ES2289426T3 - Adenovirus recombinante humano de serotipo 35. - Google Patents
Adenovirus recombinante humano de serotipo 35. Download PDFInfo
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Abstract
Un adenovirus recombinante, donde dicho adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 35 (Ad35).
Description
Adenovirus recombinante humano de serotipo
35.
La presente invención se refiere al campo de la
terapia génica, en particular a la terapia génica que implica
elementos derivados de virus, más concretamente elementos de
adenovirus. Los adenovirus han sido propuestos como vehículos
adecuados para liberar genes al anfitrión.
Existen numerosos rasgos de los adenovirus que
los hacen particularmente útiles para el desarrollo de vectores de
transferencia génica para la terapia génica en humanos:
El genoma de adenovirus está bien caracterizado.
Consta de una molécula de ADN de doble hebra lineal de
aproximadamente 36.000 pares de bases. El ADN de adenovirus
contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) idénticas de
aproximadamente 90-140 pares de bases con una
longitud exacta que depende del serotipo. Los orígenes de
replicación virales están en las ITR exactamente en los extremos
del genoma;
La biología de los adenovirus está caracterizada
en detalle; el adenovirus no está asociado con una patología humana
grave en individuos inmunocompetentes;
El virus es extremadamente eficaz al introducir
su ADN en la célula anfitriona; el virus puede infectar una amplia
gama de células y tiene una amplia gama de anfitriones;
El virus puede ser producido a elevados títulos
de virus en grandes cantidades;
El virus se puede volver de replicación
defectuosa mediante la deleción de la región temprana 1 (E1) del
genoma viral (Brody et al., 1994). La mayoría de los
vectores adenovirales utilizados en la actualidad en la terapia
génica tienen una deleción en la región E1, en la que se puede
introducir la información genética deseada.
Basándose en estas características, los métodos
preferidos para la transferencia génica in vivo en células
diana humanas, hacen uso de vectores adenovirales como vehículos de
liberación de genes.
No obstante, todavía existen desventajas
asociadas con el uso terapéutico de vectores adenovirales en
humanos. Una desventaja principal es la existencia de una inmunidad
pre-existente muy difundida entre la población
contra los adenovirus. La exposición a adenovirus de tipo salvaje es
muy común en humanos, como ya se ha documentado ampliamente
[revisado en Wadell, 1984]. Esta exposición ha dado como resultado
respuestas inmunitarias contra la mayor parte de los tipos de
adenovirus, no sólo contra los adenovirus a los cuales han sido
expuestos los individuos realmente, si no también contra los
adenovirus que tienen epítopos similares (neutralizantes). Este
fenómeno de los anticuerpos pre-existentes en
humanos, combinado con una fuerte respuesta inmunitaria humoral y
celular secundaria contra el virus, puede afectar seriamente a la
transferencia génica utilizando vectores adenovirales recom-
binantes.
binantes.
Hasta la fecha, se han propuesto seis subgrupos
diferentes de adenovirus humanos que en total abarcan 51 serotipos
de adenovirus distintos (véase el la Tabla 1). Un serotipo se define
basándose en su carácter distintivo determinado por neutralización
cuantitativa con antisueros animales (caballo, conejo). Si la
neutralización muestra cierto grado de reacción cruzada entre dos
virus, se supone el carácter distintivo del serotipo si A) las
hemaglutininas no están relacionadas, como muestra la carencia de
reacción cruzada en la inhibición de hemaglutinación, o B) existen
diferencias biofísicas/bioquímicas sustanciales en el ADN (Francki
et al., 1991). Los nueve serotipos identificados finalmente
(42-51) fueron aislados por primera vez de pacientes
infectados con VIH (Hierholzer et al. 1988; Schnurr et
al., 1993). Por razones no bien comprendidas, la mayoría de los
pacientes inmunocomprometidos desprendían adenovirus raramente o
jamás aislados de individuos inmunocompetentes (Hierholzer et
al., 1988, 1992; Khoo et al., 1995, De Jong et
al., 1998).
La inmensa mayoría de los individuos habían sido
expuestos previamente a adenovirus, especialmente los serotipos de
adenovirus 5 y el tipo 2 (Ad5 y Ad2) bien investigados o a serotipos
inmunológicamente relacionados. Importantemente, estos dos
serotipos también son los más ampliamente estudiados para su uso en
terapia génica en humanos.
El adenovirus recombinante según la invención
también puede comprender elementos de otros (adeno)virus, con
tal que se remplace un elemento que pudiera conducir a la inmunidad
contra semejante vehículo de reparto génico por un elemento de
adenovirus 35 o un homólogo funcional del mismo, que tenga reducida
semejante desventaja y preferiblemente que evite semejante
desventaja. En la presente invención un vehículo de reparto génico
es cualquier vehículo que sea capaz de liberar un ácido nucleico de
interés en una célula anfitriona. Este debe, según la invención
comprender un elemento de adenovirus 35 o un equivalente funcional
de semejante elemento, que debe tener un efecto beneficioso en lo
referente a la respuesta inmunitaria contra semejante vehículo.
Básicamente todos los demás elementos que constituyen el vehículo
pueden ser cualquiera de los elementos conocidos en la técnica o
desarrollados en la técnica, con tal que juntos sean capaces liberar
dicho ácido nucleico de interés. En principio el experto en la
técnica puede utilizar y/o producir cualquiera de los productos
adenovirales o sistemas de producción que puedan o hayan sido
aplicados en el campo de los adenovirus. Típicamente los productos
de la invención pueden ser elaborados en células de empaquetamiento
utilizables v.g. para adenovirus 5, típicamente los vectores
basados en adenovirus 35 pueden ser producidos y/o utilizados de la
misma manera que los de los otros adenovirus v.g. adenovirus 2 y/o
5. Una buena visión de conjunto de las posibilidades de los
vectores mínimos, los sistemas de empaquetamiento, la amplificación
intracelular, los sistemas basados en vectores y plásmidos puede
ser encontrada en las solicitudes copendientes de los autores de la
presente solicitud (PCT/NL99/00235 y PCT/NL96/00244). Los sistemas
de liberación no virales también pueden ser proporcionados con
elementos según la invención como lo pueden los sistemas de
liberación virales. Ambas clases de sistemas son bien conocidas en
la técnica en muchas estructuras diferentes y por lo tanto no
necesitan ninguna explicación adicional aquí. Una revisión de los
muchos sistemas diferentes y de sus propiedades se puede encontrar
en Robbins y Ghivizzani (1998) y en Prince (1998).
Los vehículos de liberación génica contienen
típicamente un ácido nucleico de interés. Un ácido nucleico de
interés puede ser un gen o una porción funcional de un gen (donde un
gen es cualquier ácido nucleico que puede ser expresado) o un
precursor de un gen o un gen transcrito en cualquier nivel de ácido
nucleico (ADN y/o ARN; de hebra doble o sencilla). Los genes de
interés son bien conocidos en la técnica e incluyen típicamente
aquellos que codifican proteínas terapéuticas tales como TPA, EPO,
citocinas, anticuerpos o derivados de los mismos, etc. Una visión
de conjunto de las proteínas terapéuticas que se van a aplicar en
terapia génica se enumera más abajo.
Factores inmunoestimuladores como los antígenos
específicos de tumores, las citocinas, etc.;
Ejemplos no limitantes de factores
anti-angiogénicos endostatina, angiostatina,
ATF-BPTI CDT-6, mutantes VEGF
negativos dominantes, etc.;
Ejemplos no limitantes de factores angiogénicos
VEGF, Factores de crecimiento de fibroblastos, Oxido nítrico
sintetasas, Péptidos natriuréticos de tipo C, etc.;
Proteínas inhibidoras de la inflamación como
CD40 soluble, FasL, IL-12, IL-10,
IL-4, IL-13 y anticuerpos de cadena
sencilla excretados para CD4, CD5, CD7, CD52, IL-2,
IL-1, IL-6, TNF, etc. o anticuerpos
de cadena sencilla excretados al receptor de las células T en
células T auto-reactivas. También se pueden utilizar
mutantes negativos de PML dominantes para inhibir la respuesta
inmunitaria.
Además, se pueden utilizar antagonistas de las
citocinas promotoras de la inflamación, por ejemplo la
IL-1RA (antagonista de receptor) y los receptores
solubles como sIL-1RI, sIL-1RII,
sTNFRI y sTNFRII. Asimismo se pueden utilizar genes inhibidores del
crecimiento y/o la respuesta inmunitaria tales como ceNOS, Bc13,
cactus e I\kappa\beta\alpha, \beta o \gamma y las
proteínas que inducen la apoptosis como la proteína VP3 del virus
de la anemia de pollo. Además, se pueden utilizar genes suicidas
como HSV-TK, citosina desaminasa, nitrorreductasa y
linamerasa.
Un ácido nucleico de interés también puede ser
un ácido nucleico que puede hibridar con una secuencia de ácido
nucleico presente en la célula anfitriona inhibiendo de ese modo la
expresión o transcripción o traducción de dicho ácido nucleico.
También puede bloquear por medio de la co-supresión.
En resumen un ácido nucleico de interés es cualquier ácido nucleico
que se puede desear para proporcionar a una célula con el fin de
inducir una respuesta por esa célula, cuya respuesta puede ser la
producción de una proteína, la inhibición de semejante producción,
la apoptosis, la necrosis, la proliferación, la diferenciación etc.
La presente invención es la primera en describir el adenovirus 35 o
un homólogo funcional del mismo para uso terapéutico, para esto la
invención también proporciona un adenovirus de serotipo 35 o un
homólogo funcional del mismo o un virus quimérico derivado de él, o
un vehículo de liberación génica basado en dicho virus, su homólogo
o su quimera para su uso como fármaco. El propio serotipo de la
presente invención, el adenovirus de tipo 35, es conocido en la
técnica. Es un adenovirus del grupo B poco común que fue aislado de
pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida y otras
alteraciones de inmunodeficiencia (Flomenberg et al., 1987;
De Jong et al., 1983). Se ha demostrado que el Ad 35 difiere
del subgrupo C caracterizado más completamente (incluyendo Ad2 y
Ad5) con respecto a las propiedades patogénicas (Basler et
al., 1996). Se ha sugerido que esta diferencia puede tener
correlación con las diferencias en la región E3 del genoma de Ad35
(Basler et al., 1996). El ADN de Ad35 ha sido parcialmente
clonado y mapeado (Kang et al., 1989a y b;
Valderrama-Leon et al., 1985).
Los serotipos de adenovirus de tipo B tales como
34 y 35 tienen una región E3 diferente a los otros serotipos.
Típicamente esta región está implicada en la supresión de la
respuesta inmunitaria a los productos adenovirales. Por lo tanto
esta invención proporciona un vehículo de liberación génica según la
invención por medio del cual dichos elementos implicados en la
evitación o disminución de la respuesta inmunitaria comprenden los
productos de expresión de E3 de adenovirus 35 o los genes que los
codifican o equivalentes funcionales de cualquiera o de ambos.
Otra porción de los adenovirus implicada en la
respuesta inmunitaria es la cápsida, en particular las proteínas
pentona y/o hexona. Por lo tanto la invención también proporciona un
vehículo de liberación génica según la invención por medio del cual
los elementos comprenden al menos una proteína de la cápsida de
adenovirus 35 o una porción funcional de la misma, tal como las
proteínas de la fibra, la pentona y/o la hexona o un gen que
codifica al menos una de ellas. No es necesario que una proteína
completa relevante para la respuesta inmunitaria tenga su origen en
el adenovirus 35 (o un homólogo funcional del mismo). Es
perfectamente posible insertar una porción de una proteína de la
fibra, pentona o hexona de adenovirus en otra fibra, pentona o
hexona. De ese modo se obtienen proteínas quiméricas.
Asimismo es posible tener una pentona de cierto
adenovirus, una hexona de otro y una fibra o una región E3 de otro
adenovirus más. Según la invención al menos una de las proteínas o
genes que las codifican debe comprender un elemento de adenovirus
35 o un homólogo funcional del mismo, con lo que dicho elemento
tiene un efecto sobre la respuesta inmunitaria del anfitrión. Así
la invención proporciona una liberación génica según la invención,
que es una quimera de adenovirus 35 con otro adenovirus como mínimo.
De este modo también se puede modificar el virus resultante en
otros aspectos en lugar de sólo la respuesta inmunitaria. Se puede
intensificar su eficacia de infección con los elementos
responsables de la misma; se puede intensificar su replicación en
una célula de empaquetamiento, o se puede cambiar su tropismo.
De este modo la invención proporciona p. ej. un
vehículo de liberación génica según la invención que tiene un
tropismo diferente al del adenovirus 35. Por supuesto el tropismo
debe ser alterado preferiblemente de manera que el vehículo de
liberación génica sea liberado preferentemente en un subgrupo de
células del anfitrión, es decir las células diana. Los cambios en
el tropismo y los otros cambios que también pueden ser aplicados en
la presente invención de vehículos de liberación adenovirales o de
otros genes se describen en las solicitudes
co-pendientes de los autores de la presente
solicitud (núms. 98204482.8, 99200624.7 y 98202297.2). Por supuesto
la presente solicitud también proporciona todos y cada uno de los
bloques necesarios y/o útiles para obtener los vehículos de
liberación génica y/o las quimeras, etc. de la presente invención.
Esto incluye las células de empaquetamiento tales como PER.C6
(número de consigna en la ECACC 96022940) o células basadas en
ellas, pero adaptadas para Ad35 o un homólogo funcional del mismo;
también se incluyen cualquiera de los ácidos nucleicos que
codifican las porciones funcionales del adenovirus 35 o un homólogo
funcional del mismo, tales como los constructos coadyuvantes, y los
constructos de empaquetamiento, así como los vectores que comprenden
los genes de interés y p. ej. una ITR,
etc.
etc.
Típicamente la solicitud de los autores de la
presente solicitud (PCT/NL96/00244) describe los elementos
necesarios y útiles para lograr los vehículos de liberación génica
de la invención. Así la invención también proporciona un ácido
nucleico que codifica al menos una porción funcional de un vehículo
de liberación génica según la invención, o un virus, homólogo o
quimera del mismo según la invención. Según la invención, tales
elementos, que codifican funciones que terminarán en el vehículo de
liberación génica resultante deben comprender o ser codificados por
un ácido nucleico que codifique al menos uno de los elementos del
adenovirus de serotipo 35 o un equivalente funcional del mismo,
responsable de evitar o disminuir la actividad neutralizadora contra
los elementos adenovirales del anfitrión en el cual se ha liberado
el gen. Típicamente el gen de interés estará presente en el mismo
ácido nucleico lo que significa que semejante ácido nucleico tiene
semejante gen o que tiene un sitio para introducir allí un gen de
inte-
rés.
rés.
Típicamente semejante ácido nucleico también
comprende al menos una ITR y si es un ácido nucleico que va a ser
empaquetado también una señal de empaquetamiento. Sin embargo, como
se ha mencionado antes todos los elementos necesarios y útiles y/o
las unidades estructurales para la presente invención pueden ser
encontrados en la solicitud de los autores de la presente solicitud
(PCT/NL96/00244). Un grupo de mejoras adicionales en el campo de la
producción de vehículos de liberación génica adenovirales es el
sistema plasmídico de los autores de la presente solicitud descrito
en PCT/NL99/00235 mencionada antes en la presente memoria. Este
sistema funciona en una realización como una recombinación homóloga
de un plásmido adaptador y un plásmido más largo, comprendiendo
juntos todos los elementos del ácido nucleico que va a ser
incorporado al vehículo de liberación génica. Estos métodos también
pueden ser aplicados a los vehículos de liberación génica inventados
en el momento presente y a sus elementos estructurales. De este
modo la invención también proporciona un ácido nucleico según la
invención que comprende adicionalmente una región de nucleótidos
diseñada o utilizable para la recombinación homóloga,
preferiblemente como parte de al menos un grupo de dos ácidos
nucleicos que comprende un ácido nucleico según la invención, por
medio del cual dicho grupo de ácidos nucleicos es susceptible de un
evento de recombinación homóloga individual entre sí, que conduce a
un ácido nucleico que codifica un vehículo de liberación génica
funcional. Se proporcionan tanto las células de empaquetamiento
vacías (en las cuales todavía se tiene que introducir o producir el
vector que va a ser empaquetado para elaborar un vehículo de
liberación génica según la invención) como las células que
comprenden un vector según la invención que va a ser empaquetado. De
este modo la invención también abarca una célula que comprende un
ácido nucleico según la invención o un grupo de ácidos nucleicos
según la invención, preferiblemente una célula que complementa los
elementos necesarios para la replicación adenoviral que están
ausentes del ácido nucleico que va a ser empaquetado, o de un grupo
de ácidos nucleicos según la invención. En la presente invención se
ha descubierto que los vectores de adenovirus 35 con E1 suprimida,
no son susceptibles de replicación en células que proporcionan las
proteínas del adenovirus 5 en trans. La invención
proporciona por lo tanto adicionalmente una célula capaz de
proporcionar las proteínas E1 del adenovirus 35 en trans.
Semejante célula es típicamente una célula humana derivada de la
retina o el riñón. Se ha demostrado que las células embrionarias
tales como los amniocitos, son particularmente adecuadas para la
generación de una línea celular que complemente E1. Por lo tanto en
la presente invención se prefieren tales células. La
complementación específica del serotipo por las proteínas E1 puede
ser debida a una o más proteínas codificadas por la región E1. Por
lo tanto es esencial que al menos la proteína de serotipo
específico sea proporcionada en trans en la línea celular
complementadora. Las proteínas E1 no específicas del serotipo
esenciales para la complementación eficaz de un adenovirus con E1
suprimida pueden derivar de otros serotipos de adenovirus.
Preferiblemente, se proporciona al menos una proteína E1 de la
región E1B de adenovirus 35 en trans para complementar los vectores
basados en adenovirus 35 con E1 suprimida. En una realización el
ácido nucleico que codifica una o más proteínas E1 específicas del
serotipo es introducido en la célula PER.C6 o una célula que se
origina a partir de una célula PER.C6 (número de consigna en la
ECACC 96022940), o una célula de empaquetamiento similar que
complementa con los elementos de Ad 35 o un homólogo funcional del
mismo. Como ya se ha referido la invención también abarca un método
para producir un vehículo de liberación génica según la invención,
que comprende expresar un ácido nucleico según la invención en una
célula según la invención y cosechar el vehículo de liberación
génica resultante. Lo anterior hace referencia a la carga de la
célula de empaquetamiento vacía con los ácidos nucleicos relevantes.
El formato de la célula cargada también es por supuesto parte de la
presente invención, que proporciona un método para producir un
vehículo deliberación génica según la invención, que comprende
cultivar una célula de empaquetamiento cargada (célula productora)
según la invención en un medio de cultivo adecuado y cosechar el
vehículo de liberación génica resultante.
Los vehículos de liberación génica resultantes
obtenibles mediante cualquiera de los métodos según la invención
también son por supuesto parte de la presente invención, también
concretamente un vehículo de liberación génica según la invención,
que deriva de una quimera de un adenovirus y un virus
integrante.
Es bien sabido que los vehículos de liberación
génica adenovirales no se integran normalmente en el genoma
anfitrión. Para la expresión a largo plazo de los genes en una
célula anfitriona se prefiere por lo tanto preparar quimeras que
tengan esa capacidad. Tales quimeras han sido descritas en la
solicitud de los autores de la presente invención
co-pendiente PCT/NL98/00731. Un ejemplo muy bueno de
semejante quimera de adenovirus y un virus integrante donde dicho
virus integrante es un virus adenoasociado. Como se ha discutido
aquí antes otras quimeras útiles, que también pueden ser combinadas
con las anteriores son las quimeras (sea ésta en proteínas
completas intercambiables o partes de las mismas o ambas) que tienen
un tropismo alterado. Un ejemplo muy bueno de la misma es una
quimera de Ad 35 y Ad 16, posiblemente con elementos por ejemplo de
Ad 2 o Ad 5, donde la porción determinante del tropismo de Ad 16 o
un equivalente funcional del mismo se utiliza para dirigir el
vehículo de liberación génica a sinoviocitos y/o células de la
musculatura lisa (véase el las solicitudes
co-pendientes de los autores de la presente
invención núms. 98204482.8 y 99200624.7). Las células dendríticas
(DC) y las células del tallo hematopoyético (HSC) no son fácilmente
transducidas con vehículos génicos derivados de Ad2 y Ad5. La
presente invención proporciona vehículos de liberación génica que
poseen una capacidad de transducción de células DC y HSC
incrementada. Tales vehículos de liberación génica comprenden al
menos la porción determinante del tropismo del tejido de un
adenovirus Ad35. La invención proporciona por lo tanto
adicionalmente el uso de una porción determinante del tropismo del
tejido de una cápsida del adenovirus 35 para transducir células
dendríticas y/o células del tallo hematopoyético. Otros adenovirus
de tipo B también son adecuados. Una porción determinante del
tropismo del tejido comprende al menos la protuberancia y/o el eje
de una proteína de la fibra. Por supuesto para una persona experta
en la técnica es muy posible determinar las secuencias de
aminoácidos responsables el tropismo del tejido en la proteína de la
fibra. Semejante conocimiento puede ser utilizado para idear
proteínas quiméricas que comprenden tales secuencias de aminoácidos.
Tales proteínas quiméricas son por lo tanto parte de la invención.
Las células DC son células presentadoras de antígenos muy eficaces.
Introduciendo el vehículo de liberación génica en tales células el
sistema inmunitario del anfitrión puede ser disparado hacia
antígenos específicos. Tales antígenos pueden estar codificados por
ácidos nucleicos liberados en las DC o por las proteínas del propio
vehículo de liberación génica. La presente invención también
proporciona por lo tanto un vehículo de liberación génica con la
capacidad de eludir el sistema inmunitario del anfitrión como
vacuna. El vector es capaz de eludir el sistema inmunitario lo
suficiente para encontrar eficazmente células diana y al mismo
tiempo es capaz de liberar antígenos específicos para las células
presentadoras de antígenos permitiendo de ese modo la inducción y/o
la estimulación de respuestas inmunitarias eficaces hacia el
antígeno o los antígenos específicos. Para modular adicionalmente la
respuesta inmunitaria, el vehículo de liberación génica puede
comprender proteínas y/o ácidos nucleicos que codifican tales
proteínas capaces de modular una respuesta inmunitaria. Se
encuentran ejemplos no limitantes de tales proteínas entre las
interleucinas, las moléculas de adherencia, las proteínas
co-estimuladoras, los interferones etc. La invención
proporciona por lo tanto adicionalmente una vacuna que comprende un
vehículo de liberación génica de la invención. La invención
proporciona adicionalmente un vector de adenovirus con la capacidad
de transducir eficazmente DC y/o HSC, comprendiendo el vehículo al
menos una porción determinante del tropismo de tejido del adenovirus
de serotipo 35. La invención proporciona adicionalmente el uso de
semejantes vehículos de liberación para la transducción de células
HSC y/o DC. Se encontraron tropismos de tejido similares entre otros
adenovirus de serotipo B, concretamente en el serotipo 11. Por
supuesto también es posible proporcionar otros vehículos de
liberación génica con la porción determinante del tropismo de tejido
proporcionando de ese modo a tales vehículos de liberación una
capacidad de transducción de DC y/o HSC. Tales vehículos de
liberación génica también son por lo tanto parte de la
invención.
Los vehículos de liberación génica según la
invención pueden ser utilizados para liberar genes o ácidos
nucleicos de interés en las células del anfitrión. Este será
típicamente un uso farmacéutico. Semejante utilización está
incluida en la presente invención. Las composiciones adecuadas para
semejante uso también son parte de la presente invención. La
cantidad de vehículo de liberación génica que se necesita que esté
presente por dosis o por infección (m.o.i.) dependerá de la
afección que se vaya a tratar, de la ruta de administración
(típicamente parenteral) del sujeto y de la eficacia de la
infección, etc. Los estudios para descubrir la dosis son bien
conocidos en la técnica y se pueden utilizar típicamente aquellos ya
realizados con otros vehículos de liberación génica (adenovirales)
como pautas para encontrar las dosis adecuadas de los vehículos de
liberación génica según la invención. Típicamente es aquí donde se
pueden encontrar excipientes adecuados, medios de administración
adecuados, medios adecuados de prevención de la infección con el
vehículo cuando no se desea, etc. Así la invención también
proporciona una formulación farmacéutica que comprende un vehículo
de liberación génica según la invención y un excipiente adecuado,
así como una formulación farmacéutica que comprende un adenovirus o
una quimera del mismo, o un homólogo funcional del mismo según la
invención y un excipiente adecuado.
Figura 1: Diagrama de barras que muestra el
porcentaje de muestras de suero positivas para la neutralización de
cada adenovirus wt humano sometido a ensayo (véase el ejemplo 1 para
la descripción del análisis de neutralización).
Figura 2: Gráfico que muestra la ausencia de
correlación entre la razón VP/DICC50 y el porcentaje de
neutralización.
Figura 3: Representación esquemática de un mapa
de restricción parcial de Ad35 (tomado de Kang et al., 1989)
y los clones generados para elaborar virus basados en Ad35
recombinantes.
Figura 4: Diagrama de barras que presenta el
porcentaje de muestras de suero que muestran actividad
neutralizadora para una selección de serotipos de adenovirus. Los
sueros derivaban de voluntarios sanos de Bélgica y Reino Unido.
Figura 5: Diagrama de barras que presenta el
porcentaje de muestras de suero que muestran actividad
neutralizadora para los serotipos de adenovirus 5, 11, 26, 34, 35,
48 y 49. Los sueros derivaban de cinco localizaciones diferentes de
Europa y Estados Unidos.
Figura 6: Secuencia de adenovirus humano de tipo
35. Como se explica en el texto la secuencia de nucleótidos de los
extremos terminales del virus no se resuelven definitivamente.
Figura 7: Mapa de pAdApt
Figura 8: Mapa de pIPspAdApt
Figura 9: Mapa de pIPspAdApt1
Figura 10: Mapa de pIPspAdApt3
Figura 11: Mapa de pAdApt35IP3
Figura 12: Mapa de pAdApt35IP1
Figura 13: Representación esquemática de las
etapas experimentadas para construir
pWE.Ad35.pIX-rITR
Figura 14: Mapa de
pWE.Ad35.pIX-rITR
Figura 15: Mapa de
pRSV.Ad35-E1
Figura 16: Mapa de PGKneopA
Figura 17: Mapa de pRSVpNeo
Figura 18: Mapa de pRSVhbvNeo
Figura 19: Análisis de citometría de flujo sobre
la expresión de proteína fluorescente Verde (GFP) en células
TF-1 humanas. Las células TF-1 no
transducidas fueron utilizadas para ajustar un nivel de fondo del
1%. Se muestra la expresión de GFP en células transducidas con Ad5,
Ad5.Fib16. Ad5.Fib17, Ad5.Fib40-L, Ad5.Fib35, y
Ad5.Fib51.
Figura 20: Transducción de estroma de tipo
fibroblástico humano primario. Las células fueron analizadas 48
horas después de una exposición de dos horas a los diferentes virus
con fibra quiméricos. Se muestra el porcentaje de células que se ha
encontrado que son positivas para el transgen: proteína fluorescente
verde (GFP) utilizando un citómetro de flujo. Las células
estromáticas no transducidas fueron utilizadas para ajustar un fondo
al 1%. Se muestran los resultados de diferentes experimentos (n=3)
\pm la desviación típica.
Figura 21: Transducción de estroma de tipo
fibroblástico humano primario, células CD34^{+} y células
CD34^{+}Lin^{-}. Las células fueron analizadas 5 días después
de una exposición de dos horas a los diferentes virus con fibra
quiméricos. Se muestra el porcentaje de células que se ha encontrado
que son positivas para el transgen: proteína fluorescente verde
(GFP) utilizando un citómetro de flujo. Las células no transducidas
fueron utilizadas para ajustar un fondo al 1%. Asimismo se muestra
el número de eventos GFP positivos dividido por el número total de
eventos analizados (entre paréntesis).
Figura 22: A) Análisis citométrico de flujo de
células GFP positivas tras la transducción de células CD34^{+}
con Ad5.Fib51. Todas las células reunidas en R2-R7
son positivas para CD34 pero difieren en la expresión de los
marcadores de diferenciación tempranos CD33, CD38, y CD71 (Lin). Las
células en R2 son negativas para CD333, CD38, CD71 mientras las
células en R7 son positivas para estos marcadores. Para demostrar la
especificidad de Ad5.Fib51 se determinó el porcentaje de células
GFP positivas en R2-R7 que se demostró que disminuía
a partir del 91% (R2) al 15% (R7). B) Idéntico experimento como se
muestra en A (el eje de las X es R2 a R7) pero para los otros virus
quiméricos de la fibra Ad que muestran que Ad5.Fib35, y Ad5.Fib16 se
comportan de un modo similar a Ad5.Fib51.
Figura 23: Alineamiento de las proteínas de la
fibra quiméricas de Ad5fib16, Ad5fib35 y Ad5fib51 con la secuencia
de fibra de Ad5.
Figura 24: Toxicidad de la exposición de
Adenovirus a células de médula ósea humana primitiva y células del
Tallo. Los cultivos celulares fueron sometidos a recuento
inmediatamente antes y 5 días después de la transducción con
adenovirus. Se muestra el porcentaje de células de médula ósea
humana primitivas (CD34^{+}) y HSC (CD34^{+}Lin^{-})
recuperadas en comparación con el día 0.
Figura 25: Transducción de DC inmaduras a una
dosis de virus de 100 o 1.000 partículas de virus por célula. El
virus sometido a ensayo es Ad5 y vectores basados en Ad5 que portan
la fibra de serotipo 12 (Ad5.Fib12), 16 (Ad5.Fib16), 28
(Ad5.Fib28), 32 (Ad5.Fib32), la fibra larga de 40
(AD5.Fib40-L), 49 (Ad5.Fib49), 51 (Ad5.Fib51). La
expresión del transgen de la luciferasa es expresada como unidades
de luz relativa por microgramo de proteína.
Figura 26: Análisis citométrico de flujo de la
expresión de LacZ sobre DC inmaduras y maduras transducidas con
10.000 partículas de virus por célula de Ad5 o los vectores con
fibra quiméricos Ad5.Fib16, Ad5.Fib40-L, o
Ad5.Fib51. Los porcentajes de las células que puntuaban como
positivas se muestran en la esquina superior izquierda de cada
histograma.
Figura 27: Expresión del transgen de la
luciferasa en DC inmaduras humanas medida 48 horas después de la
transducción con 1.000 o 5.000 partículas de virus por célula. Los
virus sometidos a ensayo fueron virus quiméricos con fibra que
portaban la fibra de los miembros del subgrupo B (serotipos 11, 16,
35, y 51).
Figura 28: Expresión de la proteína fluorescente
verde en DC humanas inmaduras después de la transducción con 1.000
partículas de virus por célula de Ad5, Ad5.Fib16, y Ad5.Fib35. Las
células no transducidas fueron utilizadas para ajustar un nivel de
fondo de aproximadamente el 1% (-).
Figura 29: Transducción de DC de ratón y
chimpancé. La expresión del transgen de la luciferasa medida en DC
de ratón 48 horas después de la transducción se expresa como
unidades de luz relativa por microgramo de proteína. Las DC de
chimpancé fueron medidas 48 horas después de la transducción
utilizando un citómetro de flujo. La expresión de GFP demuestra la
escasa transducción de Ad (35) en contraste con Ad5.Fib35 (66%).
Figura 30: Crecimiento dependiente de la
temperatura de PER.C6. Se cultivaron células PER.C6 en Medio de
Eagle Modificado de Dulbecco con un suplemento de Suero Bovino
Fetal al 10% (FBS, Gibco BRL) y MgCl_{2} 10 mM en una atmósfera
de CO_{2} al 10% a 32ºC, 37ºC o 39ºC. El día 0, se sembraron un
total de 1 x 10^{6} células PER.C6 por matraz para el cultivo de
tejidos de 25 cm^{2} (Nunc) y las células fueron cultivadas a
32ºC, 37ºC o 39ºC. El día 1-8, se contaron las
células. La tasa de crecimiento y la densidad celular final del
cultivo de PER.C6 a 39ºC era comparable al de 37ºC. La tasa de
crecimiento y la densidad final del cultivo de PER.C6 a 32ºC
estaban ligeramente reducidas en comparación con las de 37ºC o las
de 39ºC. Las células PER.C6 fueron sembradas a una densidad de 1 x
10^{6} células por matraz para el cultivo de tejidos de 25
cm^{2} y cultivadas a 32, 37, o 39ºC. En los momentos puntuales
indicados, las células fueron sometidas a recuento en un contador
celular Burker. PER.C6 crece bien tanto a 32, como a 37 y 39ºC.
