JP2003527435A - 免疫療法におけるｍｉａの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、炎症性疾患を予防するためのＭＩＡの使用、特に慢性的な関節軟骨破壊の治療におけるそれらの使用に関する。より具体的には、ＭＩＡは、慢性関節リウマチに罹患している患者におけるＭＩＡ抗原に対する特異的Ｔ細胞寛容を誘導するために使用されうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、炎症性疾患、より具体的には慢性関節リウマチの治療のための免疫
調整剤としての、ＭＩＡタンパク質又はその特定の誘導体の使用に関する。

【０００２】 免疫系の第一の機能的役割は、侵入してくる外来、即ち非自己の抗原を保持し
ている病原体から、個体を防御することである。この機能を安全かつ効率的に果
たすためには、外来抗原と、その個体自身の身体に由来する自己抗原とを識別す
るためのメカニズムが必要とされる。この自己−非自己識別の過程の失敗、即ち
自己抗原に対する免疫寛容の欠損は、自己抗原に対する免疫反応性をもたらし、
組織の損傷及び器官の機能の欠損を含む自己免疫疾患を引き起こしうる。

【０００３】 自己免疫疾患は、ヒトの保健医療における主要な問題である。１つの抗原又は
抗原性複合体に対する免疫学的過程の結果である自己免疫疾患もあるが、自己免
疫反応が、複数の器官に存在しうる多くの型の抗原を含んでいる場合もある。い
くつかの証拠系列が、免疫系が、自己免疫疾患の病原に関与していることを示し
ている。第一に、個体が自己免疫疾患を発症する確率は、遺伝的背景と密接に連
鎖しており、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識する応答性Ｔ細胞へと（自己）抗原
を提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子をコードする遺伝子
は、疾患感受性との強い遺伝連鎖を示す。第二に、単球／マクロファージ及びＴ
細胞のような免疫系の細胞は、標的の器官に浸潤する。第三に、自己免疫疾患を
有する患者のＴ細胞は、関与しているかもしれない自己抗原に応答してインビト
ロで増殖する。第四に、自己免疫の動物モデルにおける研究は、単球／マクロフ
ァージ及びＴ細胞のような免疫系の細胞が、疾患活性の誘導及び発現に関与して
いることを明確に証明している。

【０００４】 慢性関節リウマチ（ＲＡ）のような疾患は、自己免疫疾患の場合に起こりうる
免疫病理を例示しうる。ＲＡは、共通の臨床症候が、滑膜細胞の増殖、パンヌス
形成、軟骨分解、及び骨侵食を伴う持続性炎症性滑膜炎、並びに機能の欠損を引
き起こす最終的な関節変形である、慢性の多システム疾患として出現する。

【０００５】 ＲＡのような、免疫系が不要な望ましくない免疫応答を起こす自己免疫障害の
治療のための既存の療法は、不十分である。治療は、自己免疫疾患の、原因では
なく症状の軽減を焦点としている。自己免疫疾患の治療において使用されている
大部分の薬物、例えばステロイド及び非ステロイド性抗炎症化合物は、非特異的
であり、相当の有毒な副作用を有する。自己免疫疾患は、長期的な薬物投与を必
要とする慢性状態であるため、このことは特に問題である。

【０００６】 抗原特異的な無毒の免疫調整療法は、非特異的免疫抑制の極めて魅力的な代替
法である。この抗原特異的療法は、標的（自己）抗原、又は（自己）抗原由来の
合成Ｔ細胞反応性ペプチドによる、患者の治療を含む。これらの合成ペプチドは
、（自己）抗原のＴ細胞エピトープに相当し、それ自体及び（自己）抗原の両方
に対する特異的Ｔ細胞寛容を誘導するために使用されうる。標的（自己）抗原の
調節された投与は、免疫系の脱感作において極めて効果的であり得る。免疫系の
脱感作又は免疫寛容は、抗原又はエピトープを摂取又は吸入した動物は、該抗原
又はエピトープが全身経路を介して導入された場合、該抗原又はエピトープに対
する全身性免疫応答を発現する能力が低いという、古くより観察されている現象
に基づいている。

【０００７】 本発明において、黒色腫阻害活性（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＭＩＡ）と呼ばれるタンパク質が、免疫系の調整におい
て使用されうることが見出された。

【０００８】 ＭＩＡを含有する黒色腫細胞の分泌タンパク質画分は、Ｂｏｇｄａｈｎら（１
９８９，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：５３５８−５３６３）により最初に報告
された。精製されたＭＩＡは、Ｓ期の延長、及びＧ２コンパートメントにおける
停止により、黒色腫細胞増殖を阻害した。ＭＩＡタンパク質の精製及び部分アミ
ノ酸配列決定により、縮重オリゴヌクレオチドを使用して、ＭＩＡタンパク質を
コードするｃＤＮＡが同定された（Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５６９５−５７０１）。タンパク質は、１３１アミノ
酸の前駆体として翻訳され、それが、推定分泌シグナルペプチドの切断により、
成熟型の１０７アミノ酸のＭＩＡへとプロセシングされるようである。既知タン
パク質との相同性は見出されなかった。マウスの対応ＭＩＡ ｃＤＮＡが単離さ
れ、それは、ヒトタンパク質との８８％のアミノ酸同一性を有するタンパク質を
コードしていたため、高い進化上の保存が明らかとなった。ヒト黒色腫細胞系は
、１１ｋＤのＭＩＡタンパク質を培養培地へと分泌することが示された。黒色腫
細胞系ＨＴＺ−１９により分泌された、又は大腸菌において産生された精製ＭＩ
Ａタンパク質は、悪性黒色腫細胞及びいくつかの神経外胚葉の腫瘍に対して強力
な細胞増殖阻害剤として機能するようであった。増殖抑制特徴に基づき、ＭＩＡ
が抗腫瘍治療物質として魅力的であることが示唆された。Ｃｙｓ−１３０の隣に
Ｃ末端ヒスチジンタグを含有する精製ＭＩＡは、増殖阻害アッセイにおいて完全
に不活性であることが報告された。

【０００９】 Ｖａｎ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎら（１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６
２３７−６２４３）は、ＭＩＡ遺伝子発現が、非転移性黒色腫細胞系及び黒色腫
転移巣には検出されるが、高度に転移性の細胞系及び腫瘍前段階では検出されな
いことを示した。ヒトＭＩＡ遺伝子の構造は、Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆら（１９９
６，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：２６９１−２６９３）により報告さ
れ、そのプロモーターはヒト及びマウスの黒色腫細胞において特異的に高レベル
の遺伝子活性化を与え、その活性はホルボールエステル処理により増強され得た
。

【００１０】 タンパク質レベルにおいて、Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆら（１９９７，Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２０８：５１６−５２５；１９９９，Ａｎｔｉｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：２６９１−２６９３）は、悪性黒色腫患者における増
強されたＭＩＡの血清レベルが、疾患の後期と密接に関連していることを結論付
けた。

【００１１】 ウシ関節軟骨における遺伝子発現に対するレチノイン酸の効果を研究した、Ｄ
ｉｅｔｚ及びＳａｎｄｅｌｌ（１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３
３１１−３３１６）は、阻害されたＣＤ−ＲＡＰ遺伝子（軟骨由来レチノイン酸
感受性タンパク質）のｃＤＮＡをクローニングした。ＣＤ−ＲＡＰは、ヒトＭＩ
Ａのウシ対応物であると結論付けられた。

【００１２】 マウス及びラットの組織におけるインシトゥハイブリダイゼーション及び免疫
学的局在部位決定より、ＣＤ−ＲＡＰの正常な発現は軟骨に限定されていると結
論付けられた。ＣＤ−ＲＡＰ／ＭＩＡの発現は、軟骨形成と関連しているようで
あった。

【００１３】 最近、関節破壊と関連しているリウマチ病、例えば慢性関節リウマチの患者（
Ｍｕｌｌａｒ−Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３
８：１４８−１５４）及び競技後のマラソン走者（Ｎｅｉｄｈａｒｔ ｅｔ ａ
ｌ，１９９９，Ａｂｓｔｒａｃｔ １４１２，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌ．Ｒ
ｈｅｕｍａｔｏｌ．−第６３回Ａｎｎｕａｌ Ｓｃｉ．Ｍｅｅｔｉｎｇ）におい
ても、ＭＩＡの血清レベルが増強されていることが報告された。従って、増強さ
れたＭＩＡの血清レベルの存在と、関節組織損傷との間には診断的な関係が存在
するようである。

【００１４】 （例えば、ＲＡのような）（自己）免疫疾患における主要な問題は、免疫系が
有害反応する正確な標的又は抗原について不明な部分が大きいという点である。
それは、抗原特異的な疾病の調整が不可能であるかもしれないことを意味してい
る。

【００１５】 しかしながら、（自己）免疫応答における標的として関与している（１つ以上
の）抗原が不明なまま、抗原により推進される（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｒｉｖｅｎ
）無毒な型の免疫調整療法が利用可能であるとすれば、それは重要な利点であろ
う。そのような抗原推進型療法は、自己免疫過程において放出又は産生されると
予想される抗原の使用による、抗原特異的調整細胞の生成を含むであろう。その
ような抗原は、炎症又は組織破壊において利用可能となるであろう。自己免疫疾
患の場合には、局所的に産生された自己抗原が、そのような抗原により誘導され
る調整細胞を活性化、又は再活性化するはずである。

