JP5335037B2 - アデノウイルス型35の少なくとも1つの因子を含有するアデノウイルス由来遺伝子運搬担体 - Google Patents
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Description
血管因子、限定する例ではないが、VEGF、線維芽細胞増殖因子、一酸化窒素シンターゼ、C型ナトリウム排泄増加ペプチド、など。
PMLの優勢マイナス突然変異体を免疫反応を阻害するのに使用することができる。
所望しない免疫反応の限定しない例は、遺伝子運搬担体又はアデノウイルス血清型に対する免疫反応を呼び起こすこと、及び/又は遺伝子運搬担体又はアデノウイルス血清型35に対する免疫反応の向上である。本発明の別の側面において、別の使用は、異なるサブグループに属するAdベクターからなる。したがって、本発明のこの側面は、遺伝子治療目的用のアデノウイルス投与を繰り返さないようにすることに取り組んでいる。
ヒト血清における中和活性の検出用高スループット測定
全てのウイルス血清型に対する、中和抗体の存在のために多量のヒト血清をスクリーニングするために、自動化96ウエル測定を開発した。
100個体のパネルを選択した。被験者(50%男性、50%女性)は、人種に制限されない20〜60の間の健康的な個体であった。全ての被験者は同意書にサインをした。アデノウイルス研究に専門的に従事する人々は除外された。
全ての既知ヒトアデノウイルスのプロトタイプを、PER.C6 細胞(ECACC寄託番号96022940)(Fallauz et al.、1998) で播種したT25フラスコでインキュベーションして、完全なCPEを収穫した。冷凍/解凍後、1-2mlの粗い溶解物をPER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)をT80フラスコに播種するのに使用し、ウイルスを完全なCPEで収穫した。CPEの接種と出現との間の時間枠、ウイルスの量は、異なる血清型間の新しい培地に再感染するために必要とした。アデノウイルスストックを冷凍/解凍によって調製し、3-4T175cm2 3層フラスコにPER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)を播種するために使用した。CPEが発生した際に、細胞をフラスコを軽く叩いて収穫し、滴下し、ウイルスを、2段階CsCl勾配によって以下のように単離、精製した。
アデノウイルスをPER.C6(ECACC寄託番号 96022940)細胞上で滴定し、5日間の中和測定期間で完全なCPEを得るのに必要なウイルスの量を決定した。これに関して、100μl培地を96ウエルプレートの各ウエルの中へ分配した。104、105、106、107倍に予め希釈した25μlのアデノウイルスストックを96ウエルプレートのカラム2に加え、10回のピペット上げ下げによって混合した。その後、25μlをカラム2からカラム3へ持っていき、再び混合した。これをカラム11から25μlを処分した後、カラム11まで繰り返した。このように5工程でいくつか希釈したものを予め希釈したストックから得られ始めた。その後、3×104PER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)を、100μl体積で加え、プレートを37℃で、5%CO2で5又は6日間インキュベートした。CPEを顕微鏡でモニターした。RoadとMuenschの方法を使用して細胞培養阻害量50%(CCID50)を計算した。
希釈したヒト血清サンプルを有する96ウエルプレートを37℃で、5%CO2下で解凍した。50μl当たり200CCID50へ希釈したアデノウイルスストックを調製し、50μl部分標本を血清を有するプレートのカラム1〜11へ加えた。プレートを1時間37℃で5%CO2下でインキュベートした。
その後、6×105/mlの50μlPER、C6細胞(ECACC寄託番号96022940)を全てのウエルに調剤して、1日37℃で5%CO2下でインキュベートした。各列に対して清潔なピペットチップを用いて上清を除去し、血清の毒性影響を避けるために200μlの新鮮な培地をすべてのウエルに加えた。プレートを別に4日間37℃で5%CO2下でインキュベートした。加えて、類似の対照例プレートをデュプロ(duplo)において、列A及びBにおいて試験した各血清型に特異的なウサギに発生し希釈したプラスの対照例血清、及び列C及びDにおいてマイナスの対照例血清(FCS)を用いて、セットアップした。列E-Hのそれぞれにおいて滴定を、上で述べたように試験すべき各ウイルスの200CCID50で始まる5倍希釈工程で行った。
5日目に対照例プレートの1つを顕微鏡とMTT測定で分析した。試験的な力価を顕微鏡観察した対照例滴定プレートから計算した。
組み換えウイルスの生産用のAd5プラスミドベクターの発生と、アデノウイルス遺伝子の容易な操作
pBr/Ad.Bam-rITR(ECACC寄託番号p97082122)
ITR配列の平滑末端クローニングを容易にするために、野生型ヒトアデノウイルス型5(Ad5)DNAをクレノウ酵素で過剰のdNTPの存在下で処理した。クレノウ酵素による不活性、フェノール/クロロホルム抽出による精製、次いでエタノール調製の後、DNAをBamHIで消化した。このDNA調製物を、以下のように調製したpBr322由来ベクターDNAとのくくり反応においてさらに精製することなしに使用した。すなわち、pBr322 DNAをEcoRV及びBamHIで消化し、TSAP酵素(Life Technologies)で処理することによって脱リン酸化し、LMPアガロースゲル上で精製した(SeaPlaque)。コンピタントE.coli DH5α(Life Techn.)の中へ形質転換し、アンピシリン耐性コロニーの分析の後、Ad5のBamHI部位から右のITRへ広がる挿入物に対して予期されたような消化パターンを示す1つのクローンを選別した。
pBR/Ad.Bam-rITRをBamHI及びSalIで消化した。アデノウイルス挿入物を含むベクター断片をLMPアガロース(SeaPlaque GTG)で単離し、wt Ad5DNA由来の4.8kb SalI―BamHI断片へくくり、Geneclean IIキットを精製した(Bio 101、Inc.)。1つのクローンを選択し、完全なAd5配列を制限酵素分析によって決定した。クローンpBr/Ad.Sal-rITRは、bP16746でSaiL部位からアデノ型5配列を含み、 (大部分の3‘G残基を欠く) rITRを含む。
wtアデノ型5DNAを、ClaI及びBamHIで消化し、20.6kb断片を電気溶出によってゲルから単離した。pBr322を同じ酵素で消化し、アガロースゲルからGenecleanによって精製した。両方の断片をコンピタントDH5αの中へくくり形質転換した。生じたクローンpBr/Ad. Cla―Bamを制限酵素消化によって分析し、bp919から21566までのアデノウイルス配列を持つ挿入物を含むように示した。
pBr/Ad.AflII−BamをEcoRI(pBrにおいて)で直線状にし、AflIIで一部消化した。AflIIを20分間65℃で加熱不活性化後、断片末端をクレノウ酵素で満たした。その後、DNAを、PacI部位を含む平滑二本鎖オリゴリンカー(5‘-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3’)にくくった。このリンカーは、以下の2つのオリゴヌクレオチド、すなわち、5’−AATTGTCTTAATTAACCGC-3‘及び5’−AATTGCGGTTAATTAAGAC−3‘をアニーリングすることによって作り、次いでクレノウ酵素で平滑化した。緩衝液を変えるのにくくったDNAが析出した後、くくったものを過剰のPacI酵素で消化し、オリゴの結合を除去した。bp 3534から21566までのAd5配列及びベクター配列を含有する22016bp部分的断片をLMPアガロース(Seaplaque GTG)において単離し、コンピタントDH5αの中へ再びくくり、形質転換した。PacI部位を含むことが見出されて、大きいアデノ断片を有する1つのクローンを選択し、5’末端で配列化し、PacIリンカーの(最後の)AflII部位における正確な挿入を確かめた。
クローンpBr/Ad.Bam-rITRにAd5のITR近くのPacI部位の挿入を可能とするために、約190ヌクレオチドをpBr322骨格のClaI部位と、ITR配列の開始との間で除去した。これを以下のようにした。すなわち、pBr/Ad. Bam−rITRをClaIで消化し、変更した長さの時間(2分、5分、10分、及び15分)ヌクレアーゼBal31で処理した。ヌクレオチド除去の程度は、同一の緩衝液と状態を用いて、(ClaI部位でも消化されている)pBr322DNAでの分離反応によって従われる。Bal31酵素を75℃で10分間インキュベーションすることによって不活性化し、より小さい容積のTE緩衝液で沈殿させ、再懸濁した。
