CN102220357B - 包含重组病毒载体的多价疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含重组载体例如重组腺病毒的疫苗。本载体包括编码来自一种或多种结核病致病菌的至少两种抗原的异源核酸。本发明也涉及特异性蛋白酶识别位点连接抗原的应用，其中通过蛋白酶识别位点，所编码的抗原可被切割分离。切割后，抗原以独立方式引起免疫应答。重组载体可以包括编码切割接头和分离抗原的蛋白酶的核酸。本发明进一步涉及所述重组载体编码的遗传佐剂的应用，其中所述遗传佐剂也可通过可切割的接头及特异性蛋白酶的存在而切割。

Description

包含重组病毒载体的多价疫苗
本申请为2007年5月16日提交的申请号为200580039095.7标题为“包含重组病毒载体的多价疫苗”的申请的分案申请
发明领域
本发明涉及重组DNA和病毒载体疫苗领域。更具体地，本发明涉及重组DNA和携带编码多价抗原的核酸的病毒载体和/或佐剂。
发明背景
几千年来，结核病(TB)在世界范围内一直是人类健康的主要威胁。由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的TB是暴露于空气传播的结核分枝杆菌细菌感染而引起的肺部感染性疾病。该菌具有强感染性，据估计，目前约有1/3的世界人口(20亿人)受到感染。进一步预计，TB每年已致超过2百万的世界人口死亡。只有5-10％的具有免疫能力的人群对TB敏感，并且其中超过85％的人群将发展成只在肺中的疾病，而HIV感染人群也能发展成更容易导致死亡的全身性疾病。
约90％的结核分枝杆菌感染的人群将不会发展成疾病。然而，在这些潜伏感染个体中，该细菌能存活许多年，并且在免疫系统变弱的情况下例如在HIV感染后能被重新激活。因为其潜伏特性，所以通常感染个体必须通过给予几种抗生素12个月以上进行治疗，该治疗通常不是非常有吸引力的治疗，因为费用和可能的多药抗性的发生，该治疗也不是一个在大多数发展中国家中非常有效的治疗。
一种相对成功的TB疫苗已经被开发出来：卡介苗(BCG)疫苗在二十世纪早期产生，1921年首次将其给予个体。BCG疫苗是基于奶牛的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)细菌的减毒株。该疫苗相对安全，可以容易和相当便宜的生产。在2000年，BCG疫苗覆盖了86％的世界人群。然而，该疫苗似乎对成人肺TB不是特别有效，因为发展中国家的许多地区仍然有非常高的TB发生率，尽管进行了BCG疫苗接种项目。据估计，BCG疫苗预防了仅5％的TB造成的所有疫苗可预防的死亡(Kaufmann，2000)。
由于BCG疫苗普遍相当低的保护率，以及由于针对儿童时期和散布TB的特异性保护，所以基于其它系统和其它领域例如抗其它热带感染疾病和HIV的疫苗所获得的知识，更多的努力被用于开发新的、应用更加广泛的抗TB疫苗上(Wang and Xing综述，2002)。
不同方法被用来开发新TB疫苗，范围从亚单位疫苗和DNA疫苗到修饰的分枝杆菌菌株。此外，也产生了基于重组病毒的疫苗，该疫苗通过基因输送载体例如修饰的Ankara痘苗(MVA)载体和复制缺陷型腺病毒载体能将结核分枝杆菌抗原转移至抗原呈递细胞。
抗TB的裸DNA疫苗记载在WO96/15241中(也参见EP0792358)，同时许多报道记载了来自结核分枝杆菌的多种抗原以重组或纯化的形式应用于疫苗：WO 95/01441、WO 95/14713、WO96/37219、US 6,599,510、WO 98/31388、WO 98/44119、WO 99/04005、WO 99/24577、WO 00/21983、WO 01/04151、WO 01/79274、WO2004/006952、US 2002/0150592。也提示了应用包含不同TB抗原的融合蛋白：见WO 98/44119、EP 0972045以及EP 1449922，这些文献公开了ESAT-6和MPT59融合多肽的应用(MPT59也称为Ag85B或85B抗原)。
尽管所有这些和其它产生抗结核病疫苗的努力以确保强的细胞和体液免疫应答以及长效高保护率，但这样的疫苗目前还没有获得。
附图简述
图1：pAdApt35Bsu.myc图谱
图2：pAdApt35Bsu.TB.LM图谱
图3：pAdApt35Bsu.TB.SM图谱
图4：pAdApt35Bsu.TB.FLM图谱
图5：pAdApt35Bsu.TB.3M图谱
图6：pAdApt35Bsu.TB.4M图谱
图7：pAdApt35Bsu.TB.5M图谱
图8：pAdApt35Bsu.TB.6M图谱
图9：pAdApt35Bsu.TB.7M图谱
图10.抗-TB抗原多克隆抗体与Ad35病毒感染A549细胞的裂解物的Western印记，所述Ad35病毒包含不同组TB抗原的核酸，具有myc-标记(A)和不含myc-标记(B)。(C)与(B)相似，有分子量标记。参见表I注释。
图11.使用含不同组编码结核抗原的核酸的7种不同腺病毒载体(DNA)的免疫方案的实验设计。
图12.在不含肽的刺激下，干扰素-γ生产(IFNγ+)染色阳性的抗原特异性脾细胞百分率(A：CD4+细胞，B：CD8+细胞)。
图13.在Ag85A抗原相关肽刺激下，干扰素-γ生产(IFNγ+)染色阳性的抗原特异性脾细胞百分率(A：CD4+细胞，B：CD8+细胞)。
图14.在Ag85B抗原相关肽刺激下，干扰素-γ生产(IFNγ+)染色阳性的抗原特异性脾细胞百分率(A：CD4+细胞，B：CD8+细胞)。
图15.在TB10.4抗原相关肽刺激下，干扰素-γ生产(IFNγ+)染色阳性的抗原特异性脾细胞百分率(A：CD4+细胞，B：CD8+细胞)。
图16.ICN染色阳性的CD4+和CD8+脾细胞百分率总述，该脾细胞获自注射了三联插入片段(triple insert)TB-L(A)和TB-S(B)的小鼠血清。
图17.包含编码Ag85A、Ag85B和Tb10.4抗原的核酸的不同剂量TB-S的剂量应答效应。Ag85A(A)、Ag85B(C)和TB 10.4(E)的CD4反应。Ag85A(B)、Ag85B(D)和TB10.4(F)的CD8反应。(G)：含校正肽库(adjusted peptide pool)的Ag85B的CD8反应(参见实施例6)：左图，TB-L感染；右图，TB-S感染。
图18.BCG引发且不同Ad-TB载体加强的CD4和CD8反应。Ag85A(A)、Ag85B(C)和TB10.4(E)的CD4反应。Ag85A(B)、Ag85B(D)和TB10.4(F)的CD8反应。
图19.TB-LM的核苷酸序列
图20.TB-SM的核苷酸序列
图21.TB-FLM的核苷酸序列
图22.TB-LM的氨基酸序列
图23.TB-SM的氨基酸序列
图24.TB-FLM的氨基酸序列
图25.长期读数的BCG引发/Ad35-TB加强实验的Ag85A刺激。上部：CD4反应，下部：CD8反应。Ad35.E＝空Ad35病毒。
图26.长期读数的BCG引发/Ad35-TB加强实验的Ag85B刺激。上部：CD4反应，下部：CD8反应。Ad35.E＝空Ad35病毒。
图27.长期读数的BCG引发/Ad35-TB加强实验的TB10.4刺激。上部：CD4反应，下部：CD8反应。Ad35.E＝空Ad35病毒。
发明概述
本发明涉及重组病毒载体，优选复制缺陷腺病毒，更优选重组人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50，其中病毒载体包括异源核酸序列，该序列编码来自一种或多种结核致病菌的至少两种抗原的(融合)多肽。编码的抗原可以直接连接，即形成一个单一多肽。在一个优选的实施方案中，抗原以前体多蛋白存在，在该情况下，他们通过由共表达的特异性蛋白酶识别的接头序列连接。异源核酸可以包括编码蛋白酶的基因。由于抗原存在在融合产物中，所以直接连接的融合蛋白可引发期望的免疫应答，同时包含蛋白酶位点的蛋白被切割为分离的抗原形式，每一抗原也可产生期望的免疫应答。蛋白酶优选通过被细胞蛋白酶识别的蛋白酶识别位点连接至抗原。与使用仅包括单一转基因编码单位的病毒载体的免疫或治疗相比，两种方案提供了额外的或甚至是协同的作用。更通常地，本发明也涉及包括异源核酸序列的病毒载体，该序列编码被蛋白酶特异切割位点分隔的多抗原。可以理解，这样的抗原可以来自广泛来源，包括但不限于感染物，例如病毒、细菌和寄生虫，因此，根据本发明这个方面，该抗原并不限于来自结核致病菌的抗原。来自结核分枝杆菌(Tuberculosis mycobacterium)的抗原作为非限制性的实例，以说明这种多价病毒载体疫苗如何产生，在进入宿主细胞之后该抗原如何分离，以及该抗原能产生免疫应答。
本发明还涉及病毒载体共表达的遗传佐剂的应用。这些佐剂由核酸编码，该核酸是导入病毒载体基因组的异源核酸序列的一部分。佐剂与特异抗原共同表达，因此能刺激针对抗原的免疫应答。具体地，编码佐剂的序列可与编码抗原的序列直接连接，但优选地与编码一个或多个抗原的序列由编码蛋白酶识别位点的接头序列分隔。在后一情况中，佐剂与抗原分别存在在宿主中，其能与抗原一起提供免疫刺激效应。
发明详述
本发明涉及包含重组病毒载体的多价疫苗。优选的病毒载体是重组腺病毒(Ad)载体。本发明的重组腺病毒载体包括编码至少两种不同抗原的异源核酸序列。抗原可位于单一多肽中。这些决定簇可以是来自病毒、细菌和寄生病原体的抗原，或者宿主抗原，例如但不限于自身免疫抗原或肿瘤抗原。在优选的实施方案中，抗原来自结核(TB)致病菌，更优选来自结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌(M.africanum)或牛分枝杆菌(M.bovis)或者其组合。抗原可以是全长天然蛋白，抗原与宿主蛋白或模拟物的嵌合融合体，源自病原体的抗原的一或多个片段，或者仍可引发期望免疫应答的其它突变体。可典型地用于本发明病毒载体的编码TB抗原的基因包括但不限于：Ag85A(MPT44)、Ag85B(MPT59)、Ag85C(MPT45)、TB10.4(CFP7)、ESAT-6、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CFP9、CFP10、CFP10A、CFP11、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP26(MPT51)CFP27、CFP28、CFP29、CFP30A、CFP30B、CWP32、CFP50、MPT63、MTC28、LHP、MPB59、MPB64、MPT64、TB15、TB18、TB21、TB33、TB38、TB54、TB12.5、TB20.6、TB40.8、TB10C、TB15A、TB17、TB24、TB27B、TB13A、TB64、TB11B、TB16、TB16A、TB32、TB32A、TB51、TB 14、TB27、HBHA、GroEL、GroES(WO95/01441、WO 98/44119、US 6,596,281、US 6,641,814、WO 99/04005、WO 00/21983、WO 99/24577)以及公开在WO 92/14823、WO95/14713、WO 96/37219、US 5,955,077、US 6,599,510、WO 98/31388、US 2002/0150592、WO 01/04151、WO 01/70991、WO 01/79274、WO2004/006952、WO 97/09428、WO 97/09429、WO 98/16645、WO98/16646、WO 98/53075、WO 98/53076、WO 99/42076、WO 99/42118、WO 99/51748、WO 00/39301、WO 00/55194、WO 01/23421、WO01/24820、WO 01/25401、WO 01/62893、WO 01/98460、WO 02/098360、WO03/070187、US 6,290,969、US 6,338,852、US 6,350,456、US6,458,366、US 6,465,633、US 6,544,522、US 6,555,653、US 6,592,877、US 6,613,881、US 6,627,198中的抗原。特定用途的抗原融合体是本文首次公开的那些(例如Ag85A-Ag85B-TB 10.4及其组合)，但也已知如ESAT-6-MPT59和MPT59-ESAT-6这样的融合体已经公开在WO98/44119和上述参考文献中。