Figura 31: Niveles de DBP en células PER.C6
transfectadas con pcDNA3, pcDNA3wtE2A o pcDNA3ts125E2A.
Se fraccionaron cantidades iguales de extracto
de células completas mediante SDS-PAGE sobre geles
al 10%. Las proteínas fueron transferidas a membranas
Immobilon-P y la proteína DBP fue visualizada
utilizando el monoclonal \alphaDBP B6 en un sistema de detección
ECL. Todas las líneas celulares derivadas de la transfección con
pcDNA3ts125E2A expresan la proteína DBP codificada por E2A de 72 kDa
(panel izquierdo, calles 4-14; panel central,
calles 1-13; panel derecho, calles
1-12). En contraste, la única línea celular derivada
de la transfección con pcDNAwtE2A no expresaba la proteína DBP
(panel izquierdo, calle 2). No se detectaba DBP en el extracto de
una línea celular derivada de la transfección con pcDNA3 (panel
izquierdo, calle 1), que sirve como control negativo. El extracto
de células PER.C6 transfectadas transitoriamente con pcDNA3ts125
(panel izquierdo, calle 3) servía como control positivo para el
procedimiento de transferencia Western. Estos datos confirman que
la expresión constitutiva de wtE2A es tóxica para las células y que
utilizando el mutante ts125 de E2A se puede evitar esta
toxicidad.
Figura 32: Crecimiento en suspensión de
PER.C6ts125E2A C5-9.
La línea que expresa tsE2A
PER.C6tsE2A.c5-9 fue cultivada en suspensión en
Ex-cell® sin suero. En los momentos puntuales
indicados, las células fueron contadas en un contador celular
Burker. Se indican los resultados de 8 cultivos independientes.
PER.C6tsE2A crece bien en suspensión en medio
Ex-cell® sin suero.
Figura 33: Curva de crecimiento PER.C6 y
PER.C6tsE2A
Se cultivaron células PER.C6 o PER.C6ts125E2A
(c8-4) a 37ºC o 39ºC, respectivamente. El día 0, se
sembraron un total de 1 x 10^{6} células por matraz para el
cultivo de tejidos de 25 cm^{2}. En los momentos puntuales
indicados, se contaron las células. El crecimiento de las células
PER.C6 a 37ºC es comparable con el crecimiento de PER.C6ts125E2A
c8-4 a 39ºC. Esto muestra que la sobreexpresión
constitutiva de ts125E2A no tiene un efecto adverso sobre el
crecimiento de las células a la temperatura no permisiva de
39ºC.
Figura 34: Estabilidad de PER.C6ts125E2A. Para
varios pases, se cultivó la línea celular PER.C6ts125E2A clon
8-4 a 39ºC en medio sin G418. Se fraccionaron
cantidades iguales de extracto de células completas mediante
SDS-PAGE sobre geles al 10%. Las proteínas fueron
transferidas a membranas Immobilon-P y se visualizó
la proteína DBP utilizando el monoclonal \alphaDBP B6 en un
sistema de detección ECL. La expresión de la proteína DBP
codificada por ts125E2A es estable durante al menos 16 pases, lo que
equivale a aproximadamente 40 duplicaciones celulares. No se
observaron descensos en los niveles de DBP durante este período de
cultivo, indicando que la expresión de ts125E2A es estable, incluso
en ausencia de presión de selección con G418.
Figura 35: Actividad tTA en células PER.C6/tTA
(A) y PER.C6/E2A/tTA (B) resistentes a higromicina. Se hicieron
crecer 16 colonias de células PER.C6/tTA resistentes a higromicina
independientes y 23 colonias de células PER.C6/E2A/tTA resistentes
a higromicina independientes en pocillos de 10 cm^{3} hasta la
subconfluencia y se transfectaron con 2 \mug de pUHC
13-3 (un plásmido que contiene el gen informador de
la luciferasa bajo el control del promotor 7xtetO). La mitad de los
cultivos se mantuvo en medio que contenía doxiciclina para inhibir
la actividad de tTA. Las células fueron cosechadas a las 48 horas de
la transfección y se midió la actividad luciferasa. La actividad
luciferasa se indica en unidades de luz relativa (RLU) por \mug de
proteína.
Como se ha descrito antes, los serotipos de
adenovirus más ampliamente estudiados no son idealmente adecuados
para liberar material genético adicional en las células anfitrionas.
Esto se debe parcialmente a la inmunidad
pre-existente entre la población contra estos
serotipos. Esta presencia de anticuerpos
pre-existentes en humanos, combinada con una fuerte
respuesta humoral y celular secundaria contra el virus afectará a la
terapia génica adenoviral. La existencia de inmunidad preexistente
ha sido reconocida en la técnica. En WO97/12986 se propuso la
utilización de un serotipo de adenovirus diferente de los comúnmente
utilizados Ad2 y Ad5, a saber adenovirus de serotipo 7
(Ad7).
(Ad7).
La presente invención proporciona el uso de al
menos los elementos de un serotipo y los homólogos funcionales del
mismo de adenovirus que son muy adecuados como vectores de terapia
génica. La presente invención también describe un escrutinio de
alto rendimiento automatizado de todos los serotipos de adenovirus
conocidos frente a sueros de muchos individuos. Sorprendentemente,
no se encontró capacidad neutralizadora en ninguno de los sueros
que se evaluaron frente a un serotipo concreto, el adenovirus 35 (Ad
35). Esto hace extremadamente útil el serotipo de la presente
invención como sistema vector para la terapia génica en el hombre.
Semejante sistema vector es capaz de transferir eficazmente
material genético a una célula humana sin el problema inherente de
la inmunidad pre-
existente.
existente.
Típicamente, se produce un virus utilizando un
vector adenoviral (típicamente un plásmido, un cósmido o un vector
de baculovirus). Tales vectores también son por supuesto parte de la
presente invención. La invención también proporciona vectores
derivados de adenovirus que se han vuelto de replicación defectuosa
mediante deleción o inactivación de la región E1. Por supuesto,
también se puede insertar un gen de interés por ejemplo en el sitio
de la E1 del adenovirus original del cual deriva el vector. En todos
los aspectos de la invención los adenovirus pueden contener
deleciones en la región E1 e inserciones de genes heterólogos
conectados o no al promotor. Además, los adenovirus pueden contener
deleciones en las regiones E2, E3 o E4 e inserciones de genes
heterólogos conectados a un promotor. En estos casos, se requieren
las líneas celulares complementadoras de E2 y/o E4 para generar
adenovirus recom-
binantes.
binantes.
Se puede elegir la utilización del propio
serotipo Ad35 para la preparación de los adenovirus recombinantes
que van a ser utilizados en terapia génica. Alternativamente, se
puede elegir la utilización de elementos derivados del serotipo de
la presente invención en tales adenovirus recombinantes. Se puede
desarrollar por ejemplo un adenovirus quimérico que combine las
propiedades deseables de diferentes serotipos. Algunos serotipos
tienen una gama de anfitrión algo limitada, pero tienen la ventaja
de ser menos inmunogénicos, algunos lo contrario. Algunos tienen el
problema de ser de virulencia limitada, pero tienen una amplia gama
de anfitrión y/o una inmunogenicidad reducida. Tales adenovirus
quiméricos son conocidos en la técnica, y se pretende que estén
dentro del alcance de la presente invención. Así en una realización
la invención proporciona un adenovirus quimérico que comprende al
menos una porción del genoma del adenovirus del presente serotipo,
que le proporciona la ausencia de inmunidad
pre-existente, y al menos una porción del genoma de
adenovirus de otro serotipo de adenovirus dando como resultado un
adenovirus quimérico. De esta manera el adenovirus quimérico
producido es tal que combina la ausencia de inmunidad
pre-existente del serotipo de la presente invención,
con otras características de otro serotipo. Tales características
pueden ser la estabilidad frente a la temperatura, el ensamblaje,
el anclaje, la infección re-dirigida, el rendimiento
de producción, la infección re-dirigida o mejorada,
la estabilidad del ADN en la célula diana, etc.
Generalmente se necesitará una célula de
empaquetamiento con el fin de producir una cantidad suficiente de
adenovirus. Para la producción de adenovirus recombinantes para la
terapia génica, se encuentran disponibles numerosas líneas
celulares. Entre estas se incluyen pero no están limitadas a las
líneas celulares conocidas PER.C6 (número de consigna en la ECACC
96022940), 911, 293, y E1 A549.
Un importante rasgo de la presente invención es
el método para producir el adenovirus. Típicamente, no se desea que
un lote de adenovirus para aplicaciones clínicas contenga adenovirus
de replicación competente. En general por lo tanto, se desea omitir
numerosos genes (al menos uno) del genoma adenoviral en el genoma
adenoviral y facilitar estos genes al genoma de la célula a la cual
se dirige el vector para producir adenovirus quiméricos. Semejante
célula es denominada normalmente célula de empaquetamiento. Por
tanto la invención también proporciona una célula de
empaquetamiento para producir un adenovirus (un vehículo de
liberación génica) según la invención, que comprende en trans todos
los elementos necesarios para la producción de adenovirus no
presentes en el vector adenoviral según la invención. Típicamente
el vector y la célula de empaquetamiento deben ser adaptados entre
sí ya que tienen todos los elementos necesarios, pero no tienen
elementos solapantes que conduzcan a un virus de replicación
competente mediante recombinación.
De este modo, la invención también proporciona
un estuche de porciones que comprende una célula de empaquetamiento
según la invención y un vector recombinante según la invención por
medio del cual no hay esencialmente secuencia solapante que
conduzca a la recombinación dando como resultado la producción de
adenovirus de replicación competente entre dicha célula y dicho
vector.
De este modo, la presente invención proporciona
los métodos para producir adenovirus, que tras la aplicación
escapará de la inmunidad humoral pre-existente, que
comprende proporcionar un vector con elementos derivados de un
serotipo de adenovirus contra el cual no existe virtualmente
inmunidad natural y transfectar dicho vector en una célula de
empaquetamiento según la invención y permitir la producción de
partículas virales.
En un aspecto esta invención describe el uso del
serotipo de adenovirus de la presente invención para superar la
actividad neutralizadora del anfitrión existente por naturaleza o
inducida hacia los adenovirus administrados in vivo para
aplicaciones terapéuticas. La necesidad de un nuevo serotipo está
acentuada por las observaciones de que 1) la liberación sistémica
repetida del adenovirus de serotipo 5 recombinante es infructuosa
debido a la formación de elevados títulos de anticuerpos
neutralizadores contra el adenovirus de serotipo 5 recombinante
(Schulick y col, 1997), y 2) la inmunidad
pre-existente o humoral está muy difundida en la
población.
En otro aspecto la invención proporciona el uso
de vehículos de liberación génica de la invención o el uso del
serotipo 35 de adenovirus para vacunación. Semejante uso evita al
menos en parte las respuestas inmunitarias no deseadas del
anfitrión. Ejemplos no limitantes de las respuestas inmunitarias no
deseadas están evocando una respuesta inmunitaria contra el
vehículo de liberación génica o el serotipo 35 de adenovirus y/o
reforzando una respuesta inmunitaria contra el vehículo de
liberación génica o el serotipo 35 de adenovirus.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para permitir el escrutinio de una gran cantidad
de suero humano en cuanto a la presencia de anticuerpos
neutralizadores contra todos los serotipos de adenovirus, se
desarrolló un análisis de 96 pocillos automatizado.
Se seleccionó un panel de 100 individuos. Los
voluntarios (50% hombres, 50% mujeres) eran individuos sanos entre
20 y 60 años de edad sin restricción de raza. Todos los voluntarios
firmaron un informe de consentimiento. Se excluyeron las personas
implicadas profesionalmente en la investigación de adenovirus.
Se recogieron aproximadamente 60 ml de sangre en
tubos secos. En las dos horas posteriores a la toma de muestras, la
sangre fue centrifugada a 2.500 rpm durante 10 minutos. Se
transfirieron aproximadamente 30 ml de suero a tubos de
polipropileno y se almacenaron congelados a -20ºC hasta su uso
adicional.
El suero se descongeló y se inactivó con calor a
56ºC durante 10 minutos y después se formaron alícuotas para evitar
ciclos repetidos de congelación/descongelación. Parte se utilizó
para realizar cinco etapas de diluciones 1:2 en medio (DMEM, Gibco,
BRL) en una cantidad suficiente para llenar aproximadamente 70
placas de 96 pocillos. Las alícuotas de sueros no diluidos y
diluidos fueron pipeteadas en placas de pocillos profundos (formato
de 96 pocillos) y utilizando un PlateMate programado dispensadas en
alícuotas de 100 \mul en placas de 96 pocillos. De este modo las
placas fueron cargadas con ocho sueros diferentes por duplicado (100
\mul/pocillo) conforme al siguiente
esquema:
esquema:
Donde S1/2 a S8/2 en las columnas 1 y 6
representan 1x sueros diluidos y Sx/4, Sx/8, Sx/16 y Sx/32 las
diluciones seriadas 1:2. Las últimas placas también contenían
cuatro pocillos cargados con 100 \mul de suero de ternera fetal
como control negativo. Las placas se mantuvieron a -20ºC hasta su
uso adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon prototipos de todos los adenovirus
humanos conocidos en matraces T25 sembrados con células PER.C6
(número de consigna en la ECACC 96022940) (Fallaux et al.,
1998) y se cosecharon tras un ECP completo. Tras
congelar/descongelar se utilizaron 1-2 ml de
productos lisados brutos para inocular en un matraz T80 células
PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) y el virus fue
cosechado a un ECP completo. El marco temporal entre la inoculación
y la aparición de ECP así como la cantidad de virus necesaria para
re-infectar un nuevo cultivo, diferían entre los
serotipos. Las soluciones de partida de adenovirus fueron preparadas
mediante congelación/descongelación y se utilizaron para inocular
3-4 matraces de tres capas T175 cm^{2} con células
PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940). Tras la aparición
del ECP, las células se cosecharon tapando el matraz, se
sedimentaron y el virus se aisló y se purificó mediante un gradiente
en CsCl de dos etapas como sigue. Los sedimentos celulares fueron
disueltos en 50 ml de tampón NaPO_{4} 10 mM (pH 7,2) y congelados
a -20ºC. Después de descongelar a 37ºC, se añadieron 5,6 ml de
desoxicolato de sodio (5% p/p). La solución se mezcló suavemente y
se incubó durante 5-10 minutos a 37ºC para lisar
completamente las células. Después de homogeneizar la solución, se
añadieron 1.875 \mul de MgCl_{2} 1M. Tras la adición de 375
\mul de ADNasa (10 mg/ml) la solución se incubó durante 30
minutos a 37ºC. Los restos celulares se separaron por centrifugación
a 1.880xg durante 30 minutos a la temperatura ambiente sin
interrupción. El sobrenadante se purificó con posterioridad de las
proteínas mediante extracción con freón (3x). El sobrenadante
aclarado se cargó en un gradiente por bloques de cloruro de cesio
tamponado con Tris/HCl 1 M (intervalo: 1,2/1,4 gr/ml) y se
centrifugó a 21.000 rpm durante 2,5 horas a 10ºC. La banda de virus
se aísla después de lo cual se realiza una segunda purificación
utilizando un gradiente continuo tamponado con Tris/HCl 1M de 1,33
gr/ml de cloruro de cesio. El virus fue centrifugado después
durante 17 horas a 55.000 rpm a 10ºC. La banda de virus se aísla y
se añade sacarosa (50% p/v) a una concentración final del 1%. El
exceso de cloruro de cesio se separa mediante diálisis (tres veces
1 hora a la temperatura ambiente) en portas para diálisis
(Slide-a-lizer, corte 10.000 kDa,
Pierce, USA) frente a 1,5 litros de PBS con un suplemento de
CaCl_{2} (0,9 mM), MgCl_{2} (0,5 mM) y una concentración
creciente de sacarosa (1, 2, 5%). Después de la diálisis, el virus
es separado del "slide-a-lizer"
después de lo cual se toman alícuotas en porciones de 25 y 100
\mul tras lo cual el virus es almacenado a -85ºC.
Para determinar el número de partículas de virus
por mililitro, se hacen pasar 50 \mul del lote de virus por una
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) como describen Shabram
et al. (1997). Los virus se hicieron eluir utilizando un
gradiente de NaCl que oscilaba de 0 a 600 mM. Como se representa en
la Tabla I, la concentración de NaCl a la cual eluían los virus
difería significativamente entre los serotipos.
La mayor parte de los adenovirus humanos
replicaban bien en las células PER.C6 (número de consigna en la
ECACC 96022940) con pequeñas excepciones. Los adenovirus de tipo 8
y 40 se hicieron crecer en células 911-E4 (He et
al., 1998). Las soluciones de partida purificadas contenían
entre 5x10^{10} y 5x10^{12} partículas de virus/ml (VP/ml; ver
la tabla I).
\vskip1.000000\baselineskip
Los adenovirus fueron titulados en células
PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) para determinar la
cantidad de virus necesaria para obtener un ECP completo en cinco
días, la duración del análisis de neutralización. A este fin, se
dispensaron 100 \mul de medio en cada pocillo de las placas de 96
pocillos. Se añadieron 25 \mul de soluciones de partida de
adenovirus prediluidas 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} o 10^{7} veces
a la columna 2 de una placa de 96 pocillos y se mezclaron
pipeteando arriba y abajo 10 veces. Después se llevaron 25 \mul
de la columna 2 a la columna 3 y de nuevo se mezclaron. Esto se
repitió hasta la columna 11 después de lo cual se descartaron 25
\mul de la columna 11. De este modo se obtuvieron diluciones
seriadas en etapas de 5 partiendo de una solución de partida
prediluida. Después se añadieron 3x10^{4} células PER.C6 (número
de consigna en la ECACC 96022940) en un volumen de 100 \mul y las
placas se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante cinco o seis
días. Se controló microscópicamente el ECP. Se utilizó el método de
Reed y Muensch para calcular la dosis inhibidora del cultivo
celular del 50% (DICC50).
Análogamente se crearon placas idénticas que
fueron analizadas utilizando el análisis MTT (Promega). En este
análisis se cuantifican células vivas mediante tinción
colorimétrica. A este fin, se añadieron 20 \mul de MTT (7,5 mg/ml
en PBS) a los pocillos y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante
dos horas. El sobrenadante fue separado y se añadieron a los
pocillos 100 \mul de una solución 20:1 de
isopropanol/triton-X100. Las placas se pusieron en
un aparato oscilatorio de 96 pocillos durante 3-5
minutos para solubilizar la tinción precipitada. Se midió la
absorbancia a 540 nm y a 690 nm (fondo). Mediante este análisis se
pueden distinguir los pocillos con ECP en marcha o con ECP
completo.
completo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descongelaron placas de 96 pocillos con
muestras de suero humano diluido a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se
prepararon soluciones de partida de adenovirus diluidas a 200
DICC50 por 50 \mul y se añadieron alícuotas de 50 \mul a las
columnas 1-11 de las placas con suero. Las placas
fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después se
dispensaron 50 \mul de células PER.C6 (número de consigna en la
ECACC 96022940) a 6x10^{5}/ml en todos los pocillos y se
incubaron durante 1 día a 37ºC, CO_{2} al 5%. El sobrenadante se
separó utilizando puntas de pipeta nuevas para cada fila y se
añadieron 200 \mul de medio de nueva aportación a todos los
pocillos para evitar los efectos tóxicos del suero. Las placas
fueron incubadas durante otros 4 días a 37ºC, CO_{2} al 5%.
Además, se establecieron placas de control paralelas por duplicado
con sueros de control positivos diluidos generados en conejos y
específicos para cada serotipo que se iba a someter a ensayo en las
filas A y B y con suero de control negativo (FCS) en las filas C y
D. Asimismo, en cada una de las filas E-H se
realizó una titulación como se ha descrito antes con etapas de
dilución 1:5 partiendo de una DICC50 de 200 de cada virus que va a
ser sometido a ensayo. El día 5 una de las placas de control fue
analizada microscópicamente y con el análisis MTT. Se calculó el
título experimental a partir de la placa de titulación de control
observada microscópicamente. Si se encontraba que el ECP era
completo, es decir la primera dilución en el experimento de
titulación de control analizada mediante MTT muestra una clara
muerte celular, todas las placas de análisis eran tratadas. Si no,
se dejaba continuar el análisis durante uno o más días hasta que el
ECP completo era evidente después de lo cual se trataban todas las
placas. En la mayoría de los casos, el análisis se terminó el día
5. Para Ad1, 5, 33, 39, 42 y 43 el análisis se dejó durante seis
días y para Ad2 durante ocho días.
Se considera que una muestra de suero no es
neutralizadora cuando a la concentración de suero más elevada se
observa una protección máxima del 40% en comparación con los
controles sin suero.
Los resultados del análisis de los adenovirus
prototipo 44 frente al suero de 100 voluntarios sanos se muestran
en la figura 1. Como se esperaba el porcentaje de las muestras de
suero que contenían anticuerpos neutralizadores para Ad2 y Ad5 era
muy elevado. Esto también se verificaba para la mayor parte de los
adenovirus de numeración inferior. Sorprendentemente, ninguna de
las muestras de suero contenía anticuerpos neutralizadores para el
adenovirus de serotipo 35. Asimismo, el número de individuos con
títulos de anticuerpo neutralizadores para los serotipos 26, 34 y
48 era muy bajo.
Por lo tanto, los adenovirus con E1 suprimido
basados en Ad35 o uno de los otros serotipos mencionados antes
tienen una importante ventaja en comparación con los vectores
recombinantes basados en Ad5 respecto al aclaramiento de los virus
por los anticuerpos neutralizadores.
Asimismo, los vectores basados en Ad5 que tienen
(partes de) las proteínas de la cápsida implicadas en la respuesta
inmunogénica del anfitrión remplazadas por las correspondientes
(partes de) proteínas de la cápsida de Ad35 o uno de los otros
serotipos serán menos, o incluso no serán, neutralizados por la
inmensa mayoría de los sueros humanos.
Como se puede observar en la tabla I la razón
VP/DICC50 calculada a partir de las partículas del virus por ml y
la DICC50 obtenida para cada virus en los experimentos era muy
variable y oscilaba entre 0,4 y 5 log. Esto estaba causado
probablemente por las diferentes eficacias de infección de las
células PER.C6 (número de consigna en la ECACC 96022940) y por las
diferencias en la eficacia de replicación de los virus. Además, las
diferencias en las calidades de los lotes pueden jugar un papel. Una
elevada proporción VP/DICC50 representa que se había puesto más
virus en los pocillos para obtener el ECP en 5 días. Como
consecuencia el resultado del estudio de neutralización podría
estar influido puesto que más partículas de virus (inactivas) podían
proteger los anticuerpos. Para verificar si este fenómeno había
tenido lugar, se trazó la proporción VP/DICC50 frente al porcentaje
de las muestras de suero que se había encontrado que eran positivas
en el análisis (Figura 2). El gráfico muestra claramente que no hay
correlación negativa entre la cantidad de virus del análisis y la
neutralización en suero.
\newpage
Ejemplo
2
Con el fin de facilitar la clonación de extremos
romos de las secuencias ITR, se trató ADN de adenovirus de tipo 5
humano de tipo salvaje (Ad5) con la enzima de Klenow en presencia de
dNTP en exceso. Tras la inactivación de la enzima de Klenow y la
purificación mediante extracción con fenol/cloroformo seguida de
precipitación con etanol, el ADN fue digerido con BamHI. Esta
preparación de ADN fue utilizada sin purificación adicional en una
reacción de ligación con el ADN del vector derivado de pBr322
preparado como sigue: se digirió el ADN de pBr322 con EcoRV y
BamHI, se desfosforiló mediante tratamiento con la enzima TSAP (Life
Techonologies) y se purificó en gel de LMP-agarosa
(SeaPlaque GTG). Tras la transformación en E. Coli
DH5\alpha competente (Life Technologies) y el análisis de las
colonias resistentes a ampicilina, se seleccionó un clon que
mostraba un patrón de digestión como se esperaba para un inserto
que se extendía desde el sitio BamHI de Ad5 a la ITR derecha.
El análisis de la secuencia de la frontera de
clonación de la ITR derecha revelaba que la mayor parte de los
restos G 3' de la ITR se habían perdido, se encontró que el resto de
la ITR era correcto. Dicho resto G perdido es complementado por la
otra ITR durante la replicación.
PBr/Ad.Bam-rITR fue
digerido con BamHI y SalI. El fragmento vector que incluía el
inserto de adenovirus fue aislado en agarosa LMP (SeaPlaque GTG) y
ligado a un fragmento SalI-BamHI de 4,8 kb obtenido
a partir de ADN de Ad5 wt y purificado con el estuche de Genclean
II (Bio 101, Inc.). Se seleccionó un clon y se determinó la
integridad de las secuencias de Ad5 mediante análisis con enzimas de
restricción. El clon pBr/Ad.Sal-rITR contiene
secuencias adeno de tipo 5 desde el sitio SalI en el pb 16746 hasta
e incluyendo la rITR (perdiendo el principal resto G 3').
Se digirió ADN adeno de tipo 5 wt con ClaI y
BamHI, y se aisló el fragmento de 20,6 kb del gel mediante
electro-elución. Se digirió pBr322 con las mismas
enzimas y se purificó a partir del gel de agarosa mediante
Geneclean. Ambos fragmentos fueron ligados y transformados en
DH5\alpha competente. El clon resultante
pBr/Ad.Cla-Bam fue analizado mediante digestión con
enzimas de restricción y se demostró que contenía un inserto con
secuencias de adenovirus desde el pb 919 al 21566.
El clon pBr/Ad.Cla-Bam fue
linealizado con EcoRI (en pBr322 y digerido parcialmente con AflII.
Tras la inactivación con calor de AflII durante 20' a 65ºC los
extremos del fragmento fueron rellenados con la enzima de Klenow.
Después el ADN fue ligado a un oligoconector de doble hebra de
extremos romos que contenía un sito PacI (5'-AAT
TGT CTT AAT TAA CCG CTT AA-3'). Este conector
fue elaborado recociendo los siguientes dos oligonucleótidos:
5'-AAT TGT CTT AAT TAA CCG C-3' Y
5'-AAT TGC GGT TAA TTA AGA C-3',
seguido de formación de extremos con la enzima de Klenow. Tras la
precipitación del ADN ligado para cambiar el tampón, las ligaciones
fueron digeridas con un exceso de enzima PacI para separar los
concatámeros del oligo. El fragmento parcial de 22016 pb que
contenía las secuencias de Ad5 desde el pb 3534 hasta el 21566 y las
secuencias vectoras, fue aislado en agarosa LMP (SeaPlaque GTG),
religado y transformado con DH5\alpha competente. Se seleccionó un
clon que se había encontrado que contenía el sitio PacI y que había
conservado el fragmento adeno grande y se secuenció en el extremo
5' para verificar la inserción correcta del conector PacI en el
sitio AflII (perdido).
Para permitir la inserción de un sitio PacI
cerca de la ITR de Ad5 en el clon pBr/Ad.Bam.rITR se separaron
aproximadamente 190 nucleótidos entre el sitio ClaI del esqueleto de
pBr322 y el inicio de las secuencias ITR. Esto se realizó como
sigue: pBr/Ad.Bam-rITR fue digerido con ClaI y
tratado con la nucleasa Bal31 durante diferentes intervalos de
tiempo (2', 5', 10' y 15'). Se siguió el grado de separación de
nucleótidos para separar las reacciones del ADN de pBr322 (también
digerido en el sitio ClaI), utilizando tampones y condiciones
idénticos. La enzima Bal31 fue inactivada por incubación a 75ºC
durante 10', el ADN fue precipitado y resuspendido en un volumen
más pequeño de tampón TE. Para asegurar los extremos romos, los ADN
se trataron adicionalmente con ADN polimerasa de T4 en presencia de
dNTP en exceso. Tras la digestión del ADN de pBr322 (control) con
SalI, se observó una degradación satisfactoria (\sim150 pb) en la
muestra tratada durante 10' o 15'. Las muestras de
pBr/Ad.Bam-rITR tratadas 10' o 15' fueron ligadas
después a los conectores PacI de extremos romos descritos antes
(Ver pBr/Ad.AflII-Bam). Las ligaciones fueron
purificadas por precipitación, digeridas con PacI en exceso y
separadas de los conectores en gel de agarosa LMP. Tras la
religación, los ADN fueron transformados en DH5\alpha competentes
y se analizaron las colonias. Se seleccionaron diez clones que
mostraban una deleción de aproximadamente la longitud deseada y
estos fueron analizados adicionalmente mediante secuenciación
T-track (estuche secuenciador de T7, Pharmacia
Biotech). Se encontraron dos clones con el conector PacI insertado
inmediatamente aguas abajo de la rITR. Tras la digestión con PacI,
el clon Núm. 2 tiene 28 pb y el clon Núm. 8 tiene 27 pb anclados a
la ITR.
Se utilizó el vector cosmídico pWE15 (Clontech)
para clonar insertos de Ad5 más grandes. Primero, se insertó un
conector que contenía un sitio PacI único en los sitios EcoRI de
pWE15 creando pWE.pac. En este punto, se utilizó el oligo PacI de
doble hebra descrito para pBr/Ad.AflII-BamHI pero
ahora con sus extremos EcoRI sobresalientes. Después se aislaron
los siguientes fragmentos mediante electroelución en gel de agarosa:
pWE.pac digerido con PacI, pBr/AflII-Bam digerido
con PacI y BamHI y pBr/Ad.Bam-rITR#2 digerido con
BamHI y PacI. Estos fragmentos fueron ligados entre sí y
empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento del fago
\lambda (Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la
infección en bacterias anfitrionas, se desarrollaron colonias sobre
las placas y se analizaron en cuanto a la presencia del inserto
completo. PWE/Ad.AflII-rITR contiene todas las
secuencias de adenovirus de tipo 5 desde el pb 3534 (sitio AflII)
hasta la ITR derecha inclusive (perdiendo el resto G 3'
principal).
Se trató ADN adeno 5 wt tratado con enzima de
Klenow en presencia de dNTP en exceso y con posterioridad se
digirió con SalI. Dos de los fragmentos resultantes, denominados ITR
izquierda-Sal (9.4) y
Sal(16.7)-ITR derecha, respectivamente,
fueron aislados en agarosa LMP (SeaPlaque GTG). Se digirió ADN de
pBr322 con EcoRV y SalI y se trató con fosfatasa (Life
Technologies). El fragmento vector fue aislado utilizando el método
Geneclean (BIO 101, Inc.) y ligado a los fragmentos SalI de Ad5.
Sólo la ligación con el fragmento de 9,4 kb producía colonias con
un inserto. Tras el análisis y la secuenciación de la frontera de
clonación se seleccionó un clon que contenía la secuencia ITR en
toda su longitud y se prolongó hasta el sitio SalI en el pb
9462.
PBr/Ad.lITR-Sal(9.4) es
digerido con SalI y desfosforilado (TSAP, Life Technologies). Para
prolongar este clon hasta el tercer sitio SalI de Ad5, se linealizó
pBr/Ad.Cla-Bam con BamHI y se digirió parcialmente
con SalI. Se aisló un fragmento SalI de 7,3 kb que contenía
secuencias de adenovirus desde 9462-16746 en gel de
agarosa LMP y se ligó al fragmento vector
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) digerido con SalI.
PWE.pac fue digerido con ClaI y los extremos 5'
sobresalientes fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow. El
ADN fue digerido después con PacI y aislado en gel de agarosa.
PWE/AflII-rITR fue digerido con EcoRI y tras el
tratamiento con la enzima de Klenow fue digerido con PacI. El
fragmento grande de 24 kb que contenía las secuencias adenovirales
fue aislado en gel de agarosa y ligado al vector pWE.pac de extremos
romos y digerido con ClaI utilizando el kit Ligation Expres® de
Clontech. Tras la transformación de células Ultracompetent
XL10-Gold de Stratagene, se identificó que los
clones contenían el inserto esperado.
PWE/AflII-EcoRI contiene secuencias de Ad5 de los
pb 3534-27336.