コスミドベクターpWE15(Clontech)をより大きいAd5挿入物をクローン化するのに使用した。最初に、特有のPacI部位を含むリンカーを、pWE,pacを作製するpWE15のEcoRI部位に挿入した。この末端で、pBr/Ad.AflII・BamHIに対して述べたような二本鎖PacIオリゴを使用したが、なお、そのEcoRI突出末端を有していた。その後、以下の断片、すなわち、PacIで消化したpWE.pac、PacIとBamHIで消化したpBr/AflII−Bam、及びBamHIとPacIで消化したpBr/AflII-Bamを電気溶出によって、アガロースゲルから単離した。これらの断片を、製造者のプロトコールによるλファージパッケージング抽出物(Stratagene)を使用して共にくくった。宿主バクテリアに感染させた後、コロニーをプレート上で成長させて、完全な挿入物の存在を分析した。pWE/Ad.AflII-rITRは、右ITR(大部分の3’ G残基を欠く)を含めbp 3534(AflII部位)からアデノウイルス型5配列を全て含んでいる。
アデノ5 wt DNAをクレノウ酵素で過剰なdNTPの存在下で処理し、次いでSalIで消化した。それぞれ、左ITR-Sal(9.4)及びSal(16.7)-右ITR設計した生じた断片2つを、LMPアガロース(Seaplaque GTG)で単離した。PBr322DNAをEcoRV及びSalIで消化しファスファターゼ(Life Technologies)で処理した。Geneclean 法(BIO 101、Inc.)を使用して、ベクター断片を単離し、Ad5SalI断片へくくった。9.4kb断片を有するくくったものだけが、挿入物を持つコロニーを与えた。クローニングの境界を分析し、シークエンシングした後、完全なITR配列を含み、bP9462でSalI部位へ拡張したクローンを選択した。
pBr/Ad.lITR−Sal(9.4)をSalIで消化して、脱リン酸化した(TSAP、Life Technologies)。このクローンをAd5において3番目のSal部位まで延長するために、pBr/Ad.Cla−BamをBamHIで直線状にしてSalIで一部消化した。9462-16746からのアデノウイルス配列を含む7.3kbSalI断片を、LMPアガロースゲル中で単離し、SalI消化したpBr/Ad.lITR-Sal(9.4)ベクター断片にくくった。
pWE.pacをClaIで消化し、5’突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。その後、このDNAをPacIで消化し、アガロースゲルから単離した。pWE/AflII-rITRをEcoRIで消化し、クレノウ酵素で処理後、PacIで消化した。アデノウイルス配列含有の大きな24kbフラグメントをアガロースゲルから単離し、ClaIで消化および平滑化したpWE.pacベクターにクローンテック社(Clontech)からのリゲーションエクスプレス(Ligation Expresstm)キットを使用して結合した。Stratageneからの超受容能XL10-Gold細胞の形質転換の後、期待される挿入断片を含むクローンを確認した。pWE/AflII-EcoRIは、bp3534-27336からのAd5配列を含む。
ベクターpWE/Ad.AflII-rITRの3’ITRは末端G-ヌクレオチドを含まない。さらに、PacI部位は右ITRからほぼ30bpに位置している。これらの両特性は、3’ITRにおける複製の開始が非効率なため、ウイルス生成の効率が減少し得る。ウイルス生成の間、アダプタープラスミドにおける左のITRは完全であり、均一な組み換えの後、ウイルスDNAの複製が可能であることに注意を要する。
5′-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3′および
Ad101:5′-TGA TTC ACA TCG GTC AGT GC-3′
を使用して、630bpPCRフラグメントを3’Ad5配列に対応して生成した。続いて、このPCRフラグメントをベクターpCR2.1(Invitorogen)においてクローン化し、PCRフラグメント含有クローンを単離し、配列化してDNAの正しい増幅を検査した。その後、PCRクローンをPacIおよびAvrIIで消化し、0.5kbアデノ挿入断片をPacI/部分的にAvrIIで消化したpBr/Ad.Bam-rITRpac#2フラグメント生成pBr/Ad.Bam-rITRsp.に結合した。次に、この構成を使用して、コスミドクローン(上記のように)を生成した。これは、アデノ配列3534から35938に対応する挿入断片を有する。このクローンをpWE/AflII-rITRspと名付ける。
pWE/Ad.AflII-rITR(ECACC寄託P97082116)からE2Aコード配列の除去を、以下のようにして達成した。左および右部位におけるE2Aコード領域をフランキングするアデノウイルス配列をプラスミドpBr/Ad.Sal.rITR(ECACC寄託P97082119)から製造者のプロトコルに準拠してExpand PCR装置を使用してPCR反応で増幅した。以下のプライマーを使用した。右フランキング配列(Ad5ヌクレオチド24033から25180に対応):
ΔE2A.SnaBI:5′-GGC GTA CGT AGC CCT GTC GAA AG-3′
ΔE2A.DBP−開始:5′-CCA ATG CAT TCG AAG TAC TTC CTT CTC CTA TAG GC-3′
増幅DNAフラグメントをSnaBIおよびNsiIで消化した(NsiI部位を、下線を付したプライマーΔE2A.DBP−開始において生成する)。
ΔE2A.DBP−停止:5′-CCA ATG CAT ACG GCG CAG G-3′
ΔE2A.BamHI:5′-GAG GTG GAT CCC ATG GAC GAG-3′
増幅DNAをBamHIおよびNsiIで消化した(NsiI部位を、下線を付したプライマーΔE2A.DBP−停止において生成する)。次に、消化したDNAフラグメントをSnaBI/BamHIで消化したpBr/Ad.Sal-rITRに結合した。配列は、プラスミドpBr/Ad.Sal.rITRΔE2AにおけるユニークNsiI部位を使用してDBPコード領域の正確な置換を確認した。ユニークNsiI部位を使用して、組み換えベクターにより導入されるべき遺伝子に対して発現カセットを導入できる。
パッケージング細胞ラインにおける組み換えアデノウイスルおよびE1配列間の配列重複がないことは、安全な、新規な組み換え体のRCAのない生成および増殖について重要である。アダプタープラスミドpMLPI.TK(PCT/NL96/00244に記載)は、前記発明の改良パッケージング細胞ラインと共に前記発明に従う使用のために設計されたアダプタープラスミドの例である。このプラスミドを出発物質として使用して、特異的なプロモーターを含む核酸分子および遺伝子配列を容易に交換できる新規なベクターを作った。
ポリリンカー配列のみ含み、プロモーターまたはポリA配列を含まないアダプタープラスミドを作るために、pAd5/L420−HSApacをAvrIIおよびBglIIで消化した。ベクターフラグメントを同じ制限酵素で消化したインカーオリゴヌクレオチドに結合した。リンカーを以下の配列のオリゴをアニールすることにより作った:
PLL−1:5′−GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACC GGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GAT CTG G−3′および
PLL−2:5′−CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATC CGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAG GGA TGG C−3′。
このアニールしたリンカーをAvrIIおよびBglIIで消化し、カラム精製(Qiaquick ヌクレオチド除去キット)により小さい末端から製造者推薦にしたがって分離した。その後、リンカーをAvrIIおよびBglIIで消化したpAd5/L420−HSApacフラグメントに結合した。組み込まれたリンカーを有し、挿入の完全性をチェックするために配列されたAdMireと呼ぶクローンを選択した。アダプタープラスミドpAdMireは完全な発現カセットの容易な挿入を可能にする。
CMVplus:5′−GATCGGTACCACTGCAGTGGTCAATATTGGCCATTAGCC−3′および
CMVminA:5′−GATCAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGC−3′
PCRフラグメントを先ずPST1(CMVplusにおいて下線を付す)で消化し、その後、3’−突出末端をT4DNAポリメラーゼで処理することにより除去した。その後、DNAをHindIII(CMVminAにおいて下線を付す)で消化し、上記のAvrIIおよびHindIIIで消化したpAd5/L420−HSApacベクターフラグメントに結合した。得られたプラスミドをpAd5/CMV−HSApacと呼んだ。その後、このプラスミドをHindIIIおよびBamHIで消化し、ベクターフラグメントを単離し、HindIIIおよびBglIIでAdMireを消化した後に得られたポリリンカー配列に結合する。得られたプラスミドをpAdAptと呼んだ。アダプタープラスミドpAdAptはヒトCMVプロモーター(Boshartら、1985年)のヌクレオチド−735から+95を含む。
