NO20024458L - Anvendelse av MIA i immunoterapi - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av MIA-proteinet eller spesifikke derivater derav som immunmodulerende midler for behandling av autoimmune sykdommer, og mer spesifikt reumatoid artritt.

Immunsystemets viktigste funksjonelle rolle er å beskytte individet mot inntrengende patogene organismer som bærer fremmede antigener som er ikke-selv-antigener. For utførelse av denne funksjon på en sikker og effektiv måte trenges det en mekanisme til å skjelne mellom fremmede antigener og autoantigener som stammer fra individets egen kropp. Svikt i denne selv-ikke-selv-skjelningsprosess, det vil si tap av immuntoleranse overfor selv-antigener, kan føre til immunreaktivitet overfor autoantigener som resulterer i autoimmun sykdom, innbefattende vevsødeleggelse og tap av organfunksjon.

Autoimmune sykdommer er et stort problem innenfor helsepleie for mennesker. En del autoimmune sykdommer kan være resultat av en immunologisk prosess rettet mot ett antigen eller antigenkompleks, mens hos andre kan den autoimmune reaksjon innbefatte mange typer antigener som kan være tilstede i mange organer. Flere bevislinjer har vist at immunsystemet inngår i patologien for autoimmune sykdommer. For det første er sjansene for at individer skal utvikle en autoimmun sykdom, nær knyttet til deres genetiske bakgrunner: gener som koder for vevstypekompleks («major histocompatibility complex») klasse II (MHC)-molekyler som presenterer (auto)antigener overfor responderende T-celler som oppfatter MHC-peptidkomplekser, viser en sterk genetisk tilknytning til mottakelighet for sykdom. For det annet infiltrerer celler i immunsystemet, så som monocytter/makrofager og T-celler, målorganer. For det tredje prolifererer T-celler, hos pasienter med autoimmune sykdommer in vitro som svar på potensielt involverte autoantigener. For det fjerde har undersøkelser i dyremodeller av autoimmunitet klart vist at celler i immunsystemet så som monocytter/makrofager og T-celler er innblandet i induksjon og ekspresjon av sykdomsaktivitet.

En sykdom så som reumatoid artritt (RA) kan illustrere immunpatologien som kan oppstå når det gjelder en autoimmun sykdom. RA presenterer seg som en kronisk multisystemsykdom hvor den felles kliniske tilkjennegivelse er den hardnakkede inflammatoriske synovitt ledsaget av proliferasjon av synovialceller, pannusdannelse, brusknedbrytning og ben-erosjon, og til slutt ledd-deformasjon som resulterer i tap av funksjon.

Eksisterende terapier for behandling av autoimmune sykdommer, så som RA, hvor immunsystemet frembringer en uønsket og uheldig inflammatorisk respons, er utilstrekkelige. Behandling har fokusert på lindring av symptomer på autoimmun sykdom snarere enn på årsaken til den. De fleste legemidler som anvendes ved behandling av autoimmune sykdommer, f.eks. steroider og ikke-steroide anti-inflammatoriske forbindelser, er ikke-spesifikke og har betydelige toksiske bivirkninger. Dette er spesielt problematisk siden autoimmune sykdommer er kroniske tilstander som fordrer langvarig administrering av medikamenter.

Antigenspesifikk, ikke-toksisk immunmodulasjonsterapi tilveiebringer et meget attraktivt alternativ for den ikke-spesifikke immunsuppresjon. Denne antigenspesifikke terapi innbefatter behandling av pasienter med mål-(auto)antigenet eller med syntetiske T-celle-reaktive peptider som stammer fra (auto)antigenet. Disse syntetiske peptider svarer til T-celle-epitoper på

(auto)antigenet og kan anvendes til indusering av spesifikk T-celle-toleranse både overfor dem selv og overfor (auto)antigenet. Kontrollert administrering av mål-(auto)antigenet kan være meget effektivt til desensibilisering av immunsystemet. Desensibilisering eller immuntoleranse hos immunsystemet er basert på det lenge observerte fenomen at dyr som er blitt foret med eller har inhalert et antigen eller en epitop, er mindre i stand til å utvikle en systemisk immunrespons overfor antigenet eller epitopen når antigenet eller epitopen innføres via en systemisk vei.

Det er nå blitt funnet at proteinet som kalles melanom-inhiberende aktivitet (MIA), kan anvendes til modulering av immunsystemet.

Utskilte proteinfraksjoner av melanomceller inneholdende MIA er først blitt rapportert av Bogdahn et al. (1989, Cancer Res. 49:5358-5363). Renset MIA inhiberte melanomcelleproliferasjon ved forlengelse av S-fasen og bremsing i G2-delen. Ved rensing av MIA-proteinet og partiell aminosyresekvensering ble cDNA som koder for MIA-protein, identifisert ved anvendelse av degenererte oligonukleotider (Blesch et al., 1994, Cancer Res. 54:5695-5701). Proteinet så ut til å bli translatert som en forløper med 131 aminosyrer, som bearbeides til det ferdige MIA med 107 aminosyrer ved avspalting av et putativt sekresjons-signalpeptid. Det ble ikke funnet noen homologi til noe kjent protein. Isolasjon av muse-motstykke-cDNA for MIA viste en høy evolusjonær konservering, siden den kodet for et protein med 88% aminosyreidentitet med det humane protein. Humane melanomcellelinjer ble vist å utskille MIA-proteinet på 11 kD i dyrknings-mediet. Renset MIA-protein som ble utskilt av melanom-cellelinje HZ-19 eller som ble dannet i E. coli, så ut til å virke som potent cellevekstinhibitor for maligne melanomceller og en del neuroektodermale tumorer. Basert på den vekst-regulerende egenskap ble det antydet at MIA var attraktivt som en terapeutisk antitumorsubstans. Renset MIA inneholdende en C-terminal histidin-merkesubstans i nabostilling til Cys-130 ble rapportert å være totalt inaktiv i vekstinhiberingsanalyser.

Van Groningen et al. (1995, Cancer Res. 55:6237-6243) viste at MIA-genekspresjon ble påvist i ikke-metastaserende melanomcellelinjer og i melanom-metastaselesjoner, men ikke i sterkt metastaserende cellelinjer og pretumor-stadier. Strukturen av det humane MIA-gen ble rapportert av Bosserhoff et al.

(1996, Anticancer Res. 19:2691-2693), og dets promoter ga høye nivåer av genaktivering spesifikt i humane og muse-melanomceller, og dets aktivitet kunne forsterkes ved behandling med forbolestere.

På proteinnivået konkluderte Bosserhoff et al. (1997, Developm. Dynamics 208:516-525; 1999, Anticancer Res. 19:2691-2693) med at forhøyede serumnivåer av MIA hos pasienter med malignt melanom er nær forbundet med sene stadier av sykdommen.

Ved studering av virkningen av retinoinsyre på gen-ekspresjonen i bovin leddbrusk klonet Dietz og Sandell (1996, J. Biol. Chem. 271:3311-3316) cDNA for det inhiberte CD-RAP-gen (brusk-avledet retinoinsyre-sensitivt protein). Det ble konkludert med at CD-RAP var det bovine motstykke til det humane MIA.

Ved in situ-hybridisering og immunlokalisering på muse- og rottevev trakk man den konklusjon at den normale ekspresjon av CD-RAP er begrenset til brusk. Ekspresjonen av CD-RAP/MIA-genet så ut til å være knyttet til kondrogenese.

Det er nylig også blitt rapportert forhøyede serumnivåer av MIA hos pasienter med reumatiske sykdommer, f.eks. reumatoid artritt, forbundet med leddødeleggelse (Muller-Ladner et al., 1999, Rheumatol. 38:148-154) og hos maratonløpere etter at de har løpt (Neidhart et al. 1999, Sammendrag 1412, American Coll. Rheumatol. - 63rd Annual Sei. Meeting). Det ser følgelig ut til å finnes et diagnostisk forhold mellom tilstedeværelsen av forhøyede serumnivåer av MIA og ødeleggelse av leddvev.

Hovedproblemet ved (auto)immune sykdommer (så som f.eks. RA) er at de nøyaktige målsubstanser eller antigener som immunsystemet reagerer uheldig overfor, i stor grad er ukjente, noe som tyder på at modulering av en sykdoms-enhet på antigenspesifikk måte kanskje ikke er mulig.