La ITR 3' del vector
pWE/Ad.AflII-rITR no incluye el nucleótido G
terminal. Además, el sitio PacI está localizado a casi 30 pb de la
ITR derecha. Ambas características pueden disminuir la eficacia de
la generación de virus debido al inicio ineficaz de la replicación
en la ITR 3'. Obsérvese que durante la generación del virus la ITR
izquierda del plásmido adaptador está intacta y permite la
replicación del ADN del virus tras la recombinación homóloga.
Para mejorar la eficacia del inicio de la
replicación en la ITR 3', se modificó
pWE/Ad.AflII-rITR como sigue: primero se digirió el
constructo pBR/Ad.Bam-rITRpac#2 con PacI y después
se digirió parcialmente con AvrII y se aisló el fragmento que
contenía el vector de 17,8 kb y se desfosforiló utilizando la enzima
SAP (Boehringer Mannheim). Este fragmento carece de las
adenosecuencias desde el nucleótido 35464 a la ITR 3'. Utilizando
ADN de pWE/Ad.AflII-rITR como molde y los
cebadores
ITR-EPH: 5'-CGG
AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT
ACC-3'
y
Ad101: 5'-TGA TTC ACA TCG GTC
AGT GC-3'
Se generó un fragmento mediante PCR de 630 pb
que correspondía a las secuencias 3' de Ad5. Este fragmento de la
PCR fue clonado con posterioridad en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y
se aislaron los clones que contenían el fragmento de la PCR y se
secuenciaron para verificar la correcta amplificación del ADN. El
clon de la PCR fue digerido después con PacI y AvrII y el inserto
adeno de 0,5 kb fue ligado al fragmento
pBr/Ad.Bam-rITRpacNúm.2 digerido con PacI/AvrII
parcial generando pBr/Ad.Bam-rITRsp. A continuación
se utilizó este constructo para generar un clon cosmídico (como se
ha descrito antes) que tiene un inserto correspondiente a las
secuencias de adenovirus 3534 a 35938. Este clon fue denominado
pWE/AflII-rITRsp.
La deleción de las secuencias codificadoras de
E2A de pWE/Ad.AflII-rITR (consigna ECACC P97082116)
ha sido completada como sigue. Las secuencias adenovirales que
flanquean la región codificadora de E2A a la izquierda y a la
derecha fueron amplificadas a partir del plásmido pBr/Ad.Sal.rITR
(consigna ECACC P97982119) en una reacción de PCR con el sistema
Expand PCR (Boehringer) según el protocolo del fabricante. Se
utilizaron los siguiente cebadores: Secuencias limítrofes por la
derecha (correspondientes a los nucleótidos 24033 a 25180 de Ad5):
\DeltaE2A.SnaBI: 5'-GGC GTA CGT AGC CCT GTC GAA
AG-3' y \DeltaE2a.DBP-inicio:
5'-CCA ATG CAT TCG AAG TAC TTC CTT CTC CTA
TAG GC-3'
El fragmento de ADN amplificado fue digerido con
SnaBI y NsiI (el sitio NsiI es generado en el cebador
\DeltaE2A.DBP-inicio, subrayado).
\DeltaE2A.DBP-inicio, subrayado).
Secuencias limítrofes por la izquierda
(correspondientes a los nucleótidos 21557 a 22442 de Ad5):
\DeltaE2A.DBP-terminación: 5'-CCA
ATG CAT ACG GCG CAG ACG G-3' y
\DeltaE2a.BamHI: 5'-GAG GTG GAT CCC ATG GAC
GAG-3'.
El ADN amplificado fue digerido con BamHI y NsiI
(el sitio NsiI es generado en el cebador
\DeltaE2A.DBP-terminación, subrayado).
Con posterioridad, los fragmentos de ADN
digeridos fueron ligados en pBr/Ad.Sal-rITR digerido
con SnaBI/
BamHI. La secuenciación confirmaba la reposición exacta de la región codificadora de DBP con un único sitio NsiI en el plásmido pBr/Ad.Sal-rITR\DeltaE2A. Se puede utilizar el único sitio NsiI para introducir un casete de expresión para un gen que va a ser transducido mediante el vector recombinante.
BamHI. La secuenciación confirmaba la reposición exacta de la región codificadora de DBP con un único sitio NsiI en el plásmido pBr/Ad.Sal-rITR\DeltaE2A. Se puede utilizar el único sitio NsiI para introducir un casete de expresión para un gen que va a ser transducido mediante el vector recombinante.
La deleción de las secuencias codificadoras de
E2A se realizó de manera que los sitios aceptores del empalme del
gen que codifica L4 de 100 K en la posición 24048 en la hebra
superior se dejaron intactos. Además, las señales de
poliadenilación de los ARN de E2A y los ARN de L3 originales de la
izquierda de las secuencias codificadoras se dejaron intactas. Esto
asegura la expresión apropiada de los genes de L3 y del gen que
codifica la proteína L4 de 100 K durante el ciclo vital del
adenovirus.
A continuación, se generó el plásmido
pWE/Ad.AflII-rITR\DeltaE2A. El plásmido
pBR/Ad.Sal-rITR\DeltaE2A fue digerido con BamHI y
SpeI. El fragmento de 3,9 Kb en el que la región codificadora de E2A
fue remplazada por el único sitio NsiI fue aislado. El
pWE/Ad.AflII-rITR fue digerido con BamHI y SpeI. El
fragmento de ADN de 35 Kb, del cual se separaba el fragmento
BamHI/SpeI que contenía la secuencia codificadora de E2A, fue
aislado. Los fragmentos fueron ligados y empaquetados utilizando
extractos de empaquetamiento del fago \lambda según el protocolo
del fabricante (Stratagene), rindiendo el plásmido
pWE/Ad.AflII-rITR\DeltaE2A.
Este clon cosmídico puede ser utilizado para
generar vectores adenovirales que tienen E2A suprimida mediante
cotransfección de ADN digerido con PacI junto con plásmidos
adaptadores digeridos sobre células de empaquetamiento que expresan
el producto génico de E2A funcional.
La ausencia de solapamiento de secuencia entre
el adenovirus recombinante y las secuencias de E1 en la línea
celular de empaquetamiento es esencial para la generación libre de
RCA segura y la propagación de nuevos virus recombinantes. El
plásmido adaptador pMLPI.TK (descrito en PCT/NL96/00244) es un
ejemplo de un plásmido adaptador diseñado para su uso según la
invención en combinación con las líneas celulares de empaquetamiento
de la invención. Este plásmido fue utilizado como sustancia de
partida para elaborar un nuevo vector en el cual las moléculas de
ácido nucleico que comprenden un promotor específico y las
secuencias de genes pueden ser fácilmente intercambiadas.
Primero, se generó un fragmento de PCR a partir
de ADN molde de pZip\DeltaMo+PyF101(N^{-}) (descrito en
PCT/
NL96/00195) con los siguientes cebadores: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' Y LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Se utilizó ADN polimerasa de Pwo (Boehringer Manheim) según el protocolo del fabricante con los siguientes ciclos de temperatura: una vez 5' a 95ºC; 3' a 55ºC; y 1' a 72ºC, y 30 ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 60ºC, 1' a 72ºC, seguido de una vez 10' a 72ºC. El producto de la PCR fue digerido después con BamHI y ligado en el vector pMLP10 (Levrero et al., 1991) digerido con PvuII y BamHI, generando de ese modo el vector pLTR10. Este vector contiene secuencias adenovirales desde el pb 1 al pb 454 seguido de un promotor que constaba de una parte de la LTR Mo-MuLV cuyas secuencias intensificadoras de tipo salvaje estaban remplazadas por el intensificador de un virus de polioma mutante (PyF101). El fragmento promotor fue denominado L420. A continuación, se insertó la región codificadora del gen HSA murino. Se digirió pLTR10 con BstBI seguido de tratamiento de Klenow y digestión con NcoI. El gen HSA fue obtenido mediante amplificación por PCR en pUC18-HSA (Kay et al., 1990) utilizando los siguientes cebadores: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' y HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. El fragmento amplificado de 269 pb fue subclonado en un vector lanzadera utilizando los sitios NcoI y BglII. La secuenciación confirmó la incorporación de la secuencia codificadora correcta del gen HSA, pero con una inserción de TAG extra directamente después del codón de terminación TAG. La región codificadora del gen HSA, incluyendo la duplicación de TAG fue escindida en forma de un fragmento NcoI(cohesivo)-SalI(romo) y clonada en el fragmento NcoI(cohesivo)/BstBI(romo) de 3,5 kb de pLTR10, dando como resultado pLTR-HSA10.
NL96/00195) con los siguientes cebadores: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' Y LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Se utilizó ADN polimerasa de Pwo (Boehringer Manheim) según el protocolo del fabricante con los siguientes ciclos de temperatura: una vez 5' a 95ºC; 3' a 55ºC; y 1' a 72ºC, y 30 ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 60ºC, 1' a 72ºC, seguido de una vez 10' a 72ºC. El producto de la PCR fue digerido después con BamHI y ligado en el vector pMLP10 (Levrero et al., 1991) digerido con PvuII y BamHI, generando de ese modo el vector pLTR10. Este vector contiene secuencias adenovirales desde el pb 1 al pb 454 seguido de un promotor que constaba de una parte de la LTR Mo-MuLV cuyas secuencias intensificadoras de tipo salvaje estaban remplazadas por el intensificador de un virus de polioma mutante (PyF101). El fragmento promotor fue denominado L420. A continuación, se insertó la región codificadora del gen HSA murino. Se digirió pLTR10 con BstBI seguido de tratamiento de Klenow y digestión con NcoI. El gen HSA fue obtenido mediante amplificación por PCR en pUC18-HSA (Kay et al., 1990) utilizando los siguientes cebadores: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' y HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. El fragmento amplificado de 269 pb fue subclonado en un vector lanzadera utilizando los sitios NcoI y BglII. La secuenciación confirmó la incorporación de la secuencia codificadora correcta del gen HSA, pero con una inserción de TAG extra directamente después del codón de terminación TAG. La región codificadora del gen HSA, incluyendo la duplicación de TAG fue escindida en forma de un fragmento NcoI(cohesivo)-SalI(romo) y clonada en el fragmento NcoI(cohesivo)/BstBI(romo) de 3,5 kb de pLTR10, dando como resultado pLTR-HSA10.
Finalmente, se digirió
pLTR-HSA10 con EcoRI y BamHI después de lo cual se
insertó el fragmento que contenía la ITR izquierda, la señal de
empaquetamiento, el promotor L420 y el gen HSA en el vector pMLP1.TK
digerido con las mismas enzimas y remplazando de ese modo el
promotor y las secuencias génicas. Esto daba como resultado el
nuevo plásmido pAd/L420-HSA adaptador que contiene
los sitios de reconocimiento convenientes para diversas enzimas de
restricción próximos al promotor y las secuencias génicas. SnaBI y
AvrII pueden ser combinados con HpaI, NheI, KpnI, HindIII para
intercambiar las secuencias promotoras, mientras los últimos sitios
pueden ser combinados con los sitios ClaI o BamHI 3' de la región
HSA para remplazar los genes de este constructo. Otro plásmido
adaptador que fue diseñado para permitir el fácil intercambio de
moléculas de ácido nucleico fue elaborado remplazando las
secuencias promotoras, génicas y poli A en
pAd/L420-HSA por el promotor de CMV, un sitio de
clonación múltiple, un intrón y una señal poli A. Para este fin, se
digirió pAd/L420-HSA con AvrII y BglII seguido de
tratamiento con Klenow para obtener extremos romos. El fragmento de
5,1 kb con el vector pBr322 y las secuencias adenovirales fue
aislado y ligado a un fragmento de 1570 pb romo de pcDNA1/amp
(Invitrogen) obtenido mediante digestión con HhaI y AvrII seguido
de tratamiento con ADN polimerasa de T4. Este plásmido adaptador
fue denominado pAd5/CLIP. Para permitir la separación de secuencias
vectoras de la ITR izquierda en pAd/Clip, éste plásmido fue
parcialmente digerido con EcoRI y el fragmento lineal fue aislado.
Se recoció un oligo de la secuencia 5' TTA AGT CGA
C-3' consigo mismo dando como resultado un conector
con un sitio SalI y EcoRI sobresaliente. El conector fue ligado al
vector pAd5/Clip parcialmente digerido y se seleccionaron los
clones que tenían el conector insertado en el sitio EcoRI 23 pb
aguas arriba de la ITR de adenovirus izquierda en pAd/Clip dando
como resultado pAd5/Clipsal. Del mismo modo, se ha cambiado el sitio
EcoRI de pAd/5/Clip por un sitio PacI mediante inserción de un
conector de secuencia 5'-AAT TGT CTT AAT TAA CCG CAA
TT-3'. El vector pAd5/Clip fue digerido
parcialmente con EcoRI, desfosforilado y ligado al conector PacI con
EcoRI sobresaliente. La mezcla de ligación fue digerida con PacI
para separar los concatámeros, aislada en gel de agarosa y religada.
El vector resultante fue denominado pAd5/Clippac. Estos cambios
permiten más flexibilidad para liberar la ITR izquierda de la
secuencia vectora plasmídica.
El vector pAd5/L420-HSA también
fue modificado para crear un sitio SalI o PacI aguas arriba de la
ITR izquierda. A este fin pAd5/L420-HSA fue
digerido con EcoRI y ligado al conector PacI descrito antes en la
presente invención. La mezcla de ligación fue digerida con PacI y
religada tras el aislamiento del ADN lineal en gel de agarosa para
separar los conectores concatamerizados. Esto daba como resultado un
plásmido adaptador pAd5/L420-HSApac. Este
constructo fue utilizado para generar
pAd5/L420-HSAsal como sigue:
pAd5/L420-HSApac fue digerido con ScaI y BsrGI y el
fragmento vector fue ligado al fragmento de 0,3 kb aislado tras la
digestión de pAd5/Clipsal con las mismas enzimas.
Para crear un plásmido adaptador que contenga
solamente una secuencia poliligadora y no secuencias promotoras o
poli A, se digirió pAd5/L420-HSApac con AvrII y
BglII. El fragmento vector fue ligado a un oligonucleótido conector
digerido con las mismas enzimas de restricción. El conector fue
elaborado recociendo oligos de la siguiente secuencia:
PLL-1: 5'-GCC ATC CCT AGG AAG CTT
GGT ACC GGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GAT CTG
G-3' y PLL-2: 5'-CCA
GAT CTC GTC TAG AGG ATC CGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT
TCC TAG GGA TGG C-3'.
Los conectores recocidos fueron digeridos con
AvrII y BglII y separados de los extremos pequeños mediante
purificación en columna (estuche de separación de nucleótidos
Qiaquick) según las recomendaciones de los fabricantes. El conector
fue ligado después al fragmento pAd5/L420-HSApac
digerido con AvrII/BglII. Se seleccionó un clon, denominado AdMire,
que tenía el conector incorporado y fue secuenciado para verificar
la integridad del inserto.
El plásmido adaptador AdMire permite la fácil
inserción de casetes de expresión completas.
Se construyó un plásmido adaptador que contenía
el promotor de CMV humano que media elevados niveles de expresión
en células humanas como sigue: pAd5/L420-HSApac fue
digerido con AvrII y los extremos salientes 5' fueron rellenados
utilizando la enzima de Klenow. Una segunda digestión con HindIII
dio como resultado la separación de las secuencias promotoras de
L420. El fragmento vector fue aislado y ligado a un fragmento de PCR
que contenía la secuencia promotora de CMV. Este fragmento de la
PCR fue obtenido tras la amplificación de las secuencias de CMV de
pCMVLacI (Stratagene) con los siguientes cebadores: CMVplus:
5'-GAT CGG TAC CAC TGC AGT GGT CAA TAT TGG
CCA TTA GCC-3' y CMVminA: 5'-GAT
CAA GCT TCC AAT GCA CCG TTC CCG GC-3'. El
fragmento de la PCR fue digerido primero con PstI (subrayado en
CMVplus) después de lo cual los extremos salientes 3' fueron
separados mediante tratamiento con ADN polimerasa de T4. Después el
ADN fue digerido con HindIII (subrayado en CMVminA) y ligado en el
fragmento pAd5/L420-HSApac descrito en la presente
memoria digerido con AvrII y HindIII. El plásmido resultante fue
denominado pAd5/CMV-HSApac. Este plásmido fue
digerido después con HindIII y BamHI y el fragmento vector fue
aislado y ligado a la secuencia poliligadora obtenida tras la
digestión de AdMire con HindIII y BglII. El plásmido resultante fue
denominado pAdApt. El plásmido adaptador pAdApt contiene los
nucleótidos 735 a +95 del promotor de CMV humano (Boshart et
al., 1985). Una segunda versión de este plásmido adaptador que
contiene un sitio SalI en lugar del sitio PacI aguas arriba de la
ITR izquierda fue elaborada insertando el fragmento
ScaI-BsrGI de 0,7 kb de pAd5/Clipsal en pAdApt
digerido con ScaI y digerido parcialmente con BsrGI. Este clon fue
denominado pAdApt.sal.
Se pueden generar adenovirus recombinantes
libres de RCA muy eficazmente utilizando los plásmidos adaptadores
descritos en la presente memoria y los constructos
pWe/Ad.AflII-rITR o
pWe/Ad.AflII-rITRsp. Generalmente, el plásmido
adaptador que contiene el transgen deseado en la casete de expresión
deseada es digerido con enzimas adecuadas para liberar el inserto
de secuencias vectoras en el extremo 3' y/o 5'. Los plásmidos de
complementación adenovirales pWE/Ad.AflII-rITR o
pWE/Ad.AflII-rITRsp son digeridos con PacI para
liberar las secuencias adeno de los plásmidos vectores. Como
ejemplo no limitante se describe la generación de
AdApt-LacZ. Se generó el plásmido adaptador
pAdApt-LacZ como sigue. El gen LacZ de E.
Coli fue amplificado a partir del plásmido pMLP.nlsLacZ (EP
95-202.213) mediante PCR con los cebadores
5'-GGG GTG GCC AGG GTA CCT CTA GGC TTT TGC
AA-3' y 5'-GGG GGG ATC CAT AAA CAA
GTT CAG AAT CC-3'. La reacción de PCR fue realizada
con Ex Taq (Takara) según el protocolo de los proveedores en el
siguiente programa de amplificación: 5 minutos a 94ºC, 1 ciclo; 45
segundos a 94ºC y 30 segundos a 60ºC y 2 minutos a 72ºC, 5 ciclos;
45 segundos a 94ºC y 30 segundos a 65ºC y 2 minutos a 72ºC, 25
ciclos; 10 minutos a 72; 45 segundos a 94ºC y 30 segundos a 60ºC y 2
minutos a 72ºC, 5 ciclos, ciclo I. El producto de la PCR fue
digerido con posterioridad con KpnI y BamHI y el fragmento de ADN
digerido fue ligado en pcDAN3 (Invitrogen) digerido con KpnI/BamHI,
dando lugar a pcDNA3.nlsLacZ. El constructo pcDNA3.nlsLacZ fue
digerido después con
KpnI y BamHI y el fragmento LacZ de 3 kb fue aislado en gel utilizando el estuche Geneclean Spin (Bio 101, Inc.).
KpnI y BamHI y el fragmento LacZ de 3 kb fue aislado en gel utilizando el estuche Geneclean Spin (Bio 101, Inc.).
pAdApt también fue digerido con KpnI y BamHI y
el fragmento vector lineal fue aislado en gel como antes. Ambos
fragmentos aislados fueron ligados y se seleccionó un clon que
contenía el inserto LacZ. El constructo pAdApt-LacZ
fue digerido con SalI, purificado mediante el estuche Geneclean Spin
y con posterioridad digerido con PacI.
PWE/Ad.AflII-rITRsp fue digerido con PacI. Ambas
mezclas de digestión fueron tratadas durante 30' a 65ºC para
inactivar las enzimas. Las muestras fueron colocadas en gel para
estimar la concentración. Se sembraron 2,5x10^{6} células PER.C6
en matraces T25 en DMEM con FCS al 10% y MgCl 10 mM. Al día
siguiente se transfectaron cuatro microgramos de cada plásmido a
las células PER.C6 (consigna ECACC 96022940) utilizando el
reaccionante de transfección Lipofectamine (Life Technologies Inc.)
según las instrucciones del fabricante. Al día siguiente el medio
fue remplazado por medio de cultivo de nueva aportación y las
células fueron cultivadas adicionalmente a 37ºC, CO_{2} al 10%.
De nuevo un día más tarde fueron tratadas con tripsina, sembradas en
matraces T80 y cultivadas a 37ºC, CO_{2} al 10%. Se obtuvo un ECP
completo 6 días después de la siembra en los matraces T80. Las
células fueron cosechadas en el medio y sometidas a un ciclo de
congelación/descongelación. El producto lisado bruto obtenido de
este modo fue utilizado para purificar en placa la mezcla de virus.
Se escogieron diez placas, se desplegaron en una placa de 24
pocillos y se sometieron a ensayo en cuanto a la expresión de LacZ
tras la infección de las células A549. Los virus de las diez placas
expresaban LacZ.
Ejemplo
3
Los anticuerpos neutralizadores en suero humano
están dirigidos principalmente a la proteína hexona y en un grado
menor a la proteína pentona. Las proteínas hexona de los diferentes
serotipos muestran regiones muy variables presentes en bucles que
se pronostica que están expuestas en la parte externa del virus
(Athappilly et al., 1994; J. Mol. Biol. 242,
430-455). Para estas regiones altamente variables
han sido mapeados la mayoría de los epítopos de tipo específico
(Toogood et al., 1989; J. Gen Virol. 70,
3203-3214). Así el reemplazo de (parte de) las
secuencias de la hexona por las correspondientes secuencias de un
serotipo diferente es una estrategia eficaz para evitar los
anticuerpos neutralizadores (pre-existentes) de Ad5.
Las secuencias que codifican la hexona del adenovirus de serotipo 5
están localizadas entre los nucleótidos 18841 y 21697.
Para posibilitar el fácil intercambio de las
secuencias que codifican la hexona de los serotipos de adenovirus
alternativos en el esqueleto de Ad5, primero se generó un vector
lanzadera.
Este subclon, codificado
pBr/Ad.Eco-PmeI, fue generado digiriendo primero el
plásmido pBr322 con EcoRI y EcoRV e insertando el fragmento
PmeI-EcoRI de 14 kb de
pWE/Ad.AflII-Eco. En este vector lanzadera se
realizó una deleción de un fragmento SanDI de 1430 pb mediante
digestión con SanDI y religación para dar
pBr/Ad.Eco-PmeI \DeltaSanDI. El fragmento
separado contiene los únicos sitios SpeI y MunI. De
pBr/Ad.Eco-PmeI\DeltaSanDI se suprimió el ADN de
Ad5 que codificaba la hexona. A este fin, se amplificaron mediante
PCR las secuencias que flanqueaban la hexona y se conectaron entre
sí generando de ese modo sitios de restricción únicos que
remplazaban la región codificadora de la hexona. Para estas
reacciones de PCR se requerían cuatro oligonucleótidos diferentes:
\Deltahex1-\Deltahex4.
\Deltahex1: 5'-CCT GGT GCT GCC
AAC AGC-3'
\Deltahex2: 5'-CCG GAT
CC A CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3'
\Deltahex3: 5'-CCG GAT
CC A ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA
AC-3'
\Deltahex4: 5'-GAG AAG GGC ATG
GAG GCT G-3'
El ADN amplificado producto de \pm 1100 pb
obtenido con los oligonucleótidos \Deltahex1 y \Deltahex2 fue
digerido con BamHI y FseI. El ADN amplificado producto de \pm 1600
pb obtenido con los oligonucleótidos \Deltahex3 y \Deltahex4
fue digerido con BamHI y SbfI. Estos fragmentos de PCR digeridos
fueron purificados con posterioridad en gel de agarosa y en una
reacción de ligación en tres partes utilizando la enzima ligasa de
T4 conectada a pBr/Ad.Eco-PmeI \Delta SanDI
digerida con FseI y SbfI. El constructo resultante estaba
codificado por pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexon. Este
constructo fue secuenciado en parte para confirmar la correcta
secuencia de nucleótidos y la presencia de los sitios de restricción
únicos MunI y SpeI.
PBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexon
sirve como vector lanzadera para introducir secuencias de hexona
heterólogas amplificadas a partir de ADN de virus de diferentes
serotipos utilizando cebadores que introducen los sitios de
restricción únicos MunI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las
secuencias de hexona respectivamente. Para generar vectores basados
en Ad5 que contengan secuencias de hexona de los serotipos para los
cuales los individuos sanos no tienen títulos de NAB, o los tienen
muy bajos, se amplificaron las secuencias de hexona de Ad35, Ad34,
Ad26 y Ad48 utilizando los siguientes cebadores:
Hex-up2: 5'-GAC TAG TCA AGA TGG CYA
CCC CHT CGA TGA TG-3' y Hex-do2:
5'-GCT GGC CAA TTG TTA TGT KGT KGC GTT RCC
GGC-3'. Estos cebadores fueron diseñados utilizando
las secuencias de las regiones codificadoras de hexona publicadas
(por ejemplo las secuencias de hexona de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad7,
Ad16, Ad40 y Ad41 pueden ser obtenidas en GenBank). Los nucleótidos
degenerados fueron incorporados en las posiciones que muestran
variación entre los serotipos.
Los productos de la PCR fueron digeridos con
SpeI y MunI y clonados en el constructo
pBr/Ad.Eco-Pme\DeltaHexon digerido con las mismas
enzimas.
Las secuencias de hexona modificadas fueron
introducidas con posterioridad en el constructo
pWE/Ad.AflII-rITR mediante intercambio del
fragmento AscI generando pWE/Ad.AflII-rITRHexXX
donde XX representa el serotipo utilizado para amplificar las
secuencias de las hexonas.
Los constructos
pWE/Ad.AflII-rITRHexXX son utilizados después para
elaborar virus de la misma manera que se ha descrito antes en la
presente memoria para los virus recombinantes de Ad5.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la pentona del adenovirus de tipo 5
está localizado entre las secuencias 14156 y 15869. La base pentona
es la proteína de la cápsida de adenovirus que media la
internalización del virus en la célula diana. Se ha demostrado que
al menos ciertos serotipos (tipo C y B) logran esto mediante la
interacción de una secuencia RGD de la pentona con las integrinas
de la superficie celular. Sin embargo, los adenovirus de tipo F no
tienen una secuencia RGD y para la mayoría de los virus del grupo A
y D no se conoce la secuencia de la pentona. Por lo tanto, la
pentona puede estar implicada en la especificidad de la célula
diana. Además, como proteína de la cápsida, la proteína pentona
está implicada en la inmunogenicidad del adenovirus
(Gahery-Segard et al., 1998). Por lo tanto,
la reposición de las secuencias de pentona de Ad5 con las secuencias
de pentona de serotipos para los cuales no existen o son bajos los
títulos de NAB existentes además de la reposición de las secuencias
de hexona evitará el aclaramiento del vector adenoviral más
eficazmente que la reposición de la hexona sola. La reposición de
las secuencias de la pentona también puede afectar a la
especificidad de infección.
Para poder introducir secuencias de pentona
heterólogas en Ad5 los autores de la presente invención hicieron
uso del sistema basado en plásmidos descrito antes. Primero se
elaboró un vector lanzadera para las secuencias de pentona mediante
inserción del fragmento NheI-EcoRV del constructo
pWE/Ad.AflII-EcoRI en pBr322 digerido con las
mismas enzimas. El vector resultante fue denominado pBr/XN. De este
plásmido se suprimieron las secuencias de pentona de Ad5 y se
remplazaron por sitios de restricción únicos que se utilizaron
después para introducir nuevas secuencias de pentona de otros
serotipos. A este fin, se amplificaron las secuencias limítrofes
izquierdas de la pentona en pBr/XN mediante PCR utilizando los
siguientes cebadores: DP5-F: 5'-CTG
TTG CTG CTG CTA ATA GC-3' y DP5-R:
5'-CGC GGA TCC TGT ACA ACT AAG GGG AAT
ACA AG-3'
DP5-R tiene un sitio BamHI
(subrayado) para la ligación a la secuencia limítrofe derecha y
también introduce un sitio BsrGI único (negrita) en el extremo 5'
de la primera región de la pentona de Ad5.
La secuencia limítrofe derecha fue amplificada
utilizando: DP3-F: 5'-CGC GGA
TCC CTT AAG GCA AGC ATG TCC ATC CTT-3' y
DP3-3R: 5'-AAA ACA CGT TTT ACG CGT
CGA CCT TTC-3'
DP3-F tiene un sitio BamHI
(subrayado) para la ligación a la secuencia limítrofe izquierda y
también introduce un sitio AflII único (negrita) en el extremo 3'
de la primera región de la pentona de Ad5.
Los dos fragmentos resultantes de la PCR fueron
digeridos con BamHI y ligados entre sí. Después esta mezcla de
ligación fue digerida con AvrII y BglII. PBr/XN también fue digerido
con AvrII y BglII y el fragmento vector fue ligado a los fragmentos
de PCR ligados digeridos. El clon resultante fue denominado
pBr/Ad.\Deltapenton. Las secuencias codificadoras de la pentona
de Ad35, Ad34, Ad26 y Ad48 fueron amplificadas mediante PCR de
manera que los extremos 5' y 3' contuvieran los sitios BsrGI y AflII
respectivamente. A este fin, se utilizaron los siguientes
cebadores:
Para Ad34 y Ad35:
P3-for: 5'-GCT
CGA TGT ACA ATG AGG AGA CGA GCC GTG CTA-3'
P3-rev: 5'-GCT
CGA CTT AAG TTA GAA AGT GCG GCT TGA AAG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Para Ad26 y Ad48:
P17F: 5'-GCT CGA TGT ACA ATG AGG
CGT GCG GTG GTG TCT TC-3'
P17R: 5'-GCT CGA CTT AAG TTA GAA
GGT GCG ACT GGA AAG C-3'
Los productos de la PCR amplificados fueron
digeridos con BfrI y BsrGI y clonados en pBr/Ad.\Deltapenton
digerido con las mismas enzimas. La introducción de estas secuencias
de pentona heterólogas en pBr/Ad.\Deltapenton generó constructos
denominados pBr/Ad.pentonXX donde XX representa el número del
serotipo correspondiente al serotipo utilizado para amplificar las
secuencias de pentona insertadas. Con posterioridad las nuevas
secuencias de pentona fueron introducidas en el vector
pWE/Ad.AfllII-rITR que tenía una hexona modificada.
Por ejemplo las secuencias de pentona de Ad35 fueron introducidas
en el constructo pWE/Ad.AflII-rITRHex35 mediante
intercambio del fragmento FseI común. Asimismo se realizaron otras
combinaciones de secuencias de pentona y hexona. Los virus con
secuencias de hexona y pentona modificadas fueron elaborados como se
ha descrito antes utilizando la cotransfección con un plásmido
adaptador en células PER.C6 (número de consigna en la ECACC
96022940). Además, las secuencias de pentona fueron introducidas en
el constructo pWE/Ad.AflII-rITR. Los últimos
constructos contienen sólo una pentona modificada y los virus
generados a partir de estos constructos serán utilizados para
estudiar la contribución de las secuencias de pentona a la
neutralización de adenovirus y también para el análisis de los
posibles cambios en la eficacia y la especificidad de la
infección.
La infección por adenovirus está mediada por dos
proteínas de la cápsida fibra y pentona. La unión del virus a las
células se logra mediante la interacción de la proteína fibra
saliente con un receptor de la superficie celular. La
internalización tiene lugar en ese caso tras la interacción de la
proteína pentona con las integrinas de la superficie celular. Se ha
demostrado que al menos algunos adenovirus del subgrupo C y B
utilizan un receptor diferente para la unión a la célula y por lo
tanto tienen eficacias de infección diferentes en los diferentes
tipos de células. Así es posible cambiar el espectro de infección de
los adenovirus cambiando la fibra de la cápsida. La secuencia
codificadora de la fibra de Ad5 está localizada entre los
nucleótidos 31042 y 32787. Para separar el ADN de Ad5 que codifica
la fibra los autores de la presente invención comenzaron en el
constructo pBr/Ad.Bam-rITR. Primero se eliminó un
sitio NdeI de este constructo. Para este propósito, el ADN del
plásmido pBr322 fue digerido con NdeI después de lo cual los
extremos salientes fueron rellenados utilizando enzima de Klenow.