RCAのない組み換え体アデノウイルスを非常に効率的に上記アダプタープラスミドおよびpWE/Ad.AflII−rITRまたはpWE/Ad.AflII−rITrsp構造を使用して生成できる。一般に、所望の発現カセットにおける所望のトランスジーンを含むアダプタープラスミドは適当な酵素で消化され、3’および/または5’末端のベクター配列から挿入断片を遊離する。アデノウイルス相補性プラスミドpWE/Ad.AflII−rITRまたはpWE/Ad.AflII−rITRspはPacIで消化され、アデノ配列をベクタープラスミドから遊離する。非制限的な例として、AdApt−LacZの生成を説明する。E.coli LacZ遺伝子をプラスミドpMLP.nlsLacZ(EP95−202213)からプライマー5′−GGGGTGGCCAGGGTACCTCTAGGCTTTTGCAA−3′および5′−GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC−3′を用いてPCRより増幅した。PCR反応を以下の増幅プログラムにて供給者プロトコルに従ってExTag(Takara)を用いて行った:5分94℃、1サイクル;45秒94℃および30サイクル60℃および2分72℃、5サイクル;45秒94℃および30秒65℃および2分72℃、25サイクル;10分72;45秒94℃および30秒60℃および2分72℃、5サイクル、1サイクル。次に、PCR生成物をKpnIおよびBamHIで消化し、消化されたDNAフラグメントをKpnI/BamHI消化pcDNA3(Invitrogen)に結合し、pcDNA3.nlsLacZを増加させた。その後、構成pcDNA3.nlsLacZをKpnIおよびBamHIで消化し、3kb LacZフラグメントをジーンクリーンスピンキット(Bio101社)を使用してゲルから単離した。
キメラ組み換え体アデノウイルスの生成
ヒト血清中で抗体を中和するヘキソンキメラAd5基アデノウイルスの生成は主にヘキソン蛋白質を指向し、ペントン蛋白質にあまり拡張しない。異なる血清型からのヘキソン蛋白質は、ウイルスの外側でさらされるべきことを予定されるループ中に存在する高可変領域を示す(Athappillyら、1994、J. Mol. Biol. 242, 430-455)。殆どの型の特異的なエピトープはこれらの高可変領域にマップされている(Toogood ら、1989; J. Gen Viol. 70, 3203-3214)。こうして、異なる血清型からの相当する配列と(一部の)ヘキソン配列との置換は、Ad5に対する抗体の(先在)中和を回避する効果的な方法である。アデノウイルス血清型5のヘキソンコード配列はヌクレオチド18841と21697間に位置する。
Δhex1:5′−CCT GGT GCT GCC AAC AGC−3′
Δhex2:5′−CC(G GAT CC)A CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG−3′
Δhex3:5′−CC(G GAT CC)A ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA AC−3′
Δhex4:5′−GAG AAG GGC ATG GAG GCT−3′
Hex−up2:5′−GACTAGTCAAGATGGCYACCCCHTCGATGATG−3′および
Hex−do2:5′−GCTGGCCAATTGTTATGTKGTKGCGTTRCCGGC−3′
次に、ヘキソン改変配列を、pWE/Ad.AflII−rITRHexXX(ここで、XXはヘキソン配列を増幅するのに使用した血清型を表す)を生成するAscIフラグメントの交換により、構成pWE/Ad.AflII−rITRに導入した。
その後、pWE/Ad.AflII−rITRHexXX構成を使用して、Ad5組み換え体ウイルスについての上記と同じ方法でウイルスを作った。
アデノウイルス型5ペントン遺伝子は、配列14156および15869間に位置する。ペントンベースは、目標細胞へのウイルスのインターナリゼイションを媒介するアデノウイルスキャプシド蛋白質である。少なくとも幾つかの血清型(C型およびB型)は、ペントン中のRGD配列と細胞表面上のインテグリンとの相互作用によりこのことを達成することが示された。しかし、F型アデノウイルスはRGD配列を持たず、AおよびDグループの殆どのウイルスに対してペントン配列は未知である。このため、ペントンは目標細胞特異性に含まれ得る。さらに、キャプシド蛋白質として、ペントン蛋白質はアデノウイルスの免疫原性に含まれる(Gahery-Segardら、1998)。このため、Ad5ペントン配列と無か低い力価のNABある血清型からのペントン配列と置換およびヘキソン配列の置換は、ヘキソン単独の置換よりも効果的にアデノウイルスベクターのクリアランスを防止する。ペントン配列の置換は感染特異性に影響する。
DP5−F:5′−CTG TTG CTG CTG CTA ATA GC−3′および
DP5−R:5′−CGC GGA TCC (TGT ACA) ACT AAG GGG AAT ACA AG−3′
DP5−Rは右フランキング配列に結合するためのBamHI部位(下線)を有し、前者Ad5ペントン領域の5’末端におけるユニークBsrGI部位(括弧)を導入する。
DP3−Fは、左のフランキング配列に結合するためのBamHI部位(下線)を有し、前者Ad5ペントン領域の3’末端におけるユニークAflII部位(括弧)を導入する。
Ad34およびAd35に対して:
P3−for:5′−GCT CGA TGT ACA ATG AGG AGA CGA GCC GTG CTA−3′
P3−rev:5′−GCT CGA CTT AAG TTA GAA AGT GCG GCT TGA AAG−3′
Ad26およびAd48に対して:
P17F:5′−GCT CGA TGT ACA ATG AGG CGT GCG GTG GTG TCT TC−3′
P17R:5′−GCT CGA CTT AAG TTA GAA GGT GCG ACT GGA AAG C−3′
アデノウイルス感染を2つのキャプシド蛋白質繊維およびペントンにより媒介される。細胞に対するウイルスの結合は、突出繊維蛋白質と細胞表面上のリセプターとの相互作用により達成される。インターナリゼイションをペントン蛋白質と細胞表面上のインテグリンとの相互作用後に行う。CおよびBサブグループからの少なくとも幾つかのアデノウイルスは、細胞結合に対する異なるリセプターを使用することを示され、このため、異なる細胞型で異なる感染効率を有する。したがって、キャプシドの繊維を変えることによりアデノウイルスの感染スペクトルを変えることが可能である。アデノウイルス血清型5の繊維コード配列はヌクレオチド31042および32787間に位置する。アデノウイルス血清型5DNAエンコード繊維を除去するため、我々は、構成pBr/Ad.Bam−rITRについて開始した。先ず、NdeI部位をこの構成から除去した。この目的のため、pBr322プラスミドDNAをNdeIで消化し、その後、突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。このpBr322プラスミドを再結合し、NdeIで消化し、E.coli DH5αに形質転換した。得られたpBr/ΔNdeIプラスミドをScaIおよびSalIで消化し、得られた3198bpベクターフラグメントをpBr/Ad.BamrITR由来の15349bp ScaI−SalIフラグメントに結合し、プラスミドpBr/Ad.Bam−rITRΔNdeIを得た。これは、ユニークNdeI部位を含む。次に、PCRをオリゴヌクレオチドNY−up:
5′−CGA(CAT ATG)TAG ATG CAT TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG−3′および
NY−down:
5′−GGA GAC CAC TGC CAT GTT−3′で行った。
Ad35組み換え体ウイルスを生成するプラスミド基システムの構築
Ad35の部分的な制限マップは、以前に公表された(Valderrama-Leon ら、1985; Kang ら、1989; Li ら、1991)。Ad35に基づく組み換え体アデノウイルスを生成する機能的なプラスミド基システムの例は、以下の要素からなる:1.左のITRおよびAd35由来パッケージング配列および異種発現カセットの挿入断片に対する少なくとも1つの制限部位からなりE1配列がないアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドは、pIXプロモーターを含む領域をコードし、第2のヌクレオチドを有するアダプタープラスミドの同種組み換え体を媒介するのに充分な配列をコードするE1BからのAd35配列3’を含む。
2.アダプタープラスミドに同種の配列、複製、およびパッケージング細胞中には存在せず速い、中間の、遅い遺伝子である、組み換え体ウイルスのパッケージングに必要なAd35配列を含む第2のヌクレオチド。
3.Ad35のE1機能を補うことができる少なくとも機能的E1蛋白質を提供するパッケージング細胞。
Ad35に対する中和活性(NA)の優勢が異なる地理的位置からのヒト血清において低い。