【００１６】 Ｔ細胞により媒介される軟骨破壊を治療するため、寛容誘導療法を効果的に使
用するためには、炎症過程を担当するＴ細胞を活性化する自己抗原に対して患者
を脱感作することができるＴ細胞反応性（ポリ）ペプチドを同定することが必要
である。

【００１７】 Ｔ細胞により媒介される軟骨破壊に罹患している患者において、好ましくは原
因軟骨抗原に対する全身性免疫寛容、より具体的には特異的Ｔ細胞寛容を誘導す
ることができる（ポリ）ペプチドを提供することが、本発明の目的である。ＭＩ
Ａは、前記の要件を満たし、効率的な寛容原として使用されうることが、本発明
において見出された。

【００１８】 本発明において、全身性免疫寛容の誘導とは、リンパ球が抗炎症性サイトカイ
ンを産生する状態を獲得するような、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原特異的
リンパ球の刺激と理解されるものとする。抗炎症性サイトカインとは、例えばＩ
Ｌ−４、ＩＬ−１０、及び／又はＴＧＦ−βでありうる。ＡＰＣにより寛容状態
にされたリンパ球は、身体の他の部位、例えば進展中の炎症部位に、抗炎症状態
を与えることができる。

【００１９】 免疫系は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球のような特異的細胞を活性化し、インタ
ーロイキン、抗体、及び補体因子のような可溶性因子を産生することにより、外
来抗原から個体を防御し、外来抗原への曝露に応答する。免疫系が応答する抗原
は抗原提示細胞（ＡＰＣ）により分解され、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ク
ラスＩＩ糖タンパク質と会合した抗原の断片が、細胞表面上に発現される。ＭＨ
Ｃ糖タンパク質−抗原断片複合体がＴ細胞へと提示され、それによって、そのＴ
細胞受容体が、結合しているＭＨＣクラスＩＩタンパク質と連帯で抗原断片を認
識する。Ｔ細胞が活性化され、即ち増殖し、かつ／又はインターロイキンを産生
するようになり、攻撃下の抗原に対して活性化されたリンパ球の増幅が引き起こ
される（Ｇｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６１：３８−４６，１９
８９）。

【００２０】 自己抗原も、連続的にプロセシングされ、ＭＨＣ糖タンパク質により抗原断片
としてＴ細胞へと提示される（Ｊａｒｄｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５３：３２６−３２９，１９９１）。従って、自己認識は免疫系に固有の
ものである。正常な状況では、免疫系は自己抗原に対して寛容であり、これらの
自己抗原による免疫応答の活性化は回避される。自己抗原に対する寛容が欠損し
た場合、免疫系は、１個以上の自己抗原に対して活性化されるようになり、自己
反応性Ｔ細胞の活性化が引き起こされ、時には自己抗体の産生も引き起こされる
。この現象が、自己免疫と呼ばれる。免疫応答は、一般に、破壊性、即ち侵入外
来抗原を破壊するため、自己免疫応答は身体の組織の破壊を引き起こしうる。

【００２１】 従って、ＭＩＡタンパク質の断片がＡＰＣにより発現されるであろうこと、従
って、ＭＩＡタンパク質の断片も免疫応答を惹起しうることは、明らかであろう
。ヒトＭＩＡタンパク質と類似の機能を有するか、又は少なくとも構造的に密接
に関係している他の種のタンパク質は、同一の寛容原性効果を達成する可能性が
ある。従って、免疫応答を惹起する相同ポリペプチド又はそのオルソログもしく
は一部も、本発明に含まれる。

【００２２】 配列、特に比較的小さいペプチドの配列に起こりうる変動は、全体配列の（１
個以上の）アミノ酸の違い、又は該配列内の（１個以上の）アミノ酸の欠失、置
換、挿入、逆位、もしくは付加により証明されうる。生物学的活性及び免疫学的
活性を本質的に改変させないと予想されるアミノ酸置換は、記載されている。関
連アミノ酸間のアミノ酸交換、又は進化において高頻度に起こっている交換は、
特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌであ
る（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕ
ｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ
．３）。この情報に基づき、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感
度なタンパク質比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５−１４４１，１９８５
）、及び相同ポリペプチド間の機能的類似性の決定の方法を開発した。

【００２３】 本発明に係るタンパク質は、配列番号１を含むポリペプチドを含むが、少なく
とも７０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の類似性を有するポリペ
プチドも含まれる。寛容原性効果を及ぼすことができるそのようなポリペプチド
の一部も、含まれる。そのような一部は、単独、例えば可溶型で機能性であるか
もしれないし、又はキメラポリペプチドを得るため、既知のバイオテクノロジー
的手段又は化学合成のいずれかにより他のポリペプチドと連結させられてもよい
。

【００２４】 本明細書において使用されるように、類似性という用語は、ＮＣＢＩ−ＢＬＡ
ＳＴ ２．０．１０［１９９９年８月２６日］（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈ
ｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃ
ｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂ
ｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）”Ｇａ
ｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏ
ｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０
２）に定義されているようなものである。プログラムは、デフォルト設定を使用
して、配列アラインメントを検索するために使用される。アミノ酸アラインメン
トには、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスがデフォルトとして使用され、類似性が
ポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）の数として示される。低い組成複雑度のフィ
ルタリングは含まれない。

【００２５】 ＭＩＡタンパク質又は相同ポリペプチドの断片とは、タンパク質の部分配列と
理解されたい。「部分配列」とは、「一部」と定義されると理解され、完全タン
パク質を包含すると誤解すべきではない。これらの部分配列は、以下の機能的特
徴を有する。ｉ）ペプチドは、疾患関連ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ−ＤＲＢ
１^＊０１０１、ＤＲＢ１^＊０４０１、ＤＲＢ１^＊０４０４、ＤＲＢ１^＊０４０８
、ＤＲＢ１^＊０４０５、ＤＱＢ^＊０３０１、又はＤＱＢ^＊０３０２と結合するこ
とができ、かつｉｉ）ペプチドは、ヒト、好ましくは自己免疫患者、より好まし
くはＲＡ患者におけるＴ細胞応答を惹起することができなければならない。その
ような応答は、例えばインビトロＴ細胞増殖アッセイ、又はＴ細胞サイトカイン
産生の検出のためのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＴ）（Ｃｏ
ｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８）に
おいて測定されうる。好ましくは、ペプチドは、ＭＩＡ（ポリ）ペプチドによる
免疫感作の際、前記のような関連ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子及びヒトＣＤ４に関
してトランスジェニックな動物においてＴ細胞により認識されなければならない
。

【００２６】 関連ＭＨＣ分子により認識されるエピトープを含んでいる限り、これらの部分
配列の長さは、重要でない。好ましくは、部分配列は、ＭＩＡの少なくとも９個
の連続アミノ酸を有する。好ましくは、これらのペプチドは、９〜５５アミノ酸
残基のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、ペプチドは、９〜３５、特に９
〜２５アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。はるかに好ましいのは、９〜１５
アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチドである。高度に好ましいのは、１
３又は１４アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチドである。最も好ましい
のは、配列番号１１又は配列番号１２を含むペプチドである。

【００２７】 本発明に係るペプチドの、例えば二量体又は三量体のような多量体も、本発明
の範囲に含まれる。本発明に係る多量体は、多数の同一ペプチドからなるホモマ
ー、又は異なるペプチドからなるヘテロマーのいずれかでありうる。

【００２８】 （ポリ）ペプチドが、ペプチドの片側又は両側で延長させられた場合にも、同
一の免疫学的機能を発揮しうることが、当業者には明らかであろう。延長部分は
、タンパク質の天然の配列と類似したアミノ酸配列でありうる。しかしながら、
（ポリ）ペプチドは、非天然配列により延長させられてもよい。従って、ＭＩＡ
、及び抗炎症機能を有するその断片は、非天然配列によりいずれかの部位で延長
させられうる。従って、例えば、配列番号１１又は配列番号１２を含むポリペプ
チドは、本発明の一部である。これらのペプチドの長さは、好ましくは前記の通
りである。（ポリ）ペプチドが、本発明に係る免疫学的機能を達成するのであれ
ば、その元々の機能を発揮する必要はなく、従って不活性であってもよい。本発
明に係る（ポリ）ペプチドは、結合溝がペプチドにより占拠されるよう、ＭＨＣ ＩＩ分子と接合されうる。好ましくはやはりアミノ酸配列からなる、可動性リ
ンカー分子によって、ペプチドを接合させてもよい。ＭＨＣ分子は、定常ドメイ
ンを保有していなくてもよく、相互に直接接合しているか、又は可動性リンカー
によって接合している可変ドメインのみからなっていてもよい。そのような複合
体の利点は、可溶型で存在することができ、Ｔ細胞により直接認識されうるとい
う点である。