Este plásmido pBr322 fue religado después, digerido con NdeI y
transformado en E. Coli DH5\alpha. El plásmido
pBr/\DeltaNdeI fue digerido con ScaI y SalI y el fragmento vector
de 3198 pb resultante fue ligado al fragmento
ScaI-SalI de 15349 pb derivado de pBr/Ad.BamrITR,
dando como resultado el plásmido
pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI que contenía por tanto
un único sitio NdeI. A continuación se realizó una PCR con los
oligonucleótidos NY-up: 5'-CGA
CAT ATG TAG ATG CAT TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC
GTG-3' y NY-down:
5'-GGA GAC CAC TGC CAT GTT-3'.
Durante la amplificación, se introdujeron ambos
sitios de restricción NdeI (negrita) y NsiI (subrayado) para
facilitar la clonación de los ADN de la fibra amplificados. La
amplificación consistía en 25 ciclos de 45 segundos cada uno a
94ºC, 1 minuto a 60ºC, y 45 segundos a 72ºC. La reacción de PCR
contenía 25 pmoles de oligonucleótidos NY-up y
NY-down, dNTP 2 mM, tampón para PCR con MgCl_{2}
1,5 mM, y 1 unidad de la polimerasa estable al calor Elongase
(Gibco, Países Bajos). Una décima parte del producto de la PCR se
hizo circular sobre gel de agarosa lo que demostró que el fragmento
de ADN esperado de \pm 2200 pb estaba amplificado. Este fragmento
de la PCR fue purificado con posterioridad utilizando el sistema del
estuche Geneclean (Bio101 Inc.). Después, tanto el constructo
pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI como el producto de la
PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción NdeI y SbfI. El
fragmento de la PCR fue clonado con posterioridad utilizando la
enzima ligasa de T4 en pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI
digerido con NdeI y SbfI, generando pBr/Ad.BamR\DeltaFib.
Este plásmido permite la inserción de cualquier
secuencia de la fibra amplificada mediante PCR a través de los
sitios NdeI y NsiI únicos que están insertados en lugar de la
secuencia de la fibra eliminada. Los virus pueden ser generados
mediante la recombinación homóloga doble en células de
empaquetamiento descrita en la patente de los Estados Unidos Núm.
5994128 de Bout et al. utilizando un plásmido adaptador,
constructo pBr/Ad.AflII-EcoRI digerido con PacI y
EcoRI y un constructo pBr/Ad.BamR\DeltaFib en el cual se han
insertado las secuencias de la fibra heterólogas. Para aumentar la
eficacia de la generación de virus, se modificó el constructo
pBr/Ad.BamR\DeltaFib para generar un sitio PacI que flanqueaba la
ITR derecha. A este fin, se digirió pBr/Ad.BamR\DeltaFib con
AvrII y el fragmento de adenovirus de 5 kb fue aislado e introducido
en el vector pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 descrito antes
remplazando el correspondiente fragmento AvrII. El constructo
resultante fue denominado pBr/Ad.BamR\Deltafib.pac. Una vez que
se ha introducido una secuencia de la fibra heteróloga en
pBr/Ad.BamR\DeltaFib.pac, el clon de adenovirus con la fibra
modificada a mano derecha es introducido en un gran clon cosmídico
como se ha descrito antes en la presente memoria para
pWE/Ad.AflII-rITR. Semejante clon cosmídico grande
permite la generación de adenovirus sólo mediante una recombinación
homóloga. Los virus basados en Ad5 con fibras modificadas han sido
elaborados y descritos (núms. 98204482.8 y 99200624.7). Además, las
secuencias de hexona y pentona de los serotipos de esta invención
se combinan con las secuencias de la fibra deseadas para generar
virus que infectan las célula diana de elección muy eficazmente.
Por ejemplo, las células de la musculatura lisa, las células
endoteliales o los sinoviocitos (todos de origen humano)
son muy bien infectados con virus basados en Ad5 con una fibra de los virus del subgrupo B especialmente Ad16.
son muy bien infectados con virus basados en Ad5 con una fibra de los virus del subgrupo B especialmente Ad16.
Los ejemplos descritos antes en los cuales las
secuencias específicas pueden ser suprimidas del esqueleto de Ad5
en los plásmidos y remplazadas por las correspondientes secuencias
de otros serotipos muestran claramente la flexibilidad del sistema.
Es evidente que mediante los métodos descritos en la presente
memoria se puede elaborar cualquier combinación de genes de la
cápsida de diferentes serotipos. Así, se diseñan adenovirus basados
en Ad5 quimérico recombinante con las secuencias de hexona y pentona
deseadas haciendo menos sensible a la neutralización al virus y con
secuencias de fibra deseadas que permiten una infección eficaz en
tejidos diana específicos.
Ejemplo
4
Se han publicado previamente mapas de
restricción parciales de Ad35 (Valderrama-Leon et
al., 1985; Kang et al., 1989; Li et al. 1991). Un
ejemplo de un sistema basado en plásmidos funcionales para generar
adenovirus recombinantes basados en Ad35 consta de los siguientes
elementos:
- 1.
- Un plásmido adaptador que comprende una ITR izquierda y secuencias de empaquetamiento derivadas de Ad35 y al menos un sitio de restricción para la inserción de una casete de expresión heteróloga y que carece de las secuencias de E1. Además, el plásmido adaptador contiene secuencias 3' de Ad35 de E1B que codifican la región que incluye el promotor pIX y secuencias codificadoras suficientes para mediar la recombinación homóloga del plásmido adaptador con un segundo nucleótido.
- 2.
- Un segundo nucleótido que comprende secuencias homólogas para el plásmido adaptador y secuencias de Ad35 necesarias para la replicación y el empaquetamiento del virus recombinante, esto es, genes tempranos, intermedios y tardíos que no están presentes en la célula de empaquetamiento.
- 3.
- Una célula de empaquetamiento que proporciona al menos proteínas E1 funcionales capaces de complementar la función E1 de Ad35.
El ADN de Ad35 fue aislado de un lote de virus
purificado como sigue. A 100 \mul de solución de partida de virus
(Ad35: 3,26x10^{12} VP/ml) se añadieron 10 \mul 10x tampón
ADNasa (Tris-HCl 130 mM pH 7,5; CaCl_{2} 1,2 M;
MgCl_{2} 50 mM). Tras la adición de 10 \mul de ADNasa I de 10
mg/ml (Roche Diagnostics) la mezcla fue incubada durante 1 hora a
37ºC. Tras la adición de 2,5 \mul de EDTA 0,5 M, 3,2 \mul de SDS
al 20% y 1,5 \mul de ProteinaseK (Roche Diagnostics; 20 mg/ml)
las muestras fueron incubadas a 50ºC durante 1 hora. A
continuación, se aisló el ADN viral utilizando el GeneClean Spin Kit
(Bio101 Inc.) según las instrucciones de los fabricantes. El ADN se
hizo eluir de la columna de centrifugación con 25 \mul de agua
MilliQ estéril. En lo siguiente se utilizarán unos tamaños de
fragmentos de ADN y una numeración de fragmentos según Kang et
al. (1989). El ADN de Ad35 fue digerido con EcoRI y los tres
fragmentos (aproximadamente 22,3 (A), 7,3 (B) y 6 kb (C)) fueron
aislados del gel utilizando el estuche GeneClean (Bio 101, Inc.).
pBr322 fue digerido con EcoRI o con EcoRI y EcoRV y los fragmentos
digeridos fueron aislados del gel y desfosforilados con la enzima
Tsap (Gibco BRL). A continuación, se ligó el fragmento C de Ad35 de
6 kb con el fragmento pBr322xEcoRI y el fragmento de Ad35 que
contenía la ITR (EcoRI-B) fue ligado al fragmento
pBr322xEcoRI/EcoRV. Las ligaciones fueron incubadas a 16ºC durante
la noche y transformadas en bacterias DH5\alpha competentes (Life
Techn.) Se analizaron minipreps de colonias obtenidas en cuanto a
la correcta inserción de los fragmentos de Ad35 mediante análisis
de restricción. Se encontró que los fragmentos de Ad35 tanto de 6 kb
como de 7,3 kb estaban correctamente insertados en pBR322. El
fragmento de 6 kb fue aislado en ambas orientaciones
pBr/Ad35-Eco6.0^{+} como
pBr/Ad35-Eco6.0^{-} con lo que + representa la
orientación 5' a 3' relativa para pBr322. El clon con el inserto de
Ad35 B de 7,3 kb, denominado pBr/Ad35-Eco7.3 fue
secuenciado parcialmente para verificar la correcta ligación de la
ITR 3'. Se encontró que la ITR tenía al menos la secuencia
5'-CATCATCAAT...-3' en la hebra inferior. Después
se amplió pBr/Ad35-Eco7.3 en el extremo 5' mediante
inserción del fragmento Ad35 de 6 kb. A este fin,
pBr/Ad35-Eco7.3 fue digerido con EcoRI y
desfosforilado. El fragmento fue aislado del gel y ligado al
fragmento EcoRI de Ad35 de 6 kb. Tras la transformación los clones
fueron sometidos a ensayo en cuanto a la correcta orientación del
inserto y se seleccionó un clon, denominado
pBr/Ad35-Eco13.3.
Este clon es ampliado después con el fragmento
SalI D de \sim5,4 kb obtenido tras la digestión de Ad35 wt con
SalI. A este fin, se elimina el sitio SalI del esqueleto de pBr322
mediante digestión parcial de pBr/Ad35-Eco13.3 con
SalI, relleno de los extremos cohesivos mediante tratamiento de
Klenow y religación. Se selecciona un clon que contiene un único
sitio SalI en el inserto adenoviral. Este clon, denominado
pBr\Deltasal/Ad35-Eco13.3 es linealizado después
con AatII que está presente en el esqueleto de pBr322 y ligado con
el conector SalI con los extremos complementarios AatII. El ADN es
digerido después con SalI en exceso y el fragmento lineal es
aislado y ligado al fragmento SalI-D de 5,4 kb de
Ad35. Se selecciona un clon que contiene el fragmento SalI
insertado en la orientación correcta en
pBr/Ad35-Eco13.3. El clon resultante,
pBr/Ad35.Sal2-rITR contiene los \sim17 kb 3' de
Ad35 incluyendo la ITR derecha. Para permitir la liberación de la
ITR derecha de las secuencias vectoras en el momento de generación
del virus, se introduce mediante PCR un sitio NotI que flanquea la
ITR.
El fragmento EcoRI-A de Ad35 de
22,3 kb también fue clonado en pBr322xEcoRI/EcoRV. Se seleccionó un
clon, denominado pBr/Ad35-EcoA3', que tenía
aparentemente una deleción de aproximadamente 7 kb del extremo 5'.
Contenía el sitio SalI a 9,4 kb del ADN wt de Ad35 y a
aproximadamente 1,5 kb de las secuencias aguas arriba. Utilizando
este sitio SalI y el único sitio NdeI del esqueleto de pBr322 se
amplía este clon en el extremo 5' mediante inserción de un
fragmento 5' de Ad35 de aproximadamente 5 kb desde el primer SalI de
Ad35 de tal manera que se crea un sitio de restricción NotI en el
extremo 5' de Ad35 mediante inserción de un conector. Este clon,
denominado pBr/Ad35.pIX-EcoA no contiene las
secuencias del extremo izquierdo (ITR, secuencias de empaquetamiento
y E1) y en el extremo 3' tiene aproximadamente un solapamiento de
3,5 kb con el clon pBr/Ad35.Sal2rITR.
Para crear un plásmido adaptador, se digirió
pAd35 con SalI y el fragmento B del extremo izquierdo de \sim9,4
kb fue aislado. pBr322 fue digerido con EcoRV y SalI, aislado en gel
y desfosforilado con la enzima Tsap. Ambos fragmentos son ligados y
los clones con la inserción correcta y la secuencia correcta de la
ITR izquierda son seleccionados. Para permitir la liberación de la
ITR izquierda de las secuencias vectoras en el momento de la
generación del virus, se introduce mediante PCR un sitio NotI que
flanquea la ITR izquierda. A partir de este clon se suprimen las
secuencias E1 y se remplazan por una secuencia poliligadora
utilizando la PCR. La secuencia poliligadora se utiliza para
introducir una casete de expresión para un gen de elección.
Los clones de Ad35 recombinantes son generados
mediante transfección de las células PER.C6 con el plásmido
adaptador, pBr/Ad35.pIX-EcoA y
pBr/Ad35.Sal2-rITR como se muestra en la figura 3.
La recombinación homóloga da lugar a virus recombinantes.
Ejemplo
5
En el ejemplo 1 se describió el análisis de la
actividad neutralizadora (NA) en sueros humanos de una localización
en Bélgica. Sorprendentemente, de un panel de 44 serotipos de
adenovirus sometidos a ensayo, un serotipo, Ad35, no era
neutralizado en ninguno de los 100 sueros analizados. Además, se
encontró que unos pocos serotipos, Ad26, Ad34 y Ad48 eran
neutralizados en un 8%, o menos, de los sueros sometidos a ensayo.
Este análisis fue ampliado adicionalmente a otros serotipos de
adenovirus no sometidos a ensayo previamente y, utilizando una
selección de serotipos del primer escrutinio, también se amplió a
sueros de diferentes localizaciones geográficas.
A este fin, los adenovirus fueron propagados,
purificados y sometidos a ensayo en cuanto a la neutralización en
el análisis de inhibición del ECP como se describe en el ejemplo 1.
Utilizando los sueros del mismo lote que en el ejemplo 1, se
sometieron a ensayo para la neutralización los serotipos de
adenovirus 7B, 11, 14, 18 y 44/1876. Se encontró que estos virus
eran neutralizados respectivamente en el 59, 13, 30, 98 y 54% de
los sueros. Así, de esta serie Ad11 es neutralizado con una
frecuencia relativamente baja.
Puesto que se sabe que la frecuencia de
aislamiento de los serotipos de adenovirus de tejido humano así como
la prevalencia de AN para los serotipos de adenovirus puede diferir
en las diferentes localizaciones geográficas, los autores de la
presente invención sometieron a ensayo una selección de los
serotipos de adenovirus contra sueros de diferentes lugares. Se
obtuvieron sueros humanos de dos lugares adicionales en Europa
(Bristol, Reino Unido y Leiken, Países Bajos) y de dos lugares en
los Estados Unidos (Stanford, CA y Great Neck, NY). Los adenovirus
que se encontró que eran neutralizados en el 20% o menos de los
sueros del primer escrutinio, así como Ad2, Ad5, Ad27, Ad30, Ad38,
Ad43, fueron sometidos a ensayo en cuanto a la neutralización en
sueros del Reino Unido. Los resultados de estos experimentos se
presentan en la Figura 4. Los adenovirus de serotipos 2 y 5 fueron
neutralizados de nuevo en un elevado porcentaje de sueros humanos.
Además, algunos de los serotipos que eran neutralizados en un bajo
porcentaje de sueros en el primer escrutinio son neutralizados en un
porcentaje mayor de los sueros del Reino Unido, v.g. Ad26 (7% vs.
30%), Ad28 (13% vs. 50%), Ad34 (5% vs. 27%) y Ad48 (8% vs. 32%). La
actividad neutralizadora frente a Ad11 y Ad49 que se encontraban en
un porcentaje relativamente bajo de sueros en el primer escrutinio,
se encuentran en un porcentaje incluso menor de sueros en este
segundo escrutinio (13% vs. 5% y 20% vs. 11%, respectivamente). Se
encontró ahora que el serotipo de Ad35 que no era neutralizado en
ninguno de los sueros en el primer escrutinio, era neutralizado en
un bajo porcentaje (8%) de sueros del Reino Unido. La prevalencia
de AN en sueros humanos del Reino Unido es la más baja para los
serotipos Ad11 y Ad35.
Para un análisis adicional, se obtuvieron sueros
de dos localizaciones en los Estados Unidos (Stanford, CA y Great
Neck, NY) y de Países Bajos (Leiden). La Figura 5 presenta una
visión de conjunto de los datos obtenidos con estos sueros y los
datos previos. No todos los virus fueron sometidos a ensayo en todos
los sueros, excepto para Ad5, Ad11 y Ad35. La conclusión global de
este escrutinio comprensivo de sueros humanos es que la prevalencia
de actividad neutralizadora para Ad35 es la más baja de todos los
serotipos en todos los países del oeste: como media el 7% de los
sueros humanos contienen actividad neutralizadora (5 localizaciones
diferentes).
Otro grupo B de adenovirus, Ad11 también es
neutralizado en un bajo porcentaje de sueros humanos (media 11% en
sueros de 5 localizaciones diferentes). El adenovirus de tipo 5 es
neutralizado en un 56% de los sueros humanos obtenidos de 5
localizaciones diferentes. Aunque no sometido a ensayo en todos los
sueros, el serotipo 49 del grupo D también es neutralizado con una
frecuencia relativamente baja en muestras de Europa y de una
localización de los Estados Unidos (media 14%).
En los experimentos de neutralización descritos
antes se evalúa que un suero no es neutralizador cuando en el
pocillo con la concentración de suero más elevada la protección
máxima de ECP es del 40% en comparación con los controles sin
suero. La protección se calcula como sigue:
% \ protección
= \frac{DO \ pocillo \ correspondiente - DO \ control \ virus}{DO \
control \ no \ infectado - DO \ control \ virus} \ x \
100
Como se ha descrito en el ejemplo 1, el suero es
cultivado en placa en cinco diluciones diferentes que oscilan entre
diluciones por 4 y por 64. Por lo tanto, es posible distinguir entre
títulos bajos (es decir neutralización solo en las concentraciones
de suero más elevadas) y títulos elevados de AN (es decir también
neutralización en pocillos con la concentración de suero más baja).
De los sueros humanos utilizados en el escrutinio de los autores de
la presente invención que se encontró que contenían actividad
neutralizadora para Ad5, resultó que el 70% tenía títulos elevados
mientras de los sueros que contenían AN para Ad35, sólo el 15%
tenían títulos elevados. De los sueros que eran positivos en cuanto
a AN para Ad11 sólo el 8% tenían títulos elevados.
Para Ad49 este era del 5%. Por lo tanto, no sólo
la frecuencia de AN para Ad35, Ad11 y Ad49 es mucho más baja en
comparación con Ad5, si no que de los sueros que contienen AN para
estos virus, la inmensa mayoría tiene títulos bajos. Los vectores
adenovirales basados en Ad35 tienen por lo tanto una clara ventaja
sobre los vectores basados en Ad5 cuando se utilizan como vehículos
de terapia génica o vectores de vacunación in vivo o en
cualquier aplicación en la que la eficacia de infección sea impedida
por la actividad neutralizadora.
En los siguientes ejemplos se describe la
construcción de un sistema vector para la generación de vectores
basados en Ad35 libres de RCA, seguros.
Ejemplo
6
Los virus Ad35 fueron propagados en células
PER.C6 y el ADN fue aislado como se describe en el ejemplo 4. La
secuencia total fue generada por Qiagen Sequence Services (Qiagen
GmbH, Alemania). El ADN viral total fue sometido a cizalla mediante
sonicación y los extremos del ADN se volvieron romos mediante ADN
polimerasa de T4. Los fragmentos romos sometidos a cizalla fueron
fraccionados por tamaños sobre geles de agarosa y se obtuvieron
porciones de gel correspondientes a fragmentos de ADN de 1,8 a 2,2
kb. El ADN fue purificado a partir de las porciones de gel mediante
el protocolo de extracción de gel de QIAquick y subclonado en un
banco fragmentado al azar "shotgun" de vectores de clonación
del plásmido pUC19. Se utilizó una disposición de los clones en
placas de 96 pocillos cubriendo el ADN diana 8 (+/- 2) veces para
generar la secuencia total. La secuenciación se realizó en
termocicladores Perkin-Elmer 9700 utilizando la
química de BigDyeTerminator y la ADN polimerasa de AmpliTaq FS
seguido de purificación de las reacciones de secuenciación
utilizando la tecnología QIAGEN DyeEx 96. Los productos de la
reacción de secuenciación fueron sometidos después a separación
automatizada y detección de fragmentos en secuenciadores de 96
calles ABI 377 XL. Los resultados de la secuencia inicial fueron
utilizados para generar una secuencia cóntigo y los espacios fueron
rellenados mediante lecturas de paseo con cebador sobre el ADN
diana o mediante secuenciación directa de los productos de la PCR.
Los extremos de los virus resultaron estar ausentes en el banco
fragmentado al azar, muy probablemente debido a las dificultades de
clonación resultantes de los aminoácidos de pTP que permanecen
unidos a las secuencias ITR tras la digestión con proteinasa K del
ADN
viral.
viral.
Las rondas de secuencias adicionales sobre el
ADN viral resolvían la mayor parte de la secuencia de esas regiones,
sin embargo era difícil obtener una secuencia clara de los
nucleótidos más terminales. En el extremo 5' la porción de la
secuencia obtenida era 5'-CCA ATA ATA TAC CT...-3' mientras
en el extremo 3' la porción de la secuencia obtenida era 5'-...AGG
TAT ATT ATT GAT GAT GGG-3'. La mayoría de los adenovirus
humanos tienen una secuencia terminal 5'-CAT CAT
CAA TAA TAT ACC-3'. Además, un clon que representaba
el extremo 3' del ADN de Ad35 obtenido tras clonar el fragmento
EcoRI de Ad35 de 7 kb en pBr322 (véase el ejemplo 4) también resultó
tener la secuencia CATCATCAATAAT... típica. Por lo tanto, Ad35
puede tener la secuencia del extremo típica y las diferencias
obtenidas al secuenciar directamente el ADN viral se deben a
artefactos correlacionados con rondas de secuenciación
"run-off" y la presencia de aminoácidos
residuales de pTP.
La secuencia total de Ad35 con secuencias
terminales corregidas se da en la Figura 6. Basándose en la
homología de la secuencia con Ad5 (Genbank Núm.M72360) y Ad7
(secuencia parcial Genbank Núm.X0300) y en la localización de los
marcos de lectura abiertos, la organización del virus es idéntica a
la organización general de la mayoría de los adenovirus humanos,
especialmente los virus del subgrupo B. La longitud total del genoma
es de 34794 pares de bases.
Ejemplo
7
Un sistema vector basado en plásmidos funcional
para generar vectores adenovirales recombinantes comprende los
siguientes componentes:
- 1.
- Un plásmido adaptador que comprende una ITR izquierda y secuencias de empaquetamiento derivadas de Ad35 y al menos un sitio de restricción para la inserción de una casete de expresión heteróloga y carente de secuencias E1. Además, el plásmido adaptador contiene las secuencias 3' de Ad35 de la región codificadora de E1B incluyendo el promotor pIX y secuencias codificadoras suficientes para mediar la recombinación homóloga del plásmido adaptador con una segunda molécula de ácido nucleico.
- 2.
- Una segunda molécula de ácido nucleico, que comprende secuencias homólogas al plásmido adaptador, y secuencias de Ad35 necesarias para la replicación y el empaquetamiento del virus recombinante, esto es, genes tempranos, intermedios y tardíos que no están presentes en la célula de empaquetamiento.
- 3.
- Una célula de empaquetamiento que proporciona al menos proteínas E1 funcionales capaces de complementar la función E1 de Ad35.
Otros métodos para la generación de adenovirus
recombinantes en células de empaquetamiento complementadoras son
conocidos en la técnica y pueden ser aplicados a los virus Ad35 sin
apartarse de la invención. Como ejemplo, se describe con detalle
más abajo la construcción de un sistema basado en plásmidos, como se
ha esbozado antes.
\vskip1.000000\baselineskip
A este fin, el plásmido adaptador pAdApt (Figura
7; descrito en el ejemplo 2) fue modificado primero para obtener
plásmidos adaptadores que contienen poliligadores ampliados y que
tienen los sitios de restricción únicos convenientes flanqueando la
ITR izquierda y la secuencia de adenovirus en el extremo 3' para
permitir la liberación del inserto de adenovirus de las secuencias
del vector plasmídico. La construcción de estos plásmidos se
describe más abajo con detalle: El plásmido adaptador pAdApt
(Ejemplo 2) fue digerido con SalI y tratado con Shrimp Alkaline
Phosphatase para reducir la re-ligación. Un
conector, compuesto por los siguientes dos oligos fosforilados y
recocidos: ExSalPacF 5' - TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT
GGG TTC GAA TTA ATT AA- 3'; y ExSalPacR 5' - TCG ATT AAT TAA TTC
GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA- 3'; fue ligado
directamente en el constructo digerido, remplazando de ese modo el
sitio de restricción SalI por Pi-PsPI, SwaI y PacI.
Este constructo fue denominado conector pADAPT+ExSalPac. Además,
parte de la ITR izquierda de pAdApt fue amplificada mediante PCR
utilizando los siguientes cebadores: PCLIPMSF: 5' -CCC CAA TTG GTC
GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG -3' y pCLIPBSRGI: 5' - GCG
AAA ATT GTC ACT TCC TGT G - 3'. El fragmento amplificado fue
digerido con MunI y BsrGI y clonado en pAd5/Clip (véase el Ejemplo
2), que estaba parcialmente digerido con EcoRI y tras la
purificación digerido con BsrGI, re-insertando de
ese modo la ITR izquierda y la señal de empaquetamiento. Tras el
análisis con la enzima de restricción, el constructo fue digerido
con ScaI y SgrAI y el fragmento de 800 pb fue aislado del gel y
ligado en el conector pADAPT+ExSalPac digerido con ScaI/SgrAI. El
constructo resultante, denominado pIPspSalAdapt, fue digerido con
SalI, desfosforilado, y ligado al conector de doble hebra
ExSalPacF/ExSalPacR fosforilado mencionado antes. Un clon en el que
el sitio PacI era el más cercano a la ITR fue identificado mediante
análisis de restricción y las secuencias fueron confirmadas
mediante análisis de la secuencia. Este constructo pAdApt novedoso,
denominado pIPspAdapt (Figura 8) alberga por tanto dos conectores
ExSalPac que contienen las secuencias de reconocimiento para PacI,
PI-PspI y BstBI, que rodean la porción adenoviral
del constructo adaptador adenoviral, y que puede ser utilizado para
linealizar el ADN plasmídico antes de la
co-transfección con fragmentos coadyuvantes
adenovirales.
Con el fin de incrementar adicionalmente las
permutaciones de clonación transgénica se construyeron numerosas
variantes de poliligadores basadas en pIPspAdapt. Para este fin se
digirió primero pIPspAdapt con EcoRI y se desfosforiló. Un conector
compuesto por los dos oligos fosforilados y recocidos siguientes:
Ecoconector+: 5' - AAT TCG GCG CGC CGT CGA CGA TAT CGA TAG CGG CCG
C - 3' y Ecoconector-: 5' - AAT TGC GGC CGC TAT CGA TAT CGT CGA CGG
CGC GCC G - 3' fue ligado en este constructo, creando de este modo
sitios de restricción para AscI, SalI, EcoRV, ClaI y NotI. Se
obtuvieron ambas orientaciones de este conector y se confirmaron las
secuencias mediante análisis de restricción y análisis de la
secuencia. El plásmido que contenía el poliligador en el orden 5'
HindIII, KpnI, AgeI, EcoRI, AscI, SalI, EcoRV, ClaI, NotI, NheI,
HpaI, BamHI y XbaI fue denominado pIPspAdapt1 (Figura 9) mientras
el plásmido que contenía el poliligador en el orden HindIII, KpnI,
AgeI, NotI, ClaI, EcoRV, SalI, AscI, EcoRI, NheI, HpaI, BamHI y
XbaI fue denominado pIPspAdapt2.
Para facilitar la clonación de los otros
constructos efector o antisentido, se diseñó un conector compuesto
por los dos oligonucleótidos siguientes, para invertir el
poliligador del pIPspAdapt: HindXba+ 5'-AGC TCT AGA
GGA TCC GTT AAC GCT AGC GAA TTC ACC GGT ACC AAG CTT
A-3'; HindXba-5'-CTA
GTA AGC TTG GTA CCG GTG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CCT CTA
G-3'. Este conector fue ligado en pIPspAdapt
digerido con HindIII/XbaI y el constructo correcto fue aislado. La
confirmación se realizó mediante análisis con enzimas de restricción
y secuenciación. Este nuevo constructo, pIPspAdaptA, fue digerido
con EcoRI y el Ecoconector mencionado antes fue ligado en este
constructo. Se obtuvieron ambas orientaciones de este conector,
dando como resultado pIPspAdapt3 (Figura 10), que contiene el
poliligador en el orden XbaI, BamHI, HpaI, NheI, EcoRI, AscI, SalI,
EcoRV, ClaI, NotI, AgeI, KpnI y HindIII. Todas las secuencias
fueron confirmadas mediante análisis con enzimas de restricción y
secuenciación.
Después se construyeron plásmidos adaptadores
basados en Ad35 como sigue:
La ITR izquierda y la secuencia de
empaquetamiento correspondiente a los nucleótidos 1 a 464 de las
secuencias de Ad35 wt (Figura 6) fueron amplificadas mediante PCR
sobre ADN de wtAd35 utilizando los siguientes cebadores:
Cebador 35F1:
5'-CGG AAT TCT TAA TTA ATC GAC
ATC ATC AAT AAT ATA CCT TAT AG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador 35R2:
5'-GGT GGT CCT AGG CTG ACA CCT
ACG TAA AAA CAG-3'
La amplificación introduce un sitio PacI en el
extremo 5' y un sitio AvrII en el sitio 3' de la secuencia.
Para la amplificación se utilizó la enzima ADN
polimerasa Platinum Pfx (LTI) según las instrucciones del fabricante
pero con los cebadores a 0,6 \muM con DMSO añadido a una
concentración final del 3%. El programa de amplificación fue el
siguiente: 2 minutos a 94ºC, (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a
56ºC, 1 minuto a 68ºC) durante 30 ciclos, seguido de 10 minutos a
68ºC.
El producto de la PCR fue purificado utilizando
un estuche de purificación pvr (LTI) según las instrucciones de
fabricante y digerido con PacI y AvrII. El fragmento digerido fue
purificado después en gel utilizando el estuche geneclean (Bio 101,
Inc.). El plásmido adaptador basado en Ad5
pIPspAdapt-3 (Figura 10) fue digerido con AvrII y
después parcialmente con PacI y el fragmento de 5762 pb fue aislado
en una porción de gel de agarosa LMP y ligado con el fragmento de
PCR mencionado antes digerido con las mismas enzimas y transformado
en células DH10B electrocompetentes (LTI). El clon resultante se
denomina pIPspAdapt3-Ad35lITR.
Paralelamente, se amplificó una segunda porción
de ADN de Ad35 utilizando los siguientes cebadores:
35F3: 5'-TGG TGG AGA TCT GGT GAG
TAT TGG GAA AAC-3'
35R4: 5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGG
GAA ATG CAA ATC TGT GAG G-3'
Las secuencias de este fragmento corresponden a
los nucl. 3401 a 4669 de wtAd35 (Figura 6) y contiene 1,3 kb de
secuencias que comienzan directamente 3' desde la secuencia
codificadora de E1B 55k. La amplificación y purificación se
realizaron como se ha descrito antes para el fragmento que contiene
la ITR izquierda y la secuencia de empaquetamiento. El fragmento de
PCR fue digerido después con PacI y subclonado en el vector pNEB193
(New England Biolabs) digerido con SmaI y PacI. La integridad de la
secuencia del clon resultante fue verificada mediante análisis de
la secuencia.
Después pNEB/Ad35pF3R4 fue digerido con BglII y
PacI y el inserto de Ad35 fue aislado del gel utilizando el estuche
QIAExII (Qiagen). PIPspAdapt3-Ad35lITR fue digerido
con BglII y después parcialmente con PacI. El fragmento de 3624 pb
(conteniendo secuencias del vector, la ITR de Ad35 y las secuencias
de empaquetamiento así como el promotor de CMV, la región de
clonación múltiple y la señal poliA), también fue aislado utilizando
el estuche QIAExII (Qiagen). Ambos fragmentos fueron ligados y
transformados en células DH10B (LTI). El clon resultante,
pAdApt35IP3 (Figura 11), tiene la casete de expresión de pIPspAdapt3
pero contiene la ITR izquierda de Ad35 y las secuencias de
empaquetamiento y un segundo fragmento correspondiente a los nucl.
