MX2011000507A - Vacuna de vih basada en apuntamiento de gag y nef maximizado a celulas dendriticas. - Google Patents

Vacuna de vih basada en apuntamiento de gag y nef maximizado a celulas dendriticas.

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Gerard Zurawski
Anne-Iaure Flamar
Amanda Cobb
Holly Mead
Monica Montes
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Abstract

La presente invención incluye composiciones y métodos para la fabricación y uso de una vacuna que incluye un anticuerpo CD-específico o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a la degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos o un anticuerpo CD-específico o fragmento del mismo al cual un antígeno de Nef diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno o ambos, en donde la vacuna es apta de producir una respuesta inmune de célula T VIH-específica a Gap p17. Gag p24, Nef y/o Ciclina D1.

Description

VACUNA DE VIH BASADA EN APUNTAMIENTO DE GAG Y NEF MAXIMIZADO A CELULAS DENDRITICAS CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con el campo de agentes que apuntan proteínas virales a células dendríticas .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes son descritos en relación con presentación de antígeno .
Las células dendríticas juegan un papel fundamental en controlar la interfase de inmunidad innata e inmunidad adquirida al proveer señales solubles e intercelulares, seguidas por reconocimiento de patógenos. Estas funciones de las células dendríticas son extensamente dependientes de la expresión de receptores de superficie especializados, "receptores de reconocimiento de patrón" (PRR) , representados, más notablemente, por receptores semejantes a toll (TLR) y lectinas tipo C o receptores semejantes a lectina (LLR) .
En el paradigma actual, un papel principal de los TLR es alertar a las células dendríticas para producir interleucina 12 (IL-12) y otras citocinas inflamatorias para iniciar respuestas inmune. Los LLR tipo C operan como constituyentes de el la captura de antígeno poderosa y mecanismo de absorción de macrófagos y células dendríticas . En comparación con los TLR, sin embargo, los LLR podrían tener intervalos más amplios de funciones biológicas que incluyen migraciones celulares, interacciones intercelulares. Estas múltiples funciones de los I LLR podrían ser debidas a los hechos de que los LLR, a diferencia de los TLR, se pueden reconocer tanto a sí mismo como no sí mismo. Sin embargo, la complejidad de los LLR, incluyendo la redundancia de un número de LLR expresados en células inmune, ha sido uno de los obstáculos principales para entender las funciones detalladas de los LLR individuales.
Además, los ligandos naturales para la mayoría de estos receptores siguen estando sin identificar. No obstante, evidencia de estudios recientes sugieren que los LLR, en colaboración con los TLR, pueden contribuir a la activación de células inmune durante infecciones microbianas .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención incluye composiciones y métodos para incrementar la efectividad de presentación de antígeno mediante una célula que ; presenta antígeno al aislar y purificar un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica mediante, eliminación de uno o más sitios proteolíticos ; y poner en contacto la célula que presenta antigeno bajo condiciones en donde el complejo de anticuerpo-antígeno es procesado y presentado para reconocimiento de célula T. En un aspecto, la célula que presenta antigeno comprende una célula dendritica. En otro aspecto el anticuerpo especifico de célula dendritica o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de Co erina/Dockerina o el anticuerpo específico de célula dendritica o fragmento . del mismo es enlazado a una mitad de un par de Coherina/Dockerina y el antigeno de Gag diseñado es enlazado a la mitad complementaria del par de Coherina/Dockerina para formar un complejo. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendritica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag. En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más sitios de glicosilación nuevos o el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendritica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendritica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más enlazadores seleccionados de SEQ ID NOS. 4 y 6.
En otro aspecto de la presente invención, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa. En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es humanizado. En un aspecto específico, el complejo de anticuerpo-antígeno es seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además una etiqueta de secuencia usada para purificación o identificación del complejo. En todavía otro aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, MHC clase II, CDl, CD2 , CD3, CD4, CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54 , CD56, CD57 , CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTINA-1 , B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1 y ASPGR.
Otra modalidad de la presente invención incluye composiciones y métodos para incrementar la efectividad de presentación de antígeno por una célula que presenta antigeno al: aislar y purificar un anticuerpo" específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Nef diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno; y poner en contacto la célula que presenta antígeno bajo condiciones en donde el complejo de anticuerpo-antígeno es procesado y presentado para reconocimiento de célula T. En un aspecto, la célula que presenta antígeno comprende una célula dendrítica. En otro aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de Co erina/Dockerina o el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de Coherina/Dockerina y el antígeno de Nef diseñado es enlazado a la mitad complementaria del par de Coherina/Dockerina para formar un complejo. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef. En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más nuevos sitios de glicosilación, o el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más sitios de glicosilación que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada. En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más enlazadores seleccionados de SEQ ID NO. 4 y 6. En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa. En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es humanizado. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, y 17. En otro aspecto, el ¡complejo de anticuerpo-antígeno comprende además una etiqueta de secuencia usada para purificación o identificación del complejo. En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, HC clase II, CDl, CD2 , CD3 , CD4, CD8 , CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43 , CD44, CD45, CD54, CD56, 1 CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTINA-1 , B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2 , ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1, y ASPGR.
Todavía otra modalidad de la presente invención es una vacuna que comprende un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica al eliminar uno o más sitios proteolíticos . En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más nuevos sitios de glicosilación. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más enlazadores seleccionados de SEQ ID NO. 4 y 6. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo especifico de célula dendr tica o fragmento del mismo y el antigeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionado de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa. En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendritica o fragmento del mismo es humanizado. En un aspecto específico, el complejo de anticuerpo-antígeno es seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además una etiqueta de secuencia usada para purificación > del complejo. El experimentado en el arte reconocerá que el complejo de anticuerpo-antígeno puede ser formado mediante asociación covalente o no covalente entre el anticuerpo específico de célula dendritica o fragmento del mismo y el antígeno o en forma de una proteína de fusión, ya sea con una u otra de las porciones en el término amino o término carboxi o aún como contactámeros en una o más, ya sea de una u otra porción. En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendritica o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, MHC clase II, CDl, CD2 , CD3 , CD , CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43 , CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56 , DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1, y ASPGR.
Todavía otra modalidad de la presente invención es una vacuna que comprende un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Nef diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende uno o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno . En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más sitios de glicosilacion nuevos. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más sitios de glicosilacion que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más enlazadores seleccionados de SEQ ID NOS. 4 y 6. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa. En un aspecto específico, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es humanizado. En otro aspecto específico, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende una etiqueta de secuencia usada para purificación del complejo. El experimentado en el arte reconocerá que el complejo de anticuerpo-antígeno puede ser formado mediante asociación covalente o no covalente entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno o en forma de una proteína de fusión, ya sea con una u otra de las porciones en el término amino o en término carboxi o aún como contactámeros o una o más ya sea de una u otra porción. En otro aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, MHC clase II, CDl, CD2 , CD3 , CD4 , CD8, CDllb, CD14, CD15 , CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56,- CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1, y ASPGR.
Todavía otra modalidad de la presente invención es una vacuna que comprende: un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica al eliminar uno o más sitios proteolíticos ; y un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Nef diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno, en donde la vacuna es apta de producir una respuesta inmune de célula T VIH-específica a Gag pl7, Gag p24 y Nef. En un aspecto, los antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión. En otro aspecto, los antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión separada por uno o más enlazadores flexibles. En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag o Nef que comprende uno o más enlazadores seleccionados de SEQ ID NO: 4 y 6. En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa. En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es humanizado. En un aspecto específico, la vacuna es seleccionada de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además una etiqueta de secuencia usada para purificación del complejo.
En todavía otra modalidad, la presente invención es una vacuna que comprende un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica al eliminar uno o más sitios proteolíticos ; y un antígeno de Nef diseñado que es anexado al anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo o al antígeno de Gag diseñado de un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno, en donde la vacuna es apta de .producir una respuesta inmune de célula T VIH-específica a Gag pl7, Gag p24 y Nef . En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo, los antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión. En un aspecto, los antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión separada por uno o más enlazadores flexibles .
Todavía otra modalidad de la presente invención incluye un método para incrementar la efectividad de células dendríticas al aislar células dendríticas del paciente; exponer las células dendríticas a cantidades activantes de una vacuna que comprende: un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica al eliminar uno o más sitios proteolíticos ; y un antígeno de Nef diseñado que es anexado al anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo o al antígeno de Gag diseñado de un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementa la secreción del compiejo de anticuerpo-antígeno, en donde la vacuna es apta de producir una respuesta inmune de célula T VIH-específica a Gag pl7, Gag p24 y Nef; y reintroducir las células dendríticas activadas, cargadas de antígeno al paciente.
Todavía otra modalidad de la presente invención incluye una vacuna que comprende un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno diseñado que comprende Ciclina Di o fragmentos de la misma anexados para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Ciclina Di es menos susceptible a degradación proteolítica al eliminar uno o más sitios proteolíticos . En un aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Ciclina Di. En otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más sitios de glicosilación nuevos. En todavía otro aspecto, el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Ciclina Di que comprende uno o más sitios de glicosilación que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada. Por ejemplo, el complejo de anticuerpo-antígeno puede comprender además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo y el antígeno de Ciclina Di que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa. En un aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es humanizado. En otro aspecto, el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de Coherina/Dockerina y el antígeno de Ciclina Di diseñado es enlazado a la mitad complementaria del par de Coherina/Dockerina para formar un complejo. La presente invención también incluye un método para incrementar la efectividad de células dendríticas que comprende: aislar células dendríticas del paciente; exponer las células dendríticas a cantidades activadoras de una vacuna que comprende: un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno diseñado que comprende Ciclina Di o fragmento (s) del mismo anexados para' formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Ciclina Di es menos susceptible a degradación proteolítica al eliminar uno o más sitios proteolíticos o introducir sitios de glicosilación o mejorar la expresión al seleccionar uno o más codones que mejoran la expresión; y reintroducir las células dendríticas activadas, cargadas de antígeno a paciente.
Todavía otra modalidad de la presente invención incluye un ácido nucleico aislado y purificado que codifica un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32. Todavía otra modalidad de la presente invención incluye un polipéptido aislado y purificado seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Para un entendimiento más completo de los elementos y ventajas de la presente invención, ahora se hará referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas y en las cuales: La Figura 1 muestra un análisis de PAGE de SDS reducido teñido con azul de Coomassie de proteínas de fusión de anticuerpo p24 gag purificados por cromatografía de afinidad de proteína A obtenidas de células CHO-S o células 293F transfectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican la fusión de cadena H - gag p24, con diagramas de los constructos o construcciones y pesos moleculares esperados.
La Figura 2 muestra un análisis de SDS de PAGE reducido teñido por azul de Coomassie de proteína de fusión de anticuerpo de gag p24 purificado por cromatografía de afinidad de proteína A obtenida de células CHO-S o 293F transfectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican una fusión de cadena H. - gag p24 con un enlazador de cadena H - gag p24 derivado de precursor B de escafoldina de afianzamiento celulosomal [Bacteroides cellulosolvens] y un plásmido de expresión de cadena ligera [L] correspondiente, con diagramas de los constructos o construcciones y sitios de glicosilación y pesos moleculares esperados .
Las Figuras 3A a 3C muestran los esquemas de dominio estructural para cipA.
Las Figuras 4A a 4C muestran el esquema de dominio estructural para el precursor de escafoldina B de afianzamiento celulosomal [Bacteroides cellulosolvens] .
La Figura 5 muestra un gel con la posición aproximada para la cadena H C535-codificada, con diagramas de los constructos o construcciones y pesos moleculares esperados .
La Figura 6 muestra un gel del producto parcialmente purificado de la . expresión de [inAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-varl-Viralgag-p40-varl-6xHis] C601 co-transfectado con el plásmido de expresión de cadena L apropiado, con diagramas de los constructos y sitios de glicosilación y pesos moleculares esperados .
La Figura 7 muestra varios constructos de cadena H-ant geno co-transfectados transitoriamente a células 293F con constructos de expresión de cadena L apropiadas idénticos, con diagramas de los constructos y sitios de glicosilación y pesos moleculares esperados .
La Figura 8 es una gráfica de una selección para detectar el subconjunto de anticuerpos anti-CD40 que se pueden enlazar y activar a CD40.
La Figura 9 muestra el análisis de FACS del teñido de CD8+ [eje horizontal] contra el teñido de tetrámero Mi de Flu [eje vertical] tal como es producido por un intervalo de dosis de 10 µg/ml a un conjugado de Mi de Flu de Dockerina - Cohesina sin anti-CD4012El2-hIgG4.
La Figura 10 muestra el análisis de FACS del teñido de CD8+ [eje horizontal] contra el teñido de tetrámero de MI de Flu [eje vertical] tal como es producido por un intervalo de dosis de 10 µg/ml a un conjugado de Dockerina - Cohesina Mi Flu sin testigo de hIgG4.
La Figura 11 ilustra el protocolo usado para analizar in vitro la potencia de moléculas de apuntamiento del receptor anti-DC - antigeno (TM) para producir la expansión de células T antígeno-específicas en el contexto de un cultivo de PBMC.
La Figura 12 muestra los efectos de apuntamiento de células dendríticas [dentro de las PBMC] con una vacuna anti- CD4012E12 gag pl7 nef gag p24.
La Figura 13 muestra que la vacuna produce la expansión de células T CD4+ con especificidades a todos los grupos de péptidos gag p24.
La Figura 14 son datos de FACS - el eje vertical muestra el porcentaje de células que producen IFNy [panel superior] . El panel inferior muestra datos similares para células T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia gag pl7 produjeron significativamente mayor producción de células T que producen IFNy que el testigo sin péptido.
La Figura 15 muestra que datos en forma de gráfica que la vacuna produce la expansión de células T CD4+ con especificidades a la mayoría de los grupos de péptidos nef de VIH - aún a las dosis de vacuna más bajas probadas en porcentaje de células T CD4+ que producen IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no fueron tratadas con péptidos .
La Figura 16 son datos de FACS que muestran que la vacuna produce la expansión de células T CD4+ con especificidades a la mayoría de los grupos de péptido de nef de VIH - aún a la dosis de vacuna más baja probada el porcentaje de células T CD4+ que producen IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no fueron tratadas con péptidos .
La Figura 17 muestra los datos en forma de gráfica - el eje vertical muestra el porcentaje de células que producen IFNy [panel superior] . El panel inferior muestra datos similares para células T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia de nef dieron como resultado una ' producción significativamente mayor de células T que producen IFNy que el testigo sin péptidos.
La Figura 18 muestra el contorno de un protocolo para probar la habilidad de una vacuna compuesta de ánti-CD40-12El2 enlazado a PSA [antígeno específico de próstata] para .dar como resultado la expansión de células T CD4+ específicas de PSA de población de células T naturales correspondientes a un arreglo amplio de epítopos de PSA.
