JP2011224014A - アデノウイルス型３５の少なくとも１つの因子を含有するアデノウイルス由来遺伝子運搬担体 - Google Patents

アデノウイルス型３５の少なくとも１つの因子を含有するアデノウイルス由来遺伝子運搬担体 Download PDF

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Abstract

【課題】キャプシドタンパク質の変更によってアデノウイルストロピズムを変える。
【解決手段】血清型は、それらの天然の屈性と異なる。アデノウイルス血清型（２，４，５及び９）は、肺上皮、他の呼吸器の組織に対して天然の関係をすべて持つ。対照的に、血清型（４０及び４１）は、胃腸管に対して天然の関係を有する。上述した血清型は、少なくともキャプシドタンパク質（ペントン系、ヘキソン）、細胞結合に関与するタンパク質（繊維細胞）、及びアデノウイルス複製に伴うタンパク質と異なる。血清型間のトロピズム及びキャプシドタンパク質の違いは、キャプシドタンパク質の変更によってアデノウイルストロピズムを変えることを目的とする多くの研究を導びいた。
【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子治療、特に、ウイルス、とりわけアデノウイルスの因子由来の因子を含む遺伝子治療の分野に関する。アデノウイルスは、遺伝子を宿主へ運搬するための適切な担体として提案されている。ヒト遺伝子治療用の遺伝子運搬ベクターの開発に対して特に役立たせるアデノウイルスの多くの特徴がある。
すなわち、アデノウイルスゲノムは、かなり特徴的である。それは、約36000塩基対の直線2本鎖DNA分子からなる。アデノウイルスDNAは、血清型に依存する正確な長さを持つ約90〜140塩基対の理想的な逆方向末端反復(ITR)を含む。複製のウイルスの起源は、ゲノム末端で正確にITR内である。
アデノウイルスの生物学は、詳細に特徴付けられており、アデノウイルスは、免疫適応可能な個体における厳格なヒト病理学に関係がない。
ウイルスは、そのDNAを宿主細胞内へ引き合わせるのに極めて有効である。すなわち、ウイルスは、広範な種類の細胞に感染することができ、広範な宿主範囲を有する。ウイルスは、高いウイルス力価で大量に生産することができる。ウイルスは、ウイルスのゲノムの初期領域(E1)の削除により複製欠陥を与えることができる(Brody et al、1994)。遺伝子治療に現在使用されている大部分のアデノウイルスベクターは、所望の遺伝子の情報を導入することが可能なE1領域を削除されている。
Brody（ブロディー）, S. L.およびCrystal（クリスタル）, R. G. (1994) Adenovirus mediated in vivo gene transfer（アデノウイルスはインビボ遺伝子導入を媒介した）. Ann. N. Y. Acad. Sci.（アナルス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス）716: 90-101
これらの特徴に基づき、ヒト目的細胞内への生体内遺伝子運搬用の好ましい方法は、アデノウイルスベクターを遺伝子運搬担体として応用することである。
しかしながら、アデノウイルスのヒトにおける治療の使用に関してなお欠点を有する。主な欠点は、アデノウイルスに対して個体間に広範に予め存在する免疫の存在である。野生型アデノウイルスへさらされることは、広範に提供されているように(Wadell、1984参照)、ヒトに非常に一般的なことである。このさらされることは、大部分のアデノウイルス型、個体が実際にさらされたアデノウイルスに対するもののみならず、同様の(中和)エピトープを有するアデノウイルスに対しても免疫反応を生ずる。ヒトに予め存在する抗体のこの現象と、ウイルスに対する強い二次的体液性及び細胞性免疫反応との組み合わせは、組み換えアデノウイルスベクターを使用する遺伝子運搬に深刻な影響を与える可能性がある。
現在まで、合計で51の明確なアデノウイルス血清型を含むヒトアデノウイルスの6つの異なるサブグループが、提案されている(表１)。血清型は、動物(ウマ、ウサギ)の抗血清に対する質的な中和によって決定されるときその免疫学的示差性に基づき特徴付けられる。もし中和が、2つのウイルス間の交差反応をある程度示すなら、血清型の示差性は、A)赤血球凝集素−阻害の交差反応を欠くことによって示されるように、赤血球凝集素が無関係であるか、又はB)DNAにおける実質的な制物理学的／生物化学的な違いが存在するかと仮定される。最後に明らかにされた9つの血清型(42−51)は、最初にHIV感染患者から単離された(Hierholzer et al 1988、 Schnerr et al 1993) 。十分に理解されていない理由として、大部分の免疫能のない患者は、免疫能のある個体からはほとんどないか一度も単離されていないアデノウイルスを減少させる(Hierholozer et al 1988、1992、Khoo et al、1995、De Jong et al、1998)。
大量の個体は、以前にアデノウイルス、とくに十分に調査されたアデノウイルス血清型５及び型２(Ad５及びAd2)又は免疫学的に関連する血清型にさらされている。重要なことには、これらの2つの血清型はヒト遺伝子治療において使用するために大部分広範に研究もされている。
それが、このような欠点が少なく、好ましくはこのような欠点を回避する、アデノウイルス35又はその機能的相同物の因子によってそのような遺伝子運搬担体に対する免疫を導く因子を置き換える限り、他の(アデノ)ウイルス由来である。本発明において、遺伝子運搬担体は、宿主細胞に興味ある核酸を運搬する能力を有するいずれかの担体である。本発明によれば、それは、そのような担体に対する免疫反応に関して有益な効果を有していなければならないアデノウイルス35因子又はそのような因子の機能的同等物を含まなければならない。それらが共に興味ある前記核酸を運搬する能力を有する限り、基本的に、担体を造る他の因子は、当業界で既知か、当業界で開発されたいずれの因子とすることができる。原則的に、当業者は、アデノウイルス分野において適用することができるか適用されたいずれかのウイルス産物又は生産系を使用及び／又は生産することができる。
調査した各ヒトwtアデノウイルスの中和化に対して陽性である血清サンプルの割合を示す棒グラフである（中和化アッセイの説明については実施例１を参照のこと）。 VP/CCID50比と中和化割合との間に関係が無いことを示すグラフである。 Ad35（Kangら、1989年より引用）および組換えAd35ベースのウイルスを作るために作製したクローンの部分制限マップの略図である。 アデノウイルス血清型の選択に対する中和活性を示す血清サンプルの割合を示す棒グラフである。血清はベルギーおよび英国の健康な志願者から得た。 アデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８および４９に対する中和活性を示す血清サンプルの割合を示す棒グラフである。血清はヨーロッパおよびアメリカの異なる５箇所から得た。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 ヒトアデノウイルス３５の配列である。明細書で説明したとおり、ウイルスの末端のヌクレオチド配列は正確には解明されていない。 pAdAptのマップである。 pIPspAdaptのマップである。 pIPspAdapt1のマップである。 pIPspAdapt3のマップである。 pAdApt35IP3のマップである。 pAdApt35IP1のマップである。 pWE.Ad35.pIX-rITR構築のために取られたステップの略図である。 pWE.Ad35.pIX-rITRのマップである。 pRSV.Ad35-E1のマップである。 PGKneopAのマップである。 pRSVpNeoのマップである。 pRSVhbvNeoのマップである。 ヒトTF-1細胞における緑色蛍光タンパク質（GFP）発現に対するフローサイトメトリー分析である。非形質導入TF-1細胞を用いてバックグランドレベルを１％にした。Ad5、Ad5.Fib16、Ad5.Fib17、Ad5.Fib40-L、Ad5.Fib35およびAd5.Fib51で形質導入した細胞におけるGFP発現を示す。 プライマリーヒト繊維芽細胞様ストローマの形質導入である。異なるキメラ繊維ウイルスに２時間曝した後４８時間で細胞を分析した。フローサイトメーターを用い、導入遺伝子である緑色蛍光タンパク質（GFP）に対して陽性を示した細胞の割合を示す。非形質導入ストローマ細胞を用いてバックグランドを１％とした。異なる実施例（ｎ＝３）の結果を±標準偏差で示す。 一次ヒト繊維芽細胞様ストローマCD34+細胞およびCD34+Lin-細胞の形質導入である。異なるキメラ繊維ウイルスに２時間曝した後５日で細胞を分析した。フローサイトメーターを用い、導入遺伝子である緑色蛍光タンパク質（GFP）に対して陽性を示した細胞の割合を示す。非形質導入細胞を用いてバックグランドを１％とした。また、GFP陽性数を総分析数で除した結果（括弧内）も示す。 ２２ａはCD34+細胞をAd5.Fib51で形質導入した後のGFP陽性細胞のフローサイトメトリー分析である。R2〜R7で囲まれた細胞は全てCD34に対して陽性であるが、これらの細胞は早期分化マーカーCD33、CD38およびCD71（Lin）の発現において異なる。R2内の細胞はCD33、CD38およびCD71に対して陰性であるが、R7内の細胞はこれらのマーカーに対して陽性である。Ad5.Fib51の特異性を示すために、GFP陽性細胞の割合をR2〜R7内で測定した。その結果、９１％（R2）から１５％（R7）へと減少した。 ２２ｂは（ａ）と同様の実験を行ったものである（Ｘ軸はR2〜R7）。但し、Ad5.Fib51と同様の挙動をするAd5.Fib35およびAd5.Fib16を示す他のAd繊維キメラウイルスを用いた。 Ad5繊維配列と、Ad5fib16、Ad5fib35およびAd5fib51のキメラ繊維タンパク質のアライメントである。 アデノウイルスに未分化ヒト骨髄細胞および幹細胞を曝した毒性である。アデノウイルス形質導入直前および５日後に細胞株を計数した。回収した未分化ヒト骨髄細胞（CD34+）およびHSCs（CD34+Lin-）を０日目と比較して示す。 1細胞当たり100または1000ウイルス粒子のウイルス投与量での未熟DCの形質導入である。検査したウイルスはAd5およびAd5ベースのベクターで、血清型１２（AD5.Fib12）、１６（Ad5.Fib16）、２８（Ad5.Fib28）、３２（Ad5.Fib32）、長繊維組織４０（Ad5.Fib40-L）、４９（Ad5.Fib49）、５１（Ad5.Fib51）の繊維組織を保有するベクターである。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現をタンパク質１マイクログラム当たりの相対発光量として表す。 Ad5または繊維キメラベクターAd5.Fib16、Ad5.Fib40-LもしくはAd5.Fib51の１細胞当たり1000ウイルス粒で形質導入した未熟および成熟DCのLacZ発現のフローサイトメトリー分析である。陽性を示した細胞の割合を各ヒストグラムの右上隅に示した。 1細胞当たり1000または5000ウイルス粒で形質導入した後４８時間で測定したヒト未熟DCにおけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現である。検査したウイルスはサブグループB（血清型１１、１６、３５および５１）の繊維組織を保有する繊維キメラウイルスであった。 Ad5、Ad5.Fib16およびAd5.Fib35の1細胞当たり1000ウイルス粒で形質導入した後４８時間のヒト未熟DCにおける緑色蛍光タンパク質（GFP）発現である。非形質導入細胞を用いてバックグランドレベルを約１％（−）にした。 マウスおよびチンパンジーDCの形質導入である。形質導入後４８時間にマウスDCで測定したルシフェラーゼ導入遺伝子発現をタンパク質１マイクログラム当たりの相対発光量として表す。フローサイトメーターを用いて形質導入後４８時間でチンパンジーのDCを測定した。GFP発現はAd5.Fib35（６６％）に対して、Ad（３５）の形質導入が低いことを示している。 PER.C6細胞の温度依存増殖である。10%CO2雰囲気中、32℃、37℃または39℃のいずれかで10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco BRL）および10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変イーグル培地中でPER.C6細胞を培養した。0日目に、合計１×１０６のPER.C6細胞を25cm2の細胞培養フラスコ（Nunc）に播種し、細胞を32℃、37℃または39℃のいずれかで培養した。１〜８日目に細胞を計数した。39℃におけるPER.C6細胞培養の増殖率および最終細胞密度を37℃におけるものと比較した。32℃におけるPER.C6細胞培養の増殖率および最終密度は37℃または39℃のものと比較して僅かに減少した。PER.C6細胞を25cm2細胞培養フラスコ当たり密度１×１０６細胞で播種し、32℃、37℃または39℃のいずれかで培養した。示した時期において、細胞をBurker細胞計数器で計数した。PER.C6は32℃、37℃および39℃の何れにおいても良好に増殖した。 pcDNA3、pcDNA3wtE2AまたはpcDNA3ts125E2AでトランスフェクトしたPER.C6細胞のDBPレベルである。等量の全細胞抽出物を１０％ゲル上でSDS-PAGEによって分画化した。タンパク質をImmobilon-Pメンブランに移し、αDBPモノクローナル抗体B6を用いECL検出システムによってDBPタンパク質を可視化した。pcDNA3tsE2Aトランスフェクション由来の細胞株全てが72kDaのE2AをコードしたDBPタンパク質を発現することを示す（左段のパネル、レーン４〜１４；中段のパネル、レーン１〜１３；右段のパネル、レーン１〜１２）。対照的に、pcDNA3wtE2Aトランスフェクション由来の細胞株はDBPタンパク質を発現することができなかった（左段のパネル、レーン２）。pcDNA3トランスフェクション由来の細胞株からの抽出物ではDBPタンパク質が検出されず（左段のパネル、レーン１）、負のコントロールとして用いた。PER.C6細胞の抽出物はpcDNA3ts125によって過渡的にトランスフェクションされ（左段のパネル、レーン３）、ウェスタンブロット法の正のコントロールとして用いた。これらのデータは、wtE2Aの構成的発現が細胞毒性を有し、またこの毒性がE2Aのts125突然変異株を用いることによって回避することができることを確証している。 PER.C6ts125E2A C5-9の懸濁増殖である。細胞株PER.C6tsE2A.c5-9を無血清Ex-cellTMの懸濁液で培養した。示した時期において、細胞をBerker細胞計数器で計数した。８つの独立した組織培養の結果を示す。PER.C6tsE2Aは、無血清Ex-cellTM培地の懸濁液で良好に増殖する。 PER.C6およびPER.C6tsE2Aの増殖曲線である。PER.C6細胞またはPER.C6ts125E2A（c8-4）細胞をそれぞれ３７℃または３９℃で培養した。０日目、全体で1×106の細胞を25cm2組織培養フラスコ（Nunc）に播種した。示した時期において、細胞を計数した。３７℃におけるPER.C6細胞の増殖は３９℃におけるPER.C6ts125E2A c8-4の増殖に匹敵した。これは、ts125E2Aの構成的過剰発現は、非許容温度である３９℃において細胞の増殖に対して逆効果を有していないことを示している。 PER.C6ts125E2Aの安定性である。幾つかの継代に対し、PER.C6ts125E2A細胞株クローン8-4を３９℃で、G418を含まない培地中で培養した。等量の全細胞抽出物を１０％ゲル上でSDS-PAGEによって分画化した。タンパク質をImmobilon-Pメンブランに移し、αDBPモノクローナル抗体B6を用い、ECL検出システムによってDBPタンパク質を可視化した。少なくとも１６継代にわたり、ts125E2AをコードしたDBPの発現は安定であった。これはおよそ４０細胞倍加に相当する。この培養時間においてDBPレベルの減少は観察されず、G418選択圧が無い場合においてさえもts125E2Aの発現が安定であることが示された。 図３５Ａはハイグロマイシン耐性のPER.C6/tTA細胞（Ａ）におけるtTA活性である。１６の独立なハイグロマイシン耐性PER.C6/tTA細胞コロニーと２３の独立なハイグロマイシン耐性PER/E2A/tTA細胞コロニーとを10cm2ウエルで増殖し手準集密的にし、２μｇのpUHC 13-3（7xtetOプロモーターの制御下でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを含有するプラスミド）でトランスフェクトした。細胞培養液の半分をドキシサイクリンの入っていない培地中に維持し、tTAの活性を阻害した。トランスフェクション後４８時間で細胞を収穫し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性はタンパク質１μｇ当たりの相対発光量で示す。 図３５ＢはPER/E2A/tTA細胞（B）におけるtTA活性である。１６の独立なハイグロマイシン耐性PER.C6/tTA細胞コロニーと２３の独立なハイグロマイシン耐性PER/E2A/tTA細胞コロニーとを10cm2ウエルで増殖し手準集密的にし、２μｇのpUHC 13-3（7xtetOプロモーターの制御下でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを含有するプラスミド）でトランスフェクトした。細胞培養液の半分をドキシサイクリンの入っていない培地中に維持し、tTAの活性を阻害した。トランスフェクション後４８時間で細胞を収穫し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性はタンパク質１μｇ当たりの相対発光量で示す。
典型的に、本発明の生産物は、例えばアデノウイルス5、典型的にはアデノウイルス35に基づくベクターに使用可能なパッケージング細胞において製造することができ、他のアデノウイルス、例えば、アデノウイルス2及び/又は5のものと同様の方法で生産及び/又は使用する事ができる。最小のベクター、パッケージング系、細胞内増幅、ベクター及びプラスミドベース系の可能性の良好な概要は、ここで参照として組み込む出願人の同時係属出願(PCT／NL99／00235及びPCT／NL96／00244)において見出すことができる。どのウイルス運搬系もウイルス運搬できるような本発明による因子を与えていない。
両方の種類の系は、多くの異なるセットアップにおいて当業界において周知であり、それゆえ、ここでさらなる説明は必要としない。多くの異なる系及びそれらの特性に関する概要は、ここで参照により組み込むRobbins, Ghivizzani (1998)及びPrince(1998)において見出すことができる。
典型的に遺伝子運搬担体は、興味ある核酸を含む。興味ある核酸は、遺伝子、又は(遺伝子が発現可能ないずれかの核酸である)遺伝子の機能的部分、遺伝子の前駆体、又はいずれかの核酸レベル(DNA及び/又はRNA、すなわち2本鎖又は1本鎖)において転写された遺伝子とすることができる。興味ある遺伝子は、当業界において既知であり、治療タンパク質をコードするもの、例えば、TPA、EPO、サイトカイン、抗体、又はその誘導体などを典型的に含む。遺伝子治療において適用される治療タンパク質の概要を以下にリストする。
腫瘍特異的抗原、サイトカインなどの免疫刺激因子、 抗血管因子、限定する例ではないが、エンドスタチン、アンジオスタチン、ATF-BPTI CDT-6、優勢なマイナスVEGF突然変異体など。
血管因子、限定する例ではないが、VEGF、線維芽細胞増殖因子、一酸化窒素シンターゼ、C型ナトリウム排泄増加ペプチド、など。
さらに、炎症促進サイトカインのアンタゴニスト、例えば、IL−１RA(受容体アンタゴニスト)、及びsIL−１RI、ｓIL−IRII、ｓTNFRI及びｓTNFRIIなどの可溶性受容体を使用することができる。
可溶性CD40、FasL、IL-12、IL-10、IL-4、IL-13等の炎症阻害タンパク質、CD４、CD５、CD７、CD52、Il-2、IL-1、IL-6、TNF,などの分泌された単一鎖抗体又は、自動反応T細胞上のT細胞受容体への分泌した単一鎖抗体。
PMLの優勢マイナス突然変異体を免疫反応を阻害するのに使用することができる。
さらに、たとえば、IL-1RA(受容体アンタゴニスト)、及びsIL−１RI、sIL-1RII、sTNFRI及びsTNFRIIのような可溶性受容体等の炎症促進サイトカインのアンタゴニストを使用することができる。
ceNOSm, Bc13, カクタス、及びIκBα、β、又はγ等の成長及び/又は免疫反応阻害遺伝子、鳥貧血ウイルスのVP3タンパク質などのアポトーシス誘導タンパク質も使用することができる。さらに、HSV−TKなどの自殺遺伝子、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、及びレナメラーゼを使用することができる。
興味ある核酸は、宿主細胞に存在する核酸配列とハイブリダイズすることが可能な核酸とすることができ、それによって、前記核酸の発現、転写、又は翻訳を抑制する。協調した抑制を通してもブロックすることができる。つまり、興味ある核酸は、それが、その細胞による反応を誘導するために、細胞を生産したいと欲するいずれかの核酸であり、そのような反応は、タンパク質の生産、そのようなタンパク質の阻害、アポトーシス、壊死、増殖、違いなどかもしれない。
本発明は、治療用途用のアデノウイルス３５又はその機能的相同物を開示するための最初のものであり、したがって、本発明は、薬剤として使用するためのアデノウイルス血清型３５、又はその機能的相同物、又はそれら由来のキメラウイルス、又は前記ウイルス、その相同物、又はそのキメラに基づく遺伝子運搬担体を提供する。本発明の血清型は、アデノウイルス３５であり、それ自体は当業界において既知である。後天性免疫不全症候群及び他の免疫不全障害を持つ患者から単離するアデノウイルスは、一般的でないグループBである(Flomenberg et al, 1987 ,De Jong et al, 1983)。Ad35は、病原特性に関してより完全に特徴付けられたサブグループC(Ad2及びAd５を含む)から異なることが示された(Basler et al。この違いは、Ad35のE3領域における違いと相互に関連する可能性があることが示唆された(Basler et al、1996)。Ad35のDNAは、一部クローン化され、マップ化された(Kang et al、1989a and b、Valderama−Leon et al、1985)。
34及び35などのB型アデノウイルス血清型は、他の血清型と異なるE3領域を有する。典型的にこの領域は、アデノウイルス産物への免疫反応を抑制することと関係する。したがって、本発明は、本発明による遺伝子運搬担体を提供し、それによって、前記因子は、免疫反応回避又は消滅することに関連して、アデノウイルス35 E3 発現産物又はそれらをコードする遺伝子又はいずれか若しくは両方の機能的同等物を含有する。
免疫反応に関連するアデノウイルスの別の部分は、キャプシド、特にタンパク質及び/又はヘキソンタンパク質である。したがって、本発明は、本発明による遺伝子運搬担体を提供し、そのために、因子は、少なくとも1つのアデノウイルス35キャプシドタンパク質又はその機能的部分、例えば、繊維、ペントン、及び/又はヘキソンタンパク質、又はそれらの少なくとも1つをコードする遺伝子を含有する。免疫反応に対して関連する全てタンパク質が、アデノウイルス35(又はその機能的相同物)起源である必要はない。アデノウイルス繊維、ペントン又はヘキソンタンパク質の一部を別の繊維、ペントン、又はヘキソンの中に挿入することも明白に可能である。したがって、キメラタンパク質が得られる。
あるアデノウイルスのペントン、別のものからのヘキソン、さらに別のアデノウイルスからの繊維、又はE3領域を有することも可能である。本発明によれば、それらをコードするタンパク質又は遺伝子の少なくとも1つは、アデノウイルス35又はその機能的相同物由来の因子からなり、そのために前記因子は、宿主の免疫反応に効果を有する。したがって、本発明は、少なくとも1つの他のアデノウイルスを有するアデノウイルス３５のキメラである本発明による遺伝子運搬担体を提供する。この方法において、生じたウイルスを他の側面において免疫反応のみを変更することもできる。その代わりに有益な因子で感染の効率を高めることができる。パッケージング細胞での複製を高めたり、そのトロピズムを変えることができる。
したがって、本発明は、例えば、アデノウイルス35と異なるトロピズムを有する遺伝子運搬担体を提供する。もちろん、トロピズムは、遺伝子運搬担体が、宿主細胞、すなわち、標的細胞の下位集団へ優先的に運搬されるように好ましく変化させるべきである。本発明においてアデノウイルス又は他の遺伝子運搬担体を適用することもできるトロピズムの変更及び他の変更は、ここで参照として組み込む出願の同時係属出願に開示されている(Nos. 98204482.8、99200624.7、及び98202297.2)。もちろん、本出願は、例えば、本発明の遺伝子運搬担体及び/又はキメラになるために必要な及び／又は役立ついかなる全ての基礎的要素も提供する。これは、Ad35又はその機能的相同物に適合されないが、PER.C6(ECACC寄託番号96022940)などの細胞、又はそれを基礎とした細胞などのパッケージング細胞を含む。それは、アデノウイルス35又はその機能的相同物の機能的部分、例えば、ITRなどの興味ある遺伝子を含有するベクターはもちろん、ヘルパー構築物、及びパッケージ構築物などをコードするいずれの核酸も含まれる。