Det vil imidlertid være en viktig fordel om en antigenstyrt ikke-toksisk form av immunmodulasjonsterapi kunne anvendes uten kjennskap til antigenet (antigenene) som inngår som målsubstans i (auto)immunresponsen. En slik antigenstyrt terapi ville innbefatte dannelse av antigenspesifikke modulatorceller ved anvendelse av et antigen som ventes å bli frigjort eller dannet under autoimmun-prosessen. Et slikt antigen ville bli tilgjengelig under inflammasjon eller vevsødeleggelse. Når det gjelder en autoimmun sykdom, skulle det lokalt dannede autoantigen da aktivere eller reaktivere modulatorceller indusert med et slikt antigen.

For effektivt å anvende toleranseinduksjonsterapi til behandling av T-celle-mediert bruskødeleggelse er det et stort behov for å identifisere T-celle-reaktive (poly)peptider som kan desensibilisere pasienter overfor autoantigenet som aktiverer T-cellene som er ansvarlige for den inflammatoriske prosess.

Det er et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe et (poly)peptid som kan indusere systemisk immuntoleranse, mer spesielt spesifikk T-celle-toleranse, fortrinnsvis overfor det ansvarlige bruskantigen hos pasienter som lider av T-celle-mediert bruskødeleggelse. Det er nå blitt funnet at MIA oppfyller de ovennevnte krav og kan anvendes som et effektivt toleragen.

Ved foreliggende oppfinnelse skal det med induksjon av systemisk immuntoleranse forstås stimulering av antigenspesifikke lymfocytter ved antigenpresenterende celler (APC) på en slik måte at lymfocyttene inntar en tilstand hvor de danner anti-inflammatoriske cytokiner. Anti-inflammatoriske cytokiner kan for eksempel være IL-4, IL-10 og/eller TGF-p. Lymfocytter som er brakt til toleranse ved APC, er i stand til å påtvinge sin anti-inflammatoriske tilstand til andre steder i kroppen, f.eks. steder med pågående inflammasjon.

Immunsystemet beskytter individer mot fremmede antigener og responderer på eksponering for et fremmed antigen ved aktivering av spesifikke celler så som T- og B-lymfocytter og dannelse av løselige faktorer så som interleukiner, antistoffer og komplementfaktorer. Antigenet som immunsystemet responderer overfor, nedbrytes ved de antigenpresenterende celler (APCer), og et fragment av antigenet uttrykkes på celleoverflaten forbundet med et vevstypekompleks (MHC) klasse ll-glykoprotein. MHC-glykoprotein-antigenfragment-komplekset presenteres for en T-celle, som ved sin T-celle-reseptor gjenkjenner antigenfragmentet sammen med MHC klasse ll-proteinet som det er bundet til. T-cellen blir aktivert, dvs. at den prolifererer og/eller danner interleukiner, noe som resulterer i ekspansjon av de aktiverte lymfocytter rettet mot antigenet som er under angrep (Greyetal., Sei. Am., 261:38-46, 1989).

Selv-antigener blir også kontinuerlig bearbeidet og presentert som antigen-fragmenter ved MHC-glykoproteinene for T-celler (Jardetsky et al., Nature 353:326-329, 1991). Selvgjenkjennelse er følgelig iboende i immunsystemet. Under normale forhold er immunsystemet tolerant overfor selv-antigener, og aktivering av immunresponsen ved disse selv-antigener unngås. Når toleranse overfor selv-antigener tapes, blir immunsystemet aktivert overfor ett eller flere selv-antigener, noe som resulterer i aktivering av autoreaktive T-celler og noen ganger også i dannelse av autoantistoffer. Dette fenomen omtales som autoimmunitet. Siden immunresponsen generelt er destruktiv, dvs. ment å ødelegge det invaderende fremmede antigen, kan autoimmunresponser forårsake ødeleggelse av kroppens eget vev.

Det vil således være klart at fragmenter av MIA-proteinet vil bli uttrykt av APC, og at derfor også fragmenter av MIA-proteinet er i stand til å fremkalle en immunrespons. Også proteiner fra andre arter med liknende funksjon eller som i det minste er strukturelt nær beslektet med det humane MIA-protein, kan bevirke den samme toleragene effekt. Følgelig inngår også homologe polypeptider eller ortologer eller deler derav som fremkaller immunresponsen, i oppfinnelsen.

Variasjoner som kan finnes i en sekvens, spesielt av mindre peptider, kan vises ved (en) aminosyreforskjell(er) i den totale sekvens eller ved delesjoner, substitusjoner, innsettinger, inversjoner eller addisjoner av (en) aminosyre(r) i denne sekvens. Aminosyresubstitusjoner som er ventet ikke i vesentlig grad å forandre biologiske og immunologiske aktiviteter, er blitt beskrevet. Aminosyre-utskiftninger mellom beslektede aminosyrer eller utskiftninger som ofte har funnet sted i utviklingen, er blant annet Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, IleA/al (se M.D. Dayhof, Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3). Basert på denne informasjon utviklet Lipman og Pearson en metode for hurtig og sensitiv proteinsammenlikning

(Science, 227:1435-1441, 1985) og bestemmelse av den funksjonelle likhet mellom homologe polypeptider.

Proteinet ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter polypeptidet omfattende SEKV. ID NR.: 1, men også polypeptider med en likhet på minst 70%, fortrinnsvis 90%, mer foretrukket 95%, inngår. Også deler av slike polypeptider som fremdeles kan gi de toleragene effekter, er innbefattet. Slike deler kan være funksjonelle per se, f.eks. i solubilisert form, eller de kan være knyttet til andre polypeptider, enten på kjente bioteknologiske måter eller ved kjemisk syntese, under oppnåelse av kimæriske polypeptider.

Anvendt i det foreliggende er betegnelsen likhet som definert i NCBI-BLAST 2.0.10 [26. aug. 1999] (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller og David J. Lipman (1997)

«Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs», Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Programmet anvendes til å lete etter sekvensoppstillinger ved anvendelse av standard-(«default»)-oppsett. Når det gjelder aminosyreoppstillinger, anvendes BLOSUM62-matriksen som en standard, og likheten angis som antallet positive resultater. Ingen filtrering av lavkomposisjonell kompleksitet inngår.

Fragmentene av MIA-proteinet eller homologe polypeptider skal forstås som subsekvenser av proteinet. «Subsekvens» skal forstås definert som «en del» og bør ikke feiltolkes som å omfatte hele proteinet. Disse subsekvenser har følgende funksjonelle egenskaper: i) peptidene kan bindes ved de sykdoms-tilknyttede MHC-molekyler, fortrinnsvis HLA-DRB1<*>0101, DRB1<*>0401, DRB1<*>0404, DRB1<*>0408, DRB1<*>0405, DQB<*>0301 eller DQB<*>0302, og ii) peptidene må være i stand til å fremkalle en T-cellerespons hos mennesker, fortrinnsvis autoimmune pasienter, mer foretrukket RA-pasienter. En slik respons kan for eksempel måles i en in vitro-T-celle-proliferasjonsanalyse eller i en analyse for påvisning av T-celle-cytokindannelse (f.eks. ELISA eller ELISPOT)

(Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1998). Peptidene må fortrinnsvis også oppfattes av T-celler i dyr som er transgene for de relevante humane MHC klasse ll-molekyler, som nevnt ovenfor, og human CD4 ved immunisering med et MIA-(poly)peptid.

Lengden av disse subsekvenser er ikke viktig, under forutsetning av at den omfatter epitopen som skal oppfattes av det aktuelle MHC-molekyl. Subsekvensen har fortrinnsvis minst 9 på hverandre følgende aminosyrer av MIA. Disse peptider har fortrinnsvis en aminosyresekvens på 9-55 aminosyrerester. Mer foretrukket har peptidene en aminosyresekvens på 9-35, spesielt 9-25 aminosyrerester. Mye mer foretrukket er peptider med en aminosyresekvens på 9-15 aminosyrerester. Sterkt foretrukket er peptider med en aminosyresekvens på 13 eller 14 aminosyrerester. Mest foretrukket er peptider som omfatter SEKV. ID NR.: 11 eller SEKV. ID NR.: 12.

Innenfor oppfinnelsens ramme er også multimerer av peptidene, så som for eksempel en dimer eller trimer av peptidene ifølge oppfinnelsen. En multimer ifølge oppfinnelsen kan enten være en homomer, bestående av en mangfoldighet av det samme peptid, eller en heteromer bestående av forskjellige peptider.