La Figura 19 muestra que muchos péptidos de PSA dan como resultado respuesta de producción de IFNy potentes que indican que el anti-CD4012El2 y agentes antiCD40 similares pueden proporcionar efectivamente antígeno a células dendríticas, dando como resultado el cebado de las respuestas inmune contra múltiples epítopos del antígeno.
La Figura 20 muestra que las células dendríticas apuntadas con anti-CD40-PSA apuntadas a células dendríticas inducen respuestas de célula T CD8+ PSA-específicas . Las células dendríticas de IFN fueron apuntadas con una proteína de fusión de mAb de 1 µg con PSA. Células T CD8+ autólogas purificadas fueron co-cultivadas por 10 días. Las células fueron teñidas con anti-CD8 y PSA (KLQCVDLHV) -tetrámero . Las células son de un donador saludable HLA-A*0201 positivo. Los resultados demuestran que anti-CD40 proporcionan efectivamente PSA a las células dendríticas, que a su vez producen la expansión de células T CD8+ PSA-específicas .
La Figura 21 resume el protocolo de apuntamiento de células dendríticas para probar vacunas de apuntamiento de receptor anti-células dendríticas en cuanto a su habilidad para dirigir la expansión de células T antígeno-específicas de la absorción apuntada por las células dendríticas y presentación de epítopos de antígeno sobre su superficie celular.
La Figura 22 [panel superior] muestra la comparación de la eficacia de vacunas nef anti-CD4012E12 , gag p24 anti-CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [paciente Aph002] .
La Figura 22 [panel inferior] muestra la comparación de la eficacia de vacunas nef anti-CD4012El2 , gag p24 anti-CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [paciente Aph002] .
La Figura 23 [panel superior] muestra la comparación de la eficacia de vacunas nef anti-CD4012El2 , gag p24 anti-CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [paciente AphOlO] .
La Figura 23 [panel inferior] muestra la comparación de la eficacia de vacunas nef anti-CD4012El2 , gag p24 anti-CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [paciente Aph002] .
La Figura 24 es un gel que muestra un análisis de la interacción de la proteína de fusión Cohesina-Ciclina Di con anticuerpo recombinante receptor de anti-CD-Dockerina.
La Figura 25 muestra un esquema de péptidos traslapantes de Ciclina Di.
La Figura 26 muestra un esquema (izquierdo) del diseño del estudio para probar la habilidad de complejos anti-CD40-Ciclina Di para producir la expansión in vitro dé células T CD4+ Ciclina Dl-específicas y los resultados de FACS obtenidos mediante el mismo (derecha) .
La Figura 27 es un análisis de FACS similar a aquel detallado en la Figura 26, con un donador normal diferente - en este caso el complejo anti-CD40-Ciclina Di produjo la expansión de células T CD4+ proliferantes IFNg positivas para los péptidos de Ciclina Di P4, P43 , y P70.
La Figura 28 muestra un esquema (izquierda) y análisis (derecho) similar a aquel mostrado en la Figura 26, excepto que se usaron células T CD8+.
La Figura 29 muestra datos similares del mismo donador como la Figura 28, pero analizados con péptidos individuales de fondos de péptidos .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En tanto que la elaboración y uso de varias modalidades de la presente invención son discutidos en detalle a continuación, se debe apreciar que la presente invención provee muchos conceptos inventivos aplicables que pueden ser implementados en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas discutidas en la presente son solamente ilustrativas de maneras específicas para elaborar y usar la invención y no delimitan el alcance de la invención.
Para facilitar el entendimiento de esta invención, un número de términos son definidos a continuación. Los términos definidos en la presente tienen significados como se entiende comúnmente por la persona de habilidad ordinaria en las áreas relevantes a la presente invención. Términos tales como "un", "uno" y "el" no pretenden referirse solamente a una entidad singular, sino que incluyen la clase general en la cual un ejemplo específico puede ser usado por ilustración. La terminología en la presente es usada para describir modalidades específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto como se resume en las reivindicaciones.
Las células dendríticas (DC) son células que presentan antígeno que juegan un papel clave en regular la inmunidad antígeno-específica (Mellman y Steinman 2001), (Banchereau, Briere et al. 2000), (Celia, Sallusto et al. 1997) . Las células dendríticas capturan antígenos, los procesan en péptidos y presentan estos a las células T. Por consiguiente, la administración de antígeno directamente a células dendríticas es un área de foco para me orar vacunas . Uno de tales ejemplos es el desarrollo de vacunas a base de células dendríticas utilizando carga de antígeno ex vivo de células dendríticas autólogas que son luego re-administradas a pacientes (Banchereau, Schuler-Thurner et al. 2001), (Steinman y Dhodapkar 2001) . Otra estrategia para mejorar la eficacia de. vacuna es el apuntamiento específico a células dendríticas de antígeno conjugadas con anticuerpos contra receptores específicos de células dendríticas internalizantes. El potencial de apuntamiento de células dendríticas para vacunación es destacado por estudios en ratones clave. In vivo, el apuntamiento con el mAb anti-LOX-1 a ovalbumina (OVA) indujo una respuesta de célula T CD8+ protectora, vía presentación cruzada de antígeno exógena hacia la ruta de HC clase I (Delneste, Magistrelli et al. 2002). También, la ovalbumina conjugada al mAb anti-DEC205 en combinación con un estímulo de maduración de CD40L mejoró la presentación restringida por MHC clase I mediante células dendríticas in vivo y condujo a la formación durable de células T CD8+ de memoria efectoras (Bonifaz, Bonnyay et al. 2004). Ambos de estos estudios mostraron una escasez de dosis espectacular (esto es, respuestas inmune fuertes a dosis de antígeno muy bajas) y sugirieron respuestas más amplias que las normalmente observadas con otros tipos de inmunización de. OVA. El trabajo reciente con apuntamiento del antígeno de gag de VIH a células dendríticas vía DEC205 ha extendido estos conceptos a un •antígeno clínicamente relevante y confirmaron los principios de apuntamiento de antígeno a células dendríticas - escasez de dosis espectacular, respuestas protectoras de una sola vacunación y expansión de células T antígeno-específicas tanto en compartimientos de CD8 como de CD4 (Trumpfheller, Finke et al. 2006) .
La presente invención provee el acomplejamiento de múltiples antígenos o proteínas (diseñados, expresados y purificados independientemente del anticuerpo monoclonal primario) de manera controlada, multivariable, a un solo mAb recombinante primario. Actualmente, hay métodos para diseñar sitios de biotinilación específicos del sitio que proveen la adición de diferentes proteínas (cada una diseñada separadamente enlazada a estreptavidina) a un mAb primario. Sin embargo, la presente invención provee la adición al mAb primario de múltiples combinaciones, en proporciones equimolares fijas y locaciones de proteínas diseñadas separadamente .
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo o fragmento del mismo" es usado para describir un sistema de anticuerpo recombinante que ha sido diseñado para proveer un anticuerpo específico objetivo. El anticuerpo mpnoclonal elaborado utilizando técnicas de hibridoma estándar, despliegue de anticuerpo recombinante, anticuerpos monoclonales humanizados y los semejantes. El anticuerpo puede ser usado para, por ejemplo, apuntar (vía un anticuerpo recombinante primario contra un receptor internalizante, por ejemplo, un receptor de célula dendrítica humano) múltiples antígenos y/o antígenos y una citocina activante a células dendríticas (DC) .
La porción de enlace de antígeno de los anticuerpos incluye uno o más fragmentos (esto es, los fragmentos de los mismos) que pueden incluir uno o más dominios variables, uno o más dominios variables y el primer dominio constante, un fragmento de Fab, un fragmento de Fab' , un fragmento de F(ab)2, y fragmento de Fv, y fragmento de Fabc y/o un fragmento de Fab con porciones del dominio de Fe al cual porciones de enlace modulares cognatas son agregada a la secuencia de aminoácido y/o enlazadas. El anticuerpo para uso puede ser de cualquier isotipo o clase, subclase o de cualquier fuente (animal y/o recombinante) . En ciertos aspectos, los sitios de enlace de antígeno son derivados de anticuerpos monoclonales no , humanos que son injertados, utilizando técnicas bien conocidas en el arte, sobre una cadena fundamental de anticuerpo humano "humanizando" mediante esto el anticuerpo.
El término "antígeno" como se usa en la presente se refiere a una molécula que puede iniciar una respuesta inmune humoral y/o celular en un receptor del antígeno. El antígeno puede ser usado en dos contextos diferentes con la presente invención: como un objetivo para el anticuerpo u otro dominio de reconocimiento de antígeno del anticuerpo diseñado o recombinante (rAb) o como la molécula que es transportada a y/o a una célula u objetivo por el rAb como un conjugado (enlace covalente o no covalentemente) o una proteína de fusión. El antígeno es usualmente un agente que provoca una enfermedad para la cual una vacunación sería tratamiento ventajoso. Cuando el antígeno es presentado sobre MHC, el péptido es frecuentemente de alrededor de 8 a alrededor de 25 aminoácidos. Los antígenos incluyen cualquier tipo de molécula biológica, incluyendo, por ejemplo, metabolitos intermediarios simples, azúcares, lípidos y hormonas también como macromoléculas, tales como carbohidratos complejos, fosfol pidos , ácidos nucleicos y proteínas. Categorías comunes de antígenos incluyen, pero no están limitadas a, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngales, antígenos de protozooarios y otros antígenos parásitos, antígenos de tumor, antígenos involucrados en enfermedad autoinmune, alergia y rechazo de injerto, y otros antígenos misceláneos . La presente invención usa antígeno de virus que tienen características mejoradas (por ejemplo, proteólisis disminuida, secreción mejorada, expresión o estabilidad mejorada) y que son apuntadas a células que presentan antígeno utilizando el anticuerpo o fragmentos del mismo.
Ejemplos de antígenos virales incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, antígenos retrovirales tales como antígenos retrovirales de los antígenos de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tales como productos genéticos de los genes gag, pol y env, la proteína Nef, transcriptasa inversa, y otros componentes de VIH; antígenos virales de hepatitis tales como las proteínas S, M y L de virus de hepatitis B, el antígeno pre-S de virus de hepatitis B, y otras hep.atitis, por ejemplo, componentes virales de hepatitis A, B, y C, tales como AR viral de hepatitis C; antígenos virales de influenza tales como hemaglutinina y neuraminidasa y otros componentes virales de influenza; antígenos virales de sarampión tales como la proteína de fusión de virus de sarampión y otros componentes de virus de sarampión; antígenos virales de rubéola tales como proteínas El y E2 y otros componentes de virus de rubéola; antígenos rotavirales tales como VP7sc y otros componentes rotavirales; antígenos citomegalovirales tales como glicoproteína B de envolvente y otros componentes de antígeno citomegalovirales; antígenos virales sincitiales respiratorios tales como la proteína de fusión de RSV, la proteína 2 y otros componentes de antígeno viral sincitial respiratorio; antígenos virales de herpes simplex tales como proteínas prematuras ¦ inmediatas, glicoproteína D, y otros componentes de antígeno viral de herpes simplex; antígenos virales de varicela zoster tales como gpl, gpll, y otros componentes de antígeno viral de varicela zoster; antígenos virales de encefalitis japonesa tales como proteínas E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, 80% de E, y otros componentes de antígeno virales de encefalitis japonesa; antígenos virales de rabia tales como glicoproteína de rabia, nucleoproteína de rabia y otros componentes de antígeno viral de rabia. Véase Fundamental Virology, Segunda Edición, eds . Fields, B. N. y Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991) para ejemplos adicionales de antígenos. virales.
Objetivos antigénicos que pueden ser administrados utilizando las vacunas de rAb-DC/DC-antígeno de la presente invención incluyen genes que codifican antígenos tales como antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngales o antígenos parásitos. Los virus incluyen picornavirus , coronavirus, togavirus, flavirvirus, rhabdovirus, paramixovirus , orthomyxovirus , bunyavirus, arenavirus, reovirus, retrovirus, papilomavirus , parvovirus, herpesvirus, poxvirus, hepadnavirus y virus espongiforme. Otros objetivos virales incluyen influenza, virus 1 y 2 de herpes simplex, sarampión, dengue, viruela, polio o VIH. Patógenos incluyen tripanosomas , gusanos de cinta, gusanos redondos, helmínticos, malaria. Marcadores de tumor, tales como antígeno fetal o antígeno específico de próstata, pueden ser apuntados de esta manera. Otros ejemplos incluyen: proteína env de VIH y antígenos de superficie de hepatitis B. La administración de un vector de acuerdo con la presente invención por propósitos de vacunación requeriría que los antígenos vector-asociados sean suficientemente no inmunógenos para permitir la expresión a largo plazo del transgen, para la cual una respuesta inmune fuerte sería deseable. En algunos casos, la vacunación de un individuo puede solamente ser requerida no frecuentemente, tal como anualmente o bianualmente y proveer protección inmunológica a largo plazo contra el agente infeccioso. Ejemplos específicos de organismos, alérgenos y secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para uso en vectores y finalmente como antígenos con la presente invención se pueden encontrar en la patente estadounidense No. 6,541,011, porciones relevantes incorporadas en la presente por referencia, en particular, las tablas que hacen coincidir organismos y secuencias específicas que pueden ser usados con la presente invención.
Antígenos sobre la superficie de células inmune, por ejemplo, células que presentan antígeno o células dendríticas, que pueden ser apuntadas utilizando el rAb de la presente invención serán en general seleccionados en base a un número de factores, en los que se incluyen: probabilidad de internalización, nivel de especificidad de célula inmune, tipo de célula inmune apuntada, nivel de madurez celular inmune y/o activación y los semejantes. Ejemplos de marcadores de superficie celular para células dendríticas incluyen, pero no están limitados a, MHC clase I, MHC Clase II, B7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR y/o ASPGR y los semejantes; en tanto que en algunos casos también tienen la ausencia de CD2 , CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56, y/o CD57. Ejemplos de marcadores de superficie celular para células que presentan antígeno incluyen, pero no están limitados a, MHC clase I, MHC Clase II, CD40, CD45, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy. LOX-1 o ASPGR. Ejemplos de marcadores de superficie celular para células T incluye, pero no están limitados a, CD3 , CD4, CD8, CD 14, CD20, CDllb, CD16, CD45 y HLA-DR .