一个利用多抗原的方法可以通过单个载体中存在有两个或多个分离的表达盒，每个表达盒包含各自感兴趣的基因来实现。该方法具体有以下优点，例如与载体空间利用度相关：分隔的盒通常包括各自的启动子和/或诱导物以及各自的多腺苷酸化信号序列。这种盒通常在病毒载体中需要独立位置，这将导致更繁琐的克隆步骤，而称为“启动子干扰”或“压制(squelching)”(启动子发挥作用所要求的细胞因素的有限可利用度)的现象可限制不同启动子的表达水平。
以本文公开的涉及多TB抗原融合体的重组病毒载体为例，现在可以制备包含编码多于一个抗原的多个核酸的重组腺病毒载体，其中病毒载体产生强免疫应答，而应用单一插入体引发有限效应。具体地，这些载体编码重组遗传嵌合物，其在单顺反子mRNA中表达两种或多种抗原，例如以融合蛋白形式。当DNA疫苗或病毒载体用于激发对所载抗原的T细胞免疫时，该方法是有效的。然而，这种融合蛋白可能有其它不能事先预料的额外缺点，已经发现这种融合体可能会扭曲免疫显性模式而不能总是以相同潜能激发针对所有靶抗原的免疫，而遗传融合体表达的第二个也可能更重要的缺点是由于融合配偶体紧密靠近或其它原因，各个成分不能折叠成天然构象。由于这些原因，遗传融合体可能引发针对无义表位的抗体应答，这种抗体不能识别原始病原体所展示的天然表位，对抗击感染较弱。
本发明人现在开发了一种系统，其中多抗原由单一异源核酸序列编码，其中表达的多蛋白被加工成分离的抗原多肽。因此，在一个实施方案中，本发明涉及能使多抗原表达的病毒载体，所述多抗原被依次加工成分离的抗原，由此避免与遗传融合体相关的可能限制，同时也不需要独立的表达盒。迄今，还没有记载能使病毒载体表达的遗传融合体精确加工为分离抗原的组合物或方法。DNA或病毒载体包含的核酸编码的多抗原的表达是利用蛋白酶(PR)例如禽类白血病病毒(ALV；本文称为PR-ALV)编码的病毒蛋白酶证明的，其中所述抗原接着被加工成分离的抗原。在ALV中，ALV-PR形成gag蛋白的C末端结构域，该结构域已知催化gag和gag-pol前体加工，这是ALV复制的关键步骤(Skalka综述.1989)。
产生了独特的ALV-PR定向加工系统。含有ALV-PR和给定抗原的多蛋白通过DNA或病毒载体表达，其中ALV-PR优选形成多蛋白的N末端，后面紧接与ALV-PR消化位点连接的抗原序列。优选两个不同的切割位点用于该系统。一个切割位点(GSSGPWPAPEPPAVSLAMTMEHRDRPLV；SEQ ID NO：22)释放ALV-PR，另一切割位点(PPSKSKKGGAAAMSSAIQPLVMAVVNRERDGQTG；SEQ ID NO：21)则被ALV-PR所识别，用于分离在分离多肽中的其它被编码的抗原。
或者，PR和其切割位点可由其它逆转录病毒所编码或基于其它逆转录病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和劳斯肉瘤病毒。
在优选的实施方案中，本发明公开了包含编码来自结核分枝杆菌的多抗原的核酸序列的重组病毒载体，其中不同的核酸序列被编码ALV蛋白酶识别位点的序列彼此分隔。在该情况下，分离的TB抗原以多蛋白的形式产生而后加工，这样它们被切割成分离的抗原多肽，各自导致免疫应答。可以理解，ALV蛋白酶系统不限于应用TB-特异性抗原。本领域技术人员将会理解该系统有可能应用其它抗原，这些抗原与TB抗原不同或与之组合，以及其可应用于其它治疗方案，例如基因治疗及肿瘤免疫。
优选地，包含被蛋白酶位点分隔的多抗原编码序列的病毒载体是腺病毒载体。病毒载体可以是病毒颗粒本身，术语病毒载体也可以指编码病毒颗粒的核酸。腺病毒载体优选是重组载体，其基于或衍生于在低百分数的靶群中遭遇中和活性的腺病毒种或血清型。这些腺病毒有时也称为“稀有”腺病毒，因为它们通常不会在人群中规律流行。因此，优选的血清型是Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。
本文所用的“抗原”是指蛋白质或其片段，在动物或人类细胞或组织中表达时，其能引发免疫应答。例子包括但不限于：病毒蛋白、细菌蛋白、寄生物蛋白、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂以及治疗剂。抗原可以是野生型蛋白、该蛋白的截短形式、该蛋白的突变形式、或该蛋白的任何其它变体，在每种情况下，在接种的动物或人宿主中表达时均能够引发免疫应答。可以理解，当抗原直接融合时，该融合是重组分子生物学的结果；因此，本文所用的两种抗原的直接融合体并不是指发生在自然界的单一野生型蛋白的两个抗原部分。为了清楚起见，当单一野生型蛋白的两个抗原部分(两部分通常直接连接于蛋白内)通过本文所公开的接头(例如通过ALV蛋白酶位点，如下文所述)连接时，该融合体也是本发明的一部分。在优选的实施方案中，本发明涉及直接连接或通过一个或多个蛋白酶位点连接的不同蛋白质(有抗原活性)。在更优选的实施方案中，编码蛋白酶的基因与感兴趣的蛋白相连，更优选通过另一种蛋白酶位点相连。
不同抗原不需要来自同一病原物种。多物种不同抗原的组合也包括在本发明范围内，其中不同抗原由单一载体内的核酸序列编码。
“宿主抗原”是指存在在受体动物细胞或组织的蛋白或其部分，例如但不限于细胞蛋白、免疫调节剂或治疗剂。
抗原可以由密码子优化的合成基因编码，及用常规重组DNA方法构建。
如上所述，包含ALV蛋白酶系统的重组病毒载体表达的抗原可以是在侵入动物宿主、在动物宿主内建群或在动物宿主内复制之前或期间由任何病毒、细菌或寄生病原体表达的任何分子。这些病原体在人、家畜或野生动物宿主中可以是感染性的。
病毒抗原来自的病毒病原体包括但不限于：正粘病毒，例如流感病毒；逆转录病毒，例如RSV、HTLV-1和HTLV-II；疱疹病毒，例如EBV；CMV或单纯疱疹病毒；慢病毒，例如HIV-1和HIV-2；弹状病毒，例如狂犬病毒；小RNA病毒，例如脊髓灰质炎病毒；痘病毒，例如痘苗病毒；轮状病毒；以及细小病毒，例如腺伴随病毒(AAV)。
病毒抗原的例子在下组可以找到，包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)抗原Rev、Pol、Nef、Gag、Env、Tat、Tat突变衍生物，例如Tat-A31-45、gp120的T-细胞和B-细胞表位、HIV-I Env和gp120的嵌合衍生物，例如gp120与CD4的融合体、截短或修饰的HIV-I Env，例如gp140或HIV-1Env和/或gp140的衍生物。其它例子是乙肝表面抗原、轮状病毒抗原，例如VP4和VP7，流感病毒抗原，例如血凝素、神经氨酸酶或核蛋白，以及单纯疱疹病毒抗原，例如胸苷激酶。
细菌抗原衍生自的细菌病原体的例子包括但不限于：分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、大肠杆菌(E coli)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)、李斯特氏菌属(Listeria spp.)、肺炎军团菌(Legionella pneumoniae)、Fansicella spp.、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、弧菌属(Vivrio spp.)以及布氏疏螺旋体(Borelliaburgdorferi)。
细菌病原体的保护性抗原的例子包括产肠毒性大肠杆菌的菌体抗原，例如CFA/I菌毛抗原和热不稳定毒素的非毒性B亚基；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)pertactin、百日咳博德特氏菌的腺苷酸环化酶-溶血素、破伤风梭菌(Clostridium tetani)破伤风毒素C片段、布氏疏螺旋体OspA、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)和斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)保护性类结晶表面层蛋白(protective paracrystalline-surface-layer proteins)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素(也称作″Llo″和″Hly″)和/或超氧化物岐化酶(也称为″SOD″和″p60″)、幽门螺杆菌的脲酶以及炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthrax)的致死毒素的受体结合结构域和/或保护性抗原。
寄生抗原衍生自的寄生病原体包括但不限于：疟原虫属(Plasmodium spp.)，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)；锥虫属(Trypanosome spp.)，例如克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)；贾第虫属(Giardia spp.)，例如肠贾第虫(Giardia intestinalis)；牛蜱属(Boophilus spp.)；巴倍虫属(Babesia spp.)，例如田鼠巴倍虫(Babesiamicroti)；内阿米巴属(Entamoeba spp.)，例如溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)；艾美虫属(Eimeria spp.)，例如巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)；利什曼原虫属(Leishmania spp.)；血吸虫属(Schistosome spp.)；Brugia属(Brugia spp.)；Fascida属(Fascidaspp.)；恶丝虫属(Dirofilaria spp.)；吴策丝虫属(Wuchereria spp.)；以及盘尾丝虫属(Onchocerea spp.)。