【００２９】 従って、本発明に係るポリペプチドは、炎症性疾患を予防するための医薬品の
調製において使用されうる。

【００３０】 抗原上に存在するＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープと類似している（
ポリ）ペプチド（ＭＩＡポリペプチド、又はこれらのエピトープを含むその断片
を含む）は、例えば関節炎、より具体的には慢性関節リウマチのような、Ｔ細胞
により媒介される軟骨破壊に罹患している哺乳動物、より具体的にはヒトにおけ
る、該抗原に対する全身性免疫寛容を誘導するための療法において使用するのに
極めて適している。

【００３１】 より具体的には、ポリペプチドは、炎症性疾患、好ましくは免疫細胞により媒
介される軟骨破壊に罹患している患者における、特異的Ｔ細胞寛容を誘導するた
めの医薬品の調製において使用されうる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である
。最も好ましい疾患は、関節炎、より好ましくは慢性関節リウマチである。炎症
性疾患に罹患している患者を治療する治療的処置に加え、ＭＩＡ及びその断片は
、炎症性疾患に対する感受性を有する患者における予防的処置においても、使用
されうる。

【００３２】 本発明に係るペプチドによる自己免疫障害の治療は、無関係ではあるが共局在
している抗原に対して、全身性免疫寛容が誘導されるという事実を利用する。制
御細胞が、抗原特異的に、免疫応答を下方調整しうるサイトカインのような多面
性タンパク質を分泌する。

【００３３】 場合によっては、そのような処置は、ＤＭＡＲＤ（疾患修飾抗リウマチ薬（Ｄ
ｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉ−Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｒｕｇ
ｓ）、例えばスルファサラジン、抗マラリア薬（クロロキン、ヒドロキシクロロ
キン）、注射用又は経口用の金、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチ
オプリン、シクロスポリン、ミコフェノラート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）
）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）、副腎皮質ステロイド、又は自己免
疫患者における疾患の経過に影響を与えることが既知のその他の薬物のような他
の薬剤の投与と組み合わせられ得る。

【００３４】 本発明に係るポリペプチドは、該抗原、即ちＭＩＡポリペプチド、即ち配列番
号１のポリペプチドを含むタンパク質又はその一部とは異なる抗原と反応性であ
るが、抗原と同一の組織に存在するリンパ球を調整するためにも使用されうる。
抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導により、自己免疫障害は、全身性免疫寛容により治
療されうる。より一般的には、調整すべき細胞は、造血細胞である。一般に、寛
容原として機能するためには、ペプチドは、免疫調整能を保有しており、かつ通
常比較的大きいタンパク質の一部として局所的に発現される、という少なくとも
２つの条件を満たさねばならない。

【００３５】 本発明に係るポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により調製されうる。本発明
に係るタンパク質、ペプチド、該ペプチドの多量体、又はキメラペプチドをコー
ドする核酸配列は、発現ベクターへ挿入される。適当な発現ベクターは、複製及
び発現に必要な調節領域を含む。発現ベクターは、宿主細胞における発現をもら
たしうる。適当な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母細胞、及び哺乳動物細胞であ
る。そのような技術は、当分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照
のこと。

【００３６】 本発明に係る（ポリ）ペプチドは、例えば、例えばＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）及びＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０）に記載されている固相ペ
プチド合成のような、ペプチド合成のための周知の有機化学的方法によっても調
製されうる。

【００３７】 （ポリ）ペプチドは、エキソペプチダーゼにより触媒される加水分解を減少さ
せるであろうＣ及び／又はＮ末端の修飾により安定化させられうる。修飾には、
Ｃ末端アシル化（例えば、アセチル化＝Ａｃ−ペプチド）、Ｎ末端アミド導入（
例えば、ペプチド−ＮＨ_２）、アシル化とアミド導入との組み合わせ（例えば、
Ａｃ−ペプチド−ＮＨ_２）、Ｌアミノ酸の代わりのＤアミノ酸の導入（Ｐｏｗｅ
ｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８１：７３１−７３５，１９
９２）が含まれうる。

【００３８】 その他の修飾は、エンドペプチダーゼによる加水分解の防止を焦点とする。こ
れらの修飾の例は、Ｌアミノ酸の代わりのＤアミノ酸の導入、修飾されたアミノ
酸、ペプチド内の環化、修飾されたペプチド結合、例えば還元型ペプチド結合ψ
［ＣＨ_２ＮＨ］の導入、及び例えばペプトイド（Ｎ−アルキル化グリシン誘導体
）（Ａｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂ
ａｓ，１１３：６３−７８，１９９４及びＳｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９３６７−９３７１，１９９２
）である。

【００３９】 本発明は、本発明に係る（ポリ）ペプチドを含む医薬調製物の投与により、炎
症性自己免疫疾患に罹患しているか罹患しやすい患者を治療する方法を提供する
。（ポリ）ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞により認識され、それを刺激すること
ができるＴ細胞エピトープを含む。これらのＴ細胞は、例えば炎症性障害に罹患
している患者の血中に見出されうる。そのような患者は、グレーヴス病、若年性
関節炎、原発性糸球体腎炎、多発性関節炎、変形性関節症、シェーグレン症候群
、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、アディソン病、原発性胆管硬化症、ブドウ
膜炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、又は糖尿病のよ
うな疾患に罹患している患者でありうる。

【００４０】 従って、本発明によると、ＭＩＡ及び／又は抗炎症効果を有するであろうその
断片を、薬学的に許容される単体と共に含む組成物を投与することにより、炎症
性疾患に罹患しているか罹患しやすい哺乳動物が、治療されうる。好ましくは、
ＭＩＡ及び／又は全身性免疫寛容を誘導するであろうその断片を含む組成物が、
全身性免疫寛容が誘導される量、投与される。より好ましくは、Ｔ細胞特異的寛
容が誘導される量が、投与される。炎症性疾患は、好ましくは、免疫細胞により
媒介される軟骨破壊疾患、より好ましくは関節炎、さらに好ましくは慢性関節リ
ウマチである。

【００４１】 前記の組成物は、ＭＩＡの少なくとも９個の連続アミノ酸を有するＭＩＡの部
分配列を含むペプチドを含んでいてもよい。好ましくは、組成物は、配列番号１
１又は配列番号１２を含むペプチドを含む。さらに好ましくは、ペプチドは、配
列番号１１又は１２からなる。従って、これらのペプチドは、治療物質として使
用されうる。従って、これらのペプチドは、前記のような炎症性疾患に対する医
薬組成物の製造のためにも使用されうる。

【００４２】 本発明に係る医薬組成物の投与は、攻撃下の関節軟骨中の自己抗原性タンパク
質、及び本発明に係るペプチド１個以上のアミノ酸配列により特徴付けられるか
、又は類似している、同定されたＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを示す
他の自己抗原に対する、これらの患者の全身性免疫寛容、特に特異的自己反応性
Ｔ細胞の寛容を誘導するであろう。従って、誘導された寛容は、攻撃下の関節軟
骨における局所的炎症応答の減少をもたらすであろう。

【００４３】 本発明に係る（ポリ）ペプチドは、免疫抑制薬の非特異的抑制効果と比較して
、自己反応性Ｔ細胞に対する特異的な効果を有しており、従って免疫系の他の成
分には影響しないという利点を有する。

【００４４】 全身性免疫寛容は、本発明に係るペプチドを、高用量又は低用量、投与するこ
とにより獲得されうる。ペプチドの量は、投与経路、投与時間、患者の年齢、並
びに一般的な健康状態及び食事に依存するであろう。

【００４５】 一般的に、体重１ｋｇ当たり０．０１から１００００μｇ、好ましくは０．０
５から５００μｇ、より好ましくは０．１から１００μｇのペプチドが使用され
うる。

【００４６】 薬学的に許容される担体は、当業者に周知であり、例えば、無菌生理食塩水、
ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペク
チン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、及び水を含む。その他の担体は、例えば
、所望によりリポソームに封入されていてもよい、ＭＨＣクラスＩＩ分子であり
うる。

【００４７】 さらに、本発明に係る医薬組成物は、１個以上のアジュバントを含みうる。適
当なアジュバントは、特に、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アンフ
ィゲン（ａｍｐｈｉｇｅｎ）、トコフェノール（ｔｏｃｏｐｈｅｎｏｌｓ）、モ
ノホスフェニル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｅｎｙｌ）リピドＡ、ムラミルジペプチ
ド、及びＱｕｉｌｌ Ａのようなサポニンを含む。好ましくは、本発明に係る寛
容療法において使用されるアジュバントは、粘膜上皮と結合する、コレラ毒素Ｂ
サブユニット又はカルボマー（ｃａｒｂｏｍｅｒｓ）のような粘膜アジュバント
（ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）である。アジュバントの量は、アジュ
バント自体の性質による。

【００４８】 さらに、本発明に係る医薬組成物は、例えば、ソルビトール、マンニトール、
デンプン、スクロースデキストリン（ｓｕｃｒｏｓｅｄｅｘｔｒｉｎ）、及びグ
ルコースを含む炭水化物、アルブミン又はカゼインのようなタンパク質、並びに
アルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤のような安定化剤を１個以上含んでいても
よい。

【００４９】 適当な投与経路は、例えば、筋肉内注射、皮下注射、静脈注射、又は腹腔内注
射、経口投与、及びスプレーのような鼻腔内投与である。鼻腔内投与が好ましい
。

