ES2890230T3 - Vacuna contra el VIH basada en el direccionamiento de Gag y Nef maximizado a células dendríticas - Google Patents

Vacuna contra el VIH basada en el direccionamiento de Gag y Nef maximizado a células dendríticas Download PDF

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Abstract

Una proteína modificada por ingeniería para la expresión en hospedadores eucariotas, que comprende un enlazador de dominio interestructural que consiste en el péptido definido por la SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra el VIH basada en el direccionamiento de Gag y Nef maximizado a células dendríticas
Sector de la técnica
La presente invención se refiere en general al campo de los agentes que dirigen proteínas víricas a células dendríticas.
Estado de la técnica
Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes se describen en relación con la presentación de antígenos. Las células dendríticas desempeñan un papel fundamental en el control de la interfaz de la inmunidad innata y adquirida al proporcionar señales solubles e intercelulares, seguidas del reconocimiento de patógenos. Estas funciones de las CD dependen en gran medida de la expresión de receptores de superficie especializados, 'receptores de reconocimiento de patrones' (PRR, por sus siglas en inglés), representados, principalmente, por receptores de tipo toll (TLR, por sus siglas en inglés) y receptores de lectinas de tipo C o de tipo lectina (LLR, por sus siglas en inglés).
En el paradigma actual, un papel importante de los TLR es alertar a las CD para que produzcan interleucina 12 (IL-12) y otras citocinas inflamatorias para iniciar respuestas inmunitarias. Los LLR de tipo C funcionan como constituyentes del poderoso mecanismo de captación y captura de antígenos de los macrófagos y las CD. En comparación con los TLR, sin embargo, los LLR podrían tener abanicos más amplios de funciones biológicas que incluyen migraciones celulares, interacciones intercelulares. Estas múltiples funciones de los LLR podrían deberse al hecho de que los LLR, a diferencia de los TLR, puede reconocerse tanto a sí mismos como a otros. Sin embargo, la complejidad de los LLR, incluyendo la redundancia de varios LLR expresados en células inmunitarias, ha sido uno de los principales obstáculos para comprender las funciones en detalle de los LLR individuales. Asimismo, los ligandos naturales para la mayoría de estos receptores permanecen sin identificar. No obstante, la evidencia de estudios recientes sugiere que los LLR, en colaboración con los TLR, pueden contribuir a la activación de las células inmunitarias durante las infecciones microbianas.
Objeto de la invención
En una realización, la presente invención proporciona una proteína modificada por ingeniería para la expresión en hospedadores eucariotas, que comprende un enlazador de dominio interestructural que consiste en la s Eq ID NO: 4, preferentemente en donde dicha proteína modificada por ingeniería es una proteína de fusión que comprende un enlazador de dominio interestructural que consiste en: la SEQ ID NO: 4. La presente invención también proporciona el uso de la SEQ ID NO: 4 para modificar por ingeniería proteínas para mejorar la expresión en hospedadores eucariotas.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un complejo anticuerpo-antígeno que comprende: un anticuerpo específico de células dendríticas (CD) o un fragmento de unión a antígeno del mismo al que se une un antígeno Gag que es menos susceptible a la degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos en donde el complejo anticuerpo-antígeno comprende un enlazador flexible que consiste en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6 entre el anticuerpo específico de CD o fragmento de unión a antígeno del mismo y el antígeno Gag.
En un aspecto, el anticuerpo específico de CD o un fragmento del mismo está humanizado. En otro aspecto, el anticuerpo específico de CD o el fragmento de unión a antígeno se selecciona de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1 y ASPGR, preferentemente se une específicamente a CD40.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un complejo anticuerpo-antígeno que comprende un complejo anticuerpo-antígeno que comprende un anticuerpo específico de CD o un fragmento de unión a antígeno del mismo al que se une un antígeno Nef en donde el complejo anticuerpo-antígeno comprende un enlazador flexible que consiste en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6 entre el anticuerpo específico de CD o un fragmento del mismo y el antígeno Nef. En un aspecto, el anticuerpo específico de CD o fragmento de unión a antígeno del mismo está humanizado. En un aspecto, el anticuerpo específico de CD o el fragmento de unión a antígeno se une se selecciona de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1 y ASPGR, preferentemente se une específicamente a CD40.
Otra realización más de la presente invención es una vacuna que comprende un complejo anticuerpo-antígeno que comprende un anticuerpo específico de CD o fragmento de unión a antígeno del mismo al que se une un antígeno Gag para formar un complejo anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno Gag es menos susceptible a la degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos, en donde el complejo anticuerpo-antígeno comprende un enlazador flexible que consiste en la SEQ ID NO: 4 o 6 entre el anticuerpo específico de CD o fragmento de unión a antígeno del mismo y el antígeno Gag. En un aspecto, el anticuerpo específico de CD o un fragmento del mismo está humanizado. El experto en la materia reconocerá que el complejo anticuerpo-antígeno puede formarse mediante asociación covalente o no covalente entre el anticuerpo o fragmento específico de CD y el antígeno o en forma de una proteína de fusión, con cualquiera de las porciones en el extremo amino o carboxilo o incluso como contactámeros o una o más de cualquiera de las porciones. En un aspecto, el anticuerpo específico de CD o el fragmento de unión a antígeno se une se selecciona de un anticuerpo que se une específicamente a MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, Lo X-1 y ASPGR.
Otra realización más de la presente invención es una vacuna que comprende un complejo anticuerpo-antígeno que comprende un anticuerpo específico de CD o fragmento de unión a antígeno del mismo al que se une un antígeno Nef modificado por ingeniería, en donde el complejo anticuerpo-antígeno comprende un enlazador flexible que consiste en la SEQ ID NO: 4 o 6 entre el anticuerpo específico de CD o fragmento de unión a antígeno del mismo y el antígeno Nef.
En un aspecto específico, el anticuerpo específico de CD o un fragmento del mismo está humanizado. El experto en la materia reconocerá que el complejo anticuerpo-antígeno puede formarse mediante asociación covalente o no covalente entre el anticuerpo o fragmento específico de CD y el antígeno o en forma de una proteína de fusión, con cualquiera de las porciones en el extremo amino o carboxilo o incluso como contactámeros o una o más de cualquiera de las porciones. En otro aspecto, el anticuerpo específico de CD o el fragmento de unión a antígeno se une se selecciona de un anticuerpo que se une específicamente a MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1 y ASPGR.
Descripción de las figuras
Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, se hace referencia ahora a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas y en las que:
La figura 1 muestra un análisis de SDS-PAGE reducido teñido con azul de Coomassie de proteínas de fusión gag p24-anticuerpo purificadas por cromatografía de afinidad con proteína A obtenidas a partir de células CHO-S o 293F transfectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican la fusión cadena H - gag p24, con diagramas de las construcciones y pesos moleculares esperados.
La figura 2 muestra un análisis de SDS-PAGE reducido teñido con azul de Coomassie de la proteína de fusión gag p24-anticuerpo purificada por cromatografía de afinidad con proteína A obtenida de células CHO-S o 293F transfectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican una fusión cadena H - gag p24 con un enlazador de cadena H - gag p24 derivado del precursor B de formación de armazones de anclaje celulosómico [Bacteroidescellulosolvens] y un plásmido de expresión de cadena ligera [L] correspondiente, con diagramas de las construcciones y sitios de glucosilación y pesos moleculares esperados.
Las figuras 3A a 3C muestran el esquema del dominio estructural para cipA.
Las figuras 4A a 4C muestran el esquema del dominio estructural para el precursor B de formación de armazones de anclaje celulosómico [Bacteroidescellulosolvens].
La figura 5 muestra un gel con la posición aproximada esperada para la cadena H codificada en C535, con diagramas de las construcciones y pesos moleculares esperados.
La figura 6 muestra un gel del producto de expresión parcialmente purificado de [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-var1-Viralgag-p40-var1-6xHis] C601 cotransfectado con el plásmido de expresión de cadena L apropiado, con diagramas de las construcciones y sitios de glucosilación y pesos moleculares esperados.
La figura 7 muestra varias construcciones cadena H-antígeno cotransfectadas transitoriamente en células 293F con construcciones de expresión de cadena L apropiadas idénticas, con diagramas de las construcciones y sitios de glucosilación y pesos moleculares esperados.
La figura 8 es un gráfico de una exploración para detectar el subconjunto de anticuerpos anti-CD40 que pueden unirse y activar CD40.
La figura 9 muestra el análisis FACS de la tinción de CD8+ [eje horizontal] frente a la tinción de tetrámero M1 con Flu [eje vertical] según lo provocado por un intervalo de dosis de 10 ug/ml a ningún conjugado de dockerina anti-CD4012E12-hIgG4-cohesina Flu M1.
La figura 10 muestra el análisis FACS de la tinción de CD8+ [eje horizontal] frente a la tinción de tetrámero M1 con Flu [eje vertical] según lo provocado por un intervalo de dosis de 10 ug/ml a ningún conjugado de dockerina hIgG4-cohesina Flu M1 de control.
La figura 11 muestra el protocolo utilizado para analizar invitro la potencia de las moléculas de direccionamiento (TM, por sus siglas en inglés) antirreceptores de CD-antígeno para provocar la expansión de linfocitos T específicos de antígeno en el contexto de un cultivo de PBMC.
La figura 12 muestra los efectos del direccionamiento a CD [dentro de las PBMC] con una vacuna anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24.
La figura 13 muestra que la vacuna provoca la expansión de linfocitos T CD4+ con especificidades para todos los grupos de péptidos gag p24.
La figura 14 son datos de FACS; el eje vertical muestra el porcentaje de células productoras de IFNy [panel superior]. El panel inferior muestra datos similares para los linfocitos T CD8+ dentro del cultivo de PBM, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia de gag p17 provocaron una producción significativamente mayor de linfocitos T productores de IFNy que el control sin péptidos.
La figura 15 muestra los datos en forma de gráfico de que la vacuna provoca la expansión de linfocitos T CD4+ con especificidades para la mayoría de los grupos de péptidos de nef de VIH; incluso en la vacuna más baja probada, el porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no se trataron con péptidos.
La figura 16 son datos de FACS que muestran que la vacuna provoca la expansión de linfocitos T CD4+ con especificidades para la mayoría de los grupos de péptidos de nef de VIH; incluso en la vacuna más baja probada, el porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no se trataron con péptidos.
La figura 17 muestra los datos en forma de gráfico; el eje vertical muestra el porcentaje de células productoras de IFNy [panel superior]. El panel inferior muestra datos similares para los linfocitos T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia de nef provocaron una producción significativamente mayor de linfocitos T productores de IFNy que el control sin péptidos.
La figura 18 muestra el esquema de un protocolo para probar la capacidad de una vacuna compuesta de anti-CD40-12E12 unido a PSA [antígeno específico de próstata] para provocar la expansión, a partir de una población de linfocitos T no expuestos previamente, de linfocitos T CD4+ específicos para PSA correspondientes a una amplia matriz de epítopos de PSA.
La figura 19 muestra que muchos péptidos de PSA provocan potentes respuestas de producción de IFNy, lo que indica que anti-CD4012E12 y agentes antiCD40 similares pueden suministrar antígenos a las CD de manera eficaz, dando como resultado el cebado de respuestas inmunitarias contra múltiples epítopos del antígeno. La figura 20 muestra que las CD dirigidas con anti-CD40-PSA dirigido a las CD inducen respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de PSA. Los IFNDC se dirigieron con 1 pg de proteína de fusión de mAb con PSA. Se cultivaron de manera conjunta linfocitos T CD8+ autólogos purificados durante 10 días. Las células se tiñeron con anti-CD8 y tetrámero de PSA (KLQCVDLHV). Las células son de un donante sano positivo HLA-A*0201. Los resultados demuestran que anti-CD40 suministra de manera eficaz PSA a la CD, que a su vez provocan la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de PSA.
La figura 21 describe el protocolo de direccionamiento de CD para probar vacunas de direccionamiento antirreceptores de CD para determinar su capacidad para dirigir la expansión de linfocitos T específicos de antígeno que es el resultado de la captación dirigida por las CD y la presentación de epítopos de antígeno en su superficie celular.
La figura 22 [panel superior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph002].
La figura 22 [panel inferior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph002].
La figura 23 [panel superior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph010].
La figura 23 [panel inferior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph002].
La figura 24 es un gel que muestra un análisis de la interacción de la proteína de fusión cohesina-ciclina D1 con el anticuerpo recombinante antirreceptores de CD-dockerina.
La figura 25 muestra el esquema de péptidos solapantes de ciclina D1.
La figura 26 muestra un esquema (izquierda) del diseño del estudio para probar la capacidad de los complejos anti-CD40-ciclina D1 para provocar la expansión invitro de linfocitos T CD4+ específicos de ciclina D1, y los resultados de FACS obtenidos de ese modo (derecha).
La figura 27 es un análisis FACS similar al detallado en la figura 26, con un donante normal diferente - en este caso, el complejo anti-CD40-ciclina D1 provocó la expansión de linfocitos T CD4+ proliferantes IFNg positivos específicos para los péptidos P4, P43 y P70 de ciclina D1.
La figura 28 muestra un esquema (izquierda) y un análisis (derecha) similar al que se muestra en la figura 26, excepto que se utilizaron linfocitos T CD8+.