典型的には、ここで参照として組み込む出願人の出願(PCT/NL96/00244)は、創作された遺伝子運搬担体を達成するのに必要で有益な因子を開示する。したがって、本発明は、本発明による遺伝子運搬担体、又は本発明によるウイルス、相同物、そのキメラの少なくとも機能的部分をコードする核酸も提供する。
本発明によれば、生じた遺伝子運搬担体となるであろう機能をコードする当該因子は、遺伝子が運搬されるべき宿主によるアデノウイルス因子に対する中和活性を回避又は消滅することを担う、アデノウイルス血清型３５又はその機能的同等物の少なくとも1つをコードする核酸を含有するか、又は当該核酸によってコードされなければならない。
典型的には、興味ある遺伝子は、同様の核酸に存在し、それは、当該核酸がそのような遺伝子を有するか、その中に興味ある遺伝子を導入する部位を有することを意味する。
典型的には、当該核酸は、少なくとも1つのITR及びもしそれがパッケージングすべき核酸ならパッケージングシグナルも含有する。しかしながら、以前に述べたように、本発明のための全ての必要で役立つ因子及び/又は基礎的要素は、出願人の出願(PCT/NL96/00244)に見出すことができる。アデノウイルス遺伝子運搬担体の分野における更なる改善の一組は、以前にここで述べたPCT/NL99/00235に開示された出願人のプラスミド系である。この系は、1つの実施態様において、共に遺伝子運搬担体に組み込まれた核酸の全ての因子を含有するアダプタープラスミド及びより長いプラスミドの相同組み換えとして機能する。これらの方法は、本創作遺伝子運搬担体及びそれらの基礎的要素に適用することもできる。
したがって、本発明は、好ましくは、本発明による核酸を含有する2つの核酸の少なくとも1組の部分として、さらに相同組み換え用に設計し使用するヌクレオチドの領域を含有する本発明による核酸を提供し、そのために、前記核酸の１組は、互いに単一相同組み換え可能であり、機能的遺伝子運搬担体をコードする核酸となる。
パッケージされるべき本発明によるベクターを含む細胞はもちろん、 (本発明による遺伝子運搬担体を生産するためのパッケージされるべきベクターを、なお導入され生産されなければならない) 両方のからのパッケージング細胞を提供する。それゆえ、本発明は、本発明による核酸又は本発明による核酸の１組を含む細胞も包含し、好ましくは、パッケージされるべき核酸、又は本発明による核酸の1組から欠くアデノウイルス複製用に必要な因子を補足する細胞である。本発明において、翻訳において、アデノウイルス5タンパク質を与える細胞の複製能を欠く、E1欠如したアデノウイルス３５ベクターを見出した。したがって、本発明は、翻訳においてアデノウイルス３５E1タンパク質を提供する能力を有する細胞を更に提供する。当該細胞は、典型的には、網膜又は腎臓から引き出したヒト細胞である。羊水細胞(amniocyte)などの胚細胞は、E1補足細胞カブの発生に特に適することが示された。そのため当該細胞は、本発明において好ましい。E1タンパク質による血清型特異的相補性は、E1領域によってコードされる1又はそれ以上のタンパク質のためであるということができる。そのため、少なくとも血清型特異的タンパク質を翻訳の際に相補性細胞株を与えることは本質的なことである。E1欠如アデノウイルスの効果的な相補性のために本質的な非血清型特異的E1タンパク質を他のアデノウイルス血清型から引き出すことができる。好ましくは、アデノウイルス35のE1B領域由来の少なくともE1タンパク質を翻訳においてE1欠如アデノウイルス３５系ベクターを補足するために提供する。1つの実施態様において、1又はそれ以上の血清型特異的E1タンパク質をコードする核酸を、PER.C6細胞又はPER.C６細胞(ECACC寄託番号96022940)由来の細胞、又はAd35又はその機能的相同物由来の因子を補足する同様のパッケージング細胞の中へ導入する。本既に言及したように、本発明は、本発明による細胞において本発明の核酸を発現し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することからなる本発明による遺伝子運搬担体を生産するための方法を含む。上記は、からのパッケージング細胞を関連核酸で充填することに関する。充填した細胞の構成は、もちろん本発明の一部であり、本発明による充填したパッケージ細胞(生産細胞)を適当な培地で培養し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することからなる、本発明による遺伝子運搬担体の製造方法を提供する。
本発明によるいかなる方法によって得られた生成遺伝子運搬担体、特に、アデノウイルス及び組込みウイルスのキメラ由来の本発明による遺伝子運搬担体も、もちろん本発明の一部である。アデノウイルス遺伝子運搬担体は、通常宿主ゲノムに組み込まれないのは周知である。長期間の宿主細胞内での遺伝子の発現について、そのような能力を有するキメラを調製することは好ましい。当該キメラは、ここで参照として組み込む、出願人の同時係属出願PCT/NL98/00731に開示されている。アデノウイルスと組込みウイルスの当該キメラの好適な例としては、前記組込みウイルスが、アデノ随伴ウイルスである。ここで以前に述べたように、上記と組み合わせることもできる他の役立つキメラは、変更したトロピズムを有する(全タンパク質又はその一部又は両方を交換している)キメラである。その好適な例は、おそらく、例えばAd2又はAd５由来の因子を持つAd35及びAd16のキメラであり、Ad16又はその機能的同等物の部分を決定するトロピズムを、遺伝子運搬担体をここで参照として組み込むシノビオサイト(synoviocyte)及び/又は平滑筋細胞(出願人の同時係属出願nos .98204482 . 8及び99200624.7)へ誘導するのに使用することができる。樹状細胞(DC)、造血幹細胞(HSC)遺伝子運搬担体由来のAd２又はAd5と容易に形質導入しない。本発明は、DC細胞及びHSC細胞の向上した形質導入能力を持つ遺伝子運搬担体を提供する。このような遺伝子運搬担体は、Ad35アデノウイルスの部分を決定する組織トロピズムを含む。それゆえ、本発明は、樹状細胞及び／又は造血幹細胞を形質導入するためのアデノウイルス35キャプシドの部分を決定する組織トロピズムの使用を提供する。他のB型アデノウイルスも適する。組織トロピズム決定部分は、少なくとも繊維タンパク質のノブ及び/又はシャフトを含む。もちろん当業者にとって繊維タンパク質中の組織トロピズムを担うアミノ酸配列を決定することは、明白に可能である。当該知識は、このようなアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を構築するのに使用することができる。そのために、このようなキメラタンパク質も本発明の一部である。DC細胞は、細胞を与える非常に有効な抗原である。遺伝子運搬担体を当該細胞に導入することによって、宿主の免疫系を特異的な抗原へ誘発することができる。このような抗原は、DCへ運搬された核酸又はそれ自身で遺伝子運搬担体のタンパク質によってコードすることができる。
したがって、本発明は、ワクチンとして宿主免疫系へ上手く達成し得る能力を有する遺伝子運搬担体も提供する。ベクターは、それが標的細胞を効率的に見つけるために十分長い間、免疫系を回避する能力を有し、同時に、特異的抗原を抗原存在細胞へ運搬する能力を有し、それによって、特異的抗原に対する効率的な免疫反応の誘導及び/又は刺激を可能とする。免疫反応を効率よく調節するために、遺伝子運搬担体は、免疫反応を調節する能力を有する当該タンパク質をコードするタンパク質及び／又は核酸を含有する。当該タンパク質の限定されない例は、インターロイキン、粘着分子、同時刺激タンパク質、インターフェロンなどのなかに見られる。したがって、本発明は、さらに本発明の遺伝子運搬担体を含有するワクチンを提供する。さらに、本発明は、DC及び／又はHSC、少なくともアデノウイルス血清型35の部分を決定する組織トロピズムを含有する担体を効率的に形質導入する能力を持つアデノウイルスベクターを提供する。さらに、本発明はHSC及び/又はDC細胞の形質導入用の遺伝子運搬担体の使用を提供する。同様の組織トロピズムは、他のアデノウイルス血清型B、特に血清型１１にも見られ、これもまた本発明の部分である。もちろん、組織トロピズム決定部分を有する他の遺伝子運搬担体を提供することも可能であり、それによって、向上したDC及び/又はHSC形質導入能力を有する当該運搬担体を生産する。そのため、そのような遺伝子運搬担体も本発明の一部である。
本発明による遺伝子運搬担体は、関心ある遺伝子又は核酸を宿主細胞へ運搬するのに使用することができる。これは典型的に、薬剤的使用であろう。そのような使用も本発明に含まれる。そのような使用に適当な組成物も本発明の一部である。投与当たり又は感染当たりに存在すべき必要な遺伝子運搬担体の量(m.o.i)は、治療すべき状況、投与経路(典型的に非経口)、被験者、感染の効率など、に依存する。適量決定研究は、当業界において周知であり、他の(アデノウイルス)遺伝子運搬担体で既に行なわれているものを、本発明の遺伝子運搬担体の適当な投与量を見つけるための案内として典型的に使用する事ができる。典型的には、これは、ある人が適当な賦形剤、適当な投与手段、所望しない担体の感染を防ぐ適当な手段などを見出すことができるということである。したがって、本発明は、本発明によるアデノウイルス、そのキメラ、又はその機能的相同物と、賦形剤とを含有する薬剤配合物はもちろん、本発明による遺伝子運搬担体と、適当な賦形剤とを含有する薬剤配合物も提供する。
上述したように、大部分の広範に研究されたアデノウイルスの血清型は、追加の遺伝物質を宿主に運搬するのに理想的に適していない。これは、部分的には、これらの血清型に対する集団の間に予め存在する免疫のためである。ヒトにおいて予め存在する抗体のこのような存在と、ウイルスに対する強い二次的体液性及び細胞性免疫反応との組み合わせは、アデノウイルス遺伝子治療に影響を与えるであろう。
本発明は、遺伝子治療ベクターとして非常に適するアデノウイルスの血清型及びその機能ある相同物の少なくとも因子の使用を提供する。本発明は、多くの個体由来の血清に対して自動化高スループットスクリーニングも開示する。驚くべきことに、中和能力は、ある特定の血清型、アデノウイルス35(Ad)に対して評価されたいずれの血清においても見出されない。これは、ヒトにおける遺伝子治療用ベクター系として極めて有益な本発明の血清型を作る。当該ベクター系は、予め存在する免疫の本来的な問題なしに、遺伝物質を効率的にヒト細胞へ運搬する能力がある。
典型的には、ウイルスは、アデノウイルスベクター(典型的には、プラスミド、コスミド、バキュロウイルス)を使用して生産される。もちろん当該ベクターも、本発明の一部である。本発明は、E1領域を削除するか、不活性化することによって複製欠陥を与えられたアデノウイルス由来ベクターも提供する。もちろん、興味ある遺伝子を例えばベクターが引き出されたオリジナルのアデノウイルスのE1領域の部位で挿入する事もできる。
本発明の全ての側面において、アデノウイルスは、E1領域の欠損、及びプロモータにどちらか、あるいはどちらも結合しない異質遺伝子の挿入を含むことができる。さらに、アデノウイルスは、E2、E3、又はE4領域の欠損しているもの。プロモーターに結合した異質遺伝子を挿入しているものも含まれる。この場合において、E2及び/又はE4補足細胞株も組み換えアデノウイルスを生成するために要求される。
ある者は、遺伝子治療に使用すべき組み換えアデノウイルスの調製用にAd35 血清型それ自体を使用して選択することができる。あるいは、ある者は、当該組み換えアデノウイルスにおいて本発明の血清型由来の因子を使用するのに選択する事ができる。ある者は、例えば、異なる血清型から所望の特性を組み合わせたキメラアデノウイルスを開発する事ができる。いくつかの血清型は、幾分宿主の範囲に限定されるが、より少ない免疫源の利益を有し、いくつかはその他の回避法である。いくつかは、限られた病毒性の問題を有するが、広範な宿主範囲及び／又は減少した免疫原性を有する。当該キメラアデノウイルスは、当業界において既知であり、それらは本発明の範囲内にあることを意味する。したがって、１つの実施態様において、本発明は、予め存在する免疫を無くす、少なくとも本発明の血清型のアデノウイルスの一部、及び少なくとも別のアデノウイルス血清型由来のアデノウイルスゲノムを含有するキメラアデノウイルスを提供する。この方法において生産されたキメラアデノウイルスは、本発明の血清型の予め存在する免疫を欠如したものを別の血清型の他の特性へ組み合わせたようなものである。このような特性は、温度安定性、組み立て性、固着性、変更した感染、生産収率、変更又は改善した感染、標的細胞中のDNAの安定性などかもしれない。
一般に、パッケージング細胞は、十分な量のアデノウイルスを生産するために必要とされるであろう。遺伝子治療目的の組み換えアデノウイルスの生産のために、いくつかの細胞株を利用することができる。これらは限定されないが、既知の細胞株PER.C6(ECACC 寄託番号96022940)、911,293、及びE1 A549を含む。
本発明の重要な特徴は、アデノウイルスを生産する手段である。典型的には、複製コンピタントアデノウイルスを含むために臨床的用途用にアデノウイルス バッチを欲しない。それゆえ、一般的には、アデノウイルスベクターにおいてアデノウイルスゲノムから多量の遺伝子(少なくとも1つ)を省略すること、及びベクターがキメラアデノウイルスを生産するのに持ってきた細胞のゲノム中にこれらの遺伝子を供給することが望ましい。当該細胞は通常パッケージング細胞と呼ばれる。したがって、本発明によるアデノウイルスベクターに存在しないアデノウイルス生産用に必要な全ての因子を翻訳において含む、本発明によるアデノウイルス(遺伝子運搬担体)を生産するためのパッケージング細胞も提供する。典型的には、ベクター及びパッケージング細胞は、それらが全ての必要な因子を有する点で互いに適合されなければならないが、それらは重複因子を有さず、組み換えによって複製コンピタントウイルスを誘導する。それゆえ、本発明によるパッケージング細胞及び本発明による組み換えベクターを含有する部分のキットを提供し、そのため組み換えを導入する配列重複がないことが本質的であり、前記細胞と前記ベクターとの間の複製コンピタントアデノウイルスの生産を生じる。
それゆえ、本発明は、適用上で予め存在するヒト免疫を回避するであろうアデノウイルスの製造方法であって、事実上天然の免疫が存在しないアデノウイルス血清型由来の因子を持つベクターを提供し、前記ベクターを本発明によるパッケージング細胞へ移入し、ウイルスの粒子を生産することを可能とする方法を提供する。
１つの側面において本発明は、治療用途用に生体内で投与したアデノウイルスに対して、自然に存在するか又は誘導された、中和宿主活性を克服するための本発明のアデノウイルス血清型の使用を記載する。新規血清型への必要性は、１)組み換えアデノウイルス血清型５の繰り返しの組織の運搬は、組み換えアデノウイルス血清型５に対する中和抗体の高い力価の形成のために成功しない(Schulick et al、1997)こと、2)予め存在するヒト免疫は個体間に広がっていること、という観察によって抑制される。
別の側面において、本発明はワクチン注射目的用の本発明の遺伝子運搬担体の使用又はアデノウイルス血清型３５の使用を提供する。このような使用は、少なくともある程度宿主の望ましくない免疫反応を妨げる。
所望しない免疫反応の限定しない例は、遺伝子運搬担体又はアデノウイルス血清型に対する免疫反応を呼び起こすこと、及び／又は遺伝子運搬担体又はアデノウイルス血清型35に対する免疫反応の向上である。本発明の別の側面において、別の使用は、異なるサブグループに属するAdベクターからなる。したがって、本発明のこの側面は、遺伝子治療目的用のアデノウイルス投与を繰り返さないようにすることに取り組んでいる。
実施例１
ヒト血清における中和活性の検出用高スループット測定
全てのウイルス血清型に対する、中和抗体の存在のために多量のヒト血清をスクリーニングするために、自動化96ウエル測定を開発した。
ヒト血清
100個体のパネルを選択した。被験者(50％男性、50％女性)は、人種に制限されない20〜60の間の健康的な個体であった。全ての被験者は同意書にサインをした。アデノウイルス研究に専門的に従事する人々は除外された。
約60mlの血液を乾燥チューブ中に引き込んだ。サンプリング後2時間以内に、血液を2500rpmで10分間遠心分離した。約30ml血清をポリプロピレンチューブに移し、さらに使用するまで−20℃で冷凍保存した。
血清を解凍し、56℃で10分間熱不活性化し、その後、繰り返しの冷凍/解凍サイクルを避けるために部分標本とした。部分標本は、約70個の96ウエルプレートを調合するのに十分な量で、培地(DMEM、Gibco BRL)において2倍希釈の5段階工程を作るのに使用した。希釈していない血清及び希釈した血清の部分標本を深いウエルプレート(96-ウエルフォーマット)の中へ滴下し、プログラムされたプレートメートを使用して100μl部分標本を96-ウエルプレートの中に分配した。この方法でプレートを、以下のスキームに従いデュプロ(duplo )(100μl/well) で8つの異なる血清を満たした。
Figure 2011224014
カラム1及び6中のS1/2〜S8/２は、1×希釈した血清を示し、Sx/４、Sx/８、Sx/１６及びSx/３２は2倍希釈を示す。最後のプレートは、マイナスの対照例として100μl子牛血清を満たした4つのウエルも含む。プレートをさらに使用するまで−20℃に保持した。
ヒトアデノウイルスストックの調製
全ての既知ヒトアデノウイルスのプロトタイプを、PER.C6 細胞(ECACC寄託番号96022940)(Fallauz et al．、1998) で播種したT25フラスコでインキュベーションして、完全なCPEを収穫した。冷凍/解凍後、1-2mlの粗い溶解物をPER．C6細胞(ECACC寄託番号96022940)をT80フラスコに播種するのに使用し、ウイルスを完全なCPEで収穫した。CPEの接種と出現との間の時間枠、ウイルスの量は、異なる血清型間の新しい培地に再感染するために必要とした。アデノウイルスストックを冷凍/解凍によって調製し、3-4T175cm2 3層フラスコにPER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)を播種するために使用した。CPEが発生した際に、細胞をフラスコを軽く叩いて収穫し、滴下し、ウイルスを、2段階CsCl勾配によって以下のように単離、精製した。
細胞ペレットを50ml10mMNaPO4緩衝液(pH7.2)に溶解し、−20℃で冷凍した。37℃で解凍後、5.6mlデオキシコール酸ナトリウム(5％w/v)を加えた。溶液を穏やかに混合し、5-15分間37℃でインキュベートし完全に細胞を溶解した。溶液を均質化した後、1875μl１MMgCl2を加えた。375μlDNアーゼ(10mg/ml)の添加後、溶液を30分間37℃でインキュベーションした。細胞残骸を1880xgで30分間RTで停止することなく遠心分離して取り除いた。次に、上清をタンパク質からフレオンを摘出して清浄にした(3x)。清浄にした上清を１Mトリス/塩酸緩衝セシウムクロライド ブロック勾配(範囲1.2/1.4 gr/ml)にのせ、21000rpmで2.5時間10℃で遠心分離した。1.33gr/mlのセシウムクロライドの１Mトリス/塩酸緩衝連続勾配を使用して、第２の精製を行なった後、ウイルスバンドを単離した。その後、ウイルスを17時間55000rpmで10℃で遠心分離した。ウイルスバンドを単離し、スクロース(50％w/v)を１％の最終濃度へ加えた。過剰なセシウムクロライドを、CaCl2(0.9mM)、MgCl2(0.5mM)及び増加させた濃度のサッカロース(1、2、5％)を補った1.5 ltr PBSに対して透析スライド(Slide−a−lizer、カットオフ10000kDa、Pierce、USA)中で透析によって除去した。透析後、ウイルスを−85℃で貯蔵して25と100μllの部分に部分標本した後、ウイルスをスライドアライザー(Slide a lizer)から除去した。
1ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を決定するために、50μlのウイルスバッチを、shabram et al(1997)に記載されたように、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にかける。０〜600mMの範囲のNaCl勾配を使用してウイルスを溶出した。表１に述べたように、ウイルスは、NaCl濃度で血清型間でかなり異なって溶出した。
大部分のヒトアデノウイルスは、2，3の例外を除き、PER．C6細胞(ECACC寄託番号96022940)によく複製した。アデノウイルス型8及び40を911-E4細胞上で成長させた(He et al．、1998)。精製したストックは、５×1010と5×1012ウイルス粒子/ml(VP/ml表1参照)の間で含んでいた。
精製したヒトアデノウイルスストックの滴定
アデノウイルスをPER.C6(ECACC寄託番号 96022940)細胞上で滴定し、5日間の中和測定期間で完全なCPEを得るのに必要なウイルスの量を決定した。これに関して、100μl培地を96ウエルプレートの各ウエルの中へ分配した。10４、105、106、107倍に予め希釈した25μlのアデノウイルスストックを96ウエルプレートのカラム２に加え、10回のピペット上げ下げによって混合した。その後、25μlをカラム2からカラム３へ持っていき、再び混合した。これをカラム１１から25μlを処分した後、カラム11まで繰り返した。このように5工程でいくつか希釈したものを予め希釈したストックから得られ始めた。その後、3×104PER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)を、100μl体積で加え、プレートを37℃で、5％CO2で5又は6日間インキュベートした。CPEを顕微鏡でモニターした。RoadとMuenschの方法を使用して細胞培養阻害量50％(CCID50)を計算した。
並行して同一のプレートをセットアップしMTT測定（Promega）を使用して分析した。この測定において生存する細胞を、比色分析染色によって定量した。ここに、20μlMTT(PBS中の7.5mgr/ml)をウエルに加え、37℃で、５％CO2下2時間インキュベートした。上清を取り除き、100μlの20:1イソプロパノール／トリトン-X100溶液をウエルに加えた。促進させた染色を溶解するのに、プレートを3〜5分間96-ウエルシェイカー上に置いた。吸光度を540nmと690nm(バックグランド)で測定した。この測定によって進行中のCPE又は完全なCPEを有するウエルを区別することができる。
中和測定
希釈したヒト血清サンプルを有する96ウエルプレートを37℃で、5％CO2下で解凍した。50μl当たり200CCID50へ希釈したアデノウイルスストックを調製し、50μl部分標本を血清を有するプレートのカラム1〜11へ加えた。プレートを1時間37℃で５％CO2下でインキュベートした。
その後、６×105/mlの50μlPER、C6細胞(ECACC寄託番号96022940)を全てのウエルに調剤して、1日37℃で5％CO2下でインキュベートした。各列に対して清潔なピペットチップを用いて上清を除去し、血清の毒性影響を避けるために200μlの新鮮な培地をすべてのウエルに加えた。プレートを別に4日間37℃で5％CO2下でインキュベートした。加えて、類似の対照例プレートをデュプロ(duplo)において、列A及びBにおいて試験した各血清型に特異的なウサギに発生し希釈したプラスの対照例血清、及び列C及びDにおいてマイナスの対照例血清(FCS)を用いて、セットアップした。列E-Hのそれぞれにおいて滴定を、上で述べたように試験すべき各ウイルスの200CCID50で始まる5倍希釈工程で行った。
5日目に対照例プレートの1つを顕微鏡とMTT測定で分析した。試験的な力価を顕微鏡観察した対照例滴定プレートから計算した。
もしCPEが完全に検出されれば、すなわち、MTTによって分析された対照例力価実験での最初の希釈は、明白な細胞死を示すなら、すべての測定プレートは処理されている。もし違うなら、全てのプレートを進行させた後完全なCPEが明白になるまで1日又はそれ以上の日数処理させた。殆どの場合測定を5日間で終了した。Ad１、5、33、39、42及び43に対して、測定を6日間行い、d2に対して8日間であった。
最も高い血清濃度で、血清なしの対照例に比較して40％見られたとき、血清サンプルを中和性なしと見なす。100健康被験者からの血清に対して44プロトタイプアデノウイルスの分析結果を図1に示す。予想したように、Ad２及びAd5への中和抗体を含む血清サンプルの割合は非常に高かった。これは、大部分のより低い数のアデノウイルスに対して本当である。驚くべきことに、どの血清サンプルもアデノウイルス血清型35への中和抗体を含まなかった。血清型26,34、及び48への中和抗体力価を持つ個体の数は、非常に低かった。