実施例1において、我々は、ベルギーの一位置からヒト血清の中和活性(NA)の分析を説明した。試験した44アデノウイルス血清型のパネルのうち、一血清型Ad35はアッセイした100の血清のいづれかにおいて中和されなかった。さらに、幾つかの血清型Ad26、Ad34、Ad48が試験された血清のうち8%以下において中和されることがわかった。この分析は、さらに以前には試験されていないアデノウイルスの他の血清型に対して拡張され、第1スクリーンからの血清型の選択を使用して、異なる地理的一からの血清にも拡張した。
ヒトアデノウイルス型35の配列
Ad35ウイルスをPER.C6細胞で増殖し、DNAを実施例4に記載したように単離した。全配列をQiagen Sequence Service (Qiagen GmbH, Germany)により生成した。全ウイルスDNAを超音波処理で剪断し、DNA末端をT4DNAポリメラーゼで平滑化した。
組み換え体Ad35基ウイルスを生成するプラスミド基ベクターシステムの構成
組み換え体アデノウイルスベクターを生成する機能的プラスミド基ベクターシステムは以下の成分からなる:
1.左のITRおよびAd35由来パッケージング配列および異種発現カセットの挿入断片に対する少なくとも1つの制限部位からなりE1配列がないアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドは、pIXプロモーターを含む領域をコードし、第2の核酸分子を有するアダプタープラスミドの同種組み換え体を媒介するのに充分な配列をコードするE1BからのAd35配列3’を含む。
3.Ad35のE1機能を補うことができる少なくとも機能的E1蛋白質を提供するパッケージング細胞。
アダプタープラスミドpAdApt(図7、実施例2に記載)を、先ず改変して、拡張されたポリリンカーを含み、左のITRをフランキングする便利なユニーク制限部位を有するアダプタープラスミドおよび3’末端におけるアデノウイルス配列を得て、プラスミドベクター配列からのアデノウイルス挿入断片の遊離を可能にした。これらのプラスミドの構成を以下に詳細に説明する:アダプタープラスミドpAdApt(実施例2)をSalIで消化し、シュリンプアルカリフォスファターゼで処理し、再結合を減少させた。以下の2つのリン酸化およびアニール化オリゴからなるリンカー:ExSalPacF 5′−TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT GGG TTC GAA TTA ATT AA−3′およびExSalPacR 5′−TCG ATT AAT TAA TTC GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA−3′;を、消化した構成に直接結合し、これにより、Pi−PspI,SwaIおよびPacIによりSalI制限部位を置換した。この構成をpADAPT+ExSalPacリンカーと呼ぶ。さらに、pAdAptの左ITRの一部を以下のプライマーを使用して、PCRにより増幅した:PCLIPMSF 5′−CCC CAA TTG GTC GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG:およびpCLIPBSRGI:5′−GCG AAA ATT GTC ACT TCC TGT G−3′。増幅したフラグメントをMunIおよびBsrGIで消化し、pAd5/Clip(参照:実施例2)にクローン化し、EcoRIで部分的に消化し、精製後、BsrGIで消化した。これにより、左のITRおよびパッケージングシグナルを再挿入した。制限酵素分析の後、この構成をScaIおよびSgrAIで消化し、800bpフラグメントをゲルから単離し、ScaI/SgrAI消化pADAPT+ExSalPacリンカーに結合した。pIPspSalAdaptと呼ぶ得られた構成をSalIで消化し、脱リン酸化し、上記のリン酸化ExSalPacF/ExSalPacRダブルストランドリンカーに結合した。PacI部位がITRに最も近いクローンを、制限分析により同定し、配列を配列分析により確認した。pIPspAdapt(図8)と呼ぶこの新規なpAdApt構成は、PacI、PI−PspIおよびBstBIに対する認識配列を含む2つのExSalPacリンカーを有し、アデノウイルスアダプター構成のアデノウイルス部分を囲み、プラスミドDNAをリニア化するに使用でき、その後アデノウイルスヘルパーフラグメントを用いたコトランスフェクションが可能である。
左のITRおよびAd35wt配列ヌクレオチド1〜464(図6)に対応するパッケージング配列をPCRにより、以下のプライマーを使用してwtAd35DNAについてのPCRにより増幅した:
プライマー35F1:
5′−CGG AAT TCT TAA TTA ATC GAC ATC ATC AAT AAT ATA CCT TAT AG−3′
プライマー35R2:
5′−GGT GGT CCT AGG CTG ACA CCT ACG TAA AAA GAG−3′
増幅により、配列の5’末端のPacI部位および3’末端のAvrII部位を導入した。
35F3:5′−TGG TGG AGA TCT GGT GAG TAT TGG GAA AAC−3′
35R4:5′−CGG AAT TCT TAA TTA AGG GAA ATG CAA ATC TGT GAG G−3′
このフラグメントの配列は、wtAd35(図6)のnucl.3401から4669に対応し、E1B55kコード配列から直接3’から開始する1.3kbの配列を含む。増幅および精製を、左のITRおよびパッケージング配列含有フラグメントに対して上記のようにして行った。その後、PCRフラグメントをPacIで消化し、SamIおよびPacIで消化したpNEB193ベクター(New England Biokabs)にサブクローン化した。得られたクローンの配列の完全性を配列分析により確認した。
そしてpNEB/Ad35pF3R4をBglIIとPacIによって消化し、QIAExIIキット(Qiagen)を用いてAd35挿入物をゲルから単離した。pIPspAdApt3−Ad35lITRはBglIIにより、そしてPacIにより部分的に消化された。3624bpの断片(ベクター配列、ad35ITR及びパッケージ配列のみならずCMVプロモーター、複合的なクローニング領域及びポリAシグナルを含んでいる)もまた、QIAExIIキット(Qiagen)を用いて単離された。両断片はライゲートされて、コンピーテントなDH10B細胞(LTI)の中へ形質転換された。得られたクローンであるpAdApt35IP3(図11)は、pIPspAdApt3に由来する発現カセットを有しているが、Ad35レフトITR及びパッケージ配列及びAd35に由来する塩基3401から4669に対応する第二の断片を含んでいる。複合的なクローニング部位を反対の方向性で有しているAd35アダプタープラスミドの第二のバージョンは、下記の様にして作られた。
図13は、Ad35配列の3401bpから34794(ライトITRの末端)を含んでいるコスミドクローンの構築を保証する種々の工程を表し、それを下記に詳しく述べる。
35F5:5’−CGG AAT TCG CGG CCG CGG TGAGTA TTG GGA AAA C−3’
35R6:5’−CGC CAG ATC GTC TAC AGA ACAG−3’
35F7:5’−GAA TGC TGG CTT CAG TTG TAATC−3’
35R8:5’−CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTAAAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC−3’
1)Ad35.E1発現プラスミドの構築
PER.C6中でAd5−E1蛋白質は効率的にAd35組み換えウイルスを相補することができなかったので、Ad35E1蛋白質はAd5を相補をしている細胞において発現されなければならず(例えば、PER.C6)、あるいは2倍体初代ヒト細胞又はアデノウイルスE1蛋白質を発現していない確立された細胞系列から始めて、Ad35E1蛋白質を発現している新たなパッケージ細胞系列を作らなければならない。最初の可能性に取り組むために、下記に示す様にAd35E1領域を発現プラスミド中でクローン化した。
35F11:5’−GGG GTA CCG AAT TCT CGC TAG GGT ATT TAT ACC−3’
35F10:5’−GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG−3’
このPCRは、5’末端にKpnIとEcoRI部位を導入し、更に3’末端にSbfIとXbaI部位を導入する。
HBV−F;5’−GGC TCT AGA GAT CCT TCG CGG GAC GTC−3’及び
HBV−R;5’−GGC GAA TTC ACT GCC TTC CAC CAA GC−3’
PER.C6細胞は5×106 細胞の密度でT25フラスコ中に播種され、次の日に以下を含むDNA混合物によりトランスフェクトされた。
− PacIによって消化されたpAdApt35.LacZ 1μg
− 消化されていないpRSV.Ad35E1 5μg
− NotIによって消化されたpWE.Ad35.pIX−rITR 2μg