【００５０】 （ポリ）ペプチドの（自己）免疫応答調整能の試験には、マウスにおけるコラ
ーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、ラットにおけるアジュバント関節炎、マウスにお
ける実験的アレルギー性脳脊髄炎、及びマウスにおける非肥満性糖尿病（ＮＯＤ
）のような、いくつかのネズミモデルが適していることが示されている。抗原は
、そのようなモデルにおいて、静脈内に、腹腔内に、経口的に、又は鼻腔内に投
与されうる（Ｌｉｂｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８
：５９９−６０３，１９９７による概説）。これらのモデルにおける読み出しを
容易にするためには、信頼区間を増加させることが重要である。本発明により、
関節炎モデルにおける罹患率及び臨床スコアは、最初の関節炎誘発因子、例えば
ＣＩＡにおけるコラーゲンＩＩ型を、細胞外マトリックスタンパク質アグリカン
に由来するペプチドと組み合わせることにより改善されうることが見出された。
このペプチドは、好ましくは、最初の誘発因子と同時に投与されるが、別々の投
与も可能である。

【００５１】 以下の実施例は、本発明を例示するものであり、決して本発明の範囲を制限す
るものとは解釈すべきでない。

【００５２】 （図面の簡単な説明） 図１は、ｐＮＧＶ１−ＭＩＡ（Ｈｉｓ_７）ＤＮＡ構築物の概略図である。ＭＩ
Ａ（Ｈｉｓ_７）コーディング配列は、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサー
／開始点の後ろにＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングされた。

【００５３】 図２は、ＤＢＡ／１マウス（ｎ＝１５／群）におけるコラーゲンＩＩ型誘導関
節炎の臨床的徴候の発症率を示す図である。モニタリングには、各動物の四肢全
てが含まれた（基準については、図３の説明を参照のこと）。関節炎誘導後２０
日目、２５日目、及び３０日目に、ＭＩＡ３０μｇ（黒四角）又は生理食塩水（
黒丸）の鼻腔内投与により、動物を処理した。両側カイ二乗統計検定（生理食塩
水処理対照群と比較）は、Ｐ＝０．０２０（^＊）を示した。

【００５４】 図３は、ＤＢＡ／１マウスにおける関節炎誘導後２０日目、２５日目、及び３
０日目の、ＭＩＡ３０μｇ（黒四角）又は生理食塩水（黒丸）の鼻腔内投与の後
の、コラーゲンＩＩ型誘導関節炎の進展を示す図である。モニタリングには各動
物の四肢全てが含まれ、Ｊｏｏｓｔｅｎら（１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１５９：４０９４−４１０２）による記載された基準：スコア０．５（有意な変
化）；スコア１．０（中程度の変化）；スコア１．５（顕著な変化）；スコア２
．０（最大の腫脹、発赤、及び強直を伴う重度の関節炎）に従った。データは、
各マウス群（ｎ＝１５）についての平均スコアを表している。疾患発症の重度は
、ＭＩＡ処理動物において、大きく抑制された。９５％信頼レベルを用いた両側
マンホイトニー統計検定（生理食塩水処理対照群と比較）は、Ｐ＜０．０５（^＊ ）、即ち２８日目におけるＰ＝０．０３１６、３０日目におけるＰ＝０．０３７
７、及び３５日目におけるＰ＝０．０２６８を示した。３３日目においては、Ｐ
＝０．０５４５（^＊＊）であった。

【００５５】 図４は、ＭＩＡの鼻腔内適用が、コラーゲンＩＩ型関節炎における関節破壊か
ら防御することを示す図である。Ｘ線撮影（Ｘ線画像化）は、実験の最後（３５
日目）に、個々のマウスの後肢に対して実施された（ｎ＝１５ ＤＢＡ／１マウ
ス／群）。Ｘ線写真は、低倍率の立体顕微鏡を使用してスコア化された。以下の
指針に従い、０から５のスコアが各肢に与えられた。スコア０：変化なし；スコ
ア１：微小の変化；スコア２：中程度の変化；スコア３：顕著な変化；スコア４
：重度の変化；スコア５：多数の動物において外見的にも可視であった重度の関
節炎を反映する完全な破壊。データは、生理食塩水処理マウス（白バー）及びＭ
ＩＡ処理マウス（黒バー、３０μｇ用量）についての平均値＋／−ＳＥＭを表し
ている。９５％信頼レベルを用いた両側マンホイトニー統計検定を使用したデー
タの統計学的比較は、Ｐ＜０．００６５（^＊）を示した。

【００５６】 図５は、ＲＡ軟骨におけるＭＩＡ遺伝子発現の検出を示す図である。ＲＡ患者
５人の関節膝軟骨に由来するｃＤＮＡに対し、ＭＩＡ特異的オリゴヌクレオチド
（レーン２〜６）又はＧＡＰＤＨ特異的オリゴヌクレオチド（レーン８〜１２）
を用いたＲＴ−ＰＣＲを実施した。各ＰＣＲ反応物５μｌを、断片長マーカーと
しての１００ｂｐラダー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（レーン７）と共に、アガロー
スゲルで分離した。レーン７の中央のブロードなバンドは、６００ｂｐマーカー
断片を表している。ＭＩＡ特異的オリゴヌクレオチド及びＧＡＰＤＨ特異的オリ
ゴヌクレオチドを使用した、鋳型ｃＤＮＡなしのＲＴ−ＰＣＲ対照反応は、それ
ぞれレーン１及び１３に示されている。

【００５７】 図６は、ＤＢＡ／１マウス（ｎ＝１５／群）におけるコラーゲンＩＩ型誘導関
節炎の臨床的徴候の発症率を示す図である。モニタリングには、各動物の四肢全
てが含まれた（基準については、図７の説明を参照のこと）。関節炎誘導後２０
日目、２５日目、及び３０日目に、ＭＩＡペプチド１０μｇ（黒三角）、ＭＩＡ
ペプチド３０μｇ（黒四角）、又は生理食塩水（黒丸）の鼻腔内投与により、動
物を処理した。両側フィッシャー統計検定（生理食塩水処理対照群と比較）は、
Ｐ＜０．０５（^＊）、即ち３０日目におけるＰ＝０．０４２、及び３３日目にお
けるＰ＝０．０１４を示した。両側カイ二乗統計検定は、３７日目におけるＰ＝
０．０４０を示した。

【００５８】 図７は、関節炎誘導後２０日目、２５日目、及び３０日目の、ＭＩＡペプチド
１０μｇ（黒三角）、ＭＩＡペプチド３０μｇ（黒四角）、又は生理食塩水（黒
丸）の鼻腔内投与の後の、コラーゲンＩＩ型誘導関節炎の進展を示す図である。
モニタリングは、各動物の四肢全てを含み、Ｊｏｏｓｔｅｎら（１９９７，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：４０９４−４１０２）により記載された基準：スコ
ア０．５（有意な変化）；スコア１．０（中程度の変化）；スコア１．５（顕著
な変化）；スコア２．０（最大の腫脹、発赤、及び強直を伴う重度の関節炎）に
従った。データは、各マウス群（ｎ＝１５ ＤＢＡ／１マウス／群）についての
平均スコアを表している。疾患発症の重度は、ＭＩＡペプチド１０μｇ処理動物
において、大きく抑制される。９５％信頼レベルを用いた両側マンホイトニー統
計検定（生理食塩水処理対照群と比較）は、３３日目におけるＰ＝０．０３８８
（^＊）、及び３７日目におけるＰ＝０．０５７４（^＊＊）を示した。片側検定に
おいては、３７日目にＰ＝０．０２８７（^＊＊）であった。

【００５９】 図８は、ＤＢＡ／１マウスにおける、関節炎誘導後２０日目、２５日目、及び
３０日目の、ＭＩＡペプチド１０μｇ（黒三角）、ＭＩＡペプチド３０μｇ（黒
四角）、又は生理食塩水（黒丸）の鼻腔内投与の後の、コラーゲンＩＩ型誘導関
節炎における個々の関節炎スコアを示す図である。モニタリングには、各動物の
四肢全てが含まれた（基準については、図７の説明を参照のこと）。各処理群に
ついて、３７日目の実験終了時の各マウスの個々の関節炎スコアの中央値が示さ
れている。９５％信頼レベルを用いた両側マンホイトニー検定を使用した統計分
析（生理食塩水処理対照群と比較）は、毎回１０μｇのＭＩＡで処理された群に
ついて、両側検定においてはＰ＝０．０５７４、片側検定においてはＰ＝０．０
２８７（^＊＊）を示した。

【００６０】 図９は、ＭＩＡペプチドの鼻腔内適用が、コラーゲンＩＩ型関節炎における関
節破壊を防御することを示す図である。実験終了時（３７日目）に、Ｘ線撮影（
Ｘ線画像化）を、個々のマウスの後肢に対して実施した（ｎ＝１５／群のＤＢＡ
／１マウス）。低倍率の立体顕微鏡を使用してＸ線写真をスコア化した。以下の
指針に従い、各肢に０〜５のスコアを与えた。スコア０：変化なし；スコア１：
微小の変化；スコア２：中程度の変化；スコア３：顕著な変化；スコア４：重度
の変化；スコア５：多数の動物において外見的にも可視であった重度の関節炎を
反映する完全な破壊。データは、生理食塩水処理マウス（白バー）及びＭＩＡ処
理マウス（黒バー；１０μｇ用量、斜線付きバー：３０μｇ用量）についての平
均＋／−ＳＥＭを表している。９５％信頼レベルを用いた両側マンホイトニー検
定を使用したデータの統計学的比較は、Ｐ＝０．００１０（^＊）を示した。