Det vil være klart for fagfolk på området at (poly)peptidene kan være forlenget på én av sidene av peptidet eller på begge sider og fremdeles utøve den samme immunologiske funksjon. Den forlengede del kan være en aminosyresekvens i likhet med proteinets naturlige sekvens. Imidlertid kan (poly)peptidet også forlenges med ikke-naturlige sekvenser. Følgelig kan MIA samt fragmentene derav med den anti-inflammatoriske funksjon forlenges i hver side med ikke-naturlige sekvenser. Derfor er f.eks. polypeptider omfattende SEKV. ID NR.: 11 eller SEKV. ID NR.: 12 en del av oppfinnelsen. Lengden av disse peptider er fortrinnsvis som angitt ovenfor. Det vil være klart at (poly)peptidet ikke behøver utøve sin opprinnelige funksjon og at det som sådant kan være inaktivt skjønt det likevel utfører sin immunologiske funksjon ifølge oppfinnelsen. (Poly)peptidet ifølge oppfinnelsen kan være knyttet til MHC ll-molekyler, slik at bindingsspalten er opptatt av peptidet. Et fleksibelt linkermolekyl, som fortrinnsvis også består av aminosyresekvenser, kan tilknytte peptidet. MHC-molekylene behøver ikke ha sine konstante domener og kan bestå kun av sine variable doméner, enten direkte knyttet til hverandre eller sammenknyttet via en fleksibel linker. Fordelen med et slikt kompleks er at det kan finnes i løselig form og kan gjenkjennes direkte av T-celler.

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan derfor anvendes ved fremstilling av et farmasøytisk preparat for forhindring av inflammatoriske sykdommer.

(Poly)peptidene, hvilke (poly)peptider likner de MHC klasse ll-begrensede T-celle-epitoper som finnes på. antigenet omfattende MIA-polypeptidet eller

fragmenter derav omfattende disse epitoper, er meget godt egnet for anvendelse ved en terapi for induksjon av systemisk immuntoleranse overfor antigenet hos pattedyr, mer spesifikt mennesker, som lider av T-celle-mediert bruskødeleggelse, så som for eksempel artritt, mer spesifikt reumatoid artritt.

Mer spesifikt kan polypeptidene anvendes ved fremstilling av et farmasøytisk preparat til induksjon av spesifikk T-celle-roleranse hos pasienter som lider av inflammatoriske sykdommer, fortrinnsvis immuncelle-mediert bruskødeleggelse. Immuncellen er fortrinnsvis en T-celle. Den mest foretrukne sykdom er artritt, mer foretruket reumatoid artritt. I tillegg til en terapeutisk behandling hvor pasienter som lider av en inflammatorisk sykdom, behandles, kan MIA og fragmentene derav også anvendes ved en forebyggende behandling for pasienter som er utsatt for å få en inflammatorisk sykdom.

Behandling av autoimmune sykdommer med peptidene ifølge oppfinnelsen gjør bruk av det faktum at systemisk immuntoleranse induseres til ubeslektede, men ko-lokaliserte antigener. Regulatorcellene utskiller på en antigenspesifikk måte pleiotropiske proteiner så som cytokiner som kan nedmodulere immunresponsen.

Eventuelt kan en slik behandling kombineres med administrering av andre medikamenter så som DMARD'er (sykdomsmodifiserende anti-reumatiske legemidler, f.eks. sulfasalazin, anti-malariamidler (klorokin, hydroksyklorokin), injiserbart eller oralt gull, metotrexat, D-penicillamin, azatioprin, cyklosporin, mykofenolat), NSAID'er (ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler), kortikosteroider eller andre legemidler som er kjent for å innvirke på sykdommens forløp i autoimmune pasienter.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til modulering av lymfocytter som er reaktive overfor andre antigener enn nevnte antigen, men som er tilstede i det samme vev som antigenet, dvs. proteiner omfattende MIA-polypeptidet, dvs. polypeptidet ifølge SEKV. ID NR.:: 1 eller deler derav. Ved induksjon av antigenspesifikk T-celle-toleranse, kan autoimmune sykdommer behandles ved systemisk immuntoleranse. Mer vanlig er cellene som skal moduleres, hematopoietiske celler. For at peptidet skal funksjonere som toleragen, må det generelt oppfylle minst to betingelser, dvs. at det må ha immunmodulerende evne og det må uttrykkes lokalt vanligvis som en del av et større protein.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved rekombinant DNA-teknikker. En nukleinsyresekvens som koder for proteinet, et peptid ifølge oppfinnelsen, en multimer av nevnte peptider eller et kimærisk peptid innføres i en ekspresjonsvektor. Egnede ekspresjonsvektorer omfatter de nødvendige kontrollområder for replikasjon og ekspresjon. Ekspresjonsvektoren kan bringes til ekspresjon i en vertscelle. Egnede vertsceller er for eksempel bakterier, gjærceller og pattedyrceller. Slike teknikker er velkjente på området; se for eksempel Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.

(Poly)peptidene ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles ved hjelp av velkjente organisk-kjemiske metoder for peptidsyntese, så som for eksempel fastfase-peptidsyntese beskrevet for eksempel i J. Amer. Chem. Soc. 85:2149

(1963) og Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214 (1990).

(Poly)peptidene kan stabiliseres ved C- og/eller N-terminal-modifikasjoner, som vil redusere eksopeptidase-katalysert hydrolyse. Modifikasjonene kan innbefatte: C-terminal acylering (f.eks. acetylering = Ac-peptid), N-terminal amid-innføring (f.eks. peptid-NH2), kombinasjoner av acylering og amid-innføring (f.eks. Ac-peptid-NH2) og innføring av D-aminosyrer i stedet for L-aminosyrer (Powell et al., J. Pharm. Sei., 81:731-735, 1992).

Andre modifkkasjoner er fokusert på forhindring av hydrolyse ved endopeptidaser. Eksempler på disse modifikasjoner er: innføring av D-aminosyrer i stedet for L-aminosyrer, modifiserte aminosyrer, syklisering i peptidet, innføring av modifiserte peptidbindinger, f.eks. reduserte peptidbindinger ^[C^NH] og f.eks. peptoider (N-alkylerte glycinderivater) (Adang et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 113:63-78, 1994 og Simon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:9367-9371, 1992).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for behandling av pasienter som lider av eller er utsatt for å få inflammatoriske autoimmune sykdommer, ved administrering av et farmasøytisk preparat omfattende (poly)peptidet ifølge oppfinnelsen. (Poly)peptidet omfatter T-celle-epitoper, som gjenkjennes av og er i stand til å stimulere autoreaktive T-celler. Disse T-celler kan finnes f.eks. i blodet hos pasienter som lider av inflammatoriske sykdommer. Slike pasienter kan lide av sykdommer så som Graves' sykdommer, juvenil artritt, primær glomerulonefritt, polyartritt, osteoartritt, Sjogrens syndrom, myasthenia gravis, reumatoid artritt, Addisons sykdom, primær biliær sklerose, uveitt, systemisk lupus erythematosus, inflammatorisk tarmsykdom, multippel sklerose eller diabetes.

I henhold til oppfinnelsen kan således pattedyr som lider av eller er utsatt for å få en inflammatorisk sykdom, behandles ved administrering av et preparat omfattende MIA og/eller fragmenter derav som vil ha anti-inflammatoriske virkninger, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Fortrinnsvis administreres en systemisk immuntoleranse-induserende mengde av et preparat omfattende MIA og/eller fragmenter derav som vil indusere nevnte systemiske immuntoleranse. Mer foretrukket administreres en T-celle-spesifikk toleranse-induserende mengde. Den inflammatoriske sykdom er fortrinnsvis en immuncelle-mediert bruskødeleggende sykdom, mer foretrukket artritt, enda mer foretrukket reumatoid artritt.

Forannevnte preparater kan også omfatte peptider omfattende en subsekvens av MIA med minst 9 på hverandre følgende aminosyrer fra MIA. Preparatene omfatter fortrinnsvis et peptid omfattende SEKV. ID NR.: 11 eller SEKV. ID NR.: 12. Enda mer foretrukket består peptidet av SEKV. ID NR.: 11 eller 12. Følgelig kan disse peptider anvendes som en terapeutisk substans. Disse peptider kan derfor også anvendes for fremstilling av et farmasøytisk preparat mot inflammatoriske sykdommer som beskrevet i det foregående.

Administrering av det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen vil indusere systemisk immuntoleranse, spesielt toleranse hos de spesifikke autoreaktive T-celler hos disse pasienter, overfor de autoantigene proteiner i leddbrusken under angrep, og andre selv-antigener som oppviser de identifiserte MHC klasse ll-bindende T-celle-epitoper kjennetegnet eller etterliknet ved aminosyresekvensene hos ett eller flere av peptidene ifølge oppfinnelsen. Den induserte toleranse vil således føre til en reduksjon i den lokale inflammatoriske respons i leddbrusken under angrep.

(Poly)peptidene ifølge oppfinnelsen har den fordel at de har en spesifikk virkning på de autoreaktive T-celler, hvorved de andre komponenter i immunsystemet følgelig forblir intakte sammenliknet med den ikke-spesifikke suppressive effekt av immunsuppressive legemidler.