そのため、Ad35又は他の上述した血清型に基づく組み換えE1欠如アデノウイルスは、中和抗体によるウイルスの一掃に関してAd５に基づく組み換えベクターに比較して重要な利点を有する。
Ad35又は他の血清型の1つの相当するキャプシドタンパク質(の部分)によって置換した宿主の免疫源反応を伴うキャプシドタンパク質(の部分)を有するAd5系ベクターは、膨大なヒト血清によって中和され、少ないか等しくはないであろう。
表１に見られるように、ml当たりのウイルス粒子から計算したVP/CCID50の割合と、実験において各ウイルスに対して得られたCCUD50は、かなり多様であり、0.4〜5logの範囲であった。これは、PER．C6細胞(ECACC寄託番号96022940)の異なる感染効率及びウイルスの複製効率における違いによっておそらく引き起こされる。さらにバッチの特性も重要な役割を演じるかもしれない。高いVP/CCID50率は、多くのウイルスが5日間CPEを得るためにウエル上に置かれたことを意味する。結果として、より多くの(不活性)ウイルス粒子が抗体を防御したので、中和試験の結果は偏るかもしれない。この現象が生じるかどうかをチェックするために、VP/CCID50割合を、測定においてプラスに見られた血清サンプルの割合に対してプロットした(図2)。図は、測定におけるウイルスの量と血清中の中和との間に否定的な相関関係がないことを明白に示す。
実施例２
組み換えウイルスの生産用のAd5プラスミドベクターの発生と、アデノウイルス遺伝子の容易な操作
pBr/Ad.Bam-rITR(ECACC寄託番号p97082122)
ITR配列の平滑末端クローニングを容易にするために、野生型ヒトアデノウイルス型５(Ad5)DNAをクレノウ酵素で過剰のdNTPの存在下で処理した。クレノウ酵素による不活性、フェノール／クロロホルム抽出による精製、次いでエタノール調製の後、DNAをBamHIで消化した。このDNA調製物を、以下のように調製したpBr322由来ベクターDNAとのくくり反応においてさらに精製することなしに使用した。すなわち、pBr322 DNAをEcoRV及びBamHIで消化し、TSAP酵素(Life Technologies)で処理することによって脱リン酸化し、LMPアガロースゲル上で精製した(SeaPlaque)。コンピタントE.coli DH5α(Life Techn.)の中へ形質転換し、アンピシリン耐性コロニーの分析の後、Ad5のBamHI部位から右のITRへ広がる挿入物に対して予期されたような消化パターンを示す1つのクローンを選別した。
右のITRのクローニング境界の配列分析は、ITRの大部分の３‘G残基が間違っていて、ITRの残りは、正しいと判明した。前記間違いのG残基は、他のITRによって複製中に補う。
pBr/Ad.Sal-rITR（ECACC寄託番号p97082119）
pBR/Ad.Bam-rITRをBamHI及びSalIで消化した。アデノウイルス挿入物を含むベクター断片をLMPアガロース(SeaPlaque GTG)で単離し、wt Ad５DNA由来の4.8kb SalI―BamHI断片へくくり、Geneclean IIキットを精製した(Bio 101、Inc.)。1つのクローンを選択し、完全なAd５配列を制限酵素分析によって決定した。クローンpBr/Ad.Sal-rITRは、bP16746でSaiL部位からアデノ型5配列を含み、 (大部分の３‘G残基を欠く) rITRを含む。
pBr/Ad.Cla-Bam(ECACC寄託番号P97082117)
wtアデノ型５DNAを、ClaI及びBamHIで消化し、20.6kb断片を電気溶出によってゲルから単離した。pBr322を同じ酵素で消化し、アガロースゲルからGenecleanによって精製した。両方の断片をコンピタントDH５αの中へくくり形質転換した。生じたクローンpBr/Ad. Cla―Bamを制限酵素消化によって分析し、bp919から21566までのアデノウイルス配列を持つ挿入物を含むように示した。
pBr/Ad.AflII-Bam(ECACC寄託番号P97082114)
pBr/Ad.AflII−BamをEcoRI(pBrにおいて)で直線状にし、AflIIで一部消化した。AflIIを20分間65℃で加熱不活性化後、断片末端をクレノウ酵素で満たした。その後、DNAを、PacI部位を含む平滑二本鎖オリゴリンカー(５‘-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-３’)にくくった。このリンカーは、以下の2つのオリゴヌクレオチド、すなわち、5’−AATTGTCTTAATTAACCGC-３‘及び５’−AATTGCGGTTAATTAAGAC−３‘をアニーリングすることによって作り、次いでクレノウ酵素で平滑化した。緩衝液を変えるのにくくったDNAが析出した後、くくったものを過剰のPacI酵素で消化し、オリゴの結合を除去した。bp 3534から21566までのAd5配列及びベクター配列を含有する22016bp部分的断片をLMPアガロース(Seaplaque GTG)において単離し、コンピタントDH5αの中へ再びくくり、形質転換した。PacI部位を含むことが見出されて、大きいアデノ断片を有する1つのクローンを選択し、5’末端で配列化し、PacIリンカーの(最後の)AflII部位における正確な挿入を確かめた。
pBr/Ad.Bam-ｒITRpac♯２(ECACC寄託番号p97082120)及びpBr/Ad.Bam-ｒITRpac♯８(ECACC寄託番号p97082121)
クローンpBr/Ad.Bam-rITRにAd5のITR近くのPacI部位の挿入を可能とするために、約190ヌクレオチドをpBr322骨格のClaI部位と、ITR配列の開始との間で除去した。これを以下のようにした。すなわち、pBr／Ad. Bam−rITRをClaIで消化し、変更した長さの時間(2分、5分、10分、及び15分)ヌクレアーゼBal31で処理した。ヌクレオチド除去の程度は、同一の緩衝液と状態を用いて、(ClaI部位でも消化されている)pBr322DNAでの分離反応によって従われる。Bal31酵素を75℃で10分間インキュベーションすることによって不活性化し、より小さい容積のTE緩衝液で沈殿させ、再懸濁した。
平滑末端を確実にするために、さらにDNAをT4DNAポリメラーゼで過剰なdNTPの存在下で処理した。(対照)pBr322DNAのSalIでの消化後、十分な分解(150bp)を10分、15分間処理したサンプルにおいて観察した。その後、10分、又は15分処理したpBr/Ad、Bam-rITRサンプルを上述した平滑PacIリンカー(pBr/Ad.AflII−Bam)にくくった。過剰のPacIで消化したくくったものを沈殿によって精製し、リンカーからLMPアガロースゲル上で分離した。くくった後、DNAをコンピタント5αの中へ挿入し、クローンを分析した。およそ所望の長さを欠く10個のクローンを選別し、さらにそれらをTトラックシークエンシング（T7シークエンシング キット、Pharmacia Biotech）によって分析した。2つのクローンをrITRの丁度下流で挿入したPacIリンカーで見出す事ができる。PacIで消化後、クローン♯２は28bpを有し、クローン♯8はITRに付着した27bpを有する。
pWE/Ad.AflII-rITR（ECACC寄託番号P97082116）
コスミドベクターpWE15（Clontech）をより大きいAd５挿入物をクローン化するのに使用した。最初に、特有のPacI部位を含むリンカーを、pWE,pacを作製するpWE15のEcoRI部位に挿入した。この末端で、pBr/Ad.AflII・BamHIに対して述べたような二本鎖PacIオリゴを使用したが、なお、そのEcoRI突出末端を有していた。その後、以下の断片、すなわち、PacIで消化したpWE.pac、PacIとBamHIで消化したpBr/AflII−Bam、及びBamHIとPacIで消化したpBr/AflII-Bamを電気溶出によって、アガロースゲルから単離した。これらの断片を、製造者のプロトコールによるλファージパッケージング抽出物（Stratagene）を使用して共にくくった。宿主バクテリアに感染させた後、コロニーをプレート上で成長させて、完全な挿入物の存在を分析した。ｐWE/Ad.AflII-rITRは、右ITR(大部分の3’ G残基を欠く)を含めbp 3534(AflII部位)からアデノウイルス型５配列を全て含んでいる。
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4)（ECACC寄託番号p97082115）
アデノ5 wt DNAをクレノウ酵素で過剰なdNTPの存在下で処理し、次いでSalIで消化した。それぞれ、左ITR-Sal(9.4)及びSal(16.7)-右ITR設計した生じた断片2つを、LMPアガロース(Seaplaque GTG)で単離した。PBr322DNAをEcoRV及びSalIで消化しファスファターゼ(Life Technologies)で処理した。Geneclean 法(BIO 101、Inc.)を使用して、ベクター断片を単離し、Ad5SalI断片へくくった。9.4kb断片を有するくくったものだけが、挿入物を持つコロニーを与えた。クローニングの境界を分析し、シークエンシングした後、完全なITR配列を含み、bP9462でSalI部位へ拡張したクローンを選択した。
pBr/Ad.ｌITR−Sal(16.7)（ECACC寄託番号P97082118）
pBr/Ad.lITR−Sal(9.4)をSalIで消化して、脱リン酸化した(TSAP、Life Technologies)。このクローンをAd5において3番目のSal部位まで延長するために、pBr/Ad.Cla−BamをBamHIで直線状にしてSalIで一部消化した。9462-16746からのアデノウイルス配列を含む7.3kbSalI断片を、LMPアガロースゲル中で単離し、SalI消化したpBr/Ad.lITR-Sal(9.4)ベクター断片にくくった。
pWE/Ad.AflII-EcoRI
pWE.pacをClaIで消化し、5’突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。その後、このDNAをPacIで消化し、アガロースゲルから単離した。pWE/AflII-rITRをEcoRIで消化し、クレノウ酵素で処理後、PacIで消化した。アデノウイルス配列含有の大きな24kbフラグメントをアガロースゲルから単離し、ClaIで消化および平滑化したpWE.pacベクターにクローンテック社（Clontech）からのリゲーションエクスプレス（Ligation Expresstm）キットを使用して結合した。Stratageneからの超受容能XL10-Gold細胞の形質転換の後、期待される挿入断片を含むクローンを確認した。pWE/AflII-EcoRIは、bp3534-27336からのAd5配列を含む。
pWE/Ad.AflII-rITRspの生成
ベクターpWE/Ad.AflII-rITRの3’ITRは末端G-ヌクレオチドを含まない。さらに、PacI部位は右ITRからほぼ30bpに位置している。これらの両特性は、3’ITRにおける複製の開始が非効率なため、ウイルス生成の効率が減少し得る。ウイルス生成の間、アダプタープラスミドにおける左のITRは完全であり、均一な組み換えの後、ウイルスDNAの複製が可能であることに注意を要する。
3’ITRにおける複製の開始の効率を改良するために、pWE/Ad.AflII-rITRを以下のように改変した。つまり、先ず、構成pBr/Ad.Bam-rITRpac#2をPacIで消化し、その後、部分的にAvrIIで消化し、17.8kbのベクター含有フラグメントを単離し、SAP酵素を使用して脱リン酸化した。このフラグメントはヌクレオチド35464から3’ITRまでのアデノ配列が欠けている。pWE/Ad.AflII-rITRからのDNAを鋳型として、さらにプライマーITR-EPH：
5′-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3′および
Ad101：5′-TGA TTC ACA TCG GTC AGT GC-3′
を使用して、630bpPCRフラグメントを3’Ad5配列に対応して生成した。続いて、このPCRフラグメントをベクターpCR2.1（Invitorogen）においてクローン化し、PCRフラグメント含有クローンを単離し、配列化してDNAの正しい増幅を検査した。その後、PCRクローンをPacIおよびAvrIIで消化し、0.5kbアデノ挿入断片をPacI／部分的にAvrIIで消化したpBr/Ad.Bam-rITRpac#2フラグメント生成pBr/Ad.Bam-rITRsp.に結合した。次に、この構成を使用して、コスミドクローン（上記のように）を生成した。これは、アデノ配列3534から35938に対応する挿入断片を有する。このクローンをpWE/AflII-rITRspと名付ける。
pWE/Ad.AflII-rITRΔE2Aの生成
pWE/Ad.AflII-rITR（ECACC寄託P97082116）からE2Aコード配列の除去を、以下のようにして達成した。左および右部位におけるE2Aコード領域をフランキングするアデノウイルス配列をプラスミドpBr/Ad.Sal.rITR（ECACC寄託P97082119）から製造者のプロトコルに準拠してExpand PCR装置を使用してPCR反応で増幅した。以下のプライマーを使用した。右フランキング配列（Ad5ヌクレオチド24033から25180に対応）：
ΔE2A.SnaBI：5′-GGC GTA CGT AGC CCT GTC GAA AG-3′
ΔE2A.DBP−開始：5′-CCA ATG CAT TCG AAG TAC TTC CTT CTC CTA TAG GC-3′
増幅DNAフラグメントをSnaBIおよびNsiIで消化した（NsiI部位を、下線を付したプライマーΔE2A.DBP−開始において生成する）。
左フランキング配列（Ad5ヌクレオチド21557から22442に対応):
ΔE2A.DBP−停止：5′-CCA ATG CAT ACG GCG CAG G-3′
ΔE2A.BamHI：5′-GAG GTG GAT CCC ATG GAC GAG-3′
増幅DNAをBamHIおよびNsiIで消化した（NsiI部位を、下線を付したプライマーΔE2A.DBP−停止において生成する）。次に、消化したDNAフラグメントをSnaBI/BamHIで消化したpBr/Ad.Sal-rITRに結合した。配列は、プラスミドpBr/Ad.Sal.rITRΔE2AにおけるユニークNsiI部位を使用してDBPコード領域の正確な置換を確認した。ユニークNsiI部位を使用して、組み換えベクターにより導入されるべき遺伝子に対して発現カセットを導入できる。
E2Aコード配列の除去を、トップストランドの位置24048における100KエンコードL4−遺伝子のスプライスアクセプター部位が完全に残されるように行った。さらに、E2Aコード配列の左側部位のオリジナルE2A-RNAおよびL3-RNAのポリアデニル化シグナルは完全に残った。これにより、アデノウイルスライフサイクルの間におけるL3−遺伝子および100K L4−蛋白質エンコード遺伝子の適正な発現が確実になる。
次に、プラスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを生成した。プラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲΔＥ２ＡをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化した。Ｅ２Ａコード領域がユニークＮｓｉＩ部位により繰り返される３．９Ｋｂフラグメントを単離した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化した。Ｅ２Ａコード配列含有ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩフラグメントを除去する３５Ｋｂ ＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントを、製造者のプロトコル（stratagene）にしたがって、λファージ−パッケージング抽出物を使用して、結合しパッケージして、プラスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲΔＥ２Ａを得た。
このコスミドクローンは、ＰａｃＩ消化ＤＮＡおよび消化アダプタープラスミドの、機能的Ｅ２Ａ遺伝子生成物を発現するパッケージング細胞に対するコトランスフェクションにより、Ｅ２Ａについて欠失されるアデノウイルスベクターを生成するのに使用できる。
アダプタープラスミドの構築
パッケージング細胞ラインにおける組み換えアデノウイスルおよびＥ１配列間の配列重複がないことは、安全な、新規な組み換え体のＲＣＡのない生成および増殖について重要である。アダプタープラスミドｐＭＬＰＩ．ＴＫ（ＰＣＴ／ＮＬ９６／００２４４に記載）は、前記発明の改良パッケージング細胞ラインと共に前記発明に従う使用のために設計されたアダプタープラスミドの例である。このプラスミドを出発物質として使用して、特異的なプロモーターを含む核酸分子および遺伝子配列を容易に交換できる新規なベクターを作った。
先ず、ＰＣＲフラグメントを以下のプライマーを使用してｐＺｉｐΔＭｏ＋ＰｙＦ１０１（Ｎ−）テンプレートＤＮＡ（ＰＣＴ／ＮＬ９６／００１９５に記載）から生成した：ＬＴＲ−１：５′−ＣＴＧ ＴＡＣ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＴＧ ＣＡＣ ＴＧＧ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＡＣ ＴＧ−３′およびＬＴＲ−２：５′−ＧＣＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＴＣＧ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＴＴ ＡＡＣ ＣＧＧ ＧＣＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＡＴＣ Ｇ−３′ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を以下の温度サイクルで製造者プロトコルに従って使用した：９５℃にて５’；５５℃にて３’；７２℃にて１’を１回、および９５℃にて１’、６０℃にて１’、７２℃にて１’を３０サイクル、７２℃にて１０’を１回。その後、ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩで消化し、ＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＬＰ１０（Levrero ら、1991）ベクターに結合した。このベクターはｂｐ１からｂｐ４５４までのアデノウイスル配列、およびそれに続く突然変異体ポリオーマウイルス（ＰｙＦ１０１）からエンハンサーにより置換された野生型エンハンサー配列を有するＭｏ−ＭｕＬＶ ＬＴＲの一部からなるプロモーターを含む。このプロモーターフラグメントを設計した、Ｌ４２０。次に、マウスＨＳＡ遺伝子のコード領域を挿入した。ｐＬＴＲ１０をＢｓｔＢＩを用いて設計し、クレノウ処理し、ＮｃｏＩで消化した。ＨＳＡ遺伝子を以下のプライマーを使用してｐＵＣ１８−ＨＳＡ（Kay ら、１９９０年）でＰＣＲ増幅により得た：ＨＳＡ１、５’−ＧＣＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ Ｃ−３′およびＨＳＡ２、５’−ＧＴＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＣＴＡ ＣＴＡ ＡＣＡ ＧＴＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＴＡＧ ＡＡ−３′。２６９ｂｐ増幅フラグメントを、ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位を使用してシャトルベクターにおいてサブクローン化した。ＴＡＧ停止コドンの直後のエキストラＴＡＧ挿入を有するが、ＨＳＡ遺伝子の正しいコード配列の確実な取り込みの配列化。その後、ＴＡＧ重複を含むＨＳＡ遺伝子のコード領域を、ＮｃｏＩ（スティッキー）−ＳａｌＩ（平滑）フラグメントとして除去し、ｐＬＴＲ１０からの３．５ｋｂＮｃｏＩ（スティッキー）／ＢｓｔＢＩ（平滑）フラグメントにクローン化し、ｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０を得た。
最後に、ｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、その後、左のＩＴＲ、パッケージングシグナル、Ｌ４２０プロモーターおよびＨＳＡ遺伝子含有フラグメントを、同じ酵素で消化したベクターｐＭＬＰＩ．ＴＫに挿入し、これにより、プロモーターと遺伝子配列を置換した。これにより、プロモーターおよび遺伝子配列付近の種々の制限酵素に対する便利な認識部位を含む新規なアダプタープラスミドｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡを得た。ＳｎａＢＩおよびＡｖｒＩＩは、プロモーター配列を交換するために、ＨｐａＩ，ＮｈｅＩ，ＫｐｎＩ，ＨｉｎｄＩＩＩと組み合わせることができる。しかし、後者の部位は、この構成において遺伝子を置換するために、ＨＳＡコード領域からＣｌａＩまたはＢａｍＨＩ部位３’と組み合わせることができる。
核酸分子を容易に交換可能にするように設計された別のアダプタープラスミドを、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡにおけるプロモーター、遺伝子、ポリＡ配列とＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位、イントロン、ポリＡシグナルを置換することにより作った。この目的のために、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡをＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、クレノウで処理し、平滑末端を得た。ｐＢｒ３２２ベクターおよびアデノウイルス配列を有する５．１ｋｂフラグメントを単離して、ＨｈａＩおよびＡｖｒＩＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより得たｐｃＤＮＡ／ａｍｐ（Invitrogen）からの平滑１５７０ｂｐフラグメントに結合した。このアダプタープラスミドをｐＡｄ５／ＣＬＩＰと呼んだ。ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐにおける左のＩＴＲからベクター配列の除去を可能にするために、このプラスミドを部分的にＥｃｏＲＩで消化し、リニアフラグメントを単離した。配列５’ＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣ−３’のオリゴをそれ自体アニールし、ＳａｌＩ部位およびＥｃｏＲＩオーバーハングを有するリンカーを得た。このリンカーを部分的に消化したｐＡｄ５／Ｃｌｉｐベクターに結合し、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐにおける左のアデノウイルスＩＴＲの２３ｂｐ上流のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたリンカーを有するクローンを選択し、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐｓａｌを得た。同様に、ｐＡｄ５／ＣｌｉｐにおけるＥｃｏＲＩ部位を配列５′−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣＡＡＴＴ−３′のリンカーの挿入によりＰａｃＩ部位に変えた。ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐベクターを部分的にＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、ＥｃｏＲＩオーバーハングを有するＰａｃＩリンカーに結合した。結合混合物をＰａｃＩで消化し、コンカテマーを除去し、アガロースゲルから単離し、再結合した。得られたベクターをｐＡｄ５／Ｃｌｉｐｐａｃと呼んだ。これらの変化により、プラスミドベクター配列から左のＩＴＲを遊離する融通性がより高くできる。
また、ベクターｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡを改変し、左のＩＴＲの上流にＳａｌＩまたはＰａｃＩ部位を作った。これについて、ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡをＥｃｏＲＩで消化し、上記のＰａｃＩリンカーに結合した。この結合混合物をＰａｃＩで消化し、アガロースゲルからリニアＤＮＡの単離後、再結合し、コンカテマー化リンカーを除去した。これにより、アダプタープラスミドｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡｐａｃを得た。この構成を使用して、ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡｓａｌを以下のように、生成した：ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡｐａｃをＳｃａＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ベクターフラグメントを、同じ酵素でｐＡｄ５／Ｃｌｉｐｓａｌを消化した後単離した０．３ｋｂフラグメントに結合した。