3401 a 4669 de Ad35. Una segunda versión del plásmido adaptador de
Ad35 que tenía el sitio de clonación múltiple en la orientación
contraria se elaboró como sigue:
PIPspAdapt1 (Figura 9) fue digerido con NdeI y
BglII y la banda de 0,7 kpb que contiene parte del promotor de CMV,
MCS y poliA de SV40 fue aislada e insertada en los sitios
correspondientes de pAdApt35IP3 generando pAdApt35IP1 (Figura
12).
Los plásmidos adaptadores pAdApt35.LacZ y
pAdApt35.Luc fueron generados después insertando los transgenes de
pcDNA.LacZ (digerido con KpnI y BamHI) y pAdApt.Luc (digerido con
HindIII y BamHI) en los sitios correspondientes en pAdApt35IP1. La
generación de pcDNA.LacZ y pAdApt.Luc se describe en la Solicitud de
Patente Internacional WO99/55132.
La Figura 13 presenta las diversas etapas
acometidas para construir el clon cosmídico que contiene las
secuencias de Ad35 de los pb 3401 a 34794 (extremo de la ITR
derecha) que se describen con detalle más abajo.
Se generó un primer fragmento de PCR
(pIX-NdeI) utilizando el siguiente grupo de
cebadores: 35F5: 5'-CGG AAT TCG CGG GCG CCG CGG TGA
GTA TTG GGA AAA C-3' y 35R6: 5'-CGC
CAG ATC GTC TAC AGA ACA G-3'. Se utilizó la ADN
polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante, sin
embargo, con una concentración final de 0,6 \muM de ambos
cebadores y utilizando 50 ng de ADN de Ad35 wt como molde. La
amplificación se realizó como sigue: 2 minutos a 94ºC, 30 ciclos de
30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 1 minuto 45 segundos a
72ºC, seguido de 8 minutos a 68ºC. Para permitir la clonación en el
vector de clonación TA PCR2.1, se realizó una última incubación con
1 unidad de polimerasa superTaq (HT Biotechnology LTD) durante 10
minutos a 72ºC.
El fragmento amplificado de 3370 pb contiene las
secuencias de Ad35 desde el pb 3401 al 6772 con un sitio NotI
añadido en el extremo 5'. Los fragmentos fueron purificados
utilizando el estuche de purificación por PCR (LTI).
Se generó un segundo fragmento de PCR
(NdeI-rITR) utilizando los siguientes cebadores:
35F7: 5'-GAA TGC TGG CTT CAG TTG TAA
TC-3' y 35R8: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG
CAT TTA AAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3'. La
amplificación se realizó con ADN polimerasa pfx (LTI) según las
instrucciones del fabricante pero con 0,6 \muM de ambos cebadores
y DMSO al 3% utilizando 10 ng de ADN de wtAd35 como molde. El
programa era el siguiente: 3 minutos a 94ºC y 5 ciclos de 30
segundos a 94ºC, 45 segundos a 40ºC, 2 minutos 45 segundos a 68ºC
seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 2
minutos 45 segundos a 68ºC. Para permitir la clonación en el vector
de clonación TA PCR2.1, se realizó una última incubación con 1
unidad de polimerasa superTaq durante 10 minutos a 72ºC. El
fragmento amplificado de 1,6 kb que oscilaba del nucl. 33178 al
extremo de la ITR derecha de Ad35, fue purificado utilizando el
estuche de purificación por PCR (LTI).
Ambos fragmentos de PCR purificados fueron
ligados en el vector PCR2.1 del estuche de clonación TA (Invitrogen)
y transformados en células competentes STBL-2
(LTI). Los clones que contenían el inserto esperado fueron
secuenciados para confirmar la amplificación correcta. A
continuación, ambos fragmentos fueron separados por corte del
vector mediante digestión con NotI y NdeI y purificados en gel
utilizando el estuche Geneclean (Bio 101, Inc.). El vector
cosmídico pWE15 (Clontech) fue digerido con NotI, desfosforilado y
también purificado en gel. Estos tres fragmentos fueron ligados y
transformados en células competentes STBL2 (LTI). Uno de los clones
correctos que contenía ambos fragmentos de la PCR fue digerido
después con NdeI y el fragmento lineal fue purificado en gel
utilizando el estuche Geneclean. El ADN de Ad35 wt fue digerido con
NdeI y el fragmento de 26,6 kb fue purificado en gel LMP utilizando
Agarase Enzym (Roche) según las instrucciones del fabricante. Estos
fragmentos fueron ligados entre sí y empaquetados utilizando los
extractos de empaquetamiento del fago \lambda (Stratagene) según
el protocolo del fabricante. Tras la infección en células
STBL-2, las colonias se hicieron crecer sobre
placas y se analizaron en cuanto a la presencia del inserto
completo. Se seleccionó un clon con el fragmento grande insertado
en la orientación correcta y que tenía los patrones de restricción
correctos tras las digestiones independientes con tres enzimas
(NcoI, PvuII y ScaII). Este clon se denomina
pW.Ad35.pIX-rITR. Contiene las secuencias de Ad35
desde el pb 3401 al extremo y está flanqueado por sitios NotI
(Figura 14).
El virus Ad35 de tipo salvaje se puede hacer
crecer sobre células de empaquetamiento PER.C6 a títulos muy
elevados. No obstante, no se sabe si la región E1 de Ad5 que está
presente en PER.C6 es capaz de complementar los virus recombinantes
de Ad35 con E1 suprimida. Para someter a ensayo esto, las células
PER.C6 fueron cotransfectadas con el plásmido adaptador
pAdApt35.LacZ descrito antes y el fragmento del esqueleto grande
pWE.Ad35.pIX-rITR. Primero, pAdApt35.LacZ fue
digerido con PacI y pWE.Ad35.pIX-rITR fue digerido
con NotI. Sin purificación adicional se mezclaron 4 \mugr de cada
constructo con DMEM (LTI) y se transfectaron en células PER.C6,
sembrados a una densidad de 5x10^{6} células en un matraz T25 el
día antes, utilizando Lipofectamine (LTI) según las instrucciones
del fabricante. Como control positivo, se cotransfectaron 6 \mugr
de ADN de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con PacI con
un fragmento NheI de 6,7 kb aislado de ADN de Ad35 wt que contenía
el extremo izquierdo del genoma viral incluyendo la región E1.
Al día siguiente se renovó el medio (DMEM con
FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM) y las células fueron incubadas
adicionalmente. A los 2 días de la transfección, las células fueron
tratadas con tripsina y transferidas a matraces T80. El matraz de
control positivo mostraba ECP a los cinco días de la transfección,
mostrando que el constructo pWE.Ad35.pIX-rITR es
funcional al menos en presencia de proteínas E1 de Ad35. La
transfección con el plásmido adaptador LacZ de Ad35 y
pWE.Ad35.pIX-rITR no daba lugar a ECP. Estas células
fueron cosechadas en el medio el día 10 y congeladas/descongeladas
una vez para liberar el virus de las células. Se añadieron 4 ml del
material cosechado a un matraz T80 con las células PER.C6 (a una
confluencia del 80%) y se incubaron durante otros cinco días. Esta
cosecha/reinfección se repitió dos veces pero no hubo evidencia de
virus asociado con ECP. A partir de este experimento parece que las
proteínas E1 de Ad5 no son, o no son lo bastante, capaces de
complementar los virus recombinantes de Ad35, sin embargo, puede ser
que el solapamiento de la secuencia del plásmido adaptador y el
plásmido esqueleto pWE.Ad35.pIX-rITR no sea lo
bastante grande para recombinar eficazmente y dar origen a un
genoma de virus recombinante. La transfección de control positiva se
realizó con un fragmento del extremo izquierdo de 6,7 kb y por lo
tanto el solapamiento de la secuencia era de aproximadamente 3,5
kb. El plásmido adaptador y el fragmento
pWE.Ad35.pIX-rITR tienen un solapamiento de la
secuencia de 1,3 kb. Para verificar si el solapamiento de la
secuencia de 1,3 kb es demasiado pequeño para una recombinación
homóloga eficaz, se realizó una cotransfección con
pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con PacI y un fragmento
de PCR de ADN wt de Ad35 generado con 35F1 y 35R4 mencionados antes
utilizando los mismos procedimientos descritos antes en la presente
memoria. El fragmento de PCR contiene por tanto las secuencias del
extremo izquierdo hasta el pb 4669 y por lo tanto tiene las mismas
secuencias solapantes con pWE.Ad35.pIX-rITR que el
plásmido adaptador pAdApt35.LacZ pero tiene secuencias E1 de Ad35.
Tras la purificación en columna de la PCR, el ADN fue digerido con
SalI para separar posibles secuencias molde intactas. Una
transfección con el producto de la PCR digerido solo servía como
control negativo. Cuatro días después de la transfección, se produjo
el ECP en las células transfectadas con el producto de la PCR y el
fragmento pIX-rITR de Ad35, y no en el control
negativo.
Este resultado muestra que la secuencia
solapante de 1,3 kb es suficiente para generar virus en presencia
de proteínas E1 de Ad35.
A partir de estos experimentos los autores de la
presente invención concluyen que la presencia de al menos una de
las proteínas E1 de Ad35 es necesaria para generar vectores basados
en Ad35 recombinantes a partir de ADN plasmídico en líneas
celulares complementadoras de Ad5.
Ejemplo
8
Puesto que las proteínas E1 de Ad5 en PER.C6 no
son capaces de complementar los virus recombinantes de Ad35
eficazmente, las proteínas E1 de Ad35 han de ser expresadas en
células complementadoras de Ad5 (v.g. PER.C6). Por otra parte, se
tiene que crear una nueva línea celular de empaquetamiento que
exprese las proteínas E1 de Ad35, partiendo o bien de células
humanas primarias diploides o bien de líneas celulares establecidas
que no expresen las proteínas E1 de adenovirus. Para estudiar la
primera posibilidad, se clonó la región E1 de Ad35 en plásmidos de
expresión como se describe más abajo.
Primero, se amplificó la región E1 de Ad35 desde
el pb 468 al pb 3400 a partir de ADN de wtAd35 utilizando el
siguiente grupo de cebadores: 35F11: 5'-GGG GTA CCG
AAT TCT CGC TAG GGT ATT TAT ACC-3' y 35F10:
5'-GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC
TG-3'. Esta PCR introduce un sitio KpnI y EcoRI en
el extremo 5' y un sitio SbfI y XbaI en el extremo 3'.
La amplificación en 5 ng de ADN molde se realizo
con ADN polimerasa Pwo (Roche) utilizando las instrucciones del
fabricante, no obstante, con ambos cebadores a una concentración
final de 0,6 \muM. El programa era el siguiente: 2 minutos a
94ºC, 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC y 2 minutos
a 72ºC, seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a
60ºC y 2 minutos a 72ºC, seguido de 10 minutos a 72ºC. El producto
de la PCR fue purificado mediante un estuche de purificación de PCR
(LTI) y digerido con KpnI y XbaI. El fragmento de la PCR digerido
fue ligado después al vector de expresión pRSVhbvNeo (véase el más
abajo), también digerido con KpnI y XbaI. Las ligaciones fueron
transformadas en células STBL-2 competentes (LTI)
según las instrucciones del fabricante y las colonias fueron
analizadas en cuanto a la correcta inserción de las secuencias E1
de Ad35 en el poliligador entre el promotor de RSV y poliA de
HBV.
El clon resultante fue denominado
pRSV.Ad35-E1 (Figura 15). Las secuencias de Ad35 en
pRSV.Ad35-E1 fueron verificadas mediante análisis
de la secuencia.
Se generó pRSVhbvNeo como sigue:
pRc-RSV (Invitrogen) fue digerido con PvuII,
desfosforilado con la enzima TSAP (LTI) y el fragmento vector de 3
kb fue aislado en agarosa de bajo punto de fusión (LMP). El plásmido
pPGKNeopA (Figura 16) descrito en WO96/35798, fue digerido con SspI
completamente para linealizar el plásmido y facilitar la digestión
parcial con PvuII. Tras la digestión parcial con PvuII, los
fragmentos resultantes fueron separados en un gel de agarosa LMP y
el fragmento PvuII de 2245 pb, que contenía el promotor de PGK, el
gen de resistencia a la neomicina y poliA de HBV, fue aislado. Ambos
fragmentos aislados fueron ligados para dar el vector de expresión
pRSV-pNeo que ahora tiene la casete de expresión
SV40prom-neo-SV40poliA original
remplazada por una casete
PGKprom-neo-HBVpoliA (Figura 17).
Este plásmido fue modificado adicionalmente para remplazar BGHpA
por HBVpA como sigue: se linealizó pRSVpNeo con ScaI y se digirió
adicionalmente con XbaI. El fragmento de 1145 pb, que contenía
parte del gen Amp y las secuencias promotoras de RSV y una secuencia
poliligadora, fue aislado en gel utilizando el estuche GeneClean
(Bio Inc. 101). A continuación pRSVpNeo fue linealizado con ScaI y
adicionalmente digerido con EcoRI parcialmente y el fragmento de
3704 pb que contenía la casete PGKneo y las secuencias del vector
fueron aislados en gel como antes. Un tercer fragmento, que contenía
la secuencia poliA de HBV flanqueada por XbaI y EcoRI en el extremo
5' y 3' respectivamente, fue generado después mediante
amplificación mediante PCR en pRSVpNeo utilizando el siguiente grupo
de cebadores: HBV-F: 5'-GGC TCT AGA
GAT CCT TCG CGG GAC GTC-3' y HBV-R:
5'-GGC GAA TTC ACT GCC TTC CAC CAA
GC-3'. La amplificación se realizó con la enzima
Elongase (LTI) según las instrucciones del fabricante con las
siguientes condiciones: 30 segundos a 94ºC, después 5 ciclos de 45
segundos a 94ºC, 1 minuto a 42ºC y 1 minuto a 68ºC, seguido de 30
ciclos de 45 segundos a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 1 minuto a 68ºC,
seguido de 10 minutos a 68ºC. El fragmento de la PCR de 625 pb fue
purificado después utilizando el estuche de purificación de PCR
Qiaquick, digerido con EcoRI y XbaI y purificado en gel utilizando
el estuche GeneClean. Los tres fragmentos aislados fueron ligados y
transformados en células DH5\alpha competentes (LTI) para dar el
constructo pRSVhbvNeo (Figura 18). En este constructo las regiones
reguladoras de la transcripción de la casete de expresión de RSV y
el marcador de selección para neomicina se modifican para reducir
el solapamiento con los vectores adenovirales que a menudo
contienen secuencias reguladoras de la transcripción de CMV y
SV40.
Se sembraron células PER.C6 a una densidad de 5
x 10^{6} células en un matraz T25 y al día siguiente se
transfectaron con una mezcla de ADN que contenía:
- -
- 1 \mug pAdApt35.Lacz digerido con PacI
- -
- 5 \mug pRSV.Ad35E1 no digerido
- -
- 2 \mug pWE.Ad35.pIX-rITR digerido con NotI
La transfección se realizó utilizando
Lipofectamine según las instrucciones del fabricante. Cinco horas
después de la adición de la mezcla de transfección a las células,
el medio se separó y se remplazó por medio de nueva aportación. Al
cabo de dos días las células fueron transferidas a matraces T80 y
cultivadas adicionalmente. Una semana después de la transfección se
añadió 1 ml del medio a células A549 y al día siguiente las células
se tiñeron para la expresión de LacZ. Las células de color azul eran
claramente visibles dos horas después de la tinción indicando que
se habían producido virus que expresaban LacZ recombinantes. Las
células fueron cultivadas adicionalmente pero no se observó una
clara aparición de ECP. Sin embargo, al cabo de 12 días aparecían
grupos de células en la monocapa y 18 días después de la
transfección las células se desprendieron. Las células y el medio
se cosecharon después, se congelaron-descongelaron
una vez y se utilizó 1 ml del producto lisado bruto para infectar
células PER.C6 en una placa de 6 pocillos. Dos días después de la
infección las células fueron teñidas para la actividad LacZ. Al
cabo de dos horas se habían teñido de azul el 15% de las células.
Para someter a ensayo la presencia de virus wt y/o de replicación
competente, se infectaron células A549 con estos virus y se
cultivaron adicionalmente. No se encontraron signos de ECP indicando
la ausencia de virus de replicación competente. Estos experimentos
muestran que los virus AdApt35.LacZ recombinantes se habían
construido en células PER.C6 cotransfectadas con un constructo de
expresión
Ad35.E1.
Ad35.E1.
Después se utilizaron los virus AdApt35.LacZ
para investigar la infección en presencia de suero que contiene
actividad neutralizadora de virus Ad5. El virus LacZ basado en Ad5
purificado servía como control positivo para la AN. A este fin, se
sembraron células PER.C6 en una placa de 24 pocillos a una densidad
de 2 x 10^{5} células/pocillo. Al día siguiente se diluyó una
muestra de suero humano con una elevada actividad neutralizadora de
Ad5 en medio de cultivo en cinco etapas de diluciones a la quinta.
Después se mezclaron 0,5 ml de suero diluido con 4x10^{6}
partículas virales de virus AdApt5.LacZ en 0,5 ml de medio y al cabo
de 30 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 0,5 ml de la
mezcla a las células PER.C6 por duplicado. Para los virus
AdApt35.LacZ, se mezclaron 0,5 ml de muestras de suero diluido con
0,5 ml del producto lisado bruto conteniendo virus AdApt35.LacZ y
tras la incubación se añadieron 0,5 ml de esta mezcla a células
PER.C6 por duplicado. Las muestras de virus incubadas en medio sin
suero fueron utilizadas como control positivo para la infección. Al
cabo de dos horas de infección a 37ºC, se añadió medio para alcanzar
un volumen final de 1 ml y las células se incubaron adicionalmente.
Dos días después de la infección las células fueron teñidas para la
actividad LacZ. Los resultados se muestran en la Tabla II. A partir
de estos resultados está claro que mientras los virus AdApt5.LacZ
eran eficazmente neutralizados, los virus AdApt35.LacZ se mantenían
infecciosos con independencia de la presencia de suero humano. Esto
demuestra que los virus basados en Ad35 recombinantes escapan a la
neutralización en sueros humanos que contienen AN de virus basados
en Ad5.
Ejemplo
9
En el ejemplo 3 los autores de la presente
invención han descrito la generación de un banco de adenovirus
basados en Ad5 que albergan la proteína de la fibra de otros
serotipos. Como ejemplo no limitante para el uso de este banco los
autores de la presente invención describen aquí la identificación de
adenovirus con la fibra modificada que muestran una infección
mejorada de las células del tallo hematopoyético.
Las células aisladas de médula ósea, sangre del
cordón umbilical, o sangre periférica humanas que portan el
fenotipo citométrico de flujo de ser positivas para el antígeno CD34
y negativas para los marcadores de diferenciación temprana CD33,
CD38 y CD71 (lin^{-}) son referidas comúnmente como células del
tallo hematopoyético (HSC). La modificación genética de estas
células es de gran interés puesto que todos los linajes
hematopoyéticos están derivados de estas células y por lo tanto la
HSC es una célula diana para el tratamiento de muchas alteraciones
hematopoyéticas humanas adquiridas o congénitas. Entre los ejemplos
de las enfermedades que son corregibles por modificación genética
de HSC se incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de
Hurlers, enfermedad de Hunters, enfermedad de Sanfilippos,
enfermedad de Morquios, enfermedad de Gaucher, enfermedad de
Farbers, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de
Krabe, Leucodistrofia Metacromática, enfermedad de las células I,
síndrome de inmunodeficiencia grave, deficiencia de
Jak-3, deficiencia de Fucosidosis, talasemia, y
porfiria eritropoyética. Además de estas alteraciones
hematopoyéticas también las estrategias para prevenir o tratar el
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y los cánceres
hematopoyéticos están basadas en la modificación genética de HSC o
de células derivadas de HSC tales como los linfocitos CD4 positivos
en el caso del SIDA. Los ejemplos enumerados en la presente memoria
pretenden de este modo introducir ADN en la HSC con el fin de
complementar a nivel genético una deficiencia de un gen o una
proteína. En el caso de las estrategias para el SIDA o el cáncer,
el ADN que se va a introducir en las HSC puede ser de genes
anti-virales o de genes suicidas.
Además de los ejemplos enumerados en la presente
memoria, existen otras numerosas áreas en las cuales la transducción
eficaz de HSC utilizando vectores adenovirales puede jugar un
importante papel. Por ejemplo en el caso de las aplicaciones para
tejidos. En esta área es importante dirigir la diferenciación de HSC
a linajes específicos. Algunos ejemplos, no limitantes, son la
formación de hueso, la formación de cartílago, la formación de piel
ex vivo, así como la generación de precursores de las células
T o precursores de las células endoteliales. La generación de
hueso, cartílago o piel en biorreactores puede ser utilizada para el
transplante tras fracturas óseas o lesiones de la médula espinal o
lesiones por quemaduras graves. Naturalmente, las células
transducidas también pueden ser re-infundidas
directamente en el paciente. La formación de un gran número de
precursores de células endoteliales a partir de HSC tiene interés
puesto que las células endoteliales pueden regresar, tras la
re-infusión, a sitios de lesión cardiovascular tales
como la isquemia. Del mismo modo, la formación de un gran número de
células T a partir de HSC tiene interés puesto que estos precursores
de las células T pueden ser cebados, ex vivo, para erradicar
ciertas dianas en el cuerpo humano tras la reinfusión de las células
T cebadas. Las dianas preferidas en el cuerpo humano pueden ser
tumores o células infectadas con virus.
A partir de los ejemplos descritos en la
presente memoria, se puede concluir que la liberación génica eficaz
para HSC tiene un gran interés para el campo de la terapia génica.
Por lo tanto, la alteración de la gama de células anfitrionas de
Ad5 para que sea capaz de dirigirse a HSC in vitro así como
in vivo es el principal interés de la invención. Para
identificar un adenovirus quimérico con unas características
preferidas de infección de HSC humanas, los autores de la presente
invención generaron un banco de virus basados en Ad5 que portaban
la molécula de la fibra de serotipos adenovirales alternativos
(serotipos 8, 9, 13, 16, 17, 32, 35, 45, 40-L, 51).
La generación de este banco con la fibra modificada se describe en
el ejemplo 3. Se tomó Ad5 como referencia. Se sometió a ensayo un
pequeño panel de este banco en TF-1 humano (leucemia
eritroide, ATCC CRL-2003) mientras todos los virus
quiméricos generados fueron sometidos a ensayo en células
estromáticas primarias humanas y HSC humanas. Las células
TF-1 humanas fueron mantenidas rutinariamente en
DMEM con un suplemento de FCS al 10% y 50 ng/ml de
IL-3 (Sandoz, Basel, Suiza). El estroma de tipo
fibroblástico primario humano, aislado aspirando médula ósea, se
mantiene rutinariamene en DMEM/FCS al 10%. El estroma fue sembrado
a una concentración de 1 x 10^{5} células por pocillo de placas de
24 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra las células
fueron expuestas durante 2 horas a 1000 partículas de virus por
célula de Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib17, Ad5.Fib35,
Ad5.Fib40-L, o Ad5.Fib51 portando todos GFP como
marcador. Al cabo de 2 horas las células fueron lavadas con PBS y
sembradas de nuevo en medio sin la adición de virus. Las células
TF-1 fueron sembradas a una concentración de 2 x
10^{5} células por pocillo de placas de 24 pocillos y también
fueron expuestas durante 2 horas a 1000 partículas de virus de los
diferentes adenovirus quiméricos. El virus fue eliminado lavando
las células después de 2 horas de exposición. Ambos tipos de células
fueron cosechados 48 horas después de la exposición al virus y
analizados en cuanto a la expresión de GFP utilizando un citómetro
de flujo. Los resultados en las células TF-1,
mostrados en la figura 19, demuestran que los adenovirus quiméricos
que portan una fibra de los serotipos 16, 35, o 51 (todos derivados
del subgrupo B de adenovirus) tienen unas características de
infección preferidas en comparación con Ad5 (subgrupo C), Ad5.Fib17
(subgrupo D), o Ad5.Fib40-L (subgrupo F). Se
sometió a ensayo estroma primario humano puesto que estas células
son utilizadas comúnmente como células "alimentadoras" para
permitir la proliferación y el mantenimiento de HSC en condiciones
de cultivo ex vivo. En contraste con la transducción de las
células TF-1, ninguno de los adenovirus de fibra
quimérica era capaz de transducir eficazmente estroma primario
humano (Figura 20). Se observó una infección razonable de estroma
primario de tipo fibroblástico humano sólo con Ad5 a pesar de la
observación de que ninguna de las moléculas receptoras conocidas
son expresadas en estas células (véase el la tabla III). La ausencia
de infección de estroma humano utilizando los virus quiméricos es
ventajosa puesto que en un entorno de cultivo simultáneo, el
adenovirus quimérico no será absorbido principalmente por las
células "alimentadoras" estromáticas.
Para someter a ensayo la capacidad de
transducción de los virus de fibra quimérica, se utilizó una reserva
de sangre de cordón umbilical (3 individuos) para el aislamiento de
células del tallo. Las células CD34^{+} fueron aisladas de una
preparación de células mononucleares utilizando el sistema de
separación de laboratorio MACS (Miltenyi Biotec) utilizando el
protocolo proporcionado por el fabricante. De las células
CD34^{+}, 2 x 10^{5} se sembraron en un volumen de 150 \mul
de DMEM (sin suero; Gibco, Gaithersburg, MD) y se añadieron 10
\mul de adenovirus quimérico (para dar una proporción final de
partículas de virus/célula de 1000). Los adenovirus quiméricos
sometidos a ensayo eran Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib35, Ad5Fib17,
Ad5.Fb51 conteniendo todos GFP como marcador. Las células fueron
incubadas durante 2 horas en una atmósfera humidificada de CO_{2}
al 10% a 37ºC. Después de eso, las células fueron lavadas una vez
con 500 \mul de DMEM y resuspendidas en 500 \mul de medio
StemPro-34 SF (Life Technologies, Grand Island,
NY).
Las células fueron cultivadas después durante 5
días en placas de 24 pocillos (Greiner, Frickenhausen, Alemania) en
estroma de médula ósea humana pre-establecido (ref
1) irradiado (20 Gy), en una atmósfera humidificada de CO_{2} al
10% a 37ºC. Al cabo de 5 días, se recogió la población celular
completa mediante tripsinización con 100 \mul de
Tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco). El número de células
antes y después de 5 días de cultivo fue determinado utilizando un
hematocitómetro. Se calculó el número de células CD34^{+} y
CD34^{++}CD33,38,71^{-} en cada muestra a partir del número
total de células recuperadas y la frecuencia de las células
CD34^{+}CD33,38,71^{-} en la población total como se determina
mediante análisis FACS. La eficacia de transducción fue determinada
mediante análisis FACS mientras se controlaba en las distintas
subpoblaciones la frecuencia de células que expresaban GFP así como
la intensidad de GFP por célula individual. Los resultados de este
experimento, mostrados en la figura 21, demuestran que el Ad5 o el
adenovirus quimérico Ad5.Fib17 no infecta las células
CD34^{+}Lin^{-} como quedaba demostrado por la ausencia de
expresión de GFP. En contraste, con los virus quiméricos que
portaban la molécula de fibra de los serotipos 16, 51, o 35 se
obtenían elevados porcentajes de células GFP positivas en esta
población de células. Se demuestra la especificidad para
CD34^{+}Lin^{-} puesto que se observa una escasa expresión de
GFP en las células CD34^{+} que también expresan CD33, CD38 y
CD71. El subfraccionamiento de las células CD34^{+}Lin^{-}
(Figura 22) mostraba que el porcentaje de células positivas para GFP
disminuía utilizando Ad5.Fib16, Ad5.Fib35, o Ad5.Fib51 cuando las
células se volvían más y más positivas para los marcadores de
diferenciación temprana CD33 (mieloide), CD71 (eritroide), y CD38
(marcador de diferenciación temprana común). Estos resultados
demuestran por tanto la especificidad de los adenovirus quiméricos
Ad5.Fib16, Ad5.Fib35, y Ad5.Fib51 para HSC.
En la figura 23 se muestra el alineamiento de la
fibra de Ad5 con las proteínas de la fibra del grupo B quiméricas
derivadas de Ad16, 35 y 51. Determinando el número de células
recuperadas tras el procedimiento de transducción se puede
determinar la toxicidad de los adenovirus. La recuperación de la
cantidad de células CD34^{+} así como la cantidad de
CD34^{+}Lin^{-} (Figura 24) demuestra que una exposición de 2
horas a 1000 partículas de adenovirus no tenía efecto sobre el
número de células recuperadas.
Ejemplo
10
Las células dendríticas son células
presentadoras de antígenos (APC), especializadas en iniciar una
respuesta inmunitaria primaria y capaces de reforzar el tipo de
memoria de la respuesta inmunitaria. Dependiendo de su estado de
desarrollo, las DC despliegan diferentes funciones: las DC inmaduras
son muy eficaces en la captación y el procesamiento de antígenos
para la presentación por las moléculas de clase I y clase II del
Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), mientras las DC
maduras, que son menos eficaces en la captura y el procesamiento de
antígenos, funcionan mucho mejor al estimular las células T
CD4^{+} y CD8^{+} sin activación previa "naïve" y de
memoria, debido a la elevada expresión de las moléculas del MHC y
las moléculas co-estimuladoras de su superficie
celular. Las DC inmaduras maduran in vivo tras la captación
de antígenos, viajan a las áreas de las células T del los órganos
linfoides, y ceban la activación de las células T.
Puesto que las DC son las células responsables
del desencadenamiento de una respuesta inmunitaria ha habido un
interés desde hace mucho tiempo en cargar las DC con proteínas
inmunoestimuladoras, péptidos o genes que codifiquen estas
proteínas para disparar el sistema inmunitario. Las aplicaciones de
esta estrategia se encuentran en el campo del tratamiento del
cáncer así como en el campo de la vacunación. Hasta aquí, las
estrategias anti-cancerosas han estado enfocadas
principalmente a una carga ex vivo de las DC con antígenos
(proteínas o péptidos). Estos estudios han revelado que este
procedimiento daba como resultado la inducción de la actividad de
las células T citotóxicas. Los antígenos utilizados para cargar las
células son identificados generalmente por ser específicos de los
tumores. Algunos ejemplos, no limitantes, de tales antígenos son
GP100, MAGE, o Mart-1 para el melanoma.
Además del tratamiento del cáncer se están
evitando en la actualidad otras muchas enfermedades humanas
potenciales a través de la vacunación. En la estrategia de
vacunación, se presenta al sistema inmunitario un patógeno
"invalidado" por medio de la acción de las células
presentadoras de antígenos, es decir las DC inmaduras. Entre los
ejemplos bien conocidos de prevención de enfermedades por medio de
estrategias de vacunación se incluyen la Hepatitis A, B, C, la
influenza, la rabia, la fiebre amarilla, el sarampión. Además de
estos programas de vacunación bien conocidos, se están
desarrollando programas de investigación para el tratamiento de la
malaria, el ébola, la ceguera de los ríos, el VIH y otras muchas
enfermedades. Muchos de los patógenos mencionados antes son
considerados peligrosos para la generación de una vacuna de
patógenos "invalidados". Esta última se llama así por el
aislamiento y la caracterización de proteínas de cada patógeno que
son capaces de armar una respuesta inmunitaria madura que produce
una protección completa tras la sensibilización con el patógeno de
tipo salvaje.
Para que esta estrategia de cargar las DC con
proteínas o péptidos inmunoestimuladores se vuelva factible
terapéuticamente se deben satisfacer al menos dos criterios
distintos. 1) el aislamiento de un gran número de DC que puedan ser
aisladas, manipuladas, y re-infundidas en un
paciente, haciendo autólogo el procedimiento. Hasta la fecha, es
posible obtener tales grandes cantidades de DC inmaduras a partir de
monocitos de sangre periférica cultivados de cualquier donador
dado. 2) un vector que pueda transducir las DC eficazmente de manera
que se pueda liberar el ADN que codifica la proteína
inmunoestimuladora. Lo último es extremadamente importante puesto
que ha quedado claro que el tiempo requerido para que las DC viajen
a los órganos linfoides es tal que la mayoría de las proteínas o
péptidos ya se han liberado de las DC produciendo un cebado
inmunitario incompleto. Debido a que las DC son células
diferenciadas terminalmente y por tanto no están en división, se
están considerando los vectores adenovirales recombinantes para
liberar el ADN que codifica los antígenos para las DC. Idealmente
este adenovirus debe tener una elevada afinidad por las células
dendríticas pero además no debe ser reconocido por los anticuerpos
neutralizadores del anfitrión de manera que se pueda completar la
transducción in vivo de las DC. Esto último podría omitir la
necesidad de manipulaciones ex vivo de las DC pero daría
como resultado un procedimiento médico idéntico a los programas de
vacunación que están teniendo lugar en la actualidad, es decir
predominantemente inyección intramuscular o subcutánea. De este
modo, las DC transducidas por los vectores adenovirales que
codifican una proteína inmunogénica pueden ser ajustados idealmente
para que sirvan como coadyuvantes naturales para la inmunoterapia y
la
vacunación.
vacunación.