La figura 29 muestra datos similares del mismo donante que la figura 28, pero analizados con péptidos individuales de grupos de péptidos.
Descripción detallada de la invención
Aunque la realización y el uso de diferentes realizaciones de la presente invención se analizan en detalle a continuación, debe apreciarse que la presente invención proporciona muchos conceptos de la invención que pueden incorporarse en una amplia variedad de contextos específicos. Las realizaciones específicas analizadas en el presente documento son simplemente ilustrativas de formas específicas de realizar y utilizar la invención.
Para facilitar la comprensión de la presente invención, se definen a continuación varios términos. Los términos definidos en el presente documento tienen significados como los comúnmente entendidos por un experto habitual en la materia de las áreas relevantes para la presente invención. Los términos como "un", "una" y "el/la" no pretenden referirse únicamente a una entidad en singular, sino que incluyen la clase general de la que se puede usar un ejemplo específico como ilustración. La terminología en el presente documento se utiliza para describir realizaciones específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, que en el sentido más amplio es como se indica en las reivindicaciones.
Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos que desempeñan un papel clave en la regulación de la inmunidad específica de antígenos (Mellman y Steinman 2001), (Banchereau, Briere etal.2000), (Cella, Sallusto etal.1997). Las CD capturan antígenos, los procesan en péptidos y los presentan a los linfocitos T. Por lo tanto, el suministro de antígenos directamente a las CD es un área de interés para mejorar las vacunas. Un ejemplo de ello es la creación de vacunas basadas en CD que utilizan la carga de antígenos exvivo de CD autólogas que después se vuelven a administrar a los pacientes (Banchereau, Schuler-Thurner etal.2001), (Steinman y Dhodapkar 2001). Otra estrategia para mejorar la eficacia de las vacunas es el direccionamiento específico a las CD del antígeno conjugado con anticuerpos contra receptores específicos de CD de internalización. El potencial de dirigirse a las CD para la vacunación se destaca en estudios clave con ratones. El direccionamiento, in vivo con un mAb anti-LOX-1 acoplado a ovoalbúmina (OVA) indujo una respuesta protectora de linfocitos T CD8+, a través de la presentación cruzada de antígenos exógenos hacia la vía de MHC de clase I (Delneste, Magistrelli et al.2002). Además, la OVA conjugada con mAb anti-DEC205 en combinación con un estímulo de maduración de CD40L potenció la presentación restringida por MHC de clase I mediante las CD invivo y dio lugar a la formación duradera de linfocitos T CD8+ de memoria efectores (Bonifaz, Bonnyay etal.2004). Ambos estudios mostraron un ahorro de dosis espectacular (es decir, fuertes respuestas inmunitarias a dosis de antígenos muy bajas) y sugirieron respuestas más amplias que las que se observan normalmente con otros tipos de inmunización con OVA. Un trabajo reciente con el direccionamiento del antígeno gag de VIH a CD a través de DEC205 ha extendido estos conceptos a un antígeno clínicamente relevante y ha confirmado los principios de direccionamiento del antígeno a CD, ahorro de dosis drástico, respuestas protectoras de una sola vacunación y expansión de linfocitos T específicos de antígeno en los compartimentos tanto CD8 como CD4 (Trumpfheller, Finke etal.2006, Nchinda G. etal., (2008) J. Clin. Invest., 118(4): 1427-1436). Los enlazadores de proteínas que comprenden sitios consenso de glucosilación ligados a N u O se conocen de Gustavsson etal. (2001, Prot. Eng., Des. Sel., 14(9):711-715) y Poon etal. (2007, J. Biol. Chem.
282(3):2091-2100), respectivamente.
La presente divulgación proporciona la formación de complejos de múltiples antígenos o proteínas (modificados por ingeniería, expresados y purificados independientemente del mAb primario) de una manera controlada, multivariable, con un único mAb recombinante primario. Actualmente, existen métodos para modificar por ingeniería sitios de biotinilación específicos de sitio que proporcionan la adición de diferentes proteínas (cada una de ellas modificada por ingeniería por separado unidas a estreptavidina) al mAb primario. Sin embargo, la presente divulgación proporciona la adición al mAb primario de múltiples combinaciones, en proporciones y ubicaciones equimolares fijas, de proteínas modificadas por ingeniería por separado.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo o fragmento del mismo" se usa para describir un sistema de anticuerpos recombinantes que se ha modificado por ingeniería para proporcionar un anticuerpo específico de diana. El anticuerpo monoclonal elaborado utilizando técnicas de hibridoma convencionales, presenta anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales humanizados y similares. El anticuerpo se puede utilizar para, por ejemplo, dirigirse (a través de un anticuerpo recombinante primario contra un receptor de internalización, por ejemplo, un receptor de células dendríticas humanas) a múltiples antígenos y/o a antígenos y a una citocina activadora de las células dendríticas (CD).
La porción de unión a antígeno del anticuerpo incluye uno o más fragmentos (es decir, fragmentos del mismo) que pueden incluir uno o más dominios variables, uno o más variables y el primer dominio constante, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab)2 y fragmento Fv, y fragmento Fabc y/o un fragmento Fab con porciones del dominio Fc al que las porciones de unión modular afines se añaden a la secuencia de aminoácidos y/o se unen. El anticuerpo a utilizar puede ser de cualquier isotipo o clase, subclase o de cualquier fuente (animal y/o recombinante). En determinados aspectos, los sitios de unión a antígeno derivan de anticuerpos monoclonales no humanos que se injertan, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, en un esqueleto de anticuerpo humano "humanizando", de este modo, el anticuerpo.
El término "antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que puede iniciar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular en un receptor del antígeno. El antígeno puede usarse en dos contextos diferentes con la presente divulgación: como una diana para el anticuerpo u otro dominio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo modificado por ingeniería o recombinante (rAb, por sus siglas en inglés) o como la molécula que se transporta hacia y/o dentro de una célula o diana mediante el rAb como un conjugado (unida covalentemente o no covalentemente) o una proteína de fusión. El antígeno suele ser un agente que causa una enfermedad para la que la vacunación sería un tratamiento ventajoso. Cuando el antígeno se presenta en MHC, el péptido tiene, con frecuencia, de aproximadamente 8 a aproximadamente 25 aminoácidos. Los antígenos incluyen cualquier tipo de molécula biológica, incluyendo, por ejemplo, metabolitos intermedios simples, azúcares, lípidos y hormonas, así como macromoléculas tales como carbohidratos complejos, fosfolípidos, ácidos nucleicos y proteínas. Las categorías comunes de antígenos incluyen, pero sin limitación, antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, protozoarios y otros antígenos parasitarios, antígenos tumorales, antígenos implicados en enfermedades autoinmunitarias, alergia y rechazo de injertos y otros antígenos diversos. La presente divulgación utiliza antígenos de virus que tienen características mejoradas (p. ej., disminución de la proteólisis, secreción potenciada, expresión o estabilidad potenciadas) y que se dirigen a células presentadoras de antígeno utilizando el anticuerpo o fragmentos del mismo.
Los ejemplos de antígenos víricos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, antígenos retrovíricos tales como antígenos retrovíricos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) antígenos tales como productos génicos de los genes gag, pol y env, la proteína Nef, transcriptasa inversa y otros componentes de VIH; antígenos víricos de la hepatitis como las proteínas S, M y L del virus de la hepatitis B, el antígeno pre-S del virus de la hepatitis B y otras hepatitis, por ejemplo, hepatitis A, B y C, componentes víricos tal como ARN vírico de la hepatitis C; antígenos del virus de la gripe tales como hemaglutinina y neuraminidasa y otros componentes del virus de la gripe; antígenos víricos del sarampión tal como la proteína de fusión del virus del sarampión y otros componentes del virus del sarampión; antígenos del virus de la rubeola tales como proteínas E1 y E2 y otros componentes del virus de la rubéola; antígenos del rotavirus tales como VP7sc y otros componentes de rotavirus; antígenos de citomegalovirus tales como glicoproteína B de la envuelta y otros componentes de antígenos de citomegalovirus; antígenos del virus sincitial respiratorio tal como la proteína de fusión RSV, la proteína M2 y otros componentes de antígenos del virus sincitial respiratorio; antígenos del virus del herpes simple tal como proteínas tempranas inmediatas, glicoproteína D y otros componentes de antígenos del virus del herpes simple; antígenos del virus de varicela zóster tal como gpI, gpII y otros componentes de antígenos del virus de varicela zoster; antígenos del virus de la encefalitis japonesa tal como las proteínas E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, 80 % E y otros componentes de antígenos del virus de la encefalitis japonesa; antígenos del virus de la rabia tal como la glicoproteína de la rabia, nucleoproteína de la rabia y otros componentes de antígenos el virus de la rabia. Véase Fundamental Virology, segunda edición, eds. Fields, B. N. y Knipe, D. M. (Raven Press, Nueva York, 1991) para ejemplos adicionales de antígenos víricos.
Las dianas antigénicas que pueden suministrarse utilizando las vacunas de rAb-CD/CD-antígeno de la presente divulgación incluyen genes que codifican antígenos tales como antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos o antígenos parasitarios. Los virus incluyen picornavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus, rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, buniavirus, arenavirus, reovirus, retrovirus, papilomavirus, parvovirus, herpesvirus, poxvirus, hepadnavirus y virus espongiforme. Otras dianas víricas incluyen virus de la gripe, virus del herpes simple 1 y 2, sarampión, dengue, viruela, poliomielitis o VIH. Los patógenos incluyen tripanosomas, platelmintos, lombrices intestinales, helmintos, malaria. Se pueden utilizar como diana de esta manera marcadores tumorales, tales como el antígeno fetal o el antígeno específico de próstata. Otros ejemplos incluyen: proteínas env de VIH y antígeno de superficie de la hepatitis B. La administración de un vector con fines de vacunación requeriría que los antígenos asociados al vector fueran suficientemente no inmunogénicos para permitir la expresión a largo plazo del transgén, para el que se desearía una fuerte respuesta inmunitaria. En algunos casos, la vacunación de un individuo solo puede ser necesaria con poca frecuencia, tales como anualmente o cada dos años, y proporcionan protección inmunitaria a largo plazo contra el agente infeccioso. Ejemplos específicos de organismos, alérgenos y secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos para su uso en vectores y, en última instancia, como antígenos, se pueden encontrar en la patente de los Estados Unidos n.° 6.541.011, en particular, en las tablas que coinciden con los organismos y las secuencias específicas que se pueden utilizar.
Se seleccionarán antígenos sobre la superficie de células inmunitarias, por ejemplo, células presentadoras de antígenos o células dendríticas, que puedan utilizarse como diana utilizando el rAb de la presente divulgación generalmente en función de una serie de factores, incluyendo: probabilidad de internalización, nivel de especificidad de las células inmunitarias, tipo de célula inmunitaria utilizada como diana, nivel de madurez y/o activación de células inmunitarias y similares. Ejemplos de marcadores de superficie celular para células dendríticas incluyen, pero sin limitación, MHC de clase I, MHC de clase II, B7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR y/o ASPGR y similares; mientras que en algunos casos también tienen la ausencia de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56 y/o CD57. Ejemplos de marcadores de superficie celular para células presentadoras de antígenos incluyen, pero sin limitación, MHC de clase I, MHC de clase II, CD40, c D45, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1 o ASPGR. Ejemplos de marcadores de superficie celular para linfocitos T incluyen, pero sin limitación, CD3, CD4, CD8, CD 14, CD20, CD11 b, CD16, CD45 y HLA-DR.
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo o epítopos" se refiere a un antígeno peptídico o proteico que incluye una estructura primaria, secundaria o terciaria similar a un epítopo ubicado dentro de cualquiera de una variedad de polipéptidos patógenos codificados por el ADN o ARN patógenos. El nivel de similitud será generalmente de tal grado que los anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra dichos polipéptidos también se unirán a, reaccionarán con, o reconocerán de otra manera, el antígeno peptídico o proteico. Se pueden emplear varios métodos de inmunoensayo junto con dichos anticuerpos, tales como, por ejemplo, transferencia Western, ELISA, RIA y similares, siendo todos ellos conocidos por los expertos en la materia. La identificación de epítopos de patógenos y/o sus equivalentes funcionales, adecuados para su uso en vacunas es parte de la presente divulgación. Una vez aislados e identificados, se pueden obtener fácilmente equivalentes funcionales. Por ejemplo, uno puede emplear los métodos de Hopp, como se enseña en la Patente de los Estados Unidos N.° 4.554.101, que enseña la identificación y preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácidos en función de la hidrofilia. Los métodos descritos en otros artículos diversos y programas de software basados en ellos, también se pueden utilizar para identificar secuencias centrales epitópicas (véase, por ejemplo, Jameson y Wolf, 1988; Wolf etal., 1988; patente de los Estados Unidos N.° 4.554.101). La secuencia de aminoácidos de estas "secuencias centrales epitópicas" puede, después, incorporarse fácilmente en péptidos, ya sea mediante la aplicación de síntesis de péptidos o tecnología recombinante.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal " se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población homogénea de anticuerpos. La expresión no se limita a la especie o fuente del anticuerpo, tampoco se pretende que esté limitado por la forma en que se produce. La expresión abarca inmunoglobulinas completas, así como fragmentos tales como Fab, F(ab')2 , Fv y otros fragmentos que muestran propiedades de unión inmunitaria de la molécula de anticuerpo monoclonal precursor.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por restos de aminoácidos de las regiones variables ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L") aminoterminales. Tres tramos muy divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones hipervariables" que se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" (FR, por sus siglas en inglés). Como se usa en el presente documento, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen una con respecto a la otra en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria de la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones de determinantes de la complementariedad", o "CDR".