アダプタープラスミドｐＡｄＭｉｒｅおよびｐＡｄＡｐｔの生成
ポリリンカー配列のみ含み、プロモーターまたはポリＡ配列を含まないアダプタープラスミドを作るために、ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡｐａｃをＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。ベクターフラグメントを同じ制限酵素で消化したインカーオリゴヌクレオチドに結合した。リンカーを以下の配列のオリゴをアニールすることにより作った：
ＰＬＬ−１：５′−ＧＣＣ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＴＴ ＡＡＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＴＧ Ｇ−３′および
ＰＬＬ−２：５′−ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＧＴ ＴＡＡ ＣＧＣ ＴＡＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＡＧ ＧＧＡ ＴＧＧ Ｃ−３′。
このアニールしたリンカーをＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、カラム精製（Qiaquick ヌクレオチド除去キット）により小さい末端から製造者推薦にしたがって分離した。その後、リンカーをＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化したｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡｐａｃフラグメントに結合した。組み込まれたリンカーを有し、挿入の完全性をチェックするために配列されたＡｄＭｉｒｅと呼ぶクローンを選択した。アダプタープラスミドｐＡｄＭｉｒｅは完全な発現カセットの容易な挿入を可能にする。
ヒト細胞中で高い発現レベルを仲介するヒトＣＭＶプロモーターを含むアダプタープラスミドを以下のように構築した：ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡｐａｃをＡｖｒＩＩで消化し、５’突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。ＨｉｎｄＩＩＩでの第２の消化により、Ｌ４２０プロモーター配列を除去した。ベクターフラグメントを単離してＣＭＶプロモーター配列を含むＰＣＲフラグメントに結合した。このＰＣＲフラグメントを、以下のプライマーでｐＣＭＶＬａｃＩ（Stratagene）からのＣＭＶ配列の増幅後に得た：
ＣＭＶｐｌｕｓ：５′−ＧＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＡＧＣＣ−３′および
ＣＭＶｍｉｎＡ：５′−ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣ−３′
ＰＣＲフラグメントを先ずＰＳＴ１（ＣＭＶｐｌｕｓにおいて下線を付す）で消化し、その後、３’−突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより除去した。その後、ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（ＣＭＶｍｉｎＡにおいて下線を付す）で消化し、上記のＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡｐａｃベクターフラグメントに結合した。得られたプラスミドをｐＡｄ５／ＣＭＶ−ＨＳＡｐａｃと呼んだ。その後、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターフラグメントを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩでＡｄＭｉｒｅを消化した後に得られたポリリンカー配列に結合する。得られたプラスミドをｐＡｄＡｐｔと呼んだ。アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔはヒトＣＭＶプロモーター（Boshartら、１９８５年）のヌクレオチド−７３５から＋９５を含む。
左のＩＴＲの上流のＰａｃＩ部位の代わりにＳａｌＩ部位を含むこのアダプタープラスミドの第２のバージョンを、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐｓａｌからの０．７ｋｂＳｃａＩ−ＢｓｒＧＩフラグメントをＳｃａＩで消化しかつＢｓｒＧＩで部分的に消化したｐＡｄＡｐｔに挿入することにより作った。このクローンをｐＡｄＡｐｔと呼んだ。
Ａｄ５に基づく組み換え体アデノウイルスの生成
ＲＣＡのない組み換え体アデノウイルスを非常に効率的に上記アダプタープラスミドおよびｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲまたはｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴｒｓｐ構造を使用して生成できる。一般に、所望の発現カセットにおける所望のトランスジーンを含むアダプタープラスミドは適当な酵素で消化され、３’および／または５’末端のベクター配列から挿入断片を遊離する。アデノウイルス相補性プラスミドｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲまたはｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐはＰａｃＩで消化され、アデノ配列をベクタープラスミドから遊離する。非制限的な例として、ＡｄＡｐｔ−ＬａｃＺの生成を説明する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子をプラスミドｐＭＬＰ．ｎｌｓＬａｃＺ（ＥＰ９５−２０２２１３）からプライマー５′−ＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡ−３′および５′−ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣ−３′を用いてＰＣＲより増幅した。ＰＣＲ反応を以下の増幅プログラムにて供給者プロトコルに従ってＥｘＴａｇ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った：５分９４℃、１サイクル；４５秒９４℃および３０サイクル６０℃および２分７２℃、５サイクル；４５秒９４℃および３０秒６５℃および２分７２℃、２５サイクル；１０分７２；４５秒９４℃および３０秒６０℃および２分７２℃、５サイクル、１サイクル。次に、ＰＣＲ生成物をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、消化されたＤＮＡフラグメントをＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）に結合し、ｐｃＤＮＡ３．ｎｌｓＬａｃＺを増加させた。その後、構成ｐｃＤＮＡ３．ｎｌｓＬａｃＺをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、３ｋｂ ＬａｃＺフラグメントをジーンクリーンスピンキット（Ｂｉｏ１０１社）を使用してゲルから単離した。
また、ｐＡｄＡｐｔをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、リニアベクターフラグメントを上記のようなゲルから単離した。両単離フラグメントを結合し、ＬａｃＺ挿入断片含有の１方のクローンを選択した。構成ｐＡｄＡｐｔ−ＬａｃＺをＳａｌＩで消化し、ジーンクリーンスピンキットで精製し、続いて、ＰａｃＩで消化した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｓｐをＰａｃＩで消化した。両消化混合物を６５℃だけで３０’間処理し、酵素を不活性化した。試料をゲル上におき、その濃度を見積もった。２．５×１０６ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）を１０％ＦＣＳおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌのＤＭＥＭのＴ２５フラスコにまいた。次の日、各プラスミドの４マイクログラムをＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）に、リポフェクトアミントランスフェクションリエイジェンス（Life Technoloies Inc.）を使用して、製造者の指示にしたがってトランスフェクトした。次の日、培地を新たな培養培地で置換し、さらに細胞を３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。再び、２４時間後の細胞をトリプシンで処理し、Ｔ８０フラスコにまき、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。Ｔ８０フラスコにまいた後６日で充分なＣＰＥを得た。細胞を培地中でハーベストし、１回冷凍／解凍サイクルに付した。粗ライゼート取得本方法を使用してウイルス混合物のプラーク精製を行った。１０のプラークを拾い、２４ウェルプレートに拡げ、Ａ５４９細胞感染の後ＬａｃＺ発現について試験した。全て１０プラークからのウイルスがＬａｃＺを発現した。
実施例３
キメラ組み換え体アデノウイルスの生成
ヒト血清中で抗体を中和するヘキソンキメラＡｄ５基アデノウイルスの生成は主にヘキソン蛋白質を指向し、ペントン蛋白質にあまり拡張しない。異なる血清型からのヘキソン蛋白質は、ウイルスの外側でさらされるべきことを予定されるループ中に存在する高可変領域を示す（Athappillyら、1994、J. Mol. Biol. 242, 430-455）。殆どの型の特異的なエピトープはこれらの高可変領域にマップされている（Toogood ら、1989; J. Gen Viol. 70, 3203-3214）。こうして、異なる血清型からの相当する配列と（一部の）ヘキソン配列との置換は、Ａｄ５に対する抗体の（先在）中和を回避する効果的な方法である。アデノウイルス血清型５のヘキソンコード配列はヌクレオチド１８８４１と２１６９７間に位置する。
アデノウイルス血清型５バックボーンへの二者択一のアデノウイルスからのヘキソンコード配列の容易な交換を促進するために、先ずシャトルベクターを生成した。このサブクローン、コード化ｐＢｒ／Ａｄ．Ｅｃｏ−ＰｍｅＩを、先ずプラスミドｐＢｒ３２２をＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化することにより、かつｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｅｃｏからの１４ｋｂＰｍｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入することにより生成した。このシャトルベクターでは、１４３０ｂｐ ＳａｎＤＩフラグメントの除去は、ＳａｎＤＩでの消化によりなされ、再結合してｐＢｒ／Ａｄ．Ｅｃｏ−ＰｍｅＩΔＳａｎＤＩを得た。除去されたフラグメントはユニークＳｐｅＩおよびＭｕｎＩ部位を含む。ｐＢｒ／Ａｄ．Ｅｃｏ−ＰｍｅＩΔＳａｎＤＩからアデノウイルス血清型5ＤＮＡエンコードヘキソンを除去した。ヘキソンフランキング配列をＰＣＲ増幅し、一緒に結合し、これにより、ユニーク制限部位を生成し、ヘキソンコード領域を置換した。これらのＰＣＲ反応について、４つの異なるオリゴヌクレオチドが必要である：Δｈｅｘ１−Δｈｅｘ４。
Δｈｅｘ１：５′−ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＡＧＣ−３′
Δｈｅｘ２：５′−ＣＣ（Ｇ ＧＡＴ ＣＣ）Ａ ＣＴＡ ＧＴＧ ＧＡＡ ＡＧＣ ＧＧＧ ＣＧＣ ＧＣＧ−３′
Δｈｅｘ３：５′−ＣＣ（Ｇ ＧＡＴ ＣＣ）Ａ ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＡＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＡＣ−３′
Δｈｅｘ４：５′−ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＣＴ−３′
オリゴヌクレオチドΔｈｅｘ１およびΔｈｅｘ２を使用して得られた±１１００ｂｐの増幅ＤＮＡ生成物をＢａｍＨＩおよびＦｓｅＩで消化した。オリゴヌクレオチドΔｈｅｘ３およびΔｈｅｘ４を使用して得られた±１６００ｂｐの増幅ＤＮＡ生成物をＢａｍＨＩおよびＳｂｆＩで消化した。次に、これらの消化ＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから精製し、トリ−パートリゲイション反応を、ＦｓａＩおよびＳｂｆＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｅｃｏ−ＰｍｅＩΔＳａｎＤＩに結合したＴ４リガーゼ酵素を使用して行った。得られた構造はコード化ｐＢｒ／Ａｄ．Ｅｃｏ−ＰｍｅＩΔＨｅｘｏｎであった。この構成は部分的に配列され、正しいヌクレオチド配列およびユニーク制限部位ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩの存在を確認した。
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｅｃｏ−ＰｍｅＩΔＨｅｘｏｎは、それぞれヘキソン配列の５’および３’末端におけるユニーク制限部位ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩを導入するプライマーを使用して、異なる血清型からのウイルスＤＮＡから増幅された異種ヘキソン配列を導入するシャトルベクターとして役立つ。健康な個人が全くないかまたは非常に低い力価のＮＡＢを有する血清型からのヘキソン配列を含むＡｄ５基ベクターを生成するために、Ａｄ３５、Ａｄ３４、Ａｄ２６、およびＡｄ４８のヘキソン配列を以下のプライマーを使用して増幅した：
Ｈｅｘ−ｕｐ２：５′−ＧＡＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＧＣＹＡＣＣＣＣＨＴＣＧＡＴＧＡＴＧ−３′および
Ｈｅｘ−ｄｏ２：５′−ＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＡＴＧＴＫＧＴＫＧＣＧＴＴＲＣＣＧＧＣ−３′
これらのプライマーを、公開されたヘキソンコード領域（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ７、Ａｄ１６、Ａｄ４０、Ａｄ４１のヘキソン配列は、Genbannkにより得ることができる）の配列を使用して消化した。生成したヌクレオチドを、血清型間の変化を示す位置にて結合した。
ＰＣＲ生成物をＳｐｅＩおよびＭｕｎＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｅｃｏ−ＰｍｅＩΔＨｅｘｏｎ構成にクローン化した。
次に、ヘキソン改変配列を、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲＨｅｘＸＸ（ここで、ＸＸはヘキソン配列を増幅するのに使用した血清型を表す）を生成するＡｓｃＩフラグメントの交換により、構成ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲに導入した。
その後、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲＨｅｘＸＸ構成を使用して、Ａｄ５組み換え体ウイルスについての上記と同じ方法でウイルスを作った。
ペントンキメラＡｄ５基組み換え体ウイルスの生成
アデノウイルス型５ペントン遺伝子は、配列１４１５６および１５８６９間に位置する。ペントンベースは、目標細胞へのウイルスのインターナリゼイションを媒介するアデノウイルスキャプシド蛋白質である。少なくとも幾つかの血清型（Ｃ型およびＢ型）は、ペントン中のＲＧＤ配列と細胞表面上のインテグリンとの相互作用によりこのことを達成することが示された。しかし、Ｆ型アデノウイルスはＲＧＤ配列を持たず、ＡおよびＤグループの殆どのウイルスに対してペントン配列は未知である。このため、ペントンは目標細胞特異性に含まれ得る。さらに、キャプシド蛋白質として、ペントン蛋白質はアデノウイルスの免疫原性に含まれる（Gahery-Segardら、１９９８）。このため、Ａｄ５ペントン配列と無か低い力価のＮＡＢある血清型からのペントン配列と置換およびヘキソン配列の置換は、ヘキソン単独の置換よりも効果的にアデノウイルスベクターのクリアランスを防止する。ペントン配列の置換は感染特異性に影響する。
Ａｄ５中に異種のペントン配列を導入可能にするために、我々は上記のプラスミド基システムを使用した。先ず、ペントン配列に対するシャトルベクターを、構成ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩからの７．２ｋｂ ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを同じ酵素で消化したｐＢｒ３２２に挿入することにより作った。得られたベクターをｐＢｒ／ＸＮと呼ぶ。これより、プラスミドＡｄ５ペントン配列を除去し、他の血清型からの新規なペントン配列を導入のに使用されるユニーク制限部位により置換した。ｐＢｒ／ＸＮのペントンの左のフランキング配列は以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅された：
ＤＰ５−Ｆ：５′−ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ ＡＴＡ ＧＣ−３′および
ＤＰ５−Ｒ：５′−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ （ＴＧＴ ＡＣＡ） ＡＣＴ ＡＡＧ ＧＧＧ ＡＡＴ ＡＣＡ ＡＧ−３′
ＤＰ５−Ｒは右フランキング配列に結合するためのＢａｍＨＩ部位（下線）を有し、前者Ａｄ５ペントン領域の５’末端におけるユニークＢｓｒＧＩ部位（括弧）を導入する。
右フランキング配列を、ＤＰ３−Ｆ：５′−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ （ＣＴＴ ＡＡＧ） ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＴＣ ＣＴＴ−３′およびＤＰ３−３Ｒ：５′−ＡＡＡ ＡＣＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＣＴ ＴＴＣ−３′を使用して増幅した。
ＤＰ３−Ｆは、左のフランキング配列に結合するためのＢａｍＨＩ部位（下線）を有し、前者Ａｄ５ペントン領域の３’末端におけるユニークＡｆｌＩＩ部位（括弧）を導入する。
得られた２つのＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、一緒に結合した。この結合混合物をＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。ｐＢｒ／ＸＮをＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ベクターフラグメントを消化結合ＰＣＲフラグメントに結合した。得られたクローンをｐＢｒ／Ａｄ．Δｐｅｎｔｏｎと呼ぶ。Ａｄ３５、Ａｄ３４、Ａｄ２６、およびＡｄ４８からのペントンコード配列を、５’および３’末端がそれぞれＢｓｒＧＩおよびＡｆｌＩＩ部位を含むように、ＰＣＲ増幅した。これに対して、以下のプライマーを使用した：
Ａｄ３４およびＡｄ３５に対して：
Ｐ３−ｆｏｒ：５′−ＧＣＴ ＣＧＡ ＴＧＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＡ ＧＣＣ ＧＴＧ ＣＴＡ−３′
Ｐ３−ｒｅｖ：５′−ＧＣＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＧＣＧ ＧＣＴ ＴＧＡ ＡＡＧ−３′
Ａｄ２６およびＡｄ４８に対して：
Ｐ１７Ｆ：５′−ＧＣＴ ＣＧＡ ＴＧＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧＧ ＣＧＴ ＧＣＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＣ−３′
Ｐ１７Ｒ：５′−ＧＣＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＴＴＡ ＧＡＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＡＧ Ｃ−３′
増幅ＰＣＲ生成物をＢｆｒＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＢｒ／Ａｄ．Δｐｅｎｔｏｎにクローン化した。ｐＢｒ／Ａｄ．Δｐｅｎｔｏｎ中のこれら異種ペントン配列はｐＢｒ／Ａｄ．ｐｅｎｔｏｎＸＸ（ＸＸは挿入されたペントン配列を増幅するのに使用する血清型に相当する血清型の数を表す）と呼ぶ構成を生成した。次に、新規なペントン配列を改変ヘキソンを有するｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌｌＩＩ−ｒＩＴＲベクターに導入した。例えば、Ａｄ３５からのペントン配列を構成ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌｌＩＩ−ｒＩＴＲＨｅｘ３５に普通のＦｓｅＩフラグメントの交換により導入した。ペントンおよびヘキソン配列の他の組み合わせも作った。改変ペントンおよびヘキソン配列を有するウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）のアダプタープラスミドを用いたコトランスフェクションを使用して上記のようにして作った。さらに、ペントン配列をｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌｌＩＩ−ｒＩＴＲ構成に導入した。後者の構成は、改変ペントンのみを含み、これらの構成から生成したウイルスはペントン配列のアデノウイルスの中和への寄与および感染効率および特異性の可能な変化の解析を研究するのに使用した。
繊維キメラＡｄ５基ウイルスの生成
アデノウイルス感染を２つのキャプシド蛋白質繊維およびペントンにより媒介される。細胞に対するウイルスの結合は、突出繊維蛋白質と細胞表面上のリセプターとの相互作用により達成される。インターナリゼイションをペントン蛋白質と細胞表面上のインテグリンとの相互作用後に行う。ＣおよびＢサブグループからの少なくとも幾つかのアデノウイルスは、細胞結合に対する異なるリセプターを使用することを示され、このため、異なる細胞型で異なる感染効率を有する。したがって、キャプシドの繊維を変えることによりアデノウイルスの感染スペクトルを変えることが可能である。アデノウイルス血清型５の繊維コード配列はヌクレオチド３１０４２および３２７８７間に位置する。アデノウイルス血清型５ＤＮＡエンコード繊維を除去するため、我々は、構成ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲについて開始した。先ず、ＮｄｅＩ部位をこの構成から除去した。この目的のため、ｐＢｒ３２２プラスミドＤＮＡをＮｄｅＩで消化し、その後、突出末端をクレノウ酵素を使用して満たした。このｐＢｒ３２２プラスミドを再結合し、ＮｄｅＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。得られたｐＢｒ／ΔＮｄｅＩプラスミドをＳｃａＩおよびＳａｌＩで消化し、得られた３１９８ｂｐベクターフラグメントをｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍｒＩＴＲ由来の１５３４９ｂｐ ＳｃａＩ−ＳａｌＩフラグメントに結合し、プラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＮｄｅＩを得た。これは、ユニークＮｄｅＩ部位を含む。次に、ＰＣＲをオリゴヌクレオチドＮＹ−ｕｐ：
５′−ＣＧＡ（ＣＡＴ ＡＴＧ）ＴＡＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＡＧ ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＴＡ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＴＧ−３′および
ＮＹ−ｄｏｗｎ：
５′−ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＧＣ ＣＡＴ ＧＴＴ−３′で行った。
