 배양하였다. 5일 후, 전체 세포 개체군을 0.25% 트립신-EDTA(Gibco) 100 ㎕로 트립신화하여 수집하였다. 배양 전 후 5일 세포의 수를 세포계수기를 사용하여 결정하였다. 각 샘플에서 CD34+및 CD34++CD33, 38, 71- 세포들의 수는 회수된 세포들의 총수로부터 산출하였고 전체 개체군에서 CD34++CD33, 38,71- 세포의 확률은 FACS 분석으로 결정하였다. 형질도입 효율은 개개의 세포당 GFP의 강도로서 뿐만 아니라 GFP 발현 세포의 빈도를 구별가능한 서브 개체군을 모니터 하는 동안 FACS 분석으로 결정하였다. 도 21과 같이, 본 실험의 결과는 아데노바이러스 혈청형 5 또는 키메라 아데노바이러스 Ad5.Fib17이 GFP 발현에 의해 증명되듯이 CD34+Lin-세포들을 감염시키지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로, 혈청형 16, 51, 또는 35의 섬유 분자를 전달하는 키메라 바이러스와 함께 GFP 양성 세포들의 높은 빈도는 이 세포 개체군에서 얻어진다. CD33, CD38, 및 CD71에서 또한 발현되는 GFp 발현이, CD34+세포에서 거의 관찰되지 않기 때문에CD34Lin의 특이성이 설명된다. CD34Lin- 세포들의 하위분획화(도 22)는 Ad5.Fib16, Ad5.Fib35 또는 Ad5.Fib51을 사용한 GFP 감소에 대한 세포 백분률이, 세포들이 초기 분화 마커들 DC33(moeloid), CD71(erythroid), 및 CD38(공통의 초기 분화 마커)에 대해 점점 더 양성일 때, 양성임을 나타낸다. 그러므로, 이들 결과들은 HSCs에 대한 키메라 아데노바이러스 Ad5.Fib16, Ad5.Fib35, 및 Ad5.Fib51의 특이성을 설명한다. 도 23은 Ad16, 35 및 51로부터 유도된 키메라 B-군 섬유 단백질을 갖는 Ad5 섬유의 정렬을 나타낸다. 형질도입 과정 후 회수된 세포들의 수를 결정함에 의해, 아데노바이러스의 독성을 결정할 수 있다. CD34+Lin-뿐만 아니라 CD34+세포의 양의 회수는, 아데노바이러스 입자 1000에 대한 2 시간의 노출이, 회수된 세포의 수에 영향을 미치지 않았다는 것을 증명한다.
실시예 10
수지상 돌기 세포들의 세포 타입 특이성을 갖는 Ad5/섬유 35 키메라 벡터
수지상 돌기 세포는 1차 항원 반응을 개시하고 항원 반응의 기억 타입을 부스트(boost)하기 위해 특이화된 항원 제공 세포(APC)이다. 그들의 개발 단계에 따라, DC는 다양한 작용을 보인다: 미숙 DC는 주요 조직 적합성 복합물(MHC) Ⅰ류 및 Ⅱ류 분자들에 의해 표시를 위해 항원의 이해 및 처리에 매우 효과적인 반면, 항원 포획 및 처리에 덜 효과적인, 성숙 DC는, MHC 분자들 및 그들 세포 표면에서 공동-자극 분자의 고발현 때문에, 순수 및 기억 CD4+와 CD8+T 세포를 자극할 때 훨씬 나은 실행을 한다. 미숙 DCs는 항원의 이해 후, 임파 기관에서 T-세포 영역으로의 이동을 성숙하게 하고, 및 T-세포활성을 준비한다.
DCs는 면역 반응을 자극하는 세포이며, 면역자극 단백질, 펩타이드 또는 이들 단백질을 코드화하는 유전자를 갖는 DCs를 면역 시스템을 자극하기 위한 로딩에 오랜 흥미가 있었다. 이 전략을 위한 적용은 접종분야 뿐만 아니라 암치료분야에 있다. 지금까지, 항암 전략은 생체외에서 우선적으로 항원(단백질 또는 펩티드)에 DCs를 로딩하는 것에 집중되었다. 이들 연구는 이 공정이 세포독성 T 세포 활성의 유도를 일으킨다는 것을 나타내었다. 세포를 로딩하는데 사용된 항원은 일반적으로 종양에 특이한 것으로 확인된다. 몇몇, 비-제한적인 이와 같은 항원의 예는 흑색종에 대한, GP100, mage, 또는 Mart-1이다.
암치료 이외에 여러가지 기타 잠재적인 인간 질병이 접종을 통해 현재 예방되고 있다. 백신 전략에 있어서, "손상된(crippled)" 병원체가, 세포 제공 항원, 즉 미숙 DCs의 작용을 통해 면역 시스템에 제공된다. 백신 전략을 통한 질병 예방의 잘 알려진 예에는 간염 A, B, 및 C, 인플루엔자, 광견병, 황색열, 홍역등을 포함한다. 이들 잘 알려진 백신 프로그램 이외에, 말라리아, 에볼라, 리버 브라인드니스, HIV, 및 기타 다른 질병들을 처리하기 위한 연구 프로그렘이 개발 중이다. 여러 상기 변원체들이 "손상된" 병원체 백신의 생성에 위험하다고 알려져 있다. 그러므로, 이들 후자들은, "완전 부풀어진(full blown)" 면역 반응을 공급할 수 있고 그러므로 야생형 병원체에 의한 도전에 완전한 보호를 제공하는 이들 병원체의 단백질의 분리 및 특성화를 요구한다.
면역자극 단백질 또는 펩타이드로 DCs를 로딩하는 이 단계는 치료학적으로실행가능하다. 적어도 두개의 구별할 수 있는 기준에 맞아야 한다. 1)공정을 자동화하기 위해, 분리되고, 조종되고, 환자에게 재주입될 수 있는 다량의 DCS의 분리. 현재, 어느 제공된 공여체에서 배양된 말초 혈액 단핵세포에서와 같은 다량의 미숙 DCs를 얻는 것이 가능하다. 2)면역자극 단백질에 대한 DNA 코드화가 전달될 수 있는 DCs를 효과적으로 형질도입할 수 있는 벡터. 후자는 매우 중요한데, DCs가 임파기관까지 이동하는데 요구되는 시간이 대부분의 단백질 또는 펩타이드들이 이미 DCs로부터 방출되어 면역 준비가 불완전하게 되기 때문이다. DCs는 종말적으로 분화되고 그러므로 비-분열 세포이므로, 재조합 아데노바이러스 벡터들은 DCs에 항원에 대해 DNA 코드화를 전달한다고 고려된다. 이상적으로, 이 아데노바이러스는 수지상 돌기 세포에 대한 고친화성을 가져야하며, DCs의 생체내 형질도입이 수행될 수 있도록 숙주의 항체를 중화함에 의해 인식될 수 없어야 한다. 후자는 DCs의 생체외 조작 필요성을 없애지만 의학 공정은 현재 실시되는 백신 프로그램, 즉 근육내 또는 피하 주사와 동일하다. 그러므로, 면역원성 단백질을 코드화하는 아데노바이러스 벡터들은 면역요법과 백신에 대한 천연 보충약으로 작용하기에 이상적으로 알맞다.
상기 실시예들로부터, DCs에 대한 효과적인 유전자 전달은 유전자 치료분야의 중요한 관심이라고 결론지을 수 있다. 그러므로, 생체내 뿐만 아니라 시험관내에서 표적 DCs가 될 수 있는 아데노바이러스 혈청형 5 숙주세포 범위의 변경은 본 발명의 중요한 관심이다. 인간 DCs에 대해 바람직한 감염 특성을 갖는 키메라 아데노바이러스를 확인하기 이해, 본 발명자들은 선택적인 혈청형(혈청형 8, 9, 13,16, 17, 32, 35, 45, 40-L, 51)으로부터 섬유 분자를 전달하는 Ad5 기초 바이러스들의 라이브러리를 제작하였다. Ad5는 참조로서 선택되었다. 본 발명자들은 미숙, 성숙 DC에서 유도된 인간 단핵세포의 다른 섬유를 발현하는 재조합 키메라 아데노바이러스에 대한 감수성을 평가하였다.
건강한 기증자들로부터의 인간 PBMC를 피콜-히파큐(Ficoll-Hypaque) 밀도 원심분리를 통해 분리하였다. 단핵세포들을 FICT 표지된 항-인간 CD14 모노클로날 항체(Becton Dickinson), 항FITC. 마이크로비드 및 MACS 분리칼럼 (Miltenyi Biotec) 세포로 착색하여 CD14+세포의 풍부화에 의해 PBMC로부터 분리하였다.
이 공정은 대부분 FACS에 의해 분석된 바에 의하면 CD14+ 90% 미만인 세포 개체군을 생성한다. 세포는 태아 송아지 혈청(Gibco) 10 %, rhu GM-CSF(R&D/ITK diagnostics) 200 ng/ml, rhu IL-4(R&D/ITK diagnostics) 100n g/ml를 함유하는 RPMI-1640 배지(Ginco)를 사용한 배지에 놓고 선택일에 사이토킨을 함유하는 새로운 배지로 배양을 공급하며 7일동안 배양시켰다. 7일 후, 이 공정으로 생긴 미숙 DC는 FACS 분석에 의해 설명되듯이, 표현형 CD83-, CD14low또는 CD14-, HLA-DR+를 발현하였다. 미숙 DC는 3일동안 TNF-a 100 ng/ml를 함유하는 배지에서 세포를 배양함에 의해 성숙되었고, 여기서 그 후 그들의 세포 표면에서 CD83을 발현하였다. 파일럿 실험에서, 5.105미숙 DCs를 24-웰 플이트의 웰에 접종하였고 각 섬유 재조합 바이러스 세포당 100 및 1000 바이러스 입자들을 24 시간 노출하였다. 시험된 바이러스는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 및 Ad5 기초 섬유 키메라 바이러스:Ad5.Fib12, Ad5.Fib16, Ad5.Fib28, Ad5.Fib32, Ad5.Fib40-L (혈청형 40의 긴 섬유), Ad5.Fib49, 및 Ad5.Fib51(여기서 Fibxx는 섬유 분자가 유도된 혈청형을 나타낸다)이었다. 이들 바이러스들은 각각 서브그룹 C, A, B, D, F, D, 및 B에서 유도되었다. 24시간 후, 세포들이 용해되었고(1% Triton X-100/PBS) 루시페라제 활성을 제조사(Promege, Madison, WI, USA)에 의해 공급된 프로토콜을 사용하여 결정하였다. 도 25에 나타낸 이 실험의 결과는, 트랜스유전자의 낮은 수준의 발현에 의해 증명되듯이 미숙 DCs를 불완전하게 감염시킨다는 것을 증명한다. 반대로, Ad5.Fib16 및 Ad5.Fib51 (양쪽 B-그룹 섬유 혈청형 바이러스) 및 또한 Ad5.Fib40-L (서브그룹 F)은 루시페라제 트랜스유전자 발현을 기초로 한 미숙 DCs의 충분한 감염을 나타낸다.