寄生病原体的保护性抗原的例子包括疟原虫属的环子孢子蛋白(CS)或肝期特异性(LSA)抗原LSA-I和LSA-3，例如P.bergerii或恶性疟原虫的那些或其免疫原性突变体；疟原虫属的裂殖子表面抗原、溶组织内阿米巴的半乳糖特异性凝集素、利什曼原虫属的gp63、硕大利什曼原虫(Leishmania major)的gp46、Brugia malayi的副肌球蛋白、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的丙糖磷酸异构酶、蛇形毛圆线虫(Trichostrongylus colubriformis)的分泌的球蛋白样蛋白、Frasciola hepatica、牛血吸虫(Schistosoma bovis)和日本血吸虫(S.japonicum)的谷胱甘肽-S-转移酶以及牛血吸虫和日本血吸虫的KLH。
如上所述，包含编码ALV或ALV样蛋白酶的核酸的重组病毒载体可编码宿主抗原，其可以是任何细胞蛋白、免疫调节剂、或治疗剂或其部分，其可在受体细胞中表达，其包括但不限于肿瘤、移植物、和自身免疫抗原或者肿瘤、移植物、自身免疫抗原的片段和衍生物。因此，在本发明中，病毒载体可以编码肿瘤、移植物或自身免疫抗原，或者其部分或衍生物。或者，病毒载体可以编码合成基因(如上所述制备)，所述合成基因编码肿瘤特异的移植物或自身免疫抗原或其部分。这种抗原的实例包括但不限于前列腺特异抗原、MUC1、gp100、HER2、TAG-72、CEA、MAGE-1、酪氨酸酶、CD3以及IASβ链。
具体地，通过在单一多蛋白中导入多个多肽并在需要这些多个(分离)多肽的宿主中将该多蛋白加工成分离的多肽，本文公开的ALV蛋白酶位点技术也可用于基因治疗应用。
作为进一步增强病毒载体免疫原性的手段，编码至少一个抗原和佐剂的表达盒被构建，其能用于增强对所述病毒载体表达抗原的宿主应答。该佐剂在本文中也称作“遗传佐剂”，因为基因编码用作佐剂的蛋白。优选的应用如上所述应用蛋白酶和连接蛋白酶位点，在翻译后将抗原从佐剂切开，尽管在某些实施方案中，佐剂也可直接与抗原连接。
病毒载体编码的特定佐剂可以选自广泛的遗传佐剂。在优选的实施方案中，佐剂是霍乱毒素A亚基(CtxA；实例：GenBank accessionno.X00171、AF175708、D30053、D30052)，或其功能部分和/或功能突变衍生物，例如Ctx的A亚基的A1结构域(CtxA1；GenBankaccession no.K02679)。或者，任何细菌腺苷二磷酸核糖外毒素家族成员的细菌毒素都可以使用。非限制性的实例是肠产毒性大肠杆菌的热不稳定毒素A亚基(EltA)和百日咳毒素S1亚基。其它的实例是腺苷酸环化酶-溶血素，例如百日咳博德特氏菌、支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)或副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)cyaA基因。或者，特定的ADP-核糖转移酶毒素可以是霍乱毒素A亚基(即CtxA)的任何衍生物或其部分(即Ctx A亚基的A1结构域(即CtxA1))，所述霍乱毒素来源于任何经典霍乱弧菌(Vibrio cholerae)菌株(例如菌株395)或E1-Tor霍乱弧菌(例如菌株2125)，所述E1-Tor霍乱弧菌显示出降低的ADP-核糖转移酶催化活性但仍保留了结构完整性，包括但不限于第7位的精氨酸被赖氨酸取代(R7K)、41位的丝氨酸被苯丙氨酸取代(S41F)、61位的丝氨酸被赖氨酸取代(S61K)、63位的丝氨酸被赖氨酸取代(S63K)、53位的缬氨酸被天冬氨酸取代(V53D)、97位的缬氨酸被赖氨酸取代(V97K)或104位的酪氨酸被赖氨酸取代(Y104K)或者其组合。或者，特定的ADP-核糖转移酶毒素可以是任何完全类似的霍乱毒素的衍生物，但由于分别在催化位点或临近催化位点的突变所致而已经是无毒的蛋白。这样的突变体可以通过下文所述的常规定点诱变方法制备。
在另一实施方案中，ADP-核糖转移酶毒素是分离自任何肠产毒性大肠杆菌的肠产毒性大肠杆菌的热不稳定毒素的A亚基(LtxA)的任何衍生物，所述肠产毒性大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌菌株H10407，其显示出降低的ADP-核糖转移酶催化活性但仍保留了结构完整性，包括但不限于R7K、S41F、S61K、S63K、V53D、V97K或Y104K或其组合。或者，特定的ADP-核糖转移酶毒素可以是任何完全类似的霍乱毒素衍生物，所述衍生物由于在催化位点或临近催化位点的突变而无毒。这样的突变体可以通过下文所述的常规定点诱变方法制备。
虽然ADP-核糖基化毒素是有效的佐剂，但本发明的病毒载体编码的佐剂也可以是来自病毒、细菌或原生动物生物体的任何生物活性蛋白、免疫调节DNA、双链RNA或小抑制RNA(本文称为siRNA)。特定的生物活性蛋白可以选自但不限于下列：第1类.该类佐剂通过抑制Rho——宿主小GTPase而诱导凋亡。抑制Rho已经清楚与诱导凋亡相关。诱导凋亡是驱使旁观者T细胞应答的有用方法，也是诱导CTL的有效方法。至今，该策略还没有在任何实验系统中被评估。SopE活性结构域包含在氨基酸78-240中，它仅需要486bp基因用于表达。大肠杆菌CNF-1的催化结构域可能有类似特性。第2类.细菌膜孔蛋白已经显示出具有免疫调节活性。这些疏水同源三聚体蛋白形成允许Mr＜600Da分子通过膜的孔。膜孔蛋白的实例包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的OmpF、OmpC和OmpD蛋白。第3类.双链RNA(dsRNA)激活宿主细胞，包括树突状细胞。编码由内含子或核酶所间隔的反向重复序列的mRNA的表达导致dsRNA的表达。第4类.肽基序(motive)[WYF]xx[QD]xx[WYF]已知可诱导CD1d-限制性NK T细胞应答(Kronenberg和Gapin，2002)。具有该基序融合到T4fibritin卷曲-卷曲基序的肽的表达可产生三聚体肽，其将在CD1d-限制性T细胞上交联TCR，从而激活先天宿主应答。第5类.siRNA可用于靶向宿主mRNA分子，抑制免疫应答(例如kir)，调节免疫应答(例如B7.2)或阻止交叉呈递(例如Rho)。第6类.SiRNA’s能用于靶向共刺激分子例如CD80和CD86的疫苗。抑制这些分子将阻止共刺激，从而导致T细胞无反应性。
惊奇地，如本文公开的，已发现TB致病菌抗原例如TB10.4蛋白不仅本身能用作抗原，而且甚至能用作其它TB抗原例如Ag85A的佐剂：在存在三联插入片段的情况中(Ag85A-Ag85B-TB10.4)，惊奇地发现构建体中TB10.4的存在刺激了针对Ag85A的免疫应答，而TB10.4的缺失显示出针对CD8+脾细胞的弱作用(参见实施例4和图13B)。进一步研究TB10.4佐剂效应发现当存在于三联构建体中时，TB10.4实际刺激了针对Ag85A的CD8细胞的活化，而各个编码独立抗原的独立载体的感染没有导致这种刺激，这强烈提示TB10.4抗原应该存在于同一载体中或者存在于同一翻译产物中。
本发明还涉及编码通过蛋白酶识别位点融合的至少一个抗原和细胞因子的病毒载体。这种载体用于增加对所述病毒载体表达的装载抗原的宿主应答。病毒载体编码的细胞因子的实例是白介素-4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、TGFβ和TNFα。
导入功能性表达盒以产生在真核细胞或组织中能表达免疫调节剂的病毒载体的重组DNA和RNA方法是本领域已知的。
本文描述了用于构建表达多于一个的抗原的病毒载体的组合物和方法，所述抗原来自TB致病菌，优选结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和/或牛分枝杆菌。优选地，病毒载体是复制缺陷型重组腺病毒载体。一个深入研究和经常应用的腺病毒血清型是腺病毒5(Ad5)。在小鼠和恒河猴研究中，抗Ad5免疫的存在显示基本抑制了基于Ad5的疫苗的免疫原性。I期临床实验的早期数据显示该问题也发生在人类中。
为避开先前感染了最常见的人腺病毒(例如Ad5)的个体中已存在免疫性的问题，一个有前景的策略涉及开发来自不会面临这种已存在免疫性的腺病毒血清型的重组载体。被鉴定为特别有用的人腺病毒载体是基于血清型11、26、34、35、48、49和50，如WO 00/70071、WO 02/40665和WO 2004/037294所示(也参见Vogels et al.2003)。其他人发现腺病毒24(Ad24)也是特别有利的，因为它示出是稀有血清型(WO 2004/083418)。因此，在优选的实施方案中，所述病毒载体是衍生自选自下组的血清型的腺病毒：Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。这种选择人腺病毒作为疫苗载体的优点具体地在于人通常不会感染这些野生型腺病毒。因此，抗这些血清型的中和抗体在人群中大体上很少见。这与血清型5不同，因为人经常感染这种野生型血清型。当用作随后的重组疫苗载体时，例如一种利用腺病毒的抗疟疾疫苗，亲本野生型血清型感染过程中所引起的免疫应答可对重组腺病毒血清型的效力产生负面影响。不同腺病毒血清型在世界范围人群的传播因地区不同而不同。通常，优选的血清型在世界大多数地区的宿主中遇到低中和活性，如WO 00/70771所述。在另一优选的实施方案中，腺病毒是猿猴、犬或牛腺病毒，因为这些病毒在给予重组病毒的(人类)宿主中不会遇到预先存在的免疫。本领域的普通技术人员可以很好理解在人基因治疗或疫苗中使用的猿猴腺病毒。此外，发现犬和牛腺病毒也可在体外感染人细胞，因此也可应用于人类。特别优选的猿猴腺病毒是分离自黑猩猩的那些。合适的例子包括C68(也称为Pan 9；US 6,083,716)以及Pan 5、6和7(WO03/046124)；也参见WO 03/000851。
因此，在低比例需要免疫的人群中遇到中和活性的那些病毒影响重组载体的选择。本发明的优点有多种。利用被认为是安全的且能悬浮生长至极高体积的细胞，并利用不含任何动物或人来源成分的培养基，可以将重组病毒例如重组腺病毒生产至非常高的滴度。而且，已知重组腺病毒引发抗腺病毒基因组中异源核酸序列编码的蛋白的强免疫应答。本发明人意识到包含多抗原的疫苗将提供针对TB致病菌更强更广泛的免疫应答。此外，尽管单抗原本身也能在小鼠纯系株中诱导保护，但是包含几种抗原的混合物(cocktail)是令人信服的应用于人类的更好疫苗，因为它很少可能会在异源人群中遇到MHC相关的无应答。
然而，从疫苗开发的实践立场来看，生产和配制由多个构建体组成的疫苗是非常昂贵的。除了简化制备方法外，单一构建体能保证抗原呈递细胞对组分的等量吸收，由此产生广泛特异性的免疫应答。