増幅の間、ＮｄｅＩ（括弧）およびＮｓｉＩ制限部位（下線）の両方を導入して増幅繊維ＤＮＡのクローン化を促進した。増幅は、９４℃で各４５秒２５サイクル、６０℃で１分、および７２℃で４５秒からなった。ＰＣＲ反応は２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＮＹ−ｕｐまたはＮＹ−ｄｏｗｎ、２ｍＭｄＮＴＲ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ緩衝液、および１ユニットのエロンガーゼ（Elongase）熱安定性ポリメラーゼ（Gibco、 オランダ）を含んだ。１／１０の生成物をアガロースゲルに適用し、±２２００ｂｐの予期したＤＮＡフラグメントを増幅したことを示した。次に、このＰＣＲフラグメントをジーンクリーンキットシステム（Bio101 Inc.）を使用して精製した。その後、構成ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＮｄｅＩおよびＰＣＲ生成物の両方を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳｂｆＩで消化した。次にＰＣＲフラグメントをＴ４リガーゼ酵素を使用してＮｄｅＩおよびＳｂｆＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＮｄｅＩにクローン化し、ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂを得た。
このプラスミドにより、除去された繊維配列の代わりに挿入されたユニークＮｄｅＩおよびＮｓｉＩ部位を介してＰＣＲ増幅繊維配列の挿入が可能になる。ウイルスは、特許ＰＣＴ／ＮＬ９６／００２４４に記載されたパッケージング細胞において、アダプタープラスミド、ＰａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化した構成ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ、および異種繊維配列が挿入されたｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ構成を使用して、２つの同種の組み換え体により生成できる。ウイルス生成効率を上げるために、構成ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂを改変して右ＩＴＲをフラッンキングするＰａｃＩ部位を生成した。ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂをＡｖｒＩＩで消化し、５ｋｂアデノフラグメントを単離し、相当するＡｖｒＩＩフラグメントを置換して上記ベクターｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ．ｐａｃ＃８に導入した。得られた構成をｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ．ｐａｃと呼ぶ。
一旦、異種繊維に配列をｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ．ｐａｃに導入し、繊維改変右側アデノウイルスクローンをｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲに対して上記した大きいコスミドクローンに導入する。このような大きいコスミドクローンにより、たった１つの同種の組み換え体によりアデノウイルスの生成が可能になる。改変繊維を有するＡｄ５基ウイルスを作り、説明した（Ｎｏ．９８２０４４８２．８および９９２００６２４．７）。さらに、本発明からの血清型からのヘキソンおよびペントン配列を、所望の繊維配列と組み合わせて、効率的に選択して目標細胞を感染するウイルスを生成する。例えば、平滑な筋肉細胞、内皮細胞または滑膜細胞等ヒト起源の細胞は、Ｂサブグループウイルス、特にアデノウイルス１６型からの繊維を有するＡｄ５基ウイルスで非常によく感染される。
特異的な配列がプラスミドのＡｄ５バックボーンから除去でき、他の血清型からの相当する配列により置換されうる上記の例は、システムの融通性を示す。上記方法により、異なる血清型からのキャプシド遺伝子のいかなる組み合わせをも作ることができることは明らかである。したがって、中和に対して感受性の低いウイルスを作る所望のヘキソンおよびペントンを有し、特異的な目標組織に効率的に感染できる所望の繊維配列を有するキメラ組み換え体Ａｄ５基アデノウイルスを設計する。
実施例４
Ａｄ３５組み換え体ウイルスを生成するプラスミド基システムの構築
Ａｄ３５の部分的な制限マップは、以前に公表された（Valderrama-Leon ら、1985; Kang ら、1989; Li ら、1991）。Ad35に基づく組み換え体アデノウイルスを生成する機能的なプラスミド基システムの例は、以下の要素からなる:1．左のＩＴＲおよびＡｄ３５由来パッケージング配列および異種発現カセットの挿入断片に対する少なくとも１つの制限部位からなりＥ１配列がないアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドは、ｐＩＸプロモーターを含む領域をコードし、第２のヌクレオチドを有するアダプタープラスミドの同種組み換え体を媒介するのに充分な配列をコードするＥ１ＢからのＡｄ３５配列３’を含む。
２．アダプタープラスミドに同種の配列、複製、およびパッケージング細胞中には存在せず速い、中間の、遅い遺伝子である、組み換え体ウイルスのパッケージングに必要なＡｄ３５配列を含む第２のヌクレオチド。
３．Ａｄ３５のＥ１機能を補うことができる少なくとも機能的Ｅ１蛋白質を提供するパッケージング細胞。
Ａｄ３５ＤＮＡを精製ウイルスバッチから以下のように単離した。１００μｌのウイルスストック（Ａｄ３５：３．２６×１０１２ＶＰ／ｍｌ）に１０μｌの１０×ＤＮＡアーゼ緩衝液（１３０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１，２Ｍ ＣａＣｌ２；５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を添加した。１０μｌの１０ｍｇｒ／ｍｌのＤＮＡアーゼＩ（Roche Diagnostics）の添加後、この混合物を１時間、３７℃でインキュベートした。２．５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡの添加の後、３．２μｌの２０％ＳＤＳおよび１．５μｌのプロテイナーゼＫ（Roche Diagnostics; 20mgr/ml）試料を５０℃で１時間インキュベートした。次に、ウイルスＤＮＡをジーンクリーンスピンキット(Bio101 Inc.)を使用して、製造者の指示にしたっがって単離した。ＤＮＡをスピンカラムから25μlの無菌ＭｉｌｌｉＱ水で溶離した。
以下のＤＮＡフラグメントのサイズにおいて、フラグメントナンバリングはＫａｎｇら（１９８９）に従った。Ａｄ３５ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、３つのフラグメント（約２２．３（Ａ）、７．３（Ｂ）、６ｋｂ（Ｃ）をゲルからジーンクリーンキット（Bio101 Inc.）を使用して単離した。ｐＢｒ３２２をＥｃｏＲＩで、またはＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、消化したフラグメントをゲルから単離し、Ｔｓａｐ酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して脱リン酸化した。次に、６ｋｂ Ａｄ３５ＣフラグメントをｐＢｒ３２２ｘＥｃｏＲＩフラグメントに結合し、ＩＴＲ含有Ａｄ３５フラグメント（ＥｃｏＲＩ−Ｂ）をｐＢｒ３２２ｘＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントに結合した。連結反応を１６℃で一晩インキュベートし、ＤＨ５α能力バクテリア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ．）に形質転換した。得られたクローンのミニプレプ（minipreps）をＡｄ３５フラグメントの正しい挿入断片について制限分析により解析した。６ｋｂおよび７．３ｋｂのＡｄ３５フラグメントの両方がｐＢｒ３２２に正しく挿入されたことがわかった。６ｋｂフラグメントをｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ６．０＋ およびｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ６．０−の両配向において単離した。これにより、＋はｐＢｒ３２２に対して５’から３’の配向を表す。ｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ７．３と呼ぶ７．３ｋｂのＡｄ３５Ｂ挿入断片を有するクローンを部分的に配列化し、３’ＩＴＲの正しい結合をチェックした。ＩＴＲは低ストランド中配列５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴ．．．−３’を有する。その後、ｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ７．３を５’末端に６ｋｂ Ａｄ３５フラグメントの挿入断片により拡張した。ｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ７．３をＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化した。フラグメントをゲルから単離し、６ｋばｄ３５ＥｃｏＲＩフラグメントに結合した。形質転換後、クローンを挿入断片の正しい配向について試験し、１つのクローンを選択し、ｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ１３．３と呼んだ。
その後、このクローンを、ＳａｌＩでｗｔＡｄ３５の消化の後に得られた〜５．４ｋｂ ＳａｌＩ Ｄ フラグメントを用いて拡張する。ｐＢｒ３２２バックボーンのｓａｌＩ部位を、ＳａｌＩを用いたｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ１３．３の部分的な消化により除去し、クレノウ処理および再結合によりスティッキー末端を満たす。アデノウイルス挿入断片のシグナルＳａｌＩ部位を含む１つのクローンを選択する。その後、ｐＢｒΔｓａｌ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ１３．３と呼ぶこのクローンをｐＢｒ３２２バックボーンに存在するＡａｔＩＩでリニア化し、ＡａｔＩＩ相補末端でＳａｋＩリンカーに結合する。その後、ＤＮＡを過剰のＳａｋＩで消化し、このリニアフラグメントを単離し、Ａｄ３５からの５．４ｋｂＳａｌＩ−Ｄフラグメントに結合する。ｐＢｒ／Ａｄ３５−Ｅｃｏ１３．３に正しい配向に挿入されたＳａｌＩフラグメントを含む１つのクローンを選択する。得られたクローン、ｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｓａｌ２−ｒＩＴＲは、右ＩＴＲを含む３’〜１７ｋｂのＡｄ３５を含む。ウイルス精製の際にベクター配列から右ＩＴＲの遊離を可能にするために、右ＩＴＲをフランキングＮｏｔＩ部位をＰＣＲにより導入する。
また、２２．３ｋｂのＡｄ３５ ＥｃｏＲＩ−ＡフラグメントをｐＢｒ３２２ｘＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶでクローン化した。５’末端の約７ｋｂが明らかに除去されたｐＢｒ／Ａｄ３５−ＥｃｏＡ３’と呼ぶ１つのクローンを選択した。それは、Ａｄ３５ｗｔＤＮＡの９．４ｋｂおよび配列上流の約１．５ｋｂにおいてＳａｌＩ部位を含む。ｐＢｒ３２２バックボーンのユニークＮｄｅＩ部位およびこのＳａｌＩ部位を使用して、このクローンを、ＮｏｔＩ制限部位をリンカーの挿入断片によりＡｄ３５の５’末端において作る方法で、Ａｄ３５の第１ＳａｌＩからの約５ｋｂのＡｄ３５フラグメント５’の挿入断片により５’末端に拡張する。ｐＢｒ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ＥｃｏＡと呼ぶこのクローンは左の末端配列（ＩＴＲ，パッケージング配列およびＥ１）を含まず、３’末端にてクローンｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｓａｌ２−ｒＩＴＲを伴う約３．５ｋｂのオーバーラップを有する。
アダプタープラスミドを作るために、Ａｄ３５をＳａｌＩで消化し、〜９．４ｋｂの左の末端Ｂフラグメントを単離した。ｐＢｒ３２２をＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩで消化し、ゲルから単離し、Ｔｓａｐ酵素で脱リン酸化した。両フラグメントを結合し、正しい挿入断片を有するクローンおよび左ＩＴＲの正しい配列を選択する。ウイルス生成の際にベクター配列からの左のＩＴＲの遊離を可能にするために、左のＩＴＲをフランキングするＮｏｔＩ部位をＰＣＲにより導入する。このクローンから、Ｅ１配列を除去しＰＣＲを使用してポリリンカーにより置換する。ポリリンカー配列を使用して発現カセットを選択遺伝子に対して導入する。
組み換え体Ａｄ３５クローンを、図３に示すように、アダプタープラスミド、ｐＢｒ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ＥｃｏＡおよびｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｓａｌ２−ｒＩＴＲを用いたＰＥＲ．Ｃ６細胞のトランスフェクションにより生成する。同種の組み換えにより組み換え体ウイルスが増加する。
実施例５
Ａｄ３５に対する中和活性（ＮＡ）の優勢が異なる地理的位置からのヒト血清において低い。
実施例１において、我々は、ベルギーの一位置からヒト血清の中和活性（ＮＡ）の分析を説明した。試験した４４アデノウイルス血清型のパネルのうち、一血清型Ａｄ３５はアッセイした１００の血清のいづれかにおいて中和されなかった。さらに、幾つかの血清型Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ４８が試験された血清のうち８％以下において中和されることがわかった。この分析は、さらに以前には試験されていないアデノウイルスの他の血清型に対して拡張され、第１スクリーンからの血清型の選択を使用して、異なる地理的一からの血清にも拡張した。
アデノウイルスを増殖し、精製し、実施例１で説明したようにＣＰＥインヒビションアッセイにおいて中和について試験した。実施例１と同じバッチからの血清を使用して、アデノウイルス血清型７Ｂ、１１、１４、１８、４４／１８７６を中和に対して試験した。これらのウイルスは、それぞれ５９、１３、３０、９８および５４％の血清で中和されることがわかった。こうして、このシリーズのうち、Ａｄ１１は比較的低い頻度で中和される。
ヒト組織からのアデノウイルス血清型単離の頻度およびアデノウイルス血清型に対するＮＡの優勢は、異なる地理的位置で異なり得ることがわかるので、我々は、さらに、異なる場所からの血清に対するアデノウイルス血清型の選択を試験した。ヒト血清をヨーロッパの２つの付加的な場所（英国のブリストル、およびオランダのライデン）およびアメリカ合衆国の２つの場所（カリフォルニアのスタンフォードおよびニュウヨークのグレートネック）から得た。第１スクリーンの２０％以下の血清で中和されることがわかったアデノウイルスおよびＡｄ２、Ａｄ５、Ａｄ２７、Ａｄ３０、Ａｄ３８、Ａｄ４３を、英国からの血清における中和について試験した。これらの実験の結果を図４に示す。
アデノウイルス血清型２および５を再び高い白分率のヒト血清で中和した。さらに、第１スクリーンの低い百分率の血清で中和した血清型の幾つかを高い百分率の英国からの血清で中和する（例示：Ａｄ２６（７％対３０％）、Ａｄ２８（１３％対５０％）、Ａｄ３４（５％対２７％）、Ａｄ４８（８％対３２％））。第１スクリーンの比較的低い百分率の血清で見出されたＡｄ１１およびＡｄ４９に対する中和活性は、この第２スクリーンの低い百分率の血清で見出される（それぞれ１３％対５％、および２０％対１１％）。第１スクリーンの血清のいづれかで中和された血清型Ａｄ３５は、英国からの低い百分率（８％）の血清で中和されることがわかる。英国からのヒト血清のＮＡの優勢は、血清型Ａｄ１１およびＡｄ３５に対して最も低い。
さらなる分析に対して、血清をアメリカ合衆国の２つの場所（カリフォルニアのスタンフォードおよびニュウヨークのグレートネック）およびオランダ（ライデン）から得た。図５はこれらの血清について得られたデータおよび以前のデータの概観を表す。全てではないウイルスをＡｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ３５を除く全ての血清において試験した。ヒト血清の総合的なスクリーンからの全体的な結論は、Ａｄ３５に対する中和活性の優勢が、西部の国々において最も低い全血清型であるということである：平均７％のヒト血清が中和活性を含む（５つ異なる場所）。
また、別のＢグループアデノウイルス、Ａｄ１１を、低い百分率のヒト血清で中和する（５つの異なる位置からの血清で平均１１％）。アデノウイルス型５を５つの異なる位置から得た５６％のヒト血清で中和する。全ての血清を試験したわけではないが、Ｄグループ血清型４９をアメリカ合衆国の一位置からおよびヨーロッパからの試料において比較的低い頻度で中和する（平均１４％）。
上記の中和実験で、最も高い血清濃度のウェルにおいてＣＰＥの最大保護が血清なしでコントロールに対して４０％であるとき、血清を非中和と判定する。保護を以下のようにして計算する：
Figure 2011224014
実施例１で説明したように、血清を、４×から６４×までの希釈範囲で、５つの異なる希釈中にプレートする。したがって、低い力価（すなわち、最も高い血清濃度のみにおける中和）と高い力価（すなわち、最も低い血清濃度のウェルでも中和）間を区別可能である。Ａｄ５に対する中和活性を含むことがわかった我々のスクリーンで使用されたヒト血清のうち、７０％が高い力価を有することがわかったが、Ａｄ３５に対するＮＡを含む血清のうち、１５％のみが高い活性を有した。Ａｄ１１に対するＮＡについて陽性であった血清のうち、８％のみが高い力価を有した。Ａｄ４９に対してこれは５％であった。
したがって、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ａｄ４９に対するＮＡの頻度が、Ａｄ５に対するようにずっと低いのみならず、これらのウイルスに対するＮＡを含む血清のうち、多くが低い力価を有する。Ａｄ１１、Ａｄ３５、またはＡｄ４９に基づくアデノウイルスベクターは、感染効率が中和活性により妨げられる適用で、またはインビボで予防接種ベクターまたは遺伝子治療伝達体として使用される場合、Ａｄ５基ベクターに対して明らかな利点を有する。
以下の例で、安全で、ＲＣＡフリーなＡｄ３５基ベクターの生成に対するベクターシステムの構成を説明する。
実施例６
ヒトアデノウイルス型３５の配列
Ａｄ３５ウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞で増殖し、ＤＮＡを実施例４に記載したように単離した。全配列をQiagen Sequence Service (Qiagen GmbH, Germany)により生成した。全ウイルスＤＮＡを超音波処理で剪断し、ＤＮＡ末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。
剪断平滑化フラグメントは、アガロースゲル上でサイズ分画され、１．８から２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントに対応するゲルスライスを得た。ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出プロトコルによりゲルスライスから精製し、ｐＵＣ１９プラスミドクローニングベクターのショットガンライブラリーにサブクローン化した。目標ＤＮＡ８（＋／−２）倍をカバーする９６ウェルプレートのクローンのアレイを使用して、全配列を生成した。配列化を、Perkin-Elmer 9700 thermo cyclersで、BigDyeTerminator chemistry nd AmpliTag FS DNA ポリメラーゼを使用して行い、その後、QIAGEN DyeEx 96 technology を使用して配列化反応の精製を行った。その後、配列化反応生成物をABI377XL96 lane sequencersでフラグメントの自動分離および検出に付した。イニシャル配列コンティグ(contig)配列およびギャップを、目標ＤＮＡ上のプライマーウオーキングリードにより、またはＰＣＲ生成物の直接配列化により満たした。ウイルス末端は、ショットガン中にないことがわかった。おそらくウイルスＤＮＡのプロテイナーゼＫ消化後にＩＴＲ配列に結合しているｐＴＰのアミノ酸から得られたクローニングが困難なためである。
付加的な配列は、これらの領域における配列の殆どを解決するウイルスＤＮＡ上をランするが、殆どのターミナルヌクレオチドの明確な配列を得ることは困難であった。５’末端で得られた配列は、５’−ＣＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴ．．−３’であった。しかし、３’末端で得られた配列は、５’−ＡＧＧＴＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧ−３’であった。殆どのヒトアデノウイルスは、末端配列５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ−３’を有する。さらに、ｐＢｒ３２２へのターミナル７ｋｂ Ａｄ３５ ＥｃｏＲＩ フラグメントのクローニング後に得たＡｄ３５ＤＮＡの３’末端を表すクローン（参照：実施例４）は、典型的なＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴ．．．配列を有することがわかった。しかし、Ａｄ３５は典型的な末端配列を有し、ウイルスＤＮＡ上に直接配列化する際に得た相違は、ラン−オフ配列ランに関連するアーチファクトおよびｐＴＰの残りのアミノ酸の存在のためである。
訂正したターミアル配列を有するＡｄ３５の全配列を、図６に示す。基礎になるＡｄ５（genbank # M72360）およびＡｄ７（部分的配列genbank # X03000）を有する配列ホモロジーおよびオープンリーディングフレームの位置に、ウイルスの体制は殆どのヒトアデノウイルス、特にサブグループＢウイルスの一般的な体制に一致する。ゲノムの全長は３４７９４塩基対である。
実施例７
組み換え体Ａｄ３５基ウイルスを生成するプラスミド基ベクターシステムの構成
組み換え体アデノウイルスベクターを生成する機能的プラスミド基ベクターシステムは以下の成分からなる：
１．左のＩＴＲおよびＡｄ３５由来パッケージング配列および異種発現カセットの挿入断片に対する少なくとも１つの制限部位からなりＥ１配列がないアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドは、ｐＩＸプロモーターを含む領域をコードし、第２の核酸分子を有するアダプタープラスミドの同種組み換え体を媒介するのに充分な配列をコードするＥ１ＢからのＡｄ３５配列３’を含む。
２．アダプタープラスミドに同種の配列、複製、およびパッケージング細胞中には存在せず速い、中間の、遅い遺伝子である、組み換え体ウイルスのパッケージングに必要なＡｄ３５配列を含む第２の核酸分子。
３．Ａｄ３５のＥ１機能を補うことができる少なくとも機能的Ｅ１蛋白質を提供するパッケージング細胞。
相補パッケージング細胞での組み換え体アデノウイルスの生成に対する他の方法は、当業界でしられており、発明から解離することなくＡｄ３５ウイルスに適用可能である。例として、先に概略を示したプラスミド基システムの構成を以下に詳述する。
１）Ａｄ３５アダプタープラスミドの構成
アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ（図７、実施例２に記載）を、先ず改変して、拡張されたポリリンカーを含み、左のＩＴＲをフランキングする便利なユニーク制限部位を有するアダプタープラスミドおよび３’末端におけるアデノウイルス配列を得て、プラスミドベクター配列からのアデノウイルス挿入断片の遊離を可能にした。これらのプラスミドの構成を以下に詳細に説明する：アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ（実施例２）をＳａｌＩで消化し、シュリンプアルカリフォスファターゼで処理し、再結合を減少させた。以下の２つのリン酸化およびアニール化オリゴからなるリンカー：ＥｘＳａｌＰａｃＦ ５′−ＴＣＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＧＧ ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＧＧ ＴＴＣ ＧＡＡ ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＡ−３′およびＥｘＳａｌＰａｃＲ ５′−ＴＣＧ ＡＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＴＣ ＧＡＡ ＣＣＣ ＡＴＡ ＡＴＡ ＣＣＣ ＡＴＡ ＡＴＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＴＧＣ ＣＡ−３′；を、消化した構成に直接結合し、これにより、Ｐｉ−ＰｓｐＩ，ＳｗａＩおよびＰａｃＩによりＳａｌＩ制限部位を置換した。この構成をｐＡＤＡＰＴ＋ＥｘＳａｌＰａｃリンカーと呼ぶ。さらに、ｐＡｄＡｐｔの左ＩＴＲの一部を以下のプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した：ＰＣＬＩＰＭＳＦ ５′−ＣＣＣ ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＡＡ ＴＡＴ ＡＣＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＧＧ：およびｐＣＬＩＰＢＳＲＧＩ：５′−ＧＣＧ ＡＡＡ ＡＴＴ ＧＴＣ ＡＣＴ ＴＣＣ ＴＧＴ Ｇ−３′。増幅したフラグメントをＭｕｎＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ（参照：実施例２）にクローン化し、ＥｃｏＲＩで部分的に消化し、精製後、ＢｓｒＧＩで消化した。これにより、左のＩＴＲおよびパッケージングシグナルを再挿入した。制限酵素分析の後、この構成をＳｃａＩおよびＳｇｒＡＩで消化し、８００ｂｐフラグメントをゲルから単離し、ＳｃａＩ／ＳｇｒＡＩ消化ｐＡＤＡＰＴ＋ＥｘＳａｌＰａｃリンカーに結合した。ｐＩＰｓｐＳａｌＡｄａｐｔと呼ぶ得られた構成をＳａｌＩで消化し、脱リン酸化し、上記のリン酸化ＥｘＳａｌＰａｃＦ／ＥｘＳａｌＰａｃＲダブルストランドリンカーに結合した。ＰａｃＩ部位がＩＴＲに最も近いクローンを、制限分析により同定し、配列を配列分析により確認した。ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ（図８）と呼ぶこの新規なｐＡｄＡｐｔ構成は、ＰａｃＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩおよびＢｓｔＢＩに対する認識配列を含む２つのＥｘＳａｌＰａｃリンカーを有し、アデノウイルスアダプター構成のアデノウイルス部分を囲み、プラスミドＤＮＡをリニア化するに使用でき、その後アデノウイルスヘルパーフラグメントを用いたコトランスフェクションが可能である。
トランスジーンクローニング順序をさらに増加するために、多くのポリリンカー変異型をｐＩＰｓｐＡｄａｐｔに基づいて構成した。この目的のために、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔを先ずＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化した。以下の２つのリン酸化およびアニール化オリゴからなるリンカー：Ｅｃｏｌｉｎｋｅｒ＋：５′−ＡＡＴ ＴＣＧ ＧＣＧ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＣＧＣ ＣＣＧ Ｃ−３′およびＥｃｏｌｉｎｋｅｒ−：５′−ＡＡＴ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＡＴ ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＧＣ ＧＣＣ Ｇ−３′；を、この構成に結合し、これによりＡｓｃＩ，ＳａｌＩ，ＥｃｏＲＶ，ＣｌａＩおよびＮｏｔＩに対する制限部位を作った。このリンカーの両配向を得て、配列を制限分析および配列分析により確認した。オーダー５’ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＡｇｅＩ，ＥｃｏＲＩ，ＡｓｃＩ，ＳａｌＩ，ＥｃｏＲＶ，ＣｌａＩ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ，ＨｐａＩ，ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩにおけるリンカーを含むプラスミドをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ１（図９）と呼び、オーダー５’ＨｉｎｄＩＩＩ，ＫｐｎＩ，ＡｇｅＩ，ＮｏｔＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＡｓｃＩ，ＥｃｏＲＩ，ＮｈｅＩ，ＨｐａＩ，ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩにおけるリンカーを含むプラスミドをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ２と呼ぶ。
他のセンスまたはアンチセンス構成のクローニングを促進するために、以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるリンカーを設計し、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔのポリリンカーを逆にした：ＨｉｎｄＸｂａ＋５′−ＡＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＴ ＡＡＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ Ａ−３′；ＨｉｎｄＸｂａ−５′−ＣＴＡ ＧＴＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＴＡ ＧＣＧ ＴＴＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＴＡ Ｇ−３′。このリンカーをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔに結合し、正しい構成を単離した。
制限酵素分析および配列化により確認した。この新規な構成ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔＡをＥｃｏＲＩで消化し、上記エコリンカーをこの構成に結合した。このリンカーの両配向を得て、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ３（図１０）を得た。これは、オーダーＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｐａＩ，ＮｈｅＩ，ＥｃｏＲＩ，ＡｓｃＩ，ＳａｌＩ，ＥｃｏＲＶ，ＣｌａＩ，ＮｏｔＩ，ＡｇｅＩ，ＫｐｎＩ，およびＨｉｎｄＩＩＩポリリンカーを含む。全配列を制限酵素分析および配列化により確認した。
Ａｄ３５基アダプタープラスミドを以下のように構成した：
左のＩＴＲおよびＡｄ３５ｗｔ配列ヌクレオチド１〜４６４（図６）に対応するパッケージング配列をＰＣＲにより、以下のプライマーを使用してｗｔＡｄ３５ＤＮＡについてのＰＣＲにより増幅した：
プライマー３５Ｆ１：
５′−ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＴＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＡＴＡ ＣＣＴ ＴＡＴ ＡＧ−３′
プライマー３５Ｒ２：
５′−ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＣＡ ＣＣＴ ＡＣＧ ＴＡＡ ＡＡＡ ＧＡＧ−３′
増幅により、配列の５’末端のＰａｃＩ部位および３’末端のＡｖｒＩＩ部位を導入した。
増幅のために、白金ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＬＴＩ）を製造者の指示にしたがって使用したが、３％の最終濃度に０．６μＭのプライマーおよびＤＭＳＯを添加した。増幅プログラムは以下のようである：つまり、３０サイクルに対して９４℃で２分（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分）、次に６８℃で１０分。
ＰＣＲ生成物を、製造者の指示にしたがってｐｃｒ精製キット（ＬＴＩ）を使用して精製し、ＰｃａＩおよびＡｖｒＩＩで消化した。その後、消化したフラグメントをジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）を使用してゲルから精製した。Ａｄ５基アダプタープラスミドｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ−３（図１０）をＡｖｒＩＩで消化し、その後、ＰｃａＩで部分的に消化し、５７６２ｂｐフラグメントをＬＭＰアガロースゲルスライスで単離し、同じ酵素で消化した上記ＰＣＲフラグメントで結合し、電子受容能（electrocompetent）DH10B細胞（ＬＴＩ）に形質転換した。得られたクローンをｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ３−Ａｄ３５ｌＩＴＲと呼ぶ。
並行的に、Ａｄ３５ＤＮＡの第２のピースを以下のプライマーを使用して増幅した：
３５Ｆ３：５′−ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＡＣ−３′
３５Ｒ４：５′−ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＡＡ ＴＴＡ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＴＧ ＣＡＡ ＡＴＣ ＴＧＴ ＧＡＧ Ｇ−３′
このフラグメントの配列は、ｗｔＡｄ３５（図６）のｎｕｃｌ．３４０１から４６６９に対応し、Ｅ１Ｂ５５ｋコード配列から直接３’から開始する１．３ｋｂの配列を含む。増幅および精製を、左のＩＴＲおよびパッケージング配列含有フラグメントに対して上記のようにして行った。その後、ＰＣＲフラグメントをＰａｃＩで消化し、ＳａｍＩおよびＰａｃＩで消化したｐＮＥＢ１９３ベクター（New England Biokabs）にサブクローン化した。得られたクローンの配列の完全性を配列分析により確認した。
そしてｐＮＥＢ／Ａｄ３５ｐＦ３Ｒ４をＢｇｌＩＩとＰａｃＩによって消化し、ＱＩＡＥｘＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＡｄ３５挿入物をゲルから単離した。ｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ３−Ａｄ３５ｌＩＴＲはＢｇｌＩＩにより、そしてＰａｃＩにより部分的に消化された。３６２４ｂｐの断片（ベクター配列、ａｄ３５ＩＴＲ及びパッケージ配列のみならずＣＭＶプロモーター、複合的なクローニング領域及びポリＡシグナルを含んでいる）もまた、ＱＩＡＥｘＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離された。両断片はライゲートされて、コンピーテントなＤＨ１０Ｂ細胞（ＬＴＩ）の中へ形質転換された。得られたクローンであるｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ３（図１１）は、ｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ３に由来する発現カセットを有しているが、Ａｄ３５レフトＩＴＲ及びパッケージ配列及びＡｄ３５に由来する塩基３４０１から４６６９に対応する第二の断片を含んでいる。複合的なクローニング部位を反対の方向性で有しているＡｄ３５アダプタープラスミドの第二のバージョンは、下記の様にして作られた。
ｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ１（図９）はＮｄｅＩとＢｇｌＩＩによって消化され、ＣＭＶプロモーターの一部分を含んでいる０．７ｋｂｐのバンド、ＭＣＳとＳＶ４０ポリＡは単離され、ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ３の対応する部位に挿入されて、ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１を生成する（図１２）。
そしてｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ及びｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃアダプタープラスミドを、ｐｃＤＮＡ．ＬａｃＺ（ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにより消化された）とｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩにより消化された）に由来するトランス遺伝子を、ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１中の対応部位へ挿入することにより生成した。ｐｃＤＮＡ．ＬａｃＺ及びｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃの生成は、ＷＯ９９／５５１３２に述べられている。
２）ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＸＩ−ｒＩＴＲコスミドの構築
図１３は、Ａｄ３５配列の３４０１ｂｐから３４７９４（ライトＩＴＲの末端）を含んでいるコスミドクローンの構築を保証する種々の工程を表し、それを下記に詳しく述べる。
第一のＰＣＲ断片（ｐＩＸ−ＮｄｅＩ）を下記のプライマーセットを用いて生成した。
３５Ｆ５：５’−ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＧＧ ＴＧＡＧＴＡ ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＡＡ Ｃ−３’
３５Ｒ６：５’−ＣＧＣ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＡＣＡＧ−３’
ＤＮＡポリメラーゼＰｗｏ（ロシュ）を、製造者の指示に従って使用したが、両プライマーの終濃度は０．６μＭとし、５０ナノグラムのｗｔＡｄ３５のＤＮＡを鋳型として使用した。下記の様にして増幅を行った。即ち、９４℃で２分、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、そして７２℃で１分４５秒を３０サイクル、続いて６８℃で８分である。ＴＡクローニングベクターＰＣＲ２．１でのクローニングを可能とするために、１ユニットのｓｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼ（ＨＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＴＤ）による最後のインキュベーションを、７２℃で１０分間行った。
３３７０ｂｐの増幅された断片は、５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位を有する、３４０１から６７７２ｂｐまでのＡｄ３５配列を含む。ＰＣＲ精製キット（ＬＴ１）を用いて断片を精製した。
第二のＰＣＲ断片（ＮｄｅＩ−ｒＩＴＲ）を下記のプライマーを用いて作製した。
３５Ｆ７：５’−ＧＡＡ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＴＡＡＴＣ−３’
３５Ｒ８：５’−ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＡＴ ＴＴＡＡＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＡ ＴＡＡ ＴＡＴ ＡＣＣ−３’
ｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（ＬＴＩ）を用いて、製造者の指示に従って、鋳型として１０ナノグラムのｗｔＡｄ３５のＤＮＡを使用して増幅を行ったが、０．６μＭの両プライマーと３％のＤＭＳＯを用いた。プログラムは下記の通りである。即ち、９４℃で３分、９４℃で３０秒、４０℃で４５秒、６８℃で２分４５秒を５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分４５秒を２５サイクルである。ＴＡクローニングベクターＰＣＲ２．１におけるクローニングを可能とするために、１ユニットのｓｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼを用いて７２℃で１０分間、最後のインキュベーションを行った。Ａｄ３５の塩基３３１７８からライトＩＴＲの末端までの範囲である、１．６ｋｂの増幅された断片を、ＰＣＲ精製キット（ＬＴ１）を用いて精製した。
両方の精製されたＰＣＲ断片を、ＴＡ−クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰＣＲ２．１ベクターへライゲートし、ＳＴＢＬ−２コンピーテント細胞（ＬＴ１）へ形質導入した。予期された挿入を含むクローンの配列を決定して増幅が正しいことを確認した。次に、ＮｏｔＩとＮｄｅＩを用いた消化により両断片をベクターから切り出し、ジェネクリーンキット（ＢＩＯ １０１，Ｉｎｃ．）を用いてゲルから精製した。コスミドベクターｐＷＥ１５（クローンテック）をＮｏｔＩにより消化し、脱リン酸化し、やはりゲルから精製した。これらの３つの断片をライゲートし、ＳＴＢＬ２コンピーテント細胞（ＬＴ１）中へ形質導入した。両方のＰＣＲ断片を含んでいる正しいクローンの一つを、その後ＮｄｅＩによって消化し、そして平滑断片をジェネクリーンキットを用いてゲルから精製した。Ａｄ３５のｗｔＤＮＡをＮｄｅＩを用いて消化し、、製造者の指示に従って、２６．６ｂｐの断片をアガロースエンザイム（ロシュ）を用いてＬＭＰゲルから精製した。これらの断片を共にライゲートし、製造者のプロトコールに従って、λファージパッケージングエクストラクト（ストラタジーン）を用いてパッケージした。ＳＴＢＬ−２細胞へ感染させた後、コロニーをプレート上で生育して完全な挿入物の存在を解析した。正しい方向性で挿入された大きな断片を持ち、また３つの酵素（ＮｃｏＩ，ＰｖｕＩＩとＳｃａＩ）を用いたイナエペナエント（ｉｎａｅｐｅｎａｅｎｔ）な消化の後に正しい制限パターンを有している、一つのクローンが選抜された。このクローンはｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと名付けられた。それはＡｓ３５配列をｂｐ３４０１から末端まで含み、ＮｏｔＩ部位によってフランキングされている（図１４）。
３）ＰＥＲ．Ｃ６におけるＡｄ３５に基づく組み換えウイルスの産生野生型Ａｄ３５ウイルスは、非常に高いタイターまでＰＥＲ．Ｃ６パッキング細胞において生育することができる。しかし、ＰＥＲ．Ｃ６に存在しているＡｄ５−Ｅ１領域が、Ｅ１が欠損したＡｄ３５組み換えウイルスを補うことが可能であるかどうかについては知られていない。これを試験するために、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、上記のアダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺと大きな骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）断片ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにより、共トランスフェクションを行った。最初に、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺをＰａｃＩによって消化し、そしてｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲをＮｏｔＩによって消化した。それ以上の精製は行わずに、各構築物の４マイクログラムをＤＭＥＭ（ＬＴ１）と混合し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞へトランスフェクトし、製造者の指示に従ってリポフェクタミン（ＬＴ１）を使用しながら、Ｔ２５フラスコ中へ５×１０６ 細胞個の密度で前日に播種を行った。陽性コントロールとして、ＰａｃＩにより消化された６マイクログラムのｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲのＤＮＡを６．７ｋｂのＮｈｅＩ断片と共トランスフェクトし、その断片はＥ１領域を含むウイルスゲノムの左末端を含んでいるＡｄ３５ｗｔのＤＮＡから単離された。
次の日に培地（１０％ＦＢＳと１０ｍＭのＭｇＣｌ２ を含むＤＭＥＭ）を新たにし、更に細胞を培養した。トランスフェクションに続いた２日目に、細胞をトリプシン処理してＴ８０フラスコに移した。陽性コントロールフラスコは、トランスフェクションに続く５日目でＣＰＥを示し、それはｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ構築物は、少なくともＡｄ３５−Ｅ１蛋白質の存在下で機能していることを示している。Ａｄ３５ ＬａｃＺアダプタープラスミドとｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲによるトランスフェクションは、ＣＰＥを引き起こさなかった。これらの細胞は１０日目に培地中で回収され、細胞からウイルスを放出させるために一度凍結／解凍を行った。回収された材料の４ｍｌを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（８０％コンフルエント）と共にＴ８０フラスコへ添加し、更に５日間培養した。この回収／再感染は２回繰り返されたが、ウイルスに関連したＣＰＥについての証拠は何もなかった。この実験から、Ａｄ５−Ｅ１蛋白質はＡｄ３５組み換えウイルスを補うことができないか、あるいは不十分であるようだが、しかし、アダプタープラスミドとｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ骨格プラスミドの配列の重複が、効率的に組み換えて組み換えウイルスゲノムを生じさせるには不十分であるということかもしれない。陽性コントロールのトランスフェクションが６．７ｋｂの左末端断片を用いて行われ、そのために配列重複は約３．５ｋｂであった。アダプタープラスミド及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ断片は１．３ｋｐの重複配列を有していた。
１．３ｋｐの重複が効率的な相同性組み換えに小さ過ぎるかどうかをチェックするために、ＰａｃＩで消化されたｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと、上記の３５Ｆ１と３６Ｒ４によって生成したＡｄ３５ｗｔのＤＮＡのＰＣＲ断片と共に、前に述べたのと同様の方法を用いて共トランスフェクトが行われた。そこでＰＣＲ断片はｂｐ４６６９までの左配列を含み、そしてそのためにアダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺと同様の、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲとの重複配列を有しているが、Ａｄ３５Ｅ１配列を有している。ＰＣＲカラム精製に続いて、無傷であるかもしれない鋳型配列を除去するために、ＤＮＡをＳａｌＩで消化した。消化されたＰＣＲ産物単独とのトランスフェクションは、陰性コントロールとして役立った。トランスフェクションの４日後に、ＰＣＲ産物及びＡｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲ断片によってトランスフェクトされた細胞でＣＰＥが起こったが、陰性コントロールにおいては起こらなかった。これは、１．３ｋｂの重複配列は、Ａｄ３５Ｅ１蛋白質があるところでウイルスを生成するのに十分であることを示している。これらの実験より、少なくとも一つのＡｄ３５．Ｅ１配列蛋白質の存在が、Ａｄ３５を相補する細胞系列で、組み換えＡｄ３５に基づくベクターをプラスミドＤＮＡから生成するのに必要である、と我々は結論した。
実施例８
１）Ａｄ３５．Ｅ１発現プラスミドの構築
ＰＥＲ．Ｃ６中でＡｄ５−Ｅ１蛋白質は効率的にＡｄ３５組み換えウイルスを相補することができなかったので、Ａｄ３５Ｅ１蛋白質はＡｄ５を相補をしている細胞において発現されなければならず（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６）、あるいは２倍体初代ヒト細胞又はアデノウイルスＥ１蛋白質を発現していない確立された細胞系列から始めて、Ａｄ３５Ｅ１蛋白質を発現している新たなパッケージ細胞系列を作らなければならない。最初の可能性に取り組むために、下記に示す様にＡｄ３５Ｅ１領域を発現プラスミド中でクローン化した。
最初に、ｂｐ４６８からｂｐ３４００までのＡｄ３５Ｅ１領域を、下記のプライマーセットを用いてｗｔＡｄ３５ＤＮＡから増幅した。