【００６１】 図１０は、ＤＢＡ／１マウスにおけるチャレンジ後２４時間目（黒バー）及び
４８時間目（白バー）におけるＤＴＨ応答を示す図である。マウスを、ＭＩＡ（
右の２セットのバー）又はＤＴＨ誘導における陽性対照としてのオボアルブミン
（左の２セットのバー）により免疫感作し、チャレンジした。免疫感作の５日前
、１０日前、及び１５日前に、ＭＩＡ３０μｇ、オボアルブミン３０μｇ（陽性
処理対照）、又は生理食塩水（陰性処理対照）の鼻腔内投与により、マウスを処
理した。データは、抗原特異的な肢腫脹の平均＋／−ＳＥＭを表している。９５
％信頼レベルを用いた片側マンホイトニー検定を使用した、タンパク質処理群（
ＭＩＡ又はオボアルブミン、鼻腔内）の２４ｈデータと、対応する生理食塩水処
理対照との統計学的比較は、Ｐ＜０．０５（^＊）を示した。

【００６２】 図１１は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるチャレンジ後２４時間目（黒バー）及
び４８時間目（白バー）におけるＤＴＨ応答を示す図である。マウスを、ＭＩＡ
（右の２セットのバー）又はＤＴＨ誘導における陽性対照としてのオボアルブミ
ン（左の２セットのバー）により免疫感作し、チャレンジした。免疫感作の５日
前、１０日前、及び１５日前に、ＭＩＡ３０μｇ、オボアルブミン３０μｇ（陽
性処理対照）、又は生理食塩水（陰性処理対照）の鼻腔内投与により、マウスを
処理した。データは、抗原特異的な肢腫脹の平均＋／−ＳＥＭを表している。９
５％信頼レベルを用いた片側マンホイトニー検定を使用した、タンパク質処理群
（ＭＩＡ又はオボアルブミン、鼻腔内）と、対応する生理食塩水処理対照との統
計学的比較は、Ｐ＜０．０５（^＊）を示した。

【００６３】 図１２は、ＲＡ患者（白バー、ドナー１から５）又は健常ドナー（黒バー、ド
ナー６から１０）のヒトリンパ球を用いたＴ細胞増殖を示す図である。細胞を、
プレートと結合した抗ＣＤ３抗体０．２μｇと共に培養した。３日後、０．１μ
Ｃｉ ^３Ｈチミジンを添加し、細胞を１８時間インキュベートした。細胞増殖の
尺度としての^３Ｈチミジン取り込みを、ガスシンチレーションにより決定した。
データは、平均刺激指数を表している。

【００６４】 図１３は、ＲＡ患者（白バー、ドナー１から５）又は健常ドナー（黒バー、ド
ナー６から１０）のヒトリンパ球を用いたＴ細胞増殖を示す図である。細胞を、
ＭＩＡ０．５μｇと共に培養した。６日後、０．１μＣｉ ^３Ｈチミジンを添加
し、細胞を１８時間インキュベートした。細胞増殖の尺度としての^３Ｈチミジン
取り込みを、ガスシンチレーションにより決定した。データは、平均刺激指数を
表している。

【００６５】 実施例 実施例１ ＤＮＡクローニング及び組換えＭＩＡ（ｈｉｓ７）の作製／精製 ｃＤＮＡクローニング １０％ウシ胎仔血清の存在下で、ＤＭＥＭ／Ｈａｍｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）
培地中で、ヒト黒色腫細胞を用いて、標準的な培養を実施した。ＲＮＡ単離の前
に、培養された単層細胞を、氷冷ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄した。ＲＮＡをＲＮＡ
ｚｏｌＢ（Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて単離した。第一鎖ｃ
ＤＮＡ合成は、およそ４μｇの全ＲＮＡに対して、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ
（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）及びランダム６マープライマーを用いて実施した。ＧＭ
Ｍ３細胞由来のｃＤＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによるＭＩＡ ｃＤＮＡクローニ
ングのため、２つのオリゴヌクレオチドを設計した。センスプライマー（５’Ａ
ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣ
ＣＴＴ３’）（配列番号４）及びアンチセンスプライマー（５’ＡＴＡＴＧＧＡ
ＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＡＧＡ
ＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＴＣ３’）（配列番号５）。センスプライマーは、Ｋｏ
ｚａｋ（１９９９，Ｇｅｎｅ ２３４：１８７−２０８）に従い最適化された翻
訳開始領域を含有しており、アンチセンスプライマーは、最適化された翻訳終止
コドン（ＭｃＣａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：５４３１−５４３５）；イタリック体）及び
ＭＩＡのＣｙｓ−１３０に続く７個のＨｉｓコドン（Ｂｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ
．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：５６９５−５７０１）を含有して
いた。ＰＣＲは、４００ｎｇ／プライマー、２００μＭ ｄＮＴＰ、及び１ｕ
Ｔａｑポリメラーゼを全容量１００μｌで用いて、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ９
６００で、９４℃５分を１サイクル、９４℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃１分
を３５サイクル、７２℃５分を１サイクル、実施された。ＰＣＲ増幅産物をアガ
ロースゲルから単離し、ベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとク
ローニングした。ＭＩＡ−ｐＣＲ２．１クローン２のｃＤＮＡ挿入物を二方向に
配列決定した（配列番号２）。真核生物発現ベクターｐＮＧＶ１（ＥＭＢＬ登録
番号Ｘ９９２７４）へのｃＤＮＡのサブクローニングのため、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢａｍＨＩによりＭＩＡ−ｐＣＲ２．１クローン２からＭＩＡ ｃＤＮＡ
を消化し、ｐＮＧＶ１のＳＶ４０初期プロモーターの後ろへとライゲートさせ、
ｐＮＧＶ１−ＭＩＡ（Ｈｉｓ７）クローン１（図１）を得た。プラスミドは、最
後のアミノ酸Ｑが（Ｈｉｓ）_７に交換された配列番号１の配列を有するタンパク
質をコードする。

【００６６】 ｐＮＧＶ１−ＭＩＡ（Ｈｉｓ７）ＤＮＡによるＣＨＯ細胞のトランスフェクシ
ョン ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）を、５％ＦＣＳ（Ｈａｒｌａｎ ｓｅｒａ
ｌａｂ）を含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍｍ’ｓ Ｆ１２中で培養した。Ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、並びに５％ＦＣＳ及び０．８ｍｇ／ｍｌネ
オマイシン（Ｇ４１８スルフェート、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、０．２２μＭ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＶ０２５ＢＳフィル
ターを使用してフィルター滅菌）を含有する選択培地ＤＭＥＭ／Ｈａｍｍ’ｓ
Ｆ１２を使用して、ｐＮＧＶ１−ＭＩＡ（Ｈｉｓ７）構築物をＣＨＯ−Ｋ１へと
トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、細胞プールとして、Ｄ
ＭＥＭ Ｆ１２、１０％ＦＣＳ、１０％ＤＭＳＯ中で、−１４０℃で凍結させた
。これらのストックを、解凍させ、Ｔ２５ ｒｏｕｘフラスコで、ＤＭＥＭ Ｆ
１２、５％ＦＣＳ＋０．８ｍｇ／ｍｌネオマイシン中で培養した。３日後、９６
穴プレートに１ウェル当たり２０個、１０個、及び５個の細胞を播くことにより
、単一細胞クローニングを実施した。クローンを視覚的検査により選択した。ク
ローニングから２週間後、クローンを６穴プレートに移し、９０％コンフルエン
スにまで増殖させた。次に、細胞を無血清培地（０．８ｍｇ／ｍｌネオマイシン
を含有）中で一夜培養し、発現を１日継続させた。９６穴ドットブロット（下記
参照）を使用して、ＭＩＡ−Ｈｉｓ７発現を検出した。産生量の最も多いトラン
スフェクタントをスケールアップし、アンプル中で−１４０℃で凍結させた。無
血清培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くウェスタンブロッティング及び
その後の抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体（Ｄｉａｎｏｖａ ＧＭＢＨ、カタログ
番号Ｄｉａ９００、ロット番号１００６９６、１０００倍希釈）を用いた検出に
より分析した。ブロッキング及び抗体インキュベーションは、ドットブロット法
についての記載のようにして実施された。