Como se usa en el presente documento, la expresión anticuerpo "humanizado" se refiere a aquellas moléculas que comprenden un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana que se han descrito, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus CDR asociadas fusionadas con dominios constantes humanos, CDR de roedor injertadas en una FR de soporte humano antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado y CDR de roedor soportadas por FR de roedor chapadas de manera recombinante. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunitaria no deseada hacia las moléculas contra anticuerpos humano de roedores, lo que limita la duración y eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos.
La preparación de composiciones de vacuna que incluyen los ácidos nucleicos que codifican antígenos como principio activo, puede prepararse como inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación puede estar emulsionada, encapsulada en liposomas. Con frecuencia, los principios activos inmunogénicos se mezclan con transportadores que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo.
La expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un transportador que no causa una reacción alérgica u otro efecto adverso en los sujetos a los que se administra. Transportadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Asimismo, si se desea, la vacuna puede contener cantidades mínimas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH y/o adyuvantes que potencian la eficacia de la vacuna. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser eficaces incluyen, pero sin limitación: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, MTP-PE y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno/Tween 80 al 2 %. Otros ejemplos de adyuvantes incluyen DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio), adyuvantes completo e incompleto de Freund y QuilA. Asimismo, pueden utilizarse sustancias inmunomoduladoras tales como linfocinas (p. ej., iFN-y, IL-2 e IL-12) o inductores sintéticos de IFN-y tales como poli I:C en combinación con los adyuvantes descritos en el presente documento.
Productos farmacéuticos que pueden incluir un polinucleótido desnudo con una o varias copias de las secuencias de nucleótidos específicas que se unen a sitios de unión a ADN específicos de las apolipoproteínas presentes en las lipoproteínas plasmáticas como se describe en la presente divulgación. El polinucleótido puede codificar un péptido biológicamente activo, ARN antisentido, o ribozima y se proporcionará en una forma administrable fisiológicamente aceptable. Otro producto farmacéutico que puede surgir de la presente divulgación puede incluir una fracción de lipoproteínas plasmáticas altamente purificada, aislada según la metodología, descrita en el presente documento a partir de la sangre del paciente o de otra fuente y un polinucleótido que contiene una o varias copias de las secuencias de nucleótidos específicas que se unen a sitios de unión a ADN específicos de las apolipoproteínas presentes en las lipoproteínas plasmáticas, unido previamente a la fracción de lipoproteínas purificadas en una forma de administración fisiológicamente aceptable.
Otro producto farmacéutico más puede incluir una fracción de lipoproteínas plasmáticas altamente purificadas que contiene fragmentos de apolipoproteínas recombinantes que contienen una o varias copias de motivos de unión a ADN específicos, unidos previamente a un polinucleótido que contiene una o varias copias de las secuencias de nucleótidos específicas, en una forma de administración fisiológicamente aceptable. Otro producto farmacéutico más puede incluir una fracción de lipoproteínas plasmáticas altamente purificadas que contiene fragmentos de apolipoproteínas recombinantes que contienen una o varias copias de motivos de unión a ADN específicos, unidos previamente a un polinucleótido que contiene una o varias copias de las secuencias de nucleótidos específicas, en una forma de administración fisiológicamente aceptable.
La dosis a administrar depende en gran medida del peso corporal y del estado físico del sujeto que se está tratando, así como de la vía de administración y la frecuencia del tratamiento. Una composición farmacéutica que incluye el polinucleótido desnudo unido previamente a una fracción de lipoproteínas altamente purificadas puede administrarse en cantidades que varían de 1 pg a 1 mg de polinucleótido y de 1 pg a 100 mg de proteína.
La administración de la vacuna a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de agentes quimioterapéuticos, teniendo en cuenta la toxicidad, en caso de que la hubiera, del vector. Se prevé que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla que puedan aplicarse diversas terapias convencionales, así como intervención quirúrgica, en combinación con la terapia génica descrita.
Cuando se contemple la aplicación clínica de una terapia génica, será necesario preparar el complejo como una composición farmacéutica apropiada para la aplicación prevista. Generalmente, esto implicará preparar una composición farmacéutica que esté esencialmente libre de pirógenos, así como de cualquier otra impureza que podría ser dañina para los seres humanos o los animales. En general, se deseará emplear sales y tampones apropiados para hacer el complejo estable y permitir la captación del complejo por las células diana.
Las composiciones acuosas pueden incluir una cantidad eficaz del compuesto, disuelto o dispersado en un transportador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones también pueden denominarse inóculos. En la técnica se conoce bien el uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas.
Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse principios activos complementarios. Las composiciones pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Patologías. Dependiendo de la enfermedad particular a tratar, la administración de composiciones terapéuticas se realizará a través de cualquier vía común siempre que el tejido diana esté disponible a través de esa vía a efectos de maximizar el suministro de antígeno a un sitio para una respuesta inmunitaria máxima (o en algunos casos mínima). La administración generalmente será mediante inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Otras áreas de suministro incluyen: oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. La administración tópica sería particularmente ventajosa para el tratamiento de cánceres de piel. Normalmente, dichas composiciones se administrarían como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen transportadores, tampones u otros excipientes fisiológicamente aceptables.
Las composiciones de vacuna o de tratamiento se pueden administrar por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, ya sea por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales o formulaciones adecuadas para su distribución como aerosoles. En el caso de las formulaciones orales, la manipulación de subconjuntos de linfocitos T empleando adyuvantes, empaquetado de antígenos, o la adición de citocinas individuales a diversas formulaciones dan como resultado vacunas orales mejoradas con respuestas inmunitarias optimizadas. Para supositorios, los aglutinantes y transportadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5 % al 10 %, preferentemente 1 %-2 %. Las formulaciones orales incluyen dichos excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10 %-95 % de principio activo, preferentemente 25-70 %.
Los ácidos nucleicos que codifican el antígeno pueden formularse en la vacuna o las composiciones de tratamiento como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino del péptido libres) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, maleico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína y similares.
Las composiciones de vacuna o de tratamiento se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del sujeto que se va a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos y el grado de protección o tratamiento deseado. Los intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación con un intervalo de aproximadamente 0,1 mg a 1000 mg, tal como en el intervalo de aproximadamente 1 mg a 300 mg, y preferentemente en el intervalo de aproximadamente 10 mg a 50 mg. mg. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las inyecciones de refuerzo también son variables, pero se caracterizan por una administración inicial seguida de inoculaciones posteriores u otras administraciones. Las cantidades precisas de principio activo que se necesitan administrar dependen del criterio del médico responsable del tratamiento y pueden ser propias para cada sujeto. Resultará evidente para los expertos en la materia que la cantidad terapéuticamente eficaz de molécula de ácido nucleico o polipéptidos de fusión dependerá, entre otras cosas, de la pauta posológica, de la dosis unitaria de antígeno administrada, si la molécula de ácido nucleico o el polipéptido de fusión se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmunitario y la salud del receptor, y la actividad terapéutica de la molécula de ácido nucleico o polipéptido de fusión particular.
Las composiciones pueden administrarse en una pauta de dosis única o en una pauta de múltiples dosis. Una pauta de dosis múltiple es aquella en la que un ciclo primario de vacunación puede incluir, por ejemplo, 1-10 dosis separadas, seguidas de otras dosis administradas a intervalos de tiempo posteriores necesarios para mantener o reforzar la respuesta inmunitaria, por ejemplo, a los 1-4 meses para una segunda dosis, y si es necesario, una o unas dosis posteriores después de varios meses. Son deseables refuerzos periódicos a intervalos de 1-5 años, generalmente 3 años, para mantener los niveles deseados de inmunidad protectora. El ciclo de la inmunización puede seguirse realizando ensayos de proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL) invitro cultivados junto con ESAT6 o ST-CF y midiendo los niveles de IFN-y liberados a partir de los linfocitos cebados. Los ensayos se pueden realizar utilizando marcadores convencionales, tal como radionucleótidos, enzimas, marcadores fluorescentes y similares. Estas técnicas son conocidas por los expertos en la materia y se pueden encontrar en las patente de los Estados Unidos N.° 3.791.932, 4.174.384 y 3.949.064.
La vacuna descrita en el presente documento puede proporcionarse en una o más "dosis unitarias" dependiendo de si se utilizan los vectores de ácido nucleico, las proteínas purificadas finales o se utiliza la forma de vacuna final. La dosis unitaria se define como que contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen de tratamiento adecuados. La cantidad a administrar y la vía y formulación particulares, están dentro de la habilidad de los expertos en la materia clínica. También se puede evaluar el sujeto a tratar, en particular, el estado del sistema inmunitario del sujeto y la protección deseada. No es necesario administrar una dosis unitaria como una sola inyección, sino que puede incluir una infusión continua durante un período de tiempo establecido. La dosis unitaria puede describirse convenientemente en términos de ADN/kg (o proteína/kg) de peso corporal, con intervalos entre aproximadamente 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,5, 1, 10, 50, 100, 1.000 o más mg/ADN o proteína/kg de peso corporal. Asimismo, la cantidad de vacuna de rAb-CD/CD-antígeno suministrada puede variar de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 8,0 mg/kg de peso corporal. Por lo tanto, en realizaciones particulares, se pueden suministrar 0,4 mg, 0,5 mg, 0,8 mg, 1,0 mg, 1,5 mg, 2,0 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 5,5 mg, 6,0 mg, 6,5 mg, 7,0 mg y 7,5 mg de la vacuna. a un individuo invivo. La dosis de vacuna a administrar depende en gran medida del peso corporal y del estado físico del sujeto que se está tratando, así como de la vía de administración y la frecuencia del tratamiento. Una composición farmacéutica que incluye un polinucleótido desnudo unido previamente a un vector de suministro liposómico o vírico puede administrarse en cantidades que varían de 1 pg a 1 mg de polinucleótido o de 1 pg a 100 mg de proteína. Por lo tanto, las composiciones particulares pueden incluir entre aproximadamente 1 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg o 1.000 pg de polinucleótido o proteína que se une independientemente a 1 pg, 5 pg, 10 pg, 20 pg, 3,0 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 mg, 1,5 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg o 100 mg de vector.
La presente divulgación también se puede usar para preparar un transportador modular de rAb que es, por ejemplo, un mAb humanizado recombinante (dirigido a un receptor de células dendríticas humanas específico) en forma de complejo con antígenos protectores de ricina, toxina de ántrax y enterotoxina de StaphylococcusB. El mercado potencial de esta entidad es la vacunación de todo el personal militar y la vacuna almacenada en reserva para administrar a grandes núcleos de población en respuesta a cualquier amenaza biológica relacionada con estos agentes. La divulgación tiene una amplia aplicación al diseño de vacunas en general, tanto para uso humano como animal. Las industrias de interés incluyen las industrias farmacéutica y biotecnológica.
En el presente documento se describen composiciones y métodos, incluyendo vacunas, que dirigen (suministran) antígenos de manera específica a células presentadoras de antígenos (ApC, por sus siglas en inglés) con el fin de provocar respuestas inmunitarias potentes y amplias dirigidas contra el antígeno. Estas composiciones evocan respuestas inmunitarias protectoras o terapéuticas contra el agente (patógeno o cáncer) del que deriva el antígeno. Asimismo, las composiciones crean agentes que son directamente, o junto con otros agentes, terapéuticos a través de su unión específica con células presentadoras de antígenos.
Vacuna contra Gag-Nef. La secuencia que se muestra a continuación es una proteína de fusión de cadena pesada (H) - gag p24 de VIH donde la región p24 [en cursiva] está unida al extremo carboxiterminal de hIgG4H a través de un espaciador corto [negrita] derivado de un bucle flexible del complejo principal de histocompatibilidad humano, clase II, precursor DR alfa. Los restos AS subrayados están codificados por sitios de restricción utilizados a efectos de construcción [en este caso, Nhe I]. Este tipo de proteína de fusión anticuerpo-p24 se ha descrito en la bibliografía científica [p. ej., Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses (2006) Boscardin etal., JEM, Volumen 203, Número 3, 599-606].