두번째 실험에서, 5.105미숙 및 성숙 DC를 마커로서 LacZ 유전자를 모두 전달하는 Ad5. Ad5.Fib16, Ad5.Fib40-L, 및 Ad5.Fib51의 세포당 10000 바이러스 입자들로 감염시켰다. LacZ 발현을 CM-FDG 키트 시스템을 사용하여 제조사(Molecular probes, Leiden, 네덜란드)의 지시에 따라 유동 세포계수 분석으로 모니터하였다. 도 26에 나타낸 본 실험의 결과는, Ad5.Fib16 및 Ad5.Fib51이 미숙 및 성숙 인간 DCs에 대한 형질도입에서 Ad5보다 우수한, 상기 실험과 관련된다. 또한, 이 실험은 Ad5.Fib40-L이 Ad5.Fib16과 Ad5.Fib51 만큼 우수하지 않지만 Ad5보다는 우수한 것을 나타낸다. 이들 결과를 기초로, 본 발명가들은 B 그룹 바이러스의 섬유를 함유하는 다른 키메라 아데노바이러스, 예를 들면 Ad5.Fib11 과 Ad5.Fib35의 DCs를 감염시키는 능력을 시험하였다. 본 발명자들은 미숙 DCs에 초점을 맞추었는데, 이들이 MHC Ⅰ류와 Ⅱ류에 발현된 전이 유전자 산물을 처리하는 세포이기 때문이다. 미숙 DCs를 24 웰 플레이트에 5.105세포/웰의 세포밀도로 접종하고 세포당 1000 및 5000 바이러스 입자들로 감염기키고 세포를 용출하기전 미숙 DCs에 대한 조건에서 48시간 동안 배양하고 루시페라제 활성을 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 27과 같이, 그룹-B 바이러스의 섬유를 함유하는 Ad5 기초 키메라 아데노바이러스는 미숙 DCs를 효과적으로 감염시킨다는 것을 증명한다. 네번째 실험에서, 본 발명자들은 상기 실험과 동일하게 미숙 DCs를 다시 감염시켰으나, 이번에는 Ad5, Ad5.Fib16, 및 Ad5.Fib35를 마커유전자로서 녹색형광 단백질 전달에 사용하였다. 유동 세포계수기를 사용하여 바이러스 노출 48시간 후 측정된 GFP 발현 결과를 도 28에 나타내었고 이것은 지금까지 얻은 자료와 연관된다. 그러므로, 지금까지의 결과는 주로 서브그룹B 섬유 35,51,16 및 11로부터 유도된 선택적인 아데노바이러스로부터 섬유를 전달하는 Ad5 기초 벡터들이 인간 DCs으로 형질도입에 Ad5보다 뛰어나다는 것으로 이루어진다. 이것을 설명하기 위해, 본 발명자들은 이들 바이러스들을 마우스와 침팬치 모델에 사용할 수 있는가를 확인하기 위해 이들 동물로 부터 유도된 DCs에 시험하였다. 서브그룹 B로부터 유도된 인간 아데노바이러스에 대한 수용체는 지금까지 알려져 있지 않으므로 이 단백질이 종들간에 보존되는지 여부는 알려져 있지 않다. 양쪽 종들에 대한 미숙 DCs를 24-웰 플레이트의 웰당 105밀도로 접종하였다. 세포들을 순차적으로, 마우스 DC의 경우 Ad5, Ad5.Fib16, 및 Ad5Fib51의 세포당,및 침팬치 DCs의 경우 Ad5와 Ad5Fib35의 세포당 1000 바이러스 입자에 48시간 노출시켰다(도 29). 마우스 실험은 마커로서 루시페라제를 전달하는 바이러스로 실시하였고, Ad5와 비교하여 루시페라제 활성이 약 10 ~ 50 배 증가했음이 증명되었다. 침판지 DC는 GFP 바이러스로 감염시켰고 유동 세포계수기를 사용하여 분석하였다. 이들 결과 역시 도 29에 나타나 있으며, Ad5(3%)는 Ad5.Fib35(66.5%)와 비교하여 매우 불완전하게 침팬치 DCs를 형질도입함을 증명한다.
실시예 11
Ad11-기초한 재조합 바이러스를 생성하기 위한 플라스미드-기초한 벡터 시스템의 제조
실시예 5에 기재한 중화 실험의 결과는 Ad35처럼 Ad11은 또한 대다수의 인간 혈청 샘플에서 중화되지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, Ad11에 기초한 재조합 아데노바이러스들은 유전자 치료 처리에 대한 벡터로서 통상적으로 사용되는 Ad2 및 Ad5-기초한 벡터보다 바람직하다. Ad35 및 Ad11은 모두 B-그룹 바이러스이고 DNA 상동성 클러스터 2(Wadell, 1984)에 속하는 바이러스들로 분류된다. 따라서, Ad35 및 Ad11의 게놈들은 매우 유사하다. Ad11-기초한 재조합 바이러스를 생산하기 위한 플라스미드 기초한 시스템을 생성하기 위해서, 실시예 7에서 생성된 어댑터(adapter) 플라스미드 pAdApt35IP1은 다음과 같이 변형된다. 구조체 pAdApt35IP1은 AvrII로 소화되고 나서, 부분적으로 PacI으로 소화된다. 소화 혼합물은 겔상에서 분리되고, 발현 카세트 및 벡터 골격을 포함하는 4.4 kb 단편은 유진클린 키트(BIO 101, Inc.)를 사용하여 분리된다. 그리고 나서 제조자 지침에 따라 Pwo DNA를 사용한 프라이머 35F1 및 35R2(실시예 7 참조)를 사용하여 wtAd11 DNA상에서 PCR 증폭을 시행한다. 얻어진 0.5 kb의 PCR 단편을 PCR 정제 키트(LTI)를 사용하여 정제하고 상기 제조된 pAdApt35IP1의 단편에 결찰한다. 이것은 5' 아데노바이러스 단편이 상응하는 Ad11의 서열로 교환된 구조체 pAdApt11-35IP1을 제공한다. 다음, pAdApt11-35IP1을 BglII 및 특히 PacI으로 소화한다. 얻어진 단편들을 겔상에서 분리하고 그리고 벡터 서열, 5' 아데노바이러스 단편 및 발현 카세트를 함유하는 3.6 kb 단편을 상기한 바와 같이 겔로부터 정제한다. 다음에, wtAd11 DNA 상에서 프라이머 35F3 및 35R4(실시예 7 참조)를 사용하여 PCR 단편을 생성한다. 상기한 바와 같이 증폭을 실시하고 얻어진 1.3 kb 단편을 정제하고, BglII 및 PacI으로 소화하였다. 그리고 나서, 구조체 pAdApt11IP1을 제공하기 위해 분리된 단편을 결찰하였다. 이 어댑터 플라스미드는 이제 Ad35 서열 대신에 Ad11 서열을 함유한다. PCR 증폭된 Ad11 서열의 정확한 PCR 증폭은 이 클론 내의 서열과 상응하는 Ad11 DNA의 서열을 비교하여 증명된다. 후자는 나타낸 PCR 프라이머를 사용하여 Ad11 DNA상에서 직접 서열화에 의해 얻어진다. Ad11 골격을 함유하는 대형 코스미드 클론은 다음과 같이 생성된다. 우선, Ad35 DNA에 대해 실시예 7에서 설명된 바와 같이 Pwo DNA 폴리머라제와 함께 프라이머 35F5 및 36R6을 사용하여 Ad11 DNA상에서 PCR 단편을 증폭한다. 그리고 나서, PCR 정제 키트(LTI)를 사용하여 PCR 단편을 정제하고 NotI 및 NdeI으로 소화하였다. 유전자 청소 키트(Bio 101, Inc.)를 사용하여 생성되는 3.1 kb 단편을 겔로부터 분리한다. 그리고 나서 제조자 지침에 따라 Pwo DNA 폴리머라제와 함께 프라이머 35F7 및 35R8(실시예 7 참조)을 사용하여Ad11 DNA상에서 두번째 PCR 단편을 생성하고, PCR 정제 키트(LTI)를 사용하여 정제한다. 이 증폭된 단편은 또한 NdeI 및 NotI로 소화되고 생성되는 1.6 kb 단편은 상기한 바와 같이 겔로부터 세척된다. 그리고 나서, 두 소화된 PCR 단편을 사전에 NotI로 소화된 코스미드 벡터 pWE15와 함께 결찰하고, 제조자 지침에 따라 Tsap 효소(LTI)를 사용하여 디포스포릴화(dephosphorylate) 한다. 주입되는 두 단편들 중의 한 복사체를 갖는 한 클론을 선택한다. 4.7 kb의 단편을 제공하는 분석적 NotI 소화에 의하여 정확한 클론을 선택한다. 동일한 크기의 단편을 제공하는 프라이머 35F5 및 35R8을 사용하는 PCR 반응에 의해 확인한다. 그리고 나서, 정확한 클론을 NdeI으로 선형화하고 겔로부터 분리한다. 다음에, wtAd11 DNA를 NdeI으로 소화하고, 제조자 지침에 따라 아가라제 효소(Roche)를 사용하여 저 용융점 아가로제 겔로부터 대형 27 kb 단편을 분리한다. 그리고 나서 두 단편을 결찰하고 제조자 프로토콜에 따라 λ파지 팩키징 추출물(Stratagene)을 사용하여 패키징화 한다. STBL-2 세포들(LTI)로 감염 후 콜로니를 플레이트상에서 성장시키고, 완전한 삽입물의 존재에 대해 분석한다. 그리고 나서, 선택된 클론을 PER.C6상에서 동시-트랜스펙션에 의해 시험한다. 여기서, DNA는 NotI과 소화되고, 프라이머 35F1 및 35R4(실시예 7 참조)와 함께 Ad11 DNA상에서 생성된 2μg의 PCR 단편으로 6μg이 동시-트랜스펙션된다. 정확한 클론은 트랜스펙션후 일주일 이내에 CPE를 제공한다. 정확한 클론은 pWE.Ad11.pIX-rITR로 칭해진다.
상기한 과정을 사용하여, 외래 유전자의 삽입물에 적합한 어댑터 플라스미드로 이루어진 플라스미드-기초한 시스템 그리고 바이러스성 골격을 포함하는 대형헬퍼 단편이 생성된다. 재조합 AD11-기초한 바이러스들은 Ad35-기초한 재조합 바이러스를 위해 기재된 방법을 사용하여 제조된다.
실시예 12
환자로부터 유도된 샘플에서 아데노바이러스의 중화
실시예 1 및 실시예 5에 기재된 중화 실험에서, 모든 샘플들은 건강한 지원자로부터 유도되었다. 비-중화된 벡터의 응용중의 하나는 유전자 치료법의 영역에 있기 때문에, 유전자 치료법으로 처리를 위한 후보인 환자들의 집단에서 낮은 빈도 및 낮은 역가로 Ad35가 또한 중화되는지를 조사하는 것은 흥미롭다.
- 심장-혈관 질병 환자
26쌍의 혈청 및 심장 유체(PF) 샘플을 심장 질환이 있는 환자로부터 유도하였다. 이것들은 실시예 1에서 설명된 중화 분석을 사용하여 Ad5 및 Ad35에 대하여 시험되었다. 결과는 건강한 지원자로부터 유래한 샘플로 이전의 데이타를 확인하였다. 70%의 혈청 샘플은 Ad5에 대해서는 NA, Ad35에 대해서는 4%를 함유하였다. 심장 유체 샘플에서, 역가는 Ad5에 대해서는 NA이고 Ad35에 대해서는 없는, 총 40%의 더 낮은 결과를 야기하였다. PF 및 혈청에서 NA 사이에는 우수한 상관관계가 있고 즉, 쌍을 이룬 혈청 샘플에서 NA없는 양성 PF 샘플은 없었다. 이 결과들은 Ad35에 기초한 비-중화된 벡터들이 심장-혈관 질병의 치료용 Ad5 벡터보다 바람직하다는 것을 나타낸다. 이 적용에서 모든 형태의 비-중화된 벡터들에 적용되듯이, 벡터는 비-중화된 혈청형의 게놈에 기초하거나 또는, 비-중화된 혈청형의 적어도 주요 캡시드 단백질(헥손, 펜톤 및 임의적으로 섬유)을 표현하더라도 Ad5(또는, 다른 혈청형)에 기초할 수 있다.