そしてAd5ウイルスの中和活性を含むヒト血清の存在下での感染を検討するために、AdApt35.LacZウイルスをを使用した。精製したAd5に基づくLacZウイルスを、NAの陽性コントロールとして使用した。ここで、PER.C6細胞を2×105 細胞/ウェルの密度で、24穴のプレートに播種した。次の日に、Ad5を中和する高い活性を有するヒト血清サンプルを、培養培地中で5段階で5倍希釈した。そして0.5mlの希釈された血清を、0.5mlの培地に入ったAdApt5.LacZウイルスの4×106 のウイルス微粒子と混合し、そして37℃で30分間インキュベーションした後、0.5mlの混合物を2重の系列でPER.C6細胞に添加した。AdApt5.LacZウイルスについて、0.5mlの希釈された血清サンプルをAdApt5.LacZウイルスを含んでいる0.5mlの粗ライゼートと混合し、そしてインキュベーションの後にこの混合物の0.5mlを、2重の系列でPER.C6細胞に添加した。血清がない培地中でインキュベートされたウイルスサンプルを、感染の陽性コントロールとして使用した。37℃で2時間感染した後、培地を添加して最終容量を1mlとし、細胞を更にインキュベートした。感染の2日後、細胞を染色してLacZ活性を見た。結果を表IIに示す。これらの結果から、AdApt5.LacZウイルスは効果的に中和されたが、ヒト血清が存在しているにも関わらずAdApt35.LacZウイルスが感染性を残していることは、明らかである。これは、組み換えAd35に基づくウイルスは、Ad5に基づくウイルスへのNAを含むヒト血清中で中和を逃れることを証明するものである。
ネモポエティック(nemopoietic)なCD34Lin幹細胞に対する細胞型特異性を有するAd5/ファイバー35キメラベクター
実施例3において、我々は他の血清型の繊維蛋白質を有するアデノウイルスに基づくAd5のライブラリーの生成について述べた。このライブラリーの使用方法のための限定的ではない実施例として我々はここで、血液幹細胞の感染が改善されたことを示す、繊維組織で改変されたアデノウイルスの同定について述べる。
樹状細胞のための細胞型特異性を有するAd35/ファイバー35キメラベクター
樹状細胞は抗原提示細胞(APC)であり、初期免疫反応を開始する様に特殊化されていて記憶型の免疫反応を促進することが可能である。それらの発達の段階に依存して、DCは異なった機能を果たし、未成熟なDCは、主要組織適合性複合体(MHC)クラスI及びクラスII分子による提示のための、抗原の取り込みとプロセシングにおいて非常に有効であり、それに対して成熟DCは、抗原獲得とプロセシングにおける有効性は低いが、細胞表面におけるMHC分子と共刺激分子の発現が高いために、記憶していない(naive)及び記憶したCD4+ 及びCD8+ T細胞をより良く刺激する。未成熟なDCは抗原を取り込んだ後にインビボで成熟し、リンパ系器官のT細胞区域へ移動し、そしてT細胞活性化をプライムする。
Ad11に基づく組み換えウイルスと生成するためのプラスミドに基づくベクターシステムの構築
実施例5において述べた中和実験の結果は、Ad35と同様にAd11もまた、ヒト血清サンプルの大部分においては中和されないことを示している。そこで、Ad11に基づく組み換えアデノウイルスは、遺伝子治療処置及びワクチン接種のためのベクターとして、一般的に使用されるAd2及びAd5に基づくベクターよりも好ましい。Ad35とAd11の両者はBグループのウイルスであり、DNAホモロジークラスター2に属するウイルスとして分類されている(Wadell,1984)。そこで、Ad35とAd11のゲノムは非常に似通っている。Ad11に基づく組み換えウイルスの作製ためプラスミドに基づくシステムを生成するために、実施例7において生成したアダプタープラスミドpAdApt35IP1を下記の様に改変した。
患者から得られたサンプルの中のウイルスの中和
実施例1と5の中で述べた中和実験において、全てのサンプルは健康なボランティアから得た。非中和ベクターの適用の一つは遺伝子治療の分野であり、遺伝子治療の処置の候補者である患者群において、Ad35はやはり中和頻度が低く、力価も低いかどうかを検討することは興味深い。
26のペア血清と心嚢液(pericardial fluid:PF)のサンプルを、心不全を有する患者から得た。これらを、実施例1において述べた中和アッセイを用いて、Ad5とAd35について試験した。この結果は、健康なボランティアに由来するサンプルについての先のデータを確認するものであった。血清サンプルの70%はAd5のためのNAを含み、そして4%はAd35のためのNAを含んでいた。心嚢液サンプルでの力価はより低く、全体の40%がAd5のためのNAを有し、Ad35のためのNAを有するものはなかった。PF中のNAと血清の間には良い相関があり、即ち、ペア血清サンプル中にNAを有さない陽性PFサンプルはなかった。これらの結果は、Ad35に基づく非中和ベクターは、心血管疾患の治療の目的において、Ad5ベクターより好ましいことを示している。この適応における全ての形態の非中和ベクターについて正しいことであるが、ベクターは非中和血清型のゲノムに基づくか、又はAd5(又は他の血清型)に基づくことができるが、しかし、少なくとも非中和活性型の主要なカプシド蛋白質(ヘキソン、ペントン及び随意的に繊維組織)を提示している。
関節炎のもとにある分子決定因子はまだ知られていないが、関節におけるT細胞機能不全と成長因子産生の不均衡が、滑膜組織の炎症と過形成を引き起こすことが知られている。滑膜細胞(cynoviocyte)の増殖が開始し、軟骨と骨に侵入し、これらの組織を破壊する結果となる。現在の治療は(初期段階の時は)抗炎症剤(抗TNF,IL1−RA、IL−10)及び/又は従来の薬物(例えばMTX、スルファサラジン)の投与から始まる。リューマチ関節炎の後期段階においては、外科手術に基づく滑膜切除術、放射線照射、又は化学的な治療が行われる。替わりの又は付加的な選択は遺伝子治療を介した処置であり、そこでアデノウイルスベクターは患者の関節に直接に運搬され、抗炎症剤又は自殺遺伝子が発現する。コラーゲンによって誘導された関節炎に罹っているアカゲザルで行われた前の研究は、マーカー遺伝子を有するAd5に基づくベクターは、滑膜細胞(cynoviocyte)に形質導入することができることを示している。ヒトの場合において、アデノウイルスの運搬はNAの存在によって妨げられるかどうかは知られていない。
Ad35に基づくウイルスの骨格の修飾
1)pBr/Ad35.Pac−rITR及びpBr/Ad35.PRnの作製
実施例4は、Ad35サブクローンpBr/Ad35.Eco13.3の作製について述べている。このクローンはAd35の配列をbp21943からEcoRIへクローン化されたライトITRの末端まで、そしてpBr322のEcoRVを含む。これらの配列をAd35においてbp18137に位置しているPacI部位まで伸長するために、pBr/Ad35.Eco13.3(実施例4を見よ)をAatIIとSnaBIで消化し、そして断片を含んでいる大きなベクターをQIAEXIIゲル抽出キット(Qiagen)を用いてゲルから単離した。Ad35wtのDNAをPacIとSnaBIで消化し、上記のようにして4.6kb断片を単離した。そしてこの断片を、PacIとAatIIの突出を含んでいる二本鎖(ds)リンカーへライゲートした。下記のオリゴヌクレオチドをアニールした後にこのリンカーが得られた。
A−P1:5’−CTG GTG GTT AAT−3’
A−P2:5’−TAA CCA CCA GAC GT−3’
アデノウイルスはヒト細胞に異なった効率で感染する。感染は以下を含む2つの過程を伴っている。1.ウイルスと細胞上の特異的なレセプターへの結合を仲介する繊維組織蛋白質、及び2.例えばRGD配列と細胞表層に存在するインテグリンへの相互作用による、インターナリゼーションを仲介するペントン蛋白質。Ad35がメンバーであるサブグループBのウイルスについては繊維蛋白質のための細胞間レセプターは知られていない。ヒト細胞の感染効率において、Ad5の様なサブグループCのウイルスと比較して、サブグループBのウイルスには大きな差がある(WO 00/03029とEP 99200624.7を見よ)。一つのサブグループ内でさえも、特定のヒト細胞の感染効率は種々の血清型の間で異なることがある。例えば、Ad16の繊維組織は、Ad5に基づく組み換えウイルス上に存在するとき、ヒト及びアカゲザル由来の初代内皮細胞、平滑筋細胞及び滑膜細胞(cynoviocyte)に、Ad35又はAd51の繊維組織を有するAd5キメラウイルスよりも良く感染する。そこで、Ad35に基づくウイルスの高い感染活性を得るために、繊維蛋白質を異なった血清型の繊維蛋白質に変えることが必要かもしれない。その様な繊維キメラの技術が、実施例3においてAd5に基づくウイルスについて述べられており、下記においてAd35ウイルスについて例示されている。
左フランキング配列と、Ad35の繊維蛋白質の一部分である特異なMluI部位の上流であるbp30225から繊維組織の尾部のbp30872(図6に開示したwtAd35配列による番号)までの範囲を、以下のプライマーを用いて増幅した。
DF35−1:5’−CAC TCA CCA CCT CCA ATT CC−3’及び
DF35−2:5−CGG GAT CCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA GG−3’
繊維組織蛋白質の末端のbp31798から、特異なNdeI部位の3’から得たbp33199(wtAd35配列による番号、図6)までの範囲の右フランキング配列を、以下のプライマーを用いて増幅した。