【００６７】 ドットブロットを使用したＭＩＡ−Ｈｉｓ７の検出 ＣＨＯ．ｐＮＧＶ１．ＭＩＡ（Ｈｉｓ７）クローニングの条件培地から採取さ
れた試料を、真空ドットブロット装置（Ｈｙｂｒｉ．ＤＯＴ、ＢＲＬ、Ｔｈｅ
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、ニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏｒ
ａｄ ０．４５μＭ、ロット番号９４７３）上へ滴下した。ドットブロットをＡ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ液体ブロック緩衝液（ＥＣＦ緩衝液
で１０倍希釈；０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．３Ｍ ＮａＣｌ）
と共に３０分間インキュベートした。次に、ドットブロットを、ＰＢＳＴで希釈
された０．２μｇ／ｍｌマウス抗（ｈｉｓ６）タグ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧＭＢＨ
、カタログ番号Ｄｉａ９００、ロット番号１００６９６）と共に室温でインキュ
ベートした。ＰＢＳＴで室温で５分間３回洗浄した後、ドットブロットを、２５
０ｎｇ／ｍｌ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号３６２４
５１２）と共にＲＴで２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで室温で５分間３回
洗浄した後、製造業者の指示に従い、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｌｉｆｅ ｓ
ｃｉｅｎｃｅバッチ９６）を使用して検出を実施した。

【００６８】 ドットブロット検出により、トランスフェクタント１８、３２、及び３７の細
胞２．１０４個／ｍｌ当たりの発現量が最も多いことが示された。従って、これ
らのクローンをさらなる分析のため選択した。スピナ（ｓｐｉｎｎｅｒｓ）にお
けるパイロット安定性研究を実施した。

【００６９】 撹拌培養におけるＭＩＡ−Ｈｉｓ７トランスフェクタントの安定性研究 トランスフェクタント１８、３２、及び３７の細胞を、Ｔ１７５ Ｒｏｕｘフ
ラスコ内で１００％コンフルエンスにまで培養した。２５０ｍｌの修飾ＤＭＥＭ Ｆ１２、５％ＦＣＳ、及び２５０ｍｇの担体を含有するスピナ（ｃｕｌｔｉｓ
ｐｈｅｒｅＳ、Ｐ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ ＡＢ、Ａｒｔ．ＤＧ−２００１−ＺＺ
）をデュプロ（ｄｕｐｌｏ）に播いた。ＦＣＳを段階的に減少させ、最終的にＤ
ＭＥＭ Ｆ１２＋０．５μｇ／ｌインスリン及び５ｍｇ／ｌトランスフェリンと
交換した。少なくとも４週間、最後の培地を２又は３日毎に交換し、ＭＩＡ−Ｈ
ｉｓ７の発現をウェスタンブロットにより分析した。全てのスピナの上清を収集
し、後の使用のため−２０℃で保存した。これらのクローンの安定性を３４〜３
９日間かけて試験した。毎回、培地を新たなものと交換し、試料を採取し、Ａｍ
ｉｃｏｎ微量濃縮器（カットオフ１０ｋＤａ、番号４２４０７０）を使用して５
倍に濃縮し、ウェスタンブロット法を使用してＭＩＡ（Ｈｉｓ７）について試験
した。３４〜３９日後、６つのスピナ全てが依然としてＭＩＡ−Ｈｉｓ７タンパ
ク質を発現していた。ウェスタンブロット上では、最後の試料のバンドが、最初
の試料と同じ強度を有していた。従って、この分析によると、トランスフェクタ
ントはＭＩＡ（Ｈｉｓ７）の産生に関して安定であった。ＣＨＯ−Ｋ１−ｐＮＧ
Ｖ１．ＭＩＡ（Ｈｉｓ７）クローン１８を、５Ｌ発酵槽における作製のため選択
した。発酵槽の収穫培地は、ＤＭＥＭ Ｆ１２＋０．５μｇ／ｌインスリン及び
５ｍｇ／ｌトランスフェリンを含有していた。発酵槽からの収穫培地は、３μｍ
、０．８μｍ、．２２μｍと段階的に濾過され、プラスチックバッグに４℃で収
集された。

【００７０】 ＣＨＯ−Ｋ１条件培地からのＭＩＡ（Ｈｉｓ７）タンパク質の精製 発酵槽培養からの条件培地、約１２ｌを、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．
０で緩衝し、１２ｍｌ／分の流速（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈピスト
ンポンプＰ９０００）でＳＰ−セファロースＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＸＬ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号１７−５０７６−０１）カラム（
ＸＫ５０、３００ｍｌ）へと担荷させた。この過程を、ＵＶ検出器（Ｍｏｎｉｔ
ｏｒ ＵＶ−９００ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してモニタ
リングした。２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０に
よる洗浄工程を１回実施した。カラムと結合したＭＩＡ（Ｈｉｓ７）を２０ｍＭ
リン酸ナトリウム、０．４０Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０で溶出させ、５０ｍｌ毎
の画分に収集した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ ｆｒａｃ−９００）
。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより分析した。ＭＩ
Ａ−Ｈｉｓ７を含有する画分をプールし、ゲル濾過カラムへ供した。２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム、０．４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０でのゲル濾過カラム（ＸＫ２
６／７０ ３００ｍｌＳｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈコード番号１７−１０４４−０１）の平衡化の後、ＳＰ−セファロースプー
ルを６ｍｌずつカラムへアプライした。タンパク質を２．０ｍｌ／分の流速で溶
出させた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより分析し
、ＭＩＡ（Ｈｉｓ７）タンパク質を含有する画分をプールした。これは、ウェス
タンブロットにより確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１６×２０ｃｍ）を使用し
て、プールされた画分の純度を決定するため、精製されたタンパク質２０μｇを
担荷させた。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キ
ットを使用して決定した。濃度計を使用してゲルをスキャニングし（ＧＳ−７０
０、Ｂｉｏ−ｒａｄ）、スキャンを分子分析ソフトウェア（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を
使用して分析した。スキャニングデータより、ＭＩＡ（Ｈｉｓ_７）調製物の純度
が、９２％超であるとの結論が得られた。精製されたＭＩＡ（Ｈｉｓ_７）タンパ
ク質の同定は、ＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ質量決定、それに続くＮ末端アミノ酸配列
決定により肯定的に確認された。

【００７１】 実施例２ ＭＩＡによる鼻腔内寛容誘導は、ＤＢＡ−１マウスにおけるコラーゲンＩＩ型
誘導関節炎の臨床的徴候及び放射線学的徴候を緩解させる 関節炎疾患発症に対するＭＩＡの免疫調整能を調査するため、関節炎発症の初
期に、ＭＩＡ（実施例１のようにして調製）を、ＤＢＡ／１マウスへ鼻腔内投与
した。雄ＤＢＡ／１マウスをＢｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄ（Ｒｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ
）より入手した。マウスを、アグリカンペプチド（アミノ酸：ＡＧＷＬＡＤＲＳ
ＶＲＹＰＩ、配列番号６）３０μｇ及びウシコラーゲンＩＩ型１００μｇを含む
、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が濃縮さ
れた（２ｍｇ／ｍｌ最終濃度）完全フロイントアジュバントで免疫感作した（０
日目）。２１日目、アグリカンペプチド３０μｇ及びウシコラーゲンＩＩ型１０
０μｇを含む生理食塩水の腹腔内追加注射を、マウスに与えた。２０日目、２５
日目、及び３０日目に、ＭＩＡ（３０μｇ／匹／回、ｎ＝１５）、又は対照とし
ての緩衝液（生理食塩水１５μｌ）のみ（ｎ＝１５）のいずれかの鼻腔内投与に
より、マウスを処理した。疾患の罹患率及び関節炎活性の進展を、０日目から２
〜３日間隔（処理中、関節炎誘導後２１日目、２３日目、２６日目、２８日目、
３０日目、３３日目、及び３５日目）で視覚的に追跡した。関節炎の臨床的重度
を、各肢について０から２のスケールで等級付けした。

【００７２】 ２１日目に、関節炎が徐々に発症し始めた。３５日目、生理食塩水処理動物の
７３％が関節炎の臨床的徴候を示した（図２）。対照的に、ＭＩＡ処理群におい
ては、わずか４０％の動物が疾患の臨床的徴候を示した（図２）。さらに、関節
炎の臨床的徴候（２１から３５日目）の重度は、生理食塩水処理マウスよりもＭ
ＩＡ処理群の方が低いことが認められ（図３）、このことから、ＭＩＡの鼻腔内
投与が、関節炎発症と関連した局所的な炎症過程を減少させることが示された。

【００７３】 ＭＩＡが関節破壊から防御しうるか否かを調査するため、実験の最後（３５日
目）に、Ｘ線撮影（Ｘ線画像化）を、個々のマウスの後肢に対して実施した。低
倍率の立体顕微鏡を使用してＸ線写真をスコア化した。破壊過程は、０（変化な
し）から５（関節及び／又は新生骨形成の完全な破壊）のスケールに分類した。
ＭＩＡの鼻腔内投与は、生理食塩水のみで処理されたマウスと比較して、有意に
関節破壊を阻害した（図４）。