Systemisk immuntoleranse kan oppnås ved administrering av høye eller lave doser av peptider ifølge oppfinnelsen. Mengden av peptid vil avhenge av administreringsmåten, administreringstidspunktet, pasientens alder samt generelle helsetilstander og diett.

Generelt kan det anvendes en dose på fra 0,01 til 10 000 (.ig peptid pr. kg kroppsvekt, fortrinnsvis fra 0,05 til 500 ug, mer foretrukket fra 0,1 til 100 u.g peptid.

Farmasøytisk akseptable bærere er velkjente for fagfolk på området og innbefatter for eksempel steril saltoppløsning, laktose, sakkarose, kalsiumfosfat, gelatin, dekstrin, agar, pektin, peanøttolje, olivenolje, sesamolje og vann. Andre bærere kan for eksempel være MHC klasse ll-molekyler, hvis ønskelig innesluttet i liposomer.

Dessuten kan de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen omfatte én eller flere adjuvanser. Egnede adjuvanser innbefatter blant annet aluminium-hydroksid, aluminiumfosfat, amfigen, tokofenoler, monofosfenyl-lipid A, muramyldipeptid og saponiner så som Quill A. Adjuvansene for anvendelse ved toleranseterapien ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis mukosale adjuvanser så som koleratoksin B-subenheten eller karbomerer, som bindes til mukosa-epitelet. Mengden av adjuvans avhenger av beskaffenheten av selve adjuvansen.

Videre kan det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen omfatte én eller flere stabilisatorer så som for eksempel karbohydrater innbefattende sorbitol, mannitol, stivelse, sakkarosedekstrin og glukose, proteiner så som albumin eller kasein, samt buffere så som alkaliske fosfater.

Egnede administreringsmåter er f.eks. intramuskulære injeksjoner, subkutane injeksjoner, intravenøse injeksjoner eller intraperitoneal-injeksjoner, oral administrering og nasal administrering så som sprayprodukter. Intranasal administrering er foretrukket.

For testing av (poly)peptidenes evne til å modulere (auto)immunresponser har flere musemodeller vist seg å være egnet, så som kollagen-indusert artritt hos mus (CIA), adjuvans-artritt hos rotter, eksperimentell allergisk encefalomyelitt hos mus og ikke-fedme-diabetes hos mus (NOD). Antigen kan administreres intravenøst, intraperitonealt, oralt eller nasalt i slike modeller (redegjørelse ifølge Liblau et al., Immunol. Today 18:599-603, 1997). For å gjøre utlesing («read-out») i disse modeller lettere, er det viktig å øke konfidensintervallet. I henhold til foreliggende oppfinnelse er det blitt funnet at forekomst og kliniske data i artrittmodeller kan forbedres ved kombinering av den opprinnelige trigger for artritt, f.eks. kollagen type II i CIA, med et peptid avledet fra det ekstracellulære matriksprotein aggrecan. Dette peptid kan fortrinnsvis administreres samtidig med den opprinnelige trigger, skjønt en separat administrering også kan være mulig.

Følgende eksempler er illustrerende for oppfinnelsen og må ikke på noen måte tolkes som begrensende for oppfinnelsens ramme.

Forklaring av figurene

Fig. 1

Skjematisk fremstilling av pNGV1-MIA(His7)-DNA-konstruksjonen. Den MIA(His7)-kodende sekvens ble klonet som et EcoR l-Ba/nHI-fragment bak SV40-tidligpromoter/forsterker/origo.

Fig. 2

Forekomst av kliniske tegn på kollagen type ll-indusert artritt i DBA/1-mus (n=15pr. gruppe). Overvåking innbefattet alle de 4 føtter hos hvert dyr (for kriterier, se forklaring til fig. 3). Dyrene ble behandlet på dagene 20, 25 og 30 etter artrittinduksjon ved intranasal administrering av 30 |.ig MIA (■) eller saltoppløsning (•). En tohalet statistisk chi-kvadrat-test (sammenliknet med den saltoppløsnings-behandlede kontrollgruppe) viste at P = 0,020 (<*>).

Fig. 3

Utvikling av kollagen type ll-indusert artritt etter intranasal administrering på dagene 20, 25 og 30 etter artrittinduksjon, av 30f.ig MIA (■) eller saltoppløsning (•) i DBA/1-mus. Overvåking innbefattet alle de 4 føtter hos et dyr og var ifølge kriterier beskrevet av Joosten et al. (1997, J. Immunol., 159:4094-4102): poeng 0,5: signifikante forandringer; poeng 1,0: moderate forandringer; poeng 1,5: markerte forandringer, poeng 2,0: alvorlig artritt ledsaget av maksimal opphovning, rødhet og ankylose. Dataene representerer middelpoengtallet pr. gruppe mus (n=15). Graden av sykdomsutvikling er sterkt undertrykket i MIA-behandlede dyr. En tohalet statistisk Mann Whitney-test med 95% konfidensnivå (sammenliknet med den saltoppløsningsbehandlede kontrollgruppe) viste at P<0,05 (<*>), dvs. P=0,0316 på dag 28, P=0,0377 på dag 30 og P=0,0268 på dag 35. For dag 33 er P=0,0545 (<**>).

Fig. 4

Intranasal tilføring av MIA beskytter mot leddødeleggelse ved kollagen type II-artritt. Radiografi (røntgenavbilding) ble utført for bakføttene hos individuelle mus (n=15DBA/1 mus/gruppe) ved slutten av forsøket (dag 35). Radiogrammene ble bedømt ved anvendelse av et stereomikroskop under liten forstørrelse. Et poengtall på fra 0 til 5 ble gitt til hver fot i henhold til følgende retningslinjer: poeng 0: ingen forandringer; poeng 1: mindre forandringer; poeng 2: moderate forandringer; poeng 3: markerte forandringer; poeng 4: kraftige forandringer; poeng 5: fullstendig ødeleggelse som gjenspeilet den alvorlige artritt som også var synlig utvendig hos en rekke dyr. Dataene representerer middel +/- SEM for de saltoppløsnings-behandlede mus (hvit søyle) og de MIA-behandlede mus (svart søyle, 30 (.ig-doser). Statistisk sammenlikning av data ved anvendelse av en tohalet Mann Whitney-test med et 95% konfidensnivå viste at P=0,0065 (<*>).

Fig. 5

Påvisning av MIA-genekspresjon i RA-brusk. For cDNA som stammet fra artrittisk knebrusk hos 5 RA-pasienter ble RT-PCR utført med MIA-spesifikke (felter 2-6) eller GAPDH-spesifikke oligonukleotider (felter 8-12). For hver PCR-reaksjon ble 5 yi\ separert på agarose-gel med 100 bp-stigen (Gibco-BRL) som en fragment-lengdemarkør (felt 7). Det brede bånd i midten av felt 7 representerer 600 bp markørfragmentet. RT-PCR-kontrollreaksjoner uten templat-cDNA under anvendelse av MIA- og GAPDH-spesifikke oligonukleotider er vist i henholdsvis feltene 1 og 13.

Fig. 6

Forekomst av kliniske tegn til kollagen type ll-indusert artritt i DBA/1-mus (n=15pr. gruppe). Overvåking innbefattet alle de 4 føtter hos hvert dyr (for kriterier, se forklaring til fig. 7). Dyrene ble behandlet på dagene 20, 25 og 30 etter artrittinduksjon ved intranasal administrering av 10 j_ig MIA-peptid (♦), 30j_ig MIA-peptid (■) eller saltoppløsning (•). En tohalet statistisk Fisher-test (sammenliknet med den saltoppløsning-behandlede kontrollgruppe) viste P<0,05 (<*>), dvs. P=0,042på dag 30 og P=0,014 på dag 33. En tohalet statistisk chi-kvadrat-test viste P=0,040på dag 37.

Fig. 7

Utvikling av kollagen type ll-indusert artritt etter intranasal administrering på dagene 20, 25 og 30 etter artrittinduksjon med 10 MIA-peptid (♦), 30f.ig MIA-peptid (■) eller saltoppløsning (•). Overvåking innbefattet alle de 4 føtter hos hvert dyr og skjedde i henhold til kriterier beskrevet av Joosten et al. (1997, J. Immunol., 159:4094-4102): poeng 0,5: betydelige forandringer; poeng 1,0: moderate forandringer; poeng 1,5: markerte forandringer; poeng 2,0: alvorlig artritt ledsaget av maksimal hevelse, rødhet og ankylose. Dataene representerer middelpoengtallet pr. gruppe mus (n=15 DBA/1 mus/gruppe). Graden av sykdomsutvikling er sterkt undertrykket hos dyr behandlet med 10 (.tg MIA-peptid. En tohalet statistisk Mann Whitney-test med 95% konfidensnivå (sammenliknet med den saltoppløsning-behandlede kontrollgruppe) viste at P=0,0388 på dag 33

(<*>), og P=0,0574 på dag 37 (<**>). I en énhalet test er P=0,0287 på dag 37 (<**>).