DF35−3:5’−CGG GAT CCG CTA GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAA TCA C−3’及び
DF35−4:5’−CCA GTT GCA TTG CTT GGT TGG−3’
5’−CCK GTS TAC CCG TAC GAA GAT GAA AGC−3’及び
5’−CCG GCT AGC TCA GTC ATC TTC TCT GAT ATA−3’
アデノウイルスE4プロモーターはE1蛋白質の発現によって活性化される。Ad5のE1蛋白質が、Ad35のE4プロモーターの活性化を仲介することが可能であるかどうかは未知である。そこで、PCR.C6細胞においてAd35組み換えウイルスの作製を可能とするために、E1に依存しないE4の発現を作製することは有利であろう。これは、Ad35−E4プロモーターを異種のプロモーター、それに限定するものではないが例えば7xTetOプロモーター、により、によって置き換えることにより達成できる。E1を欠損したAd5に基づく組み換えベクターは、E1が発現しないにも関わらず、標的細胞でベクター骨格に由来するウイルス遺伝子の発現が残ることを示している。ウイルス遺伝子の発現は毒性を増加し、感染された細胞に宿主免疫反応を引き起こすかもしれない。遺伝子治療とワクチン接種の分野における、多くのアデノウイルスベクター適用において、骨格に由来するウイルス遺伝子の発現を減少又は消滅させることが望まれている。これを達成する道の一つは、ウイルス骨格に由来する配列を全て、又はできるだけ多く除くことである。E2A、E2B又はE4遺伝子及び/又は後期遺伝子の機能を除くことにより、作製する間にこれらの機能を補わなければならない。
355ITR: 5'-GAT CCG GAG CTC ACA ACG TCA TTT TCC CAC G-3'および
353ITR: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT C-3'
である。このフラグメントは、bp34656(wtAd35に従った番号)とpBr/Ad35.PRnの右ITRのNoti部位3'との間の配列を含み、かつ右ITR配列のSstI部位5'を導入する。
35DE4: 5'-CCC AAG CTT GCT TGT GTA TAT ATA TTG TGG-3'および
35F7である。実施例7を参照のこと。このPCRはbp33098と34500(wtAd35に従った番号)との間のAd35配列を増幅し、かつE4 TATAボックスの上流にHindIII部位を導入する。これら2つのPCR反応により、E4プロモーターの右および左フランキング配列を増幅する。増幅には、製造元の説明書に従ってPwo DNAポリメラーゼを用いた。
TATAplus: 5'-AGC TTT CTT ATA AAT TTT CAG TGT TAG ACT AGT AAA TTG CTT AAG-3'および
TATAmin: 5'-AGC TCT TAA GCA ATT TAC TAG TCT AAC ACT GAA AAT TTA TAA GAA-3'(下線部の配列は修飾TATAボックスを形成する)
を合成した。このオリゴヌクレオチドをアニールして、HindIIIで消化したDNAと適合する5'オーバーハングを有する2本鎖DNAフラグメントを得た。アリーリング反応の生成物を、HindIIIで消化したpGL3エンハンサーベクター(Promega)にライゲートして、pAAO-E-TATAを得た。さらにクローニングするために、修復した挿入フラグメントの5'末端にHindIII部位を有するクローンを選択した。
tet3: 5'-CCG GAG CTC CAT GGC CTA ACT CGA GTT TAC CAC TCC C-3'および
tet5: 5'-CCC AAG CTT AGC TCG ACT TTC ACT TTT CTC-3'
である。増幅したフラグメントをSstIおよびHindIII(これらの部位は、それぞれtet3およびtet5に存在する)で消化し、SstI/HindIIIで消化したpAAO-E-TATAにクローンして、pAAO-E-TATA-7xtetOを得た。
E1欠損Ad35ウイルスを補完することのできる細胞株の産生pIG135およびpIG270の産生
構築物pIG.ElA.ElBは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)およびB型肝炎ウイルスのpolyA配列と作用的に連結された459〜3510のwt Ad5配列(Genbank寄託番号M72360)に対応するAd5のE1領域配列を含む。この構築物の産生についてはWO97/00326に記載されている。Ad5のE1配列をAd35の対応する配列で次のように置換する。pRSV.Ad35-E1(実施例8において説明)をEcoRIおよびSse8387Iで消化し、Ad35 E1配列に対応する3 kbのフラグメントをゲルから単離した。構築物pIG.ElA.ElBをSse8387Iで完全に消化し、EcoRIで部分的に消化した。Ad5 E1領域を有しないが、PGKプロモーターを有するベクター配列に対応する4.2 kbのフラグメントをLMPアガロースゲル上の他のフラグメントから分離し、ゲルからコレクトバンド(correct band)を励起する。得られたフラグメントの両者をライゲートし、pIG.Ad35-Elを得た。このベクターを更に修飾して、pUC119ベクターのバックボーンに存在するLacZ配列を取り出す。ここで、ベクターをBsaAIおよびBstXIで消化し、ゲルから巨大フラグメントを単離する。2本鎖オリゴを次の2つのオリゴをアニールして調製する。
BB1: 5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3'および
BB2: 5'-GTG GCC TAG GCA C-3'
である。
270F: 5'-CAC CTC TGC CTA ATC ATC TC -3'および
270R: 5'-GCT CTA GAA ATT CCA CTG CCT TCC ACC -3'
である。
新生WAG/RIJラットを妊娠1週で屠殺し、腎臓を取り出した。被膜を慎重に取り除いた後、37℃のトリプシン/EDTA(LTI)中で複数回インキュベーションし、1%FBSを含有する冷PBS中で浮遊細胞を収集することにより腎臓を単細胞懸濁液に分解した。腎臓のほとんどがトリプシン処理されると、10%FBSを補ったDMEM中に全細胞を再懸濁し、滅菌チーズクロスで濾過した。1つの腎臓から得た胚ラット腎臓(BRK)細胞を5つの皿(Greiner、6cm)に入れた。細胞密度が70〜80%に達すると、製造元の説明書に従い、CaPO4を用いて細胞を1または5μgDNA/皿でトランスフェクトした。次の構築物を別々のトランスフェクションに用いた。pIG.E1A.E1B (Ad5-E1部位を発現)、pRSV.Ad35-E1、pIG.Ad35-E1およびpIG270(後者はAd35-E1を発現)である。病巣がトランスフェクトした細胞に現れるまで、細胞を37℃、5%CO2でインキュベートした。表4は環状または線状DNAを用いた幾つかのトランスフェクション実験から得られた病巣の数を示している。予想通り、Ad5-E1部位は効率的にBRK細胞に転換した。効率は低いが、病巣はAd35-E1トランスフェクト細胞層にも発現した。Ad35に転換した病巣はより遅い時期に現れた。Ad5-E1では7〜10日であったのに対し、Ad35ではトランスフェクト後約2週間であった。これらの実験は、BグループウイルスAd35のE1遺伝子がげっ歯類プライマリー細胞を転換することができることを明白に示している。これによりAd35-E1発現構築物の機能性が証明され、かつBグループウイルスAd3およびAd7の転換能力に関する初期の発見(Dijkema、1979年)が追認された。病巣内の細胞が実際に転換されたものであるか否かを調査するために、幾つかの病巣を取り出して増大した。7つの病巣中少なくとも5つが確立した細胞株として増殖することが分かった。
羊膜穿刺後に得た羊水を遠心分離し、細胞をAminoMax培地(LTI)中に再懸濁し、組織培養フラスコ内で37℃、10%CO2で培養した。細胞が順調に増殖した時点(およそ1細胞分裂/24時間)で、AminoMax完全培地とGlutamax I(最終濃度4mM、LTI)、グルコース(最終濃度4.5g/L、LTI)および10%FBS(LTI)を補ったDMEM低グルコース培地(LTI)との1:1混合液に培地を交換した。トランスフェクションのために、約5×105細胞を10cm細胞培養皿に入れた。翌日、CaPO4トランスフェクションキット(LTI)を用い、製造元の説明書に従って細胞を皿当たり20マイクログラムの環状PIG270でトランスフェクトし、DNAを沈降させながら細胞を一晩インキュベートした。その翌日、細胞をPBSで4回洗浄して沈殿物を除去し、転換細胞の病巣が現れるまで3週間以上さらにインキュベートした。1週間に1回、培地を新しい培地に交換した。他のトランスフェクション剤、例えばLipofectAmine(LTI)またはPEI (ポリエチレンイミン、高分子量、水フリー、Aldrich)を用いたが、これに限定されるものではない。これら3つの薬剤のうち、一次ヒト羊膜に対してPEIが最も高いトランスフェクション効率を達成する。すなわちpAdApt35.LacZのトランスフェクション後48時間で約1%の青色細胞である。