A partir de los ejemplos descritos antes, se
puede concluir que la liberación génica eficaz en las DC tiene un
gran interés para el campo de la terapia génica. Por lo tanto, la
alteración de la gama de célula anfitriona del adenovirus de
serotipo 5 para que sea capaz de dirigirse a las DC in vitro
así como in vivo tiene un interés fundamental para la
invención. Para identificar un adenovirus quimérico con las
características de infección preferidas para las DC humanas, los
autores de la presente invención generaron un banco de virus
basados en Ad5 que portaban una molécula de fibra de serotipos
alternativos (serotipos 8, 9, 13, 16, 17, 32, 35, 45,
40-L, 51). Se tomó Ad5 como referencia.
Los autores de la presente invención evaluaron
la susceptibilidad de los monocitos humanos derivados de DC
inmaduras y maduras a los adenovirus quiméricos recombinantes que
expresan diferentes fibras.
Se aislaron PBMC humanos de donadores sanos por
medio de centrifugación por densidad en
Ficoll-Hypaque. Los monocitos fueron aislados de
PBMC mediante enriquecimiento en células CD14^{+} utilizando la
tinción con anticuerpo monoclonal anti-CD14 humano
marcado con FITC (Becton Dickinson), y columnas de separación de
microcuentas FITC y MACS (Miltenyi Biotec.)
Este procedimiento produce normalmente una
población de células que son CD14^{+} < 90% como se analizaba
mediante FACS. Las células fueron colocadas en cultivo utilizando
medio RPMI-1640 (Gibco) conteniendo Suero Bovino
Fetal ("FBS") al 10% (Gibco), 200 ng/ml de
GM-CSF rhu (R&D/ITK diagnostics), 100 ng/ml de
IL-4 rhu (R&D/ITK diagnostics) y cultivadas
durante 7 días alimentando los cultivos con medio de nueva
aportación conteniendo citocinas en días alternos. Las DC inmaduras
resultantes de este procedimiento al cabo de 7 días expresan un
fenotipo CD83^{-}, CD14^{bajo} o CD14^{-},
HLA-CR^{+}, como se demostraba mediante análisis
FACS. Las DC inmaduras maduran cultivando las células en medio que
contenía 100 ng/ml de TNF-a durante 3 días, después
de lo cual expresaban CD83 en su superficie celular.
En un experimento piloto se sembraron 5.10^{5}
DC inmaduras en pocillos de placas de 24 pocillos y se expusieron
durante 24 horas a 100 y 1000 partículas de virus por célula de cada
virus de fibra recombinante. El virus sometido a ensayo era Ad5, y
los virus de fibra quimérica basados en Ad5: Ad5.Fib12, Ad5.Fib16,
Ad5.Fib28, Ad5.Fib32, Ad5.Fib40-L (fibra larga del
serotipo 40), Ad5.Fib49, y Ad5.Fib51 (donde Fibxx representa el
serotipo del cual deriva la fibra). Estos virus derivan del
subgrupo C, A, B, D, D, F, D, y B respectivamente. Al cabo de 24
horas las células fueron lisadas (Triton X-100/PBS
al 1%) y la actividad luciferasa fue determinada utilizando el
protocolo suministrado por el fabricante (Promega, Madison, WT,
USA). Los resultados de este experimento, mostrados en la figura
25, demuestran que Ad5 infecta escasamente las DC inmaduras como
quedaba demostrado por el bajo nivel de expresión transgénica. En
contraste, Ad5.Fib16 y Ad5.Fib51 (ambos virus de fibra quimérica
del grupo B) y también Ad5.Fib40-L (Subgrupo F)
muestran una infección eficaz de las DC inmaduras basándose en la
expresión transgénica de la luciferasa.
En un segundo experimento, se infectaron
5.10^{5} DC inmaduras y maduras con 10.000 partículas de virus
por célula de Ad5, Ad5.Fib16, Ad5.Fib40-L, y
Ad5.Fib51 portando todas el gen LacZ como marcador. La expresión de
LacZ fue controlada mediante análisis de citometría de flujo
utilizando un sistema de estuches CM-FDG y las
instrucciones suministradas por el fabricante (Molecular Probes,
Leiden, Países Bajos). Los resultados de este experimento,
mostrados en la figura 26, se corresponden con el experimento
anterior ya que Ad5.Fib16 y Ad5.Fib51 son superiores a Ad5
transduciendo las DC humanas maduras e inmaduras. Asimismo, este
experimento muestra que Ad5.Fib40-L no es tan bueno
como Ad5.Fib16 y Ad5.Fib51 pero es mejor que Ad5.
Basándose en estos resultados los autores de la
presente invención sometieron a ensayo otros adenovirus quiméricos
que contenían fibras de virus del grupo B, por ejemplo, Ad5.Fib11 y
Ad5.Fib35 en cuanto a su capacidad para infectar las DC. Los
autores de la presente invención se concentraron en las DC inmaduras
puesto que estas son las células que transforman un producto
transgénico expresado en péptidos presentables de la clase I y II
del MHC. Las DC inmaduras fueron sembradas a una densidad celular de
5.10^{5} células/pocillo en placas de 24 pocillos (Costar) e
infectadas con 1000 y 5000 partículas de virus por célula después de
lo cual las células fueron cultivadas durante 48 horas en
condiciones para DC inmaduras antes de las mediciones de la lisis
celular y la actividad Luciferasa. El resultado de este experimento,
mostrado en la figura 27, demuestra que los adenovirus quiméricos
basados en Ad5 que contienen fibras de virus del grupo B infectan
eficazmente las DC inmaduras. En un cuarto experimento los autores
de la presente invención infectaron de nuevo DC inmaduras de una
manera idéntica a la descrita en los primeros experimentos pero esta
vez se utilizaron Ad5, Ad5.Fib16, y Ad5.Fib35 que portaban GFP como
gen marcador. Los resultados de la expresión de GFP medida con el
citómetro de flujo 48 horas después de la exposición del virus se
muestran en la figura 28 y se corresponden con los datos obtenidos
hasta ahora.
Así, los resultados hasta aquí coinciden en que
los vectores basados en Ad5 que portan una fibra de un adenovirus
alternativo derivado del subgrupo B predominantemente la fibra de
35, 51, 16, y 11 son superiores a Ad5 transduciendo las DC
humanas.
Los adenovirus descritos aquí también son muy
adecuados en la vacunación de animales. Para ilustrar esto, los
autores de la presente invención sometieron a ensayo DC derivadas de
ratón y chimpancé para identificar si estos virus pueden ser
utilizados en estos modelos animales. Esto último en particular ya
que el receptor de adenovirus humano derivado del subgrupo B es
desconocido hasta la fecha y por lo tanto no se sabe si esta
proteína está conservada entre especies. Para ambas especies se
sembraron DC inmaduras a una densidad de 10^{5} células por
pocillo de placas de 24 pocillos. Las células fueron expuestas con
posterioridad durante 48 horas a 1000 partículas de virus por
célula de Ad5, Ad5.Fib16, y Ad5.Fib51 en el caso de DC de ratón y
Ad5, Ad5.Fib35 en el caso de DC de chimpancé (véase el la figura
29). El experimento con ratón se realizó con virus que portaban
luciferasa como marcador y mostraban una actividad luciferasa
incrementada aproximadamente 10-50 veces en
comparación con Ad5. Las DC de chimpancé fueron infectadas con los
virus GFP y fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo.
Estos resultados, también mostrados en la figura 29, demuestran que
Ad5 (3%) transduce las DC de chimpancé muy escasamente en
comparación con Ad5.Fib35 (66,5%).
Ejemplo
11
Los resultados de los experimentos de
neutralización descritos en el Ejemplo 5 muestran que Ad11, como
Ad35, tampoco era neutralizado en la inmensa mayoría de las
muestras de suero humano.
Tanto Ad35 como Ad11 son virus del grupo B y se
clasifican como virus pertenecientes a la agrupación 2 de homología
del ADN (Wadell, 984). Por lo tanto, los genomas de Ad35 y Ad11 son
muy similares. Para generar un sistema basado en plásmidos para la
producción de virus recombinantes basados en Ad11 el plásmido
adaptador pAdApt35IP1 generado en el Ejemplo 7 es modificado como
sigue. El constructo pAdApt35IP1 es digerido con AvrII y después
parcialmente con PacI. La mezcla de digestión es separada en gel y
el fragmento de 4,4 kb que contiene la casete de expresión y el
esqueleto del vector es aislado utilizando el estuche de GeneClean
(BIO 101, Inc.). Después, se realiza una amplificación mediante PCR
en ADN de wtAd11 utilizando los cebadores 35F1 y 35R2 (véase el
Ejemplo 7) utilizando ADN polimerasa Pwo según las instrucciones del
fabricante. El fragmento de PCR obtenido de 0,5 kb es purificado
utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI) y ligado al
fragmento separado antes de pAdApt35IP1. Esto da el constructo
pAdApt11-35IP1 en el cual el fragmento 5' del
adenovirus es intercambiado por la correspondiente secuencia de
Ad11. A continuación, pAdApt11-35IP1 es digerido con
BglII y parcialmente con PacI. Los fragmentos obtenidos son
separados en gel y el fragmento de 3,6 kb que contiene las
secuencias vectoras, el fragmento 5' de adenovirus y la casete de
expresión es purificado en gel como antes. A continuación, se genera
un fragmento de PCR utilizando los cebadores 35F3 y 35R4 (véase el
Ejemplo 7) en ADN de wtAd11.
La amplificación se realiza como antes y el
fragmento de 1,3 kb obtenido se purifica y digiere con BglII y
PacI. Los fragmentos aislados son ligados después para dar el
constructo pAdApt11IP1. Este plásmido adaptador contiene ahora las
secuencias de Ad11 en lugar de las secuencias de Ad35. La correcta
amplificación de las secuencias de Ad11 amplificadas mediante PCR
es verificada mediante comparación de la secuencia de este clon con
la correspondiente secuencia del ADN de Ad11. El último es obtenido
mediante secuenciación directa del ADN de Ad11 utilizando los
cebadores de PCR indicados. El clon cosmídico grande que contiene el
esqueleto de Ad11 es generado como sigue: Primero, se amplifica un
fragmento de PCR sobre el ADN de Ad11 utilizando los cebadores 35F5
y 35R6 con ADN polimerasa Pwo como se describe en el Ejemplo 7 para
el ADN de Ad35. El fragmento de la PCR es purificado después
utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI) y digerido con
NotI y NdeI. El fragmento de 3,1 kb resultante es aislado en gel
utilizando el estuche GeneClean BIO 101, Inc.). Después se genera
un segundo fragmento de PCR en ADN de Ad11 utilizando los cebadores
35F7 y 35R8 (véase el Ejemplo 7) con ADN polimerasa Pwo según las
instrucciones del fabricante y se purifica utilizando el estuche de
purificación de PCR (LTI). Este fragmento amplificado también es
digerido con NdeI y NotI y el fragmento de 1,6 kb resultante es
purificado en gel como antes.
Los dos fragmentos de PCR digeridos son ligados
después con el vector cosmídico pWE15, previamente digerido con
NotI y desfosforilado utilizando la enzima Tsap (LTI) según las
instrucciones del fabricante. Se selecciona un clon que tiene
insertada una copia de ambos fragmentos. Los clones correctos se
seleccionan mediante digestión analítica con NotI que da un
fragmento de 4,7 kb. Se obtiene confirmación mediante una reacción
PCR utilizando los cebadores 35F5 y 35R8 que da un fragmento del
mismo tamaño. Después el clon correcto es linealizado con NdeI y
aislado en gel. A continuación, se digiere ADN de wtAd11 con NdeI y
el fragmento grande de 27 kb se aísla en gel de agarosa de bajo
punto de fusión utilizando la enzima agarasa (Roche) según las
instrucciones del fabricante. Ambos fragmentos son ligados después
y empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento del fago
\lambda (Stratagene) según el protocolo del fabricante. Tras la
infección en células STBL-2 (LTI) las colonias se
hacen crecer sobre placas y se analizan en cuanto a la presencia del
inserto completo. La funcionalidad de los clones seleccionados es
sometida a ensayo después mediante cotransfección en células
PER.C6. A este fin, el ADN es digerido con NotI y 6 \mugr son
co-transfectados con 2 \mugr de un fragmento de
PCR generado en ADN de Ad11 con los cebadores 35F1 y 35R4 (véase el
ejemplo 7). Los clones correctos producen ECP en la semana
siguiente a la transfección. El clon correcto es denominado
pWE.Ad11.pIX-rITR.
Utilizando el procedimiento descrito antes, se
genera un sistema a base de plásmidos que consta de un plásmido
adaptador adecuado para la inserción de genes foráneos y un
fragmento coadyuvante grande que contiene el esqueleto viral. Los
virus basados en Ad11 recombinante se elaboran utilizando los
métodos descritos aquí para los virus recombinantes basados en
Ad35.
Ejemplo
12
En los experimentos de neutralización descritos
en los Ejemplo 1 y 5, todas las muestras derivaron de voluntarios
sanos. Puesto que una de las aplicaciones de los vectores no
neutralizados se encuentra en el campo de la terapia génica, es
interesante investigar si Ad35 también es neutralizado con una baja
frecuencia y con títulos bajos en grupos de pacientes que son
candidatos para el tratamiento con terapia génica.
Se obtuvieron 26 muestras de suero y fluido
pericárdico (PF) emparejadas de pacientes con insuficiencia
cardíaca. Estas fueron sometidas a ensayo frente a Ad5 y Ad35
utilizando el análisis de neutralización descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados confirmaron los datos previos con muestras de
voluntarios sanos. El 70% de las muestras de suero contenía AN para
Ad5 y el 4% para Ad35. En las muestras de fluido pericárdico los
títulos eran inferiores dando como resultado un total del 40% con
AN para Ad5 y ninguno para Ad35. Había una buena correlación entre
AN y PF en suero es decir no había muestras PF positivas sin AN en
la muestra de suero emparejada. Estos resultados muestran que se
prefieren los vectores no neutralizados basados en Ad35 sobre los
vectores de Ad5 para el tratamiento de las enfermedades
cardiovasculares. Como se verifica para todas las formas de vectores
no neutralizados en esta aplicación, el vector puede estar basado
en el genoma del serotipo no neutralizado o puede estar basado en
Ad5 (u otro serotipo) aunque muestre al menos las principales
proteínas de la cápsida (hexónicas, pentónicas y opcionalmente
fibra) del serotipo no neutralizado.
El determinante molecular subyacente de la
artritis todavía no es conocido pero se sabe que tanto la disfunción
de las células T como la producción desequilibrada de factor de
crecimiento en las articulaciones ocasionan inflamación e
hiperplasia del tejido sinovial. Los sinoviocitos comienzan a
proliferar e invadir el cartílago y el hueso lo que conduce a la
destrucción de estos tejidos. El tratamiento actual comienza (cuando
es en la fase temprana) con la administración de fármacos
anti-inflamatorios (anti-TNF,
Il1-RA, IL-10) y/o fármacos
convencionales (v.g. MTX, sulfasalazina). En la RA en fase tardía se
realiza la sinovectomía que se basa en la cirugía, radiación, o
intervención química. Una alternativa u opción adicional es el
tratamiento por medio de terapia génica en la que un vector
adenoviral es liberado directamente en las articulaciones de los
pacientes y expresa un fármaco anti-inflamatorio o
un gen suicida. Los estudios previos realizados en monos rhesus que
padecían artritis inducida por colágeno han demostrado que los
vectores basados en Ad5 que portan un gen marcador pueden
transducir los sinoviocitos. No se sabe si en la situación humana la
liberación adenoviral está impedida por la presencia de AN. Para
investigar la presencia de AN en fluido sinovial (SF) de pacientes
con RA, se obtuvieron muestras de SF de un panel de 53 pacientes
seleccionados al azar que padecían artritis reumatoide (RA).
Estos fueron sometidos a ensayo frente a
numerosos adenovirus wt utilizando el análisis de neutralización
descrito en el Ejemplo 1. Los resultados de este escrutinio se
presentan en la Tabla III. Se encontró que el adenovirus de tipo 5
era neutralizado en el 72% de las muestras de SF. La mayor parte de
estas muestras contienen títulos elevados de AN como también la
dilución más elevada de la muestra de SF que se había sometido a
ensayo (64x) neutralizaba los virus Ad5. Esto significa que la
liberación del vector adenoviral en los sinoviocitos de las
articulaciones de los pacientes con RA será muy ineficaz. Por otra
parte, puesto que los títulos en SF son tan elevados es dudoso que
el lavado de las articulaciones antes de la inyección del vector
elimine suficiente AN. De los otros serotipos que se sometieron a
ensayo se demostró que Ad35 era neutralizado sólo en el 4% de las
muestras. Por lo tanto, estos datos confirman los resultados
obtenidos en las muestras de suero de pacientes sanos y muestran
que para el tratamiento de la artritis reumatoide los vectores
basados en Ad35 o los vectores quiméricos que despliegan al menos
alguna de las proteínas de la cápsida de Ad24 son los vectores
preferidos.
Ejemplo
13
En el Ejemplo 4 se describe la generación del
subclon de Ad35 pBr/Ad35.Eco13.3. Este clon contiene secuencias de
Ad35 desde el pb 21943 al extremo de la ITR derecha clonadas en los
sitios EcoRI y EcoRV de pBr322. Para ampliar estas secuencias al
sitio PacI localizado en el pb 18137 de Ad35, pBr/Ad35.Eco13.3
(véase el Ejemplo 4) fue digerido con AatII y SnaBI y el fragmento
que contenía el vector grande fue aislado en gel utilizando el
estuche de extracción en gel QIAEX II (Qiagen). El ADN de Ad35 wt
fue digerido con PacI y SnaBI y el fragmento de 4,6 kb fue aislado
como antes. Este fragmento fue ligado después a un conector de doble
hebra (dh) que contiene un saliente PacI y AatII. Este conector fue
obtenido tras recocer los siguientes oligonucleótidos:
A-P1: 5'-CTG GTG
GTT AAT-3' y A-P2:
5'-TAA CCA CCA GAC GT-3'
La mezcla de ligación que contenía el ligador de
doble hebra y el fragmento PacI-SnaBI de Ad35 fue
separado del conector no ligado en un gel LMP. La banda de 4,6 kb
fue separada mediante corte del gel, fundida a 65ºC, y después
ligada al fragmento vector pBr/Ad35.Eco13.3 purificado digerido con
AatII y SnaBI. Las ligaciones fueron transformadas en células DH10B
electrocompetentes (Life Technologies Inc.). El clon resultante,
pBr/Ad35.Pac-rITR, contenía secuencias de Ad35
desde el sitio PacI en el pb 18137 hasta la ITR derecha.
A continuación, se introdujo el único sitio de
restricción en el extremo 3' de la ITR derecha para poder liberar
la ITR de las secuencias del vector. A este fin, se utilizó un
fragmento de PCR que cubre las secuencias de Ad35 desde el sitio
NdeI en el pb 33165 a la ITR derecha que tenía los sitios de
restricción SwaI, NotI y EcoRI anclados a la rITR. El fragmento de
la PCR fue generado utilizando los cebadores 35F7 y 35R8 (descritos
en el Ejemplo 7). Tras la purificación, el fragmento de la PCR fue
clonado en el vector de clonación AT (Invitrogen) y secuenciado
para verificar la amplificación correcta. El clon amplificado
correcto se digirió después con EcoRI, sus extremos se hicieron
romos con la enzima de Klenow y con posterioridad se digirió con
NdeI y se aisló el fragmento de la PCR. Paralelamente, el NdeI del
vector pBr de pBr/Ad35.Pac-rITR fue separado como
sigue: se separó un vector pBr322 del cual se había separado el
sitio NdeI por digestión con NdeI, tratamiento de Klenow y
religación, se digirió con AatII y NheI. El fragmento vector fue
aislado en gel LMP y ligado al fragmento AatII-NheI
de Ad35 de 16,7 kb de pBr/Ad35.Pac-rITR que también
se había aislado en gel LMP. Esto generó
pBr/Ad35.Pac-rITR.\DeltaNdeI. A continuación
pBr/Ad35.Pac-rITR.\DeltaNdeI fue digerido con
NheI, los extremos fueron rellenados utilizando la enzima de Klenow
y el ADN fue digerido después con NdeI. El fragmento grande que
contenía el vector y las secuencias de Ad35 fue aislado. La ligación
de este fragmento vector y el fragmento de la PCR dio como
resultado pBr/Ad35.PRn. En este clon las secuencias específicas que
codifican la fibra, E2A, E3, E4 o la hexona pueden ser manipuladas.
Además, las secuencias promotoras que dirigen por ejemplo las
proteínas E4 o E2 pueden ser mutadas o suprimidas e intercambiadas
por promotores heterólogos.
Los adenovirus infectan las células humanas con
diferentes eficacias. La infección se completa mediante un
procedimiento de dos etapas que implica tanto las proteínas de la
fibra que median la unión del virus a los receptores específicos de
las células, como las proteínas pentónicas que median la
internalización mediante la interacción por ejemplo de la secuencia
RGD con las integrinas presentes en la superficie celular. Para los
virus del subgrupo B, del cual Ad35 es miembro, no se conoce el
receptor celular para la proteína de la fibra. Existen diferencias
sorprendentes en la eficacia de infección de las células humanas de
los virus del subgrupo B en comparación con los virus del subgrupo
C como Ad5 (véase WO 00/03029 y EP 99200624.7). Incluso dentro de
un subgrupo las eficacias de infección de ciertas células humanas
pueden diferir entre los diversos serotipos. Por ejemplo, la fibra
de Ad16, cuando está presente en un virus recombinante basado en Ad5
infecta principalmente las células endoteliales, las células de la
musculatura lisa y los sinoviocitos de origen humano y de mono
rhesus mejor que los virus quiméricos de Ad5 que portan la fibra de
Ad35 o Ad51. De este modo, para obtener elevadas eficacias de
infección de virus basados en Ad35, puede ser necesario cambiar la
proteína de la fibra por una proteína de la fibra de un serotipo
diferente. La tecnología para semejantes quimeras de fibras se
describe para los virus basados en Ad5 en el Ejemplo 3, y se
ejemplifica más abajo para los virus Ad35.
Primero, la mayor parte de las secuencias de la
fibra son suprimidas del esqueleto de Ad35 en el constructo
pBr/Ad35.PRn como sigue: Las secuencias limítrofes izquierdas y
parte de la proteína de la fibra de Ad35 que oscilan entre el pb
30225 aguas arriba del único sitio MluI hasta el pb 30872 (números
según la secuencia de Ad35 wt descrita en la Figura 6) en la cola
de la fibra son amplificadas utilizando los cebadores
DF35-1: 5'-CAC TCA CCA CCT CCA ATT
CC-3' y DF35-2:
5'-CGG GAT CCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA
GG-3'
Esta amplificación mediante PCR introduce un
único sitio BsiWI en la cola del gen de la fibra.
Las secuencias limítrofes derechas que oscilan
desde el extremo de la proteína de la fibra en el pb 31798 hasta el
pb 33199 (numeración según la secuencia de Ad35 wt, Figura 6), 3'
con respecto al único sitio NdeI es amplificada utilizando los
cebadores DF35-3: 5'-CGG GAT CCG CTA
GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAA TCA
C-3' y DF35-4:
5'-CCA GTT GCA TTG CTT GGT TGG-3'.
Esta PCR introduce un único sitio NheI en el lugar de las
secuencias de la fibra. La amplificación mediante PCR se realiza con
ADN polimerasa Pwo (Roche) según las instrucciones del fabricante.
Tras la amplificación los productos de la PCR son purificados
utilizando un estuche de purificación y los fragmentos son
digeridos con BamHI y ligados entre sí. Los fragmentos ligados de 2
kb son purificados en gel y clonados en el vector PCR Script Amp
(Stratagene). La amplificación correcta es verificada mediante
secuenciación. El fragmento de PCR es escindido en forma de un
fragmento MluI/NdeI y clonado en pBr/Ad35.PRn digerido con las
mismas enzimas. Esto genera pBr/Ad35.PR\Deltafib, un vector
lanzadera adecuado para introducir secuencias de la fibra de
serotipos alternativos. Esta estrategia es análoga a la estrategia
de modificación de la fibra para los virus basados en Ad5 descrita
en la Solicitud de Patente Internacional WO00/03029. Los cebadores
que se enumeran en la Tabla I de esa solicitud fueron utilizados
para amplificar las secuencias de la fibra de diversos subgrupos de
adenovirus. Para la amplificación de fibras que están clonadas en
pBr/Ad35.PR\Deltafib se pueden utilizar las mismas secuencias
cebadoras (degeneradas), no obstante, el sitio NdeI de los
cebadores directos (oligonucleótidos de la cola A a E) debe ser
cambiado por un sitio BsiWI y el sitio NsiI del oligo inverso
(oligonucleótido de la protuberancia 1 a 8) debe ser cambiado por
un sitio NheI. De este modo se amplifican 16 secuencias utilizando
los siguientes cebadores degenerados: 5'-CCK GTS
TAC CCG TAC GAA GAT GAA AGC-3' y
5'-CCG GCT AGC TCA GTC ATC TTC TCT GAT
ATA-3'. Las secuencias amplificadas son digeridas
después con BsiWI y NheI y clonadas en pBr/Ad35.PR\Deltafib
digerido con las mismas enzimas para generar pBr/Ad35.PRfib16. El
último constructo es digerido después con PacI y SwaI y el inserto
es aislado en gel. El fragmento de Ad35 PacI/SwaI con la fibra
modificada es clonado después en los sitios correspondientes de
pWE/Ad35.pIX-rITR para dar
pWE/Ad35.pIX-rITR.fib16. Este esqueleto cosmídico
puede ser utilizado después con un plásmido adaptador basado en
Ad35 para generar virus recombinantes de Ad35 que presentan la fibra
de Ad16. Se pueden amplificar otras secuencias de la fibra con los
cebadores (degenerados) mencionados antes. Si una de las secuencias
de la fibra resulta tener un sitio BsiWI o NheI interno, el
fragmento de la PCR tiene que ser digerido parcialmente con esa
enzima.
El promotor E4 de adenovirus es activado por la
expresión de las proteínas E1. No se sabe ahora si las proteínas E1
de Ad5 son capaces de mediar la activación del promotor E4 de Ad35.
Por lo tanto, para permitir la producción de virus recombinantes de
Ad35 en células PER.C6, puede ser ventajoso independizar la
expresión de E4 de la de E1. Esto se puede lograr remplazando el
promotor E4 de Ad35 por secuencias promotoras heterólogas como,
pero no limitadas a, el promotor 7xTetO.
Se ha demostrado que los vectores basados en Ad5
con E1 suprimida recombinantes tienen una expresión residual de
genes virales del esqueleto vector en las células diana, a pesar de
la ausencia de expresión de E1. La expresión génica viral aumenta
la toxicidad y puede desencadenar la respuesta inmunitaria del
anfitrión a la célula infectada. Para la mayor parte de las
aplicaciones de los vectores adenovirales en el campo de la terapia
génica y la vacunación se desea reducir o disminuir la expresión de
los genes virales del esqueleto. Un modo de lograr esto es suprimir
todas las secuencias del esqueleto viral, o tantas como sea posible.
Suprimiendo los genes E2A, E2B o E4 y/o las funciones de los genes
tardíos, se deben complementar estas funciones durante la
producción. Esta complementación puede ser por medio de un virus
coadyuvante o por medio de la adición estable de estas funciones,
con o sin una regulación de la transcripción inducible, a la célula
productora.
Los métodos para lograr esto han sido descritos
para Ad5 y son conocidos en la técnica. Un método específico es la
reposición del promotor E4 con secuencias promotoras que no son
activas en las células diana. Las proteínas E4 juegan un papel por
ejemplo en la replicación de los adenovirus por medio de la
activación del promotor E2 y en la expresión del gen tardío por
medio de la regulación del empalme y la exportación nuclear de los
transcritos génicos tardíos. Además, al menos algunas de las
proteínas E4 son tóxicas para las células. Por lo tanto, la
reducción o la eliminación de la expresión de E4 en las células
diana mejorarán adicionalmente los vectores basados en Ad35. Un
modo de lograr esto es remplazar el promotor E4 por un promotor
heterólogo que sea inactivo en las células diana. Un ejemplo de
sistema promotor/activador heterólogo que es inactivo en las
células diana es el sistema TetO inducible por tetraciclina (Gossen
y Bujard, 1992). Se pueden utilizar otros sistemas
promotor/activador procarióticos o sintéticos. En este ejemplo, el
promotor E4 del esqueleto del vector viral es remplazado por un
fragmento de ADN que contiene 7 repeticiones del elemento sensible a
la tetraciclina del operón tet (7xTetO). Un potente transactivador
de este promotor es una proteína de fusión que contiene el dominio
de unión al ADN del represor tet y el dominio de activación de VP16
(proteínas transactivadora de Tet, Tta). La expresión fuerte de E4,
independiente de la expresión de E1, puede ser lograda en células
PER.C6 que expresan Tta. Las células PER.C6 que expresan Tta han
sido generadas y descritas (véase el Ejemplo 15). Los virus con E1
suprimida derivados de Ad5 con E4 bajo el control de 7xTetO pueden
ser generados y propagados en estas células. Tras la infección en
células de origen humano o animal (que no expresan el transactivador
Tta), se encontró que la expresión de E4 disminuía enormemente en
comparación con los virus que tienen E1 suprimida con el promotor
E4 normal.
Más abajo se describe la construcción de
pWE/Ad35.pIX-rITR.TetO-E4, un vector
coadyuvante cosmídico para producir virus con la reposición del
promotor E4.
Primero, se generó un fragmento mediante
amplificación PCR en ADN de pBr/Ad35.PRn utilizando los siguientes
cebadores: 355ITR: 5'-GAT CCG GAG CTC ACA ACG TCA
TTT TCC CAC G-3' y 353ITR: 5'- CGG AAT TCG CGG CCG
CAT TTA AAT C-3'. Este fragmento contiene
secuencias entre el pb 34656 (numeración según wtAd35) y el sitio
NotI 3' de la ITR derecha de pBr/Ad35.PRn e introduce un sitio SstI
5' de la secuencia ITR dere-
cha.
cha.
Se generó un segundo fragmento de PCR en ADN de
pBr/Ad35.PRn utilizando los cebadores: 35DE4: 5'-CCC
AAG CTT GCT TGT GTA TAT ATA TTG TGG-3' y 35f7:
Véase el Ejemplo 7.
Esta PCR amplifica las secuencias de Ad35 entre
el pb 33098 y 34500 (numeración según wtAd35) e introduce un sitio
HindIII curso arriba de la caja Tata de E4. Con estas dos reacciones
de PCR se amplificaron las secuencias limítrofes derecha e
izquierda del promotor E4. Para la amplificación, se utilizó ADN
polimerasa Pwo según las instrucciones del fabricante. Se aisló un
tercer fragmento que contenía el promotor 7xTetO del constructo
pAAO-E-TATA-7xTetO
mediante digestión con SstI y HindIII. La generación de
pAAO-E-TATA-7xTetO
se describe más abajo. Después el primer fragmento de la PCR
(355/353) fue digerido con SstI y NotI y ligado al fragmento
7xTetO. La mezcla de ligación fue digerida después con HindIII y
NotI y el fragmento de 0,5 kb aislado en gel. El segundo fragmento
de la PCR (35DE4/35F7) fue digerido con NdeI y HindIII y purificado
en gel. Estos dos fragmentos son ligados después en pBr/Ad35.PRn
digerido con NdeI y NotI para dar pBr/Ad35.PR.TetOE4. La
modificación del promotor E4 es transferida después al clon
cosmídico coadyuvante de Ad35 intercambiando el fragmento PacI/SwaI
del último por uno de pBr/Ad35.PR.TetOE4 para dar
pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4.
pAAO-E-TATA.7xTetO fue generado
como sigue. Se sintetizaron dos oligonucleótidos: TATAplus:
5'-AGC TTT CTT ATA AAT TTT CAG TGT TAG ACT AGT AAA
TTG CTT AAG-3' y TATAmin: 5'-AGC TCT
TAA GCA ATT TAC TAG TCT AAC ACT GAA AAT TTA TAA
GAA-3'
(Las secuencias subrayadas forman una caja TATA
modificada).