【００７４】 実施例３ 関節軟骨におけるＭＩＡ遺伝子発現の検出 患部組織におけるＭＩＡ遺伝子の発現を、ＲＡ患者５人の軟骨試料に由来する
ｃＤＮＡに対する、ＭＩＡ特異的オリゴヌクレオチド（配列番号７及び配列番号
８）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより検出した。関節軟骨は、膝の関節交換手術の際
に得られた。軟骨から酵素的に軟骨細胞を単離し（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｍｅｔｈ．１５：１３９−１
４６）、その後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）又はＲＮＡｚｏｌＢ（Ｃ
ａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを単離した。全容量２０
μｌで、全ＲＮＡ１μｇを用いて、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−
ＢＲＬ）を使用してｃＤＮＡの合成を実施した。ＭＩＡ及び陽性対照としてのハ
ウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対するＲＴ−ＰＣＲのため、各反応に０．５
μｌのｃＤＮＡを使用した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で、５０ｎｇ
／プライマー、２００μＭ ｄＮＴＰ、及び２．５ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を全容量２５μｌで用いて、９４℃５分を１サイクル、９４
℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃１分を３５サイクル、７２℃５分を１サイクル
、ＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨに特異的なオリゴヌクレオチドは、配列番号９
及び配列番号１０であった。ＰＣＲ試料を、アガロースゲル上で分析した（図５
）。レーン２から６は、関節炎患者５人全員について、予想長のＭＩＡ ｃＤＮ
Ａ増幅産物の明確なシグナルを示しており、ＧＡＰＤＨ増幅シグナルは、各ｃＤ
ＮＡ調製物について同程度の大きさであった（レーン８から１２）。ＲＴ−ＰＣ
Ｒデータは、試験されたＲＡ患者５人中５人の患部組織、即ち罹患膝軟骨で、Ｍ
ＩＡ遺伝子が発現されていることを示している。ＭＩＡ遺伝子は、実際に、少な
くとも相当の割合のＲＡ患者の患部関節軟骨において発現されている可能性が高
い。従って、ＭＩＡタンパク質はＲＡ患者の患部軟骨において合成されていると
予想される。

【００７５】 実施例４ ＭＩＡ由来ペプチドによる鼻腔内寛容誘導は、ＤＢＡ／１マウスにおけるコラ
ーゲンＩＩ型誘導関節炎の臨床的徴候及び放射線学的徴候を緩解させる ＭＩＡ由来断片の関節炎疾患発症に対する免疫調整能を調査するため、ＭＩＡ
アミノ酸配列（配列番号１）からペプチドを選択した。選択は、対応するペプチ
ドのＲＡ関連ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ分子との結合を推定するコンセンサス配列
モチーフに基づいていた。結果として、アミノ酸１００〜１０８のＭＩＡ配列が
、推定ＤＲ結合ペプチドとして同定された（配列番号１１）。両端に２個の付加
的アミノ酸が存在する１３マーＭＩＡペプチド９８−１１０（アミノ酸：ＡＲＬ
ＧＹＦＰＳＳＩＶＲＥ；配列番号１２）が、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｓｂ
ｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）により合成され、純度９５％超の調製物として届けら
れた。ＭＩＡペプチド（配列番号１２）を誘導関節炎発症の初期に、ＤＢＡ／１
マウスに鼻腔内投与した。雄ＤＢＡ／１マウスをＢｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄ（Ｒ
ｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。アグリカンペプチド（アミノ酸：ＡＧＷＬ
ＡＤＲＳＶＲＹＰＩ、配列番号６）３０μｇ及びウシコラーゲンＩＩ型１００μ
ｇを含む、結核菌が濃縮された（２ｍｇ／ｍｌ最終濃度）完全フロイントアジュ
バントで、マウスを免疫感作した（０日目）。２１日目、マウスに、アグリカン
ペプチド３０μｇ及びウシコラーゲンＩＩ型１００μｇを含む生理食塩水の腹腔
内追加注射を与えた。２０日目、２５日目、及び３０日目に、ＭＩＡペプチド（
１０及び３０μｇ／匹／回、ｎ＝１５／群）、又は対照としての緩衝液のみ（生
理食塩水１５μｌ、ｎ＝１５／群）のいずれかの鼻腔内投与によりマウスを処理
した。疾患の罹患率及び関節炎活性の進展を、０日目から２から３日間隔（処理
中、関節炎誘導後２１日目、２３日目、２６日目、２８日目、３０日目、３３日
目、３５日目、及び３７日目）で視覚的に追跡した。関節炎の臨床的重度を、各
肢について０〜２のスケールで等級付けした。実験は、３ブロック（１ケージ当
たり５匹）でランダム化された二重盲検として実施された。

【００７６】 ２１日目に、関節炎が徐々に発症し始めた。３７日目、生理食塩水処理動物の
６７％が関節炎の臨床的徴候を示した（図６）。対照的に、ＭＩＡペプチド処理
群（１０μｇ／匹／回）においては、わずか２８％の動物が疾患の臨床的徴候を
示した（図６）。さらに、関節炎の臨床的徴候（２１から３７日目）の重度は、
生理食塩水処理マウスよりもＭＩＡペプチド処理群（１０μｇ／匹／回）の方が
低いことが認められ（図７）、このことから、ＭＩＡの鼻腔内投与が、関節炎発
症と関連した局所的な炎症過程を減少させることが示された。３０μｇ／匹／回
のＭＩＡペプチドによる処理は、１０μｇ／匹／回と比較すると少ない緩解を与
えたが、それでも、関節炎スコア及び罹患率の値は、一般に、生理食塩水処理対
照マウスで見出されたものよりも低かった（図６及び７）。ＭＩＡペプチド（配
列番号１２）による処理の結果としての関節炎スコア及び罹患率の緩解は、図８
に示されるように、個々の動物についても見られた。

【００７７】 ＭＩＡが関節破壊から防御しうるか否かを調査するため、実験の最後（３７日
目）に、Ｘ線撮影（Ｘ線画像化）を、個々のマウスの後肢に対して実施した。低
倍率の立体顕微鏡を使用してＸ線写真をスコア化した（ランダム化二重盲検）。
破壊過程は、０（変化なし）から５（関節及び／又は新生骨形成の完全な破壊）
のスケールで等級付けした。結果（図９）は、ＭＩＡペプチドの鼻腔内投与が、
生理食塩水のみで処理されたマウスと比較して、有意に関節破壊を阻害したこと
を示している。

【００７８】 実施例５ ＭＩＡの鼻腔内投与後に減少した遅延型過敏反応（ＤＴＨ） ＭＩＡタンパク質の鼻腔内投与により、全身免疫寛容を引き起こす制御Ｔ細胞
応答を誘導することが可能であることを示すため、典型的なＤＴＨ試験を実施し
た。マウスをＭＩＡタンパク質（タンパク質調製については実施例１参照）１０
μｇを含む５０％不完全フロイントアジュバントで０日目に皮下免疫感作した。
７日後、全てのマウスの左足蹠に、ＭＩＡタンパク質１０μｇを含むミョウバン
（１ｍｇ／ｍｌ最終濃度）をチャレンジした。右足蹠には、対照としてミョウバ
ンを注射した。Ｔ細胞反応性に起因する典型的なＤＴＨ応答（足蹠腫脹）を、チ
ャレンジ後２４ｈ目及び４８ｈ目に測定した。ＭＩＡタンパク質の免疫調整的役
割を調査するため、免疫感作の５日前、１０日前、及び１５日前に、ＭＩＡ３０
μｇ又は対照としての生理食塩水の鼻腔内投与により、マウスを処理した（ｎ＝
１０匹／群）。インビボＤＴＨモデルの陽性対照として、マウスをオボアルブミ
ンで免疫感作（５０μｇ／匹）し、チャレンジ（１０μｇ／匹）し、オボアルブ
ミン又は生理食塩水で鼻腔内処理（５０μｇ／匹）した。オボアルブミンは、Ｄ
ＴＨ試験において制御Ｔ細胞応答を誘導しうることが記載されている。ＤＴＨ応
答を雄ＤＢＡ／１マウス（Ｂｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄより入手）及び雌Ｂａｌｂ
／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより入手）の両方において測定し、そ
れぞれ図１０及び１１に示した。ＤＴＨ反応において予想されるように、チャレ
ンジ後４８ｈ目の足蹠腫脹は２４ｈ目と比較して常に減少していた。図１０及び
１１より、いずれのマウス系統においても、ＭＩＡタンパク質に対するＤＴＨ応
答が、ＭＩＡタンパク質の鼻腔内投与の結果として約３０％減少することが結論
付けられた。陽性対照としてのオボアルブミンでも、類似の減少が観察された。
これらのデータは、全身性免疫寛容をもたらすＭＩＡタンパク質の鼻腔内投与に
よる免疫制御Ｔ細胞集団の誘導と一致している。