在本发明的一个特定方面，复制缺陷型重组病毒载体包括编码抗原决定簇的核酸序列，其中所述异源核酸序列是密码子优化的以提高在哺乳动物优选人类中的表达。密码子优化是基于需要的氨基酸含量、在感兴趣的哺乳动物中的常用优化密码子使用以及为确保正确表达应该避免的诸多方面。这些方面可以是剪接供体或受体位点、终止密码子、Chi-位点、poly(A)延伸序列、GC-和AT-富含序列、内部TATA盒等等。哺乳动物宿主的密码子优化方法是本领域技术人员熟知的，可以在多处分子生物学文献中发现。
在优选的实施方案中，本发明涉及本发明的复制缺陷型重组腺病毒载体，其中所述异源核酸中腺嘌呤加胸腺嘧啶的含量与胞嘧啶加鸟嘌呤含量相比少于87％、优选少于80％、更优选少于59％及最优选等于约45％。
携带异源基因的重组腺病毒载体的生产是本领域熟知的，典型地涉及利用包装细胞系、连接物构建体(adapter construct)和粘粒以及从腺病毒基因组的E1区缺失至少一个功能性部分(还可参见下文包装系统和优选的细胞系)。
本发明的疫苗典型容纳在药学可接受的载体或赋形剂中。药学可接受的载体或赋形剂是本领域熟知的，并广泛用于众多的治疗产品中。优选地，应用在疫苗中效果好的载体。更优选地，疫苗进一步包含佐剂。本领域已知佐剂可进一步增强针对所应用的抗原决定簇的免疫应答。
本发明也涉及本发明的试剂盒在治疗、预防或诊断治疗TB中的应用。
本发明的包含TB抗原的重组病毒载体可用于疫苗接种方案，其中其与BCG组合使用。它们还可以用作引发剂或加强剂，分别在BCG接种之前或之后增加所需的免疫应答。也可以预见，本文公开的不同病毒载体可用于引发-加强方案中，其中一个载体在另一个之后。此外，包含直接连接的抗原的载体可以与包含由蛋白酶位点连接的抗原的载体如此组合。也可以预见引发-加强方案用一种腺病毒血清型作为引发剂，而用另一血清型用作加强剂(选自优选的人、猿猴、犬或牛腺病毒)。本发明的病毒载体也可与包含纯化(重组生产的)抗原的疫苗和/或包含编码类似或相同抗原的裸DNA或RNA的疫苗组合使用。
因此，本发明涉及包含编码来自至少一种结核(TB)致病菌的两种或多种抗原的核酸序列的重组复制缺陷型腺病毒。可以理解，多肽可以包含几个抗原部分或抗原片段(＝抗原)。而且，蛋白本身也可以被认为是“抗原”。优选地，所述重组腺病毒是人或猿猴腺病毒。更优选地，用作本发明重组载体的腺病毒选自下组：人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。提供优选抗原的TB致病菌优选是结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和/或牛分枝杆菌，所述两个或多个抗原优选选自由结核分枝杆菌的Ag85A、Ag85B、ESAT-6、f72和TB10.4开放读框编码的抗原所组成的组中。在更优选的实施方案中，所述核酸序列编码至少两种抗原，所述抗原选自由结核分枝杆菌Ag85A、Ag85B和TB10.4开放读框编码的抗原所组成的组中。在更优选的实施方案中，本发明的腺病毒包括编码全长蛋白Ag85A、Ag85B和TB10.4的核酸序列，其中更优选这三种蛋白由包含下列序列的核酸所编码，其中在所述序列中编码各个蛋白的基因以5’至3’的顺序克隆(Ag85A-Ag85B-TB10.4)。
本发明涉及本发明的重组腺病毒，其中至少两种所述抗原表达自一个多蛋白。在一个优选的实施方案中，至少两种所述抗原连接以形成融合蛋白。连接可以直接连接或通过至少一个氨基酸的连接接头连接。当接头用于连接两个独立抗原以提供本发明的两个或多个抗原的融合蛋白时，优选使用SEQ ID NO：23的一个或多个接头。
本发明也涉及包含本发明的重组腺病毒或本发明的重组多核苷酸载体的多价TB疫苗，其进一步包括药学上可接受的赋形剂，任选择地包括佐剂。许多药学上可接受的赋形剂和佐剂是本领域已知的。
本发明进一步涉及免疫哺乳动物以预防或治疗TB的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物本发明的重组腺病毒、多价TB疫苗或重组多核苷酸载体。一方面，本发明涉及免疫哺乳动物以预防或治疗TB的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物本发明的重组腺病毒、多价TB疫苗或重组多核苷酸载体用作引发免疫的步骤；以及给予所述哺乳动物本发明的重组腺病毒、多价TB疫苗或重组多核苷酸载体用作加强免疫的步骤。本发明也涉及本发明的重组腺病毒、多价TB疫苗或重组多核苷酸载体，它们其中一种用作药物，优选在结核预防、治疗或诊断治疗中应用。本发明也涉及本发明的重组腺病毒、多价TB疫苗或重组多核苷酸载体在制备预防或治疗结核的药物中的应用。
在一个特定方面，本发明涉及包含编码两个或多个抗原及蛋白酶识别位点的核酸序列的重组多核苷酸载体，其中所述抗原被表达为多蛋白，所述多蛋白包括分隔所述两个或多个抗原中至少两个抗原的蛋白酶识别位点。优选地，所述多核苷酸载体是裸DNA载体、裸RNA载体、质粒载体或病毒载体。在优选的实施方案中，所述病毒载体包装至复制缺陷型人或猿猴腺病毒中。可以理解，病毒载体可认为是两种实体：编码病毒的病毒DNA可用作核酸载体，而通过感染宿主细胞，病毒(包含病毒载体DNA)也可用于转移感兴趣的核酸至宿主细胞。因此，本文所用的“载体”是指转移感兴趣的基因或感兴趣的多个基因至宿主的手段。其可以通过直接注射DNA、RNA、质粒或病毒核酸载体实现，也可以通过用重组病毒(此时其用作载体)感染宿主细胞而实现。如本文所示，病毒可用于免疫哺乳动物(例如小鼠)，而DNA(例如以携带感兴趣的基因和病毒DNA一部分的连接物质粒(adapter plasmid)的形式)也可直接注射于哺乳动物而免疫所述哺乳动物。基于裸DNA、RNA或质粒的疫苗是本领域已知的，而基于重组病毒的疫苗也是已知的。为清楚起见，所有输送感兴趣的基因或感兴趣的多个基因至宿主细胞的实体都被认为是“载体”。
在一个优选的实施方案中，所述载体中的核酸包括编码蛋白酶的序列，其中优选所述蛋白酶在表达时表达为多蛋白的一部分，并通过蛋白酶识别位点与至少一个所述抗原连接。特别地，优选的蛋白酶识别位点包括SEQ ID NO：21或22所示序列。更优选的是本发明的重组多核苷酸载体，其中所述蛋白酶来自禽类白血病病毒(ALV)。优选地，通过蛋白酶识别位点连接的抗原来自于至少一种结核(TB)致病菌，其中所述TB致病菌优选是结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和/或牛分枝杆菌。两种或多种抗原优选选自由结核分枝杆菌的Ag85A、Ag85B、ESAT-6和TB10.4开放读框编码的抗原所组成的组，其中最优选所述异源核酸序列编码选自由结核分枝杆菌的Ag85A，Ag85B和TB10.4开放读框编码的抗原所组成组的至少两种抗原。更优选的是本发明的多核苷酸，其中抗原是全长Ag85A、Ag85B和TB10.4多肽，其所述编码基因以5’至3’顺序克隆。基于这些和其它结核抗原的融合蛋白在US 5,916,558、WO 01/24820、WO 03/070187和WO 2005/061534中描述。然而，编码本文所公开的融合蛋白的本发明核酸用于整合入重组腺病毒载体的用途没有公开。
另一方面，本发明涉及包含编码抗原和遗传佐剂异源核酸序列的重组多核苷酸载体。术语“遗传佐剂”指核酸序列编码的蛋白质分子(proteinaceous molecule)。所述抗原和所述遗传佐剂可直接连接或者在另一实施方案中间接连接，例如通过包含第一蛋白酶识别位点进行连接。在另一优选方面，所述多核苷酸载体是裸DNA载体、裸RNA载体、质粒载体或病毒载体。病毒载体优选包装至复制缺陷型人或猿猴腺病毒，其中所述腺病毒更优选的选自由人腺病毒血清型Ad11、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50所组成的组。也优选包括编码蛋白酶的序列的核酸，其中所述蛋白酶优选通过第二蛋白酶识别位点连接于所述抗原和/或所述遗传佐剂。优选的第二蛋白酶识别位点包括SEQ ID NO：22所示序列，而优选的第一蛋白酶识别位点包括SEQ ID NO：21所示序列。优选的蛋白酶是来自禽类白血病病毒(ALV)的蛋白酶，而抗原优选来自至少一种结核(TB)致病菌，更优选来自结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和/或牛分枝杆菌。优选的抗原选自下组：Ag85A、Ag85B、ESAT-6和TB10.4。最优选的实施方案是下述载体，其中所述异源核酸序列编码选自由结核分枝杆菌的抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4所组成组的至少两种抗原，其中进一步优选含有下述融合多肽，所述融合多肽按N至C末端的顺序包含全长Ag85A、Ag85B和TB10.4蛋白。
如本文所公开的，TB10.4有预想不到的佐剂活性，因为发现其可刺激针对多蛋白中存在的其它抗原(特别是Ag85A)的免疫应答。TB10.4佐剂是优选的遗传佐剂。因此，本发明也提供了包含编码TB10.4抗原与至少一种其它抗原的核酸的重组载体，其中抗原优选是结核抗原，更优选Ag85A抗原。在更优选的实施方案中，载体包括编码TB10.4抗原和至少Ag85A和Ag85B抗原的核酸。如下所概括，TB10.4被认为可增加多抗原翻译产物至蛋白体的加工，从而致使CD8应答显著增加。很可能该效应并不仅仅限于Ag85A和TB10.4，TB10.4抗原不只局限于结核疫苗，而有更广泛的应用。因此，在另一实施方案中，本发明也涉及包含编码TB10.4和至少一种其它抗原的核酸的重组载体，其中其它抗原不是分枝杆菌(Mycobacterium)抗原。本发明公开了分枝杆菌TB10.4抗原用作遗传佐剂的用途。此外，本发明公开了TB10.4抗原在制备用于治疗、诊断和/或预防除结核之外疾病的药物中的应用，并且至少在该疾病中针对感兴趣的抗原的免疫应答需要佐剂作用的刺激。因此，本发明公开了结核分枝杆菌TB10.4中的抗原能用作其它抗原例如Ag85A的佐剂。因此，本发明也涉及应用分枝杆菌抗原TB10.4作为遗传佐剂。此外，在另一实施方案中，本发明涉及分枝杆菌抗原TB10.4在制备用于治疗或预防疾病的药物中的应用，其中宿主对某抗原或感兴趣的治疗组分的免疫应答需要被刺激。本领域技术人员能确定针对给定感兴趣抗原的免疫应答水平，以及通过利用例如本文通过TB10.4所示的遗传佐剂的佐剂的额外刺激是否对治疗对象有益。
本发明进一步涉及本发明的重组多核苷酸载体，其中所述遗传佐剂包括霍乱毒素(CtxA1)或其突变衍生物，所述突变衍生物包括63位氨基酸丝氨酸被赖氨酸所取代(A1K63)。本发明也涉及多价TB疫苗，所述疫苗包括本发明的重组多核苷酸载体，进一步包括药学上可接受的赋形剂，任选地包括佐剂。
实施例
实施例1.构建携带结核分枝杆菌抗原的基于Ad35的连接物质粒
在此记载了适合产生能够表达单个或多个TB抗原的E1缺失的、基于Ad35载体的连接物质粒的构建。例子涉及TB抗原Ag85A(Swissprot#P17944)、Ag85B(Swissprot#P31952)和TB10.4(Swissprot#O53693)作为利用基于腺病毒复制缺陷型载体产生单抗原和多抗原疫苗制品的非限制性实例的手段方法。如上所述，本文应用的原理也可应用于任何预防或治疗多肽的组合。