Secuencias enlazadoras de anticuerpo-antígeno mejoradas. [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-Viralgag] C241 es:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDMAKKETVWRLEEFGRPJVgiVJgGQMVYÍgAJSPPrP NAWVKWEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDKVHPVHAGP IAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEP FRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARV
L (SEQ ID NO.: 1)
La figura 1, carriles 1 y 2 muestra un análisis de SDS-PAGE reducido teñido con azul de Coomassie de proteínas de fusión gag p24-anticuerpo purificadas por cromatografía de afinidad con proteína A obtenidas a partir de células CHO-S o 293F transfectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican la fusión cadena H - gag p24 [que codifican p. ej., C241 anterior precedido por una secuencia señal natural] y un plásmido de expresión de cadena ligera [L] correspondiente. Normalmente para la producción de proteínas secretadas, el cultivo de transfección conjunta continúa durante varios días antes de recoger el sobrenadante de cultivo para su posterior purificación. La cadena de fusión de cadena H-gag p24 de longitud completa [~77 kDa] se indica mediante la flecha superior. También se muestra un producto de cadena H escindido [flecha inferior] que migra un poco más lentamente que una cadena H no fusionada con otra proteína [que se muestra en el carril 4 como una banda de ~50 kDa]. Este resultado sugiere que la secuencia enlazadora de la cadena H - p24 es susceptible de escisión proteolítica, comprometiendo, de este modo, la integridad de la proteína de fusión anticuerpo-antígeno secretada producida.
Por el contrario, se puede secretar y recuperar una proteína de fusión anticuerpo- HA1-1 de gripe sin escisión significativa observada entre el extremo C de la cadena H y el dominio HA1-1. [mAnti-LOX-115C4H-LV-hIgG4H-C-Flex-FluHA1-1-6xHis] C114 es:
EIQLQQTGPELVKPGASVKISCKASGYPFTDYIMVWVKQSHGKSLEWIGNISPYYGTTNYNLKFKGKATL TVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSPNWDGAWFAHWGQGALVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDrJCJGY'ÍÍAMVSTDIVDTVLEJCWrVT HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFID YEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNK KGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSWTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGD TIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECLKYVR SAKLRMVHHHHHH (SEQ ID NO.: 2)
En este caso, se insertó un enlazador corto [negrita] derivado del precursor B de formación de armazones de anclaje celulosómico [CipA de Clostridiumthermocellum ATCC 27405]] entre el extremo C de la cadena H [mediante una secuencia de unión que se muestra subrayada] y el dominio HA1-1 de la gripe [en cursiva]. No hay una escisión proteolítica obvia entre el extremo C de la cadena H y el dominio HA1-1 [figura 1 carril 3].
La figura 2, carril 3 muestra un análisis de SDS-PAGE reducido teñido con azul de Coomassie de la proteína de fusión gag p24-anticuerpo purificada por cromatografía de afinidad con proteína A obtenida de células CHO-S o 293F transfectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican una fusión cadena H - gag p24 con un enlazador de cadena H - gag p24 derivado del precursor B de formación de armazones de anclaje celulosómico [Bacteroidescellulosolvens] y un plásmido de expresión de cadena ligera [L] correspondiente.
[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-var1-Viralgag-var1-6xHis] C560 se muestra a continuación [los restos subrayados son de secuencias de unión de sitios de restricción y en negrita son los restos del enlazador flexible]:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASVDSEFAQ QAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNT MLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGMÍTHNPPI PVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNA NPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGñHHHHH (SEQ ID NO.: 3)
La proteína de fusión anticuerpo-gag p24 anterior se produce intacta sin escisión detectable entre el extremo C de la cadena H y el dominio gag p24. Por lo tanto, la secuencia enlazadora QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP (SEQ ID NO: 4) es superior para la producción de vacunas contra gag p24.
Secuencias enlazadoras preferidas derivadas de armazones y proteínas relacionadas. La siguiente secuencia es CipA, un armazón de una bacteria degradadora de celulosa. Esta proteína contiene múltiples dominios de cohesina intercalados con secuencias enlazadoras [en cursiva] aparentemente evolucionadas para ser flexibles, lo que refleja el papel de esta proteína para: (i) anclarse a la matriz de celulosa a través del dominio de unión a carbohidratos [CBM-3, figura 3]; y (ii) unirse a enzimas degradadoras de celulosa tales como endoglucanasa D a través de dominios de dockerina ligados a enzimas.
>gi|2506991 |sp|Q06851 |CIPA_CLOTM Precursor de la proteína a de formación de armazones celulosómicos (glicoproteína celulosómica S1/SL) (proteína A integradora de celulosa) (cohesina) [Clostridiumthermocellum ATCC 27405]. Los restos en negrita son la secuencia enlazadora utilizada en la construcción C114 anterior.
MRKVISMLLVVAMLTTIFAAMIPQTVSAATMTVEIGKVTAAVGSKVEIPITLKGVPSKGMANCDFVLGYD PNVLEVTEVKPGSIIKDPDPSKSFDSAIYPDRKMIVFLFAEDSGRGTYAITQDGVFATIVATVKSAAAAP ITLLEVGAFADNDLVEISTTFVAGGVNLGSSVPrrQPiWPSAGVVVEIGKVTGSVGTTVEIPVYFRGVPS KGIANCDFVFRYDPNVLEIIGIDPGDIIVDPNPTKSFDTAIYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFA KIRATVKSSAPGYITFDEVGGFADNDIVEQKVSFIDGGVNVGNATPTKGATPTNTATPTKSATATPTRPS VPTNTPTNTPAWTPVSGWLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTF
WCDHAAI IGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYIjEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQ SNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSWPSTQPVTTPPATTKPPATTKPPATTIPPSDDPN AIKIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVY SYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPDKSFDTAVY PDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKSGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQRTQFFDGGV NVGDTTVPTTPTTPVTTPTDDSNAVRIKVUTVNAKPGUTVRIPVRFSGIPSKGIKÑCDFVY SYDPNVLEI IEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKSGAPNGLSVIKF VE VGGFANNDL VEQKT QFFDGG VNVGDTÍTEPAírPriP VTTPrrTDDPDAVR IKVDT VNAKPGDT VRIP VR FSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAIT KDGVFATIVAKVKSGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTEPATPITPVTTPTTTP» PPPAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDT AVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFD GGVNVGPrPPPArPPPPVrrPrrrPPPPAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDP NVLEIIEIEPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITEDGVFATIVAKVKSGAPNGL SVIKFVEVGGFANNDEVEQKTQFFDGGVFSYGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAVKIKVDTVNAKPGDTV RIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTG AYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGPPrVPrrSPrrrPP PPrPPPiWCLTLKIGRAEGRPGDTVEIPVNLYGVPQKGIASGDFVVSYDPNVLEIIEIEPGELIVDPNPTK SFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITEDGVFATIVAKVKEGAPEGFSAIEISEFGAFADNDLVEVET DLINGGVLVTNKPVIEGYKVSGYILPDFSFDATVAPLVKAGFKVEIVGTELYAVTDANGYFEITGVPANA SGYTLKISRATYLDRVIANVVVTGDTSVSTSQAPIMMWVGDIVKDNSINLLDVAEVIRCFNATKGSANYV EELDINRNGAINMQDIMIVHKHFGATSSDYDAQ (SEQ ID NO.: 5)
Las figuras 3A a 3C muestran el esquema de dominio estructural para cipA. La figura 3A muestra el esquema de dominio estructural, son los análisis de NetOGlyc 1.0 Server y NetNGlyc 1.0 Server para cipA que muestran sitios de glucosilación ligados a O (figura 3C) y ligados a N (figura 3C) altamente predichos. En particular, los sitios ligados a O están en gran parte dentro de las secuencias enlazadoras.
Otro ejemplo similar a cipA A se muestra a continuación. La secuencia enlazadora que se muestra anteriormente en C560 [QTPTNTISVTPTNNSTPTNTSTPKPNP] (SEQ ID NO: 6) deriva de esta secuencia [se muestra a continuación en negrita y cursiva, excepto por una sustitución de N a T] y contiene dos sitios potenciales de glucosilación ligados a N [subrayados]. Otras secuencias enlazadoras utilizadas en las construcciones descritas a continuación y/o en la divulgación del péptido de VIH se muestran en negrita.
>gi|50656899|gb|AAT79550.1| precursor B de formación de armazones de anclaje celulosómico [Bacteroides cellulosolvens]
MQSPRLKRKILSVILAVCYIISSFSIQFAATPQVNIIIGSAQGIPGSTVKVPINLQNVPEIGINNCDFTI KFDSDILDFNSVEAGDIVPLPVASFSSNNSKDIIKFLFSDATQGNMPINENGLFAVISFKIKDNAQKGIS NIKVSSYGS FSGMSGKEMQSLSPTFFSGSIDVSDVSTSKLDVKVGNVEGIAGTEVNVPITFENVPDNGIN NCNFTLSYDSNALEFLTTEAGNIIPLAIADYSSYRSMEGKIKFLFSDSSQGTRSIKNDGVFANIKFKIKG NAIRDTYRIDLSELGSFSSKQNNNLKSIATQFLSGSVNVKDIESSVSPTTSVHPTPrSVPPTPTKSSPGN KMKIQIGDVKANQGDTVIVPITENEVPVMGVNNCNFTLAYDKNIMEFISADAGDIVTLPMANY SYNMPSD GLVKFLYNDQAQGAMSIKEDGTFANVKFKIKQSAAFGKY SVGIKAIGSISALSNSKLIPIESIFKDGSIT VTNKPIVNIEIGKVKVKAGDKIKVPVEIKDIPSIGINNCNFTLKYNSNVLKYVSNEAGTIVPAPLANLSI NKPDEGIIKLLFSDASQGGMPIKDNGIFVNLE FQAVNDANIGVYGLELDTIGAFSGISSAKMTSIEPQFN NGSIEIFNSAQTPNPSWTENQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSTPKPNPEYNENNNIGEISGEAGGVIENPI EFKNVPDFGINNCDFSVKYDKSIFEYVTYEAGSIVKDSIVNLACMENSGIINLLFNDATQSSSPIKNNGV FAKLKFKINSNAASGTYQINAEGYGKFSGNLNGKLTSINPIFENGIINIGNVTVKPTSIPADSSrPnPTA TPTATPTTKGTPÍZVTPIYWMNVLIGNMNAAIGEEVVVPIEFKNVPPFGINNCDFKLVYDSNALELKKVEA GDIVPEPLANLSSNKSEGKIQFLFNDASQGSMQIENGGVFAKITFKVKSTAASGIYNIRKDSVGSFSGLI DNKMTSIGPKFTDGSIVVGTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPIATPTIKGTPTATmYWMmVIGKMN AEVGGEVVVPIEFNNVPSFGINNCDFKLVYDATALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDA SQGSMQIENGGVFAKITFKVKSTTATGVYDLRKDLVGSFSGLKDNKMTSIGAEFENGSITVAATAPTVTP TVNATPSAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSAATPTVTPTATATPSVTI
PTVTPTVTATPSDTIPTVTPTATATPSAIVTTITPTATAKPIATPTIKGTPTATPM.YWMNW1GKMNAEV GGEVVVPIEFKNVPSFGINNCDFKLVYDATALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKIS FLFNDASQG SMQIENGGVSAKITFKVKSTTAIGVYDIRKDLIGSFSGLKDSKMTSIGAEFTNGSirVArrAPrYPPrAP ATPSVTIPTVTPTATATPGTATPGTATPTATATPGAATPTETATPSVMIPTVTPTATATPTATATPTVKG rPTPPPYYKMNVVIGRVNVVAGEEVVVPVEFKNIPAIGVNNCNFVLEYDANVLEVKKVDAGEIVPDALIN FGSNNSDEGKVYFLFNDALQGRMQIANDGIFANITFKVKSSAAAGIYNIRKDSVGAFSGLVDKLVPISAE FTDGS1SNESAKSTPTATATGTNVTPTVAATVTPTATPASTTPTATPTATSTVKGTPTATPLY SMNVIIG KVNAEASGEVVVPVEFKDVPSIGINNCNFILEYDASALELDSAEAGEIVPVPLGNFSSNNKDEGKIYFLF SDGTQGRMQIVNDGIFAKIKFKVKSTASDGTYYIRKDSVGAFSGLIEKKIIKIGAEFTDGSITVRSLTPT PTVTPNVASPTPTKVVAEPTSNQPAGPGPITGTIPTATTTATATPTKASVATATPTATPIVVVEPTIVRP GYNKDADLAVFISSDKSRYEESSIITYSIEYKNIGKVNATNVKIAAQIPKFTKVYDAAKGAVKGSEIVWM IGNLAVGESYTKEYKVKVDSLTKSEEYTDNTVTISSDQTVDIPENITTGNDDKSTIRVMLYSNRFTPGSH SSYILGYKDKTFKPKQNVTRAEVAAMFARIMGLTVKDGAKSSYKDVSNKHWALKYIEAVTKSGIFKGYKD STFHPNAPITRAELSTVIFNYLHLNNIAPSKVHFTDINKHWAKNYIEEIYRFKLIQGYSDGSFKPNNNIT RAEVVTMINRMLYRGPLKVKVGSFPDVSPKYWAYGDIEEASRNHKYTRDEKDGSEILIE (SEQ ID NO. : 7)
Las figuras 4A a 4C muestran el esquema de dominio estructural para el precursor B de formación de armazones de anclaje celulosómico [Bacteroidescellulosolvens]. La figura 4A muestra el esquema de dominio estructural, son los análisis de NetOGlyc 1.0 Server y NetNGlyc 1.0 Server para cipA que muestran sitios de glucosilación ligados a O (figura 4B) y ligados a N (figura 4C) altamente predichos. En particular, los sitios ligados a O están en gran parte dentro de las secuencias enlazadoras.