- 류머티즘 관절염 환자들
관절염의 기초를 이루는 분자 결정인자는 아직 공지되지는 않았지만, T-세포 기능 장애 및 관절에서 불균형한 성장 인자 생산 모두가 염증 및 활액 조직의 이상 증폭을 야기하는 것으로 알려져 있다. 활액세포는 증폭을 개시하고 연골 및 뼈에 침입하여 이 조직들의 파괴를 야기한다. 현존하는 치료는 항-염증 약제(항-TNF, IL1-RA, IL-10) 및/또는 통상적인 약제(예를 들어, MTX, 술파살라진)의 투여로 개시된다(초기 단계일때). 후기 단계에서 RA 활막 절제는 수술, 조사 또는 화학약품 개입에 기초하여 시행된다. 다른 방법 또는 부가적인 선택은 아데노바이러스성 벡터가 환자의 관절에 직접 전달되어 항-염증 약제 또는 자기불활화 유전자를 발현하는 유전자 치료법을 통한 치료이다. 콜라겐-유도 관절염으로 고생하는 리서스(rhesus) 원숭이에서 시행된 종전의 연구들은 표지 유전자를 운반하는 Ad5-기초한 벡터가 활액 세포를 형질도입할 수 있다고 나타내 왔다. 인간의 경우에서 아데노바이러스성 전달이 NA의 존재에 의해 방해되는지는 알려져 있지 않다. RA 환자들의 활액 유체(SF)내에 NA의 존재를 조사하기 위해, SF 샘플을 류머티즘 관절염(RA)으로 고생하는 임의로 선택된 53명의 환자들로부터 얻었다. 실시예 1에서 설명된 바와 같은 중화 분석을 이용하여 이것들을 여러 wt 아데노바이러스에 대해 실험하였다. 이 선별의 결과를 표 3에 나타내었다. 아데노바이러스 유형 5는 72%의 SF 샘플에서 중화된다고 발견되었다. 이 샘플들의 대부분은 중화된 Ad5 바이러스로 시험된(x64) SF 샘플의 가장 높은 희석에서처럼 높은 역가의 NA를 함유한다. 이것은 RA 환자의 관절에서 활액 세포로의 아데노바이러스성 벡터의 전달이 매우 비효율적인 것을 의미한다. 더욱이, SF에서 역가는 매우 높기 때문에, 벡터 주입전에 관절의 정제가 충분할 만큼의 NA를 제거할지는 의심스럽다. 시험된 다른 혈청형 중에 단지 4%의 샘플에서만 Ad35가 중화되는 것으로 보였다. 따라서, 이 데이타들은 건강한 환자로부터 유래한 혈청 샘플에서 얻어진 결과에 일치하고, 류머티즘 관절염의 치료를 위해, Ad35-기초한 벡터 또는 Ad35에서 유래한 적어도 일부의 캡시드 단백질을 보이는 키메라 벡터가 바람직하다는 것을 나타낸다.
실시예 13
Ad35-기초한 바이러스의 골격에서 변형
1) pBr/Ad35.Pac-rITR 및 pBr/Ad35.PRn의 생성
실시예 4는 Ad35 서브클론 pBr/Ad34.Eco13.3의 생성을 기재하고 있다. 이 클론은 bp 21493에서 pBr322의 EcoRI 및 EcoRV 부위로 클론된 우측 ITR의 말단까지의 Ad35 서열을 포함한다. 이 서열들을 Ad35내의 bp 18137에 위치한 PacI 부위로 연장하기 위해서, pBr/Ad35.Eco13.3(실시예 4 참조)을 AatII 및 SnaBI로 소화하고, QIAEX II 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 대형 벡터-함유 단편을 겔로부터 분리하였다. Ad35 wt DNA를 PacI 및 SnaBI로 소화하고, 4.6 kb 단편을 상기와 같이 분리하였다. 그리고 나서, 이 단편을 PacI 및 ActII 돌출부를 함유한 이중-가닥(ds) 링커에 결찰하였다. 이 링커는 다음의 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 후에 얻어졌다:
A-P1: 5'-CTG GTG GTT AAT-3'
A-P2: 5'-TAA CCA CCA GAC GT-3'
ds 링커 및 PacI-SnaBI Ad35 단편을 함유한 결찰 혼합물을 LMP 겔상의 비결찰된 링커와 분리하였다. 4.6 kb 밴드를 겔에서 절단하고, 65℃에서 용융시키고, 그리고 나서 AatII 및 SnaBI로 소화된 정제된 pBr/Ad35.Ecol13.3 벡터 단편에 결찰하였다. 결찰물을 전기적 수용성 DH10B 세포(Life Technologies Inc.)로 형질전환하였다. 생성되는 클론인 pBr/Ad35.Pac-rITR은 bp 18137에서 PacI 부위부터 우측 ITR까지의 Ad35 서열을 함유한다.
다음에, 독특한 한정 부위를 3' 말단 또는 우측 ITR에 주입하여 벡터 서열로부터 ITR을 유리할 수 있게 하였다. 여기서, bp 33165에서 NdeI 부위부터 rITR에 부착된 한정 부위 SwaI, NotI 및 EcoRI을 갖는 곧은 ITR까지 포함하는 PCR 단편을 사용하였다. PCR 단편은 프라이머 35F7 및 35R8(실시예 7에 기재된)을 사용하여 생성하였다. 정제 후, PCR 단편들을 AT 클로닝 벡터(Invitrogen)로 클론하고 정확한 증폭을 입증하기 위해 서열화하였다. 그리고 나서, 정확한 증폭된 클론을 EcoRI로 소화하고 클레노우 효소로 둔단시키고, 그리고 나서 NdeI로 소화하고 PCR 단편들을 분리하였다. 유사하게, pBr/Ad35.Pac-rITR내의 pBr 벡터내의 NdeI을 다음과 같이 제거하였다: NdeI 부위가 NdeI으로 소화, 클레노우 처리 및 재결찰에 의해 제거된 pBr322 벡터를 AatII 및 NheI로 소화하였다. LMP 겔에서 벡터 단편을 분리하고, 또한 LMP 겔에서 분리된 pBr/Ad35.Pac-rITR에서 유래한 16.7 kb Ad35 AatII-NheI에 결찰하였다. 이것은 pBr/Ad35.Pac-rITR.ΔNdeI을 생성하였다. 다음 pBr/Ad35.Pac-rITR.ΔNdeI을 NheI로 소화하고, 말단을 클레노우 효소를 사용하여 채우고, 그리고나서, DNA를 NdeI로 소화하였다. 벡터 및 Ad35 서열을 함유하는 대형 단편을 분리하였다. 이 벡터 단편 및 PCR 단편의 결찰은 pBr/Ad35.PRn을 야기하였다. 이 클론 특이적 서열에서 섬유, E2A, E3, E4 또는 헥손에 대한 코드화는 조작될 수 있었다. 추가로, 예를 들어 E4 단백질 또는 E2를 구동하는 프로모터 서열이 돌연변이 되거나 또는 결실되고, 이종성 프로모터로 교환된다.
2) 다른 혈청형에서 유래한 섬유 단백질을 갖는 Ad35 기초한 바이러스의 생성
아데노바이러스는 다른 효율로 인간 세포들을 감염시킨다. 감염은 두 단계 공정에 의해 달성되며, 다음을 포함한다: 1. 세포상의 특이한 수용체로 바이러스의 결합을 중개하는 섬유 단백질, 및 2. 세포 표면에 존재하는 인터그린에 대한 예를 들어 RGD 서열의 상호작용에 의한 내부화를 중개하는 펜톤 단백질. Ad35가 구성성분인 서브그룹 B 바이러스에서, 섬유 단백질에 대한 세포 수용체는 알려져 있지 않다. Ad5같은 서브그룹 C 바이러스와 비교할 때, 서브그룹 B 바이러스의 사람 세포의 감염 효율에는 현저한 차이가 있다(WO 0/03029 및 EP 99200624.7을 참조). 어떤 인간 세포의 하나의 서브그룹 감염 효율내에서도 다양한 혈청형간의 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, Ad5-기초 재조합 바이러스상에 존재할때 Ad16의 섬유는 Ad35 또는 Ad51의 섬유를 운반하는 Ad5 키메라 바이러스보다 주요 내피 세포, 민무늬근육 세포, 인간의 활액 세포 및 리서스 원숭이 근원을 잘 감염시킨다. 따라서, Ad35-기초 바이러스의 높은 감염 효율을 얻기 위해서는, 다른 혈청형의 섬유 단백질에 대한 섬유 단백질을 변화시킬 필요가 있을 수 있다. 그런 섬유 키메라를 위한기술은 실시예 3에서 Ad5-기초 바이러스에 대하여 기재되어 있고, Ad35 바이러스에 대하여 하기에 예시화된다.
우선, 다음과 같이 구조체 pBr/Ad35.PRn내의 Ad35 골격으로부터 대부분의 섬유 서열을 결실하였다:
좌측 측면상의 서열 및 특유의 MluI 부위의 상류에 bp 30225로부터 섬유 후미(tail)의 bp 30872(도 6에 개시된 바와 같은 wt Ad35 서열에 따른 번호)까지의 영역인 Ad35내의 섬유 단백질의 일부를 다음의 프라이머들을 사용하여 증폭하였다.
DF35-1: 5'-CAC TCA CCA CCT CCA ATT CC-3'
및
DF35-2: 5'-CGG GAT CCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA GG-3'
이 PCR 증폭은 섬유 유전자 후미의 특유한 BsiWI 부위를 도입한다.
bp 31798에서 섬유 단백질의 말단으로부터 bp 33199(도 6, wtAd35 서열에 따른 번호)까지의 영역인 우측 측면상의 서열, 특유의 NdeI 부위에서 3'은 다음의 프라이머를 사용하여 증폭되었다.
DF35-3: 5'-CGG GAT CCG CTA GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAA TCA C-3'
및
DF-35-4: 5'-CCA GTT GCA TTG CTT GGT TGG-3'.