３５Ｆ１１：５’−ＧＧＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＣＧＣ ＴＡＧ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＡＣＣ−３’
３５Ｆ１０：５’−ＧＣＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＧＴ ＣＡＧ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＡＣ ＴＧ−３’
このＰＣＲは、５’末端にＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ部位を導入し、更に３’末端にＳｂｆＩとＸｂａＩ部位を導入する。
製造者の指示を用いてＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）により、５ナノグラムの鋳型ＤＮＡにおける増幅を行ったが、しかし、両プライマーは最終濃度０．６μＭを用いた。プログラムは下記の通りである。即ち、９４℃で２分、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で２分を５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分を２５サイクル、続いて７２℃で１０分である。ＰＣＲ生成物をＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）によって精製し、ＫｐｎＩとＸｂａＩによって消化した。そして消化されたＰＣＲ断片を、発現ベクターｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏ（下記を見よ）へライゲーションし、またＫｐｎＩとＸｂａＩによって消化した。ライゲーションされた物は製造者のマニュアルに従ってコンピーテントなＳＴＢＬ−２細胞（ＬＴＩ）へ形質導入され、コロニーについて、Ａｄ３５Ｅ１配列がＲＳＶプロモーターとＨＢＶポリＡの間のポリリンカーへ正しく挿入されているか解析した。得られたクローンをｐＲＳＶ．Ａｄ３５−Ｅ１と名ずけた（図１５）。ＲＳＶ．Ａｄ３５−Ｅ１中のＡｄ３５配列を、配列解析によってチェックした。
ｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏを以下の様に生成した。ｐＲｃ−ＲＳＶ（インビトロゲン）をＰｖｕＩＩで消化し、ＲＳＡＰ酵素（ＬＴＩ）によって脱リン酸化し、３ｂｐベクター断片を低融点アガロース（ＬＭＰ）中で単離した。ＷＯ９６／３５７９８において述べられたプラスミドｐＰＧＫｎｅｏｐＡ（図１６）をＳｓｐＩで完全に消化してそのプラスミドを平滑化し、ＰｖｕＩＩによる部分消化を促進した。ＰｖｕＩＩによる部分消化に続き、得られた断片をＬＭＰアガロースゲルで分離し、ＰＧＫプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子及びＨＢＶｐｏｌｙＡを含む２２４５ｂｐのＰｖｕＩＩ断片を単離した。両者の単離された断片はライゲートされて発現ベクターｐＲＳＶ−ｐＮｅｏを与え、それは今はＰＧＫｐｒｏｍ−ｎｅｏ−ＨＢＶ−ｐｏｌｙＡカセットによって置換された、元来のＳＶ４０ｐｒｏｍ−ｎｅｏ−ＨＢＶ−ｐｏｌｙＡ発現カセットを有している（図１７）。このプラスミドは更に改変され、下記の様にＢＧＨｐＡがＨＢＶｐＡで置換されている。即ち、ｐＲＳＶｐＮｅｏはＳｃａＩによって平滑化され、ＸｂａＩによって更に消化された。Ａｍｐ遺伝子の一部とＲＳＶプロモーター配列とポリリンカー配列を含んでいる１１４５ｂｐ断片は、ジェネクリーンキット（Ｂｉｏ Ｉｎｃ．１０１）を用いてゲルから単離された。次にｐＲＳＶｐＮｅｏはＳｃａＩによって平滑化され、更にＥｃｏＲＩによって部分的に消化され、ＰＧＫｎｅｏカセット及びベクター配列を含んでいる３７０４ｂｐ断片は、上記の様にゲルから単離された。ＸｂａＩとＥｃｏＲＩによって５’と３’末端においてそれぞれフランキングされたＨＢＶｐｏｌｙＡ配列を含む第三の断片は、下記のプライマーセットを用いてｐＲＳＶｐＮｅｏでのＰＣＲ増幅によって生成された。
ＨＢＶ−Ｆ；５’−ＧＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＡＴ ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＧＧ ＧＡＣ ＧＴＣ−３’及び
ＨＢＶ−Ｒ；５’−ＧＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＡＣ ＣＡＡ ＧＣ−３’
増幅は、エロゲナーゼ酵素（ＬＴＩ）によって製造者の指示に従って、下記の条件で行われた。即ち、９４℃で２分，そして９４℃で４５秒、４２℃で１分、６８℃で１分を５サイクル、続いて９４℃で４５秒、６５℃で１分、及び６８℃で１分を３０サイクル、続いて６８℃で１０分である。そして６２５ｂｐのＰＣＲ断片をＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ジェネクリーンキットを用いてゲルから精製した。３つの精製された断片はライゲートされ、ｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏ構築物を与えるために、ＤＨ５αコンピーテント細胞（ＬＴＩ）中へ形質導入された（図１８）。この構築物において、ＲＳＶ発現カセットの転写制御領域及びネオマイシン選抜マーカーは改変され、ＣＭＶとＳＶ４０転写制御配列をしばしば含む、アデノウイルスベクターとの重複が減少した。
２）Ａｄ３５−Ｅ１発現構築物と共トランスフェクトされたＰＥＲ．Ｃ６細胞でのＡｄ３５組み換えウイルスの生成
ＰＥＲ．Ｃ６細胞は５×１０6 細胞の密度でＴ２５フラスコ中に播種され、次の日に以下を含むＤＮＡ混合物によりトランスフェクトされた。
− ＰａｃＩによって消化されたｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ １μｇ
− 消化されていないｐＲＳＶ．Ａｄ３５Ｅ１ ５μｇ
− ＮｏｔＩによって消化されたｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ ２μｇ
トランスフェクションは、製造者の指示に従ってリポフェクタミンを用いて行った。トランスフェクション混合物を細胞に添加して５時間後、培地を取り除いて新鮮な培地に置き換えた。２日後に細胞をＴ８０フラスコへ移して、更に培養した。トランスフェクションの１週間後、１ｍｌの培地をＡ５４９細胞に加え、次の日に細胞を染色してＬａｃＺ発現をみた。染色して２時間後に青い細胞が明らかに見えるようになり、それは組み換えＬａｃＺを発現しているウイルスが作製されたことを示している。細胞は更に培養されたが、明らかなＣＰＥの出現は見られなかった。しかし１２日後に細胞の塊が単層で現れ、続く１８日後にトランスフェクション細胞は剥がされた。そして細胞と培地を回収し、一度凍結融解し、１ｍｌの粗ライゼイートを用いて６穴プレートでＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染させた。感染して２日後に、ＬａｃＺ活性をみるために細胞を染色した。２時間後に１５％の細胞が青く染色された。ｗｔ及び／又は複製しているコンピーテントなウイルスの存在を試験するために、Ａ５４９細胞をこれらのウイルスで感染し、更に培養した。ＣＰＥの兆候は見られず、それは複製能力のあるウイルスが存在しないことを示している。これらの実験は、組み換えＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスが、Ａｄ３５−Ｅ１発現構築物と共トランスフェクトされたＰＥＲ．Ｃ６細胞で作られたことを示している。
３）Ａｄ５ウイルスの中和活性を含むヒト血清の中でＡｄ３５組み換えウイルスは中和を逃れる
そしてＡｄ５ウイルスの中和活性を含むヒト血清の存在下での感染を検討するために、ＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスをを使用した。精製したＡｄ５に基づくＬａｃＺウイルスを、ＮＡの陽性コントロールとして使用した。ここで、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を２×１０５ 細胞／ウェルの密度で、２４穴のプレートに播種した。次の日に、Ａｄ５を中和する高い活性を有するヒト血清サンプルを、培養培地中で５段階で５倍希釈した。そして０．５ｍｌの希釈された血清を、０．５ｍｌの培地に入ったＡｄＡｐｔ５．ＬａｃＺウイルスの４×１０６ のウイルス微粒子と混合し、そして３７℃で３０分間インキュベーションした後、０．５ｍｌの混合物を２重の系列でＰＥＲ．Ｃ６細胞に添加した。ＡｄＡｐｔ５．ＬａｃＺウイルスについて、０．５ｍｌの希釈された血清サンプルをＡｄＡｐｔ５．ＬａｃＺウイルスを含んでいる０．５ｍｌの粗ライゼートと混合し、そしてインキュベーションの後にこの混合物の０．５ｍｌを、２重の系列でＰＥＲ．Ｃ６細胞に添加した。血清がない培地中でインキュベートされたウイルスサンプルを、感染の陽性コントロールとして使用した。３７℃で２時間感染した後、培地を添加して最終容量を１ｍｌとし、細胞を更にインキュベートした。感染の２日後、細胞を染色してＬａｃＺ活性を見た。結果を表IIに示す。これらの結果から、ＡｄＡｐｔ５．ＬａｃＺウイルスは効果的に中和されたが、ヒト血清が存在しているにも関わらずＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺウイルスが感染性を残していることは、明らかである。これは、組み換えＡｄ３５に基づくウイルスは、Ａｄ５に基づくウイルスへのＮＡを含むヒト血清中で中和を逃れることを証明するものである。
実施例９
ネモポエティック（ｎｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ）なＣＤ３４Ｌｉｎ幹細胞に対する細胞型特異性を有するＡｄ５／ファイバー３５キメラベクター
実施例３において、我々は他の血清型の繊維蛋白質を有するアデノウイルスに基づくＡｄ５のライブラリーの生成について述べた。このライブラリーの使用方法のための限定的ではない実施例として我々はここで、血液幹細胞の感染が改善されたことを示す、繊維組織で改変されたアデノウイルスの同定について述べる。
ＣＤ３４抗原が陽性であって、早期の分化マーカーであるＣＤ３３、ＣＤ３８そしてＣＤ７１（ｌｉｎ- ）が陰性であるというフローサイトメーター上における表現型を有する、ヒト骨髄、臍帯血、又は動員された末梢血から単離された細胞は、一般的に血球幹細胞（ＨＳＣ）と呼ばれている。全ての造血性系統はこれらの細胞から得られるためにこれらの細胞の遺伝的改変は非常に興味深く、そしてそのためにＨＳＣは、多くの後天的又は先天的なヒト血液疾患の治療の標的細胞である。ＨＳＣの遺伝的な改変で治癒可能な病気の例としては、これらに限られるものではないが、ハーラー病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、ゴーシュ病、ファーバー病、ニーマンピック病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、Ｉ−細胞病、重症免疫不全症候群、Ｊａｋ−３欠損症、フコシダーゼ欠損症、サラセミア、及び赤血球産生ポリフィリン症が含まれる。これらの造血疾患の患者の他に、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び血液癌を予防又は治療しようとする戦略もまた、ＨＣＳ又はＡＩＤＳの場合のＣＤ４陽性Ｔリンパ球の様なＨＳＣから得られた細胞の遺伝的改変に基づいている。上記で挙げられた例は、よって、欠損している遺伝子と蛋白質の遺伝的レベルを補うために、ＨＳＣへＤＮＡを導入することを目的としている。ＡＩＤＳ又は癌のための戦略の場合、ＨＳＣに導入するべきＤＮＡは、抗ウイルス遺伝子又は自殺遺伝子であることができる。
上記で挙げた例に加えて、アデノウイルスのベクターを用いたＨＳＣの効率的な形質導入が重要な役割を果たす、いくつかの他の分野がある。例えば組織工学の分野がある。この分野において、ＨＳＣを特異的な系統へと分化させることは重要である。いくつかの例は、限定するものではないが、Ｔ細胞前駆体又は内皮細胞前駆体の生成のみならず、エクスビボでの骨生成、軟骨生成、皮膚生成である。バイオリアクターにおける骨、軟骨、又は皮膚の生成は、骨折、又は骨髄損傷、又は重症な火傷の後の移植のために用いることができる。自然に、形質転換された細胞を患者に直接的にも再注入されることもできる。ＨＳＣから多数の内皮細胞前駆体を生成することは興味深いが、それはこれらのＨＳＣは、再注入の後に、虚血の様な心血管系障害の部位に回帰できるからである。同様に、ＨＳＣから多数のＴ細胞を生成することは興味深いが、それはこれらのＴ細胞前駆体はエクスビボでプライム化され、プライム化されたＴ細胞を再注入した後にヒト体内で特定の標的を根絶することができるからである。ヒト体内における好ましい標的は、癌又はウイルスに感染した細胞であることができる。
上記で述べた例から、ＨＳＣへの効率的な遺伝子送達は、遺伝子治療の分野における主要な興味であると結論できる。そこで、アデノウイルス血清型５宿主細胞が、インビトロのみならずインビボにおいてもＨＳＣを標的とできるように及ぶように改変することは、本発明の主要な目的である。ヒトＨＳＣにとって好ましい感染特性を有するキメラアデノウイルスを同定するために、我々は代わりの血清型（血清型８、９、１３、１６、１７、３２、３５、４５、４０−Ｌ、５１）に由来する繊維分子を運搬する、Ａｄ５に基づくウイルスのライブラリーを作製した。繊維により改変されたこのライブラリーの生成は、実施例３において述べられている。Ａｄ５は対照として用いられた。ヒトＴＦ−１（赤白血病、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２００３）に関してこのライブラリーの小さなパネルを試験し、一方ヒト初代間質細胞とヒトＨＳＣに関して、生成した全てのキメラウイルスを試験した。
１０％ＦＣＳと５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（サンドス、バーセル、スイス）を添加したＤＭＥＭ中で、ヒトＴＦ−１細胞を日常的に維持した。骨髄吸入物から単離されたヒト初代繊維芽細胞様の間質を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で日常的に維持した。２４穴プレートのウェルあたり１×１０5 細胞の濃度で間質を播種した。播種して２４時間後に、全てマーカーとして緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を有している、Ａｄ５、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６、Ａｄ５．Ｆｉｂ１７、Ａｄ５．Ｆｉｂ３５、Ａｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌ、又はＡｄ５．Ｆｉｂ５１の細胞あたり１０００個のウイルス微粒子に細胞を２時間曝した。２時間後に細胞をＰＢＳで洗浄し、ウイルスを加えない培地に再播種を行った。ＴＦ−１細胞を２４穴プレートのウェルあたり２×１０５ 細胞の濃度で播種し、そしてまた異なったキメラアデノウイルスの１０００ウイルス微粒子に２時間曝した。２時間曝した後に細胞を洗浄することにより、ウイルスを除去した。
ウイルスに曝した４８時間後に両細胞型を回収し、フローサイトメーターを用いてＧＦＰの発現を解析した。図１９に示されるＴＦ−１の結果は、血清型１６、３５又は５１（全てアデノウイルスサブタイプＢに由来する）に由来する繊維組織を運んでいるキメラアデノウイルスは、Ａｄ５（サブタイプＣ）、Ａｄ５．Ｆｉｂ１７（サブタイプＤ）又はＡｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌ（サブタイプＦ）と比較して好ましい感染特性を有すことを示す。初代ヒト間質について試験したが、それはこれらの細胞はエクスビボの培養条件下でＨＳＣの増殖及び維持を可能とする「フィーダー」細胞として一般的に使用されているからである。ＴＦ−１細胞への形質導入と比較して、繊維キメラアデノウイルスはいずれも、ヒト初代間質へ効率的な形質導入を行うことができなかった（図２０）。ヒト繊維芽細胞様初代間質の適度な感染はＡｄ５においてのみ観察されたが、一方既知のレセプター分子のいずれもこれらの細胞において発現していないと観察されている（表III を見よ）。キメラウイルスを用いてヒト間質が感染しないことは有利であるが、それは共培養の設定においては、キメラアデノウイルスは間質の「フィーダー」細胞によって本来吸収されないと思われるからである。
フィーダーキメラウイルスの形質導入能力を試験するために、臍帯血（３個体）のプールを幹細胞の単離に用いた。ＭＡＣＳラボラトリー分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、製造者によって提供されたプロトコールを用いて、単核細胞調製物からＣＤ３４＋ 細胞を単離した。ＣＤ３４＋ 細胞の２×１０５ 個を１５０μｌの容量のＤＭＥＭ（血清なし；Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）の中に播種し、１０μｌのキメラアデノウイルス（最終的なウイルス微粒子／細胞比が１０００となるように）を添加した。試験したキメラアデノウイルスは、Ａｄ５、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６、Ａｄ５．Ｆｉｂ３５、Ａｄ５．Ｆｉｂ１７、Ａｄ５．Ｆｉｂ５１であり、全てマーカーとして緑色蛍光蛋白質（ＧＥＦ）を含んでいる。１０％ＣＯ２ の湿度の高い雰囲気下で、３７℃で２時間細胞をインキュベートした。その後に、５００μｌのＤＭＥＭによって細胞を一回洗浄し、５００μｌのＳｔｅｍＰｒｏ−３４ ＳＦ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に再懸濁した。
そして細胞を、２４穴のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で５日間、照射（２０Ｇｙ）して予め確立しておいたヒト骨髄間質（文献１）上で、１０％ＣＯ２ の湿度の高い雰囲気中で３７℃で培養した。５日後に全細胞集団を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコ）１００μｌを用いたトリプシン処理によって回収した。５日間の培養前後の細胞数を、ヘモサイトメーターを用いて測定した。各サンプル中のＣＤ３４＋ 及びＣＤ３４＋＋ＣＤ３３、３８、７１- 細胞の数を回収した全細胞数から計算し、全集団中におけるＣＤ３４＋＋ＣＤ３３、３８、７１- 細胞の頻度をＦＡＣＳ解析によって測定した。別個のサブ集団において、ＧＥＦを発現している細胞の頻度のみならず、個々の細胞あたりのＧＥＦの強度を観察している間に、ＦＡＣＳ解析によって形質導入効率を測定した。図２１に示されているこの実験の結果は、アデノウイルス血清型５又はキメラアデノウイルスＡｄ５．Ｆｉｂ１７はＣＤ３４＋ Ｌｉｎ- 細胞に感染しないことを示しており、それはＧＦＰが発現しないことによって見られたとおりである。対照的に、血清型１６、５１又は３５の繊維組織分子を有しているキメラウイルスにつき、この細胞集団において高いパーセンテージのＧＦＰ陽性細胞が記録された。ＣＤ３３、ＣＤ３８及びＣＤ７１もまた発現しているＣＤ３４＋ 細胞においてはＧＦＰの発現はほとんど見られなかったため、ＣＤ３４＋ Ｌｉｎ- について特異性が示された。細胞の早期分化マーカーＣＤ３３（骨髄）、ＣＤ７１（赤血球）及びＣＤ３８（共通した早期分化マーカー）について陽性の度合いが高くなる時に、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６、Ａｄ５．Ｆｉｂ３５又はＡｄ５．Ｆｉｂ５１を用いて、ＣＤ３４＋ Ｌｉｎ- 細胞のサブ分画（図２２）により、ＧＦＰが陽性である細胞のパーセンテージが減少することが示された。そこでこれらの結果は、キメラアデノウイルスＡｄ５．Ｆｉｂ１６、Ａｄ５．Ｆｉｂ３５及びＡｄ５．Ｆｉｂ５１の、ＨＳＣに対する特異性を示している。図２３はＡｄ５繊維組織と、Ａｄ１６、３５及び５１に由来するキメラＢグループ繊維蛋白質との配列の一致を示している。形質導入処理の後に回収された細胞の数を測定することにより、アデノウイルスの毒性を決定することができる。ＣＤ３４＋ Ｌｉｎ- の数のみならず、ＣＤ３４＋ 細胞が回収された数は（図２４）、１０００個のアデノウイルス微粒子に２時間曝すことは、回収された細胞の数に影響しないことを示している。
実施例１０
樹状細胞のための細胞型特異性を有するＡｄ３５／ファイバー３５キメラベクター
樹状細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、初期免疫反応を開始する様に特殊化されていて記憶型の免疫反応を促進することが可能である。それらの発達の段階に依存して、ＤＣは異なった機能を果たし、未成熟なＤＣは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ分子による提示のための、抗原の取り込みとプロセシングにおいて非常に有効であり、それに対して成熟ＤＣは、抗原獲得とプロセシングにおける有効性は低いが、細胞表面におけるＭＨＣ分子と共刺激分子の発現が高いために、記憶していない（ｎａｉｖｅ）及び記憶したＣＤ４＋ 及びＣＤ８＋ Ｔ細胞をより良く刺激する。未成熟なＤＣは抗原を取り込んだ後にインビボで成熟し、リンパ系器官のＴ細胞区域へ移動し、そしてＴ細胞活性化をプライムする。
ＤＣは免疫反応の惹起を担っている細胞なので、ＤＣを免疫刺激性蛋白質、ペプチドまたはこれらをコードする遺伝子にロードして免疫システムを引き起こすことについて、長い間興味が持たれてきた。この戦略の適用は、ワクチン接種の分野のみならず癌治療の分野でもある。これまで癌に対する戦略は主として、ＤＣを抗原（蛋白質又はペプチド）と共にエクスビボでロードすることに焦点が置かれてきた。この方法は細胞障害性Ｔ細胞活性を誘導する結果となるということが、これらの研究により明らかとなってきた。細胞をロードするのに用いられる抗原は、一般的には癌特異的であるとして同定されている。この様な抗原のいくつかの例として、限定をするものではないが、ＧＰ１００、ｍａｇｅ、メラノーマに対するＭａｒｔ−１がある。
癌の治療に加えて、ワクチン接種によって現在予防される可能性があるヒトの疾患が他に多くある。ワクチン接種の戦略において、「不活化された」病原体が、抗原提示細胞（即ち未成熟ＤＣ）の活性を介して免疫システムへ提示される。ワクチン接種の戦略を介する疾患予防の良く知られた例には、肝炎Ａ、Ｂ及びＣ、インフルエンザ、狂犬病、黄熱病、麻疹が含まれる。これらの良く知られたワクチン接種プログラムに加えて、マラリア、エボラ、リバーブラインドネス、ＨＩＶ及び他の多くの病気の治療のための研究プログラムが開発されてきた。上記の病原体の多くは、「不活化された」病原体の生成において危険であると考えられている。そこでこの後者は各病原体の蛋白質の単離及び特性解析を求めることとなり、それによって「完璧な」免疫反応を起こすことを可能とし、それによって野生型病原体の挑戦に対して完璧に防御するという結果となる。
この免疫刺激性蛋白質又はペプチドと共にＤＣをロードするという戦略を、治療的に実現可能とするために、少なくとも２つの別個の基準に合わなければならない。１）ＤＣを多量に単離することであって、そのＤＣは単離され、操作され、また方法を自己移植的とするために患者への再注入が可能である。今日までに、その様に多量の未成熟ＤＣを、任意に与えられたドナーに由来する、培養した末梢血単球から得ることが可能である。２）ＤＣに効率的に形質導入できるベクターであって、免疫刺激性の蛋白質をコードするＤＮＡを運搬できる様なもの。後者は非常に重要であり、なぜならばＤＣがリンパ系器官へと移動することが必要となる時には多くの蛋白質又はペプチドは既にＤＣから放出され、不完全な免疫プライミングが起こるという結果となっていることが、明らかとなっているからである。ＤＣは最終的に分化しておりそのために分裂しない細胞であるので、組み換えたアデノウイルスベクターは、抗原をコードしているＤＮＡをＤＣへ運搬すると考えられている。理想的にはこのアデノウイルスベクターは樹状細胞への高い親和性を有するべきであるが、加えてインビボにおけるＤＣの形質導入を達成する様な宿主の、中和抗体によって認識されるべきではない。この後者により、ＤＣのエクスビボ操作に対する必要性は除外されるが、現在主として行われているワクチン接種プログラムである、筋肉注射又は皮下注射と同等の医学的な手段を用いるという結果となるであろう。そこで、免疫原性の蛋白質をコードしているアデノウイルスベクターにより形質導入されたＤＣは、免疫治療とワクチン接種のための天然アジュバントとして役立つことに適していることが理想的である。