Fig. 8

Individuelle artritt-poengtall ved en kollagen type ll-indusert artritt etter intranasal administrering på dag 20, 25 og 30 etter artrittinduksjon med 10 (.ig MIA-peptid (♦), 30 ug MIA-peptid (■) eller saltoppløsning (•) i DBA/1 mus. Overvåking innbefattet alle de 4 føtter pr. dyr (for kriterier, se forklaring til fig. 7). For hver behandlingsgruppe er medianen angitt for det individuelle artritt-poengtall for hver mus ved slutten av forsøket på dag 37. Statistiske analyser med anvendelse av en Mann Whitney-test med 95% konfidensnivå (sammenliknet med den saltoppløsning-behandlede kontrollgruppe) viste at for gruppen behandlet med 10 f.ig MIA/dose er P=0,0574 i en tohalet test og P=0,0287 i en énhalet test (<**>).

Fig. 9

Intranasal tilføring av MIA-peptid beskytter overfor leddødeleggelse ved kollagen type ll-artritt. Radiografi (røntgenavbilding) ble utført for bakføttene hos individuelle mus (n=15 DBA/1 mus/gruppe) ved slutten av forsøket (dag 37). Radiogrammene ble bedømt ved anvendelse av et stereomikroskop under liten forstørrelse. Et poengtall på fra 0 til 5 ble gitt til hver fot i henhold til følgende retningslinjer: poeng 0: ingen forandringer; poeng 1: mindre forandringer; poeng 2: moderate forandringer; poeng 3: markerte forandringer; poeng 4: betydelige forandringer; poeng 5: fullstendig ødeleggelse som gjenspeilet den alvorlige artritt som også var synlig utvendig hos en rekke dyr. Dataene representerer middel +/-SEM for de saltoppløsning-behandlede mus (hvit søyle) og de MIA-behandlede mus (svart søyle 10 jag doser, og skravert («arched») søyle 30 |.ig-doser). Statistisk sammenlikning av data ved anvendelse av en tohalet Mann Whitney-test med et 95% konfidensnivå viste at P=0,0010 (<*>).

Fig. 10

DTH-responser 24 timer (svarte søyler) og 48 timer (hvite søyler) etter angrep i DBA/1 -mus. Musene ble immunisert og angrepet med MIA (2 sett søyler på høyre side) eller, som positiv kontroll for DTH-induksjon, med ovalbumin (2 sett søyler på venstre side). 5, 10 og 15 dager før immunisering ble musene behandlet ved intranasal administrering med 30f_tg MIA, 30 ug ovalbumin (positiv behandlings-kontroll) eller saltoppløsning (negativ behandlings-kontroll). Dataene representerer middelverdien for antigenspesifikk fot-opphovning +/- SEM. Statistisk sammenlikning av 24 timers-dataene for de proteinbehandlede grupper (MIA eller ovalbumin, intranasalt) med de tilsvarende saltoppløsning-behandlede kontroller under anvendelse av en énhalet Mann Whitney-test med 95% konfidensnivå viste at P<0,05(<*>).

Fig. 11

DTH-respons 24 timer (svarte søyler) og 48 timer (hvite søyler) etter angrep i Balb/c-mus. Musene ble immunisert og angrepet med MIA (2 sett søyler på høyre side) eller, som positiv kontroll for DTH-induksjon, med ovalbumin (2 sett søyler på venstre side). 5, 10 og 15 dager før immunisering ble musene behandlet ved intranasal administrering med 30f.ig MIA, 30 jLig ovalbumin (positiv behandlings-kontroll) eller saltoppløsning (negativ behandlings-kontroll). Dataene representerer middelverdien for antigenspesifikk fotopphovning +/- SEM. Statistisk sammenlikning av de proteinbehandlede grupper (MIA eller ovalbumin, intranasalt) med de tilsvarende saltoppløsning-behandlede kontroller under anvendelse av en énhalet Mann Whitney-test med 95% konfidensnivå viste at P<0,05 (<*>).

Fig. 12

T-celle-proliferasjon med humane lymfocytter fra RA-pasienter (hvite søyler, donorer 1-5) og friske donorer (svarte søyler, donorer 6-10). Cellene ble dyrket med 0,2 u.g platebundne anti-CD3-antistoffer. Etter 3 dager ble det tilsatt 0,1 |iCi<3>H-thymidin, og cellene ble inkubert i 18 timer. Inkorporering av<3>H-thymidin, som mål for celleproliferasjon, ble bestemt ved gass-scintillasjon. Dataene representerer middel-stimuleringsindeksen.

Fig. 13

T-celle-proliferasjon med humane lymfocytter fra RA-pasienter (hvite søyler, donorer 1-5) og friske donorer (svarte søyler, donorer 6-10). Cellene ble dyrket med 0,5 jig MIA. Etter 6 dager ble det tilsatt 0,1 u.Ci 3H-thymidin, og cellene ble inkubert i 18 timer. Inkorporering av<3>H-thymidin, som mål for celleproliferasjon, ble bestemt ved gass-scintillasjon. Dataene representerer middel-stimuleringsindeksen.

Eksempler

Eksempel 1

DNA- kloninq og produksjon/ rensing av rekombinant MIA( his7)

cDNA-kloning

Standarddyrking ble utført med humane melanomceller i DMEM/Hamm's F12 (1:1)-medium i nærvær av 10% føtalt kalveserum. Før RNA-isolering ble dyrkede monolag-celler vasket én gang med iskald PBS-buffer. RNA ble isolert med RNAzol B (Campro Scientific). Førstestreng-cDNA-syntese ble utført med Superscript II (Gibco-BRL) og tilfeldige 6-mer-primere på~4 \. ig total-RNA. For MIA-cDNA-kloning via RT-PCR på cDNA fra GMM3-celler ble to oligonukleotider utformet: senseprimer (5' ATATGAATTCGCCACCATGGCCCGGTCCCTGGT GTGCCTT 3') (SEKV. ID NR.: 4) og antisense-primer (5' ATATGGATCCTTTAAT

GGTGATGGTGATGGTGATGGCAGTAGAAATCCCATTTGTC 3' (SEKV. ID NR.:

5). Senseprimeren inneholdt et optimalisert translasjonelt startområde i henhold til Kozak (1999, Gene 234:187-208) og antisense-primeren et optimalisert translasjonelt stoppområde (McCaughan et al., 1995, Proe. Nati. Acad. Sei. USA

92:5431-5435); uthevet) og 7 His-kodoner etter Cys-130-kodonet for MIA (Blesch et al., 1994, Cancer Res. 54:5695-5701). PCR ble utført i en Perkin Eimer 9600: 1 syklus 5 min. 94°C, 35 sykluser 30 sek. 94°C / 30 sek. 55°C /1 min 72°C, 1 syklus 5 min. 72°C med 400 ng pr. primer, 200 j.iM dNTP'er, samt 1 e Taq-polymerase i et totalvolum på 100 u.l. PCR-amplifikasjonsproduktene ble isolert fra agarose-gel og klonet i vektor pCR2.1 (Invitrogen). cDNA-innskuddet i MIA-pCR2.1 klon 2 ble sekvensert i to retninger (SEKV. ID NR.: 2). For cDNA-subkloning i den eukaryote ekspresjonsvektor pNGV1 (EMBL-adkomstnummer X99274) ble MIA-cDNA nedbrutt fra MIA-pCR2.1 klon 2 med restriksjonsenzymer EcoRI og BamHI og ligert i pNGV1 bak SV40-tidligpromoteren, noe som resulterte i pNGV1-MIA(His7) klon 1 (fig. 1). Plasmidet koder for et protein med sekvensen SEKV. ID NR.: 1 hvor den siste aminosyre Q er erstattet med (His)7.