Como se usa en la presente, el término "epítopo(s)" se refiere a un péptido o antígeno de proteína que incluye una estructura primaria, secundaria o terciaria similar a un epítopo localizado dentro de cualquiera de un número de polipéptidos de patógeno codificados por el ADN o ARN del patógeno. El nivel de similaridad será en general de tal manera a tal grado que los anticuerpos monoclónales o policlonales dirigidos contra tales polipéptidos también se enlazarán a, reaccionarán con o de otra manera reconocerán el péptido o antígeno de proteína. Varios métodos de inmunoanálisis pueden ser empleados en conjunción con tales anticuerpos, tales como por ejemplo, Western blotting, ELISA, RIA y los semejantes, todos los cuales son conocidos para aquellos de habilidad en el arte. La identificación de epítopos de patógeno y/o sus equivalentes funcionales, apropiados para uso en vacunas es parte de la presente invención. Una vez aislados e identificados, se pueden obtener fácilmente equivalentes funcionales. Por ejemplo, se pueden emplear los métodos de Hopp, como se enseña en la patente estadounidense No. 4,554,101, incorporada en la presente por referencia, que enseña la identificación y preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácidos en base a hidrofilicidad. Los métodos descritos en varios otros documentos, y programas de elementos de programación basados en los mismos, pueden también ser usados para identificar secuencias de núcleo epitópicas (véase, por ejemplo, Jameson y Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; patente estadounidense No. 4,554,101). La secuencia de aminoácidos de estas "secuencias de núcleo epitópicas" puede luego ser incorporada fácilmente a péptidos, ya sea por medio de la aplicación de síntesis de péptido o tecnología recombinante.
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población de anticuerpo homogénea. El término no está limitado con respecto a la especie o fuente del anticuerpo, ni pretende estar limitados por la manera en la cual es elaborado. El término abarca inmunoglobulinas enteras, también como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv, y otros fragmentos que exhiben propiedades de enlace inmunológicas de la molécula de anticuerpo monoclonal padre.
Como se usa en la presente, el término "sitio de enlace de antígeno" o "porción de enlace" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en el enlace de antígeno. El sitio de enlace de antígeno es formado por residuos de aminoácido de las regiones variables N-terminal ("V") de las cadenas pesada ( "H" ) y ligera ( "L" ) . Tres estiramiento altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesadas y ligeras son denominadas como "regiones hipervariables" que son interpuestas entre estiramientos de flanqueo más conservados conocidos como "regiones de estructura" (FR) . Como se usa en la presente, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que son encontradas naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas . En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas una en relación a la otra en el espacio tridimensional para formar una superficie de enlace de antígeno. La superficie de enlace de antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno enlazado, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras son denominadas como "regiones que determinan la complementareidad" , o "CDRs".
Como se usa en la presente, el término anticuerpo "humanizado" se refiere a aquellas moléculas que comprende un sitio de enlace de antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana han sido descritos, que incluyen anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus CDR asociadas fusionadas a dominios constantes humanos, CDR de roedor injertadas a un FR de soporte humano antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado, y CDR de roedor soportados mediante FR de roedor revestidos recombinantemente . Estas moléculas "humanizadas" son diseñadas para minimizar respuesta inmunológica indeseable hacia moléculas de anticuerpo antihumanas de roedor, -lo que limita la duración y efectividad de aplicaciones terapéuticas de aquellas porciones en receptores humanos .
La preparación de composiciones de vacuna que incluyen los ácidos nucleicos que codifican antígenos de la invención como el ingrediente activo, pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; formas sólidas apropiadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la infección pueden también ser preparadas. La preparación puede ser emulsificada, encapsulada en liposomas . Los ingredientes inmunógenos activos son frecuentemente mezclados con portadores que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo.
El término "portador aceptable farmacéuticamente" se refiere a un portador que no provoca una reacción alérgica u otro efecto indeseable en sujetos a quienes es administrado. Portadores aceptables farmacéuticamente apropiados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina de pH regulado de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol o los semejantes y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , agentes reguladores del pH, y/o adyuvantes que mejoran la efectividad de la vacuna. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser efectivos incluyen pero no están limitados a: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, MTP-PE y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+C S) en emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. Otros ejemplos de adyuvantes incluyen DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio) , adyuvantes completos e incompletos de Freund y QuilA. Además, sustancias moduladores inmunes tales como linfocinas (por ejemplo, IFN-?, IL-2 y IL-12) o inductores de lFN-? sintéticos tales como poli I:C pueden ser usados en combinación con adyuvantes descrito en la presente.
Productos farmacéuticos que pueden incluir un polinucleótido descubierto con una sola copia o múltiples copias de las secuencias de nucleótido específicas que se enlazan a sitios de enlace de ADN específicos de la apolipoproteína presente sobre lipoproteínas de plasma como se describen en la presente invención. El polinucleótido puede codificar un péptido biológicamente activo, AR antisentido o ribozima y será provisto en una forma fisiológicamente aceptable administrable . Otro producto farmacéutico que puede surgir de la presente invención puede incluir una fracción de lipoproteína de plasma altamente purificada, aislada de acuerdo con la metodología descrita en la presente ya sea de uno u otro de la sangre del paciente u otra fuente, y un polinucleótido que contiene una sola copia o múltiples copias de las secuencias de nucleótido específicas que se enlazan a sitios de enlace de ADN específicos de las apolipoproteínas presentes sobre lipoproteínas de plasma, pre-enlazados a la fracción de lipoproteína purificada en una forma administrable fisiológicamente aceptable.
Todavía otro producto farmacéutico puede incluir una fracción de lipoproteína de plasma altamente purificada que contiene fragmentos de apolipoproteína recombinante que contiene una sola copia o múltiples copias de porciones de enlace de ADN específicas, preenlazadas a un polinucleótido que contiene una sola copia o múltiples copias de las secuencias de nucleótido específicas, en una forma administrable fisiológicamente aceptable. Todavía otro producto farmacéutico puede incluir una fracción de lipoproteína de plasma altamente purificada que contiene fragmentos de apolipoproteína recombinantes que contienen una sola copia o múltiples copias de porciones de enlace de ADN específicas, preenlazadas a un polinucleótido que contiene una sola copia o múltiples copias de las secuencias de nucleótido específicas, en una forma administrable fisiológicamente aceptable.
La dosificación a ser administrada depende en una gran extensión en el peso corporal y condición física del sujeto que es tratado, también como la ruta de administración y frecuencia de tratamiento. Una composición farmacéutica que incluye el polinucleótido descubierto preenlazado a una fracción de lipoproteína altamente purificada puede ser administrada en cantidades que fluctúan de 1 µg a 1 mg de polinucleótido y 1 \ig a 100 mg de proteína.
La administración de vacuna a un paciente seguirá protocolos generales para la administración de quimioterapéuticos , tomando en cuenta la toxicidad, si la hay, del vector. Se anticipa que los ciclos de tratamiento serían repetidos como sea necesario. También se contempla que varias terapias estándar, también como intervención quirúrgica, pueden ser aplicadas en combinación con la terapia genética descrita.
En donde se contempla la aplicación clínica de una terapia genética, será necesario preparar el complejo como una composición farmacéutica apropiada para la aplicación propuesta. En general, esto abarcará preparar una composición farmacéutica que está esencialmente libre de pirógenos, también como . cualesquier otras impurezas que podrían ser dañinas a humanos o animales. También se deseará en general emplear sales y soluciones reguladoras del pH apropiadas para volver al complejo estable y permitir la absorción del complejo por las células objetivo.
Composiciones acuosas de la presente invención pueden incluir una cantidad efectiva del compuesto, disuelta o dispersada en un portador aceptable farmacéuticamente o medio acuoso. Tales composiciones pueden también ser denominadas como inóculos . El uso de tales medios y agentes por sustancias armacéuticas activas es bien conocido en el arte. A excepción de que, ya que como cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Ingredientes activos complementarios también pueden ser incorporados a las composiciones. Las composiciones de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. Las dispersiones pueden también ser preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para impedir el crecimiento de microorganismos .
Estados de enfermedad.
Dependiendo de la enfermedad particular a ser tratada, la administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención será vía cualquier ruta común, en tanto que el tejido objetivo esté disponible vía aquella ruta con el fin de maximizar la administración de antígeno a un sitio para una respuesta inmune máxima (o en algunos casos mínima) . La administración será en general mediante inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Otras áreas para administración incluyen: oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. La administración tópica sería particularmente ventajosa para tratamiento de cánceres de piel. Tales composiciones normalmente serian administradas como composiciones aceptables farmacéuticamente que incluyen portadores, soluciones reguladoras del pH u otros excipientes aceptables fisiológicamente.
La vacuna o composiciones de tratamiento de . la invención pueden ser administrados parenteralmente, mediante inyección, por ejemplo, ya sea subcutánea o intramuscularmente . Formulaciones adicionales que son apropiadas para otros modos de administración incluyen supositorios, y en algunos casos, formulaciones orales o formulaciones apropiadas para distribución como aerosoles. En el caso de las formulaciones orales, la manipulación de subconjuntos de célula T empleando adyuvantes, empaque de antígeno, o la adición de citocinas individuales a varias formulaciones que den como resultado vacunas orales mejoradas con respuestas inmune optimizadas. Para supositorios, aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos ; tales supositorios pueden ser formados a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0.5% a 10%, preferiblemente l%-2%. Las formulaciones orales incluyen tales excipientes empleados normalmente como por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y los semejantes. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldor'as, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10%-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25-70%.
Los ácidos nucleicos que codifican el antigeno de la invención pueden ser formulados a la vacuna o composiciones de tratamiento como formas neutras o formas de sal . Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con grupos amino libres del péptido) y que son formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfóricos, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, maleico y los semejantes. Las sales formadas con los grupos carboxilo libre pueden también ser derivadas de bases inorgánicas tales como por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidroides férricos, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y los semejantes.
La vacuna o composiciones de tratamiento son administradas de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad como será profiláctica y/o terapéuticamente efectiva. La cantidad a ser administrada depende del sujeto a ser tratado, incluyendo, por ejemplo, capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección o tratamiento deseado. Intervalos de dosificación apropiados son del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacunación con un intervalo de aproximadamente 0.1 mg a 1000 mg, tal como en el intervalo de aproximadamente 1 mg a 300 mg, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10 mg a 50 mg. Regímenes apropiados para administración inicial y tiros de refuerzo también son variables pero son tipificados por una administración inicial seguida por inoculaciones subsecuentes u otras administraciones. Cantidades precisas de ingrediente activo requeridas a ser administradas dependen del juicio del médico y pueden ser peculiares para cada sujeto. Será evidente para aquellos de habilidad en el arte que la cantidad terapéuticamente efectiva de molécula de ácido nucleico o polipéptidos de fusión de esta invención dependerán, inter alia, del horario de administración, la dosis unitaria de antígeno administrado, si la molécula de ácido nucleico o polipéptido de fusión es administrado en combinación con otros agentes terapéuticos, el estatus inmune y salud del receptor, y la actividad terapéutica de la molécula de ácido nucleico o polipéptido de fusión particular.
' Las composiciones pueden ser dadas en un horario de una sola dosis o en un horario de múltiples dosis. Un horario de múltiples dosis es uno en el cual un curso de vacunación primario puede incluir, por ejemplo, 1-10 dosis separadas, seguidas por otras dosis a intervalos de tiempo subsecuentes requeridas para mantener y/o reforzar la respuesta inmune, por ejemplo, a 1-4 meses para una segunda dosis, y si es necesario, una(s) dosis subsecuente (s) después de varios meses. Refuerzos periódicos a intervalos de 1-5 años, usualmente 3 años, son deseables para mantener los niveles deseados de inmunidad protectora. El curso de la inmunización puede ser seguido por análisis de proliferación in vitro de linfocitos de sangre periférica (PBL) co-cultivados con ESAT6 o ST-CF, y al medir los niveles de IFN-? liberado de los linfocitos cebados . Los análisis pueden ser efectuados utilizando marcadores convencionales, tales como radionucleótidos , enzimas, marcadores fluorescentes y los semejantes. Estas técnicas son conocidas para el experimentado en el arte y se pueden encontrar en las patentes estadounidenses Nos. 3,791,932, 4,174,384 y 3,949,064, porciones relevantes incorporadas por referencia.
La vacuna de la presente invención puede ser provista en una o más "dosis unitaria" dependiendo de si se usa los vectores de ácido nucleico, las proteínas purificadas finales, o se usa la forma de vacuna final. Se define que la dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas en asociación con su administración, esto es, la ruta y régimen de tratamiento apropiado. La cantidad a ser administrada, y la ruta y formulación particular, están dentro de la habilidad de aquellos experimentados en las artes clínicas. El sujeto a ser tratado puede también ser evaluado, en particular, el estado del sistema inmune del sujeto y la protección deseada. Una dosis unitaria no necesita ser administrada como una sola inyección sino que puede incluir infusión continua en un período de tiempo establecido. La dosis unitaria de la presente invención puede convenientemente ser descrita en términos de ADN/kg de peso corporal (o proteína/Kg) , con intervalos de entre aproximadamente 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.5, 1, 10, 50, 100, 1,000 o más mg/ADN o proteína/kg de peso corporal son administrados. Asimismo, la cantidad de vacuna de rAb-DC/DC-antígeno administrada puede variar de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 8.0 mg/kg de peso corporal. Así, en modalidades particulares, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.8 mg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 4.0 mg, 5.0 mg, 5.5 mg, 6.0 mg, 6.5 mg, 7.0 mg y 7.5 mg de la vacuna pueden ser administrados a un individuo in vivo. La dosificación de vacuna a ser administrada depende a una gran extensión del peso y condición física del sujeto que es tratado también como la ruta de administración y la frecuencia de tratamiento. Una composición farmacéutica que incluye un polinucleótido descubierto preenlazado a un vector de administración liposomal o viral puede ser administrada en cantidades que fluctúan de 1 u a 1 mg de polinucleótido a 1 ]ig a 100 mg de proteína. Así, composiciones particulares pueden incluir entre aproximadamente 1 ig, 5 u , 10 pg, 20 , 30 ig , 40 ug, 50 ug, 60 ug, 70 g, 80 ug, loo ug, 150 ug, 200 ug, 250 ug, 500 ug, 600 ug, 700 \ig, 800 \ig, 900 ug o 1,000 ug de polinucleótido o proteína que es enlazada independientemente a 1 ig, 5 ug, 10 ]ig , 20 ug, 3.0 ug, 40 ug 50 ug, 60 ug, 70 ug, 80 ug, 100 ug, 150 ug, 200 ug, 250 ug, 500 g, 600 g, 700 ug, 800 ug, 900 ug, 1 rng, 1.5 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg o 100 mg de vector.
La presente invención puede también ser usada para elaborar un portador de rAb modular que es, por ejemplo, un mAb humanizado recombinante (dirigido a un receptor de célula dendrítica humana específica) acomplejado con antígenos protectores de Ricina, toxina de Anthrax, . y enterotoxina de Staphylococcus B. El mercado potencial para esta entidad es vacunación de todo personal militar y la vacuna almacenada retenida en reserva a ser administrada a centros de población grandes en respuesta a cualquier bio-amenaza relacionada con estos agentes. La invención tiene amplia aplicación al diseño de vacunas en general, tanto para uso humano como animal. Industrias de interés incluyen las industrias farmacéuticas y de biotecnología.
La presente invención incluye composiciones y métodos, en los que se incluyen vacunas, que apuntan específicamente (administran) antígenos a células que presentan antígeno (APC) por el propósito de producir respuestas inmune potentes y amplias dirigidas contra el antígeno. Estas composiciones evocan respuestas inmune protectoras o terapéuticas contra el agente (patógeno o cáncer) del cual el antígeno fue derivado. Además, la invención crea agentes que son directamente o en concierto con otros agentes, terapéuticos por medio de su implicación específica con células que presentan antígeno.