이 PCR은 섬유 서열을 대신하여 특유의 NheI 부위를 도입한다. PCR 증폭은 제조자 지침에 따라 Pwo DNA 폴리머라제 (Roche)로 시행되었다. 증폭후 PCR 정제키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 단편들을 BamHI로 소화하고 같이 결찰하였다. 2kb 결찰된 단편들을 겔로부터 정제하고, PCR 스크립트 Amp 벡터 (Stratagene)에 클론하였다. 서열화에 의해 정확한 증폭을 점검하였다. 그리고 나서, PCR 단편을 MluI/NdeI 단편으로 절개하고 동일 효소로 소화된 pBr/Ad35.PRn에 클론하였다. 이는 다른 방법의 혈청형의 섬유 서열을 도입하는데 적합한 셔틀 벡터인 pBr/Ad35.PRΔfib를 생성한다. 이 계획은 WO 00/03029에 기재된 Ad5-기초 바이러스에 대한 섬유 변형 계획과 유사하다. 그러한 응용의 표 1에 목록화된 프라이머들은 아데노바이러스의 다양한 서브그룹의 섬유 서열을 증폭하는데 사용되었다. pBr/Ad35.PRΔfib에 클론된 섬유의 증폭을 위해 동일한(변성) 프라이머 서열이 사용될 수 있지만, 앞부분의 프라이머(후미 올리고뉴클레오티드 A 에서 E)내의 NdeI 부위는 BsiWI 부위로 변화되어야 하고, 뒷부분 올리고(두부(knob) 올리고뉴클레오티드 1 에서 8)는 NheI 부위에서 변화되어야 한다. 따라서 섬유 16 서열들은 다음의 퇴화 프라이머들을 사용하여 중폭된다:
5'-CCK GTS TAC CCG TAC GAA GAT GAA AGC-3' 및 5'-CCG GCT AGC TCA GTC ATC TTC TCT GAT ATA-3'. 그리고 나서, 증폭된 서열들을 BsiWI 및 NheI로 소화하고, pBr/Ad35.PRfib16을 생성하기 위해 동일한 효소로 소화된 pBr/Ad35.PRΔfib로 클론하였다. 그리고 나서, 후자의 구조체을 PacI 및 SwaI로 소화시키고, 삽입물은 겔에서 분리된다. 그리고 나서, 변형된 섬유와 함께 PacI/SwaI Ad35 단편을 pWE/Ad35.pIX-rITR의 상응하는 부위로 클론하여 pWE/Ad35.pIX-rITR.fib16을 생성한다. 그리고 나서 이 코스미드 골격은 Ad16의 섬유를 나타내는 Ad35 재조합 바이러스를 생성하기 위한 Ad35-기초 어댑터 플라스미드와 함께 사용될 수 있다. 다른 섬유 서열이 상기한 바와 같이 (변성) 프라이머로 증폭될 수 있다. 섬유 서열들 중의 하나가 내부 BsiWI 또는 NheI 부위를 갖는 것으로 밝혀지면, PCR 단편은 그 효소로 부분적으로 소화되어야 한다.
3) 유도 가능하고, E1 의존적이고, E4 발현을 갖는 Ad35-기초한 바이러스의 생성
아데노바이러스 E4 프로모터는 E1 단백질의 발현에 의해 활성화된다. Ad5 E1 단백질이 Ad35 E4 프로모터의 활성화를 중재할 수 있는지는 알려져 있지 않다. 따라서, PER.C6 세포상에서 Ad35 재조합 바이러스의 생산이 가능하게 하기 위해, E1에 비의존적인 E4를 발현하는 것이 유리할 수도 있다. 이것은 한정된 것은 아니지만, 7xTetO 프로모터같은 이종성 프로모터에 의해 Ad35-E4 프로모터를 치환하여 달성될 수 있다. 재조합 E1-결실된 Ad5-기초한 벡터들은 E1 발현의 부재에도 불구하고, 표적 세포내의 벡터 골격에서 유래한 바이러스성 유전자의 잔여 발현을 갖는다고 보여왔다. 바이러스성 유전자 발현은 독성을 증가시키고, 그리고 감염된 세포에 대한 숙주 면역 반응을 유발할 수 있다. 유전자 치료 및 백신화의 영역에서 아데노바이러스성 벡터의 대부분의 적용에 대해서, 골격으로부터 바이러스성 유전자의 발현을 감소시키거나 줄이는 것이 요구된다. 이것을 달성하기 위한 한 방법은 바이러스성 골격에서 유래한 서열을 모두 또는 가능한 많이 결실하는 것이다. E2A, E2B 또는 E4 유전자 및/또는 말기 유전자 기능을 결실함으로써 생산시 이 기능들을 보충해야 한다. 이 보충은 헬퍼 바이러스에 의해서 또는 유도가능한 전사 조절이 있거나 없거나 이 기능들을 생산자 세포에 안정적으로 첨가하여 될 수 있다. 이것을 달성하기 위한 방법은 Ad5에 대하여 기재되어 왔고, 당기술 분야에 공지되어 있다. 한 특이적인 방법은 E4 프로모터를 표적 세포에서 활동적이지 않은 프로모터 서열들로 치환하는 것이다. E4 단백질들은 예를 들어 E2 프로모터의 활성화를 통한 아데노바이러스의 복제 및 스플라이싱의 조절과 말기 유전자 전사의 핵 반출을 통한 말기 유전자 발현의 역할을 한다. 부가적으로, 적어도 E4 단백질의 일부는 세포에 유독하다. 따라서, 표적 세포에서 E4 발현의 감소 또는 제거는 또한 Ad35-기초한 벡터를 개선할 것이다. 이것을 달성하는 한 방법은 E4 프로모터를 표적 세포에서 비활성인 이종성 프로모터로 치환하는 것이다. 표적 세포에서 비활성인 이종성 프로모터/인핸서의 한 예로는 테트라사이클린 유도가능한 TetO 시스템(Gossen and Bujard, 1992)이 있다. 다른 원핵성 또는 합성 프로모터/인핸서 시스템이 사용될 수 있다. 이 예에서, 바이러스성 벡터의 골격내에 E4 프로모터는 tet 오페론에서 유래한 테트라사이클린 반응 요소의 7 반복(7xTetO)을 함유하는 DNA 단편에 의해 치환된다. 이 프로모터를 위한 강력한 트랜스액티베이터는 tet 억제제의 DNA 결합 영역 및 VP16(Tet 트랜스액티베이터 단백질, Tta)의 활성화 영역을 포함하는 융합 단백질이다. E1 발현에 비의존적인 강력한 E4 발현은 Tta를 발현하는 PER.C6 세포에서 달성될 수 있다. 발현하는 PER.C6 세포들은 생성되고 기재되어왔다(실시예 15 참조). 7xTetO의 조건하에 E4가 있는 Ad5 유도된 E1-결실된 바이러스는 생성될 수 있고, 이 세포들상에서 번식된다. 인간 또는 동물 근원(Tta 트랜스액티베이터를 발현하지 않는)의 세포들내의 감염후에, 보통 E4 프로모터가 있는 E1 결실된 바이러스와 비교하여 E4 발현은 크게 감소된 것이 발견되었다.
E4 프로모터 치환으로 바이러스를 생산하기 위한 코스미드 헬퍼 벡터인 pWE/Ad35.pIX-rITR.TetO-E4의 구성이 하기에 기재된다.
첫째, 다음의 프라이머들을 사용하여 pBr/Ad35.PRn DNA 상에서 PCR 증폭에 의해 단편을 생성하였다:
355ITR: 5'-GAT CCG GAG CTC ACA ACG TCA TTT TCC CAC G-3'
및
353ITR: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT C-3'
이 단편은 bp 34656(wtAd35에 따른 번호)과 pBr/Ad35.PRn내의 우측 ITR의 NotI 부위 3' 사이의 서열을 포함하고, 우측 ITR 서열의 SstI 부위 5'를 도입한다.
두번째 PCR 단편은 다음의 프라이머들을 사용하여 pBr/Ad35.PRn DNA 상에서 생성하였다:
35DE4: 5'-CCC AAG CTT GCT TGT GTA TAT ATA TTG TGG-3' 및
35F7: 실시예 7 참조.
이 PCR은 bp 33098과 34500(wtAd35에 따른 번호)사이의 Ad35 서열을 증폭하고, E4 Tata-box의 상부에 HindIII 부위로 도입한다. 이 두 PCR 반응으로 E4 프로모터의 우측- 및 좌측-측면 서열이 증폭된다. 증폭을 위해, 제조자 지침에 따라 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하였다. 7xTetO 프로모터를 함유한 세번째 단편을 SstI 및 HindIII로 소화에 의한 구조체 pAAO-E-TATA-7xTetO에서 제거하였다. pAAO-E-TATA-7xTetO의 생성은 하기에 기재된다. 첫번째 PCR 단편(355/353)을 SstI 및 NotI로 소화하고 7xTetO 단편에 결찰하였다. 그리고 나서, 결찰 혼합물을 HindIII 및 NotI로 소화하고, 0.5 kb 단편을 겔에서 분리하였다. 두번째 PCR 단편(35DE4/35F7)을 NdeI 및 HindIII로 소화하고 겔 정제하였다. 그리고 나서, pBr/Ad35.PR.TetOE4를 생성하기 위해 NdeI 및 NotI로 소화된 pBr/Ad35.PRn으로 이 두 단편들을 결찰하였다. 그리고 나서, pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4를 생성하기 위해 pBr/Ad35.PR.TetOE4에서 유래한 것으로 후자의 PacI/SwaI 단편을 치환하여 E4 프로모터의 변형을 Ad35 헬퍼 코스미드 클론으로 전달하였다. pAAO-E-TATA.7xTetO는 다음과 같이 생성하였다. 두 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
TATAplus: 5'-AGC TTT CTT ATA AAT TTT CAG TGT TAG ACT AGT AAA TTG CTT AAG-3' 및
TATAmin: 5'-AGC TCT TAA GCA ATT TAC TAG TCT AAC ACT GAA AAT TTA TAA GAA-3' (명시된 서열들은 변형된 TATA box를 형성한다).
HindIII 소화된 DNA에 필적하는 5' 돌출부가 있는 이중 가닥 DNA 단편을 생산하기 위해 올리고뉴클레오티드를 어닐링하였다. 어닐링 반응의 생성물을 pAAO-E-TATA를 생산하기 위한 HindIII 소화된 pGL3-증폭제 벡터(Promega)로 결찰하였다. 저장된 삽입물의 5' 말단에서 HindIII 부위를 갖는 클론을 다시 클로닝하기 위해 선택하였다.
다음에, 제조자 지침에 따라 확장 PCR 시스템(Roche)을 사용하여 PCR 반응내의 플라스미드 pUHC-13-3(Gossen and Bujard, 1992)으로부터 헵타머화된 (heptamerized) tet-오퍼레이터 서열을 증폭하였다. 다음의 프라이머들을 사용하였다:
tet3: 5'-CCG GAG CTC CAT GGC CTA ACT CGA GTT TAC CAC TCC C-3'
tet5: 5'-CCC AAG CTT AGC TCG ACT TTC ACT TTT CTC-3'
증폭된 단편들을 SstI 및 HindIII로 소화하고(이 부위들은 각각 tet3 및 tet5에 존재한다), SstI/HindIII 소화된 pAAO-E-TATA로 클론하여 pAAO-E-TATA-7xtetO를 생성한다.
생성된 pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 코스미드 클론의 기능성을 시험하기 위해서, DNA를 NotI로 소화하였다. 그리고 나서, 프라이머 35F1 및 35R4(실시예 7 참조)를 사용하여 wtAd35 DNA를 증폭하였다. 증폭 후에, PCR 혼합물을 정제하고, 본래의 바이러스성 DNA를 제거하기 위해서 SalI로 소화하였다. 그리고 나서 4g의 소화된 pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 및 PCR 단편 모두를 하루 전에 T25내에 접종된 PER.C6-tTA 세포로 동시-트랜스펙트하였다. 이틀 후에 트랜스펙트된 세포들을 T80 플라스크로 이동시키고, 다시 이틀 후에 코스미드 골격이 기능성인 CPE를 얻었다.