La presente divulgación incluye composiciones y métodos para el uso de secuencias enlazadoras de dominios interestructurales derivadas de organismos degradadores de celulosa como secuencias enlazadoras entre dominios preferidas en la modificación por ingeniería de proteínas, en particular aquellas con sitios de glucosilación altamente predichos para su uso en proteínas modificadas por ingeniería producidas en hospedadores de expresión eucariotas. Se ha encontrado que entre las propiedades mejoradas obtenidas usando estas secuencias se encuentran: i) flexibilidad inherente, facilitando, de este modo, la separación de los dominios unidos que deberían ayudar en gran medida a corregir el plegamiento de los dominios enlazados durante la síntesis y manteniendo el acceso sin obstáculos al hacer coincidir los receptores de epítopos conformacionales de antígenos en los linfocitos B; ii) glucosilación, ayudando, de este modo, a la secreción y solubilidad de la proteína de fusión del producto y protegiendo las secuencias enlazadoras de las proteasas.
Eliminación de sitios de escisión proteolítica con la secuencia gag. La figura 5 carril 1 [abajo] muestra el producto de expresión purificado de [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Viralgag-p40] C535 cotransfectado con el plásmido de expresión de la cadena L apropiado. La secuencia de la cadena H madura de C535 [los restos de gag están en cursiva y los restos codificados por el sitio de restricción de enlace subrayados] es:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEKLmHYTQKSISISIGKASLEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHI VWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKI EEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSA LSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQ EQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVK NWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVG (SEQ ID NO.: 8)
La flecha superior en la figura 5 muestra la posición aproximada esperada para la cadena H codificada en C535; solamente una pequeña parte del producto tiene una banda en esta posición. La mayor parte del producto, indicada por la flecha inferior, es una cadena H más corta de un tamaño que sugiere la existencia de un sitio sensible a proteasas aproximadamente en el límite de gag p17-p24.
La figura 6 carril 3 [abajo] muestra el producto de expresión parcialmente purificado de [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-var1-Viralgag-p40-var1-6xHis] C601 cotransfectado con el plásmido de expresión de cadena L apropiado. La secuencia de la cadena H madura de C535 [los restos de gag están en cursiva, los restos codificados por el sitio de restricción de enlace están subrayados y los restos del enlazador flexible están en negrita] es:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLEMGARA SILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEEL RSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDSEFAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMV HQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWD RVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSIL DIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGV GHHHHHH (SEQ ID NO.: 9)
La secuencia de gag anterior tiene un cambio de secuencia de KKK a VDESF [mostrado anteriormente subrayado] eliminando un posible sitio sensible a proteasas hacia el extremo C de gag p17 y la figura 6 muestra que esta forma variante se produce con una cadena H que está en gran parte sin degradar [ las bandas de menor peso molecular en el carril 3 son 'contaminantes de fondo' - véase la figura 7].
En este caso se describen variantes de gag p40 [p17 p24] con cambios en la secuencia KKK definida anteriormente que evitan la escisión proteolítica de las proteínas gag p17 p24 unidas secretadas.
Anticuerpos unidos al antígeno nef de VIH preferido. Una vacuna preferida que dirija los antígenos de VIH a las células dendríticas tendría una cantidad máxima de antígeno gag unido a una cantidad máxima de antígeno nef. La figura 7 carril 4 [abajo] muestra el producto de expresión parcialmente purificado de [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-ViralNef] C757 cotransfectado con el plásmido de expresión de la cadena L apropiado. La secuencia de la cadena H madura de C757 [los restos del clado B consenso de nef están en cursiva, los restos codificados por el sitio de restricción de enlace están subrayados y el enlazador flexible está en negrita] es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE
f y v i t j_i ffü y t ñiivrr jun y v s j_it u l¡ v jmj t ■ifü u ± a v t m t a in a g e e in jn i r t t ef v j_i u s jjg a £ ■ t ■ j_i iü k j_i t v jj ¡s. a RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMGG-KWS-K RSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLR PMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVP VEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDC (SEQ ID NO.: 10)
El análisis del producto anticuerpo-antígeno mostrado en la figura 7 muestra varias construcciones cadena H-antígeno cotransfectadas transitoriamente en células 293F con construcciones de expresión de cadena L apropiadas idénticas. Cada carril representa el producto de un sobrenadante de células de transfección de 5 ml [producción de 3 días] unido a exceso de perlas de proteína A, lavado 2 veces con PBS NaCl 1 M, eluido con HCl 20 mM, secado, disuelto en tampón de muestra de SDS PAGE reductor y analizado mediante SDS PAGE reducido con tinción con azul de Coomassie. Esta técnica permite evaluar no solamente la integridad del producto de cadena H esperado, sino que permite la estimación de los niveles de producción relativos de los productos anticuerpo-antígeno. La cuestión del nivel de producción correspondiente es muy importante, ya que los costes de producción de la vacuna dependerán en gran medida del rendimiento de la vacuna secretada intacta en los sistemas de fermentación de células de mamífero a gran escala. Si bien los niveles de expresión pueden aumentarse en gran medida a través de sistemas de vectores alternativos, en particular portando elementos de ADN que favorecen la transcripción potenciada cuando se integran en el genoma de una célula de mamífero y la selección de clones de células transfectadas de alta producción, estos enfoques se benefician en gran medida de las construcciones iniciales que expresan el producto secretado intacto con buen rendimiento sin aplicar estos enfoques adicionales. La enorme variación en la producción de fusiones anticuerpo-antígeno secretadas a partir de células de mamífero transfectadas ha sido bien documentada en solicitudes de patente anteriores [cohesina-dockerina y DCIR] y estos datos muestran que el nivel de producción es en gran medida independiente del vehículo del anticuerpo [regiones variables y constantes], sino que es más bien una propiedad intrínseca del propio antígeno. Por lo tanto, la figura 7, carril 4, muestra una producción muy eficaz de [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Viral-Nef], mostrando que esta configuración de anticuerpo fusionado al antígeno nef de clado B consenso unido a través de QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP es muy favorable.
Anticuerpos unidos a determinados antígenos gag y nef de VIH preferidos. [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flexv1-Viralgag-p40-ViralNef] C758 tiene el antígeno nef de clado B consenso añadido directamente proximal al antígeno gag p40 variante descrito anteriormente [los restos de unión están subrayados y la secuencia enlazadora flexible está en negrita]:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLEMGARA SILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEEL RSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDSEFAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMV HQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWD RVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSIL DIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGV GGPASMGGKWSKRSWGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEE VGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRY PLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKD
C (SEQ ID NO.: 11)
La figura 7, carril 5, muestra que este plásmido de expresión dirige la síntesis de esta fusión de cadena H-antígeno cuando se cotransfecta con la cadena L apropiada y se expresa muy escasamente como un producto secretado. Los carriles 6-9 muestran los productos secretados a partir de las células 293F cotransfectadas con el plásmido de expresión de la cadena L y las construcciones de expresión de cadena H gag que tienen inserciones de secuencias codificantes de antígeno nef de ciado B consenso asociadas con secuencias enlazadoras flexibles proximales y/o distales. La adición de las secuencias enlazadoras flexibles facilita la secreción de la vacuna de fusión anticuerpogag/nef intacta. Una construcción preferida para la producción de los niveles más altos de vacuna es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-f3-nef-f4-p24-6xHis] C791 [véase el carril 9]. Debido a que los niveles relativos de fusiones anticuerpo-antígeno en dichos sistemas de expresión en mamíferos son en gran medida independientes de la región V del anticuerpo, las vacunas de anticuerpo-antígeno gag/nef que se dirigen a diferentes receptores de CD deberían tener una ventaja similar en la producción si [-Flex-v1-p17-f3-nef-f4-p24-6xHis] se añade al extremo C de su cadena H.
La cadena H del carril 6 es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Viralgag-p40-f4-nef] C767 [los restos de unión están subrayados, los restos de enlazador flexible están en negrita y los restos de antígeno están en cursiva]:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTTSVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLEMGARA SILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEEL RSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDSEFAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMV HQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWD RVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSIL DIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGV GGPTNGSI TVPAUYPTVTPTVNATPSAAGPASMGGKWSKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLE KHGAITSSNTAANNADCAWLEA<QEEEEVGFPVRP<QVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYS<QKRQD ILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPER EVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDC (SEQ ID NO.: 12)
La cadena H del carril 7 es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-nef-f4-p24-6xHis] C790 C767 [los restos de unión están subrayados, los restos de enlazador flexible están en negrita y los restos de antígeno están en cursiva]:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTTSVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLEMGARA SILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEEL RSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDMGGKWSKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGA VSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIY SQKRQDILDL WVYHTQGYFPDWQNY TPGPGIRYPL TFGWCFKL VPVE PEKVEEANEGENNSLLHPMS LHG MDDPEREVL VWKFDSRLAFHHMARELHPE YYKDCEFTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAQ FAQQAAAD TGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQLGWMTHNPPIPVGEI YKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK TILKALGPGATLEEMMTACQGVGHHHHHH (SEQ ID NO. : 13)
La cadena H del carril 8 es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-f3-nef-p24-6xHis] C797 C767 [los restos de unión están subrayados, los restos de enlazador flexible están en negrita y los restos de antígeno están en cursiva]:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLE-MGARA SILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEEL RSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDTVTPTATATPSATVTTITPTATTKPVDMGGKW SKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVP LRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKL VPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDCEFAQQAAAD TGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEI YKRWIILGLNKIVRMYS PTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK TILKALGPGATLEEMMTACQGVGHHHHHH (SEQ ID NO.: 14)
La cadena H del carril 9 es [mAnt¡-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-f3-nef-f4-p24-6xH¡s] C791 C767 [los restos de unión están subrayados, los restos de enlazador flexible están en negrita y los restos de antígeno están en cursiva]:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLEMGARA SILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEEL
R.SLYNTVA^TLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDTVTPTATATPSA.XVT'TXTPTAT'TKPVDMGGKW SKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVP LRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKL VPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDCEFTtUGSlTV AATAPTVTPTVNATPSAAQ FAQQAAADTGHSNQVSQNY PIVQNIQGQMVHQAIS PRTLNAWVKWEEKAF SPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGS DIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTL RAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGHEmm (SEQ ID NO.:15)
A continuación, se muestra una modificación adicional que se está probando para eliminar la degradación residual detectada en condiciones de fermentación intensa en la producción de células CHO-S de la proteína anterior con un cambio de KKK a NKQ resaltado en subrayado, negrita, cursiva:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLT ISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLEMGARA SILSGGELDRWEKIRLRPGGNKQYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEEL RSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDTVTPTATATPSATVTTXTPTATTKPVDMGGKW SKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVP LRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKL VPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDCFFTtXGSITV AA’TPíBTV’T'P’YVNA’X'BSAAQFAQQAAADTGHSNQVSQNY PIVQNIQGQMVHQAIS PRTLNAWVKWEEKAF SPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGS DIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTL RAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGRHHHHE (SEQ ID NO. : Se observó que determinadas fusiones antígeno gag-nef con epítopos de antígeno máximos tienen propiedades de secreción/producción eficaces. Se observó que las variantes de gag p40 con inserciones o apéndices de antígeno nef flanqueadas por secuencias enlazadoras flexibles preferidas se producían y secretaban particularmente bien. Se observó que las secuencias enlazadoras flexibles divulgadas en el presente documento y que se pueden obtener a partir de organismos degradadores de celulosa eran capaces de facilitar la secreción de antígenos intactos y/o antígenos unidos como proteínas de fusión anticuerpo-antígeno.