Vacuna Gag-Nef . La secuencia mostrada a continuación es una proteína de fusión de cadena pesada (H) - p24 gag de VIH en donde la región p24 [en cursivas] es enlazada al término C de hlgG4H vía un separador corto [negritas] derivado de un bucle flexible del complejo de histocompatibilidad mayor humano, clase II, precursor alfa DR. Los residuos de AS subrayados son codificados por sitios de restricción usados por propósitos de construcción [en este caso Nhe I] . Este tipo de proteína de fusión anticuerpo-p24 ha sido descrita en la literatura científica . [por ejemplo, Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses (2006) Boscardin et al., JEM, Volume 203, Number 3, 599-606] .
Secuencias de enlazador de anticuerpo-antígeno mejoradas. [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hlgG4H-Viralgag] C241 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTC VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CVWDVS QEDPEVQF WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL GKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK QVSLTCLWGFYPSDIAVEWESNGQPFJSI YKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGI FSCSVi-HEALHMHYTQKSLSLSLGKASDM-\K^ QGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETIN EEAAEWDR PVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIV RMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQFnWWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAAT LEEMMTACQGVGGPGHKARVL (SEQ ID NO. : 1) Las figuras 1, carriles 1 y 2 muestran el análisis de PAGE de SDS reducido de teñido de azul de Coomassie de proteínas de fusión de p24 de gag-anticuerpo purificadas por cromatografía de afinidad de proteína A obtenidas de células CHO-2 o 293F transíectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican la fusión de cadena H - gag p24 [que codifica, por ejemplo C241 anterior precedida por una secuencia de señal natural] y un plásmido de expresión de cadena ligera [L] correspondiente. Comúnmente, para la producción de proteína secretada, el cultivo de co- transíección procede por hasta varios días antes de la cosecha del sobrenadante de cultivo para purificación subsecuente. La cadena de fusión de cadena H [-77 kDa] - gag p24 es indicada por la flecha superior. También se muestra un producto de cadena H escindido [flecha inferior] que migra ligeramente más lento que una cadena H no fusionada a otra proteína [mostrada en el carril 4 como una banda de -50 kDa] . Este resultado sugiere que la secuencia de cadena H -enlazador p24 es susceptible a escisión proteolítica, comprometiendo así la integridad de la proteína de fusión de anticuerpo-antígeno secretada producida.
En contraste, una proteína de fusión de anticuerpo -HA1-1 de Influenza puede ser secretada y recuperada sin escisión observada significativa entre el término C de la cadena H y el dominio de HAl-1. [mAnti-LOX-115C4H-LV-hIgG4H-C-Flex-FluHAl-l-6xHis] C114 es : EIQLQQTGPELV PGASWISCKASGYPFTDYIMVWWQSHGKSLEWIGNISPYYGTTNTOLKFKGKA TLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSPNWDGAWFAHWGQGALVWSAAKTKGPSVFPLAPCSR STSESTAALGCLV DYFPEPV VSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCN V HKPSNTKA/DKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPFA^TCVAA/DVSQEDPE VQFNWYV GVEVHNAKTKPREEQFNSTYR GQPREPQVYTLPPSQEEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE YKTTP.PVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHFALHNHYTQK^ DTVDTVLEKNVTVTHSmLLEDS GKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGmjLGNPECDPLLPVRSWSYIVE TPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLW LTEKEGSYPKLmSY KKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNmAYVS\ñn,SNYNRRFlTPEIAERP KVRDQAGRM1WYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAI NSSLPYQNIHPVTIGECLKYVRSAKLRMVHKH HH (SEQ ID NO. : 2) En este caso, un enlazador corto [negritas] derivado del precursor de escafoldina B de afianzamiento celulosomal [CipA de Clostridium thermocellum ATCC 27405]] fue insertado entre el término C de cadena H [vía una secuencia de unión mostrada subrayada] y el dominio de HAl-1 de influenza [cursivas] . No hay ninguna escisión proteolítica obvia entre el término C de cadena H y el dominio de HAl-1 [Figura 1 carril 3] .
La Figura 2, carril 3, muestra el análisis de PAGE de SDS reducido de teñido de azul de Coomassie de la proteína de fusión de anticuerpo de gag p24 purificado por cromatografía de afinidad de proteína A obtenida de células CHO-S o 293F transfectadas transitoriamente con vectores de expresión que codifican una fusión de cadena H - gag p24 con un enlazador de cadena H - gag p24 derivado de precursor escafoldina B de afianzamiento celulosomal [Bacteroides cellulosolvens ] y un plásmido de expresión de cadena ligera [L] correspondiente. [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-varl-Viralgag-varl-6xHis] C560 es mostrado a continuación [los residuos subrayados son de secuencias de unión de sitio de restricción y en negritas están los residuos de enlazador flexible] : QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSR LTISKDTSSNQWLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFD GAGTTVTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVXDYFPEPVTVSVmSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS QEDPEVQF WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGWFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSLGKASQTPimiSV PTN STPT NSN PKPmASVOSEFAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIP MFSALSEGATPQDUSÍTMl^TVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVAGPIAPGQMREPRGSDIAG TTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRA EQASQEVK1WMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGKKHHKK (SEQ ID NO. : 3) La proteína de fusión de anticuerpo-gag p24 anterior es producida intacta sin ninguna escisión detectable entre el término C de cadena H y el dominio de gag p24. Así, la secuencia de enlazador QTPTNTISVTPT NSTPT NSNPKPNP (SEQ ID NO.: 4) es superior por propósitos de producción de vacuna de gag p24.
Secuencias de enlazador preferidas derivadas de escafoldinas y proteínas relacionadas. La secuencia a continuación es CipA - una escafoldina de una bacteria degradante de celulosa. Esta proteína contiene múltiples dominios de Cohesina intercalados son secuencia de enlazador [en cursivas] evolucionadas aparentemente para ser flexibles -reflejando el papel de esta proteína para: (i) afianzarse a matriz de celulosa vía el dominio de enlace de carbohidrato [CBM-3, figura 3]; y (ii) enlazarse a enzimas degradantes de celulosa tales como Endoglucanasa D vía dominios de dockerina enzima-enlazados . >gi| 2506991 | sp | Q06851 | CIPA_CLOTM precursor de proteína A de escafoldina celulosomal (glicoproteína celulosomal Sl/SL) (proteína A integrante de celulosa A) (Cohesina) [Clostridium thermocellum ATCC 27405] . Los residuos en negritas son la secuencia de enlazador usada en el constructo de C114 anterior.
RKVISMLLWAMLTTIFAÁMIPQWSAA YDP VLEWEVTPGSIIKDPDPSKSFDSAIYPDRKMIWLFAEDSGRGTYAITQDGWATIVATVKSA AAAPI LLEVGAFAD DLVEISTTFVAGGVNLGSSVPTTQPNVPSDGVWEIGKVTGSVGTTVEIPVY FRGVPSKGIANCDFVFRYDP VLEIIGIDPGDIIVDPNPTKSFDTAIYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYA ITKDGVFAKIRATV SSAPGYITFDEVGGFADNDLVEQKVSFIDGGVNVG-VATPTKGATPTNTATPTK SATATPTRPSVPTNTPTNTPANTPVSGNLK FYNSNPSO TNSINPQFK\TNTGSSAIOLSKLTLRY YYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSY GITS VKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQI QGRFAKNDWSNYTQSIWYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPA TTXPPATTXPPSmPNAIKIKVD^ GELIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVA VKSGAPNGLSVIKFVEV GGFANNDLVEQRTQFF£>GGVWGDTTV^ IPSKGIA CDFVYSYDP VLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITK DGWATIVAKWSGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQF DDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDP VLEIIEIEPGDIIVDPNPDKS FDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKSGAPNGLSVIKFVEVGGFA DLVEQK TQFFOGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAVRIKVDTVNAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIA CD FVYSYDP VLEIIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIWLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAK VKEGAPNGLSVIKFVEVGGFAOTTOLVEQKTQFFDGGVWGDTTEPATPTTPV TPTTrDDLDAWIKV DTWAKPGDTVRIPVRFSGIPSKGIA CDFVYSYDP VLEIIEIEPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRK MIVFLFAEDSGTGAYAITEDGWATIVAKVKSGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNV GDTTBPATPTrPVTTPTTrDDLDAWIKVOTWAKPGDTVlIP FSGIPSKG^ ElIEIEPGDIIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKEGAPNGLS VIKFVEVGGFANNDLVEQKTQFFDGGVNVGDTTVPTr^PTTTPPBPTTTPiVKLTLK EIPVNLYGVPQKGIASGDFWSYDPNVLEIIEIEPGELIVDPNPTKSFDTAVYPDRKMIVFLFAEDSG TGAYAI EDGVFA IVAKVKEGAPEGFSAIEISEFGAFADNDLVEVETDLINGGVLVT KPVIEGYKV SGYILPDFSFDATVAPLVKAGFKVEIVGTELYAVTDANGYFEITGVPANASGYTLKISRATYLDRVIA NWWGDTSVSTSQAPIMMWGDIWDNSINLLDVAEVIRCFNATKGSAlrYVEELDINFJSIGAIN^ MIVHKHFGATSSDYDAQ (SEQ ID NO. : 5) Las Figuras 3A a 3C muestran el esquema de dominio estructural para cipA. La Figura 3A muestra que los esquemas de dominio estructural son NetOGlyc 1.0 Server y NetNGlyc 1.0 El análisis de Servidor para cipA muestran sitios de glicosilación O-enlazado (Figura 3C) y N-enlazados altamente predichos. En particular, los sitios O-enlazados están extensamente dentro de la secuencia de enlazador.
Otro ejemplo similar a cipA A es mostrado a continuación. La secuencia de enlazador mostrada anteriormente en C560 [QTPTNTISVTPTM STPTNTSTPKPNP] (SEQ ID NO. : 6) es derivada de esta secuencia [mostrada a continuación en cursivas en negritas, excepto por una sustitución N a T] y contiene dos sitios de glicosilación N-enlazados potenciales [subrayado] . Otras secuencias de enlazador usadas en constructos descritos a continuación y/o en la revelación del péptido de VIH son mos,tradas en negritas . >giI50656899Igb|AAT79550.1I precursor de escafoldina B de afianzamiento celulosomal [Bacteroides cellulosolvens] MQSPRLKRKILSVILAVCYIISSFSIQFAATPQV IIIGSAQGIPGSTVKVPINLQ VPEIGINNCDF TIKFDSDILDFNSVEAGDIVPLPVASFSS SKDIIKFLFSDATQG MPINE GLFAVISF.KIKDNAQ KGISNIKVSSYGSFSGMSGKE QSLSPTFFSGSIDVSDVSTSKLDV VGNVEGIAGTEVNVPITFE V PDNGI CNFTLSYDSNALEFLTTEAGNIIPLAIADYSSYRSMEGKIKFLFSDSSQGTRSIKNDGVFA NIKFKIKGNAIRDTYRIDLSELGSFSSKQNNNLKSI^ PTPTKSSPGNKMKIQIGDVTÍANQGDWIVPI PMA YSY1SMPSDGLVTFLY DQAQGAMSIKEDGTFA1 KFKIKQSAAFGKYSVGIKAIGSISALSNSK LIPIESIFKDGSITVTNKPIWIEIGKVKV AGDKIKVPVEIKDIPSIGI1 CNFTLKYNS NEAGTIVPAPLANLSINKPDEGIIKLLFSDASQGGMPIKDNGIFV LEFQAV DANIGVYGLELDTIG AFSGISSAKMTSIEPQF GSIEIF SAQTPVPSNTEVQTPTNTISV PTNNSTPTNNSTPKPNPIJYN IJWNIGEISGEAGGVIEVPIEFK PDFGIN CDFSVKYDKSIFEYV YEAGSIVTDSIW GIINLLFNDATQSSSPIKN GVFAKLKFKINSNAASGTYQINAEGYGKFSGNLNGKLTSINPIFE GI INIGN\7TVKPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGTPTVTPIYÑMN\TLIG M AAIGEEWVPIEFK V PPFGINNCDFKLWDSNALELKKVEAGDIVPEPLANLSSNKSEGKIQFLFNDASQGS QIENGGVFAK ITFKV^STAASGIYNIRKDSVGSFSGLIDNKMTSIGPKFTDGSIWGTV PTATATPSaJVTTXrPTA TKPIATPTIKGTPTATÍMY M WIGKMNAEVGGE WPIEFNNVPSFGINNCDFKLVYDATALELK NVEAGDIIKTPLANFSN KSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVFAKITFKVKSTTATGVYDLRKDLV GSFSGL DNKMTSIGAEFTNGSI VAATAPTVTPTVNATPSAATPTVTPTATATPSV IPTV PTATA TPSVTIPTVTPTATATPSAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTVTATPSDTIPTVTPTATATPSAIVTT ITPTATAKPIATPTIKGTPTATPMYWMNVVIGKMNAEVGGEVWPIEF NVPSFGINNCDFKLVYDAT ALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVSAKITFKVKSTTAIGVYDI RKDLIGSFSGLKDSKMTSIGAEFTNGSITVATTAPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPGTATPGTA TPTATATPGAATPTETA PSVMIPTVTPTATATPTATATPTVKG PTIKPVYKMNVVIGRVNVVAGEE WVPVEFKNIPAIGVNNCNFVLEYDA1 LEVKKVDAGEIVPDALINFGSNNSDEGKVYFLFNDALQGR MQIANDGIFANITFKVKSSAAAGIYNIRKDSVGAFSGLVDKLVPISAEFTDGSISVESAKSrPTATAT GTNVTPTVAATVTPTATPASTTPTATPTATSTVKGTPTATPLYSMSWIIGK^^ VPSIGINNCNFILEYDASALELDSAEAGEIVPVPLGNFSSNNKDEGKIYFLFSDGTQGRMQIVNDGIF AKIKFK STASDGTYYIRKDSVGAFSGLIEKKIIKIGAEFTDGSITVRSLTPTPTV PNVASPTPTK WAEPTSNQPAGPGPITGTIPTATTTATATPTKASVATATPTATPIVWEPTI RPGYNKDADLAVFI SSDKSRYEESSIITYSIEYKNIGKWATNWIAAQIPKFTKWDAAKGAVKGSEIVWMIGNLAVGESY TKEYKVKVDSLTKSEEYTDNTWISSDQTVDIPENITTGNDDKSTIRVMLYSNRFTPGSHSSYILGYK DKTFKPKQNV RAEVAAMFARIMGL1VKDGAKSSYKDVSNKIWALKYIEAV KSGIFKGYKDSTFHPN APITRAELSWIFNYLHI-NNIAPSKWFTDINKHWAKI IEEIYRFKLIQGYSDGSFKPNNNITR^ WMINRMLYRGPLKVKVGSFPDVSPKYWAYGDIEEASRNHKYTRDEKDGSEILIE (SEQ ID NO. : 7> Las Figuras 4A a 4C muestran el esquema de 1 dominio estructural para el precursor de escafoldina B de afianzamiento celulosomal [Bacteroides cellulosolvens] . La Figura 4A muestra los esquemas de dominio estructural son NetOGlyc 1.0 Server y NetNGlyc 1.0 Server. El análisis para cipA muestra sitios de glicosilación O-enlazados (Figura 4B) y N-enlazados altamente predichos. En particular, los sitios O-enlazados están extensamente dentro de las secuencias de enlazador.