실시예 14
E1-결실된 Ad35 바이러스를 보충할 수 있는 세포주의 생성
pIG35 및 pIG270의 생성
구조체 pIG.E1A.E1B는, 인간 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(PGK)에 작동가능하게 결합된 wt Adb 서열(Genbank 접근 번호 M72360)의 뉴클레오티드 459에서 3510에 상응하는 Ad5의 E1 영역 서열 및 B형 간염 바이러스 폴리A 서열을 포함한다. 이 구조체의 생성은 WO97/00326에 기재되어 있다. Ad5의 E1 서열을 다음과같이 상응하는 Ad35의 서열로 치환하였다. pRSV.Ad35-E1(실시예 8에 기재된)을 EcoRI 및 Sse8387I로 소화하고, Ad35 E1 서열에 상응하는 3 kb 단편을 겔에서 분리하였다. 구조체 pIG.E1A.E1B를 Sse8387I 및 특히 EcoRI로 완전히 소화하였다. Ad5 E1 영역은 없지만 PGK 프로모터를 보유하는 벡터 서열에 상응하는 4.2 kb 단편을 LMP 아가로스 겔상의 다른 단편들로부터 분리하고, 정확한 밴드를 겔에서 절단하였다. 두 얻어진 단편들을 결찰하여 pIG.Ad35-E1을 생성하였다. 이 벡터는 pUC119 벡터 골격내에 존재하는 LacZ 서열을 제거하기 위해 다시 변형되었다. 여기서, 벡터는 BsaAI 및 BstXI로 소화하고, 대형 단편을 겔에서 분리하였다. 다음의 두 올리고를 어닐링하여 이중 가닥 올리고를 제조하였다:
BB1: 5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3' 및
BB2: 5'-GTG Gcc TAG GCA C-3'
올리고 및 벡터 단편의 결찰은 구조체 pIG135를 생성하였다. 올리고의 정확한 삽입물은 BsaAI 및 BstXI 부위를 복원하고 특유한 AvrII 부위를 도입한다. 다음에, 우리는 pIG135내의 Ad35-E1 발현 카세트의 3' 말단에서 특유한 부위를 도입하였다. 여기서, 구조체을 SapI로 소화하고 3' 돌출 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단화하였다. 이렇게 해서 처리된 선형 플라스미드를 다시 BsrGI로 소화하고, 단편을 함유하는 대형 벡터를 겔에서 분리하였다. HBVpolyA 서열의 3' 말단을 회복하고 특유한 부위를 도입하기 위해서, 다음의 프라이머들을 사용하여 PCR 단편을 생성하였다:
270F: 5'-CAC CTC TGC CTA ATC ATC TC-3' 및
270R: 5'-GCT CTA GAA ATT CCA CTG CCT TCC ACC-3'
제조자 지침에 따라 Pwo 폴리머라제(Roche)를 사용하여 pIG.Ad35.E1 DNA상에서 PCR을 시행하였다. 얻어진 PCR 생성물을 BsrGI으로 소화하고, BsrGI 부위에서 삽입물 이량체화를 예방하기 위해 Tsap 효소(LTI)를 사용하여 디포스포릴화 하였다. 구조체 pIG270을 생산하기 위해, PCR 단편 및 벡터 단편을 결찰하였다.
Ad35 E1 서열들은 래트 초기 세포를 형질전환할 수 있다.
1 주일의 임신에서 새로 태어난 WAG/RIJ 래트를 희생시키고, 신장을 분리하였다. 주의 깊게 막을 제거한 후, 37℃의 트립신/EDTA(LTI)에서 여러 차례 인큐베이션하고, 1% FBS를 함유한 차가운 PBS내의 부유 세포를 모아서 단일 세포 현탁액이 되도록 신장을 분해하였다. 대부분의 신장이 트립신화 되었을때, 모든 세포들을 10% FBS로 보충되고, 무균성 치즈 클로스(cheese cloth)를 통하여 여과된 DMEM 내에 재현탁하였다. 한 신장에서 얻은 새끼 래트 신장(BRK) 세포를 5 디쉬(dish) (Greiner, 6 ㎝)에 플레이트하였다. 70-80%의 융합에 도달했을 때, 제조자 지침에 따라 CaPO4침전 키트(LTI)를 사용하여 세포들을 1 또는 5㎍ DNA/디쉬로 트랜스펙트하였다. 생성되는 구조체을 개별적인 트랜스펙션에 사용하였다: pIG.E1A.E1B(Ad5-E1 영역을 발현하는), pRSV.Ad35-E1, pIG.Ad35-E1 및 pIG270(Ad35-E1을 발현하는 후자). 형질전환된 세포들의 병소가 보일 때까지 37℃, 5% CO2에서 세포들을 인큐베이트하였다. 표 4는 환형 또는 선형 DNA를 사용한 여러 트랜스펙션 실험에서 유래한 병소의 수를 나타낸다. 기대한 대로, Ad5-E1 영역이 효율적으로 BRK 세포들을형질전환하였다. 낮은 효율이지만 Ad35-E1 트랜스펙트된 영역에서도 병소는 보였다. Ad35 형질전환된 병소는 더 지난 시간 점에서 나타났다: Ad5-E1의 경우 7-10일인 것과 비교할 때 트랜스펙션후 ~2 주. 이 실험들은 B군 바이러스 Ad35의 E1 유전자들이 초기 설치류 세포들을 형질전환할 수 있다는 것을 명백하게 나타낸다. 이것은 Ad35-E1 발현의 기능성이 B-군 바이러스 Ad3 및 Ad7(Dijkema, 1979)의 형질전환 능력의 초기 발견을 구축하고 확인한다는 것을 입증한다. 병소내의 세포들이 실제로 형질전환되는지를 시험하기 위해, 몇개의 병소를 골라내어 확장시켰다. 선택된 7 병소 중에서 적어도 5가 확립된 세포주로 성장된다고 판명되었다.
초기 인간 아미노사이트에서 유도된 신규한 팩키징 세포들의 생성
아미노센테시스(aminoscentesis)후 얻어진 양수를 원심분리하고 세포들을 AminoMax 배지(LTI)에 재현탁하고, 37℃ 및 10% CO2에서 조직 배양 플라스크내에 배양하였다. 세포들이 우수하게 성장했을 때(대략 하나의 세포 분할/24시간), 배지를 AmnioMax 완전 배지와 Glutamax 1(말단 농도 4mM, LTI), 글루코스(말단 농도 4.5g/ℓ, LTI) 및 10% FBS로 보충된 DMEM 저 글루코스 배지(LTI)의 1:1 혼합물로 치환하였다. 트랜스펙션을 위해, ~ 5 x 105세포들을 10 ㎝ 조직 배양 디쉬에 플레이트하였다. 다음 날, 제조자 지침에 따라 CaPO4 트랜스펙션 키트(LTI)를 사용하여 20 ㎍의 환형 pIG270/디쉬로 세포들을 트랜스펙트하고, 세포들을 DNA 침전으로 밤새 인큐베이트하였다. 다음 날, 침전을 제거하기 위해 PBS로 세포들을 4회 세척하고, 형질전환된 세포들의 병소가 나타날 때까지 3주이상 다시 인큐베이트하였다. 일주일에 한번씩 배지를 신선한 배지로 교환하였다. 한정하는 것은 아니지만, LipofectAmine (LTI) 또는 PEI(폴리에틸렌아민, 고 분자량, 무수성, Aldrich)같은 다른 트랜스펙션 제제를 사용하였다. 이 세가지 제제들 중, PEI가 초기 인간 아미노사이트에 가장 우수한 트랜스펙션 효율을 보였다: pAdApt35.LacZ.의 트랜스펙션 후 48시간 ~1% 파란 세포.
병소를 다음과 같이 분리하였다. 배지를 제거하고 PBS로 치환하고, 그후에 쓰고 버릴 수 있는 필터 팁이 있는 50-200㎕ Gilson 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 긁어내어 병소를 분리하였다. 10㎕ PBS에 함유된 세포들은 15㎕ 트립신/EDTA (LTI)를 함유한 96-웰 플레이트내로 이동시키고 위아래로 피펫팅하고 실온에서 짧게 인큐베이션 하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 상기한 AmnioMax 완전 배지와 보충물 및 10% FBS가 있는 DMEM의 1:1 혼합물 200㎕를 첨가후, 세포를 다시 인큐베이트하였다. 계속하여 성장한 클론을 확장하고 그리고 다른 서브그룹, 특히 Ad35 또는 Ad11에서 유래한 B-그룹 바이러스에서 특별히 유도된 것들의 E1-결실된 아데노바이러스성 벡터의 성장을 보충하는 능력을 분석하였다.
인간 배아 망막아세포에서 유래한 새로운 팩키징 세포주의 생성
유산된 태아의 눈으로부터 인간 망막 세포를 분리하고, 10% FBS(LTI)가 보충된 DMEM 배지(LTI)에서 배양하였다. 트랜스펙션 전날, ~5 x 105세포들을 6㎝ 디쉬에 플레이트하고 밤새 37℃ 및 10% CO2에서 배양하였다. 제조자 지침에 따라 CaPO4침전을 사용하여 트랜스펙션을 시행하였다. 각각의 디쉬를 환형 플라스미드로서 또는 정제된 단편으로서의 8-10㎍ pIG270 DNA로 트랜스펙트하였다. 정제된 단편을 얻기 위해서, pIG270을 AvrII 및 XbaI으로 소화하고, Ad35 E1 발현 카세트에 상응하는 4 kb 단편을 아가라제 처리(Roche)에 의해 겔에서 분리하였다. 다음 날, 무균성 PBS로 주의깊게 4회 세척하여 침전을 제거하였다. 그리고 나서, 신선한 배지를 첨가하고, 형질전환된 세포들의 병소가 나타날 때까지 트랜스펙트된 세포들을 다시 배양하였다. 충분히 다량(>100 세포)의 병소를 골라내어 상기한 바와 같이 96-웰로 이동시켰다. 계속하여 성장한 형질전환된 인간 배아 망막아세포를 확장시키고, 다른 서브그룹, 특히 Ad35 또는 Ad11에서 유래한 B-군 바이러스에서 특별히 유도된 것들의 E1-결실된 아데노바이러스성 벡터의 성장을 보충하는 능력을 시험하였다.
PER.C6에서 유도된 새로운 팩키징 세포주
실시예 8에서 상기한 바와 같이, Ad35-E1 발현 구조체, 예를 들어 pRSV.Ad35.E1의 동시-트랜스펙션으로 PER.C6상에서 Ad35 E1-결실된 바이러스들을 생성하고 성장시키는 것이 가능하다. 그러나, 각각의 증폭 단계에서 Ad35-E1 구조체의 트랜스펙션이 필요하기 때문에 이 방법을 사용한 재조합 바이러스의 대규모 생산은 부담스럽다. 부가적으로, 이 방법은 E1 서열을 혼입하여 복제 능력이 있는 바이러스를 야기하는 재조합 바이러스의 높은 발생 기회가 있으며, 플라스미드와 바이러스 게놈간의 비-상동성 재조합의 위험을 증가시킨다. 이것을 피하기 위해, 게놈내 발현 플라스미드의 통합된 복사체에 의하여 PER.C6에서 Ad35-E1 단백질의 발현이 중개되어야 한다. PER.C6 세포들은 이미 형질전환되고 Ad5-E1 단백질을 발현하기 때문에, 여분의 Ad35-E1 발현의 추가는 세포에 대해 유독할 수 있다. 그러나, Ad5-E1 발현 A549 세포들은 생성되어 왔기 때문에, 형질전환된 세포들을 E1 단백질로 안정적으로 트랜스펙트하는 것이 불가능하지는 않다.