Secuencias de ADN de la secuencia codificante del antígeno: la región del antígeno C757 es [las secuencias en negrita son sitios de unión o un codón de parada]:
GCTAGCATGGGAGGCAAATGGAGTAAAAGAAGTGTTGTGGGTTGGCCAACTGTGAGAGAAAGAATGAGAA GGGCTGAACCAGCCGCTGATGGTGTAGGTGCTGTGTCACGAGATCTGGAAAAACACGGAGCAATAACATC CTCTAATACCGCCGCAAATAACGCAGACTGTGCCTGGCTCGAAGCTCAAGAAGAAGAAGAAGTCGGATTC CCCGTGCGACCCCAAGTTCCCCTCAGACCAATGACTTATAAAGGCGCTCTGGATCTTAGCCACTTTCTTA AAGAAAAAGGAGGACTGGAAGGACTTATTTATTCACAAAAAAGACAAGACATCCTCGATTTGTGGGTATA TCATACTCAAGGTTATTTCCCAGACTGGCAAAATTATACTCCTGGACCCGGCATTCGATATCCCCTTACC TTTGGATGGTGCTTTAAACTTGTCCCCGTCGAACCTGAAAAAGTAGAAGAAGCAAATGAAGGCGAAAATA ATTCACTGCTCCACCCTATGTCACTGCACGGAATGGATGACCCCGAACGCGAAGTTCTGGTATGGAAATT TGAT TCAAGAC TTGCTTTT CACCACATGGC TAGAGAAC TTCACCCC GAATAT TATAAAGAC TG TTGA
(SEQ ID NO. : 17)
El enlazador C791 y la secuencia codificante de antígeno es [las secuencias en negrita son sitios de unión o un codón de parada]:
GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCA ACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGCCTCGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAATATTAAGCGGTGGCGAATTAGA TAGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCA AGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATAC TGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAAC CCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAG CAAAACAAAAGTGTCGATACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCA CCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGTCGACATGGGAGGCAAATGGAGTAAAAGAAGTGTTGTGGGTTGGCC AACTGTGAGAGAAAGAATGAGAAGGGCTGAACCAGCCGCTGATGGTGTAGGTGCTGTGTCACGAGATCTG GAAAAACACGGAGCAATAACATCCTCTAATACCGCCGCAAATAACGCAGACTGTGCCTGGCTCGAAGCTC AAGAAGAAGAAGAAGTCGGATTCCCCGTGCGACCCCAAGTTCCCCTCAGACCAATGACTTATAAAGGCGC TCTGGATCTTAGCCACTTTCTTAAAGAAAAAGGAGGACTGGAAGGACTTATTTATTCACAAAAAAGACAA GACATCCTCGATTTGTGGGTATATCATACTCAAGGTTATTTCCCAGACTGGCAAAATTATACTCCTGGAC CCGGCATTCGATATCCCCTTACCTTTGGATGGTGCTTTAAACTTGTCCCCGTCGAACCTGAAAAAGTAGA AGAAGCAAATGAAGGCGAAAATAATTCACTGCTCCACCCTATGTCACTGCACGGAATGGATGACCCCGAA CGCGAAGTTCTGGTATGGAAATTTGATTCAAGACTTGCTTTTCACCACATGGCTAGAGAACTTCACCCCG AATATTATAAAGACTGTGAATTCACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCC CACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCCAATTCGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAAT CAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTA GAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTC AGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCA GCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTGCATCCAGTGCATG CAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCT TCAGGAACAAATAGGATGGATGACACATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGGTGGATA ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAA AGGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGATTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCACAAGAGGT AAAAAATTGGATGACAGAAACCTTGTTGGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCA TT GGGACCAGGAGCGACACTAGAAGAAATGAT GACAGCAT GTCAGGGAGTGGGGCAT CACCAT CACCAT C ACTGA (SEQ ID NO.: 18)
Los siguientes ejemplos muestran que la presente divulgación fue capaz de dirigir el VIH y otros antígenos a CD humanas a través de CD40. Generación de potentes anticuerpos monoclonales anti-CD40 activadores. Los ratones se inmunizaron con una proteína de fusión IgG2b de ratón-CD40 humana y los linfocitos B de los ganglios linfáticos que drenan el sitio de inyección se inmortalizaron posteriormente como hibridomas. Se probaron sobrenadantes de 35 hibridomas que secretan anticuerpos anti-CD40 reactivos detectados por FACS frente a células 293F transfectadas con ADNc de CD40 en cultivos de una noche de células dendríticas humanas para determinar la inducción de secreción de citocinas. La figura 8 muestra un ejemplo de este tipo de exploración diseñada para detectar el subconjunto de anticuerpos anti-CD40 que pueden unirse y activar CD40. Este conjunto de datos muestra que dos hibridomas 12E12 y 9A11 fueron especialmente potentes en el direccionamiento CD a IL-12p40 secretada. Los ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera de 12E12 se obtuvieron usando tecnologías de clonación y secuenciación convencionales y las regiones variables se modificaron por ingeniería en vectores que expresan regiones variables de 12E12 de ratón injertadas en regiones constantes de IgG4 humana.
C269 rAB-pIRES2 [manti-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C] La secuencia de ADN a continuación muestra la región codificante de la cadena ligera quimérica y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera madura secretada esperada con la región variable de ratón en cursiva.
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGA TGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGTGCAAGTCA GGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTAC ACATCAATTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCA CCATCGGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTACTATTGTCAGCAGTTTAATAAGCTTCCTCCGAC GTTCGGTGGAGGCACCAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGA CAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT GIIAGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGS GSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQEKSGTASVVCE LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC (SEQ ID NO.: 19)
C230 rAB-pIRES2[manti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C] La secuencia de ADN a continuación muestra la región codificante de la cadena pesada quimérica y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera madura secretada esperada con la región variable de ratón en cursiva.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGG TGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCAC TTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATT AATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATG CCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAG ACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA ACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC
m p p 7 \ r * r ^ 7 \ r-* m m i \ r * 7\ r * p m 7 \ r * 7\ r * r * 7\ 7\r'*rHrp7\r~,7\rnr''7\r''7\ 7\ ~r\ r~ * i\ r ^ r ^ i \ i \ r * t\ r * T \ AGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATC AGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATA ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGG AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC TCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCT CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAG CTGAEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKG RFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO. : 20)
Las variantes de C230 se modificaron por ingeniería para codificar cadenas H de CD4012E12 con antígenos fusionados al extremo C de IgG4 humana, por ejemplo, C291 rAB-pIRES2 [manti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C-Flex-FluHA1-1-6xHis] codifica una cadena H con la secuencia que se muestra a continuación con la región del antígeno HA1-1 de gripe en cursiva y se muestra una secuencia enlazadora flexible y una etiqueta de polihistidina carboxiterminal en negrita:
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDTJCJGYiíAMVSTDTV.DTVLF.KZVVTVTií SVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDY EELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKK GKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDT IIFEANGNLIAPMYAFAL SRGFGSGIITSNASMHECNTKCQ TPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECLKYVRS AKRRMVHHHHHH (SEQ ID NO.: 21)
Otro tipo de construcción de cadena H variante es C450 rAB-pIRES2 [manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Dockerin-varl] codifica una cadena H con la secuencia que se muestra a continuación con una región de antígeno de dominio dockerina carboxiterminal que se muestra en cursiva:
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SRLTVDKSRWQEGN YFSCSVMHEALHNHYIQKSESESEGKASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKA EKNADVNRDGRVDSSDVTILSRYLIRVIEKLPI (SEQ ID NO.: 22)
Por lo tanto, los vectores de expresión que codifican las cadenas H variantes anteriores y similares pueden cotransfectarse en células 293F o CHO-S dando como resultado la secreción de proteínas de fusión de anticuerpos anti-CD4012E12-hIgG4, que puede purificarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad con proteína A.
Dichas proteínas de anticuerpo-antígeno se pueden usar como vacunas para suministrar antígeno con alta eficacia a las células dendríticas humanas. in vitro o in vivo. La proteína dockerina anti-CD4012E12-hIgG4 puede usarse igualmente para suministrar proteínas de fusión cohesina-antígeno. Por ejemplo: C32 Ecoli-pET28 [Cohesina-FluM1-6xHis] codifica la secuencia que se muestra a continuación, donde la proteína M1 de gripe se muestra en cursiva:
MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFD TAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFF DGGVNYGDTTEPATPTTPNTTPTTTDDEDAASLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLE VLMEWIKTRPIISPLTKGILGFVFTITVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFH GAKEIALSYSAGALAS CMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMV
LAS TTAKAMEQMAGSSEQAAEAMDIAS QARQMV QAMR TIGTHPS SSAGLKDDL LENLQAYQKRMGVQMQR FKLEHHHHHH (SEQ ID NO.: 23)
La proteína anterior se puede expresar como proteína soluble en E. coli y preparar como un producto puro por intercambio iónico y cromatografías de afinidad con metales. Los complejos o conjugados altamente estables entre la proteína de fusión anti-CD4012E12-hIgG4 dockerina y la proteína de fusión cohesina Flu M1 pueden ensamblarse a través de la interacción de alta afinidad dockerina-cohesina.
Se incubó un intervalo de dosis de dichos conjugados dockerina anti-CD4012E12-hIgG4-cohesina Flu M1 con células dendríticas humanas durante un día, después se añadieron linfocitos T CD8+ singénicos y se continuó la incubación durante varios días más. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD8 y un reactivo de tetrámero HLA-A2 específico para linfocitos T que llevan TCR correspondiente al epítopo 58-66 de Flu M1 inmunodominante. Las células positivas al tetrámero se muestran en la ventana encuadrada. Estos datos muestran que concentraciones de conjugados dockerina anti-CD4012E12-hIgG4 cohesina Flu M1 tan bajas como 0,001 ug/ml provocan la proliferación de linfocitos T CD8+ específicos de Flu M1 a niveles significativamente más altos que sin conjugado añadido o [panel de la siguiente figura] que una serie de intervalos de dosis paralelos de conjugados de control dockerina de IgG4 cohesina Flu M1. Estos datos demuestran que el anticuerpo anti-CD4012E12 es notablemente competente en el suministro de antígeno a las CD, lo que da como resultado el procesamiento y la presentación del antígeno como se observa mediante la proliferación de linfocitos T específicos de antígeno.
La figura 9 muestra el análisis FACS de la tinción de CD8+ [eje horizontal] frente a la tinción de tetrámero M1 con Flu [eje vertical] según lo provocado por un intervalo de dosis de 10 ug/ml a ningún conjugado de dockerina anti-CD4012E12-hIgG4-cohesina Flu M1.
La figura 10 muestra el análisis FACS de la tinción de CD8+ [eje horizontal] frente a la tinción de tetrámero M1 con Flu [eje vertical] según lo provocado por un intervalo de dosis de 10 ug/ml a ningún conjugado de dockerina hIgG4-cohesina Flu M1 de control.
Alineación de la secuencia de la cadena ligera anti-CD4012E12 de C269 (seqA) con variantes modificadas por ingeniería para conservar la unión a CD40 y potenciar la similitud con las secuencias variables de cadena ligera humana, y mediante la inclusión de codones preferidos para potenciar la expresión del producto secretado.
seqA DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPS seqB DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS seqC DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS seqD DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS seqE DIQMTQTTSSLSTSLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS
■k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k-k • kkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk•kkkkkkkkkkk seqA RFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP seqB RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP seqC RFSGS-SGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
seqD RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKPPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP seqE RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
kkkkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkkkk kkkkk seqA SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT seqB SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT seqC SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT seqD SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
seqE SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
kkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkk seqA LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seqB LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seqC LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seqD LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seclE LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
kkkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk
(SEQIDNO:24,25,26,27,28respectivamente)
Alineación de la secuencia de la cadena pesada anti-CD4012E12 de C268 (seqA) con una variante modificada por ingeniería para conservar la unión a CD40 y potenciar la similitud con las secuencias variables de cadena ligera humana, y mediante la inclusión de codones preferidos para potenciar la expresión del producto secretado.
seqA EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYY seqB EVNLVESGGGLVQPGGSLKVSCVTSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYY
kk • kkkkkkkkkkkkkkkk • kk kkkkkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk k seqA PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSA seqB PDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTLVTVSVA
kk kkkkkkkkk kkkkkk • kkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkkk k kk kk k seqA KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG seqB STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
kkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkk seqA LYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVF seqB LYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVF
kkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkkk seqA LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR seqB LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR kirkkirkkirkkkk'kirkkkirkkirkkkkirkkirkirkk'kkkiririrkkirkkkkirkkkkirkkirkkkkir seqA VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN seqB WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN
kk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkk kkkkkk kkkkkk seqA QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN seqB QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN
k kkkkkk kkkkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkk kkkkkk kkkkkk kkkkkkk kkkkkk k seqA VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
seqB VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
(SEQ ID NO: 29, 30, respectivamente)
La figura 11 muestra el protocolo utilizado para analizar invitro la potencia de las moléculas de direccionamiento[TM] antirreceptores de CD-antígeno para provocar la expansión de linfocitos T específicos de antígeno en el contexto de un cultivo de PBMC. En resumen, se incuban PBMC 2E6 a partir de aféresis de pacientes con VIH con un intervalo de dosis de la vacuna de direccionamiento y 100 U/ml de IL-2. Los medios se cambian cada dos días. El día 7 se añaden grupos de péptidos correspondientes al antígeno para inducir la producción de IFNy por los linfocitos T con especificidades de TCR para secuencias de péptidos dentro de cada grupo. Después de 4 horas de incubación con el grupo de péptidos y un agente que bloquea la secreción de citocinas, las células se tiñen con reactivos anti-CD4, anti-CD8, anti-IL-13 y anti-IFNy y se analizan mediante FACS.
Las figuras 12 y 13 muestran los efectos del direccionamiento a las CD [dentro de las PBMC] con una vacuna anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24; la composición de la cadena H se muestra a continuación: C818 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Viralgag-p17-f3-nef-f4-p24-6xHis] los restos de unión están subrayados, los restos de enlazador flexible están en negrita y los restos de antígeno están en cursiva]:
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASLE-MGARA5TLSGG ELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNT VATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDTVTPTATATPSATVTT1TPTATTKPVDMGGKWSKRSW GWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTY KGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPE KVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDCEFTNGSITVAATAPT
'VTPTVÑA’EPSAAQFAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIP MFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTT STLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQAS QEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGHHHHHH (SEQ ID NO.:31)
La figura 12 muestra que la vacuna provoca la expansión de linfocitos T CD4+ con especificidades para todos los grupos de péptidos gag p24; incluso en la vacuna más baja probada, el porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no fueron tratadas con péptidos. La figura 13 [panel superior] muestra estos datos en forma de gráfico; el eje vertical muestra el porcentaje (%) de células productoras de IFNy. El panel inferior muestra datos similares para linfocitos T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia de gag p24 provocaron una producción significativamente mayor de linfocitos T productores de IFNy que el control sin péptidos. Por lo tanto, la vacuna provocó respuestas potentes y contra múltiples epítopos dentro de gag p24 de VIH.