ヒト網膜細胞を流産した胎児の目から分離し、10%FBS(LTI)を補ったDMEM培地(LTI)中で培養する。トランスフェクションの前日に、約5×105細胞を6cm皿に入れ、37℃、10%CO2で一晩培養する。製造元の説明書に従い、CaPO4沈殿キットを用いてトランスフェクションを行う。環状プラスミドまたは精製フラグメントのいずれかとして、各皿を8〜10μgのpIG270 DNAでトランスフェクトする。精製フラグメントを得るために、pIG270をAvrIIおよびXbaIで消化しAd35 E1発現カセットに対応する4kbのフラグメントをアガラーゼ処理(Roche)によりゲルから単離した。翌日、滅菌PBSで4回洗浄して、沈殿物を慎重に洗い流す。次いで、新しい培地を加え、転換細胞の病巣が現れるまでトランスフェクトした細胞を更に培養する。十分に大きくなると(>100細胞)、病巣を取り出し、前記したようにして96ウエルに入れる。増殖を続けるトランスフォームしたヒト胚網膜芽細胞のクローンを増大し、異なるサブグループのE1欠失アデノウイルスベクター、具体的にはBグループウイルス、特にはAd35またはAd11から誘導されたものの補体増殖に対する能力を分析した。
実施例8で説明したとおり、Ad35-E1発現構築物、例えばpRSV.Ad35.E1の同時トランスフェクションと共に、Ad35 E1欠失ウイルスをPER.C6細胞上に作製および増殖させることができる。しかし、この方法を用いた組換えアデノウイルスの大規模生産は煩雑である。なぜなら、各増幅ステップに対して、Ad35-E1構築物のトランスフェクションが必要だからである。さらに、この方法では、プラスミドとウイルスゲノムとの間での非相同的組換えの危険性が増すと同時に、E1配列を組み込んだ組換えウイルスを作製する可能性が高くなり、複製コンピテントウイルスを生じる。これを避けるために、PER.C6におけるAd35-E1タンパク質の発現を、ゲノム中の発現プラスミドの完全複製により媒介する必要がある。PER.C6細胞は既に形質転換されており、かつAd5-E1タンパク質を発現しているので、さらにAd35-E1発現を加えることは細胞に対して有毒となり得る。しかし、Ad5-E1を発現するA549細胞が作られているので、E1タンパク質を有する転換細胞を安定にトランスフェクトすることも不可能ではない。
初期領域1および初期領域2Aを欠失した組換えアデノウイルスベクターの生産のための産生細胞株の作製
PER.C6-tTA細胞の作製
ここで、初期領域1(E1)および初期領域2A(E2A)を欠失した組換えアデノウイルスベクター産生用の細胞株の作製について説明する。産生細胞株は、それぞれE1およびE2A遺伝子の構成性発現によるトランスでの組換えアデノウイルスベクター由来のE1およびE2A欠失を補完する。予め確立されたAd5-E1形質転換ヒト胚網膜芽細胞株PER.C6(WO 97/00326)にE2A発現カセットをさらに付与した。
pcDNA3wtE2A:完全な野生型初期領域2A(E2A)コード領域を、供給元(Boehringer Mannheim)の標準的な手順にしたがって、ExpandTM Long Template PCRシステムを用い、プライマーDBPpcr1およびDBPpcr2を用いて、プラスミドpBR/Ad.Bam-rITR(ECACC寄託番号P97082122)から増幅した。PCRを、次の増幅プログラムを用いてBiometra Trio Thermoblockに行った。94℃で2分間を1サイクル、94℃で10秒間+51℃で30秒間+68℃で2分間を1サイクル、94℃で10秒間+58℃で30秒間、68℃で2分間を10サイクル、94℃で10秒間+58℃で30秒間+68℃で2分間およびサイクルごとに10秒間の伸長を20サイクル、68℃で5分間を1サイクルである。プライマーDBPpcr1:CGG GAT CCG CCA CCA TGG CCA GTC GGG AAG AGG AG(5'から3'へ)は、固有のBamHI制限部位(下線部)、Kozak配列(斜体部)の5'およびE2Aコード配列の開始コドンを含む。プライマーDBPpcr2:CGG AAT TCT TAA AAA TCA AAG GGG TTC TGC CGC(5'から3'へ)は、固有のEcoRI制限部位(下線部)、E2Aコード配列の終止コドンの3'を含む。太字は、E2Aコード領域由来の配列をいう。PCRフラグメントを、BamHI/EcoRIで消化し、BamHI/EcoRI消化pcDNA3(Invitrogen)にクローン化し、pcDNA3wtE2Aを得た。
PER.C6細胞を、10%CO2雰囲気内、32℃、37℃または39℃のいずれかの温度で、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco BRL)および10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco BRL)で培養した。0日目、全体で1×106のPER.C6細胞を25cm2組織培養フラスコ(Nunc)に播種し、細胞を32℃、37℃または39℃のいずれかで培養した。1〜8日目に細胞を計数した。図30は39℃におけるPER.C6細胞培養の増殖率および最終細胞密度を37℃の場合と比較して示す。32℃におけるPER.C6培養の増殖率および最終密度は37℃または39℃のものと比較して僅かに減少した。顕著な細胞死は、いずれのインキュベーション温度でも観察されなかった。したがって、PER.C6細胞は、それぞれts125E2Aに対する許容温度および非許容温度である39℃と32℃の両方で非常に良好に機能する。
トランスフェクション前日に、2×106PER.C6細胞を10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを収容した6cm組織培養皿(Greiner)に播種し、10%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。翌日、10%CO2雰囲気中、39℃で細胞をトランスフェクトする以外は供給元(Gibco BRL)の標準手順に従って、LipofectAMINE PLUSTM試薬キットを用いて組織培養皿あたり3、5または8μgのpcDNA3、pcDNA3wtE2AまたはpcDNA3tsE2AプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をts125E2Aの非許容温度である39℃に一定して保った。3日後、10%FBS、10mMのMgCl2、および0.25mg/mlのG418(Gibco BRL)を補ったDMEMに細胞を入れ、トランスフェクション10日後に最初のG418耐性コロニーが出現した。表1に示すように、pcDNA3のトランスフェクション後に得られたコロニー全数(約200コロニー)またはpcDNA3tsE2Aのトランスフェクション後に得られたコロニー全数(約100コロニー)とpcDNA3wtE2Aのトランスフェクション後に得られたコロニー全数(わずか4コロニー)との間には著しい差があった。これらの結果は、構成的に発現されたE2Aの毒性がE2A(ts125E2A)の温度感受性突然変異株を用い、かつ細胞を非許容温度である39℃で培養することによって克服することができることを示している。
アデノウイルスAd5.dl802は、E2Aコード領域の主要部分が欠失したAd5由来ベクターであり、機能的DBPを産生しない。Ad5.dl802を、ts125E2Aを構成的に発現するPER.C6細胞のE2Aトランス補完活性を試験するために用いた。親PER.C6細胞またはPER.C6tsE2Aクローン3-9を、10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEM中で、39℃、10%CO2で25cm2フラスコ内で培養し、m.o.i.5でAd5.dl802による擬似感染または感染のいずれかを行った。続いて、感染細胞を32℃で培養し、細胞を、細胞の形態およびフラスコからの細胞の剥離における変化を測定することで細胞変性効果(CPE)の発現によってスクリーニングした。2日以内にAd5.dl802に感染したPER.C6tsE2Aクローン3-9に完全なCPE発現が行われた。Ad5.dl802に感染したPER.C6細胞または擬似感染細胞には、CPEは発現しなかった。これらのデータは、ts125E2Aを構成的に発現しているPER.C6細胞が許容温度32℃でAd5.dl802ベクターのE2A欠失に対してトランスで補完することを示している。