서브그룹 B 바이러스 Ad7에서 유도된 재조합 아데노바이러스를 생성하기 위한 시도에서, Abrahmsen et al. (1997)은 wt Ad7의 오염 없이 293 세포들에서 E1-결실된 바이러스를 생성할 수 없었다. 293-ORF6 세포들에서 플라크(plaque) 세척 후 선택된 바이러스들(Brough et al., 1996)은 비-상동성 재조합에 의해 Ad7 E1B 서열을 혼입한다고 나타내었다. 따라서, 효과적인 Ad7 재조합 바이러스의 번식은 Ad7-E1B 발현 및 Ad5-E4-ORF6 발현에서만 가능한 것을 입증하였다. E1B 단백질은 세포성뿐만 아니라 바이러스성 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Bridge et al., 1993; White, 1995). 가능하게도, E1B 55K 단백질과, 바이러스성 단백질의 mRNA 반출을 증가시키고 대부분의 세포성 mRNA의 반출을 억제하는데 필요한 E4-ORF6의 사이에서 형성되는 복합체는 중요하고 어떤 면에서는 혈청형 특이적이다. 상기 실험은 Ad5의 E1A 단백질은 Ad7-E1A 결실을 보충할 수 있고, 아데노바이러스 팩키징 세포 자체에서 Ad7-E1B 발현은 안정적인 보충 세포주를 생성하기에 충분하지 않다는 것을 나타낸다. Ad35-E1B 단백질들 중 하나 또는 둘이 PER.C6 세포상에 효율적인 Ad35 벡터 증폭에서 한정 인자 인식 시험하기 위해서, E1B 프로모터 및 E1B 서열을 포함하지만 E1A에 대한 프로모터 및 코드화 영역이 결실된 Ad35 어댑터 플라스미드를 생성하였다. 여기서, 작성자 지침에 따라 Pwo DNA 폴리머라제(Roche)가 있는 프라이머 35F1 및 35R4(둘 모두 실시예 7에 기재된)를 사용하여 wtAd35 DNA의 좌측 말단을 증폭하였다. PCR 정제 키트(LTI)를 사용하여 4.6 kb PCR 생성물을 정제하고, SnaBI 및 ApaI 효소로 소화하였다. 그리고 나서, QIAExII 키트(Qiagen)를 사용하여 4.2 kb 단편 생성물을 겔에서 정제하였다. 다음에, pAdApt35IP1(실시예 7)을 SnaBI 및 ApaI로 소화하고, 진클린 키트(BIO 101, INC)를 사용하여 단편을 함유한 2.6 kb 벡터를 겔에서 분리하였다. 두 분리된 단편들을 pBr/Ad35.좌측ITR-pIX를 생산하기 위해 결찰하였다. PCR중에 정확한 증폭을 다음과 같은 기능성 시험에 의해 증명하였다: DNA 를 BstBI로 소화하여 벡터 서열로부터 Ad35 삽입물을 유리시키고, 이 DNA의 4㎍을 4㎍의 NotI 소화된 pWE/Ad35.pIX-rITR(실시예 7)과 함께 PER.C6 세포로 동시-트랜스펙트하였다. 트랜스펙트된 세포들을 2일째에 T80 플라스크로 이송하고, 다시 2일 후, 새로운 pBr/Ad35.좌측ITR-pIX 구조체이 기능성 E1 서열을 함유하는 것을 나타내는 CPE를 형성하였다. 그리고 나서, 다음과 같이 pBr/Ad35.좌측ITR-pIX 구조체을 다시 변형하였다. DNA를 SnaBI 및 HindIII로 소화하고, 5' HindII 돌출부를 클레노우 효소를 사용하여 충전하였다. 소화된 DNA의 조절 및 수용성 세포(LTI)로의 형질전환은 구조체 pBr/Ad35.좌측ITR-pIXΔE1A를 생성한다. 이 후자의 구조체은 bp 450과 1341(wtAd35에 따른 번호, 도 6)사이의 E1A 서열을 제외하고 Ad35의 좌측 말단 4.5 kb를 함유하고, 따라서 E1A 프로모터 및 대부분의 E1A 코드화 서열이 결여된다. 그리고 나서, pBr/Ad35.좌측ITR-pIXΔE1을 BstB1으로 소화하고, 이 구조체의 2㎍을 6㎍의 NotI 소화된 pWE/Ad35.pIX-rITR(실시예 7)과 함께 PER.C6 세포로 동시-트랜스펙트하였다. 트랜스펙션 일주일 후, 트랜스펙트된 플라스크에 완전한 CPE를 생성하였다.
이 실험은 적어도 하나의 Ad35-E1B 단백질이 PER.C6에서 Ad5-E1 발현에 의해보충될 수 없는 PER.C6. 셀샌드(cellsand)에서, Ad35-E1A 단백질이 Ad5-E1A 발현에 의해 기능적으로 보충되는 것을 나타낸다. 또한, PER.C6.에서 Ad35-E1B 단백질을 발현함에 의해서 Ad35 E1-결실된 바이러스를 위한 보충 세포주를 제조하는 것이 가능하드는 것을 나타낸다. PER.C6의 게놈내의 통합된 복사체로부터 Ad35-E1B 서열의 안정한 발현은 E1B 프로모터에 의해 구동되고, 한정되는 것은 아니지만, HBVpA같은 이종성 폴리-아데닐화 신호에 의해 종결될 수 있다. 자연적인 E1B 종결은 아데노바이러스성 벡터상에 존재해야 하는 pIX 전사 단위에 위치하기 때문에, 이종성 pA 신호는 E1B 삽입물과 재조합 벡터간의 중복을 막기 위해 필요하다. 다른 방법으로, 한정되는 것은 아니지만, 7xtetO 프로모터(Gossen and Bujard, 1992)같은 유도가능한 프로모터에 의한, 한정되는 것은 아니지만, 인간 PGK 같은 이종성 프로모터에 의해서 E1B 서열이 구동될 수 있다. 또한, 이런 경우, 전사 종료는 이종성 pA 서열, 예를 들어, HBV pA에 의해 중개될 수 있다. Ad35-E1B 서열은 wt Ad35 서열의 뉴클레오티드 1611과 3400사이에 위치한 E1B 21K 및 E1B 55K 단백질의 코드화 영역중 적어도 하나를 포함한다. 삽입물은 또한 wt Ad35 서열의 뉴클레오티드 1550과 1611사이에 Ad35-E1B(의 일부)를 포함한다.
실시예 15
초기 영역 1 및 초기 영역 2A에서 결실된 재조합 아데노바이러스성 벡터의 생산을 위한 생산자 세포주의 생성
PER.C6-tTA 세포의 생성
초기 영역 1(E1) 및 초기 영역 2A(E2A)에서 결실된 재조합 아데노바이러스성벡터의 생산을 위한 생산 세포주의 생성이 기재된다. 생산자 세포주는 E1 및 E2A 유전자 모두의 구조성 발현에 의한 도중에 재조합 아데노바이러스성 벡터로부터 E1 및 E2A 결실을 보충한다. 기-확립된 Ad5-E1 형질전환된 인간 배아 망막아세포 세포주 PER.C6(WO 97/00326)은 다시 E2A 발현 카세트가 장착되었다.
아데노바이러스성 E2A 유전자는 단일 가닥 DNA에 높은 친화성이 있는 72 kDa DNA 융합 단백질을 코드화한다. 이런 기능때문에, DBP의 구조성 발현은 세포들에 대해 유독성이다. ts125E2A 돌연변이체는 아미노산 413의 Pro→Ser 치환을 갖는 DBP를 코드화한다. 이 돌연변이 때문에, ts125E2A 코드화된 DBP는 32℃의 허용가능한 온도에서 활동적이지만, 39℃의 허용불가능한 온도에서는 ssDNA에 결합하지 못한다. 이것은 구조성으로 E2A를 발현하는, 기능적이지 않고, 39℃의 허용불가능한 온도에서 독성이 아닌 세포주를 생성하게 한다. 온도 민감성 E2A는 점차로 온도 감소에 기능성이 되고, 허용가능한 온도인 32℃의 온도에서 완전히 기능성이 된다.
A. 야생형 E2A- 또는 온도 민감성 ts124E2A 유전자를 발현하는 플라스미드의 생성
pcDNA3wtE2A: 공급자(Boehringer Mannheim)의 표준 프로토콜에 따라 Expand™ Long Template PCR 시스템을 사용하여, 완전한 야생형 초기 영역 2A(E2A) 코드화 영역을 프라이머 DBPpcr1 및 DBPpcr2이 있는 플라스미드 pBR/Ad.Bam-rITR(ECACC deposit P97082122)으로부터 증폭하였다. 다음의 증폭 프로그램을 사용하여 Biometra Trio Thermoblock에서 PCR을 시행하였다: 2분동안 94℃, 1사이클; 10초동안 94℃ + 30초동안 51℃ + 2분동안 68℃, 1사이클; 10초동안 94℃ + 30초동안 58℃ + 2분동안 68℃, 10사이클; 사이클 당 10초 연장한 10초동안 94℃ + 30초동안 58℃ + 2분동안 68℃, 20사이클; 5분동안 68℃, 1사이클. 프라이머 DBPpcr1: CGG GAT CC G CCA CC A TGG CCA GTC GGG AAG AGG AG(5' 내지 3')은 Kozak 서열(이탤릭체)의 특유한 BamHI 한정 부위(밑줄 친) 5'을 포함하고, E2A 코드화 서열의 코돈을 개시한다. 프라이머 DBPpcr2: CGG AAT TC T TAA AAA TCA AAG GGG TTC TGC CGC(5' 내지 3')는 E2A 코드화 서열의 중지 코돈의 특유한 EcoRI 한정 부위(밑줄 친) 3'을 포함한다. 굵은 글자는 E2A 코드화 영역으로부터 유도된 서열을 나타낸다. PCR 단편을 BamHI/EcoRI으로 소화하고, BamHI/EcoRI 소화된 pcDNA3(Invitrogen)으로 클론하여 pcDNA3wtE2A를 생성하였다.
pcDNA3tsE2A: 온도 민감성 아데노바이러스 돌연변이체 H5ts125로부터 분리된 DNA로부터 완전한 ts125E2A-코드화 영역을 증폭하였다. PCR 증폭 과정은 wtE2A의 증폭에 대한 것과 동일하였다. PCR 단편을 BamHI/EcoRI으로 소화하고, BamHI/EcoRI 소화된 pcDNA3(Invitrogen)으로 클론하여 pcDNA3tsE2A를 생성하였다. wtE2A 및 tsE2A의 코드화 서열의 완정성을 서열화에 의해 확인하였다.
B. 32-, 37- 및 39℃에서 배양된 재조합 아데노바이러스성 벡터의 생산을 위한 생산자 세포의 성장 특징
10% CO2대기의 32℃, 37℃ 또는 39℃에서, 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco BRL) 및 10mM MgCl2가 보충된 둘베코 변형 이긁 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM, Gibco BRL)내에 PER.C6 세포들을 배양하였다. 0일째에 25㎠ 조직 배양 플라스크(Nunc)당 총 1 x 106PER.C6 세포들을 접종하고, 세포들을 32℃, 37℃ 또는 39℃에서 배양하였다. 1-8일째에, 세포를 계수하였다. 도 30은 39℃에서 성장 속도 및 PER.C6 배양물의 최종 세포 밀도가 37℃일때와 유사하다는 것을 나타낸다. 32℃에서 성장 속도 및 PER.C6 배양물의 최종 세포 밀도는 37℃ 또는 39℃에서의 것과 비교할 때 약간 감소하였다. 어떤 인큐베이션 온도에서도 현저한 세포 사멸이 관찰되지 않았다. 따라서, PER.C6은 ts125E2A에 대하여 각각 허용할 수 있는, 그리고 허용할 수 없는 온도인 32℃ 및 39℃에서 모두 잘 시행되었다.