La presente invención incluye composiciones y métodos para el uso de las secuencias de enlazador de dominio interestructural derivadas de organismos degradantes de celulosa como secuencias de enlazador de inter-dominio preferidas en el diseño de proteínas - particularmente aquellas con sitios de glicosilación altamente predichos para uso en el diseño de proteínas producidas en huéspedes de expresión eucariónticos . Se ha encontrado que entre las propiedades mejoradas obtenidas utilizando estas secuencias están: i) flexibilidad inherente, facilitando mediante esto la separación de dominios enlazados que deben ayudar extensamente a corregir el plegado de dominios enlazados durante la síntesis y mantener acceso sin oscurecer al hacer coincidir receptores de célula B de epítopos conformacionales de antígeno ii) glicosilación, ayudando mediante esto a la secreción y solubilidad de la proteína de fusión de producto, y protección de la secuencia de enlazador de proteasas .
Remoción de sitios de escisión proteolíticos con la secuencia de gag. La Figura 5 carril 1 [a continuación] muestra el producto de expresión purificado de [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Viralgag-p40] C535 co-transfectado con el plásmido de expresión de cadena L apropiado. La secuencia de cadena H madura de C535 [los residuos de gag están en cursivas y los residuos codificados por sitio de restricción de enlace subrayados ] es : QWLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSG GLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSR L I SKDTSSNQVFLKI IVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFD GAGTTVTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVWSWNSGALTSGVHTFPAVIJQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCl DHKPSlSrrK^/DKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS QEDPFAfl2F WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK QVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGI FSCSV-fflEALHITOYTQKSLSLSLGKASLEMGAi^SJLSGGgLDi ^J JK LRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCV HQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWV KVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDUWMUm/GGHQAAMQMLKETINEE PGQmEPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEP FRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMACQGVG ( SEQ ID NO. : 8) La flecha superior en la Figura 5 muestra la posición aproximada esperada para, la cadena H C535-codificada solamente una pequeña porción del producto tiene una banda en esta posición. La mayor parte del producto, indicada por la flecha inferior, es una cadena H más corta de un tamaño que sugiere la existencia de un sitio sensible a proteasa aproximadamente en la frontera de gag pl7-p24.
La Figura 6 carril 3 [a continuación] muestra el producto de expresión parcialmente purificado de [mAnti- DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-varl-Viralgag-p40-varl-6xHis] C601 co-transfectado con el plásmido de expresión de cadena L apropiado. La secuencia de cadena H madura de C535 [residuos de gag están en cursivas, los residuos purificados por sitio de restricción de enlace' están subrayados y los residuos de enlazador flexible están ^en negritas] es: QWLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTISKDTSSNQWLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDWGAGT VTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVTOYFPEPVWSW SGALTSG^TFPAvLQSSGLYSLSSVV VPSSSLGTK TYTCIWDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEV™AKTKPREEQFNSTYRWSVL VI_HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCL GFYPSDIAVF^ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGNVESCSVtfflEALHlffiYT^ FKPNPASLEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ ILGQLQPSLQTGSEELRSLYN VATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVOSEFAQQAAADTGHS NQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRT AWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNIVGG HQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEI YKRWIILGLmiVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYmRFYKTLRAEQASQEViamMTETLLVQNANPD CKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGHEHUHU (SEQ ID NO. : 9) La secuencia de gag anterior tiene un cambio de secuencia de KKK a VDESF [mostrado anteriormente subrayado] que remueve un sitio sensible a proteasa potencial hacia el término C de gag pl7 y la Figura 6 muestra que esta forma variante es producida con una cadena H que está extensamente sin degradar [las bandas de peso molecular más bajo en el carril 3 son "contaminantes de fondo" - véase Figura 7] .
En una modalidad específica, la presente invención incluye variantes de gag p40 [pl7 + p24] con cambios alrededor de la secuencia de KKK definida anteriormente que impiden la escisión proteolítica de las proteínas gag. pl7 + p24 enlazadas secretadas .
Anticuerpos enlazados a antígeno de nef de VIH preferido. La presente invención incluye, pero no está limitada a, una vacuna preferida que apunta a antígenos de VIH a células dendríticas tendría una cantidad máxima de antígeno de gag enlazado con una cantidad máxima de antígeno de nef . La Figura 7, carril 4 [a continuación] muestra el producto de expresión parcialmente purificado de [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-ViralNef] C757 co-transfectado con el plásmido de expresión de cadena L apropiado. La secuencia de cadena H madura de C757 [residuos de Clase B de Consenso de nef están en cursivas, los residuos codificados por sitio de restricción de enlace están subrayados y el enlazador flexible está en negritas] es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLS IRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTISKDTSSNQWLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVWS SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV VPSSSLGTK TYTCI DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQF WYv GVEVH AKTKPREEQFNSTYRvVSvLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE YKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVPKSRWQEGNWSCS MEALH HYTQ Pl&l AjMGGKWSKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEK^ EEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLÍfíYHTQGYFPDWQNYTP GPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGEmSLLHPMSLHG DPEREVLVWKFDSRLAFHHMARE El análisis de producto de anticuerpo-antígeno mostrado en la Figura 7 muestra varios constructos de cadena H-antígeno co-transfectados transitoriamente a células 293F con constructos de expresión de cadena L apropiados idénticos. Cada carril representa el producto de un sobrenadante de célula de transfección de 5 mi [3 días de producción] enlazado a perlas de proteína A en exceso, lavado 2x con PBS + NaCl 1M, eluido con HC1 20 mM, secado, disuelto en solución reguladora del pH de muestra SDS de PAGE reductor y analizado mediante SDS PAGE reductor con teñido de azul de Coomassie. Esta técnica permite la obtención no solamente de la integridad del producto de cadena H esperado, sino que permite la estimación de los niveles de producción relativos de los productos de anticuerpo-antígeno .
La emisión de un nivel de producción relativo es muy importante puesto que los costos de producción de vacuna dependerán fuertemente del rendimiento de la vacuna secretada intacta en sistemas de fermentación de células mamíferas a gran escala. Mientras que los niveles de expresión pueden ser extensamente incrementados vía sistemas de vectores alternativos - particularmente elementos de ADN portadores que favorecen la transcripción mejorada cuando son integrados a un genoma de célula mamífero y selección de clones de célula transfectada de alta producción, estos procedimientos están extensamente ayudados por constructos de partida que expresan el producto secretado intacto en buen rendimiento sin aplicación de estos procedimientos adicionales. , La enorme variación en producción de fusiones de anticuerpo-antígeno secretadas de células transfectadas ha sido bien documentada en solicitudes de patente previas [cohesina-dockerina y DCIR] y estos datos muestran que el nivel de producción es altamente dependiente del vehículo de anticuerpo [regiones variables y constantes] , pero es más bien una propiedad . intrínseca del antígeno por si mismo. Así, la Figura 7, carril 4 muestra la producción muy eficiente de [mAnti-DClR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-ViralNef] , demostrando que esta configuración de anticuerpo fusionado a antígeno de Clade B de consenso de nef enlazado vía QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP es muy favorable.
Anticuerpos enlazados a ciertos antígenos de gag de VIH y nef preferidos. [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Viralgag-p40-ViralNef] C758 tiene el antígeno de Clade B de consenso de nef anexado directamente próximo al antígeno gag p40 variante descrito anteriormente [residuos de unión están subrayados y la secuencia de enlazador flexible está en negritas] : QWLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLS IRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSR LTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVTDYFPEPVTVSWWSGALTSG TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQF WYVDGVEVH AKTKPREEQFNSTYRWSVL VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE T ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMT QVSLTCLWGFYPSDIAVEWESNGQPFJNnn'KTTPPVLDSDGS FFLYSRL VDKSR QEG FSCSV iEALHimYTQKSLSLSLGKASOTPTOTISVTPTITOSTP I^^ PTiPNPAShEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ ILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD KEALDKIEEEQNKSVDSEFAQQAAADTGHS NQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPFWIPMFSALSEGATPQ HQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEI YKRWIILGLl^IVRimrSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKimMTETLLV CKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPASMGGKWSKRSVVGWP VRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEK HGAITSSNTAANNADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQ DILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDD PEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDC (SEQ ID NO. : 11) La Figura 7, carril 5, muestra que este plásmido de expresión dirige la síntesis de esta fusión de cadena H -antígeno cuando es co-transíectado con la cadena L apropiada es expresado muy deficientemente como un producto secretado. Los carriles 6-9 muestran los productos secretados de células 293F co-transfectadas con el plásmido de expresión de cadena L y constructos de expresión de cadena H - gag que tienen inserciones de secuencia de codificación de antígeno de Clade B de Consenso de nef asociadas con secuencias de enlazadores flexibles próximas y/o distantes. La adición de la secuencia de enlazador flexible facilita la secreción de la vacuna de fusión de anticuerpo intacto-gag/nef . Uno constructo preferido para la producción de los niveles más altos de vacuna es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-pl7-f3-nef-f -p24-6xHis] C791 [véase carril 9] . Puesto que los niveles relativos de fusiones de anticuerpo-antígeno en tales sistemas de expresión mamíferos es extensamente dependiente de la región V de anticuerpo, las vacunas de anticuerpo-gag/antígeno de nef que apuntan a diferentes receptores de células dendríticas tendrían ventaja similar en producción si [ -Flex-vl-pl7-f3-nef-f4-p24-6xHis] es anexado a su término C de cadena H.
Carril 6, cadena H es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Viralgag-p40-f -nef ] C767 [los residuos de unión están subrayados, los residuos de enlazador flexible están en negritas, y los residuos de antígeno están en cursivas] : QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGT V VSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVWSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV VPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS QEDPEVQF YVDGVEVmAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL GKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGS FFLYSRL VDKSRWQEG WSCSV-fflEALH HYTQ PKPNPASLEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ ILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDSEFAQQAAADTGHS NQVSQNYPIVQNIQGQMV QAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNMLNTVGG HQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEI YKRWIILGLmiVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWM ETLLVQNANPD CKTILKALGPGATLEEMMTACQGVGGPTNGSXTVJ^TAPTWT!PTVNATPS WPTVREKMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNAAIMADCAWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPM YKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPV EPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARELHPEYYKDC (SEQ ID NO. : 12) Carril 7, la cadena H es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-pl7-nef-f4-p24-6xHis] C790 C767 [los residuos de unión están subrayados, los residuos de enlazadores flexibles están en negritas, y los residuos de antígeno están en cursivas] : QWLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTIS DTSSNQWLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCJSTVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSvFLFPPKPKDTLMISRTPEV CvVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK QVSLTCLWGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGNWSCSVMHEALHISffl^^ PKPNPAShEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ PEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRG SDIAGTTSTLQEQIGmTmPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFY KTLRAEQASQEVKNmTETLLVQN PDCKTILKALGPGATLEEMMACQGVGRH iim (SEQ ID NO. : 13) Carril 8, la cadena H es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H- C-Flex-vl-pl7-f3-nef-p24-6xHis] C797 C767 [los residuos de unión están subrayados, los residuos de enlazador flexible están en negritas, y los residuos de antígeno están en cursivas] : QV LKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTISKDTSSNQWLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDWGAGT VTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV VSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTC VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV CVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVH AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL GKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK QVSLTCLWGFYPSDIAVEWESNGQPE YKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSR QEG WSCSVMHEALHlfflYTQKSLSLSLGKASQTP OTISVTPTITO PKPNPASLEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ ILGQLQPSLQTGSEELRSLYN VATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVOTVTPTATATPS TV T TTPTAT KV\mMGGmSKRSVVGWPTVRERi RAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTAANNADC AWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPD WQJSTYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGE SLLHPMSLHGJWDPEREVLVWKFDSRLAF HHMARELHPEYYKDCEYAQQAAADTGHSNQVSQNYPIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA KVVEEKAFS PEVIPMFSALSEGATPQDL MLinVGGHQAAMQMLKETINEEAAE RmPVHAGPIAPGQMREPRG ¦ SDIAGTTSTLQEQIGl/MTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFY KTLRAEQASQEVKNimTETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMMTACQGVG iREHR (SEQ ID NO. : 14) Carril 9, la cadena H es [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H- C-Flex-vl-pl7-f3-nef-f4-p24-6xHis] C791 C767 [los residuos de unión están subrayados, los residuos de enlazador flexible están en negritas, y los residuos de antígeno están en cursivas] : QWLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLS IRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTISKDTSSNQWLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLWDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQF WYVDGVEVH AKTKPREEQFNSTYRWSVL VLHQD LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQWTLPPSQEE TK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLWDKSRWQEGNWSCSWMF^LH^ PKPNPASLEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ ILGQLQPSLQTGSEELRSLYISriVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVOTV?PTATATVSAlV TTITPTATTKP VDMGGiCWSi^KSWG^ AWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPD WQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGE SLLHPMSLHGmDPEREVLVWKFDSRLAF Hffl^Rgl-HPgiTKDCEFTNGSITVAATAPTVT^ QGQMmQAISPRTmAWVKVVEEKAFSPFVIPMFSALSEGATPQDLNTMLN VGGHQAAMQMLKETIN EEAAEmRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIV RMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGAT LEEMMTACQGVGHHKHKH (SEQ ID NO. : 15) Una modificación adicional es probada para remover degrada residual detectada bajo condiciones de fermentación severas en la producción de célula CHO-S de la proteína anterior es mostrada a continuación con un cambio de KKK a NKQ mostradas destacada en subrayado, negritas, cursivas: QWLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY PSLKSR LTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAK KGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV VSWNSGALTSGVHTFPAA/LQSSGLYSLSSVV VPSSSLGTK TYTCIWDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTC\AA/DVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVIJHQDWL GKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL\7KGFYPSDIAVEWESNGQPE YKTTPPVXJDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGIWFSCSVMHEALHNH^^ PKPNPASLEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGNKQYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQ ILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSV^^ TTlTPTATTKPyOMGGmSKRSVVGWPTVRERMRRAEPAADGV AWLEAQEEEEVGFPVRPQVPLRPM YKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPD WQl TPGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGEmSLLHPMSLHGmDPEREVLVWKFDSRLAF i¾tMARgLHPgyyi PCEFTO QGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNVGGHQAAMQM EEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIV RMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPGAT LEEMMTACQGVGHHKHHB. (SEQ ID NO. : 16) Ciertas fusiones de antígeno de gag-nef con epítopos de antígeno máximos se encontraron tener propiedades de secreción/producción eficientes. Variantes de gag p40 con insertos o anexos de antígeno de nef flanqueados por secuencias de enlazador flexible preferidas fueron . encontradas ser particularmente bien producidas y secretadas. Se encontró que las secuencias de enlazador flexible reveladas en la presente y obtenibles de organismos degradantes de celulosa fueron aptos de facilitar la secreción de antígenos intactos y/o antígenos enlazados como proteínas de fusión de anticuerpo-antígeno .