Los oligonucleótidos fueron recocidos para
producir un fragmento de ADN de doble hebra con salientes 5' que
son compatibles con ADN digerido con HindIII. El producto de la
reacción de recocido fue ligado en el Vector
pGL3-Intensificador (Promega) digerido con HindIII
para producir pAAO-E-TATA. El clon
que tenía el sitio HindIII en el extremo 5' del inserto restaurado
fue seleccionado para su clonación adicional.
A continuación, la secuencia del operador tet
heptamerizada fue amplificada a partir del plásmido
pUHC-13-3 (Gossen y Bujard, 1992)
en una reacción de PCR utilizando el sistema de PCR Expand (Roche)
según el protocolo del fabricante. Se utilizaron los siguientes
cebadores: Tet3: 5'-CCG GAG CTC CAT GGC CTA ACT CGA
GTT TAC CAC TCC C-3' y Tet5: 5'-CCC
AAG CTT AGC TCG ACT TTC ACT TTT CTC-3'
El fragmento amplificado fue digerido con SstI y
HindIII (estos sitios están presentes en tet3 y tet5
respectivamente) y clonado en
pAAO-E-TATA digerido con
SstI/HindIII dando lugar a
pAAO-E-TATA-7xtetO.
Para someter a ensayo la funcionalidad del clon
cosmídico pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 generado, el ADN
fue digerido con NotI. El extremo izquierdo del ADN de wtAd35 fue
amplificado después utilizando los cebadores 35F1 y 35R4 (véase el
Ejemplo 7). Tras la amplificación, la mezcla de PCR fue purificada y
digerida con SalI para separar el ADN viral intacto. Después 4 gr
tanto de pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4 digerido como del
fragmento de PCR fueron cotransfectados en células
PER.C6-tTA que habían sido sembradas en matraces T25
el día anterior. Las células transfectadas fueron transferidas a
matraces T80 al cabo de dos días y dos días más tarde se obtuvo ECP,
mostrando que el esqueleto cosmídico es funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
El constructo pIG.E1A.E1B contiene las
secuencias de la región E1 de Ad35 correspondientes a los
nucleótidos 459 a 3510 de la secuencia de Ad5 wt (número de acceso
Genbank M72360) conectado operativamente al promotor de la
fosfoglicerato quinasa humana (PGK) y a las secuencias poliA del
Virus de la Hepatitis B. La generación de este constructo se
describe en WO97/00326. Las secuencias E1 de Ad5 fueron remplazadas
por las correspondientes secuencias de Ad35 como sigue.
PRSV.Ad35-E1 (descrito en el ejemplo 8) fue digerido
con EcoRI y Sse8387I y el fragmento de 3 kb correspondiente a las
secuencias E1 de Ad35 fue aislado en gel. El constructo pIG.E1A.E1B
fue digerido con Sse8387I completamente y parcialmente con EcoRI. El
fragmento de 4,2 kb correspondiente a las secuencias vectoras sin
la región E1 de Ad5 pero conservando el promotor PGK fue separado de
otros fragmentos en gel de agarosa LMP y la banda correcta fue
escindida del gel. Ambos fragmentos obtenidos fueron ligados dando
como resultado pIG.Ad35-E1.
Este vector fue modificado adicionalmente en el
esqueleto del vector pUC119. A este fin, el vector fue digerido con
BsaAI y BstXI y el fragmento grande fue aislado del gel. Se preparó
un oligo de doble hebra recociendo los dos oligos siguientes: BB1:
5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3' y BB2:
5'-GTG GCC TAG GCA C-3'.
La ligación del oligo y el fragmento del vector
dio como resultado el constructo pIG135. La inserción correcta del
oligo restaura los sitios BsaAI y BstXI e introduce un sitio AvrII
único. A continuación, los autores de la presente invención
introdujeron un sitio único en el extremo 3' de la casete de
expresión Ad35-E1 en pIG135. A este fin, el
constructo fue digerido con SapI y los extremos 3' sobresalientes se
volvieron romos mediante tratamiento con ADN polimerasa de T4. El
plásmido lineal tratado de este modo fue digerido adicionalmente
con BsrGI y el vector grande que contenía el fragmento fue aislado
en gel. Para restaurar el extremo 3' de la secuencia poliA de HBV y
para introducir un sitio único, se generó un fragmento de PCR
utilizando los siguientes cebadores: 270F: 5'-CAC
CTC TGC CTA ATC ATC TC -3' y 270r: 5'-GCT CTA GAA
ATT CCA CTG CCT TCC ACC -3'. La PCR se realizó en el ADN de
pIG.Ad35.E1 utilizando la polimerasa Pwo (Roche) según las
instrucciones del fabricante. El producto de la PCR obtenido fue
digerido con BsrGI y desfosforilado utilizando la enzima Tsap (LTI),
la última para prevenir la dimerización del inserto en el sitio
BsrGI. El fragmento de la PCR y el fragmento vector fueron ligados
para producir el constructo pIG270.
Se sacrificaron ratas WAG/RIJ recién nacidas con
1 semana de gestación y se aislaron los riñones. Tras la cuidadosa
eliminación de la cápsula, los riñones fueron disgregados en un sola
suspensión celular mediante múltiples rondas de incubación en
tripsina/EDTA (LTI) a 37ºC y recolección de las células flotantes en
PBS frío conteniendo FBS al 1%. Cuando la mayor parte del riñón se
hubo tratado con tripsina todas las células fueron resuspendidas en
DMEM con un suplemento de FBS al 10% y filtradas a través de cuajo
de queso estéril. Las células de Riñón de Cría de Rata (BRK)
obtenidas de un riñón fueron cultivadas en 5 placas (Greiner, 6
cm). Cuando se alcanzaba una confluencia del 70-80%,
las células fueron transfectadas con 1 o 5 \mugr de ADN/placa
utilizando el estuche de precipitación con CaPO_{4} (LTI) según
las instrucciones del fabricante. Los siguientes constructos fueron
utilizados en transfecciones separadas: pIG.E1A.E1B (que expresaba
la región Ad5-E1), pRSV.Ad35-E1,
pIG.Ad35-E1 y pIG270 (expresando el último la E1 de
Ad35). Las células fueron incubadas a 37ºC, CO_{2} al 5% hasta
que aparecieron focos de células transformadas. La Tabla IV muestra
el número de focos que resultan de diversos experimentos de
transfección utilizando ADN circular o lineal. Como se esperaba, la
región E1 de Ad5 transformaba eficazmente las células BRK. También
aparecían focos en la capa de células transfectadas con E1 de Ad35
aunque con menor eficacia. Los focos transformados con Ad35
aparecían en un momento puntual más tardío: \sim2 semanas después
de la transfección en comparación con los 7-10 días
para E1 de Ad5. Estos experimentos muestran claramente que los
genes E1 del virus del grupo B Ad35 son capaces de transformar
células primarias de roedor.
Esto demuestra la funcionalidad de los
constructos de expresión de E1 de Ad35 y confirma descubrimientos
anteriores de la capacidad de transformación de los virus del grupo
B Ad3 y Ad7 (Dijkema, 1979). Para someter a ensayo si las células
de los focos estaban realmente transformadas se escogieron unos
pocos focos y se ampliaron. De los 7 focos elegidos, resultó que al
menos 5 crecían en forma de líneas celulares establecidas.
Se centrifugó fluido amniótico obtenido tras la
amniocentesis y las células fueron resuspendidas en medio AmnioMax
(LTI) y cultivadas en matraces para el cultivo de tejidos a 37ºC y
CO_{2} al 10%. Cuando las células estaban creciendo bien
(aproximadamente una división celular/24 horas), el medio fue
remplazado por una mezcla 1:1 de medio completo AmnioMax y medio
MDEM con bajo contenido de glucosa (LTI) con un suplemento de
Glutamax I (concentración final 4 mM, LTI) y glucosa (concentración
final 4,5 gr/litro, LTI) y FBS al 10% (LTI). Para la transfección,
se cultivaron en placa \sim5x10^{5} células en placas para el
cultivo de tejidos de 10 cm. El día después, las células fueron
transfectadas con 20 \mugr de pIG270 circular/placa utilizando el
estuche de transfección CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones
del fabricante y las células fueron incubadas durante la noche con
el producto precipitado de ADN. Al día siguiente, las células fueron
lavadas 4 veces con PBS para separar el producto precipitado e
incubadas adicionalmente durante más de tres semanas hasta que
aparecieron focos de células transformadas.
Una vez a la semana el medio fue remplazado por
medio de nueva aportación. Se utilizaron otros agentes de
transfección similares, pero no limitados a, Lipofectamine (LTI) o
PEI (Polietilenimina, elevado peso molecular, sin agua, Aldrich).
De estos tres agentes PEI alcanzaba la mejor eficacia de
transfección en amniocitos humanos primarios: \sim1% células
azules 48 horas después de la transfección de pAdApt35.LacZ.
Los focos son aislados como sigue. Se separa el
medio y se remplaza por PBS después de lo cual los focos son
aislados raspando suavemente las células utilizando una pipeta
Gilson de 50-200 \mul con una punta de filtro
desechable. Las células contenidas en \sim10 \mul de PBS se
llevaron a una placa de 96 pocillos conteniendo 15 \mul de
tripsina/EDTA (LTI) y se obtuvo una única suspensión celular
pipeteando arriba y abajo y con una corta incubación a la
temperatura ambiente. Tras la adición de 200 \mul de la mezcla 1:1
de medio completo Amniomax y DMEM con suplementos y FBS al 10%
descrita antes, las células fueron incubadas adicionalmente. Los
clones que continuaban creciendo fueron ampliados y analizados en
cuanto a su capacidad para complementar el crecimiento de los
vectores adenovirales con E1 suprimida de diferentes subgrupos,
específicamente los derivados de virus del grupo B específicamente
de Ad35 y Ad11.
Se aislaron células de retina humana y se
cultivaron en medio DMEM con un suplemento de FBS al 10% (LTI). El
día antes de la transfección, se cultivan en placa \sim5x10^{5}
células en placas de 6 cm y se cultivan durante la noche a 37ºC y
CO_{2} al 10%. La transfección se realiza utilizando el estuche de
precipitación con CaPO_{4} (LTI) según las instrucciones del
fabricante. Cada placa es transfectada con 8-10
\mug de ADN de pIG270, ya sea en forma de un plásmido circular o
en forma de un fragmento purificado. Para obtener el fragmento
purificado pIG270 fue digerido con AvrII y XbaI y el fragmento de 4
kb correspondiente a la casete de expresión de E1 de Ad35 fue
aislado en gel mediante tratamiento con agarasa (Roche). Al día
siguiente, el producto precipitado es lavado cuidadosamente por
medio de cuatro lavados con PBS estéril. Después se añade medio de
nueva aportación y las células transfectadas son cultivadas
adicionalmente hasta que aparecen focos de células transformadas.
Cuando son bastante grandes (>100 células) los focos son
seleccionados y llevados a 96 pocillos como se ha descrito antes.
Los clones de células HER transformadas que continúan creciendo,
son ampliados y sometidos a ensayo en cuanto a su capacidad para
complementar el crecimiento de vectores adenovirales con E1
suprimida de diferentes subgrupos específicamente los derivados de
los virus del grupo B específicamente de Ad35 y Ad11.
Como se describe en el ejemplo 8, es posible
generar y hacer crecer virus con E1 suprimida de Ad35 sobre células
PER.C6 con la cotransfección de un constructo de expresión de E1 de
Ad35, p. ej. pRSV.Ad35.E1. Sin embargo, la producción a gran escala
de adenovirus recombinantes utilizando este método es engorrosa
debido a que para cada etapa de amplificación se necesita una etapa
de transfección del constructo E1 de Ad35. Además, este método
aumenta el riesgo de recombinación no homóloga entre el genoma del
plásmido y del virus con elevadas posibilidades de generación de
virus recombinantes que incorporan secuencias de E1 dando como
resultado virus de replicación competente. Para evitar esto, la
expresión de proteínas E1 de Ad35 en PER.C6 tiene que estar mediada
por copias integradas del plásmido de expresión en el genoma. Puesto
que las células PER.C6 ya están transformadas y expresan las
proteínas E1 de Ad35, la adición de expresión de E1 de Ad35 extra
puede ser tóxica para las células, no obstante, no es imposible
transfectar establemente células transformadas con proteínas E1
puesto que han sido generadas células A549 que expresan E1 de
Ad5.
En un intento de generar adenovirus
recombinantes derivados del virus del subgrupo B Ad7, Abrahamsen
et al. (1997) no fueron capaces de generar virus con E1
suprimida sobre células 293 sin contaminación de Ad7 wt. Se
demostró que los virus que fueron escogidos tras la purificación en
placa sobre células 293 ORF6 (Brough et al., 1996) tenían
incorporadas secuencias E1B de Ad7 mediante recombinación no
homóloga. De este modo, se demostró que era posible la propagación
eficaz de virus recombinantes de Ad7 solamente en presencia de
expresión de E1B de Ad7 y de la expresión de ORF6 de E4 de Ad5. Se
sabe que las proteínas E1B interaccionan con las proteínas
celulares así como virales (Bridge et al., 1993; White,
1995). Posiblemente, el complejo formado entre la proteína E1B de
55 K y ORF6 de E4 que es necesario para incrementar la exportación
de ARNm de proteínas virales y para inhibir la exportación de la
mayor parte de los ARNm celulares, es crítica y en cierto modo
específica del serotipo. Los experimentos anteriores sugieren que
las proteínas E1A de Ad5 son capaces de complementar una deleción
de E1A de Ad7 y de que la expresión de E1B de Ad7 en células de
empaquetamiento de adenovirus como tal no sea suficiente para
generar una línea celular complementadora estable. Para someter a
ensayo si una o ambas proteínas E1B de Ad35 es o son el factor
limitante en la eficaz propagación del vector de Ad35 sobre las
células PER.C6, los autores de la presente invención han generado un
plásmido adaptador de Ad35 que contiene el promotor de E1B y las
secuencias de E1B pero carece del promotor y la región codificadora
para E1A. A este fin, el extremo izquierdo del ADN de Ad35 wt fue
amplificado utilizando los cebadores 35F1 y 35R4 (ambos descritos
en el Ejemplo 7) con ADN polimerasa Pwo (Roche) según las
instrucciones del fabricante. El producto de la PCR de 4,6 kb fue
purificado utilizando el estuche de purificación de PCR (LTI) y
digerido con las enzimas SnaBI y ApaI. El fragmento de 4,2 kb
resultante fue purificado después en gel utilizando el estuche
QIAExII (Qiagen). A continuación, pAdApt35Ip1 (Ejemplo 7) fue
digerido con SnaBI y ApaI y el fragmento que contenía el vector de
2,6 kb fue aislado en gel utilizando el estuche GeneClean (BIO 101,
Inc.). Ambos fragmentos aislados fueron ligados para dar
pBr/Ad35.leftITR-pIX. La amplificación correcta
durante la PCR fue verificada mediante un ensayo de funcionalidad
como sigue: El ADN fue digerido con BstBI para liberar el inserto
de Ad35 de las secuencias vectoras y 4 \mug de este ADN fueron
cotransfectados con 4 \mug de pWE/Ad35.pIX-rITR
digerido con NotI (Ejemplo 7) en células PER.C6.
Las células transfectadas se pasaron a matraces
T80 el día 2 y de nuevo dos días después se había formado ECP
mostrando que el nuevo constructo
pBr/Ad35.leftITR-pIX contiene secuencias E1
funcionales. El constructo pBr/Ad35.leftITR-pIX fue
modificado después como sigue. El ADN fue digerido con SnaBI y
HindIII y el saliente HindIII 5' fue rellenado utilizando la enzima
de Klenow. La religación del ADN digerido y la transformación en
células competentes (LTI) produjeron el constructo
pBr/Ad35leftITR-pIX\DeltaE1A. Este último
constructo contiene el extremo izquierdo de 4,6 kb de Ad35 excepto
para las secuencias de E1A entre el pb 450 y 1341 (numeración según
wtAd35, Figura 6) y por tanto carece del promotor E1A y de la
mayoría de las secuencias codificadoras de E1A. Después
pBr/Ad35.leftITR-pIX\DeltaE1A fue digerido con
BstBI y 2 \mugr de este constructo fueron cotransfectados con 6
\mugr de pWE/Ad35.pIX-rITR (Ejemplo 7) digerido
con NotI en células PER.C6. Una semana después de la transfección
se había formado una un ECP completo en los matraces
transfectados.
Este experimento muestra que las proteínas E1A
de Ad35 son complementadas funcionalmente por la expresión de e1A
de Ad5 en células PER.C6 y que al menos una de las proteínas E1B de
Ad35 no puede ser complementada por la expresión de E1 de Ad5 en
PER.C6. Adicionalmente muestra que es posible elaborar una línea
celular complementadora para los virus con E1 suprimida de Ad35
expresando las proteínas E1B de Ad35 en PER.C6. La expresión
estable de las secuencias E1B de Ad35 a partir de copias integradas
en el genoma de las células PER.C6 puede ser dirigida por el
promotor E1B y terminada mediante una señal de
poli-adenilación heteróloga como, pero no limitada
a, HBVpA. La señal pA heteróloga es necesaria para evitar el
solapamiento entre el inserto E1B y el vector recombinante, puesto
que la terminación de E1B natural está localizada en la unidad de
transcripción pIX que tiene que estar presente en el vector
adenoviral. Alternativamente, las secuencias de E1B pueden ser
dirigidas por un promotor heterólogo como, pero no limitado a, el
promotor PGK humano o por un promotor inducible como, pero no
limitado a, el promotor 7xtetO (Gossen y Bujard, 1992). También en
estos casos la terminación de la transcripción está mediada por una
secuencia pA heteróloga, p. ej. la pA de HBV. Las secuencias E1B de
Ad35 comprenden al menos una de las regiones codificadoras de las
proteínas E1B de 21K y E1B de 55K localizadas entre los nucleótidos
1611 y 3400 de la secuencia de Ad35 wt. El inserto también puede
incluir (parte de) las secuencias E1B de Ad35 entre los nucleótidos
1550 y 1611 de la secuencia de Ad35 wt.
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí se describe la generación de líneas
celulares para la producción de vectores adenovirales recombinantes
que tienen la región temprana 1 (E1) y la región temprana 2A (E2A)
suprimidas.
Las líneas celulares productoras complementan la
deleción de E1 y E2A de los vectores adenovirales recombinantes en
trans mediante expresión constitutiva de ambos genes E1 y
E2A. La línea celular de retinoblastos embriónicos humanos
transformados con E1 de Ad35 pre-establecida PER.C6
(WO 97/00326) fue equipada adicionalmente con casetes de expresión
de E2A.
El gen E2A adenoviral codifica una Proteína de
Unión al ADN de 72 kDa que tiene una elevada afinidad por el ADN de
hebra sencilla.
Debido a esta función, la expresión constitutiva
de DBP es tóxica para las células. El mutante ts125E2A codifica una
DBP que tiene una sustitución Pro\rightarrowSer del aminoácido
413. Debido a esta mutación, la DBP codificada por ts125E2A es
completamente activa a la temperatura permisiva de 32ºC, pero no se
une ADNhs a la temperatura no permisiva de 39ºC. Esto permite la
generación de líneas celulares que expresan constitutivamente E2A,
que no es funcional y no es tóxica a la temperatura no permisiva de
39ºC. E2A sensible a la temperatura se vuelve funcional
gradualmente una vez que la temperatura disminuye y se vuelve
completamente funcional a una temperatura de 32ºC, la temperatura
permisiva.
PcDNA3wtE2A: Se amplificó la región
codificadora de la región temprana de tipo salvaje completa 2A (E2A)
a partir del plásmido pBR/Ad.Bam-rITR (consigna
ECACC P97082122) con los cebadores DBPpcr1 y DBPpcr2 utilizando el
sistema Expand®Long Template PCR según el protocolo normalizado del
proveedor (Boehringer Mannheim). La PCR fue realizada en un
Biometra Trio Thermoblock, utilizando el siguiente programa de
amplificación: 94ºC durante 2 minutos, 1 ciclo; 94ºC durante 10
segundos +51ºC durante 30 segundos + 68ºC durante 2 minutos, 1
ciclo; 94ºC durante 10 segundos + 58ºC durante 30 segundos + 68ºC
durante 2 minutos, 10 ciclos; 94ºC durante 10 segundos + 58ºC
durante 30 segundos + 68ºC durante 2 minutos con 10 segundos de
ampliación por ciclo, 20 ciclos; 68ºC durante 5 minutos, 1 ciclo.
El cebador DBPpcr1: CGG GAT CC G CCA CC A TGG CCA GTC
GGG AAG AGG AG (5' a 3') contiene un único sitio de restricción
BamHI (subrayado) 5' con respecto a la secuencia de Kozak (cursiva)
y el codón de iniciación de la secuencia codificadora de E2A. El
cebador DBPpcr2: CGG AAT TC T TAA AAA TCA AAG GGG TTC TGC
CGC (5' a 3') contiene un único sitio de restricción EcoRI
(subrayado) 3' del codón de terminación de la secuencia
codificadora de E2A. Los caracteres en negrita hacen referencia a
secuencias derivadas de la región codificadora de E2A. El fragmento
de la PCR fue digerido con BamHI/EcoRI y clonado en
pcDNA3 digerido con BamHI/EcoRI (Invitrogen), dando
lugar a pcDNA3wtE2A.
PcDN3tsE2A: La región codificadora
completa ts125E2A fue amplificada a partir de ADN aislado del
mutante de adenovirus sensible a la temperatura H5ts125. El
procedimiento de amplificación por PCR era idéntico al de la
amplificación de wtE2A. El fragmento de PCR fue digerido con
BamHI/EcoRI y clonado en pcDNA3 digerido con BamHI/EcoRI
(Invitrogen), dando lugar a pcDNA3tsE2A. La integridad de la
secuencia codificadora de wtE2A y tsE2A fue confirmada mediante
secuenciación.
Las células PER.C6 fueron cultivadas en DMEM
(Gibco BRL) con un suplemento de FBS al 10% (Gibco BRL) y MgCl_{2}
10 mM en una atmósfera con CO_{2} al 10% a 32ºC, 37ºC o 39ºC. El
día 0, se sembraron un total de 1 x 10^{6} células PER.C6 por
matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} (Nunc) y las
células fueron cultivadas a 32ºC, 37ºC o 39ºC. El día
1-8, se contaron las células. La Figura 30 muestra
que la tasa de crecimiento y la densidad celular final del cultivo
de PER.C6 a 39ºC son comparables con los de 37ºC. La tasa de
crecimiento y la densidad final del cultivo de PER.C6 a 32ºC
estaban ligeramente reducidos en comparación con los de 37ºC o
39ºC. No se observaba una muerte celular significativa a ninguna de
las temperaturas de incubación. Por lo tanto PER.C6 funciona muy
bien tanto a 32ºC como a 39ºC, la temperatura permisiva y no
permisiva para ts125E2A, respectivamente.
Un día antes de la transfección, se sembraron 2
x 10^{6} células PER.C6 por placa de cultivo de tejidos de 6 cm
(Greiner) en DMEM, con un suplemento de FBS al 10% y MgCl_{2} 10
mM y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%. Al
día siguiente, las células fueron transfectadas con 3, 5 o 8 \mug
de ADN plasmídico de pcDNA3, pcDNA3wtE2A o pcDNA3tsE2A por placa,
utilizando LipofectAMINE PLUS® Reagent Kit según el protocolo
normalizado del proveedor (Gibco BRL), excepto que las células
fueron transfectadas a 39ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%.
Después de la transfección, las células fueron mantenidas
constantemente a 39ºC, la temperatura no permisiva para ts125E2A.
Tres días más tarde, las células fueron colocadas en DMEM con un
suplemento de FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y 0,25 mg/ml de G418
(Gibco BRL), y las primeras colonias resistentes a G418 aparecieron
10 días después de la transfección. Como se muestra en la tabla 1,
había una diferencia espectacular entre el número total de colonias
obtenidas tras la transfección de pcDNA3 (\sim200 colonias) o
pcDNA3tsE2A (\sim100 colonias) y pcDNA3wtE2A (sólo 4 colonias).
Estos resultados indican que la toxicidad de E2A expresada
constitutivamente puede ser superada utilizando un mutante sensible
a la temperatura de E2A (ts125E2A) y cultivando las células a una
temperatura no permisiva de 39ºC.
De cada transfección, se escogieron numerosas
colonias raspando las células de la placa con una pipeta. Las
células desprendidas fueron colocadas con posterioridad en placas
para el cultivo de tejidos de 24 pocillos (Greiner) y cultivadas
adicionalmente a 39ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10% en DMEM,
con un suplemento de FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y 0,25 mg/ml de
G418. Como se muestra en la tabla 1, el 100% de las colonias
transfectadas con pcDNA3 (4/4) y el 82% de las colonias
transfectadas con pcDNA3tsE2A (37/45) fueron establecidas en líneas
celulares estables (las 8 colonias transfectadas con pcDNA3tsE2A
restantes crecían lentamente y fueron descartadas). En contraste,
sólo una colonia transfectada con pcDNA3wtE2A pudo ser establecida.
Las otras 3 murieron directamente después de seleccionarlas.
A continuación, se determinaron los niveles de
expresión de E2A en las diferentes líneas celulares mediante
transferencia Western. Las líneas celulares fueron sembradas en
placas para el cultivo de tejidos de 6 pocillos y los cultivos
subconfluentes fueron lavados dos veces con PBS (NPBI) y lisados y
raspados en RIPA (NP-40 1%, desoxicolato de sodio
al 0,5% y SDS en PBS al 0,1%, con un suplemento de fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM y 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina). Al
cabo de 15 minutos de incubación en hielo, los productos lisados
fueron aclarados mediante centrifugación. Las concentraciones de
proteína fueron determinadas mediante el análisis de proteínas de
Bio-Rad, según los procedimientos normalizados del
proveedor (BioRad). Se fraccionaron cantidades iguales del extracto
de células completas mediante SDS-PAGE en gel al
10%. Las proteínas fueron transferidas a membranas
Immobilon-P (Millipore) e incubadas con anticuerpo
monoclonal \alphaDBP B6. El anticuerpo secundario era anticuerpo
anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de
rábano picante (BioRad). Se realizaron el procedimiento de
transferencia Western y las incubaciones según el protocolo
proporcionado por Millipore. Los complejos fueron visualizados con
el sistema de detección ECL según el protocolo del fabricante
(Amersham). La Figura 31 muestra que todas las líneas celulares
derivadas de la transfección con pcDNA3tsE2A expresaban la proteína
E2A de 72 kDa (panel izquierdo, calles 4-14; panel
medio, calles 1-13; panel derecho, calles
1-12). En contraste, la única línea celular derivada
de la transfección con pcDNAwtE2A no expresaba la proteína E2A
(panel izquierdo, calle 2). No se detectaba proteína E2A en el
extracto de una línea celular de la transfección con pcDNA3 (panel
izquierdo, calle 1), que servía como control negativo. El extracto
de células PER.C6 transfectadas transitoriamente con pcDNA3ts125
(panel izquierdo, calle 3) servía como control positivo para el
procedimiento de transferencia Western. Estos datos confirmaron que
la expresión constitutiva de wt E2A es tóxica para las células y
que utilizando el mutante ts125 de E2A se podría evitar esta
toxicidad.
El adenovirus Ad5.d1802 es un vector derivado de
Ad5 que tiene suprimida la mayor parte de la región codificadora de
E2A y no produce DBP funcional. Se utilizó Ad5.d1802 para someter a
ensayo la actividad complementadora en trans de E2A de las células
PER.C6 que expresan constitutivamente ts125E2A. Las células PER.C6
parentales o el clon PER.C6tsE2A 3-9 fueron
cultivadas en DMEM, con un suplemento de FBS al 10% y MgCl_{2} 10
mM a 39ºC y CO_{2} al 10% en matraces de 25 cm^{2} y o bien
infectadas simuladamente o bien infectadas con Ad5.d1802 a un
m.o.i. de 5. Con posterioridad las células infectadas fueron
cultivadas a 32ºC y las células fueron rastreadas en cuanto a la
aparición del efecto citopático (ECP) determinado mediante los
cambios en la morfología celular y la separación de las células del
matraz. El ECP total aparecía en el clon PER.C6tsE2A
3-9 infectado con Ad5.d1802 en 2 días. No aparecía
ECP en las células PER.C6 infectadas con Ad5.d1802 o las células
simuladamente infectadas. Estos datos mostraban que las células
PER.C6 expresaban constitutivamente ts125E2A complementado en trans
para la deleción E2A en el vector Ad5.d1802 a la temperatura
permisiva de 32ºC.
La producción a gran escala de vectores
adenovirales recombinantes para la terapia génica humana requiere
un método de cultivo fácil y graduable para la línea celular
productora, preferiblemente un cultivo en suspensión en un medio
desprovisto de cualquier constituyente humano o animal. Con este
propósito, la línea celular PER.C6tsE2A c5-9
(denominada c5-9) fue cultivada a 39ºC y CO_{2} al
10% en un matraz para el cultivo de tejidos de 175 cm^{2} (Nunc)
en DMEM, con un suplemento de FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM. A la
sub-confluencia (confluencia del
70-80%), las células fueron lavadas con PBS (NPBI) y
el medio fue remplazado por 25 ml de medio en suspensión libre de
suero Ex-cell® 525 (JRH) con un suplemento de 1 x
L-Glutamina (Gibco BRL), denominado más adelante
SFM. Dos días más tarde, las células fueron desprendidas del matraz
dando golpecitos y las células fueron centrifugadas a 1.000 rpm
durante 5 minutos. El sedimento celular fue resuspendido en 5 ml de
SFM y se transfirieron 0,5 ml de suspensión celular a un matraz
para el cultivo de tejidos de 80 cm^{2} (Nunc), junto con 12 ml
de SFM de nueva aportación. Al cabo de 2 días, las células fueron
cosechadas (todas las células están en suspensión) y sometidas a
recuento en un contador celular Burker. A continuación, las células
fueron sembradas en un erlenmeyer para el cultivo de tejidos de 125
ml (Corning) a una densidad de siembra de 3 x 10^{5} células por
ml en un volumen total de 20 ml de SFM. Las células fueron
cultivadas adicionalmente el día a 125 rpm en un aparato
oscilatorio orbital (GFL) a 39ºC en atmósfera de CO_{2} al 10%.
Las células fueron sometidas a recuento el día 1-6
en un contador celular Burker. En la Figura 4, se muestra la curva
de crecimiento medio de los 8 cultivos. PER.C6tsE2A
c5-9 se comportaba bien en un cultivo en suspensión
sin suero. La máxima densidad celular de aproximadamente 2 x
10^{6} células por ml se alcanza a los 5 días de cultivo.
Se cultivaron células PER.C6 o PER.C6ts125E2A
(c8-4) en DMEM (Gibco BRL) con un suplemento de FBS
(Gibco BRL) al 10% y MgCl_{2} 10 mM en una atmósfera de CO_{2}
al 10% a 37ºC (PER.C6) o a 39ºC (PER.C6ts125E2A
c8-4). El día 0, se sembraron un total de 1 x
10^{6} células por matraz para el cultivo de tejidos de 25
cm^{2} (Nunc) y las células fueron cultivadas a las respectivas
temperaturas. En los momentos puntuales indicados, se contaron las
células. El crecimiento de las células PER.C6 a 37ºC era comparable
con el crecimiento de PER.C6ts125E2A c8-4 a 39ºC
(Figura 33).