C. E2A 발현 벡터가 있는 PER.C6의 트랜스펙션; 콜로니 형성 및 세포주의 생성
트랜스펙션 하루 전에, 10% FBS 및 10mM MgCl2로 보충된 DMEM내의 6㎝ 조직 배양 디쉬(Greiner)당 2 x 106PER.C6 세포를 접종하고, 10% CO2대기의 37℃에서 배양하였다. 다음 날, 공급자(Gibco BRL)의 표준 프로토콜에 따라, 10% CO2대기의 39℃에서 세포들을 트랜스펙트하는 것을 제외하고, LipofectAMINE PLUS™ 시약 키트를 사용하여 디쉬당 3, 5 또는 8㎍의 pcDNA3, pcDNA33wtE2A 또는 pcDNA3tsE2A 중의 하나로 세포들을 트랜스펙트하였다. 트랜스펙션 후, ts125E2A에 대하여 허용할 수 없는 온도인 39℃로 세포들을 일정하게 유지하였다. 3일 후, 10% FBS, 10mM MgCl2및 0.25㎎/㎖ G418(Gibco BRL)로 보충된 DMEM 내로 이동시켰고, 트랜스펙션후 10일째에 최초의 G418 대항 콜로니가 나타났다. 표 1에 나타낸 바와 같이, pcDNA3(~200 콜로니) 또는 pcDNA3tsE2A(~100 콜로니)와 pcDNA3wtE2A(단지 4 콜로니)의 트랜스펙션 후 얻어지는 콜로니의 총 수간에는 현격한 차이가 있었다. 이 결과들은 E2A(ts125E2A)의 온도 민감성 돌연변이체를 사용하고 39℃의 허용할 수 없는 온도에서 세포들을 배양함에 의해서 구조성으로 발현된 E2A의 유독성이 극복될 수 있다는 것을 나타낸다.
각 트랜스펙션으로부터, 피펫으로 디쉬에서 세포들을 긁어내서 일정 수의 콜로니를 선택하였다. 분리된 세포들을 그리고 나서 24 웰 조직 배양 디쉬(Greiner)에 넣고, 10% FBS, 10mM MgCl2및 0.25㎎/㎖ G418(Gibco BRL)로 보충된, 10% CO2대기의 37℃인 DMEM내에서 다시 배양하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 100%의 pcDNA3 트랜스펙트된 콜로니(4/4) 및 82%의 pcDNA3tsE2A 트랜스펙트된 콜로니 (37/45)가 안정적 세포주(남아있는 8 pcDNA3tsE2A 트랜스펙트된 콜로니들은 천천히 성장하고 폐기되었다)로 입증되었다. 대조적으로, 단지 1 pcDNA3wtE2A-트랜스펙트된 콜로니만이 입증될 수 있었다. 나머지 3은 선택후 곧 사멸하였다.
다음, 다른 세포주에서 E2A 발현 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다. 세포주를 6웰 조직 배양 디쉬에 접종하고, 덜 융합된 배양물을 PBS(NPBI)로 두번 세척하고, 용해시키고 그리고 RIPA( 1% NP-40, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 및 PBS내에 0.1% SDS, 1mM 페닐메틸술포닐플로라이드 및 0.1 ㎎/㎖ 트립신 저해제로 보충된)에서 긁어내었다. 얼음 상에서 15분 인큐베이션 후, 용해물을 원심분리로 정제하였다. 공급자(BioRad)의 표준 절차에 따라 Bio-Rad 단백질 분석에 의해 단백질농도를 결정하였다. 10% 겔상에서 동량의 전체-세포 추출물을 분별하였다. Immobilon-P 막(Millipore)위로 단백질을 전달하고 αDBP 단일 클론성 항체 B6과 함께 인큐베이트하였다. 2차 항체는 호스래디시-페록시다제-접합된 염소 항 마우스 항체(BioRad)이었다. Millipore에 의해 제공된 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯팅 절차 및 인큐베이션을 실행하였다. 제조자의 프로토콜(Amersham)에 따라 ECL 검출 시스템으로 복합체를 가시화하였다. 도 31은 pcDNA3tsE2A 트랜스펙션으로부터 유도된 모든 세포주가 72-kDa E2A 단백질을 발현하였다(좌측 판넬, 레인 4-14; 중앙 판넬, 레인 1-13; 우측 판넬, 레인 1-12). 반면에, pcDNAwtE2A 트랜스펙션으로부터 유도된 세포주만 E2A 단백질을 발현하지 못했다(좌측 판넬, 레인 2). E2A 단백질은 pcDNA3 트랜스펙션으로부터 유도된 세포주에서 유래한 추출물내에 검출되지 않았고(좌측 판넬, 레인 1), 이것은 음성 대조구로서 작용한다. pcDNA3ts125로 순간적으로 트랜스펙트된 PER.C6 세포에서 유래한 추출물은(좌측 판넬, 레인 3) 웨스턴 블롯팅 과정에 대한 양성 대조구로 작용하였다. 이 데이타는 wtE2A의 구조성 발현이 세포에 유독하고, E2A의 ts125 돌연변이체를 사용하는 것이 이 독성을 피할 수 있다는 것을 증명하였다.
D. 완전한-길이의 ts125E2A를 구조성으로 발현하는 PER.C6 세포상의 아데노바이러스서 벡터에서 E2A 결실의 보충
아데노바이러스 Ad5.dl802는 E2A 코드화 영역의 주요 부분이 결실된 Ad5 유도 벡터이고, 기능성 DBP를 생성하지 못한다. 구성적으로 ts125E2A를 발현하는 PER.C6 세포의 E2A 트랜스-보충(trans-complementing) 활성을 시험하기 위해Ad5.dl802를 사용하였다. 모 PER.C6 세포 또는 PER.C6tsE2A 클론 3-9를, 25㎠ 플라스크내의 39℃ 및 10% CO2에서 10% FBS 및 10mM MgCl2로 보충된 DMEM에서 배양하고, 모의 감염 또는 5의 m.o.i에서 Ad5.dl802로 감염하였다. 그리고 나서, 감염된 세포를 32℃에서 배양하고, 세포 형태 및 플라스크로부터 세포의 분리에서 변화에 의해 결정되는 것 같은 세포변성 효과(CPE)의 출연에 대해 세포들을 선별하였다. 완전한 CPE가 2일 내에 Ad5.dl802 감염된 PER.C6tsE2A 클론 3-9에서 나타났다. Ad5.dl802 감염된 PER.C6 세포 또는 모의 감염된 세포에서 CPE는 나타나지 않았다. 이 결과들은 ts125E2A를 구조성으로 발현하는 PER.C6 세포들이 32℃의 허용할 수 있는 온도에서 Ad5.dl802 벡터내의 E2A 결실을 도중에 보충한다는 것을 나타낸다.
E. PER.C6tsE2A 세포주의 혈청이 없는 현탁 배양
인간 유전자 치료를 위한 재조합 아데노바이러스성 벡터의 대규모 생산은 생산자 세포주를 위한 쉽고 증감될 수 있는 배양 방법, 바람직하게는 어떤 인간 또는 동물 구성 성분이 없는 배지에서 현탁 배양을 요구한다. 그 목적을 위해, 세포주 PER.C6tsE2A c5-9(c5-9로 지정된)를 10% FBS 및 10mM MgCl2로 보충된 DMEM내에 175㎠ 조직 배양 플라스크(Nunc)내의 39℃ 및 10% CO2에서 배양하였다. 불완전-융합 (70-80% 융합)일 때, 세포들을 PBS(NPBI)로 세척하고, 배지를 1 x L-글루타민 (Gibco BRL)으로 보충된 25㎖ 혈청이 없는 현탁 배지 Ex-cell™ 525(JRH)로 교환하고, 이하 SFM이라고 지정하였다. 이틀 후에, 경타(flicking)에 의해 플라스크로부터 세포들을 분리하고, 1000 rpm에서 5분동안 세포를 원심분리하였다. 세포 펠렛을5㎖ SFM에 재현탁하고, 0.5㎖ 세포 현탁액을 12㎖의 신선한 SFM과 함께 80㎠ 조직 배양 플라스크(Nunc)로 전달하였다. 2일 후에, 세포를 수확하고(모든 세포는 현탁상태이다), Burker 세포계수기로 계수하였다. 다음에, 125㎖ 조직 배양 삼각플라스크(뿔형)내에 총 부피가 20㎖ SFM인 ㎖ 당 3 x 105세포의 접종 밀도로 세포들을 접종하였다. 세포들을 10% CO2대기의 39℃에서 오비탈(orbital) 셰이커(GFL)상에 125 RPM으로 다시 배양하였다. 1-6일째에 Burker 세포 계수기로 세포들을 계수하였다. 도 4에서, 8 배양물에서 평균 성장 곡선을 도시하였다. PER.C6tsE2A c5-9는 혈청이 없는 현탁 배양에서 잘 시행되었다. ㎖ 당 약 2 x 105의 최대 세포 밀도가 배양 5일내에 달성되었다.
F. 37℃ 및 39℃에서 PER.C6 및 PER.C6/E2A의 성장 특성
10% CO2대기의 37℃(PER.C6) 또는 39℃(PER.C6ts125E2A c8-4)에서, 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco BRL) 및 10mM MgCl2가 보충된 둘베코 변형 이극 배지(DMEM, Gibco BRL)내에 PER.C6 세포들 및 PER.C6ts125E2A(c8-4) 세포들을 배양하였다. 0일째에, 25㎠ 조직 배양 플라스크(Nunc)당 총 1 x 106세포들을 접종하고, 각각의 온도에서 배양하였다. 지정된 시간 점에서, 세포를 계수하였다. 37℃에서 PER.C6 세포의 성장은 39℃에서 PER.C6ts125E2A c8-4의 성장과 유사하였다(도 33). 이것은 ts125E2A 코드화된 DBP의 구조성 발현이 39℃의 허용할 수 없는 온도에서 세포의 성장에 역효과를 갖지 않았다는 것을 나타낸다.
G. PER.C6ts125E2A의 안정성
여러 계대를 위해, 선택압(G418) 부재하에 39℃ 및 10% CO2에서, 10% FBS 및 10mM MgCl2가 보충된 DMEM내의 25㎠ 조직 배양 플라스크(Nunc)에서 PER.C6ts125E2A 세포주 클론8-4를 배양하였다. 불완전 융합(70-80% 융합)일때, 세포들을 PBS(NPBI)로 세척하고, 용해시키고 그리고 RIPA( 1% NP-40, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 및 PBS내에 0.1% SDS, 1mM 페닐메틸술포닐플로라이드 및 0.1 ㎎/㎖ 트립신 저해제로 보충된)에서 긁어내었다. 얼음 상에서 15분 인큐베이션 후, 용해물을 원심분리로 정제하였다. 공급자(BioRad)의 표준 절차에 따라 BioRad 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 10% 겔상에서 동량의 전체-세포 추출물을 분별하였다. Immobilon-P 막(Millipore)위로 단백질을 전달하고 αDBP 단일 클론성 항체 B6과 함께 인큐베이트하였다. 2차 항체는 호스래디시-페록시다제-접합된 염소 항 마우스 항체(BioRad)이었다. Millipore에 의해 제공된 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯팅 절차 및 인큐베이션을 실행하였다. 제조자의 프로토콜(Amersham)에 따라 ECL 검출 시스템으로 복합체를 가시화하였다. ts125E2A 코드화된 DBP는 적어도 16 계대에 대해 안정적이었고, 이것은 약 40 세포 배가(doubling)에 일치한다(도 34). 이 배양 기간동안 DBP 수준에서 감소는 관찰되지 않았고, G418 선택압의 부재하에서도 ts125E2A의 발현이 안정적이라는 것을 나타낸다.