构建pAdApt35Bsu.myc
pAdApt35Bsu连接物质粒记载在申请人的申请WO 2004/001032中。该质粒含有Ad35基因组的左侧部分(包括左侧反向末端重复(ITR))，进一步缺失功能性E1区和包含插入至E1区的CMV启动子表达盒。该连接物也包括功能性pIX启动子和E1区下游的Ad35区域，该区域足够与包含Ad35基因组剩余部分的粘粒发生同源重组，从而导致在包装细胞中产生重组复制缺陷型腺病毒，所述包装细胞提供用于功能性复制及包装产生的病毒的所有必要元件和功能。利用这种连接物质粒产生重组腺病毒是本领域技术人员已知的方法。
pAdApt35Bsu用NheI和XbaI消化，按商品使用说明用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中分离含5kb载体的片段。双链(ds)接头从下列单链(ss)寡核苷酸制备(Sigma合成)：Myc-oligo1：5′-CTA GCA AGA AAA CCG AGC AGA AGC TGA TCT CCG AGGAGG ACC TGT GAT AAT-3′(SEQ ID NO：1)和Myc-oligo2：5′-CTAGAT TAT CAC AGG TCC TCC TCG GAG ATC AGC TTC TGC TCGGTT TTC TTG-3′(SEQ ID NO：2)。将两个寡核苷酸用2μl的0.5μg/μl的贮存液混合于总体积20μl的退火缓冲液中(10mM Tris-HCl pH7.9，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇)，之后用PCR仪98℃温育2min，接着以0.6℃/min速率冷却至4℃。接着，将所得ds接头与上述制备的pAdApt35Bsu载体在3×、6×、9×摩尔过量于接头下连接。用NheI或XbaI消化检测菌落的接头序列的插入是否是正确的方向，这些位点只有方向正确时才能恢复。测序证实接头由期望的序列组成。所得连接物质粒命名为pAdApt35Bsu.myc(图1)。
以下，提供了克隆多组不同构建体的方法。所有构建体及其相应的插入片段综述于表I。
表I.包括编码TB抗原的核酸的构建体名称及其相应的插入片段。
ALV＝禽类白血病病毒蛋白酶；dig*＝细胞蛋白酶识别的蛋白酶识别位点；dig＝ALV蛋白酶识别的蛋白酶识别位点；X＝非蛋白酶识别位点的活动接头；myc＝myc-标记
  构建体   插入片段
  TB-3   ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B
  TB-3M   ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-myc
  TB-4   Ag85A-Ag85B
  TB-4M   Ag85A-Ag85B-myc
  TB-5   Ag85A
  TB-5M   Ag85A-myc
  TB-6   Ag85B
  TB-6M   Ag85B-myc
  TB-7   TB10.4
  TB-7M   TB10.4-myc
  TB-S   Ag85A-Ag85B-TB10.4
  TB-SM   Ag85A-Ag85B-TB10.4-myc
  TB-L   ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4
  TB-LM   ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4-myc
  TB-FL   Ag85A-X-Ag85B-X-TB10.4
  TB-FLM   Ag85A-X-Ag85B-X-TB10.4-myc
含有三种TB抗原的基于pAdApt35Bsu的连接物质粒的构建
本发明的异源核酸以来自一个mRNA的多蛋白编码三种结核分枝杆菌抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4。所有标示有′M′的融合序列含有myc表位(myc-标记：SKKTEQKLISEEDL；SEQ ID NO：9)连接于序列的3’端，以允许在独立的TB抗原特异性抗体不能正确识别融合体的情况下用myc特异性抗体来分析表达。因此，下文记载的所有构建体命名中的′M′都与myc-标记相关，而也制备了无myc-标记的所有构建体。
在第一实施方案中(TB-SM)，三种抗原以直接融合多蛋白表达：Ag85A-Ag85B-TB10.4-myc(TB-S＝Ag85A-Ag85B-TB10.4)。
在第二实施方案中(TB-LM)，多蛋白前体含有蛋白酶，其在整合的消化位点处胞内切割由所述消化位点分隔的三种抗原：接头/消化位点序列：PPSKSKKGGAAAMS SAIQPLVMAVVNRERDGQTG(SEQ ID NO：21)。该消化通过融合于融合蛋白N末端的序列特异性蛋白酶进行。来自禽类白血病病毒(ALV)的gag基因的这种蛋白酶也被酶切，蛋白酶消化后产生四个分离的蛋白。该多蛋白如下：ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4-myc(其中′dig*′表示分隔蛋白酶与抗原的蛋白酶消化位点[GSSGPWPAPEPPAVSLAMTMEHRDRPLV；SEQ ID NO：22]，而′dig′表示抗原间的消化位点，参见上文；TB-L＝ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4)。蛋白酶切割接头和自切割接头都可以用于本发明的载体中并包含在本文中。自加工切割位点的应用在WO 2005/017149中有记载。
在第三实施方案中，多蛋白(TB-FLM)包括未被切割(如上述第二实施方案)的接头序列分隔的上述结核分枝杆菌抗原，但允许三种抗原每一种正确独立折叠：Ag85A-X-Ag85B-X-TB10.4-myc(其中′X′表示柔性接头：GTGGSGGTGSGTGGSV；SEQ ID NO：23)。用类似构建方法也制备了不带myc-标记的所有这些融合蛋白(分别指TB-S、TB-L和TB-FL)(参见下文)。
用上文公开的结核分枝杆菌抗原的蛋白序列、Genbank公开的ALV蛋白酶PR p15序列(Acc.No.CAA86524)和Genbank Acc.No.AAK13202氨基酸476-500所公开的蛋白酶消化位点组装所需的蛋白序列。接着，将这三种蛋白序列逆翻译为优化用于在人中表达的DNA编码序列，然后合成、组装并克隆至Geneart(Germany)的pCR-Script载体中。
提供了经过密码子优化的TB-LM(Fig.19；SEQ ID N0：3)、TB-SM(Fig.20；SEQ ID NO：4)和TB-FLM(Fig.21；SEQ ID NO：5)的DNA序列以及TB-LM(Fig.22；SEQ ID NO：6)、TB-SM(Fig.23；SEQ ID NO：7)和TB-FLM(Fig.24；SEQ ID NO：8)的蛋白序列。myc表位包含于每个融合蛋白的C-末端序列SKKTEQKLISEEDL(SEQ ID NO：9)中，该序列在TB-S、TB-L和TB-FL中分别不存在。
接着将克隆的融合基因用HindIII、XbaI和ApaLI消化，之后将2.7kb(TB-L)、2.2kb(TB-FL)和2.1kb(TB-S)片段从如上从琼脂糖凝胶中分离。ApaLI消化可将质粒载体切为片段以便更好与插入片段分离。将质粒pAdApt35Bsu也用HindIII和XbaI消化，含载体片段如上述从凝胶中分离。分离的pAdApt35Bsu载体与各个含TB序列的分离片段在独立的反应中相连接并转化至DH5α感受态菌中(Invitrogen)。所得菌落用HindIII和XbaI消化分析，选择含预期插入片段的质粒克隆。获得pAdApt35Bsu.TB.LM(图2)、pAdApt35Bsu.TB.SM(图3)和pAdApt35Bsu.TB.FLM(图4)，所有克隆都含有myc-标记。为产生表达无myc-标记的融合基因的连接物质粒，将插入片段先用下列引物和模板PCR扩增：
片段TB-L
ALVprot.FW：5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GCT GGC CAT GACCAT GG-3′(SEQ ID NO：10)和10.4.RE.stop：5′-GCT AGT CTA GATTAT CAG CCG CCC CAC TTG GC-3′(SEQ ID NO：11)，以TB-LM作模板。
片段TB-FL和TB-S
85A.FW：5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG C-3′(SEQ IDNO：12)和10.4.RE.stop，以TB-FLM或TB-SM作模板。
按制造商使用说明，用Phusion DNA聚合酶(Bioke)进行扩增。使用下列程序：98℃2分钟，接着30个循环(98℃20秒，58℃30秒和72℃2分30秒)，72℃10分钟结束。所得片段用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，用HindIII和XbaI消化。接着将消化片段如上述通过Qiaquick PCR纯化柱纯化，并与用相同酶消化且通过Qiaquick PCR纯化柱纯化的pAdApt35Bsu连接。转化至DH5α感受态菌(Invitrogen)，用HindIII和XbaI作诊断酶选择含正确插入片段的克隆，得到pAdApt35Bsu.TB-L、pAdApt35Bsu.TB-S和pAdApt35Bsu.TB-FL。这些构建体不同于图2、3和4提供的构建体，因为这些构建体在C末端不含myc表位。
含有两种TB抗原的基于pAdApt35Bsu的连接物质粒的构建
使用Ag85A和Ag85B作为例子，本文还记载了含有两种TB抗原的连接物质粒的构建。对于本领域技术人员显而易见的是，用本文概述的一般策略也可以制备其它组合和不同顺序的结核分枝杆菌抗原。此处记载的融合体是TB-3M：ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-myc和TB-4M：Ag85A-Ag85B-myc，以及没有myc标记的相同构建体。设计特异性引物以从上述TB-LM和TB-SM融合蛋白扩增Ag85A和Ag85B序列(参见下文)。产生如上有和没有myc标记的融合体(分别为TB-3和TB-4)。为此，使用不同的引物组及模板。
片段TB.3M：
ALVprot.FW和85B.RE myc：5′-GCC TAG CTA GCG CCG GCT CCCAGG CTG C-3′(SEQ ID NO：13)，以TB-LM为模板。
片段TB.4M：