Transfektering av CHO-celler med pNGV1-MIA(His7)-DNA

CHO-celler (ATCC CCL61) ble dyrket i DMEM/Hamm's F12 inneholdende 5% FCS (Harlan sera lab). pNGV1-MIA(His7)-konstruksjonen ble transfektert til CHO-K1 under anvendelse av Transfectam (Promega) og seleksjonsmedium DMEM/Hamm's F12 inneholdende 5% FCS og 0,8 mg/ml neomycin (G418-sulfat Gibco BRL Life-teknologi, filtersterilisert under anvendelse av et 0,22^M filter av typen Millipore SLGV025BS). De transfekterte celler ble frosset i DMEM F12, 10% FCS, 10% DMSO som en samling av celler ved -140°C. Disse forråd ble tint og dyrket i T25 Roux-kolbe i DMEM F12, 5% FCS pluss 0,8 mg/ml neomycin. Etter tre dager ble enkeltcellekloning utført ved utplating av 20, 10 og 5 celler pr. brønn i 96-brønnsplater. Kloner ble utvalgt ved visuell inspeksjon. To uker etter kloning ble klonene overført til 6-brønnsplater og dyrket til 90% konfluens. Deretter ble cellene dyrket over natten i serumfritt medium (inneholdende 0,8 mg/ml neomycin), og ekspresjon fikk fortsette i én dag. MIA-His7-ekspresjon ble påvist ved anvendelse av en 96-brønns «dotblot» (se nedenfor). De høyest produserende transfektanter ble oppskalert og frosset i ampuller ved -140°C. Serumfri dyrkningssupernatant ble også analysert på SDS-PAGE, fulgt av Western-blotting og påfølgende påvisning med monoklonalt anti-His6-antistoff (Dianova GMBH, kat. nr. Dia 900, parti nr. 100696, fortynnet 1000 ganger). Blokkerings- og antistoffinkuberingene ble utført som beskrevet for dotblot-metoden.

Påvisning av MIA-His7 ved anvendelse av en dotblot

Prøver tatt fra kondisjonert medium fra CHO.pNGV1.MIA(His7)-kloningen ble «spottet» på et nitrocellulosefilter (Biorad 0,45 j.iM, parti nr. 9473) under anvendelse av vakuum-dotblot-apparatur (Hybri.DOT, BRL, Nederland). Dotblofen ble inkubert i 30 min med Amersham Life Science væske-blokkeringsbuffer (fortynnet 10 ganger i ECF-buffer; 0,1 M Tris-HCI pH 7,5, 0,3 M NaCI). Deretter ble dotblofen inkubert med 0,2 ug/ml muse-anti(His6)-merkemateriale (Dianova GMBH kat. nr. Dia 900 parti nr. 100696) fortynnet i PBST ved RT. Etter tre gangers vasking med PBST i fem minutter ved RT, ble dotblofen inkubert med 250 ng/ml anti-muse-lgG-HRP (Promega kat. nr. 3624512) i to timer ved RT. Etter tre gangers vasking med PBST i fem minutter ved RT, ble påvisning utført ved anvendelse av ECL (Amersham Life Science sats 96) i henhold til fabrikantens instruksjoner.

Dotblot-påvisningen viste at transfektantene 18, 32 og 37 hadde den høyeste ekspresjon pr. 2,104 celler pr. ml. Derfor ble disse kloner valgt for ytterligere analyse. Pilot-stabilitetsundersøkelser i «spinnere» ble utført.

Stabilitetsundersøkelser av MIA(His7)-transfektanter i spinnerkulturer

Celler fra transfektanter 18, 32 og 37 ble dyrket til 100% konfluens i T175 Roux-kolber. Spinnere inneholdende 250 ml DMEM F12 modifisert, 5% FCS og 250 mg bærere (cultisphereS, P Biolytica AB, art. DG-2001-ZZ) ble utsådd i to paralleller. FCS ble redusert trinnvis og til slutt erstattet med DMEM F12 + 0,5 p.g/1 insulin og 5 mg/l transferrin. I løpet av minst fire uker ble det sistnevnte medium erstattet hver 2. eller 3. dag, og ekspresjon av MIA(His7) ble analysert ved Western blot. Supernatanterfra alle spinnere ble oppsamlet og oppbevart ved

-20°C for senere bruk. Stabiliteten av disse kloner ble testet i løpet av 34-39 dager. Hver gang mediet ble fornyet, ble det tatt prøver, som ble konsentrert 5

ganger ved anvendelse av Amicon-mikrokonsentratorer (utelukkelse 10 kDa, nr. 424070) og testet med henblikk på MIA(His7) ved anvendelse av Western blot-metoden. Etter 34-39 dager, uttrykte alle de seks spinnere fremdeles MIA-His7-proteinet. På Western blot hadde båndene for de siste prøver samme intensitet som de første prøver. I henhold til denne analyse var transfektantene følgelig stabile med hensyn til produksjon av MIA(His7). CHO-K1-pNGV1.MIA(His7) klon 18 ble utvalgt for produksjon i en 5 liters fermenteringsinnretning. Innhøstings-mediet i fermenteringsinnretningen inneholdt DMEM F12 + 0,5 i^g/l insulin og 5 mg/l transferrin. Innhøstingsmediet fra fermenteringsinnretningen ble filtrert trinnvis fra 3 \ im til 0,8 jam til 0,22 jam og oppsamlet i plastposer ved 4°C.

Rensing av MIA(His7)-proteinet fra CHO-K1-kondisjonert medium

Ca. 12 I kondisjonert medium fra fermenteringsinnretningskulturer, bufret med 20 mM natriumfosfat pH 7,0, ble påsatt på en SP-Sepharose Streamline XL (Pharmacia Biotech kodenr. 17-5076-01 )-kolonne (XK50, 300 ml) ved en strømningshastighet på 12 ml/min (Pharmacia Biotech stempelpumpe P900). Denne prosess ble overvåket ved anvendelse av en UV-detektor (Monitor UV-900 Pharmacia Biotech). Et enkelt vasketrinn med 20 mM natriumfosfat, 0,10 M NaCI, pH 7,0 ble utført. MIA(His7) som var bundet til kolonnen, ble eluert med 20 mM natriumfosfat 0,40 M NaCI, pH 7,0, og oppsamlet i 50 ml-fraksjoner (Pharmacia Biotech frac-900). Fraksjonene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og Western blotting. Fraksjonene inneholdende MIA-His7 ble blandet og underkastet en gelfiltreringskolonne. Etter ekvilibrering av gelfiltreringskolonnen (XK 26/70 300 ml Superdex 75, Pharmacia Biotech kodenr. 17-1044-01) med 20 mM natriumfosfat, 0,4 M NaCI, pH 7,0, ble SP-Sepharose-blandingen påsatt på kolonnen i porsjoner på 6 ml. Proteinene ble eluert med en strømning på 2,0 ml pr.min. Fraksjonene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og Western blotting, og fraksjonene inneholdende MIA(His7)-proteinet ble blandet. Dette ble bekreftet ved Western blot. For bestemmelse av renheten av de samlede fraksjoner under anvendelse av SDS-PAGE (16 x 20 cm), ble det påsatt 20 ).ig renset protein. Protein-konsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Pierce BCA-proteinanalyse-reagenssettet. Gelen ble skannet under anvendelse av et densitometer (GS-700, Bio-rad), og skannet ble analysert under anvendelse av molekylanalyserings- programvaren (Bio-rad). Ut fra skanningdataene trakk man den konklusjon at MIA(His7)-preparatet var over 92% rent. Identiteten av det rensede MIA(His7)-protein ble positivt bekreftet ved MALDI- og ESI-massebestemmelse, fulgt av N-terminal aminosyresekvensering.

Eksempel 2

Intranasal toleranseinduksion med MIA bedrer kliniske og radiologiske tegn til kollagen type ll- indusert artritt hos DBA- 1- mus

For undersøkelse av det immunmodulerende potensial hos MIA ved artrittsykdomsutvikling ble MIA (fremstilt som i eksempel 1) administrert intranasalt til DBA/1-mus under tidlige faser av artrittutviklingen. Hannmus av typen DNA/1 ble anskaffet fra Bomholtgaard (Ry, Danmark). Musene ble immunisert (dag 0) med 30 ug aggrecan-peptid (as: AGWLADRSVRYPI, SEKV. ID NR.: 6) og 100^g bovint kollagen type II i Mycobacterium tubercolusis-anriket (2 mg/ml sluttkonsentrasjon) komplett Freunds adjuvans. På dag 21 fikk musene en intraperitoneal forsterkningsinjeksjon med 30 j.ig aggrecanpeptid og 100 (ag bovint kollagen type II i saltoppløsning. På dagene 20, 25 og 30 ble musene behandlet ved intranasal administrering enten med MIA (30 jig/dyr/dosem n=15) eller, som kontroll, med bufffer (15 (il saltoppløsning) alene (n=15). Sykdomsforekomst og utvikling av artrittaktivitet ble fulgt visuelt over tid, idet man startet på dag 0, med 2-3 dagers intervaller (under behandling observasjon på dagene 21, 23, 26, 28, 30, 33 og 35 etter artrittinduksjon). Klinisk grad av artritt ble inndelt etter en skala på fra 0 til 2 pr. fot.