Secuencias de ADN de secuencia de codificación de antígeno: la región de antígeno de C757 es [las secuencias en negritas son los sitios de unión o un codón de retención] : 6CTAGCATGGGAGGCAAATGGAGTAAAAGAAGTGTTGTGGGTTGGCCAACTGTGAGAGAAAGAATGAG AAGGGCTGAACCAGCCGCTGATGGTGTAGGTGCTGTGTCACGAGATCTGGAAAAACACGGAGCAATAA CATCCTCTAATACCGCCGCAAATAACGCAGACTGTGCCTGGCTCGAAGCTCAAGAAGAAGAAGAAGTC GGATTCCCCGTGCGACCCCAAGTTCCCCTCAGACCAATGACTTATAAAGGCGCTCTGGATCTTAGCCA CTTTCTTAAAGAAAAAGGAGGACTGGAAGGACTTATTTATTCACAAAAAAGACAAGACATGCTCGATT TGTGGGTATATCATACTCAAGGTTATTTCCCAGACTGGCAAAATTATACTCCTGGACCCGGCATTCGA TATCCCCTTACCTTTGGATGGTGCTTTAAACTTGTCCCCGTCGAACCTGAAAAAGTAGAAGAAGCAAA TGAAGGCGAAAATAATTCACTGCTCCACCCTATGTCACTGCACGGAATGGATGACCCCGAACGCGAAG TTCTGGTATGGAAATTTGATTCAAGACTTGCTTTTCACCACATGGCTAGAGAACTTCACCCCGAATAT TATAAAGACTGTTGA (SEQ ID NO.: 17) El enlazador de C791 y secuencia de codificación antígeno es [las secuencias en negritas son sitios de unión un codón de retención] : GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAG CAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGCCTCGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAATATTAAGCGGTGGCGAAT TAGATAGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTA TGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAG ACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATA CAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAG ATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTGTCGATACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCAT CGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGTCGACATGGGAGGCAAATGGAGTAAAAGAA GTGTTGTGGGTTGGCCAACTGTGAGAGAAAGAATGAGAAGGGCTGAACCAGCCGCTGATGGTGTAGGT GCTGTGTCACGAGATCTGGAAAAACACGGAGCAATAACATCCTCTAATACCGCCGCAAATAACGCAGA CTGTGCCTGGCTCGAAGCTCAAGAAGAAGAAGAAGTCGGATTCCCCGTGCGACCCCAAGTTCCCCTCA GACCAATGACTTATAAAGGCGCTCTGGATCTTAGCCACTTTCTTAAAGAAAAAGGAGGACTGGAAGGA CTTATTTATTCACAAAAAAGACAAGACATCCTCGATTTGTGGGTATATCATACTCAAGGTTATTTCCC AGACTGGCAAAATTATACTCCTGGACCCGGCATTCGATATCCCCTTACCTTTGGATGGTGCTTTAAAC TTGTCCCCGTCGAACCTGAAAAAGTAGAAGAAGCAAATGAAGGCGAAAATAATTCACTGCTCCACCCT ATGTCACTGCACGGAATGGATGACCCCGAACGCGAAGTTCTGGTATGGAAATTTGATTCAAGACTTGC TTTTCACCACATGGCTAGAGAACTTCACCCCGAATATTATAAAGACTGTGAATTCACCAACGGCAGCA TCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCCAATTC GCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAA CATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAG AAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTGATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAA GATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCAT CAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGA TGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATG ACACATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGGTGGATAATCCTGGGATTAAATAAAAT AGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAGGAACCCTTTAGAGACT ATGTAGACCGATTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCACAAGAGGTAAAAAATTGGATGACA GAAACCTTGTTGGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCATTGGGAGCAGGAGC GACACTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTGGGGCATCACCATCACCATCACTGA (SEQ ID NO. : 18) Los siguientes ejemplos muestran que la presente invención fue apta de apuntar el VIH y otros antígenos a células dendríticas humanas vía CD40. Generación de anticuerpos monoclonales anti-CD40 activantes potentes. Ratones fueron inmunizados con una proteína de fusión CD40 IgG2b de ratón -humana y células B de nodos linfáticos que se drenan del sitio de inyección fueron inmortalizados subsecuentemente como hibridomas . Los sobrenadantes de 35 hibridomas que segregan anticuerpos reactivos anti-CD40 tal como es detectado mediante FACS contra células 293F co-transfectadas con CADN CD40 fueron probados en cultivos de la noche a la mañana de células dendríticas humanas en cuanto a inducción de secreción de citocina. La Figura 8 muestra un ejemplo de este tipo de selección diseñado para detectar el subconjunto de anticuerpos anti-CD40 que puede enlazar y activar CD40. Este conjunto de datos muestra que dos hibridomas 12E12 y 9A11 fueron especialmente potentes para dirigir células dendríticas a IL-12p40 secretado. Los cADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras de 12E12 fueron derivados utilizando tecnologías de clonación y secuenciación estándar y las regiones variables fueron diseñadas a vectores que expresan las regiones variables 12E12 de ratón injertadas sobre regiones constantes de IgG4 humanas constantes.
C269 rAB-pIRES2 [manti-CD40_12El2.3F3_K-V-hIgGK-C] . La secuencia de ADN a continuación muestra la región de codificación de cadena ligera quimérica y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera madura secretada esperada con la región variable de ratón en cursivas .
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCA GATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGTGCAA GTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATC TATTACACATCAATTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTA TTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTACTATTGTCAGCAGTTTAATAAGC TTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC ATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTT CTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGA GTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTT:AGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGT VKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVA APS IFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV KSFNRGEC (SEQ ID NO. : 19) C230 rAB-pIRES2 [manti-CD40_12El2.3F3_H-V-hIgG4H-C] . La secuencia de ADN a continuación muestra la región de codificación de cadéna pesada quimérica y la secuencia de aminoácidos esperada de la cadena ligera madura secretada con la región variable de ratón en cursivas.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCT GGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCTGGAT TCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCA TACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG AGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATT ACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTC TCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAG CACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCGCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCC CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCAC CTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTG GTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGT ACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA GCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAAC. TACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGAEWLV^SGGGLV-QPGGSLJLSCAT SGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKN LYLQMSRLKSEDTA MYYCARRGLPFHAMDmGQGTSVVSSAKTKGPS\7FPLAPCSRSTSESTAAlJGCh\nniYFPEP\n^S^ NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFOTAnA/DGVEVHNAKTKPREEQFN STYRWSVLWLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLWDKSR QEGNVFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO. : 20) Variantes de C230 fueron diseñadas para codificar cadenas H de CD4012E12 con antígenos fusionados al término C de lgG4 humano, por ejemplo, C291 rAB-pIRES2 [manti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C-Flex-FluHAl-l-6xHis] codifica una cadena H con la secuencia mostrada a continuación con la región de antígeno de HAl-1 de Influenza mostrada en cursivas y una secuencia de enlazador flexible y etiqueta de poli-histidina C-terminal mostrada en negritas: EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV GRF TISRDNAK TLYLQMSRLKSEDTAÍ^YCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEV QF WYVDGVEVH AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQWTLPPSQEE TKNQVSLTCL GFYPSDIAVEWESNGQPEMNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEG- FSCSVMHEALH HYTQ T^ TmjEKNVJVTHSmLLEDS GKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVET PNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWL TEKEGSYPKLKNSYVimKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNmAYVSVVTSlrYNRRFTPEIAERPK ?RDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNKGQTPLGAIN SSLPYQNIHPVTIGECLKYVRSAKLRMViSHHHHB. (SEQ ID NO. : 21) Otro tipo de constructo de cadena H variante es C450 rAB-pIRES2 [manti-CD40_12El2.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Dockerin-varl] que codifica una cadena H con. la secuencia mostrada a continuación con una región de antígeno de dominio de Dockerina C-terminal mostrada en cursivas: EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLE VAYINSGGGSTYYPDTVKGRF TISRDNA TLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLV DYFPEPVWSVWSGALTSGVHTFPAVIjQSSGLYSLSSvVTVPSSSLGTKTYTC V DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QF WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR QPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNWSCSVMHEALHNHYT^ YVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVDSSDV ILSRYLIRVIEKLPI (SEQ ID NO. : 22) Así, vectores de expresión que codifican las cadenas H variantes anteriores y similares pueden ser co-transfectados a células 293F o CHO-S dando como resultado la secreción de proteínas de fusión de anti-CD4012El2-hIgG4 , que puede ser purificado fácilmente mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
Tales proteínas de anticuerpo-antígeno pueden ser usadas como vacunas para administrar antígeno con alta eficiencia á células dendríticas humanas in vitro o in vivo. La proteína de Dockerina anti-CD4012EÍ2-hIgG4 puede ser usado asimismo para administrar proteínas de fusión de cohesina-antígeno. Por ejemplo: C32 Ecoli-pET28 [Cohesin-FluMl-6xHis ] codifica la secuencia mostrada a continuación, en donde la proteína Mi de Influenza es mostrada en cursivas: MDLDAWIKVDTVmKPGDTWIPWFSGIPSKGI FD AWPDRKMIWLFAEDSGTGAYAITKDGWATIVAK EGAPNGLSVIKFVEVGGFAN 3LVEQK TQFFDGGVWGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASLLTBVET7VLSIJPSGPLJ<-4£JA0fíLED/FAG KNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRK LKREITFHGAKEIALSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTN PLIRHENRMV^STTAKAMEQMAGSSEQAAEAMDIASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKDDLLENLQ AYQKRMGVQMQRFKLEK K (SEQ ID NO. : 23) La proteína anterior puede ser expresada como una proteína soluble en E. coli y preparada como un producto puro mediante cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad de metal. Complejos o conjugados altamente estables entre la proteína de fusión de anti-Dockerina CD4012El2-hlgG4 y proteína de fusión Mi de Influenza de Cohesina pueden ser ensamblados vía la interacción de Dockerina-Cohesina de alta afinidad.
Un intervalo de dosis de tales conjugados de Mi de Influenza de Dockerina-Cohesina anti-CD4012E12-hIgG4 fueron incubados con células dendríticas humanas por un día, luego células T CD8+ singénicas fueron agregadas y la incubación fue proseguida por varios días más. Las células fueron luego teñidas con anticuerpo anti-CD8 y un reactivo de tetrámero de HLA-A2 específico para células T que llevan TCR correspondiente al epítopo de Mi de Influenza inmunodominante 58-66. Las células positivas de tetrámero son mostradas en la compuerta rectangular. Estos datos muestran que las concentraciones de conjugados de Mi de Influenza Dockerina-Cohesina anti-CD4012El2- IgG4 tan bajas como de 0.001 ug/ml dan como resultado la proliferación de células T CD8+ Mi Influenza-específicas a niveles significativamente más altos ya sea que ningún conjugado agregado o [próximo panel de la figura] que una serie de intervalo de dosis paralelo de conjugados de Mi de Influenza de Dockerina-Cohesina de IgG4 testigo. Estos datos demuestran que el anticuerpo anti-CD4012El2 es notablemente eficiente para administrar el antígeno a las células dendríticas resultantes en el procesamiento y presentación del antígeno como se ve por la proliferación de células T específicas de antígeno.
La Figura 9 muestra el análisis de FACS de teñido de CD8+ [eje horizontal] contra el teñido de tetrámero de Mi de Influenza [eje vertical] tal como es producido por un intervalo de dosis de 10 ug/ml a un conjugado de Mi de Influenza de Dockerina-Cohesina sin anti-CD4012El2-hIgG4.
La Figura 10 muestra el análisis de FACS del teñido de CD8+ [eje horizontal] contra el teñido de tetrámero de Mi de Influenza [eje vertical] tal como es producido por un intervalo de dosis de 10 ug/ml a un conjugado de Mi de influenza de Dockerina-Cohesina sin testigo de hIgG .
Alineación de secuencia de cadena ligera de anti-CD4012E12 de C269 (seqA) con variantes diseñadas para retener el enlace de CD40 y para mejorar la similaridad con secuencias variables de cadena ligera humanas y al incluir codones preferidos para mejorar la expresión del producto secretado. seqA DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPEK3TVKLLIYYTSILHSGVPS seqB DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYU^QQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS seqC DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS seqD DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLJSWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS seqE DIQMTQTTSSLSTSLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS ************ . *********************************** . *********** seqA RFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP seqB RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP seqC RFSGS-SGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP seqD RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKPPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP seqE RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP ***** ********* *** ******.****** ************************** seqA SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT seqB SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT seqC SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT seqD SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT seqE SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT ************************************************************ seqA LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC seqB LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC seqC LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC seqD LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC seqE LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ********************************** (SEQ ID NO. : 24, 25, 26, 27, 28, respectivamente) Alineación de las secuencias de cadena pesada de anti-CD4012El2 de C268 (seqA) con una variante diseñada para retener el enlace de CD40 y para mejorar la similaridad con secuencias variables de cadena ligera humanas - y al incluir codones preferidos para mejorar la expresión del producto secretado.
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYY EV LVESGGGLVQPGGSLKVSCVTSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWAYINSGGGSTYY * * . **************** . ** ************************************* PDTVKGRFTISRDNA TLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSA PDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTLVTVSVA *****************.*********************************** **** * KTKGPSWPLAPCSRSTSESTAALGCLV DYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQSSG STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG *********************************************************** LYSLSSWTVPSSSLGT TYTCNVDHKPSNT VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVF LYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES YGPPCPPCPAPEFEGGPSVF ************************************************************ LFPP PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR LFPPKPKOTLMISRTPEV CVVVDVSQEDPEVQF WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE TK WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK ISKAKGQPREPQVY LPPSQEE^I K1^I ************************************************************ QVSLTCLWGFYPSDIAVEWESNGQPFJSI YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN QVSLTCL GFYPSDIAVEWESNGQPEMSFYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN ****************************************** ¦***************** VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS VFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO.: 29, 30, respectivamente) La Figura 11 ilustra el protocolo usado para analizar in vitro la potencia de moléculas de apuntamiento de receptor anti-CD-antígeno [TM] para dar como resultado la expansión de células T antígeno-específicas en el contexto de un cultivo de PBMC. Brevemente, PBMC 2E6 de la aféresis de pacientes con VIH son incubadas con un intervalo de ¦ dosis de la vacuna de apuntamiento y 100 U/ml de IL-2. Los medios son cambiados cada dos días. En el día, grupos de péptidos correspondientes al antígeno son agregados para inducir la producción de IFNy por células T con especificidades de TCR por secuencias de péptido dentro de cada grupo. Después de 4 horas de incubación con el grupo de péptidos y un agente que bloquea la secreción de citocina, las células son teñidas con reactivos anti-CD4, anti-CD8, anti-IL-13, y anti-IFNy y analizados mediante FACS .