85A.FW.TB.L：5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG CAGACC CGG CCT G-3′(SEQ ID NO：14)和85B.RE myc(参见上文)，以TB-SM为模板。
所有反应按上文记载的条件用Phusion(Bioke)DNA聚合酶进行。将PCR片段用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化，用HindIII和NheI消化，再用PCR纯化试剂盒纯化。然后将扩增片段连接于用相同酶消化的pAdApt35Bsu.myc质粒。转化至感受态DH5α菌(Invitrogen)后，筛选含正确长度的插入片段的克隆。获得构建体pAdApt35Bsu.TB.3M(图5)和pAdApt35Bsu.TB.4M(图6)。
用相同的上述用于片段TB.3M和TB.4M的正向引物和模板但用不同的反向引物85B.RE.stop：5′-GCT AGT CTA GAT TAT CAG CCGGCT CCC AGG CTG C-3′(SEQ ID NO：15)产生片段TB.3和TB.4。将扩增片段如上述纯化，用HindIII和XbaI消化，如其中记载的再次纯化，并用HindIII和XbaI作为克隆位点克隆至pAdApt35Bsu。这样就得到了仅不同于图5和图6的构建体的pAdApt35Bsu.TB.3和pAdApt35Bsu.TB.4，因为它们在C末端不含myc-表位。
本文有用但没有详细记载克隆过程的其它组合是：
ALV-dig*-Ag85B-dig-Ag85A-myc
ALV-dig*-Ag85A-dig-TB10.4-dig-Ag85B-myc
ALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85A-dig-Ag85B-myc
ALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85B-dig-Ag85A-myc
ALV-dig*-Ag85B-dig-Ag85A-dig-TB10.4-myc
ALV-dig*-Ag85B-dig-TB10.4-dig-Ag85A-myc
ALV-dig*-Ag85A-dig-TB10.4-myc
ALV-dig*-Ag85B-dig-TB10.4-myc
ALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85A-myc
ALV-dig*-TB10.4-dig-Ag85B-myc
Ag85B-Ag84A-myc
Ag85A-TB10.4-myc
Ag85B-TB10.4-myc
TB10.4-Ag85A-myc
TB10.4-Ag85B-myc
Ag85A-X-Ag85B-myc
Ag85B-X-Ag85A-myc
Ag85A-X-TB10.4-myc
Ag85B-X-TB10.4-myc
TB10.4-X-Ag85A-myc
TB10.4-X-Ag85B-myc
Ag85A-X-TB10.4-X-Ag85B-myc
Ag85B-X-Ag85A-X-TB10.4-myc
Ag85B-X-TB10.4-X-Ag85A-myc
TB10.4-X-Ag85A-X-Ag85B-myc
TB10.4-X-Ag85B-X-Ag85A-myc
Dig*、dig、myc以及X都如上述表示相同特征。可以理解也可以产生无myc-标记的这些构建体。
含单TB抗原的基于pAdApt35Bsu的连接物质粒的构建
本文也记载了含单TB抗原的Ad35连接物质粒。如上所述，蛋白以含或不含myc-标记表达。为此，用特异性引物组从TB-L和TB-S模板扩增合适的编码区：
片段TB.5M：
85A.FW.TB.L和85A.RE myc：5′-GCC TAG CTA GCG CCC TGGGGG G-3′(SEQ ID NO：16)，用TB-LM作模板。
片段TB.6M：
85B.FW：5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GTT CAG CCG GCCTGG CCT G-3′(SEQ ID NO：17)和85B.RE myc，用TB-LM作模板。
片段TB.7M：
10.4.FW：5′-GCC CAA GCT TGC CAC CAT GAG CCA GAT CATGTA CAA CTA CCC-3′(SEQ ID NO：18)和10.4.RE myc：5′-GCTAGT CTA GAT TAT CAC AGG TCC TCC TCG-3′(SEQ ID NO：19)，用TB-LM作模板。
用相同的正向引物但不同的反向引物：85A.RE.stop(TB.5)：5′-GCT AGT CTA GAT TAT CAG CCC TGG GGG GCA G-3′(SEQ IDNO：20)、85B.RE.stop(TB.6)和10.4.RE.stop(TB.7)产生无myc-标记的片段。所有反应如上所述用Phusion(Bioke)进行。所有扩增片段用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。接着TB-5M和TB-6M片段用HindIII和NheI消化，如上所述纯化之后，克隆至用相同酶消化过的pAdApt35Bsu.myc。将片段TB-7M、TB-5、TB-6和TB-7用HindIII和XbaI消化。如上纯化之后，将片段连接至用如上所示的限制性酶消化过的pAdApt35Bsu。这样获得了pAdApt35Bsu.TB.5M(图7)、pAdApt35Bsu.TB.6M(图8)、pAdApt35Bsu.TB.7M(图9)、pAdApt35Bsu.TB.5、pAdApt35Bsu.TB.6和pAdApt35Bsu.TB.7。后三种与图7、8和9中的不同仅在于C末端没有myc-标记。
实施例2.产生携带编码TB抗原的核酸的复制缺陷型Ad35病毒
产生携带异源表达盒的稳定的复制缺陷型重组的基于Ad35的腺病毒载体的方法是本领域技术人员熟知的，并且已经记载在公开专利申请WO 00/70071、WO 02/40665、WO 03/104467和WO 2004/001032中。本实施例记载了用PER.
Figure BSA00000473287700281
细胞和Ad35病毒产生基于Ad35的TB载体，所述Ad35病毒包含在Ad35骨架中取代了同源E4-Orf6和6/7序列的Ad5衍生的E4-Orf6和E4-Orf6/7基因(通常记载于WO03/104467和WO 2004/001032)。对本发明而言，PER.
Figure BSA00000473287700282
细胞是指作为专利保藏物以保藏号96022940于1996年2月29日保藏于位于Centre of Applied Microbiology & Research(CAMR)，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP40JG United Kingdom的欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)的细胞。
本文记载了产生的含有不同TB抗原的连接物质粒用Pi-PspI消化以从质粒骨架释放Ad35序列和转基因盒(连接物片段)。将构建体pWE.Ad35.pIX-EcoRV(参见WO 03/104467和WO 2004/001032)用NotI和EcoRV消化(片段2)，将构建体pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6(参见WO 03/104467和WO 2004/001032)用PacI和NotI消化(片段3)。将消化的DNA混合物在65℃温育使酶失活。对每一转染，将消化的连接物片段(360ng)、片段2(1.4μg)和片段3(1μg)混合至(最大)体积15μl，然后用DMEM(培养基，Invitrogen)调整至25μl。通过混合14.4μl Lipofectamine(Invitrogen)与10.6μl DMEM制备第二混合物，之后将两混合物加在一起，轻拍管混匀。然后，将所获DNA-Lipofectamine混合物室温温育30-40分钟，之后向管中加入4.5ml DMEM。前一天PER.C6细胞以1.5x106细胞/孔接种于含10％FBS(Invitrogen/GIBCO)和10mM MgCl2的DMEM的6孔板中，温育期间，用DMEM洗涤细胞。接着，在头两孔加入0.5ml DMEM和0.5ml温育的转染混合物。在第二个两孔，加入0.25ml培养基和0.75ml转染混合物。最后二孔，则接受1ml的转染混合物。将6孔板接着在37℃、10％CO2下温育4h之后，如下覆盖琼脂覆层。4h温育期结束之前30分钟，制备含9ml 2×MEM(Invitrogen)、0.36ml FBS、0.18ml的1M MgCl2和1.3ml PBS的混合物，于37℃放置。将无菌预制的2.5％琼脂糖(Seaplaque；Cambrex)在H2O中融化，也保温于37℃(使用前至少15分钟)。然后从细胞中除去转染培养基，并用PBS洗一次。接着，将7.5ml琼脂溶液加入MEM培养基混合物，混和，每孔迅速加入3ml。允许该覆层在气流中凝结，之后将板于37℃/10％CO2温育至少7天。在足够大时，用带无菌过滤头(20μl)的移液管从具有最低数量斑的孔中挑取单斑。将各挑取的斑在200μl培养基中混合，100μl用于接种6孔板中的PER.C6细胞。于CPE和病毒在T25瓶中的PER.C6细胞中再扩增一次之后，收获细胞和培养基，然后冻融一次，作为粗裂解物储存。这些病毒贮存物用于通过对分离的病毒DNA进行PCR来确证正确转基因的存在并检测表达。接着，按本领域已知的方法，用两步CsCl纯化法，选择一扩增斑以产生病毒种原种并用于生产的批量纯化病毒。纯化病毒的浓度通常按Shabramet al.(1997)记载的HPLC确定。
实施例3.Ad35病毒载体感染时TB抗原表达分析
融合的TB抗原的表达用western印迹确定。为此，A549细胞用不同的含有编码TB抗原的基因的Ad35病毒感染。感染48h后，将细胞用PBS(NPBI)洗二次，在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，0.5％DOC，1％Tween-20于dH2O中，添加1％SDS和以丸剂(Roche)加入的蛋白酶抑制剂)中裂解并刮擦。在冰上于裂解缓冲液中5-10分钟后，收集裂解物，离心除去杂质。将等量的全细胞提取物用4-12％Bis-Tris
Figure BSA00000473287700301
Pre-Cast Gels(Invitrogen)分级分离。将蛋白转移至Immobilon-P膜(Millipore)与结核分枝杆菌培养物滤过蛋白(Culture Filtrate Protein)的多克隆抗体温育。该多克隆血清是从抗含分泌蛋白的结核分枝杆菌培养物的兔中制备。原则上，多克隆血清含有抗Ag85A、Ag85B和TB10.4的抗体，所述抗原都是分泌蛋白。二抗是辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体(Biorad)。Western印迹方法和温育按本领域已知的一般方法进行。按制造商所提供方法，将复合物用ECL检测系统(Amersham)检测。