La figura 14 muestra que la vacuna provoca la expansión de linfocitos T CD4+ con especificidades para todos los grupos de péptidos gag p17; incluso en la vacuna más baja probada, el porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no fueron tratadas con péptidos. La figura 15 muestra estos datos en forma de gráfico; el eje vertical muestra el porcentaje de células productoras de IFNy [panel superior]. El panel inferior muestra datos similares para linfocitos T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia de gag p17 provocaron una producción significativamente mayor de linfocitos T productores de IFNy que el control sin péptidos. Por lo tanto, la vacuna provocó respuestas potentes y contra múltiples epítopos dentro de gag p17 de VIH.
La figura 16 muestra que la vacuna provoca la expansión de linfocitos T CD4+ con especificidades para la mayoría de los grupos de péptidos de nef del VIH; incluso en la vacuna más baja probada, el porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no se trataron con péptidos. La figura 17 muestra estos datos en forma de gráfico; el eje vertical muestra el porcentaje de células productoras de IFNy [panel superior]. El panel inferior muestra datos similares para los linfocitos T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia de nef provocaron una producción significativamente mayor de linfocitos T productores de IFNy que el control sin péptidos. Por lo tanto, la vacuna provocó una respuesta potente y contra múltiples epítopos dentro de nef de VIH.
Se observó que los datos muestran que la vacuna [anti-CD4012E12 - unida a la proteína de fusión gag p17 nef gag p24 especialmente modificada por ingeniería] puede, incluso en dosis bajas, provocar amplias respuestas inmunitarias, es decir, amplia representación de epítopos en los compartimentos de linfocitos T tanto CD4+ como CD8+. Estos datos demuestran además que cada una de las dos partes de la vacuna [anti-CD4012E12 y otros anticuerpos con propiedades especiales similares, y el antígeno gag-nef modificado por ingeniería para una representación máxima de epítopos consistente con una producción eficaz] - es decir, el componente anti-CD40 puede ser un vehículo para el suministro de otros antígenos y el componente de antígeno puede suministrarse mediante otros vehículos antirreceptores de CD. Los resultados también demuestran la capacidad del direccionamiento basado en CD40 para expandir una amplia gama de linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de antígeno tanto de poblaciones de linfocitos T de memoria [pacientes con VIH que recibieron la vacuna contra el VIH] como no expuestos previamente [donantes normales que recibieron antígeno PSA].
Las CD dirigidas con anti-CD40-PSA inducen respuestas de linfocitos T CD4+ específicos de PSA. La figura 18 muestra el esquema de un protocolo para probar la capacidad de una vacuna compuesta de anti-CD40-12E12 unido a PSA [antígeno específico de próstata] para provocar la expansión, a partir de una población de linfocitos T no expuestos previamente, de linfocitos T CD4+ específicos para PSA correspondientes a una amplia matriz de epítopos de PSA. En resumen, Las CD derivadas del cultivo con IFNa y GM-CSF de monocitos de un donante normal se incuban con la vacuna. El día siguiente, las células se colocan en medio nuevo y se añaden linfocitos T CD4+ puros del mismo donante. Varios días después, se añaden péptidos de PSA y, después de cuatro horas, se determinan los niveles de IFNy secretado en los sobrenadantes de cultivo.
La figura 19 muestra que muchos péptidos de PSA provocan potentes respuestas de producción de IFNy, lo que indica que anti-CD4012E12 y agentes antiCD40 similares pueden suministrar antígenos a las CD de manera eficaz, dando como resultado el cebado de respuestas inmunitarias contra múltiples epítopos del antígeno.
La figura 20 muestra que las CD dirigidas con anti-CD40-PSA dirigido a las CD inducen respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de PSA. Los IFNDC se dirigieron con 1 pg de proteína de fusión de mAb con PSA. Se cultivaron conjuntamente linfocitos T CD8+ autólogos purificados durante 10 días. Las células se tiñeron con anti-CD8 y tetrámero de PSA (KLQCVDLHV). Las células son de un donante sano positivo HLA-A*0201. Los resultados demuestran que anti-CD40 suministra de manera eficaz PSA a la CD, que a su vez provocan la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de PSA.
La figura 21 describe el protocolo de direccionamiento de CD para probar vacunas de direccionamiento antirreceptores de CD para determinar su capacidad para dirigir la expansión de linfocitos T específicos de antígeno que es el resultado de la captación dirigida por las CD y la presentación de epítopos de antígeno en su superficie celular. En resumen, los monocitos de pacientes con VIH se diferencian en CD mediante cultivo durante 3 días en IFNa y GM-CSF. A continuación, se añade la vacuna [FP] a 10 ug/ml junto con linfocitos T autólogos. Después de 10 días en cultivo, se añaden grupos de péptidos de antígeno a los linfocitos T expandidos y después de 4 horas se mide el IFNa intracelular.
La figura 22 [panel superior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph002]. La vacuna anti-CD4012E12 nef [barras verdes] estimuló la expansión de linfocitos T CD4+ productores de IFNa sensibles solamente a los epítopos del péptido nef, anti-CD4012E12 gag p24 [barras azules] estimuló la expansión de linfocitos T CD4+ productores de IFNa que sensibles solamente a los epítopos del péptido p24, mientras que el anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 estimuló la expansión de linfocitos T CD8+ productores de IFNa sensibles a epítopos de los péptidos gag p17, nef y p24.
La figura 22 [panel inferior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph002]. La vacuna anti-CD4012E12 nef [barras verdes] estimuló la expansión de linfocitos T CD8+ productores de IFNa sensibles solamente a los epítopos del péptido nef, mientras que anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [barras naranjas] estimuló la expansión de linfocitos T CD8+ productores de IFNa sensibles a los epítopos tanto del péptido gag p17 como nef.
La figura 23 [panel superior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph010]. La vacuna anti-CD4012E12 nef [barras verdes] estimuló la expansión de linfocitos T CD4+ productores de IFNa sensibles solamente a los epítopos del péptido nef, anti-CD4012E12 gag p24 [barras azules] estimuló la expansión de linfocitos T CD4+ productores de IFNa que sensibles solamente a los epítopos del péptido p24, mientras que el anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 estimuló la expansión de linfocitos T CD8+ productores de IFNa sensibles a epítopos de los péptidos gag p17, nef y p24.
La figura 23 [panel inferior] muestra una comparación de la eficacia de vacunas anti-CD4012E12 nef, anti-CD4012E12 gag p24 y anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [paciente Aph002]. La vacuna anti-CD4012E12 nef [barras verdes] estimuló la expansión de linfocitos T CD8+ productores de IFNa sensibles solamente a los epítopos del péptido nef, anti-CD4012E12 gag p24 [barras azules] estimuló la expansión de linfocitos T CD8+ productores de IFNa que sensibles solamente a los epítopos del péptido p24, mientras que anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 [barras naranjas] estimuló la expansión de linfocitos T CD8+ productores de IFNa sensibles a los epítopos tanto del péptido gag p17 como nef.
Estos datos demuestran que la vacuna anti-CD4012E12 gag p17 nef gag p24 puede provocar una amplia gama de respuestas de linfocitos T que cubren múltiples epítopos dentro de los tres elementos antigénicos de la vacuna, gag p17 de VIH, gag p24 de VIH y nef de VIH.
La siguiente secuencia es la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión cohesina [restos en negrita] - ciclina D1 [restos subrayados] expresada por el vector C515.
C515 E. coli-pET28 [Cohesina-hCiclinaD1-6xHis]
MDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPTKSFD TAVYPDRKMIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFF DGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASLEMEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEE TCAPSVSYFKCVQKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATC MFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELLLVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQ IIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMVAAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRA CQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDIHHHHHH (SEQ ID NO.:32)
Expresión y purificación de la proteína coh. ciclina D1 producida en E. coli.
Se expresó Coh. ciclina D1 en E. coli cepa T7 Express (NEB) cultivada en caldo Luria (Difco) a 37 °C con selección para resistencia a kanamicina (40 pg/ml) y agitación a 200 rondas/min hasta la fase de crecimiento logarítmico medio. Después se añadieron 120 mg/l de IPTG (Bioline) y después de 3 horas más, las células se recogieron por centrifugación y se almacenaron a -80 °C. Las células de E. coli de cada 1 L de fermentación se resuspendieron en 50 ml de Tris 50 mM enfriado con hielo, EDTA 1 mM pH 8,0 con 0.2 ml de inhibidor de proteasas Cocktail II (Calbiochem). Las células se sometieron a ultrasonidos dos veces en hielo durante 4 min en el ajuste 18 (Fisher Sonic Dismembrator 60) con un período de descanso de 5 min y después se centrifugaron a 17.000 rpm. (Sorvall SA-600) durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante de lisado celular de 50 ml se pasó a través de 10 ml de perlas de ANX Sepharose (GE Healthcare), después, el flujo pasante se ajustó al tampón de unión con 7,5 ml de Tris 160 mM, imidazol 40 mM, NaCl 4 M pH 7,9 y se cargó en una columna HP quelante HiTrap de 5 ml (GE Healthcare) cargada con Ni++. La proteína unida se lavó con NaPÜ420 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM pH 7,6 (tampón A) y se eluyó con un gradiente de imidazol de 10-500 mM en tampón A. Las fracciones de los picos se analizaron mediante gel SDS-PAGE, agrupados. Aproximadamente 15 miligramos de la proteína de fusión cohesina-ciclina D1 agrupada eluida se hicieron reaccionar durante la noche a temperatura ambiente con 10 miligramos de reactivo mPEG-MAL 20k (Nektar), que une un grupo pegilo de 20 kDa a restos de cisteína libres [de los cuales hay varios dentro del dominio ciclina D1]. Una parte de esta reacción se dializó frente a DPBS [Gibco] y una parte se ajustó a pH 7,5, después se añadió DTT a 10 mM durante 1,5 horas a temperatura ambiente para reducir los enlaces disulfuro, seguido de la adición de yodoacetamida 25 mM durante 1,5 horas a temperatura ambiente para alquilar los restos de cisteína libres, seguido de la adición de DTT 20 mM durante 1,5 horas a temperatura ambiente, seguido de diálisis frente a DPBS. Se requirió la pegilación para asegurar que la proteína permaneciera soluble en DPBS y la alquilación [que no era necesaria para la actividad de la proteína en el contexto del direccionamiento anti-CD40 in vitro] sirvió para asegurar que el producto estaba libre de formas reticuladas por disulfuro intermolecular.
Figura 24. Análisis de la interacción de la proteína de fusión cohesina-ciclina D1 con anticuerpo recombinante antirreceptores de CD-dockerina. Se incubó la proteína de fusión anticuerpo-dockerina o anticuerpo-nef de VIH [20 pg] con 100 pl de perlas de proteína A-Sepharose [GE Biosciences] y después se lavó dos veces con DPBS. Se añadieron [20 pg] cohesina-ciclina D1 [coh.ciclina D1][Peg] pegilada o pegilada y alquilada [peg alk] y, después de 30 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se separó de las perlas mediante centrifugación. Las perlas se eluyeron con HCl 20 mM y el eluato y el sobrenadante se secaron, se resuspendieron en tampón de carga SDS.PAGE y se ejecutaron en SDS.PAGe reductor y se visualizaron mediante tinción con azul de Coomasssie. El carril 1 muestra el sobrenadante de perlas cargadas con anticuerpo-dockerina coh. ciclina D1 peg y el carril 2 es el eluato de perlas correspondiente. El carril 3 muestra el sobrenadante de perlas cargadas con anticuerpo-nef de VIH coh. ciclina D1 peg y el carril 4 es el eluato de perlas correspondiente. El carril 5 muestra el sobrenadante de perlas cargadas con anticuerpo-dockerina coh. ciclina D1 peg alk y el carril 6 es el eluato de perlas correspondiente. El carril 7 muestra el sobrenadante de perlas cargadas con anticuerpo-nef de VIH coh. ciclina D1 peg alk y el carril 8 es el eluato de perlas correspondiente. El carril 9 muestra anticuerpo-dockerina solo, el carril 10 muestra anticuerpo-nef de VIH solo, el carril 11 muestra coh.ciclina D1 peg solo, y el carril 12 muestra coh.ciclina D1 peg alk solo. Las flechas [de arriba a abajo] muestran: 1) formas pegiladas de coh.ciclina D1,2 de alto peso molecular) la posición de la cadena pesada del anticuerpo, 3) la posición de la coh.ciclina D1 no pegilada [que es aproximadamente el 50 % de las preparaciones], 4) la posición de la cadena ligera del anticuerpo.
El análisis anterior muestra que el anticuerpo-dockerina, pero no el anticuerpo-nef de VIH, captura con eficacia la mayor parte de coh.ciclina D1. Esto demuestra que las preparaciones de coh.ciclina D1 pueden ensamblar un complejo con vehículos de direccionamiento antirreceptores de CD-dockerina.