실시예 16
tTA 발현화 팩키징화 세포주들의 생성
A. tTA 유전자가 발현되는 플라스미드 생성
pcDNA3.1-tTA: tTA 유전자, tetR 및 VP16 유전자들의 융합을 제한효소BamHI 및EcoRI을 사용하여 소화함에 의해 플라스미드 pUHD15-1 (Gossen and Bujard, 1992)로부터 제거하였다. 우선, pUHD15-1을EcoRI으로 소화하였다. 선형화된 플라스미드를 dNTPs의 존재하에서 클레노우 효소로 처리하여EcoRI 점착성 말단을 채웠다. 그리고 나서, 플라스미드를BamHI으로 소화하였다. 1025bp 길이의 결과의 단편을 아가로스로부터 정제하였다. 연이어서, 단편을BamHI/EcoRV 소화된 pcDNA3.1 HYGRO (-) (Invitrogen)와의 결찰반응에 사용하여 pcDNA3.1-tTA를 생성하였다. 수용성E. ColiDH5α(Life Techn.)로의 형질전환 및 암피시린 내성 콜로니의 분석 후에, pcDNA3.1-tTA로 기대되는 소화 패턴을 보이는 하나의 클론을 선별했다.
B. tPA 발현 벡터로 PER.C6 및 PER.C6/E2A의 트랜스펙션; 콜로니 형성 및 세포주의 생성
트랜스펙션 하루 전에, 2×106PER.C6 또는 PER.C6/E2A 세포들을 10% FBS (JRH) 및 10mM MgCl2로 보충된 둘베코 변형된 필수 배지 (DMEM, Gibco BRL)의 60nm 조직 배양 디쉬 (Greiner)마다 접종하고 그리고 37℃, 10% CO2분위기에서 인큐베이트하였다. 다음날, 세포들을 LipofectAMINE PLUSTM시약 키트를 사용하여 공급자 (Gibco BRL)의 표준 프로토콜에 따라서 4-8㎍의 pcDNA3.1-tTA 플라스미드 DNA로 트랜스펙션하였다. 세포들을 LipofectAMINE PLUSTM-DNA 혼합물과 함께 37℃, 10% CO2분위기에서 4시간 동안 인큐베이트하였다. 그리고 나서, 20% FBS 및 10mM MgCl2로 보충된 2ml의 DMEM을 첨가하고, 세포들을 37℃, 10% CO2분위기에서 더 인큐베이트하였다. 그 다음날, 세포들을 PBS로 세척하고, 10% FBS 및 10mM MgCl2로 보충된 신선한 DMEM에서, 37℃(PER.C6) 또는 39℃(PER.C6/E2A), 10% CO2에서 3일간 인큐베이트하였다. 그리고 나서, 배지를 선택 배지로 교환하였다; PER.C6 세포들을 10% FBS, 10mM MgCl2및 50㎍/ml 히그로마이신 B (GIBCO)로 보충된 DMEM과 함께 인큐베이트하고, PER.C6/E2A 세포들을 10% FBS, 10mM MgCl2및 100㎍/ml 히그로마이신 B로 보충된 DMEM에서 유지하였다. 이 선택에 내성인 세포들의 콜로니는 3주 내에 나타났고, 비내성 세포들은 이 기간 동안 죽었다.
각각의 트랜스펙션으로부터, 수많은 독립, 히그로마이신 내성 세포 콜로니들을 피펫으로 디쉬로부터 세포들을 긁어냄에 의해 뜯어 내어 2.5cm2디쉬 (Greiner)에 넣고 10% FBS, 10mM MgCl2을 함유하고 그리고 50㎍/ml (PER.C6) 또는 100㎍/ml (PER.C6/E2A 세포들) 히그로마이신이 보충된 DMEM에서, 10% CO2하에, 각각 37℃ 또는 39℃에서 더 성장시켰다.
그 다음에, 이들 히그로마이신-내성 세포 콜로니들이 기능성 tTA 단백질을 발현했는지를 결정하였다. 따라서, PER.C6/tTA 또는 PER/E2A/tTA 세포들의 배양물을 7×tetO 프로모터 (Grossens and Bujard, 1992) 조절하의 리포터 유전자 루시페라제를 함유하는 플라스미드 pUHC 13-3으로 트랜스펙트하였다. 루시페라제의 발현이 tTA에 의해 중재되었다는 것을 증명하기 위해서, 배양물의 반을 독시사이클린(doxycycline)이 없는 배지에서 유지하였다. 나머지 반을 8㎍/ml ehr시사이클린 (Sigma)을 갖는 배지에서 유지하였다. 후자의 약제는 테트라사이클린의 유사체이며, tTA에 결합하며, 그것의 활성을 저해한다. 모든 PER.C6/tTA 및 PER/E2A/tTA 세포주들은 루시페라제를 높은 수준으로 생산하였고, 이것은 모든 세포주들인 tTA 단백질을 발현했음을 나타낸다 (도 35a 및 35b). 또한, 루시페라제의 발현은 세포들을 독시사이클린으로 처리하였을때 크게 억제되었다. 종합적으로, 이 데이터는, 단리되고 수립된 히그로마이신-내성 PER.C6 및 PER/E2A 세포 클론들은 모두 기능성 tTA를 발현하였음을 보여 주었다.
표 1
중화 실험들에서 사용된 모든 인간 아데노바이러스가 PER.C6 세포들 (ECACC 기탁 번호 96022940)(Fallaux et al., 1998) 상에서 생산되었고 그리고 실시예 1에 언급된 바와 같이 CsCl상에서 정제되었다. 상이한 혈청형이 HPLC 컬럼으로부터 용출되는 NaCl 농도가 도시되어 있다. 바이러스 입자들/ml (VP/ml)은 Ad5 기준으로부터 계산되었다. 실험 (CCID50)에서 역가는 실시예 1에 기재된 바와 같이 중화 실험과 병행하여 수행된 적정에 의해 PER.C6 세포들 (ECACC 기탁 번호 96022940) 상에서 결정되었다. CCID50은 이 연구에서 사용된 44 바이러스들에 대해 도시되고 그리고 5일 후 웰의 50%에서 CPE를 얻는 데 요구되는 바이러스의 희석을 반영한다. VP/CCID50의 비는 log10으로 나타내며, 이것은 PER.C6 세포들 (ECACC) 상에 상이한 배치들(batches)의 감염성 측정치이다.
표 2. AdApt35.LacZ 바이러스는 인간 혈청에 의한 중화를 벗어난다
표 3. 상이한 혈청형의 wt 아데노바이러스들에 대한 중화 활성(NA)을 함유하는 활액(滑液) 샘플 %
표 4. BRK 형질전환 실험들에서 상이한 E1 발현 구조체들로 얻은 병소(foci)의 수

Claims (23)

  1. 유전자가 전달될 숙주에 의한 아데노바이러스 구성성분에 대항하는 중화 활성을 회피하게 하거나 또는 줄일 수 있는, 적어도 하나의 아데노바이러스 혈청형 35 구성성분들 또는 그것의 기능성 등가체, 및 관심의 유전자를 포함하는 유전자 전달체.
  2. 약제로서 사용하기 위한 아데노바이러스 혈청형 35 또는 그것의 기능성 동족체 또는 그로부터 유래된 케메라 바이러스, 또는 상기 바이러스, 그것의 동족체 또는 그것의 키메라에 기초한 유전자 전달체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 구성성분들은 아데노스바이러스 35 E3 발현 생성물들 또는 그들을 코드화하는 유전자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  4. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 구성성분들은 아데노바이러스 35 섬유, 펜톤 및/또는 헥손 단백질들 또는 이들 중 어느 한 가지를 코드화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  5. 제 1항, 제 3항 및 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 35와 적어도 하나의 다른 아데노바이러스의 키메라인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  6. 제 1항, 제 3항, 제 4항 및 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 35와는 다른 친화성(tropism)을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  7. 제 1항 및 제 3항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체, 또는 제 2항에 따른 바이러스, 그것의 동족체 또는 키메라의 적어도 기능성 부분을 코드화하는 핵산.
  8. 유전자가 전달될 숙주에 의한 아데노바이러스 구성성분에 대항하는 중화 활성을 회피하게 하거나 또는 줄일 수 있는, 적어도 하나의 아데노바이러스 혈청형 35 구성성분들 또는 그것의 기능성 등가체를 코드화하고 그리고 관심의 유전자를 도입할 수 있는 부위를 갖는 핵산.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 적어도 하나의 ITR을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  10. 제 7항, 제 8항 및 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 상동성 재조합을 위해 설계되거나 사용되는 뉴클레오티드 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  11. 제 7항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 두 핵산의 적어도 하나의 세트로, 상기 핵산 세트는 서로 단일의 상동성 재조합을 할 수 있고, 기능성 유전자 전달체를 코드화하는 핵산을 유도하는 것을 특징으로 하는 세트.
  12. 제 7항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 11항에 따른 핵산 세트를 포함하는 세포.
  13. 제 12항에 있어서, 제 7항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 11항에 따른 핵산 세트에는 없는 아데노바이러스성 복제의 필수 구성성분들을 보충하는 것을 특징으로 하는 세포.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, PER. C6 세포 (ECACC 기탁 번호 96022940)로부터 비롯된 것을 특징으로 세포.
  15. 제 1항 및 제 3항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체의 제조 방법으로,
    제 12항 또는 제 13항에 따른 세포에서 제 7항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 핵산을 발현하고 그리고 결과의 유전자 전달체를 수확하는 것으로 이루어지는 방법.
  16. 제 1항 및 제 3항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체의 제조방법으로,
    적절한 배양 배지에서 제 12항 또는 제 13항에 따른 세포를 배양하고 그리고 결과의 유전자 전달체를 수확하는 것으로 이루어지는 방법.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 유전자 전달체.
  18. 제 1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제 17항중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체로, 아데노바이러스와 통합화 바이러스의 키메라로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 통합화 바이러스는 아데노 연관된 바이러스인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  20. 제 1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제 17항 내지 제 19항중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체로, 아데노바이러스 16의 친화성 결정부 또는 그것의 기능성 등가체를 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
  21. 약제로 사용하기 위한 제 1항, 제 3항 내지 제 6항 또는 제 17항 내지 제 20항중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체.
  22. 제 1항, 제 3항 내지 제 6항 및 제 17항 내지 제 20항중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체 및 적절한 부형제를 포함하는 약제학적 조제물.
  23. 제 2항에 따른 아데노바이러스, 그것의 키메라, 또는 그것의 기능성 동족체 및 적절한 부형제를 포함하는 약제학적 조제물.
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