图10A显示了使用携带如上所述的包括myc表位的TB编码核酸的Ad35病毒的结果。图10A的不同泳道显示了使用的不同病毒载体，表I则显示了名称与插入片段的对应关系。以相同方式，也测量了不含myc表位的Ad35病毒的TB抗原的表达(图10B)。图10C显示了相似的结果，分子量显示在右边。Ad35病毒所表达的特异性TB(融合)蛋白用此方法检测，此外还有一些TB-3和TB-L的切割产物。从图10A可以推断包括所有三种TB抗原的多蛋白被表达，因为TB-LM道与TB-3M道相比有更高的条带出现(而且TB-S道条带比TB-4M特异性条带高)。由于TB10.4是TB-LM和TB-SM多蛋白的最C末端多肽，这显示整个多蛋白被翻译。也应该注意切割并不完全，尽管切割产物在TB-3M和TB-LM道中能看见。Ag85A和Ag85B抗原(分别为道TB-5(M)和TB-6(M))被表达。与TB10.4抗原相关的道TB-7(M)中发现没有特异染色。这可能是抗原在western印迹中没有被CFP多克隆识别，同时也可能该蛋白从凝胶跑出，或者当存在于单表达构建体(TB-7M)时该蛋白在A549细胞中少量表达，和存在于三联构建体(TB-LM、TB-L和TB-S)时。图10A中，道TB-LM在最高带(可能未裂解)下有一个稍短带可见。这提示了从多蛋白剩余部分切割了TB10.4抗原。
进一步的实验应该揭示了蛋白的物理存在，尽管已经清楚TB10.4抗原对免疫应答有贡献(参见下文)，这强烈显示该抗原存在并积极参与免疫应答。
实施例4.小鼠中编码结核分枝杆菌抗原的载体的免疫原性
首先，在小鼠中研究实施例1所述的连接物质粒(DNA构建体)的免疫原性。该构建体编码一种、两种或三种TB抗原：Ag85A、Ag85B和TB10.4。编码多个TB抗原的DNA构建体以如上所述的两种方式设计，即表达包含直接融合体并且不含myc标记的多蛋白以及表达包含编码蛋白酶和蛋白酶识别位点的序列的多蛋白，所述蛋白酶和蛋白酶识别位点使多蛋白(也不含myc标记)切割为分离的多肽。使用下列DNA构建体(参见实施例1)：
单抗原构建体
TB-5(Ag85A)、TB-6(Ag85B)和TB-7(TB 10.4)
双抗原构建体
TB-3(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B)和TB-4(Ag85A-Ag85B直接融合)
三抗原构建体
TB-L(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4)和TB-S(Ag85A-Ag85B-TB10.4直接融合)
实验设计如图11所示。七组小鼠用各自的TB DNA构建体免疫(两次实验，参见下文)。对每次免疫，DNA肌内注射三次(3×50μg)，间隔2.5周。作为阴性对照，将一组小鼠注射三次PBS。其它对照组则皮下注射单剂量的6×105cfu BCG(SSI1331株)。
最后一次DNA免疫后一周，及BCG免疫后六周，处死小鼠。分离脾脏以作为细胞免疫分析的细胞源。需要用于体液应答分析的血清通过每组心脏穿刺采血汇集。
在体外用相应抗原的肽库重新刺激后，利用胞内IFNγ染色(ICS)FACS分析，通过测量IFNγ+CD4+和IFNγ+CD8+脾细胞的频率确定特异性细胞免疫应答的水平。免疫血清用A549细胞的免疫荧光检测，所述A549细胞转导有编码相应抗原的腺病毒。
进行两个独立的免疫实验。第一个实验，每组使用3只小鼠，对每只小鼠分别分析免疫应答。第二个实验，每组8只小鼠用于DNA免疫，每组4只小鼠用于对照免疫。体外肽刺激之后，将相同组两只-两只小鼠的样品混合，染色用于FACS分析。两实验获得相似结果，将数据汇总进行统计学分析。
胞内IFNγ染色(ICS)如下进行。在存在共刺激抗体：最终稀释为1∶1000的抗小鼠CD49d和抗小鼠CD28(Pharmingen)的情况下，用所示合适的肽库(每肽的终浓度为2μg/ml)对脾细胞(106/孔，96孔板)进行两次刺激。如下文实施例6和7中所概述，肽库由跨越全抗原的15-聚体(15-mer)肽组成，含有10聚体(Ag84B)或11聚体(Ag85A、TB10.4)重叠序列，或者调整为具有来自Ag85A的肽p1和p2的Ag85B。BCG和PBS免疫小鼠的样品另外用CFP(培养物滤过蛋白；终浓度10μg/ml)和PPD(纯化蛋白衍生物；终浓度10μg/ml)刺激，CFP和PPD是BCG免疫时体外刺激常用的抗原。作为阳性对照，将样品用PMA/离子霉素(终浓度分别为50ng/ml和2μg/ml)刺激，而与培养基的温育作为阴性对照(无刺激)。37℃刺激1h后，加入分泌阻断剂GolgiPlug(Pharmingen；终稀释度1∶200)，继续温育另外5h。将相应双份样品混合，进行FACS分析。简单地说，将细胞用含0.5％BSA的PBS洗涤，与FcR阻断剂(Pharmingen；1∶50稀释)冰上温育10分钟。洗涤步骤之后，将细胞与CD4-FITC(Pharmingen；1∶250稀释)和CD8-APC(Pharmingen；1∶50稀释)冰上温育30分钟。洗涤后，将细胞用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen)冰上固定及permabilized 20分钟，之后用Perm/Wash缓冲液(Pharmingen)洗涤。胞内IFNγ用抗IFNγ-PE(Pharmingen；1∶100稀释)冰上染色30min。终洗涤步骤后，将细胞重悬于CellFix(BD)，用流式细胞仪分析。每样品测量至少10000个CD8+细胞。结果以表达IFNγ的CD4+或CD8+细胞的百分率表示。
体外再刺激样品的概述示于表II。ICS结果提供在图12-16中。
表II.体外再刺激样品综述
图12A和B显示细胞未被刺激时，背景水平相当低。图13A显示用Ag85A肽库刺激后有高频率的IFNγ+CD4+脾细胞。取自注射有携带Ag85B编码基因的构建体的小鼠的CD4+细胞有清楚的交叉反应性，这不是不可预料的，因为Ag85A与Ag85B有高度的结构同源性。与CD4+细胞所发现的相对照，来自注射了单独编码Ag85A或编码Ag85B(泳道Ag85A、Ag85B、TB-3L和TB-4S)的构建体的小鼠的细胞没有检测到CD8+脾细胞的刺激(参见图13B)。然而，注射三联构建体TB-L和TB-S的小鼠中IFNγ+CD8+脾细胞激增，清楚表明这些构建体中存在的额外抗原(TB10.4)的重要作用。很显然该组中，TB10.4抗原能强烈增加对Ag85A肽具有反应性的CD8+脾细胞的频率，而Ag85A单独(或与Ag85B组合)则不能提供应答。图14A显示Ag85B在所出现的所有组中均能增加IFNγ+CD4+脾细胞的频率，而对IFNγ+CD8+脾细胞的作用很小(参见图14B)。此处也发现了Ag85B和Ag85A如上所讨论的交叉反应性(图14A)。图15A显示应答TB10.4相关肽库的IFNγ+CD4+脾细胞的频率，其中在注射单独具有TB10.4的构建体或包含三联插入序列的构建体的小鼠之间没有发现真正的差异。然而，如图15B所示，注射包含编码TB10.4抗原的基因的构建体的小鼠的IFNγ+CD8+脾细胞频率在用TB10.4相关肽刺激时激增，特别是使用三联插入片段时(注意y轴，显示平均1.5％的脾细胞有反应性)。结果总结在图16A(TB-L中的三联插入片段：有蛋白酶和蛋白酶消化位点)和图16B(TB-S：直接连接的抗原)。具体地，不同抗原以不同方式贡献于免疫应答：Ag85A诱导CD4和CD8应答；Ag85B则仅诱导强CD4应答，几乎没有任何CD8应答。与Ag85B相反，TB10.4抗原激发强CD8应答和很低的CD4应答。这表明三联插入片段中所述序列编码的不同抗原有明显有益的辅助作用。
BCG免疫没有导致显著的ICS应答。然而，BCG免疫小鼠的脾细胞用CFP或PPD刺激72h后，用IFNγELISA试剂盒检测，产生了高水平IFNγ，这表明小鼠被有效免疫(数据未显示)。
为确定任何抗原特异性抗体是否都能在注射不同DNA构建体的小鼠中实际产生，将A549细胞在96孔板中用编码TB抗原的Ad35重组腺病毒转导。腺病毒按实施例2所述产生。为此，每孔接种1×104细胞，以感染复数5000进行病毒感染。感染两天后，将细胞用Cytofix/Cytoperm固定(4℃20分钟)，之后用Perm/Wash缓冲液洗涤。将细胞与以1∶2稀释于Perm/Wash缓冲液的免疫小鼠的血清在37℃温育1h。洗涤之后，加入1∶5稀释于Perm/Wash缓冲液的山羊抗小鼠-FITC，37℃温育30分钟。终洗涤之后，用荧光显微镜分析细胞。
免疫荧光分析显示获自用TB-6(仅Ag85B)、TB-3(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B)、TB-4(Ag85A-Ag85B直接融合)以及TB-L(ALV-dig*-Ag85A-dig-Ag85B-dig-TB10.4)免疫的小鼠血清有强烈的细胞抗原特异性染色。TB-S(Ag85A-Ag85B-TB10.4直接融合)免疫的小鼠的血清观察到了弱染色，而TB-5(仅Ag85A)和TB-7(仅TB 10.4)免疫获得的血清没有任何染色。这表明至少某些抗原能诱发抗体应答。在本实验中没有确定多蛋白剩余部分的蛋白酶完全切割以及各抗原表达水平。
实施例5.构建编码抗原和佐剂的rAd载体
本实施例构建了新的重组复制缺陷型腺病毒载体，在此命名为Ad35-X-A1K63，其共表达一种抗原(表示为X)和CtxA1突变衍生物，所述CtxA1突变衍生物在亲代CtxA1的第63位氨基酸的丝氨酸被赖氨酸所取代(即本文表示为A1K63)。
通过使用本领域技术人员已知的标准PCR方法导入PCR扩增的X并导入合适的克隆限制性位点构建连接物质粒，它适于产生能够表达X和A1K63的E1缺失的基于Ad35的载体。将所得PCR产生的DNA片段用相应限制性内切酶消化，然后退火至通常如上记载的用于Ag85A、Ag85和TB10.4的连接物质粒。对克隆的PCR片段进行另外的限制性内切酶消化、PCR和测序分析，以确证DNA在构建期间没有被改变。
从包含CtxA1拷贝的pOGLl-A质粒扩增编码A1K63的DNA。CtxA1的核苷酸序列获自GenBank(Accession#A16422)，用赖氨酸密码子AAA取代丝氨酸-63TCA密码子(nt 187-189)对其进行修饰。突变衍生物用
Figure BSA00000473287700361
定点诱变试剂盒(Stratagene)产生。定点诱变方法需要全质粒PCR，用pOGLl-A1 DNA作模板，正向引物5′-TGTTTC CCA CCA AAA TTA GTT TGA GAA GTG C-3′(SEQ ID NO：24)和反向引物5′CAAACT AAT TTT GGT GGA AAC ATA TCC ATC-3′(SEQ ID NO：25)。该过程通过将TCA密码子用AAA密码子取代而修饰187-189核苷酸(参见下划线序列)。所得PCR产生的质粒用DpnI消化以去除模板DNA，然后将消化的DNA通过化学转化导入大肠杆菌(E.coli)，30℃于琼脂生长16hr。选择分离菌落，从过夜的液体培养物中抽提DNA。用A1K63特异性引物进行质粒PCR以及进行琼脂糖凝胶电泳以筛选合适的衍生物。接着将该突变插入片段克隆至含X的相同连接物质粒中，在X上游或下游，并将腺病毒按上述生产。