Ved start på dag 21 ble artritt gradvis utviklet. På dag 35 viste 73% av de saltoppløsning-behandlede dyr kliniske tegn på artritt (fig. 2). I motsetning til dette utviklet bare 40% av dyrene i den MIA-behandlede gruppe kliniske tegn på sykdom (fig. 2). Videre ble det registrert at kliniske tegn på artritt (dag 21-dag 35) var mindre fremtredende i den MIA-behandlede gruppe enn i de saltoppløsning-behandlede mus (fig. 3), noe som tydet på at intranasal administrering av MIA reduserer den lokale inflammasjonsprosess som er forbundet med artrittutvikling.

For undersøkelse av om hvorvidt MIA kan beskytte mot leddødeleggelse ble det utført radiografi (røntgenavbilding) av bakføttene hos individuelle mus i slutten av forsøket (dag 35). Radiogrammene ble bedømt ved anvendelse av et stereomikroskop under liten forstørrelse. Destruktive prosesser ble inndelt etter en skala fra 0 (ingen forandringer) til 5 (fullstendig ødeleggelse av et ledd og/eller nye bendannelser). Intranasal administrering av MIA inhiberte signifikant leddødeleggelse sammenliknet med musene som ble behandlet med saltoppløsning alene (fig. 4).

Eksempel 3

Påvisning av MIA- genekspresjon i artrittisk brusk

Ekspresjon av MIA-genet i sykt vev ble påvist via RT-PCR med MIA-spesifikke oligonukleotider (SEKV. ID NR.: 7 og SEKV. ID NR.: 8) på cDNA som stammet fra bruskprøver fra 5 RA-pasienter. Den artrittiske brusk ble oppnådd under ledderstatningskirurgi for kneet. Kondrocytter ble isolert enzymatisk fra brusken (Cornelissen et al., 1993, J. Tiss. Cult. Meth. 15:139-146) på hvilken RNA ble isolert under anvendelse av Trizol (Gibco-BRL) eller RNAzol B (Campro Scientific). Med 1 yig total-RNA ble synteriseringen av cDNA utført ved anvendelse av Superscript II (Gibco-BRL) i et totalt volum på 20 (.il. Når det gjaldt RT-PCR på MIA og på husholdningsgen-GAPDH, som positiv kontroll, ble det anvendt 0,5 (il cDNA pr. reaksjon. PCR ble utført i en Perkin Eimer 9600: 1 syklus 5 min. 94°C, 35 sykluser 30 sek. 94°C / 30 sek. 55°C /1 min. 72°C, 1 syklus 5 min. 72°C med 50 ng/primer, 200 (.iM dNTP'er, og 2,5 e Taq-polymerase (Pharmacia) i 25 |il totalt volum. Oligonukleotider spesifikke for GAPDH var SEKV. ID NR.: 9 og SEKV. ID NR.: 10. PCR-prøvene ble analysert på agarose-gel (fig. 5). Feltene 2-6 viser tydelige signaler på MIA-cDNA-amplifikasjonsprodukt med den ventede lengde for alle de 5 artritt-pasienter, mens GAPDH-amplifikasjonssignaler er i samme størrelsesorden for hvert cDNA-preparat (feltene 8-12). RT-PCR-dataene viser at MIA-genet uttrykkes i sykt vev, dvs. angrepet knebrusk, hos 5/5 testede RA-pasienter. Det er sannsynlig at MIA-genet faktisk uttrykkes i syk leddbrusk hos minst en betydelig prosentandel av RA-pasienter. Følgelig må det ventes at MIA-proteinet syntetiseres i syk brusk hos RA-pasienter.

Eksempel 4

Intranasal toleranseinduksion med MIA- avledet peptid bedrer kliniske og radiologiske tegn til kollagen type ll- indusert artritt hos DBA/ 1- mus

For å undersøke det immunmodulerende potensial hos et MIA-avledet fragment på artrittsykdomsutviklingen ble det valgt et peptid fra MIA-aminosyresekvensen (SEKV. ID NR.: 1). Valget var basert på et konsensus-sekvensmønster som forutsier bindingen av et tilsvarende peptid til RA-relevante MHC klasse II DR-molekyler. Som resultat ble MIA-sekvensen av aminosyrer 100-108 identifisert som et forutsett DR-bindende peptid (SEKV. ID NR.: 11). Flankert av 2 ytterligere aminosyrer på hver side ble 13-mer MIA-peptid 98-110 (aminosyrer: ARLGYFPSSIVRE; SEKV. ID NR.: 12) syntetisert av Neosystem (Strasbourg, Frankrike) og levert som et mer enn 95% rent preparat. MIA-peptidet (SEKV. ID NR.: 12) ble administrert intranasalt til DBA/1-mus under tidlige faser av indusert artrittutvikling. Hannmus av typen DBA/1 ble anskaffet fra Bomholtgaard (Ry, Danmark). Musene ble immunisert (dag 0) med 30 j.tg aggrecanpeptid (aminosyrer. AGWLADRSVRYPI, SEKV. ID NR.: 6) og 100jig bovint kollagen type II i Mycobacterium tuberculosis-anriket (2 mg/ml sluttkonsentrasjon) komplett Freunds adjuvans. På dag 21 fikk musene en intraperitoneal forsterkningsinjeksjon med 30 u.g aggrecanpeptid og 100 \ ig bovint kollagen type II i saltoppløsning. På dagene 20, 25 og 30 ble musene behandlet ved intranasal administrering enten med MIA-peptid (10 og 30 (.ig/dyr/dose, n=15/gruppe) eller, som kontroll, med bufffer alene (15 (.il saltoppløsning, n=15/gruppe). Sykdomsforekomst og utvikling av artrittaktivitet ble fulgt visuelt overtid, idet man startet på dag 0, med 2-3 dagers intervaller (under behandling, observasjoner på dagene 21, 23, 26, 28, 30, 33, 35 og 37 etter artrittinduksjon). Klinisk grad av artritt ble inndelt etter en skala på fra 0 til 2 pr. fot. Forsøket ble utført som en dobbelt-blindet undersøkelse, randomisert i tre blokker (5 dyr pr. bur).

Ved start på dag 21 ble artritt gradvis utviklet. På dag 37 viste 67% av de saltoppløsning-behandlede dyr kliniske tegn til artritt (fig. 6). I motsetning til dette utviklet bare 28% av dyrene i den MIA-peptid-behandlede gruppe (10 (.ig/dyr/dose) kliniske tegn på sykdom (fig. 6). Videre ble det registrert at kliniske tegn på artritt (dag 21-dag 37) var betydelig mindre fremtredende i den MIA-peptid-behandlede gruppe (10 (ig/dyr/dose) enn i de saltoppløsning-behandlede mus (fig. 7), noe som tydet på at intranasal administrering av MIA-peptid reduserer den lokale inflammasjonsprosess som er forbundet med artrittutvikling. Skjønt behandling med 30 |ag/dyr/dose av MIA-peptid ga mindre bedring sammenliknet med 10 ug/dyr/dose, var likevel artritt-poengtall og forekomstverdier generelt under dem som ble funnet i de saltoppløsning-behandlede kontrollmus (fig. 6 og 7). Bedring av artrittpoeng og forekomst som et resultat av behandling med MIA-peptidet (SEKV. ID NR.: 12) kan også sees pr. individuelt dyr som vist på fig. 8.

For undersøkelse av om hvorvidt MIA-peptidet kan beskytte overfor leddødeleggelse, ble det utført radiografi (røntgenavbilding) på bakføttene hos individuelle mus ved slutten av forsøket (dag 37). Radiogrammene ble bedømt (dobbelt-blindet, randomisert) ved anvendelse av et stereomikroskop under liten forstørrelse. Destruktive prosesser ble inndelt etter en skala fra 0 (ingen forandringer) til 5 (fullstendig ødeleggelse av et ledd og/eller nye bendannelser) pr. fot. Resultatene (fig. 9) viser at intranasal administrering av MIA-peptid signifikant inhiberte leddødeleggelse sammenliknet med musene som ble behandlet med saltoppløsning alene.