ヒト遺伝子治療のために組換えアデノウイルスベクターを大規模で産生することは、任意のヒトまたは動物構成物質を欠いている培地で、産生細胞株、好ましくは懸濁培養の容易かつ拡張可能な培養方法を必要とする。このために、細胞株PER.C6tsE2A c5-9(c5-9と表す)を39℃、10%CO2中で10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを収容した175cm2フラスコ(Nunc)で培養した。準集密性(70〜80%集密)で、細胞をPBS(NPBI)で洗浄し、培地を1倍L−グルタミン(Gibco BRL)を補った25mlの無血清懸濁培地Ex-cellTM 525(JRH)(以下SFMと示す)と交換した。2日後、軽く叩くことで細胞をフラスコから剥離し、この細胞を1000rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを、5mlのSFM中に再懸濁し、0.5ml細胞懸濁液を12mlの新しいSFMとともに、80cm2組織培養フラスコ(Nunc)に移した。2日後、細胞を収穫し(全ての細胞が懸濁状態にある)、Burker細胞計数器で計数した。次に、20mlのSFMの全容量において3×105細胞/mlの細胞密度で、細胞を125ml組織培養エルレンマイヤー(Corning)に播種した。細胞を、39℃、10%CO2雰囲気内において、125rpmのオービタルシェーカー(GFL)でさらに培養した。1〜6日目に細胞をBurker細胞計数器で計数した。図4では、8つの培養から得た平均増殖曲線を示す。PER.C6tsE2A c5-9は、無血清懸濁培養で良好に機能する。培養5日以内に1mlあたり約2×106細胞の最大細胞密度が達成された。
PER.C6細胞またはPER.C6ts125E2A(c8-4)細胞を37℃(PER.C6)または39℃(PER.C6ts125E2A c8-4)のいずれかの10%CO2雰囲気内において、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco BRL)および10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、GibcO BRL)で培養した。0日目、全体で1×106の細胞を25cm2組織培養フラスコ(Nunc)に播種し、細胞をそれぞれの温度で培養した。示した時期において、細胞を計数した。37℃におけるPER.C6細胞の増殖は39℃におけるPER.C6ts125E2A c8-4の増殖に匹敵した(図33)。これは、ts125E2AをコードしたDBPの構成的発現は、非許容温度である39℃において細胞の増殖に対して逆効果を有していないことを示している。
幾つかの継代に対し、PER.C6ts125E2A細胞株クローン8-4を、39℃、10%CO2で、10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを含む25cm2細胞培養フラスコ(Nunc)で、選択圧(G418)無しで培養した。準集密性(70〜80%集密)で、細胞をPBS(NPBI)で洗浄し、RIPA(1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、および0.1%SDSを含むPBSであって、さらに1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび0.1mg/mlトリプシン阻害剤を補充したPBS)中に溶解し、こすり取った。氷上で15分間インキュベーションした後、ライセートを遠心分離によって取り除いた。タンパク質濃度は、供給元(BioRad)の標準手順に従い、Bio-Radタンパク質アッセイによって測定した。等量の全細胞抽出物を10%ゲル上でSDS-PAGEによって分画化した。タンパク質をImmobilon-Pメンブラン(ミリポア)に移し、αDBPモノクローナル抗体B6と共にインキュベートした。2次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体(BioRad)であった。ウェスタンブロッティング法および抗体のインキュベーションは、ミリポアによって提供された手順に従って実施した。抗体複合体を、製造元(Amersham)の手順に従ってECL検出システムによって可視化した。少なくとも16継代にわたり、ts125E2AをコードしたDBPの発現は安定であった。これはおよそ40細胞倍加に相当する(図34)。この培養期間においてDBPレベルの減少は観察されず、G418選択圧が無い場合においてさえもts125E2Aの発現が安定であることが示された。
tTA発現パッケージング細胞株の作製
A.tTA遺伝子を発現するプラスミドの作製
pcDNA3.1-tTa:tTA遺伝子、tetRおよびVP16遺伝子の融合体を、制限酵素BamHIおよびEcoRIを用いた消化により、プラスミドpUHD15-1から取り除いた(GossenとBujard、1992年)。まず、pUHD15-1をEcoRIで消化した。dNTPsの存在下で線状プラスミドをクレノー酵素で処理し、EcoRI付着末端を塞いだ。次に、プラスミドをBamHIで消化した。得られた長さ1025bpのフラグメントをアガロースから精製した。続いて、このフラグメントをBamHI/EcoRVで消化したpcDNA 3.1HYGRO(-)(Invitrogen)とのライゲーション反応に用いて、pcDNA3.1-tTAを得た。コンピテントなE.Coli DH5α(Life Tech.)への転換、およびアンピシリン耐性コロニーの分析の後、pcDNA3.1-tTAに期待される消化パターンを示す一つのクローンを選択した。
トランスフェクション前日に、2×106のPER.C6細胞またはPER.C6/E2A細胞を10%FBS(JRH)および10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変基本培地(DMEM、Gibco BRL)を収容した60mm組織培養皿(Greiner)に播種し、10%CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。翌日、供給元(Gibco BRL)の標準手順に従って、LipofectAMINE PLUSTMを用いて4〜8μgのpcDNA3.1-tTAプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトした。この細胞をLipofectAMINE PLUSTMTM−DNA混合物とともに37℃、10%CO2で4時間インキュベートした。次いで、20%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを2ml加え、37℃、10%CO2で細胞をさらにインキュベートした。翌日、細胞をPBSで洗浄し、10%FBSおよび10mMのMgCl2を補った新しいDMEMで、10%CO2雰囲気中37℃(PER.C6)または39℃(PER.C6/E2A)のいずれかで3日間インキュベートした。その後、培地を選択培地に交換した。PER.C6細胞は10%FBS、10mMのMgCl2および50μg/mlのハイグロマイシンB(GIBCO)を補ったDMEMでインキュベートし、一方、PER.C6/E2A細胞は10%FBS、10mMのMgCl2および100μg/mlのハイグロマイシンBを補ったDMEM中に維持した。選択耐性のある細胞のコロニーは3週間以内に現れたが、非耐性細胞はこの期間内に死滅した。
実施例1で記載したとおり、中和化実験に用いた全てのヒトアデノウイルスをPER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)に産生し(Fallauxら、1998年)、CsClで精製した。HPLCカラムから異なる血清型が溶出するNaCl濃度を示した。ウイルス粒/ml(VP/ml)をAd5水準から計算した。実施例1で記載したとおり、中和化実験と並行して滴定を行って、実験の力価(CCID50)をPER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)上で測定した。本実験に用いた44のウイルスに対するCCID50を示した。これは5日後に50%のウエルにおいてCPEを得るのに必要なウイルスの希釈率を示している。VP/CCID50の比をlog10で示した。これはPER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)の異なるバッチの感染力の測定値である。
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Claims (5)
- 組換えアデノウイルスをコードするアデノウイルス核酸配列を含み、アデノウイルス核酸配列はE1領域の欠失を含み、前記欠失は宿主細胞において組換えアデノウイルスを複製欠損にさせ、前記アデノウイルスはAd26である、組換えアデノウイルス。
- さらに、発現調節配列に動作可能に連結した興味のある遺伝子を含む、請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- 前記アデノウイルス核酸配列のE1領域は興味のある遺伝子を含む、請求項2に記載の組換えアデノウイルス。
- 請求項2に記載の組換えアデノウイルス、および適切な賦形剤を含む、製薬上の調剤物。
- 組換えAd26アデノウイルス群のバッチであり、その各アデノウイルスはAd26であり、および組換えアデノウイルスをコードするアデノウイルス核酸配列を含み、アデノウイルス核酸配列は興味のある遺伝子を含み、さらにE1領域の欠失を含み、前記E1領域の欠失は宿主細胞において組換えアデノウイルスを複製欠損にさせ、そして組換えAd26アデノウイルス群のバッチは複製可能なアデノウイルスを含んでいない、バッチ。
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