Las Figuras 12 y 13 muestran los efectos de apuntamiento de células dendríticas [dentro de la PBMC] con una vacuna gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 - la composición de cadena H es mostrada a continuación: los residuos de unión de C818 rAB-cetHS-puro [manti-CD40_12El2.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Viralgag-pl7-f3-nef-f4-p24-6xHis] están subrayados, los residuos de enlazador flexible están en negritas y los residuos de antígeno están en cursivas] : EWLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV GRF TISRDNAKISTTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVVPSSSLGTKTYTC V DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVYDVSQEDPEV QF WYVDGVEVH AKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGI FSCSVlfflEALHNHYTQKSLSLSLGKA^QT^ SIEMGARASILSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRE ERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQ PSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSVDTVT ATTKPVOMGGKWSKRSVVGWP VRERMRRAEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTA EEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSQKRQDILDLWVYHTQGYFPDWQNYTP GPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPEKVEEANEGENNSLLHPMSLHGMDDPEREVLVWKFDSRLAFHHMARE LHPEYYKDCEF NGSXV^AATAPT\P?PTV1^T SAAQFAQQAAADTGHSNQVSQ1^PIVQNIQGQM^ QAISPRTIMAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDIMTMLNTVGGHQAAMQML DRVHPVHAGPIAPGQmEPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPT SILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWM ETLLVQNANPDCKTILKALGPGATLEEMM ACQGVGHHHHHH (SEQ ID NO.: 31) La Figura 12 muestra que la vacuna produce la expansión de células T CD4+ con especificidades a todos los grupos de péptidos gag p24 - aún a la dosis de vacuna más baja probada, el porcentaje de células T CD4+ que producen IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no fueron tratadas con péptidos . La Figura 13 [panel superior] muestra estos datos en forma de gráfica - el eje vertical muestra el por ciento de células que producen IFNy . El panel inferior muestra datos similares para células T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia gag p24 dieron como resultado una producción significativamente mayor de células T que producen IFNy que el testigo sin popote. Así, la vacuna produjo respuestas potentes contra múltiples epítopos dentro de gag p24 de VIH.
La Figura 14 muestra que la vacuna da como resultado la expansión de células T CD4+ con especificidades a todos los grupos de péptidos gag pl7 - aún a la dosis de vacuna más baja probada, el porcentaje de células T CD4+ que producen IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no fueron tratadas con péptidos. La Figura 15 muestra estos datos en forma de gráfica - el eje vertical muestra el porcentaje de células que producen IFNy [panel superior] . El panel inferior muestra datos similares para células T CD8+ dentro del cultivo de PBMC, y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia gag pl7 dieron como resultado una producción significativamente mayor de células T que producen IFNy que el testigo sin péptido. Así, la vacuna produjo respuestas potentes contra múltiples epítopos dentro de gag pl7 de VIH.
La Figura 16 muestra que la vacuna da como resultado la expansión de células T CD4+ con especificidades a la mayoría de los grupos de péptido de nef de VIH - aún a la dosis de vacuna más baja probada, el porcentaje de células T CD4+ que producen IFNy fue significativamente mayor que cuando las células no fueron tratadas con péptidos . La Figura 17 muestra estos datos en forma de gráfica - el eje vertical muestra el porcentaje de células que producen IFNy [panel superior] . El panel inferior muestra datos similares para células T CD8+ dentro del cultivo de PBMC y estos datos también muestran que todos los grupos de péptidos que cubren la secuencia de nev dieron como resultado una producción significativamente mayor de células T que producen IFNy que el testigo sin péptido. Así, la vacuna produjo una respuesta potente contra múltiples epítopos dentro de nef de VIH.
Se encontró que los datos muestran que la vacuna [anti-CD4012El2 - enlazada a la proteína de fusión de gag pl7 nef gag p24 diseñada especialmente] puede, aún a bajas dosis, producir respuestas inmune amplias, esto es, amplia representación de epítopos en ambos de los compartimientos de célula CD4+ y CD8+. Esto datos demuestran además que cada una de las dos partes de vacuna [anti-CD4012El2 y otros anticuerpos con propiedades especiales similares, y el antígeno gag-nef diseñado para máxima representación de epítopo consistente con la producción eficiente] - esto es, el componente anti-CD40 puede ser un vehículo para administración de otros antígenos, y el componente de antígeno puede ser administrado mediante otros vehículos de receptor de anti-CD. Los resultados también demuestran la habilidad del apuntamiento basado en CD40 para expandir un amplio arreglo de células T CD4+ y CD8+ antígeno-específicas tanto para poblaciones de células T de memoria [pacientes con VIH a los que se les administró vacuna de HIV] y naturales [donadores normales a los que se les administró antígeno de PSA] .
Las células dendríticas apuntadas con anti-CD40-PSA inducen respuestas de célula T CD4+ PSA-específicas . La Figura 18 muestra el bosquejo de un protocolo para probar la habilidad de una vacuna compuesta de anti-CD40-12El2 enlazado a PSA [antígeno próstata-específico] para dar como resultado la expansión de una población de células T naturales de células T CD4+ PSA-específicas correspondientes a un amplio arreglo de epítopos de PSA. Brevemente, células dendríticas derivadas mediante cultivo con IFNy y GM-CSF de monocitos de un donador normal son incubadas con la vacuna. El siguiente día, las células son colocadas en un medio nuevo y células T CD4+ puras del mismo donador son agregadas. Varios días más tarde, se agregan péptidos de PSA y después de cuatro horas, se determinan los niveles de IFNy secretados en los sobrenadantes del cultivo.
La Figura 19 muestra que muchos péptidos de PSA dan como resultado respuesta de producción de IFNY potentes indicando que los agentes anti-CD4012El2 y agentes antiCD40 similares pueden administrar efectivamente el antígeno a células dendríticas, dando como resultado el cebado de respuestas inmune contra múltiples epítopos del antígeno.
La Figura 20 muestra que las células dendríticas apuntadas con anti-CD40-PSA apuntado a células dendríticas induce respuestas de célula T CD8+ PSA-específicas . Células dendríticas de IF DC son apuntadas con 1 µg de proteína de fusión de mAb con PSA. Células T CD8+ autólogas purificadas fueron co-cultivadas por 10 días. Las células fueron teñidas con anti-CD8 y PSA (KLQCVDLHV) -tetrámero . Las células son de un donador saludable positivo HLA-A*0201. Los resultados demuestran que anti-CD40 administra efectivamente PSA a las células dendríticas, que a su vez dan como resultado la expansión de células T CD8+ PSA-específicas .
La Figura 21 bosqueja el protocolo de apuntamiento de células dendríticas para probar vacunas de apuntamiento de receptor de anti-DC en cuanto a su habilidad para dirigir la expansión de células T antígeno-específicas resultantes de la absorción apuntada por las células dendríticas y presentación de epítopos de antígeno sobre su superficie celular. Brevemente; monocitos de paciente con VIH son diferenciados a células dendríticas mediante cultivo por 3 días en IFNa y GM-CSF. Luego la vacuna [FP] es agregada a 10 ug/ml junto con células T autólogas . Después de 10 días en cultivo, grupos de péptido de antígeno son agregados a las células T expandidas y después de 4 horas se mide IFNa intracelular .
La Figura 22 [panel superior] muestra la comparación de la eficacia de vacunas de nef anti-CD4012El2 , gag p24 anti-CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 de anti-CD4012El2 [paciente Aph002] . La vacuna de nef anti-CD4012El2 [barras- verdes] estimuló la expansión de células T CD4+ que producen IFNa sensible solamente a epxtopos de péptido de nef, gag p24 anti-CD4012E12 [barras azules] estimuló la expansión de células T CD4+ que producen IFNa sensibles a solamente epítopos de péptido p24, mientras que gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012E12 estimuló la expansión de células T CD8+ que producen IFNa sensibles a epítopos de péptido de e gag pl7, nef y p24.
La Figura 22 [panel inferior] muestra , la comparación de la eficacia de vacunas nef anti-CD4012El2 , gag p24 anti-CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [paciente -Aph002] . La vacuna de nef anti-CD4012El2 [barras verdes] estimuló la expansión de células T CD8+ que producen IFNa sensible solamente a los epítopos de péptido de nef, mientras gag pl7 nef gag p24 de anti-CD4012El2 [barras anaranjadas] estimuló la expansión de células T CD8+ que producen IFNa sensibles a ambos de los epítopos de péptido de gag pl7 y nef.
La Figura 23 [panel superior] muestra la comparación de la eficacia de vacunas de nef anti-CD4012El2 , gag p24 anti- CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [paciente AphOlO] . La vacuna de nef anti-CD4012E12 [barras verdes] estimuló la expansión de células T CD4+ que producen IFNoc sensible solamente a los epítopos de péptido de nef, gag p24. anti-CD4012El2 [barras azules] estimuló la expansión de células T CD4+ que producen IFNa sensible solamente a epítopos de péptido p24, mientras que el gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 estimuló la expansión de células T CD8+ que producen IFNa sensibles a los epítopos de péptido de gag pl7, nef y p24.
La Figura 23 [panel inferior] muestra la comparación de la eficacia de vacunas nef anti-CD4012El2 , gag p24 anti-CD4012E12, y gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [paciente Aph002] . La vacuna de nef anti-CD4012El2 [barras verdes] estimuló la expansión de células T CD8+ que producen IFNa sensible solamente a los epítopos de péptido de nef, gag p24 anti-CD4012El2 [barras azules] estimuló la expansión de células T CD8+ que producen IFNa sensibles a solamente epítopos de péptido p24, mientras que gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 [barras anaranjadas] estimuló la expansión de células T CD8+ que producen IFNa sensibles a ambos de los epítopos de péptido de gag pl7 y nef.
Estos datos demuestran que la vacuna de gag pl7 nef gag p24 anti-CD4012El2 puede producir un amplio arreglo de respuestas de célula T que cubren múltiples epítopos dentro de todos los tres elementos de antígeno de la vacuna - gag pl7 de VIH, gag p24 de VIH, y nef de VIH.
La secuencia a continuación es la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de Cohesina [residuos en negritas] - Ciclina DI [residuos subrayados] expresada por el vector C515; C515 E. coli-pET28 [Cohesin-hCyclinDl-6xHis ] I^LDAVRIKVDTVNAKPGOTVOTPVK^ FI-WAVYPDRK IVFLFAEDSGTGAYAITKI)GVFATIVAKVKEGAPNGL TQFFDGGVNVGDTTEPATPTTPVTTPTTTDDLDAASLEME MLKAEETCAPSVSYFKCVQKEVLPSMRKIVAT MLEVCEEQKCEEEWPLAMNYLDRFLSLEPVKKSR LQLLGATCMFVASK KETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELLLV KLKW LAAMTPHDFIEHFLS KMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATD FISNPPSMVAAGSWAAVQGL LRSPNNFLSYYRLTRFLS RVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQ MDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDiHHHHHH (SEQ ID NO. :32) Expresión y purificación de proteína de Coh. Ciclina Di producida en E. coli.
Coh. Ciclina Di fue expresada en E. coli cepa T7 Express (NEB) cultivada en caldo de Luria (Difco) a 37°C con selección en cuanto a resistencia a kanamicina (40 ]ig/ml) y agitación a 200 vueltas/min a una fase de crecimiento medio-logarítmico. Luego, se agregaron 120 mg/L de IPTG (Bioline) y después de 3 horas adicionales, las células fueron cosechadas mediante centrifugación y almacenadas a -80°C. Las células de E. coli de cada fermentación de 1 litro fueron resuspendidas en 50 mi de solución reguladora de pH Tris 50 mM helada, EDTA 1 mM, pH 8.0 con 0.2 mi de Coctail II inhibidor de proteasa (Calbiochem) . Las células fueron sonificadas dos veces sobre hielo durante 4 minutos en el ajuste de 18 (dispositivo Fisher Sonic Dismembrator 60)' con un período de reposo de 5 minutos y luego centrifugadas a 17,000 r.p.m. (dispositivo Sorvall SA-600) por 20 minutos a 4°C. El sobrenadante de lisado celular de 50 se hizo pasar a través de 10 mi de perlas de ANX Sepharose (GE Healthcare) , luego el flujo pasante fue ajustado a la solución reguladora del pH de enlace con 7.5 mi de Tris 160 mM, imidazol 40 mM, NaCl 4 M, pH 7.9 y cargada a una columna de HP quelante HiTrap de 5 mi (GE Healthcare) cargada con Ni++. La proteína enlazada fue lavada con NaPC>4 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7.6 (solución reguladora del pH A) y eluida con un gradiente de imidazol de 10-500 mM en solución reguladora del pH A. Las fracciones proyectadas fueron analizadas mediante gel de SDS-PAGE, acumuladas. Aproximadamente 15 miligramos de la proteína de fusión de Cohesina-Ciclina Di eluida acumulada se hicieron reaccionar durante toda la noche a temperatura ambiente con 10 miligramos de reactivo mPEG-MAL 20k (Nektar) , que anexa un grupo pegil de 20 kDa a residuos de cisteína libres [de los cuales hay varios dentro del dominio de Ciclina Di] . Una parte de esta reacción fue dializada contra DPBS [Gibco] y parte fue ajustada a pH 7.5, luego se agregó DTT a 10 mM durante 1.5 horas a temperatura ambiente para reducir cualesguier enlaces de disulfúro, seguido por la adición de yodoacetamida 25 mM durante 1.5 horas a temperatura ambiente para alquilar los residuos de cisteína libre, seguido por la adición de DTT 20 mM durante 1.5 horas a temperatura ambiente, seguido por diálisis contra DPBS. La pegilación fue requerida para asegurar que la proteína siguiera siendo soluble en DPBS y la alquilación [que no fue necesaria por la actividad de la proteína en el contexto de apuntamiento de anti-CD40 in vitro] sirvió para asegurar que el producto estaba libre de formas de enlace cruzado de disulfuro intermoleculares.