实施例6.小鼠中Ad35.TB载体的剂量应答
对表达不同单个或融合TB抗原的Ad35重组病毒检测小鼠中的抗原性。定量蛋白或肽库刺激后产生干扰素-γ(IFN-γ)的T细胞的方法通常用本领域已知的方法进行，例如WO 2004/037294、Sander etal.(1991)以及Jung et al.(1993)中所记载。具体如下所述。
将三联插入片段载体TB-S用于剂量应答免疫原性测试。将四种不同剂量的病毒颗粒(107、108、109、1010vp)肌内注射至不同组C57BL/6小鼠(每组5只)，同时3只小鼠作为阴性对照，注射1010vp的空病毒载体。免疫两周后将小鼠处死，分离脾细胞以作为细胞免疫研究的细胞源。使用胞内IFNγ染色(ICS)FACS分析，如上所述测量IFNγCD4+和CD8+脾细胞频率，确定抗原特异性细胞免疫应答的水平。结果显示在图17中。具体地，基于Ad35的TB-S载体以剂量依赖方式诱导抗原特异性的免疫应答，特别涉及Ag85B特异性CD4细胞应答的增加(图17C)。没有发现涉及TB10.4特异性CD4细胞的应答(图17E)，也没有发现涉及Ag85B特异性CD8细胞的应答(图17D)。对Ag85A和TB10.4特异性CD8细胞，107和108剂量很难检测到任何应答(分别见图17B和17F)，而用109和1010剂量则发现应答显著增加。107剂量在任意组中都没有显著效应，而108剂量则导致了Ag85A和Ag85B特异性CD4细胞的增加(分别图17A和17C)。用TB-L构建体也发现相似数据(数据未显示)。
在评估小鼠中结核分枝杆菌抗原CD8免疫显性序列表位作图发现Ag85A的称为p1(FSRPGLPVEYLQVPS；SEQ ID NO：26)和p2(GLPVEYLQVPSPSMG；SEQ ID NO：27)的肽是C57BL/6小鼠的仅有的CD8免疫显性表位。划线部分应该理论上适合C57BL/6小鼠的MHC分子。在蛋白该区域的Ag85A抗原序列(氨基酸1-19：FSRPGLPVEYLQVPSPSMG；SEQ ID NO：28)与相同区域的Ag85B的序列相同。然而，Ag85B库的p1和p2肽尽管包括Ag85A肽的相同序列，但却没有任何CD8应答(参见图17D)。这提示来自Ag85B的肽p1和p2有异常，可能因为是制备原因或者污染原因。因此，进行额外的剂量应答实验，其中Ag85B体外刺激肽库用来自Ag85A库的p1和p2重构(reconstituted)。用TB-S和TB-L载体以107、108、109和1010vp剂量进行实验。一般如上所述，免疫两周后确定T细胞应答。作为阴性对照，一组小鼠用PBS注射，另一组用空Ad35病毒(1010vp)注射。CD8细胞相关结果提供在图17G中(TB-L，左图；TB-S，右图)。显然，在体外用调整的Ag85B库刺激后，测定到CD8阳性细胞，尽管来自Ag85A抗原的肽与来自Ag85B抗原的肽相同，而Ag85B抗原肽最初曾被使用但并没有产生任何阳性结果。然而这些结果显示，在所述病毒感染后，基于Ad35的腺病毒编码Ag85B蛋白也能诱导CD8阳性T细胞应答。
实施例7.BCG引发后基于Ad35的TB载体用作加强剂
在另一实验中，用表达TB抗原的Ad35载体作为BCG免疫的加强剂进行测试。为此，按FDA发布方案(标准和实验部分CBER)，给每组小鼠皮下注射BCG疫苗(卡介苗；参考标准FDA，该疫苗是结核免疫领域常规已知的)。
四组小鼠(每组8只)用BCG皮下(6x105cfu/小鼠)引发十周之后，用携带三种直接连接的TB抗原的基于Ad35的腺病毒载体(TB-S)或者载有下列抗原组合的腺病毒Ad35载体感染：
-仅TB-4(包含Ag85A和Ag85B直接融合)
-TB-4+TB-7(仅包含TB10.4)
-TB-5(仅包含Ag85A)+TB-6(仅包含Ag85B)+TB-7
两对照组(每组4只)用PBS或BCG引发，之后，PBS组接受PBS模拟免疫，BCG引发对照组则接受109vp的空Ad35载体。基于Ad35的载体注射，在所有情况下都是用109vp肌内注射。感染4周后(引发后14周)将小鼠处死，按上述方法分离使用脾细胞。结果显示在图18中。Ag85A抗原的存在导致了针对Ag85A特异性CD4细胞的显著效应(图18A)。如所预料的(也参见图13B)，三联构建体TB-S诱导了Ag85A特异性CD8应答，而TB-4载体则不能诱导该应答(图18B)。类似结果先前已经发现(图13B)，表明Ag85A单独存在或与Ag85B组合存在都不能引起CD8应答，而当TB10.4存在时发现该应答。有趣的是，当各载体以单针注射时(图18B中的TB-4/TB-7或TB-5/TB-6/TB-7)也没有检测到任何效应，这表明当共注射时，TB10.4抗原不能诱导Ag85A特异性CD8应答，而当抗原出现在同一构建体或者至少同一细胞时就可以。TB10.4的佐剂效应机理仍未知。
Ag85B抗原观察到的效应与先前发现的一致(图18C和D)。必须注意，三联构建体TB-S中TB10.4抗原的存在并没有引起Ag85B特异性CD8应答，这与Ag85A中发现的相反。两种抗原都很好地从构建体表达，如图10B所示。阴性效应可能是因为用于测量针对Ag85B的任何CD8应答的肽库已被破坏(参见实施例6和下文)。
用TB10.4诱导的CD4+细胞非常少(图18E)。使用分离载体中(TB-5/TB-6/TB-7)TB10.4的CD8+细胞诱导比较显著(注意y轴刻度；也参见图15B)。用TB-S的TB10.4特异性CD8细胞诱导极高(图18F)，有平均约12％的IFNγ阳性CD8细胞。
可以得出结论，TB10.4抗原能诱导针对抗原的CD8应答，但当作为单一构建体时，其并不能引发CD8应答(Ag85A)。已知CD8细胞激活需要比CD4细胞激活某些更高的抗原阈值，这至少部分是因为参与MHC I类分子的抗原加工和呈递的复杂机理(Storin andBachmann.2004)。在此，本文发现当TB10.4与抗原Ag85A和Ag85B在三抗原构建体中偶联时，可引发强CD8应答，该应答不仅抗TB10.4自己而且也抗Ag85A。这可能是构建体中TB10.4的物理存在增加了融合蛋白输送至蛋白体的效率，所述蛋白体是有效呈递至CD8细胞和CD8细胞激活所必需的。较高的TB10.4特异性CD8细胞应答的原因最可能是因为与仅携带TB10.4抗原的载体相比，三联构建体的表达水平增加。虽然针对单独TB10.4的CD8应答也很显著，但由于缺乏TB10.4特异性抗血清用于western印迹而没有测量TB10.4表达水平。
靶向蛋白体的增加可能是TB10.4分子中有特异性位点的结果，所述位点例如是涉及结合泛素(或者其它负责标记被加工的蛋白的分子)、或转运蛋白的序列或者其它可增加MHC I类分子的加工和呈递的序列(Wang et al.2004)。或者，构建体中TB10.4蛋白的存在可能使融合蛋白物理上去稳定化，从而导致分子降解速率增加。抗原加工水平增加通常导致CD8细胞激活增加。此外，如果很多蛋白在蛋白体中完成加工用于I类呈递，该蛋白在胞质和胞外存在的就越少，由此不能激活B细胞。已经报道，在抗原加工(即CD8激活)和抗原特异性抗体滴度之间存在反比关系(Delogu et al.2000)。有意思的是，在双抗原构建体免疫的小鼠血清中观察到了比三抗原构建体免疫小鼠更强很多的抗原免疫荧光。该结果提示我们的含有TB 10.4的三抗原分子对蛋白体降解和CD8细胞激活是高度易感的，由此较少的用于抗体诱导。由于强T细胞应答是抗结核的优选应答，所以可以得出结论，包含编码TB10.4抗原和至少一种其它TB抗原、优选Ag85A、更优选Ag85A和Ag85B的核酸的、基于Ad35的三抗原载体非常适合用于抗结核疫苗。如图18显示结果所示，通过用BCG作引发剂可以进一步增加所发现的效应。
用具有Ag85A肽p1和p2加入的Ag85B新肽库(如实施例6所述)，也可以重复BCG引发、Ad35-TB加强的引发/加强研究，尽管当前脾细胞是从引发后26周被处死的小鼠中分离的(免疫后16周)。用PBS、Ad35.Empty、Ad35.TB-S或者Ad35.TB-L以109或1010vp各病毒载体免疫小鼠(每组8只)。结果显示在图25(Ag85A刺激)、26(Ag85B刺激)和27(TB10.4刺激)中。该结果清楚地表明时间期延长后仍能检测到显著的CD4和CD8应答。
实施例8.豚鼠的引发-加强-攻击实验
在接下来的实验中，将调查BCG引发之后再用基于Ad35的TB载体加强，是否能在攻击程序中保护针对结核分枝杆菌的感染。
将豚鼠用通常如上所示的BCG进行初始引发(6x105cfu/动物)。14周后，将动物用1010vp的Ad35.TB-S(Ag85A-Ag85B-TB10.4)或Ad35.TB-4(Ag85A-Ag85B)重组病毒免疫，或者注射PBS(对照组)。8周后，每只动物接受～100cfu结核分枝杆菌的攻击。直至引发后约78周监测动物的存活情况。中间观察提示BCG引发后用Ad35-TB加强确保了比单用BCG更高的存活率。
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Figure ISA00000473287900041
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Figure ISA00000473287900221
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Claims (7)

1.一种重组核酸分子，由编码结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的Ag85A、Ag85B和TB10.4抗原的受启动子控制的核酸序列组成，其中所述抗原是由SEQ ID NO:7的1-676位氨基酸所组成的融合蛋白的形式。
2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子由SEQ IDNO:4的13-2043位核苷酸所组成。
3.一种重组复制缺陷型腺病毒，其包含权利要求1或2的重组核酸分子，其中所述腺病毒是人、牛、犬或猿猴腺病毒。
4.权利要求3的重组复制缺陷型腺病毒，其中所述腺病毒是分离自黑猩猩的猿猴腺病毒。
5.权利要求4的重组复制缺陷型腺病毒，其是C68(也称为Pan9)、Pan5、Pan6或Pan7腺病毒。
6.一种结核疫苗，其包含权利要求3-5任一项的重组复制缺陷型腺病毒和药学上可接受的赋形剂，以及任选存在的佐剂。
7.权利要求3-5任一项的重组复制缺陷型腺病毒在制备用于诱导针对结核的免疫应答的药物中的用途。
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