El linfoma de células del manto (MCL, por sus siglas en inglés) es un linfoma no de Hodgkin de linfocitos B que representa el 5-10% de todos los linfomas no de Hodgkin, predominantemente en varones de edad avanzada. Es un cáncer muy agresivo y con peor pronóstico tras el tratamiento convencional, recaídas frecuentes y supervivencia relativamente corta. Tiene un rasgo genético: la traslocación t (11;14) (q13; q32) que da lugar a la sobreexpresión de ciclina D1.
La ciclina-D1 específica de G1/S - denominada alternativamente PRAD1, Bcl-1 funciona en el control de la progresión de G1 y la transición de G1/S en el ciclo celular mediante la formación de complejos con CDK4 y 6. No hay expresión normal en linfocitos maduros ya que la expresión depende del ciclo celular con expresión máxima en G1, mínima en S. Por lo tanto, aumentar las respuestas de los linfocitos T citotóxicos dirigidos específicamente a las células que sobreexpresan ciclina D1 es una estrategia de vacunación atractiva contra el MCL.
La figura 25 muestra un esquema de péptidos solapantes de ciclina D1. Estos se añaden a cultivos de linfocitos T, ya sea como péptidos individuales o como grupos de péptidos, donde pueden presentarse sobre MHC y de ese modo estimular la proliferación de linfocitos T específicos de péptidos.
La figura 26 muestra un esquema [panel izquierdo] del diseño del estudio para probar la capacidad de los complejos anti-CD40-ciclina D1 para provocar la expansión invitro de linfocitos T c D4+ específicos de ciclina D1. Después de la incubación de CD con el complejo de direccionamiento, se añaden linfocitos T CD4+ autólogos [es decir, del mismo donante] marcados con el colorante CFSC y el cultivo continúa durante 8 días adicionales con IL-2, después de 2 días de reposo sin IL-2. A continuación, el cultivo se divide y se estimula con péptidos de ciclina D individuales, o sin péptido, durante 8 horas seguido de tinción para IFNg e IL-2 intracelulares [indicadores de activación de linfocitos T] y análisis mediante FACS.
El análisis muestra que los péptidos P8, P16 y P54 de la ciclina D, estimulan una producción significativamente mayor de linfocitos T CD4+ proliferantes [es decir, marcados por dilución de CFSC] que las células incubadas sin péptido [u otros péptidos de ciclina D1 [no mostrado]. Por lo tanto, el complejo anti-CD40-CICLINA D1 funciona para provocar la expansión a partir de linfocitos T de un donante normal de linfocitos T específicos de ciclina D1 con fenotipo de función efectora.
La figura 27 muestra un estudio y análisis similar al detallado en la figura 26, excepto que se utilizó un donante normal diferente; en este caso, el complejo anti-CD40-ciclina D1 provocó la expansión de linfocitos T CD4+ proliferantes IFNg positivos específicos para los péptidos P4, P43 y P70 de ciclina D1.
La figura 28 muestra un esquema y análisis similares a los descritos anteriormente en la figura 26, excepto que se utilizaron linfocitos T CD8+. En este donante, el complejo anti-CD40-ciclina D1 provocó la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de ciclina D1, en particular aquellos con especificidades correspondientes a péptidos que se encontraban en el grupo I y en el grupo II.
La figura 29 muestra datos similares del mismo donante, pero analizados con péptidos individuales de estos conjuntos. En particular, estos linfocitos T muestran especificidad por los péptidos P7, P8 y P10.
El uso de la palabra "un" o "uno/a", cuando se usa junto con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva puede significar "uno/a", pero también es coherente con el significado de "uno/a o más", "al menos uno/a", y "uno/a o más de uno/a". El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse solamente a alternativas o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solamente a alternativas y a "y/o". A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que se está empleando para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de métodos adicionales que no se hayan mencionado. elementos o etapas de métodos adicionales que se hayan mencionado.
La expresión "o combinaciones de los mismos" como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los artículos enumerados antes de la expresión. Por ejemplo, "A", B, C o combinaciones de los mismos" se entiende que incluye al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o a Bc , y, si el orden es importante en un contexto en particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más artículos o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB y así sucesivamente. El experto en la materia entenderá que normalmente no hay ningún límite para el número de artículos o términos en ninguna combinación, a menos que resulte evidente de otro modo por el contexto.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína modificada por ingeniería para la expresión en hospedadores eucariotas, que comprende un enlazador de dominio interestructural que consiste en el péptido definido por la SEQ ID NO: 4.
2. Una proteína modificada por ingeniería de la reivindicación 1, en donde dicha proteína modificada por ingeniería es una proteína de fusión que comprende un enlazador de dominio interestructural que consiste en el péptido definido por la SEQ ID NO: 4.
3. Uso del péptido definido por la SEQ ID NO: 4 como enlazador de dominio interestructural en proteínas modificadas por ingeniería para mejorar la expresión en hospedadores eucariotas.
4. Un complejo anticuerpo-antígeno, que comprende:
un anticuerpo específico de células dendríticas (CD) o fragmento de unión a antígeno del mismo al que se une un antígeno Gag que es menos susceptible a la degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos o un antígeno Nef;
en donde el complejo anticuerpo-antígeno comprende un enlazador flexible que consiste en el péptido definido por la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6 entre el anticuerpo específico de CD o fragmento de unión a antígeno del mismo y el antígeno Gag o Nef.
5. El complejo anticuerpo-antígeno de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de CD se selecciona de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1 o ASGPR.
6. El complejo anticuerpo-antígeno de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de CD, se une específicamente a CD40.
7. El complejo anticuerpo-antígeno de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo específico de CD o fragmento del mismo está humanizado.
8. Una vacuna que comprende el complejo anticuerpo-antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2890230T3 (es) * 2008-07-16 2022-01-18 Baylor Res Institute Vacuna contra el VIH basada en el direccionamiento de Gag y Nef maximizado a células dendríticas
US20110311525A1 (en) * 2008-08-29 2011-12-22 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Delivery of a cd40 agonist to a tumor draining lymph node of a subject
CN103415534A (zh) * 2009-03-10 2013-11-27 贝勒研究院 靶向抗原呈递细胞的癌症疫苗
CN102741295A (zh) * 2009-03-10 2012-10-17 贝勒研究院 靶向抗原呈递细胞的抗病毒疫苗
BRPI1009455A2 (pt) 2009-03-10 2016-03-01 Baylor Res Inst anticorpos anti-c40 e usos dos mesmos
TWI483734B (zh) 2009-09-14 2015-05-11 Baylor Res Inst 針對蘭格漢氏細胞（ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ）之疫苗
JP5628544B2 (ja) * 2010-04-07 2014-11-19 株式会社豊田中央研究所 クロストリジウム・サーモセラム由来のタンパク質複合体を構築するためのタンパク質及びその利用
KR20130036246A (ko) 2010-05-07 2013-04-11 베일러 리서치 인스티튜트 사람 ｃｄ8+ ｔ 세포의 수지상 세포 면역수용체(ｄｃｉｒ)-매개 교차프라이밍
BR112013002940A2 (pt) * 2010-08-13 2019-09-24 Baylor Res Institute adjuvantes de nova vacina baseados no direcionamento dos adjuvantes para os anticorpos diretamente às células que apresentam antígenos
US20120128710A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-24 Baylor Research Institute Enhancement of Pathogen-Specific Memory Th17 Cell Responses
TW201247706A (en) * 2011-03-08 2012-12-01 Baylor Res Inst Novel vaccine adjuvants based on targeting adjuvants to antibodies directly to antigen-presenting cells
TW201300418A (zh) * 2011-03-25 2013-01-01 Baylor Res Inst 用於抗ｃ型肝炎病毒免疫之組合物及方法
SG194701A1 (en) 2011-04-29 2013-12-30 Apexigen Inc Anti-cd40 antibodies and methods of use
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
WO2014031984A1 (en) * 2012-08-24 2014-02-27 Baylor Research Institute Immunological detection methods and compositions
WO2014039840A1 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Baylor Research Institute Hiv vaccine compositions and methods
JP6693745B2 (ja) 2012-10-30 2020-05-13 アペクシジェン， インコーポレイテッド 抗ｃｄ４０抗体および使用方法
EP3013362B1 (en) 2013-06-28 2021-08-04 Baylor Research Institute Dendritic cell asgpr targeting immunotherapeutics for multiple sclerosis
CA2936833A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Baylor Research Institute Novel vaccines against hpv and hpv-related diseases
CN113577081A (zh) 2014-07-11 2021-11-02 吉利德科学公司 用于治疗hiv的toll样受体调节剂
CN105821029A (zh) * 2015-01-04 2016-08-03 彭霞 异源融合基因修饰的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法
CN105821030A (zh) * 2015-01-04 2016-08-03 彭霞 表达α1，3半乳糖转移酶的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法
US11969463B2 (en) 2017-08-10 2024-04-30 Good T Cells, Inc. Method for activating T cells for cancer treatment
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
WO2019241730A2 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
US20230210896A9 (en) 2019-02-08 2023-07-06 Good T Cells, Inc. Method for t cell activation for cancer treatment
KR20220004985A (ko) 2019-03-27 2022-01-12 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) Cd40 활성화 특성을 가진 재조합 단백질
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
WO2021094984A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
BR112022024063A2 (pt) 2020-05-26 2023-01-31 Inst Nat Sante Rech Med Polipeptídeos de coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (sars-cov-2) e usos dos mesmos para fins de vacina
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
MX2023005570A (es) 2020-11-12 2023-05-29 Inst Nat Sante Rech Med Anticuerpos conjugados o fusionados al dominio de union del receptor de la proteina de la espicula de sars-cov-2 y usos de los mismos con fines de vacunacion.
GB202019879D0 (en) * 2020-12-16 2021-01-27 Ucl Business Ltd Polypeptide
MX2023007610A (es) 2020-12-23 2023-07-12 Inst Nat Sante Rech Med Vacuna contra clamidia basada en el direccionamiento del antigeno momp vs4 a las celulas presentadoras de antigeno.
MX2023008986A (es) 2021-01-29 2023-08-15 Inserm Institut National De La Sante Et De La Rech Medicale Polipeptidos antigenicos de chlamydia trachomatis y usos de los mismos con fines de vacuna.
US20220325287A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2023278641A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023088968A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Universal sarbecovirus vaccines
WO2024074571A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dc-targeting vaccine against nipah virus infection
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3949064A (en) 1973-10-26 1976-04-06 Baxter Laboratories, Inc. Method of detecting antigens or antibodies
US4174384A (en) 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4554101A (en) * 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
DK8189A (da) * 1988-01-12 1989-07-13 Bunge Australia Antigen-antistof-konjugater, deres fremstilling og anvendelse
US6054312A (en) * 1997-08-29 2000-04-25 Selective Genetics, Inc. Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors
US6541011B2 (en) 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
WO1999057155A1 (en) * 1998-05-01 1999-11-11 The Procter & Gamble Company Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified antimicrobial protein
AU4954899A (en) 1998-06-26 2000-01-17 Trustees Of Dartmouth College Methods and compositions for modulating antigen-specific immunological (humoral)responses by targeting such antigen to apcs in conjunction with anti-cd40 ligan d administration
JP2000157282A (ja) 1998-11-30 2000-06-13 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 酵素配列複合体及び固定化酵素配列複合体とそれらの製造方法、担体分子及び酵素
PL358132A1 (en) * 2000-03-23 2004-08-09 Akzo Nobel N.V. Use of mia in immunotherapy
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
AU2002305452A1 (en) * 2001-05-08 2002-11-18 Emory University Regulating immine responses using dendritic cells
GB0118367D0 (en) 2001-07-27 2001-09-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
RU2312896C2 (ru) * 2001-09-20 2007-12-20 Глаксо Груп Лимитед Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок gag вич-1, способ получения указанной последовательности, вектор, содержащий ее, белок, кодируемый ею, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики и/или лечения вич-инфекции и спида
JPWO2003033695A1 (ja) * 2001-10-11 2005-02-03 片倉工業株式会社 組換え融合タンパク質の精製方法およびこれを利用するタンパク質の製造方法
CA2468878A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-05 Crucell Holland B.V. Antigen presenting cell targeting conjugate, an antigen presenting cell contacted with such conjugate, their use for vaccination or as medicament, and methods for their productionor generation
EP2258712A3 (en) * 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
JP2004236504A (ja) 2003-02-03 2004-08-26 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 酵素配列複合体及び固定化酵素配列複合体とそれらの製造方法、担体分子及び酵素
JP2005143444A (ja) * 2003-11-19 2005-06-09 Lion Corp キメラ酵素及び洗浄剤組成物
PT1771474E (pt) * 2004-07-20 2010-05-03 Genentech Inc Inibidores de proteína 4 do tipo angiopoietina, combinações e sua utilização
GB0417494D0 (en) * 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US20080063656A1 (en) 2004-08-09 2008-03-13 Emini Emilio A Adenoviral Vector Compositions
NZ555907A (en) * 2004-11-16 2009-12-24 Aeras Global Tb Vaccine Found Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
EP1752533A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-14 Institut National de la Recherche Agronomique Fusion proteins between plant cell-wall degrading enzymes, and their uses
WO2007103048A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity
ES2890230T3 (es) 2008-07-16 2022-01-18 Baylor Res Institute Vacuna contra el VIH basada en el direccionamiento de Gag y Nef maximizado a células dendríticas

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