Esto muestra que la expresión constitutiva de
DBP codificada por ts125E2A no tenía un efecto adverso sobre el
crecimiento de las células a la temperatura no permisiva de
39ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante varios pases, se cultivó la línea
celular PER.C6ts125E2A clon 8-4 a 39ºC y CO_{2} al
10% en un matraz para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} (Nunc)
en MDEM, con un suplemento de FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM en
ausencia de presión de selección (G418). A la subconfluencia
(confluencia del 70-80%), las células fueron
lavadas con PBS (NPBI) y lisadas y raspadas en RIPA
(NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5% y SDS en
PBS al 0,1%, con un suplemento de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1
mM y 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina). Al cabo de 15 minutos de
incubación en hielo, los productos lisados fueron aclarados mediante
centrifugación. Las concentraciones de proteína fueron determinadas
mediante el análisis de proteínas de BioRad, según los
procedimientos normalizados del proveedor (BioRad). Se fraccionaron
cantidades iguales de extracto de células completas mediante
SDS-PAGE en geles al 10%. Las proteínas fueron
transferidas a membranas Immobilon-P (Millipore) e
incubadas con anticuerpo monoclonal \alphaDBP B6. El anticuerpo
secundario era un anticuerpo anti-ratón de cabra
conjugado con peroxidasa de rábano picante (BioRad). El
procedimiento de transferencia Western y las incubaciones se
realizaron según el protocolo proporcionado por Millipore. Los
complejos fueron visualizados con el sistema de detección ECL según
el protocolo del fabricante (Amersham). La expresión de DBP
codificada por ts125E2A era estable durante al menos 16 pases, lo
que equivale a aproximadamente 40 duplicaciones celulares (Figura
34). No se observó descenso en los niveles de DBP durante este
período de cultivo, indicando que la expresión de ts125E2A era
estable, incluso en ausencia de presión de selección por G418.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
PcDNA3.1-tTA: El gen tTA, una
fusión de los genes tetR y VP16, fue separado del plásmido pUHD
15-1 (Gossen y Bujard, 1992) mediante digestión
utilizando las enzimas de restricción BamHI y EcoRI.
Primero, pUHD15-1 fue digerido con EcoRI. El
plásmido linealizado fue tratado con la enzima de Klenow en
presencia de dNTP para rellenar los extremos cohesivos
EcoRI. Después, el plásmido fue digerido con BamHI. El
fragmento resultante, de 1025 pb de longitud, fue purificado en
agarosa. Con posterioridad, el fragmento fue utilizado en una
reacción de ligación con pcDNA3 3.1 HYGRO (-) (Invitrogen) digerido
con BamHI/EcoRV dando lugar a pcDNA3.1tTA. Tras la
transformación en E. Coli DH5\alpha competente (Life
Techn.) y el análisis de las colonias resistentes a la ampicilina,
se seleccionó un clon que mostraba un patrón de digestión como el
esperado para pcDNA3.1-tTA.
\vskip1.000000\baselineskip
Un día antes de la transfección, se sembraron
2x10^{6} células PER.C6 o PER.C6/E2A por placa de cultivo de
tejidos de 60 mm (Greiner) en medio esencial modificado de Dulbecco
(DMEM, Gibco BRL) con un suplemento de FBS al 10% (JRH) y
MgCl_{2} 10 mM y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2}
al 10%. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con
4-8 \mug del ADN plasmídico
pcDNA3.1-tTA utilizando LipofectAMINE PLUS® Reagent
Kit según el protocolo normalizado del proveedor (Gibco BRL). Las
células fueron incubadas con la mezcla LipofectAMINE PLUS®-DNA
durante cuatro horas a 37ºC y CO_{2} al 10%. Después, se añadieron
2 ml de DMEM con un suplemento de FBS al 20% y MgCl_{2} 10 mM y
las células fueron incubadas adicionalmente a 37ºC y CO_{2} al
10%. Al día siguiente, las células fueron lavadas con PBS e
incubadas en DMEM de nueva aportación con un suplemento de FBS al
10%, MgCl_{2} 10 mM a 37ºC (PER.C6) o a 39ºC (Per.C6/E2A) en
atmósfera de CO_{2} al 10% durante tres días. Después, los medios
fueron intercambiados por medios de selección; las células PER.C6
fueron incubadas con DMEM con un suplemento de FBS al 10%,
MgCl_{2} 10 mM y 50 \mug/ml de higromicina B (GIBCO) mientras
las células PER.C6/E2A fueron mantenidas en DMEM con un suplemento
de FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y 100 \mug/ml de
higromicina B.
higromicina B.
Las colonias de células que resistían la
selección aparecían en tres semanas mientras las células no
resistentes morían durante este período.
A partir de cada transfección, se escogió un
número de colonias celulares resistentes a la higromicina,
independientes raspando las células de la placa con una pipeta y se
colocaron en placas de 2,5 cm^{2} (Greiner) para un crecimiento
adicional en DMEM conteniendo FBS al 10%, MgCl_{2} 10 mM y con un
suplemento de 50 \mug/ml (células PER.C6) o 100 \mug/ml
(células PER.C6/E2A) de higromicina en una atmósfera de CO_{2} al
10% y a 37ºC o 39ºC, respectivamente.
A continuación, se determinó si estas colonias
celulares resistentes a la higromicina expresaban la proteína tTA
funcional.
Por lo tanto, los cultivos de las células
PER.C6/tTA o PER/E2A/tTA fueron transfectados con el plásmido pUHC
13-3 que contiene el gen informador de la luciferasa
bajo el control del promotor 7xtetO (Gossens y Bujard, 1992). Para
demostrar que la expresión de la luciferasa estaba mediada por tTA,
la mitad de los cultivos se mantuvo en medio sin doxiciclina. La
otra mitad se mantuvo en medio con 8 \mug/ml de doxiciclina
(Sigma). Este último fármaco es un análogo de tetraciclina y se une
a tTA e inhibe su actividad. Todas las líneas celulares PER.C6/tTA
y PER/E2A/tTA rindieron elevados niveles de luciferasa, indicando
que todas las líneas celulares expresaban la proteína tTA (Figura
35). Además, la expresión de la luciferasa resultaba sumamente
suprimida cuando las células eran tratadas con doxiciclina.
Colectivamente, los datos mostraron que los clones de las células
PER.C6 y PER/E2A resistentes a la higromicina aislados y
establecidos expresaban todos tTA funcional.
Leyenda de la tabla I:
Todos los adenovirus humanos utilizados en los
experimentos de neutralización fueron producidos en células PER.C6
(número de consigna de la ECACC 96022940) (Fallaux y col., 1998) y
purificados en CsCl como se describe en el ejemplo 1. Se muestra la
concentración de NaCl a la cual eluían los diferentes serotipos de
la columna de HPLC. Las partículas de virus/ml (VP/ml) fueron
calculadas a partir de un patrón de Ad5. El título del experimento
(DICC50) fue determinado en células PER.C6 (número de consigna ECACC
96022940) como se describe en el ejemplo 1 mediante titulaciones
realizadas paralelamente al experimento de neutralización. La DICC50
se muestra para los 44 virus utilizados en este estudio y refleja
la dilución del virus necesaria para obtener un ECP en el 50% de
los pocillos al cabo de 5 días. La razón de VP/DICC50 se representa
como log_{10} y es una medida de la infectividad de los
diferentes lotes sobre las células PER.C6 (número de consigna en la
ECACC 96022940).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\hskip0.5cm# Medio de focos/placa:
Abrahamsen K, et al. (1997)
Construction of an adenovirus type 7a E1A- vector. J Virol
71:8946-8951.
Athappilly FK, et al.
(1994). The refined crystal structure of hexon, the major
coat protein of adenovirus type 2, at 2.9 \ring{A} resolution.
J. Mol. Biol. 242, 430-455.
Basler CF, et al. (1996).
Sequence of the immunoregulatory early region 3 and flanking
sequences of adenovirus type 35. Gene
170:249-54
Bridge E, et al. (1993)
Adenovirus early region 4 and viral DNA synthesis. Virology
193, 794-801.
Brody SL and Crystal RG.
(1994) Adenovirus mediated in vivo gene transfer.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 716:90-101.
Boshart M, et al. (1985). A
very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene
of human cytomegalovirus. Cell 41,
521-530,
Dijkema R, et al. (1979).
Transformation of primary rat kidney cells by DNA fragments of
weakly oncogenic adenoviruses. J. Virol. 32, No 3,
943-950.
Fallaux FJ, et al. (1998).
New helper cells and matched early region 1-deleted
adenovirus vectors prevent generation of replication competent
adenoviruses. Hum. Gene Ther. 9,
1909-1917.
Gossen M, and H Bujard
(1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by
tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89; 5547-5551.
Flomenberg PR, et al.
(1987). Molecular epidemiology of adenovirus type 35
infections in immunocompromised hosts. J. Infect Dis.
155(6): 1127-34.
Francki RIB, et al. (1991).
Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the
international Committee on taxonomy of viruses. Arch. Virol.
Suppl. 2: 140-144.
Gahery-Segard H, et
al. (1998). Immune response to recombinant capsid
proteins of adenovirus in humans: Antifiber and
anti-penton base antibodies have a synergistic
effect on neutralizing activity. J. Virol. 72,
2388-2397.
He T-C, et al.
(1998). A simplified system for generating adenovirus
recombinantees. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,
2509-2514.
Hierholzer JC, et al.
(1988) Adenoviruses from patients with AIDS: a plethora of
serotypes and a description of five new serotypes of subgenus D
(types 43-47). J. Infect. Dis. 158,
804-813.
De Jong et al. (1983).
Adenovirus isolates from urine of patients with acquired
immunodeficiency syndrome. Lancet 1(8337):
1293-1296.
Kay R, et al. (1990).
Expression cloning of a cDNA encoding M1/69. J. Immunol. 145,
1952-1959.
Kang WG, et al. (1989a).
Molecular cloning and physical mapping of the DNA of human
adenovirus type 35. Acta Microbiol Hung 36(1):
67-75.
Kang WG, et al. (1989b).
Relationship of E1 and E3 regions of human Ad35 to those of human
adenovirus subgroups A, C and D. Acta Microbiol Hung
36(4): 445-57.
Levrero M, et al. (1991).
Defective and nondefective adenovirus vectors for expressing foreign
genes in vitro and in vivo. Gene 101,
195-202.
Li QG, et al. (1991).
Genetic relationship between thirteen genomes of types of adenovirus
11, 34, and 35 with different tropisms. Intervirol. 32,
338-350.
Prince HM. (1998). Gene transfer:
a review of methods and applications. Pathology 30(4),
335-347.
Robbins PD and Ghivizzani SC.
(1998). Viral vectors for gene therapy. Pharmacol
Ther. 80, 35-47.
Schnurr, D and Dondero, M.E.
(1993). Two new candidate adenovirus serotypes.
Intervirol. 36, 79-83.
Schulick AH, et al. (1997).
Established immunity precludes adenovirus-mediated
gene transfer in rat carotid arteries. Potential for
immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of
immunity. J. Clin. Invest. 99(2),
209-19.
Shabram PW, et al. (1997)
Analytical anion-exchange HPLC of recombinant
type-5 adenoviral particles. Hum. Gene Ther.
8(4): 453-465.
Toogood CI et al. (1989)
J. Gen Virol. 70, 3203-3214
Toogood CI, et al. (1989)
The adenovirus type 40 hexon: sequence, predicted structure and
relationship to other adenovirus hexons. J. Gen. Virol. 70,
3203-14.
Valderrama-Leon G, et
al. (1985) Restriction endonuclease mapping of adenovirus
35, a type isolated from immunocompromised hosts. J Virol.
56(2):697-50.
Wadell G. (1984) Molecular
epidemiology of adenoviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol.
110, 191-220.
White E. (1995) Regulation of
p53-dependent apoptosis by Ela and E1b. Curr.
Top. Microbiol. Immunol. 199, 34-58.
<110> Crucell Holland B.V.
\hskip1cmHavenga, Menzo J.E.
\hskip1cmBout, Abraham
\hskip1cmVogels, Ronald
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Serotipo de Adenovirus y usos de los
Mismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 0035 EP 01 DIV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 04077434.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-08-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 99201545.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 00201738.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-05-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: conector que contiene un sitio PacI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgtctta attaaccgct taa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgtctta attaaccgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgcggtt aattaagac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador ITR-EPH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattctt aattaagtta acatcatcaa taatatacc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador Ad101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgattcacat cggtcagtgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta E2A.SnaBI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtacgta gccctgtcga aag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta E2A.DBP-start
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatgcatt cgaagtactt ccttctccta taggc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta E2A.DBP-stop
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaatgcata cggcgcagac gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta E2A.BamHI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggtggatc ccatggacga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador LTR-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(47)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtacgtac cagtgcactg gcctaggcat ggaaaaatac ataactg
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador LTR-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(64)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador HSA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgccaccat gggcagagcg atggtggc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador HSA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(50)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaagtcgac
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: conector
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgtctta attaaccgca att
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido PLL-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(67)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido PLL-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(67)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador CMVplus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcggtacc actgcagtgg tcaatattgg ccattagcc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador CMVminA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcaagctt ccaatgcacc gttcccggc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtggcca gggtacctct aggcttttgc aa
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggggatcc ataaacaagt tcagaatcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta hex1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggtgctg ccaacagc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta hex2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatccac tagtggaaag cgggcgcgcg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta hex3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatccaa ttgagaagca agcaacatca acaac
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador delta hex4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaagggca tggaggctg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador Hex-up2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactagtcaa gatggcyacc cchtcgatga tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador Hex-do2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctggccaat tgttatgtkg tkgcgttrcc ggc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DP5-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgttgctgc tgctaatagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DP5-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcct gtacaactaa ggggaataca ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DP3-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccc ttaaggcaag catgtccatc ctt
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DP3-3R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaacacgtt ttacgcgtcg acctttc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador P3-for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcgatgta caatgaggag acgagccgtg cta
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador P3-rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcgactta agttagaaag tgcggcttga aag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador P17F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcgatgta caatgaggcg tgcggtggtg tcttc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador P17R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcgactta agttagaagg tgcgactgga aagc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador NY-up
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(42)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacatatgt agatgcatta gtttgtgtta tgtttcaacg tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador NY-down
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagaccact gccatgtt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Secuencia parcial de
una ITR de adenovirus"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcatcaat
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Secuencia parcial de
una ITR de adenovirus"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaataatat acct
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Secuencia parcial de
una ITR de adenovirus"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtatatta ttgatgatgg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Secuencia parcial de
una ITR de adenovirus"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcatcaat aatatacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Secuencia parcial de
una ITR de adenovirus"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcatcaat aat
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligo ExSalPacF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(47)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgatggcaa acagctatta tgggtattat gggttcgaat taattaa
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligo ExSalPacR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgattaatt aattcgaacc cataataccc ataatagctg tttgcca
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador PCLIPMSF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(42)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccaattgg tcgaccatca tcaataatat accttatttt gg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador pCLIPBSRGI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaaaattg tcacttcctg tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Ecolinker+
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1). (37)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcggcgc gccgtcgacg atatcgatag cggccgc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Ecolinker-
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgcggcc gctatcgata tcgtcgacgg cgcgccg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: conector HindXba+
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(49)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctctagag gatccgttaa cgctagcgaa ttcaccggta ccaagctta
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: conector HindXba-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(49)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtaagct tggtaccggt gaattcgcta gcgttaacgg atcctctag
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35F1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(44)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattctt aattaatcga catcatcaat aatatacctt atag
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35R2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtggtccta ggctgacacc tacgtaaaaa cag
\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35F3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtggagat ctggtgagta ttgggaaaac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35R4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattctt aattaaggga aatgcaaatc tgtgagg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35F5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattcgc ggccgcggtg agtattggga aaac
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35R6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgccagatcg tctacagaac ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35F7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (23)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatgctggc ttcagttgta atc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35R8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(42)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattcgc ggccgcattt aaatcatcat caataatata cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35F11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtaccga attctcgcta gggtatttat acc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35F10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagacc tgcaggttag tcagtttctt ctccactg
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador HBV-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctctagag atccttcgcg ggacgtc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador HBV-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgaattca ctgccttcca ccaagc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido A-P1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(12)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtggtta at
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido A-P2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(14)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaccaccag acgt
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DF35-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactcaccac ctccaattcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DF35-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatcccg tacgggtaga cagggttgaa gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DF35-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(49)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccgc tagctgaaat aaagtttaag tgtttttatt taaaatcac
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DF35-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagttgcat tgcttggttg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcckgtstacc cgtacgaaga tgaaagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggctagct cagtcatctt ctctgatata
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 355ITR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccggagc tcacaacgtc attttcccac g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 353ITR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattcgc ggccgcattt aaatc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 35DE4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagcttg cttgtgtata tatattgtgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido TATA-plus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctttctta taaattttca gtgttagact agtaaattgc ttaag
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido TATA-min
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctcttaag caatttacta gtctaacact gaaaatttat aagaa
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador tet3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggagctcc atggcctaac tcgagtttac cactccc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador tet5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaagctta gctcgacttt cacttttctc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligo BB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgcctaggc cacgggg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligo BB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggcctagg cac
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 270F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctctgcc taatcatctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 270R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagaaa ttccactgcc ttccacc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DBPpcr1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccgc caccatggcc agtcgggaag aggag
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador DBPpcr2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattctt aaaaatcaaa ggggttctgc cgc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34794
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34794)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Secuencia de ácido
nucleico de Ad35"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(585)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Proteína Fibra de
Adenovirus de serotipo 5"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 356
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(356)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Proteína fibra de
Adenovirus de serotipo 16"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(325)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Proteína fibra de
Adenovirus de serotipo 35"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> adenoviridae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(325)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /obsérvese="Proteína fibra de
Adenovirus de serotipo 51"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Un adenovirus recombinante, donde dicho
adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 35 (Ad35).
2. Un adenovirus recombinante según la
reivindicación 1, donde dicho adenovirus comprende un gen de
interés.
3. Un adenovirus recombinante según la
reivindicación 1 o 2, donde dicho adenovirus comprende una deleción
en la región E1, volviendo dicha deleción a dicho adenovirus
incompetente para la replicación.
4. Un adenovirus recombinante según la
reivindicación 3, donde dicho adenovirus comprende un gen de interés
que es incorporado en la posición de la deleción E1.
5. Un adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho
adenovirus recombinante es para su uso en terapia, profilaxis y/o
diagnosis.
6. Un adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho
adenovirus es una quimera de Ad35 con al menos otro serotipo de
adenovirus, y donde dicha quimera comprende una proteína fibra, una
proteína pentona y/o una proteína hexano de un serotipo de
adenovirus diferente de Ad35.
7. Un ácido nucleico que codifica un adenovirus
recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones
1-6.
8. Un conjunto de al menos dos ácidos nucleicos
que comprenden un ácido nucleico según la reivindicación 7, donde
dicho conjunto es susceptible de un evento sencillo de recombinación
homóloga entre al menos los dos ácidos nucleicos citados, que
conduce a un ácido nucleico que codifica un adenovirus recombinante
funcional.
9. Una célula que comprende un ácido nucleico
según la reivindicación 7 o un conjunto de al menos dos ácidos
nucleicos según la reivindicación 8.
10. Una célula según la reivindicación 9, que
completa los elementos necesarios para la replicación adenoviral
que están ausentes del ácido nucleico según la reivindicación 7, o
que está ausente del conjunto de al menos dos ácidos nucleicos
según la reivindicación 8.
11. Una célula según la reivindicación 10, que
se origina a partir de una célula PER.C6 cell (número de consigna
ECACC 96022940).
12. Un método para producir un adenovirus
recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones
1-6, que comprende expresar un ácido nucleico según
la reivindicación 7 o un conjunto de al menos dos ácidos nucleicos
según la reivindicación 8 en una célula según una cualquiera de las
reivindicaciones 9-11, y cosechar el adenovirus
recombinante resultante.
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---|---|---|---|---|
US5994128A (en) | 1995-06-15 | 1999-11-30 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
US20030017138A1 (en) | 1998-07-08 | 2003-01-23 | Menzo Havenga | Chimeric adenoviruses |
US6929946B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
US6869936B1 (en) | 1999-03-04 | 2005-03-22 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for fibroblast-like or macrophage-like cell transduction |
US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
US7094398B1 (en) | 1999-06-01 | 2006-08-22 | University Of Washington | Recombinant adenoviral vectors expressing chimeric fiber proteins for cell specific infection and genome integration |
US6558948B1 (en) | 1999-11-23 | 2003-05-06 | Stefan Kochanek | Permanent amniocytic cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors |
EP1191105A1 (en) * | 2000-09-25 | 2002-03-27 | Galapagos Genomics B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for T-lymphocytes |
AU6368901A (en) | 2000-05-31 | 2001-12-11 | Univ Saskatchewan | Modified bovine adenovirus having altered tropism |
AU2002223556A1 (en) * | 2000-09-20 | 2002-04-02 | Crucell Holland B.V. | Transduction of dendritic cells using adenoviral vectors |
DE60138403D1 (de) | 2000-09-26 | 2009-05-28 | Crucell Holland Bv | Adenovirale vektoren für die übertragung von genen in zellen der skelettmuskulatur oder myoblasten |
AU2002211087A1 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-15 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors for stem cells |
EP1195440A1 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-10 | Introgene B.V. | Gene delivery vectors for stem cells |
DE60234496D1 (de) * | 2001-01-04 | 2010-01-07 | Goeran Wadell | Virusvektor zur gentherapie |
JP2004536572A (ja) | 2001-02-23 | 2004-12-09 | セル・ジェネシス・インコーポレイテッド | 新規ベクター構築物 |
AU2003210661A1 (en) * | 2002-01-24 | 2003-09-02 | Novartis Ag | Fiber shaft modifications for efficient targeting |
EA010828B1 (ru) * | 2002-04-25 | 2008-12-30 | Круселл Холланд Б.В. | Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его получения и применения |
CN100374574C (zh) | 2002-04-25 | 2008-03-12 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 稳定的腺病毒载体及其增殖方法 |
JP4237449B2 (ja) * | 2002-06-05 | 2009-03-11 | 国立医薬品食品衛生研究所長 | アデノウィルスベクター |
EP1553983A2 (en) | 2002-10-23 | 2005-07-20 | Crucell Holland B.V. | New settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
US20080153083A1 (en) | 2003-10-23 | 2008-06-26 | Crucell Holland B.V. | Settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
NZ539813A (en) * | 2002-12-17 | 2008-04-30 | Crucell Holland Bv | A replication defective recombinant adenovirus comprising a antigenic determinant of Plasmodium falciparum wherein the antigenic determinant is SEQ ID 6 |
CN1934253A (zh) * | 2003-07-18 | 2007-03-21 | 昂尼克斯药物公司 | 用于治疗疾病的b亚组腺病毒载体 |
DE602005015332D1 (de) | 2004-02-23 | 2009-08-20 | Crucell Holland Bv | Verfahren zur Reinigung von Viren |
CN1972958B (zh) * | 2004-04-12 | 2013-01-23 | 美国政府卫生与公共服务部 | 应用腺病毒载体诱导免疫应答的方法 |
RU2448157C2 (ru) | 2004-05-26 | 2012-04-20 | Псиоксус Терапьютикс Лимитед | Химерные аденовирусы для применения для лечения злокачественного новообразования |
US7741099B2 (en) | 2004-10-13 | 2010-06-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center Inc. | Adenoviral vectors and uses thereof |
CN102220357B (zh) | 2004-11-16 | 2013-12-25 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 包含重组病毒载体的多价疫苗 |
US8574595B2 (en) | 2005-04-11 | 2013-11-05 | Crucell Holland B.V. | Virus purification using ultrafiltration |
AU2006271666B2 (en) | 2005-07-22 | 2011-04-07 | Crucell Holland B.V. | Cell line for producing coronaviruses |
US20100143302A1 (en) * | 2006-03-16 | 2010-06-10 | Crucell Holland B.V. | Recombinant Adenoviruses Based on Serotype 26 and 48, and Use Thereof |
EA019928B1 (ru) | 2008-11-03 | 2014-07-30 | Круселл Холланд Б.В. | Способ получения аденовирусных векторов |
CA2770075C (en) | 2009-08-07 | 2021-08-24 | Perrine Martin | Composition for treating hbv infection |
US20120315696A1 (en) * | 2010-02-15 | 2012-12-13 | Alfred Luitjens | METHOD FOR THE PRODUCTION OF Ad26 ADENOVIRAL VECTORS |
WO2011098592A1 (en) | 2010-02-15 | 2011-08-18 | Crucell Holland B.V. | Method for the production of ad26 adenoviral vectors |
WO2012038367A1 (en) | 2010-09-20 | 2012-03-29 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic vaccination against active tuberculosis |
US9168292B2 (en) | 2010-09-27 | 2015-10-27 | Crucell Holland B.V. | Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria |
CN102260712B (zh) * | 2011-05-31 | 2013-10-02 | 北京锤特生物科技有限公司 | 溶肿瘤能力增强的B型人腺病毒Ad11突变体的构建和应用 |
AU2013231423B2 (en) | 2012-03-12 | 2018-10-04 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
CA2867955C (en) | 2012-03-22 | 2023-02-07 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against rsv |
US9119813B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-01 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
JP6162224B2 (ja) | 2012-05-24 | 2017-07-12 | クルセル ホランド ベー ヴェー | 血管組織の形質導入のためのアデノウイルスベクター |
WO2014009433A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | Transgene Sa | Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant |
JP6333814B2 (ja) | 2012-07-10 | 2018-05-30 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニムTransgene S.A. | マイコバクテリア抗原ワクチン |
WO2014078688A2 (en) | 2012-11-16 | 2014-05-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Recombinant adenoviruses and use thereof |
KR102089121B1 (ko) | 2013-03-14 | 2020-03-13 | 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 | 종양살상형 아데노바이러스 조성물 |
TR201902513T4 (tr) | 2013-04-25 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilize edilmiş çözünebilir prefüzyon RSV F polipeptitleri. |
EA034653B1 (ru) | 2013-06-17 | 2020-03-03 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv перед слиянием |
NZ718931A (en) | 2013-10-25 | 2022-10-28 | Psioxus Therapeutics Ltd | Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes |
WO2015104380A1 (en) | 2014-01-09 | 2015-07-16 | Transgene Sa | Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens |
SG11201701745TA (en) | 2014-09-03 | 2017-04-27 | Bavarian Nordic As | Methods and compositions for enhancing immune responses |
DK3656395T5 (da) | 2014-09-03 | 2024-05-27 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Fremgangsmåder og sammensætninger til at inducere beskyttende immunitet mod filovirusinfektion |
PL3197489T3 (pl) | 2014-09-26 | 2021-11-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Sposoby i kompozycje do indukowania ochronnej odporności przeciwo zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności |
MX2017005788A (es) | 2014-11-04 | 2017-08-02 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vacunas terapeuticas contra el vph16. |
PL3283634T3 (pl) | 2015-04-14 | 2019-10-31 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Rekombinowany adenowirus eksprymujący dwa transgeny z dwukierunkowym promotorem |
EP3288573B1 (en) | 2015-04-30 | 2020-02-12 | Psioxus Therapeutics Limited | Oncolytic adenovirus encoding a b7 protein |
CN107847581B (zh) | 2015-07-07 | 2022-03-22 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
WO2017005844A1 (en) | 2015-07-07 | 2017-01-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv |
CA2995740A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic hpv18 vaccines |
MD3584252T2 (ro) | 2015-12-15 | 2022-01-31 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Antigene, vectori, compoziții ale virusului imunodeficienței umane și metode de utilizare a acestora |
EP3389682B1 (en) | 2015-12-17 | 2021-11-17 | Psioxus Therapeutics Limited | Group b adenovirus encoding an anti-tcr-complex antibody or fragment |
CN108699566B (zh) | 2016-02-23 | 2023-06-30 | 萨克生物研究学院 | 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达 |
CA3013637A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Salk Institute For Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
EA201892250A1 (ru) | 2016-04-05 | 2019-03-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Вакцина против rsv |
HUE053027T2 (hu) | 2016-04-05 | 2021-06-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilizált, szolúbilis prefúziós RSV F fehérje, RSV-fertõzés megelõzésében történõ alkalmazásra |
US10517944B2 (en) | 2016-05-02 | 2019-12-31 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic HPV vaccine combinations |
ES2836598T3 (es) | 2016-05-30 | 2021-06-25 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Proteínas F de RSV prefusión estabilizadas |
SG11201810549TA (en) | 2016-06-16 | 2018-12-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Hiv vaccine formulation |
US11001858B2 (en) | 2016-06-20 | 2021-05-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
WO2018011196A1 (en) | 2016-07-14 | 2018-01-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Hpv vaccines |
EP3484507A1 (en) | 2016-07-15 | 2019-05-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection |
WO2018011198A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection |
EP3503918B1 (en) | 2016-08-29 | 2020-09-30 | Psioxus Therapeutics Limited | Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite) |
GB201713765D0 (en) | 2017-08-28 | 2017-10-11 | Psioxus Therapeutics Ltd | Modified adenovirus |
EP3532082A4 (en) | 2016-12-12 | 2020-08-26 | Salk Institute for Biological Studies | SYNTHETIC ADENOVIRUS TUMOR TARGETING AND THEIR USES |
US11034978B2 (en) | 2017-02-09 | 2021-06-15 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and short promoter for expression of heterologous genes |
US11173204B2 (en) | 2017-04-06 | 2021-11-16 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | MVA-BN and Ad26.ZEBOV or Ad26.filo prime-boost regimen |
WO2018210871A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
EP3624844A1 (en) | 2017-05-17 | 2020-03-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
CN110958887B (zh) | 2017-06-15 | 2023-10-31 | 扬森疫苗与预防公司 | 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法 |
EA202090738A1 (ru) | 2017-09-15 | 2020-06-10 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Способ безопасного индуцирования иммунитета против rsv |
WO2019099970A1 (en) | 2017-11-20 | 2019-05-23 | Janssen Pharmaceuticals Inc. | Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen |
EP3723771A4 (en) | 2017-12-11 | 2022-04-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | RECOMBINANT ADENOVIRUS AND THEIR USES |
WO2019123250A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-27 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and compositions for inducing an immune response against hepatitis b virus (hbv) |
EP3810277A1 (en) | 2018-07-20 | 2021-04-28 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Recombinant adenoviral vector expressing zika antigen with improved productivity |
MX2021008392A (es) | 2019-01-10 | 2021-10-26 | Janssen Biotech Inc | Neoantígenos prostaticos y sus usos. |
KR20220008816A (ko) | 2019-05-15 | 2022-01-21 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 기반 백신을 사용한 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 예방적 치료 |
EP3969044A1 (en) | 2019-05-15 | 2022-03-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
PE20221182A1 (es) | 2019-11-18 | 2022-08-05 | Janssen Biotech Inc | Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos |
TW202144388A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途 |
TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
CN111337042B (zh) * | 2020-03-13 | 2021-11-02 | 湖北大学 | 一种车辆路径规划方法及系统 |
US20210315986A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-14 | Janssen Biotech, Inc. | Psma and steap1 vaccines and their uses |
US20230024133A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-01-26 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate Neoantigens And Their Uses |
EP4176087A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment |
WO2022009052A2 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
CA3188801A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-13 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Rna replicon vaccines against hbv |
GB202013940D0 (en) | 2020-09-04 | 2020-10-21 | Synpromics Ltd | Regulatory nucleic acid sequences |
CA3195177A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy disorders including limb girdle 2i (lgmd2i) |
EP4267605A2 (en) | 2020-12-23 | 2023-11-01 | Janssen Biotech, Inc. | Neoantigen peptide mimics |
WO2023198815A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Sequential administration of adenoviruses |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2725726B1 (fr) * | 1994-10-17 | 1997-01-03 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
US5856152A (en) * | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
US5994128A (en) | 1995-06-15 | 1999-11-30 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
US5837511A (en) * | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
US5877011A (en) * | 1996-11-20 | 1999-03-02 | Genzyme Corporation | Chimeric adenoviral vectors |
US6100086A (en) * | 1997-04-14 | 2000-08-08 | Genzyme Corporation | Transgene expression systems |
JP4683727B2 (ja) * | 1999-03-04 | 2011-05-18 | クルーセル ホランド ベスローテン フェンノートシャップ | 線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞の形質導入のための手段と方法 |
JP2011521985A (ja) * | 2008-06-03 | 2011-07-28 | オカイロス アーゲー | Hcv感染の予防および治療のためのワクチン |
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