Figura 24. Análisis de la interacción de la proteína de fusión de Cohesina-Ciclina Di con el anticuerpo recombinante de receptor anti-CD-Dockerina. Anticuerpo-Dockerina o proteína de fusión de anticuerpo-nef de VIH [20 µg] fue incubada con 100 µ? de perlas de proteína A-Sepharose [GE. Biosciences] luego lavada dos veces con DPBS. Se agregó Cohesina-Ciclina Di [Coh.Ciclina Di] Pegilada [peg] o pegilada y alquilada [peg alk] [20 µg] y, después de 30 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante fue separado de las perlas mediante centrifugación. Las perlas fueron eluidos con HCl 20 mM y el eluido y sobrenadante fueron secados, resuspendidos en solución reguladora del pH de carga de SDS . PAGE y se hicieron correr sobre SDS. PAGE reductor y visualizados mediante teñido de azul de Coomasssie. El Carril 1 muestra el sobrenadante de las perlas cargadas con anticuerpo-Dockerina + Coh.Ciclina Di pegilada y el Carril 2 es el eluido de perla correspondiente. El Carril 3 muestra el sobrenadante de las perlas cargadas con anticuerpo-nef de VIH + Coh.Ciclina DI pegilada y el Carril 4 es el eluido de perla correspondiente. El Carril 5 muestra el sobrenadante de perlas cargadas con anticuerpo-Dockerina + Coh.Ciclina Di peg alk y el Carril 6 es el eluido de perla correspondiente. El Carril 7 muestra el sobrenadante de perlas cargadas con anticuerpo-nef de VIH + Coh.Ciclina Di peg alk y el Carril 8 es el eluido de perla correspondiente. El Carril 9-muestra el anticuerpo-Dockerina solo, el carril 10 muestra el anticuerpo-nef de VIH solo, el Carril 11 muestra Coh.Ciclina Di pegilada solo, y el Carril 12 muestra la Coh.Ciclina Di peg alk sola. Las flechas [de arriba a abajo] muestran: 1) formas pegiladas de alto peso molecular de Coh.Ciclina Di, 2) la posición de la cadena pesada de anticuerpo, 3) la posición de Coh.Ciclina Di sin pegilar [que es aproximadamente 50% de las preparaciones] , 4) la posición de la cadena ligera de anticuerpo.
El análisis anterior muestra que anticuerpo-Dockerina, pero no el anticuerpo-nef de VIH, captura efectivamente la mayor parte de la Coh.Ciclina Di. Esto demuestra que las preparaciones de Coh.Ciclina Di pueden ensamblar un complejo con vehículos de apuntamiento de receptor de anti-CD-Dockerina .
Linfoma de célula de manto (MCL) es un linfoma no de Hodgkin de célula B que representa el 5-10% de linfoma completamente sin Hodgkin, predominantemente en machos con edad avanzada. Es un cáncer muy agresivo con la peor prognosis después de tratamiento convencional, recaídas frecuentes, y sobrevivencia relativamente corta. Tiene un sello distintivo genético: translocación t (11; 14) (ql3; q32) que conduce a la sobreexpresión de Ciclina DI.
La ciclina Di Gl/S-específica - nombrada alternativamente PRADl, Bcl-1 funciona en el control de ciclo celular en el avance de Gl y transición de Gl/S vía la formación de complejos con CDK4 y 6. No hay ninguna expresión normal en linfocitos maduros puesto que la expresión es dependiente de ciclo celular con expresión máxima en Gl, mínima en S. Así, la elevación de respuesta de célula T citotóxicas dirigidas específicamente a células que sobreexpresan Ciclina Di es una estrategia de vacunación de MCL atractiva.
La Figura 25 muestra un esquema de péptidos traslapantes de Ciclina Di. Estos son agregados a cultivos de célula T, ya sea como péptidos individuales o como fondos de péptidos, en donde pueden ser presentados sobre MHC y mediante esto estimular la proliferación de células T específicas de péptido .
La Figura 26 muestra un esquema [panel izquierdo] del diseño del estudio para probar la habilidad de complejos anti-¦CD40-Ciclina Di para producir la expansión in vitro de células T CD4+ Ciclina Dl-específicas . Después de la incubación de células dendríticas con el complejo de apuntamiento, células T CD4+ autólogas [esto es, del mismo donador] marcadas con el tinte CFSC son agregadas y cultivo continúa por 8 días adicionales con IL-2, luego 2 días de reposo sin IL-2. Enseguida, el cultivo es di ided y estimulado con péptidos de Ciclina D individuales o sin péptido, por 8 horas seguido por teñido en cuanto a IFNg e IL-2 intracelulares [indicadores de activación de célula T] y análisis mediante FACS .
El análisis muestra que los péptidos de Ciclina D P8, P16 y P54 estimulan significativamente mayor producción de células T CD4+ proliferantes [esto es, marcadas mediante dilución de CFSC] que las células incubadas sin péptido [u otros péptidos de Ciclina Di [no mostrado]. Así, el complejo de anti-CD40-Ciclina DI funciona para producir la expansión de células T de un donador normal de células T Ciclina Dl-específicas con fenotipo de función efectora.
La Figura 27 muestra un estudio y análisis similar a aquel detallado en la Figura 26, excepto que se usó un donador normal diferente - en este caso, el complejo de anti-CD40-Ciclina Di produjo la expansión de células T CD4+ proliferantes IFNg positivas para péptidos de Ciclina Di P4 , P43 y P70 .
La Figura 28 muestra un esquema y análisis similar a aquellos descritos anteriormente en la Figura 26, excepto que se usaron células T CD8+. En este donador, el complejo de anti-CD40-Ciclina Di produjo la expansión de células T CD8+ Ciclina Dl-específicas , en particular aquellas con especificidades correspondientes a péptidos contenidos dentro del fondo I y fondo II .
La Figura 29 muestra datos similares del mismo donador, pero analizados con péptidos individuales de estos fondos. En particular, estas células T muestran especificidad por péptidos P7, P8 , y PIO.
Se contempla que cualquier modalidad discutida en esta especificación puede ser implementada con respecto a cualquier método, kit, reactivo o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención pueden ser usadas para obtener los métodos de la invención.
Se comprenderá que modalidades particulares descritas en la presente son mostradas a manera.de ilustración y no como limitaciones de la invención. Los elementos principales de esta invención pueden ser empleados en varias modalidades sin desviarse del alcance de la invención. Aquellos experimentados en el arte reconocerán, o serán aptos de indagar, utilizando no más que experimentación de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en la presente. Se considera que tales equivalentes están dentro del alcance de esta invención y son cubiertas por las reivindicaciones.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicadoras del nivel de habilidad de aquellos experimentados en el arte con el cual la invención es concerniente. Todas las publicaciones y solicitudes de patente son incorporadas en la presente por referencia a la misma extensión como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada por referencia.
El uso de la palabra "un" o "uno", cuando son usadas en conjunción con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación pueden significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "por lo menos uno", y "uno o más que uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones es usado para dar a entender "y/o" a no ser que se indique explícitamente para referirse a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la revelación soporta una definición que se refiere a solamente alternativas y "y/o" . En toda esta solicitud, el término "aproximadamente" es usado para indicar que un valor incluye la variación de error inherente por el dispositivo, el método que es empleado para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Como se usan en esta especificación y reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tales como "comprende" y "que comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tales como "tener" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "incluye" e "incluir") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contiene" y "contener") son inclusivas o de extremos abiertos y no excluyen elementos o etapas de método adicionales no citados.
El término "o combinaciones de los mismos" como se usa en la presente, se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los ítems enlistados precedentes al término. Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos" pretende incluir por lo menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CEA, BCA, ACB, BAC, o CAB. Continuando con este ejemplo, expresamente incluidas están combinaciones que contienen repeticiones de uno o más ítems o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y así sucesivamente. El experimentado en el arte entenderá comúnmente que no hay ningún límite en cuanto al número de ítems o términos en cualquier combinación, a no ser que sea de otra manera evidente del contexto.
Todas las composiciones y/o métodos revelados y reivindicados en la presente pueden ser elaborados y ejecutados sin experimentación indebida a la luz de la presente revelación. En tanto que las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades preferidas, será evidente para aquellos de habilidad en el arte que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en la presente sin desviarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Todos de tales sustitutos y modificaciones similares evidentes para aquellos experimentados en el arte se considera que están' dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (62)

  1. REIVINDICACIONES Un método para incrementar la efectividad de presentación de antígeno por una célula que presenta antígeno, caracterizado porque comprende: aislar y purificar un anticuerpo específico de célula dendrítica (CD) o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos ; y poner en contacto la célula que presenta antígeno bajo condiciones en donde el complejo de anticuerpo-antígeno es procesado y presentado para reconocimiento de célula T.
  2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula que presenta antígeno comprende una célula dendrítica.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de Coherina/Dockerina .
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de Coherina/Dockerina y el antígeno de Gag diseñado es enlazado a la mitad complementaria del par de Coherina/Dockerina para formar un complejo.
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antigeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más nuevos sitios de glicosilacion.
  7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilacion que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada .
  8. 8.. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y antígeno de Gag.
  9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa.
  10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es humanizado.
  11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno es seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, MHC clase II, CDl, CD2 , CD3 , CD4 , CD8, CDllb, CD14, CD15 , CD16, CD19, CD20, CD29,. CD31, CD40, CD43 , CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83 , CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1, y ASPGR.
  13. 13. Un método para incrementar la efectividad de presentación de antígeno por una célula que presenta antígeno, caracterizado porque comprende: aislar y purificar un anticuerpo específico de células dendríticas o fragmentó del mismo al cual un antígeno de Nef diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno; y poner en contacto la célula que presenta antígeno bajo condiciones en donde el complejo de anticuerpo-antígeno es procesado y presentado para reconocimiento de célula T.
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la célula que presenta antígeno comprende una célula dendrítica.
  15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de' Coherina/Dockerina y el antígeno Nef diseñado es enlazado a la mitad complementaria del par de Coherina/Dockerina para formar un complejo.
  16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Nef .
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más sitios de glicosilación que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada .
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Nef.
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porgue el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa.
  20. 20. El método de conformidad con la, reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es humanizado.
  21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el complejo de anticuerpo-antígeno es seleccionado de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
  22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, HC Clase II, CD1, CD2, CD3 , CD4 , CD8, CDllb, CD14, CD15 , CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43 , CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83 , CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1, y ASPGR.
  23. 23. Una vacuna caracterizada porque comprende un anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos .
  24. 24. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porgue el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag.
  25. 25. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porgue el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más nuevos sitios de glicosilacion.
  26. 26. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilacion que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada .
  27. 27. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además, un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y antígeno de Gag.
  28. 28. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilacion seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa.
  29. 29. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es humanizado.
  30. 30. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el. complejo de anticuerpo-antígeno es seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, .14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
  31. 31. La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, MHC clase II, CDl, CD2 , CD3 , CD4, CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2 , ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1, y ASPGR.
  32. 32. Una vacuna caracterizada porgue comprende un anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo al cual un antígeno de Nef diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno , en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno .
  33. 33. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Nef .
  34. 34. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más nuevos sitios de glicosilacion.
  35. 35. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Nef que comprende uno o más sitios de glicosilación que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada .
  36. 36. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o · fragmento del mismo y el antígeno de Nef .
  37. 37. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa.
  38. 38. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es humanizado.
  39. 39. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno es seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
  40. 40. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el anticuerpo especifico de células dendríticas o fragmento del mismo es seleccionado de un anticuerpo que se enlaza específicamente a MHC clase I, MHC clase II, COI, CD2 , CD3 , CD4, CD8 , CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43 , CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTINA-1 , B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, LOX-1, y ASPGR.
  41. 41. Una vacuna caracterizada porque comprende: un anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el' antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos; y un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Nef diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de' codón que incrementan la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno, en dónde la vacuna es apta de producir una respuesta inmune de célula T VlH-específica a Gag pl7, Gag p24 y Nef.
  42. 42. La vacuna de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque los antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión.
  43. 43. La vacuna de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque los antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión separada por uno o más enlazadores flexibles .
  44. 44. La vacuna de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag o Nef.
  45. 45. La vacuna de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Gag que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa.
  46. 46. La vacuna de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es humanizado.
  47. 47. La vacuna de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la vacuna es seleccionada de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
  48. 48. Una vacuna caracterizada porque comprende: un anticuerpo específico de célula dendrítica o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos ; y un antígeno de Nef diseñado que es anexado al anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo o al antígeno de Gag diseñado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementan la secreción de complejo de anticuerpo-antígeno, en donde la vacuna es apta de producir una respuesta inmune de célula T VIH-específica a Gag pl7, Gag p24 y Nef.
  49. 49. La vacuna de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión.
  50. 50. La vacuna de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque los antígenos de Gag y Nef comprenden una proteína de fusión separada por uno o más enlazadores flexibles .
  51. 51. La vacuna de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque la prote na es seleccionada de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
  52. 52. Un método para incrementar la efectividad de células dendr ticas, caracterizado porque comprende: aislar células dendríticas del paciente; exponer las células dendríticas a cantidades activantes de una vacuna que comprende: un anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo al cual un antígeno de Gag diseñado es anexado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Gag es menos susceptible a degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos ; y un antígeno de Nef diseñado que es anexado al anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo o al antígeno de Gag diseñado para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Nef comprende una o más optimizaciones de uso de codón que incrementa la secreción del complejo de anticuerpo-antígeno, en donde la vacuna es apta de producir una respuesta inmune de célula T VIH-específica a Gag pl7, Gag p24 y Nef; y reintroducir las células dendríticas activadas cargadas de antígeno al paciente.
  53. 53. Una vacuna caracterizada porque comprende un anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo al cual un antígeno diseñado que comprende Ciclina Di o fragmentos del mismo anexados para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Ciclina DI es menos susceptible a degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos .
  54. 54. La vacuna de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Ciclina DI.
  55. 55. La vacuna de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además uno o más nuevos sitios de glicosilación.
  56. 56. La vacuna de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Ciclina Di que comprende uno o más sitios de glicosilación que proveen flexibilidad incrementada entre el anticuerpo y el antígeno, proteólisis disminuida en el enlazador y secreción incrementada.
  57. 57. La vacuna de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el complejo de anticuerpo-antígeno comprende además un enlazador flexible entre el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo y el antígeno de Ciclina Di que comprende uno o más sitios de glicosilación seleccionados de una secuencia de enlazador derivada de un organismo degradante de celulosa.
  58. 5.8. La vacuna de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es humanizado.
  59. 59. La vacuna de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo es enlazado a una mitad de un par de Coherina/Dockerina y el antígeno de Ciclina DI diseñado es enlazado a la mitad complementaria del par de Coherina/Dockerina para formar un complejo.
  60. 60. Un método para incrementar la efectividad de células dendríticas, caracterizado porque comprende: aislar células dendríticas del paciente; , ' , exponer las células dendríticas a cantidades activadoras de una vacuna que comprende: ' . un anticuerpo específico de células dendríticas o fragmento del mismo al cual un antígeno diseñado que comprende Ciclina Di o fragmentos de la misma anexados para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, en donde el antígeno de Ciclina Di es menos susceptible a degradación proteolítica mediante la eliminación de uno o más sitios proteolíticos; y reintroducir las células dendríticas activadas, cargadas de antígeno, al paciente.
  61. 61. Un ácido nucleico aislado y purificado, caracterizado porque codifica un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 ó 32.
  62. 62. Un polipéptido aislado y purificado, caracterizado porque es seleccionado de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
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