【００７９】 実施例６ ＲＡ患者及び健常ドナーのヒトリンパ球を用いたＭＩＡタンパク質に対するＴ
細胞応答の検出 ＭＩＡタンパク質が、健常ドナー又はＲＡ患者のいずれに由来するＴ細胞によ
り認識されるか否かを示すため、Ｔ細胞増殖実験を実施した。健常ドナー５人及
びＲＡ患者５人のヘパリン処理済み静脈末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ
での標準的な遠心分離により、ヒトリンパ球を単離し、１０％ＤＭＳＯ中で−１
４０℃にまで徐々に凍結させた（Ｋｒｙｏ １０ Ｓｅｒｉｅｓ）。全ての患者
が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに
より規定された改訂された基準（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ａｒｔ
ｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３１：３１５−３２４）に従いＲＡと診
断され、リウマチ因子陽性であることが見出された。細胞を解凍させ、培養培地
（５０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ Ｆ１２）中に徐
々に再懸濁させた。培養培地中の細胞を、平底９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に、
１００μｌの容量で播いた（１．５×１０^５個／ウェル、１０％ＦＣＳ最終濃度
）。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、湿潤空気中で、ＭＩＡタンパク質（タンパク
質調製については実施例１参照）０．５μｇと共に６日間培養した。細胞を、プ
レートへとコーティングされた抗ＣＤ３抗体（ＣＬＢ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌ
ａｎｄｓ、クローンＴ３／２ １６Ａ９、１μｇ／ｍｌ、２００μｌ／ウェル、
プレートを１８ｈコーティングし、室温で保存した）の存在下又は非存在下でも
培養した。抗ＣＤ３チャレンジに対するＴ細胞応答は、Ｔ細胞集団の全体的な反
応能の尺度と見なされる。インビトロ刺激をそれぞれ５つの別々のウェルで実施
し、測定した。抗ＣＤ３刺激のためには３日後に、ＭＩＡ刺激のためには６日後
に、上清５０μｌをウェルから取り出した。続いて、０．１μＣｉ^３Ｈチミジン
を含有する培養培地２５μｌを各ウェルに添加した後、１８ｈインキュベーショ
ンを行った。細胞採集器を使用して、ガラスファイバーフィルター上に細胞を採
集した。増殖の尺度としての^３Ｈチミジン取り込みを、ガスシンチレーション（
Ｍａｔｒｉｘ９６００、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃａｎｂｅｒｒａ）により５分間決定
した。抗ＣＤ３により誘導されたシグナル、及び抗原により誘導されたシグナル
を、バックグラウンドシグナルで割ることにより、刺激指数（ＳＩ）を計算し、
それぞれ図１２及び１３に示した。図１２からのデータは、抗ＣＤ３チャレンジ
により、健常ドナーのＴ細胞が、ＲＡドナーから単離されたＴ細胞よりもおよそ
２〜３倍強く応答することを示している。図１３の刺激指数より、健常ドナー５
人中４人に由来するＴ細胞は、Ｔ細胞自体によりプロセシングされ提示されるＭ
ＩＡタンパク質の断片を認識するようである。バックグラウンドレベルを越える
応答が、ＲＡ患者５人中３人で検出されたが、ＭＩＡに対する応答性のレベルは
、ＲＡ患者由来のＴ細胞では低かった。この比較的低い応答レベルは、抗ＣＤ３
チャレンジにより決定されるようなＲＡ Ｔ細胞の比較的低い全体的な応答能に
対応するようである。

【００８０】 これらのデータは、ヒト末梢Ｔ細胞のＭＩＡ応答能が、ＲＡ病理そのものとは
無関係であることを示唆している。ヒトＴ細胞のＭＩＡ応答能は稀ではないと考
えられるため、寛容が誘導される量のＭＩＡ又はその断片の投与は、実際に、ヒ
トにおける制御Ｔ細胞応答を惹起する可能性が高い。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＮＧＶ１−ＭＩＡ（Ｈｉｓ_７）ＤＮＡ構築物の概略図である。

【図２】 ＤＢＡ／１マウス（ｎ＝１５／群）におけるコラーゲンＩＩ型誘導関節炎の臨
床的徴候の発症率を示す図である。

【図３】 ＤＢＡ／１マウスにおける関節炎誘導後２０日目、２５日目、及び３０日目の
、ＭＩＡ３０μｇ（黒四角）又は生理食塩水（黒丸）の鼻腔内投与の後の、コラ
ーゲンＩＩ型誘導関節炎の進展を示す図である。

【図４】 ＭＩＡの鼻腔内適用が、コラーゲンＩＩ型関節炎における関節破壊から防御す
ることを示す図である。

【図５】 ＲＡ軟骨におけるＭＩＡ遺伝子発現の検出を示す図である。

【図６】 ＤＢＡ／１マウス（ｎ＝１５／群）におけるコラーゲンＩＩ型誘導関節炎の臨
床的徴候の発症率を示す図である。

【図７】 関節炎誘導後２０日目、２５日目、及び３０日目の、ＭＩＡペプチド１０μｇ
（黒三角）、ＭＩＡペプチド３０μｇ（黒四角）、又は生理食塩水（黒丸）の鼻
腔内投与の後の、コラーゲンＩＩ型誘導関節炎の進展を示す図である。

【図８】 ＤＢＡ／１マウスにおける、関節炎誘導後２０日目、２５日目、及び３０日目
の、ＭＩＡペプチド１０μｇ（黒三角）、ＭＩＡペプチド３０μｇ（黒四角）、
又は生理食塩水（黒丸）の鼻腔内投与の後の、コラーゲンＩＩ型誘導関節炎にお
ける個々の関節炎スコアを示す図である。

【図９】 ＭＩＡペプチドの鼻腔内適用が、コラーゲンＩＩ型関節炎における関節破壊を
防御することを示す図である。

【図１０】 ＤＢＡ／１マウスにおけるチャレンジ後２４時間目（黒バー）及び４８時間目
（白バー）におけるＤＴＨ応答を示す図である。

【図１１】 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるチャレンジ後２４時間目（黒バー）及び４８時間
目（白バー）におけるＤＴＨ応答を示す図である。

【図１２】 ＲＡ患者（白バー、ドナー１〜５）又は健常ドナー（黒バー、ドナー６〜１０
）のヒトリンパ球を用いたＴ細胞増殖を示す図である。

【図１３】 ＲＡ患者（白バー、ドナー１〜５）又は健常ドナー（黒バー、ドナー６〜１０
）のヒトリンパ球を用いたＴ細胞増殖を示す図である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＵ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＯ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 CA04 CA11 DA02 EA04 FA10 GA11 GA18 4C076 AA93 BB25 CC04 CC09 CC26 4C084 AA02 BA01 BA08 BA17 BA18 CA27 DC50 MA59 MA66 NA14 ZA961 ZA962 ZB082 ZB111 ZB112 ZB151 ZB152 ZC022 4H045 AA10 AA30 BA10 CA41 EA20 EA22 FA72 FA74 GA22

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 炎症性疾患に対する医薬調製物の製造のための、ＭＩＡ、及
   び／又は抗炎症効果を有するであろうその断片の使用。
2. 【請求項２】 炎症性疾患に罹患しているか罹患しやすい患者における全身
   性免疫寛容の誘導のための医薬調製物の製造のための、ＭＩＡ、及び／又はＭＩ
   Ａ抗原に対する全身性免疫寛容を誘導するであろうその断片の使用。
3. 【請求項３】 炎症性疾患に罹患しているか罹患しやすい患者における特異
   的Ｔ細胞寛容の誘導のための医薬調製物の製造のための、ＭＩＡ、及び／又はＭ
   ＩＡ抗原に対する特異的Ｔ細胞寛容を誘導するであろうその断片の使用。
4. 【請求項４】 炎症性疾患が免疫細胞により媒介される軟骨破壊疾患である
   、請求項１から３の使用。
5. 【請求項５】 免疫細胞により媒介される軟骨破壊疾患が、関節炎、より具
   体的には慢性関節リウマチである、請求項５の使用。
6. 【請求項６】 組成物が、注射により、経口的に、又は鼻腔内に投与される
   、請求項１から５の使用。
7. 【請求項７】 炎症性疾患に罹患しているか罹患しやすい哺乳動物を治療す
   るための方法であって、ＭＩＡ、及び／又は抗炎症効果を有するであろうその断
   片を、薬学的に許容される担体と共に含む組成物を投与することを含む、方法。
8. 【請求項８】 炎症性疾患に罹患しているか罹患しやすい哺乳動物を治療す
   るための方法であって、ＭＩＡ、及び／又は全身性免疫寛容を誘導するであろう
   その断片を、薬学的に許容される担体と共に含む組成物を、全身性免疫寛容が誘
   導される量で投与することを含む方法。
9. 【請求項９】 炎症性疾患に罹患しているか罹患しやすい哺乳動物を治療す
   るための方法であって、ＭＩＡ、及び／又はＴ細胞特異的寛容を誘導するであろ
   うその断片を、薬学的に許容される担体と共に含む組成物を、Ｔ細胞特異的寛容
   が誘導される量で投与することを含む方法。
10. 【請求項１０】 炎症性疾患が、免疫細胞により媒介される軟骨破壊疾患で
    ある、請求項７から９の方法。
11. 【請求項１１】 疾患が、関節炎、より具体的には慢性関節リウマチである
    、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 組成物が、注射により、経口的に、又は鼻腔内に投与され
    る、請求項７から１１の方法。
13. 【請求項１３】 ＭＩＡの少なくとも９個の連続アミノ酸を有するＭＩＡの
    部分配列を含むペプチド。
14. 【請求項１４】 少なくとも９個のアミノ酸を有し、かつ配列番号１１又は
    配列番号１２を含むＭＩＡのペプチド。
15. 【請求項１５】 配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を有する、
    請求項１３のペプチド。
16. 【請求項１６】 請求項１３又は１４に記載のペプチドの有効量と、薬学的
    に許容される担体とを含む医薬組成物。
17. 【請求項１７】 治療物質として使用するための、請求項１３又は１４に記
    載のペプチドの使用。