Eksempel 5

Nedsatt forsinket h<y>peresensitivitetsreaksionstvpe ( DTH) etter intranasal administrering med MIA

For å vise at det er mulig å indusere en regulerende T-celle-respons som forårsaker systemisk immuntoleranse ved intranasal administrering av MIA-protein ble det utført en typisk DTH-test. Musene ble immunisert subkutant med 10jig MIA-protein (for proteinfremstilling se eksempel 1) i 50% ikke-komplett Freunds adjuvans på dag 0. Etter 7 dager ble alle musene tilført 10 (ag MIA-protein i alun (sluttkonsentrasjon 1 mg/ml) i venstre fotpute. Den høyre fotpute ble injisert med alun som kontroll. Den typiske DTH-respons (fotpute-opphovning), som var et resultat av T-celle-reaktivitet, ble målt 24 og 48 timer etter angrepet. For undersøkelse av MIA-proteins immunmodelerende rolle ble musene behandlet ved intranasal administrering med 30 jag MIA, eller som kontroll med saltoppløsning 5, 10 og 15 dager før immunisering (n=10 mus/gruppe). Som positiv kontroll for in vivo-DTH-modellen ble musene immunisert (50 ).ig/mus) og tilført (10 (ag/mus) ovalbumin og behandlet intranasalt (50 |ag/mus) med ovalbumin eller saltoppløsning. Ovalbumin er blitt beskrevet å være i stand til å indusere en regulerende T-celle-respons ved en DTH-test. DTH-responser ble målt både hos hannmus av typen DBA/1 (anskaffet fra Bomholtgaard) og hos hunnmus av typen Balb/c (anskaffet fra Charles River) og er vist på henholdsvis fig. 10 og 11. Som ventet, var fotpute-opphovning i en DTH-reaksjon 48 timer etter angrep alltid redusert sammenliknet med 24 timer. Ut fra fig. 10 og 11 kan man trekke den konklusjon at i begge musestammene var DTH-responsene overfor MIA-protein redusert med ca. 30% som et resultat av den intranasale administrering av MIA-protein. Med ovalbumin som positiv kontroll ble det observert liknende reduksjoner. Disse data er i overensstemmelse med induksjonen av en immunregulerende T-celle-populasjon ved intranasal administrering av MIA-protein som fører til systemisk immuntoleranse.

Eksempel 6

Påvisning av T- celle- responser overfor MIA- protein med humane lymfocytter fra RA- pasienter og friske donorer

For å vise hvorvidt MIA-proteinet oppfattes av T-celler, enten fra friske donorer eller fra RA-pasienter, ble det utført et T-celle-proliferasjonsforsøk. Humane lymfocytter ble isolert fra heparinisert venøst perifert blod fra 5 friske donorer og 5 RA-pasienter ved standard-sentrifugering på Ficoll-Paque, og de ble gradvis frosset i 10% DMSO til -140°C (Kryo 10-serien). Alle pasienter ble diagnostisert som RA i henhold til de reviderte kriterier utformet av American Rheumatology Association (Arnett et al., 1988, Arthritis & Rheumatism 31:315-324) og funnet reumatoidfaktor-positive. Cellene ble tint og gjenoppslemmet gradvis i dyrkningsmedium (DMEM F12 inneholdende 50% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS)). Cellene ble utplatet i dyrkningsmedium i flatbunnede 96-brønns-plater (Nunc) i et volum på 100 (.il (1,5 x 10<5>celler pr. brønn, 10% FCS sluttkonsentrasjon). Cellene ble dyrket i 6 dager med 0,5 ug MIA-protein (for proteinfremstilling, se eksempel 1) ved 37°C og 5% C02i fuktig luft. Cellene ble også dyrket i nærvær eller fravær av anti-CD3-antistoffer belagt på platen (CLB, Nederland, klon T3/2 16A9, 1 ug/ml, 200 ul/brønn, platene ble belagt i 18 timer og oppbevart ved romtemperatur). T-celle-responsen overfor et anti-CD3-angrep anses som et mål på den totale reaktivitet en T-celle-populasjon er i stand til. Hver in vitro-stimuelring ble utført og målt i 5 separate brønner. Av supernatanten ble 50 jai fjernet fra brønnene etter 3 dager når det gjaldt anti-CD3-stimuleringen og etter 6 dager når det gjaldt MIA-stimuleringen. Deretter ble 25 |J dyrkningsmedium inneholdende 0,1jxCi<3>H-thymidin tilsatt i hver brønn, fulgt av 18 timers inkubering. Cellene ble høstet på glassfiberfiltre under anvendelse av en cellehøstings-innretning. Inkorporering av<3>H-thymidin, som et mål for proliferasjon, ble bestemt i 5 minutter ved gass-scintillasjon (Matrix 9600, Packard Canberra). Stimuleringsindekser (Sl) ble beregnet ved dividering av de anti-CD3-induserte og antigeninduserte signaler ved deres bakgrunnssignaler, og dette er vist henholdsvis på fig. 12 og 13. Dataene fra fig. 12 viser at ved et angrep med anti-CD3 responderer T-cellene hos friske donorer grovt angitt 2-3 ganger sterkere enn T-celler isolert fra RA-donorer. Ut fra stimuleringsindeksene på fig. 13 ser det tydeligvis ut til at celler fra 4-5 friske donorer gjenkjenner fragmenter av MIA-proteinet som er bearbeidet og presentert av T-cellene selv. Responser over bakgrunnsnivå ble påvist for 3/5 RA-pasienter, skjønt nivået av respondens overfor MIA var lavt med T-cellene fra RA-pasienter. Dette lavere responsnivå ser ut til å samsvare med det lavere totale responspotensial hos RA-T-celler, ifølge bestemmelse med anti-CD3-angrepet.

Disse data tyder på at potensialet hos humane perifere T-celler til å respondere overfor MIA ikke er knyttet til RA-patologi per se. Siden humane T-cellers evne til å respondere overfor MIA ikke ser ut til å være uvanlig, er det sannsynlig at administrering av toleranseinduserende mengder av MIA eller fragmenter derav faktisk vil fremkalle en regulerende T-celle-respons hos mennesker.

Claims (17)

1. Anvendelse av MIA og/eller fragmenter derav som vil ha anti-inflammatoriske virkninger, til fremstilling av et farmasøytisk preparat mot inflammatoriske sykdommer.

2. Anvendelse av MIA og/eller fragmenter derav som vil indusere systemisk immuntoleranse overfor MIA-antigenet, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for induksjon av den systemiske immuntoleranse hos pasienter som lider av eller er utsatt for å få en inflammatorisk sykdom.

3. Anvendelse av MIA og/eller fragmenter derav som vil indusere spesifikk T-celle-toleranse overfor MIA-antigenet, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for induksjon av den spesifikke T-celle-toleranse hos pasienter som lider av eller er utsatt for å få en inflammatorisk sykdom.

4. Anvendelse ifølge kravene 1-3, hvor den inflammatoriske sykdom er en immuncellemediert bruskødeleggende sykdom.

5. Anvendelse ifølge kravene 5, hvor den immuncelle-medierte brusk-ødeleggende sykdom er artritt, mer spesifikt reumatoid artritt.

6. Anvendelse ifølge krav 1-5, hvor preparatet administreres ved injeksjon, oralt eller intranasalt.

7. Fremgangsmåte for behandling av pattedyr som lider av eller er utsatt for å få en inflammatorisk sykdom, hvilken fremgangsmåte omfatter administrering av et preparat omfattende MIA og/eller fragmenter derav som vil ha anti-inflammatoriske virkninger, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

8. Fremgangsmåte for behandling av pattedyr som lider av eller er utsatt for å få en inflammatorisk sykdom, hvilken fremgangsmåte omfatter administrering av en systemisk immuntoleranse-induserende mengde av et preparat omfattende MIA og/eller fragmenter derav som vil indusere den systemiske immuntoleranse, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

9. Fremgangsmåte for behandling av pattedyr som lider av eller er utsatt for å få en inflammatorisk sykdom, hvilken fremgangsmåte omfatter administrering av en T-celle-spesifikk toleranse-induserende mengde av et preparat omfattende MIA og/eller fragmenter derav som vil indusere den T-celle-spesifikke toleranse, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

10. Fremgangsmåte ifølge kravene 7-9, hvor den inflammatoriske sykdom er en immuncelle-mediert bruskødeleggende sykdom.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor sykdommen er artritt, mer spesifikt reumatoid artritt.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 7-11, hvor preparatet administreres ved injeksjon, oralt eller intranasalt.

13. Peptid omfattende en subsekvens av MIA med minst 9 på hverandre følgende aminosyrer fra MIA.

14. Peptid av MIA som har minst 9 aminosyrer og omfatter SEKV. ID NR.: 11 eller SEKV. ID NR.: 12.

15. Peptid ifølge krav 13, som har aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 11 eller SEKV. ID NR.: 12.

16. Farmasøytisk preparat omfattende en effektiv mengde av peptidet ifølge krav 13 eller 14, samt en farmasøytisk akseptabel bærer.

17. Anvendelse av peptider ifølge krav 13 eller 14 for anvendelse som en terapeutisk substans.