上記の例より、ＤＣへの効率的な遺伝子送達は遺伝子治療の分野における主要な興味であると結論することができる。そこで、アデノウイルス血清型５宿主細胞の範囲をインビトロのみならずインビボで標的化できるように改変することは、本発明の主要な興味である。キメラアデノウイルスをヒトＤＣにとって好ましい感染特性で同定するために、代わりの血清型（血清型８、９、１３、１６、１７、３２、３５、４５、４０−Ｌ、５１）に由来する繊維組織分子を有している、Ａｄ５に基づくウイルスのライブラリーを構築した。対照としてＡｄ５を用いた。我々は、未熟及び成熟ＤＣ由来のヒト単球の、異なった繊維組織が発現している組み換えキメラアデノウイルスへの感受性を評価した。
健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣを、フィコールハイパクー密度遠心分離によって単離した。ＦＩＴＣラベルした抗ヒト１４モノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による染色、抗ＦＩＴＣマイクロビーズ及びＭＡＣＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１４＋ 細胞を増やすことにより、ＰＢＭＣから単球を単離した。
この操作は通常、ＦＡＣＳによって解析される様に、９０％未満のＣＤ１４＋ 細胞の細胞集団であるという結果となる。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ギブコ）、２００ｎｇ／ｍｌのｒｈｕ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ／ＩＴＫ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈｕ ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ／ＩＴＫ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含んでいるＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ）を用いた培養液中に置き、サイトカインを含んでいる新鮮な培地によって一日おきに培養液を給餌しながら７日間培養した。この方法によって７日後に得られる未成熟なＤＣは、ＦＡＣＳ解析によって示される様に、ＣＤ８３- 、ＣＤ１４low 又はＣＤ１４- 、ＨＬＡ−ＤＲ＋ の表現型を発現する。未成熟なＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−ａを含んでいる培地中でその細胞を３日間培養することによって成させ、その後にはそれらは細胞表層にＣＤ８３を発現した。パイロット実験において、５×１０5個の未成熟なＤＣを２４穴プレートのウェルに播種し、各々の繊維組織組み換えウイルスの細胞あたり１００から１０００のウイルス微粒子に２４時間曝した。試験されたウイルスはアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）、及びＡｄ５に基づく繊維組織キメラウイルスである、Ａｄ５．Ｆｉｂ１２、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６、Ａｄ５．Ｆｉｂ２８、Ａｄ５．Ｆｉｂ３２、Ａｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌ（血清型４０の長い繊維）、Ａｄ５．Ｆｉｂ４９、及びＡｄ５．Ｆｉｂ５１（ここで、Ｆｉｂｘｘは繊維組織分子が由来する血清型を表す）であり、これらのウイルスはそれぞれ、サブグループＣ，Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｄ，Ｆ，Ｄ及びＢから得られた。２４時間後に細胞を溶解し（１％ トライトンＸ−１００／ＰＢＳ）、製造者によって提供されたプロトコールを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。図２５に示されるこの実験の結果は、Ａｄ５は未成熟ＤＣにあまり感染しないことを示しており、それは導入遺伝子の発現レベルが低いことによって見られたとおりである。対照的に、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６とＡｄ５．Ｆｉｂ５１（両者ともＢグループの繊維組織キメラウイルスである）そしてＡｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌ（サブグループＦ）もまた、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現に基づいた効率的な感染を示した。
第二の実験において、５×１０５ 個の未成熟及び成熟ＤＣを、全てマーカーとしてＬａｃＺ遺伝子を有している、Ａｄ５、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６、Ａｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌ、及びＡｄ５．Ｆｉｂ５１の細胞あたり、１００００のウイルス微粒子によって感染させた。ＣＭ−ＦＤＧキットシステムと製造者によって提供された指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）を使いて、フローサイトメトリー解析によりＬａｃＺの発現を観察した。図２６に示されているこの実験の結果は、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６とＡｄ５．Ｆｉｂ５１は、成熟及び未成熟のヒトＤＣに形質導入することにおいてＡｄ５より勝っている、という前の実験と一致している。またこの実験は、Ａｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌは、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６とＡｄ５．Ｆｉｂ５１程には良くないが、Ａｄ５よりは良いことを示している。これらの結果に基づき、Ｂグループウイルスの繊維組織を含んでいる他のキメラアデノウイルス、即ちＡｄ５．Ｆｉｂ１１とＡｄ５．Ｆｉｂ３５について、それらがＤＣに感染する能力を試験した。我々は未成熟なＤＣに焦点を絞ったが、なぜならば、これらは発現した導入遺伝子産物がＭＨＣクラスＩとＩＩが提示可能なペプチドとなる過程の細胞であるからである。
未成熟なＤＣを５×１０５個／ウェルの細胞密度で２４穴プレート（コースター）に播種し、細胞あたり１０００及び５０００ウイルス微粒子で感染させ、その後に、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定するまで、未成熟ＤＣのための条件下で細胞を４８時間培養した。図２７に示されるこの実験の結果は、グループＢウイルスの繊維組織を含んでいるＡｄ５に基づくキメラウイルスは未成熟ＤＣに効率的に感染する、ということを示している。第四の実験において、前で述べた実験と同様にして我々は再び未成熟ＤＣを感染させたが、この時にはＡｄ５、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６、及びＡｄ５．Ｆｉｂ３５を用いて、マーカー遺伝子として緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をのせた。ウイルス暴露の４８時間後にフローサイトメーターを用いて測定したＧＦＰ発現の結果が図２８に示され、これまでに得られたデータと相関している。そこで、これまでに得られた結果は、主として３５、５１、１６及び１１の繊維組織である、サブグループＢから得られた代替のアデノウイルス由来の繊維組織を有しているＡｄ５に基づくベクターは、ヒトＤＣに形質導入するにあたってＡｄ５より優れている、という点で一致している。ここで開示されたアデノウイルスは動物のワクチン接種にも非常に適している。
これを明らかにするために、マウス及びチンパンジー由来のＤＣについて我々は試験を行い、これらのウイルスをこれらの動物モデルにおいて使用することが可能であるかを確認した。サブグループＢ由来のヒトアデノウイルスについてのレセプターは今日まで知られておらず、そのためにこの蛋白質は種の間で保存されているかどうか未知であるために、この後者については格別に検討した。両者の種について、２４穴のプレートの１ウェルあたり１０5 個の未成熟なＤＣを播種した。続いて、マウスＤＣの場合にはＡｄ５、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６及びＡｄ５．Ｆｉｂ５１、そしてチンパンジーＤＣの場合にはＡｄ５及びＡｄ５．Ｆｉｂ３５の細胞あたり、１０００ウイルス微粒子に４８時間曝した（図２９を見よ）。マウスの実験は、マーカーとしてルシフェラーゼを有するウイルスを用いて行われ、Ａｄ５と比較しておよそ１０−５０倍のルシフェラーゼ活性の増加が示された。チンパンジーＤＣをＧＦＰウイルスによって感染させて、フローサイトメーターを用いて解析を行った。図２９にも示されているこれらの結果は、Ａｄ５．Ｆｉｂ３５（６６．５％）と比較して、Ａｄ５（３％）はチンパンジーＤＣへの形質導入が少ないことを示している。
実施例１１
Ａｄ１１に基づく組み換えウイルスと生成するためのプラスミドに基づくベクターシステムの構築
実施例５において述べた中和実験の結果は、Ａｄ３５と同様にＡｄ１１もまた、ヒト血清サンプルの大部分においては中和されないことを示している。そこで、Ａｄ１１に基づく組み換えアデノウイルスは、遺伝子治療処置及びワクチン接種のためのベクターとして、一般的に使用されるＡｄ２及びＡｄ５に基づくベクターよりも好ましい。Ａｄ３５とＡｄ１１の両者はＢグループのウイルスであり、ＤＮＡホモロジークラスター２に属するウイルスとして分類されている（Ｗａｄｅｌｌ，１９８４）。そこで、Ａｄ３５とＡｄ１１のゲノムは非常に似通っている。Ａｄ１１に基づく組み換えウイルスの作製ためプラスミドに基づくシステムを生成するために、実施例７において生成したアダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１を下記の様に改変した。
構築物ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１をＡｖｒＩＩにより、そしてＰａｃＩにより部分的に消化した。消化混合物をゲル上で分離し、発現カセットとベクター骨格を含んでいる４．４ｋｂの断片をジェネクリーンキット（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．）を用いて単離した。そして、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを製造者の指示に従って使用しながら、プライマー３５Ｆ１と３５Ｒ２（実施例７を見よ）を用いて、ｗｔＡｄ１１のＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）を用いながら得られた０．５ｋｂのＰＣＲ断片を精製し、上記で作製されたｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１の断片へライゲートした。これにより構築物ｐＡｄＡｐｔ１１−３５ＩＰ１が与えられ、その中では５’アデノウイルス断片はＡｄ１１の対応する配列へと変換されている。
次に、ｐＡｄＡｐｔ１１−３５ＩＰ１はＢｇｌＩＩによって、そして部分的にＰａｃＩによって分解される。得られた断片をゲル上で分離し、ベクター配列、５’アデノウイルス断片及び発現カセットを含んでいる３．６ｋｂ断片を、上記のようにゲルから精製する。次に、プライマー３５Ｆ３と３５Ｒ４（実施例７を見よ）を用いて、ｗｔＡｄ１１のＤＮＡのＰＣＲ断片を生成する。増幅は上記と同様に行われ、得られた１．３ｋｂ断片を精製し、ＢｇｌＩＩとＰａｃＩによって消化する。そして単離された断片をライゲートし、構築物ｐＡｄＡｐｔ１１ＩＰ１を与える。このアダプタープラスミドは今、Ａｄ３５配列の代わりにＡｄ１１配列を含む。ＰＣＲによって増幅されたＡｄ１１配列の増幅が正確であることは、このクローンの配列を、Ａｄ１１のＤＮＡの対応する配列と比較することによって実証された。示されたＰＣＲプライマーを用いて、Ａｄ１１のＤＮＡの配列を直接決定することによって、後者は得られる。Ａｄ１１骨格を含んでいる大きなコスミドクローンは、以下の様にして生成される。
最初に、実施例７でＡｄ３５のＤＮＡについて述べた様に、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼによりプライマー３５Ｆ５と３５Ｒ６を用いて、Ａｄ１１のＤＮＡのＰＣＲ断片を増幅する。その後ＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）を用いて断片ＰＣＲ断片を精製し、ＮｏｔＩとＮｄｅＩにより消化する。ジェネクリーンキット（Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ）を用いて、得られた３．１ｋｂ断片をゲルから単離した。ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼと共に製造者のマニュアルに従って用いて、プライマー３５Ｆ７と３５Ｒ８（実施例７を見よ）を使用してＡｄ１１のＤＮＡの第二のＰＣＲ断片を生成し、ＰＣＲ精製キット（ＬＴＩ）を用いて精製した。この増幅された断片もまたＮｄｅＩとＮｏｔＩを用いて消化し、得られた１．６ｋｂの断片を上記の様にしてゲルから精製した。２つの消化されたＰＣＲ断片を、その後共にコスミドベクターｐＷＥ１５にライゲートし、ｐＷＥ１５は予めＮｏｔＩで消化してＴｓａｐ酵素を用いて製造者のマニュアルに従って脱リン酸化しておいた。両断片が１コピー挿入された、一つのクローンが選抜された。正しいクローンを解析的なＮｏｔＩ消化によって選抜し、その消化は４．７ｋｂの断片を与える。同じサイズの断片を与える３５Ｆ５と３５Ｒ８プライマーを用いたＰＣＲ反応により、確認を得た。正しいクローンをその後ＮｄｅＩにより平滑化し、ゲルから単離した。
次にｗｔＡｄ１１のＤＮＡをＮｄｅＩにより消化し、製造者の指示に従いアガロース酵素（ロシュ）を用いながら、低融点アガロースゲルから大きな２７ｋｂ断片を単離した。両者の断片をその後ライゲートして、製造者のプロトコールに従ってλファージパッケージング抽出物（ストラタジーン）を用いてパッケージした。ＳＴＢＬ−２細胞（ＬＴＩ）へ感染させた後、コロニーをプレート上で生育して完全な挿入物の存在を解析した。選抜されたクローンの機能性を、その後にＰＥＲ．Ｃ６での共感染によって試験した。これに関して、ＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、６マイクログラムを、プライマー３５Ｆ１と３５Ｒ４（実施例７を見よ）によってＡｄ１１のＤＮＡにつき生成したＰＣＲ断片の２マイクログラムと共トランスフェクトした。トランスフェクションに続く一週間の内に、正しいクローンはＣＰＥを与える。正しいクローンをｐＷＥ．Ａｄ１１．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと名づけた。
上記の方法を用いてプラスミドに基づくシステムが生成し、そのシステムは、外来遺伝子の挿入に適したアダプタープラスミド及びウイルス骨格を含んでいる大きなヘルパー断片からなる。組み換えＡｄ１１に基づくウイルスは、Ａｄ３５に基づく組み換えウイルスにおいて述べた方法を用いて作製した。
実施例１２
患者から得られたサンプルの中のウイルスの中和
実施例１と５の中で述べた中和実験において、全てのサンプルは健康なボランティアから得た。非中和ベクターの適用の一つは遺伝子治療の分野であり、遺伝子治療の処置の候補者である患者群において、Ａｄ３５はやはり中和頻度が低く、力価も低いかどうかを検討することは興味深い。
心血管疾患患者
２６のペア血清と心嚢液（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｆｌｕｉｄ：ＰＦ）のサンプルを、心不全を有する患者から得た。これらを、実施例１において述べた中和アッセイを用いて、Ａｄ５とＡｄ３５について試験した。この結果は、健康なボランティアに由来するサンプルについての先のデータを確認するものであった。血清サンプルの７０％はＡｄ５のためのＮＡを含み、そして４％はＡｄ３５のためのＮＡを含んでいた。心嚢液サンプルでの力価はより低く、全体の４０％がＡｄ５のためのＮＡを有し、Ａｄ３５のためのＮＡを有するものはなかった。ＰＦ中のＮＡと血清の間には良い相関があり、即ち、ペア血清サンプル中にＮＡを有さない陽性ＰＦサンプルはなかった。これらの結果は、Ａｄ３５に基づく非中和ベクターは、心血管疾患の治療の目的において、Ａｄ５ベクターより好ましいことを示している。この適応における全ての形態の非中和ベクターについて正しいことであるが、ベクターは非中和血清型のゲノムに基づくか、又はＡｄ５（又は他の血清型）に基づくことができるが、しかし、少なくとも非中和活性型の主要なカプシド蛋白質（ヘキソン、ペントン及び随意的に繊維組織）を提示している。
リューマチ関節炎患者
関節炎のもとにある分子決定因子はまだ知られていないが、関節におけるＴ細胞機能不全と成長因子産生の不均衡が、滑膜組織の炎症と過形成を引き起こすことが知られている。滑膜細胞（ｃｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）の増殖が開始し、軟骨と骨に侵入し、これらの組織を破壊する結果となる。現在の治療は（初期段階の時は）抗炎症剤（抗ＴＮＦ，ＩＬ１−ＲＡ、ＩＬ−１０）及び／又は従来の薬物（例えばＭＴＸ、スルファサラジン）の投与から始まる。リューマチ関節炎の後期段階においては、外科手術に基づく滑膜切除術、放射線照射、又は化学的な治療が行われる。替わりの又は付加的な選択は遺伝子治療を介した処置であり、そこでアデノウイルスベクターは患者の関節に直接に運搬され、抗炎症剤又は自殺遺伝子が発現する。コラーゲンによって誘導された関節炎に罹っているアカゲザルで行われた前の研究は、マーカー遺伝子を有するＡｄ５に基づくベクターは、滑膜細胞（ｃｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）に形質導入することができることを示している。ヒトの場合において、アデノウイルスの運搬はＮＡの存在によって妨げられるかどうかは知られていない。
リューマチ関節炎患者の心嚢液（ＳＦ）中にＮＡが存在しているかを調べるために、リューマチ関節炎（ＲＡ）に罹っている患者からランダムに選ばれた５３人のパネルからＳＦサンプルを得た。実施例１で述べた中和アッセイを用いて、いくつかのｗｔアデノウイルスについてこれらを試験した。このスクリーニングの結果を表III に示す。７２％のＳＦサンプルで、アデノウイルス５型は中和されることが見出された。これらのサンプルの大部分は高い力価のＮＡを含み、そこで試験した最も高いＳＦサンプルの希釈率（６４×）でもＡｄ５ウイルスは中和された。これは、リューマチ関節炎患者の関節において滑膜細胞（ｃｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）へアデノウイルスベクターを運搬しても、非常に無効であろうことを示している。更に、ＳＦ中での力価は非常に高いために、ベクターの注入に先立っての洗浄はＮＡを十分に除去するかどうかは疑わしい。試験された他の血清型の中で、Ａｄ３５はサンプルの４％だけを中和することが示された。そのために、これらのデータは健康な患者由来の血清サンプルで得られた結果を確認するものであり、Ａｄ３５に由来するカプシド蛋白質の少なくともいくつかを提示しているＡｄ３５に基づくベクター又はキメラベクターは、リューマチ関節炎の治療において好ましいベクターであることを示している。
実施例１３
Ａｄ３５に基づくウイルスの骨格の修飾
１）ｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｐａｃ−ｒＩＴＲ及びｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲｎの作製
実施例４は、Ａｄ３５サブクローンｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｅｃｏ１３．３の作製について述べている。このクローンはＡｄ３５の配列をｂｐ２１９４３からＥｃｏＲＩへクローン化されたライトＩＴＲの末端まで、そしてｐＢｒ３２２のＥｃｏＲＶを含む。これらの配列をＡｄ３５においてｂｐ１８１３７に位置しているＰａｃＩ部位まで伸長するために、ｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｅｃｏ１３．３（実施例４を見よ）をＡａｔＩＩとＳｎａＢＩで消化し、そして断片を含んでいる大きなベクターをＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから単離した。Ａｄ３５ｗｔのＤＮＡをＰａｃＩとＳｎａＢＩで消化し、上記のようにして４．６ｋｂ断片を単離した。そしてこの断片を、ＰａｃＩとＡａｔＩＩの突出を含んでいる二本鎖（ｄｓ）リンカーへライゲートした。下記のオリゴヌクレオチドをアニールした後にこのリンカーが得られた。
Ａ−Ｐ１：５’−ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＴ ＡＡＴ−３’
Ａ−Ｐ２：５’−ＴＡＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＧＴ−３’
ｄｓリンカーとＡｄ３５のＰａｃＩ−ＳｎａＢＩ断片を含んでいるライゲーション混合物を、ライゲートされていないリンカーから、ＬＭＰゲル上で分離した。４．６ｋｂのバンドをゲルから切り出して６５℃で融解し、そしてＡａｔＩＩとＳｎａＢＩで消化した精製ｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｅｃｏ１３．３ベクター断片とライゲートした。ライゲーションを電気コンピーテントなＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）へ形質導入した。得られたクローンであるｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｐａｃ−ｒＩＴＲはＡｄ３５配列を、ＰａｃＩ部位のｂｐ１８１３７からライトＩＴＲまで含んでいた。
次に、ベクター配列からＩＴＲを遊離させることを可能とするために、特異な制限部位をライトＩＴＲの３’末端に導入した。これにつき、Ａｄ３５配列のｂｐ３３１６５におけるＮｄｅＩ部位からライトＩＴＲまでをカバーするＰＣＲ断片が用いられ、ライトＩＴＲは、ｒＩＴＲへ取り付けられたＳｗａＩ，ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を有している。プライマー３５Ｆ７と３５Ｒ８（実施例７で述べられている）を用いてＰＣＲ断片を作製した。精製の後、ＰＣＲ断片をＡＴクローニングベクター（インビトロゲン）へクローン化し、正しい増幅を証明するために配列を決定した。正しく増幅されたクローンをその後にＥｃｏＲＩで消化し、クレノフ（ｋｌｅｎｏｗ）酵素で平滑化し、続いてＮｄｅＩで消化してＰＣＲ断片を単離した。平行して、ｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｐａｃ−ｒＩＴＲでのｐＢｒベクターにおけるＮｄｅＩを下記の様にして除去した。ＮｄｅＩを用いた消化、クレノフ処理及び再ライゲーションによってＮｄｅＩ部位を除去したｐＢｒ３２２ベクターを、ＡａｔＩＩとＮｈｅＩによって消化した。ベクター断片をＬＭＰゲルで単離し、やはりＬＭＰゲルで単離したｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｐａｃ−ｒＩＴＲ由来の１６．７ｋｂのＡｄ３５．ＡａｔＩＩ−ＮｈｅＩ断片とライゲートした。これにより、ｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｐａｃ−ｒＩＴＲ．△ＮｄｅＩを作製した。次にｐＢｒ／Ａｄ３５．Ｐａｃ−ｒＩＴＲ．△ＮｄｅＩをＮｄｅＩによって消化し、クレノフ酵素を用いて末端を充填し、そしてＤＮＡをＮｄｅＩによって消化した。ベクターとＡｄ３５配列を含んでいる大きな断片を単離した。このベクター断片とＰＣＲ断片のライゲーションの結果、ｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲｎを得た。このクローンにおいて、繊維組織、Ｅ２Ａ，Ｅ３，Ｅ４又はヘキソンをコードする特異的な配列を操作することができる。加えて、例えばＥ４蛋白質又はＥ２を駆動するプロモーターを、異種のプロモーターへと変異、欠損又は改変することができる。
２）異なった血清型に由来する繊維組織蛋白質を有するＡｄ３５に基づくウイルスの産生
アデノウイルスはヒト細胞に異なった効率で感染する。感染は以下を含む２つの過程を伴っている。１．ウイルスと細胞上の特異的なレセプターへの結合を仲介する繊維組織蛋白質、及び２．例えばＲＧＤ配列と細胞表層に存在するインテグリンへの相互作用による、インターナリゼーションを仲介するペントン蛋白質。Ａｄ３５がメンバーであるサブグループＢのウイルスについては繊維蛋白質のための細胞間レセプターは知られていない。ヒト細胞の感染効率において、Ａｄ５の様なサブグループＣのウイルスと比較して、サブグループＢのウイルスには大きな差がある（ＷＯ ００／０３０２９とＥＰ ９９２００６２４．７を見よ）。一つのサブグループ内でさえも、特定のヒト細胞の感染効率は種々の血清型の間で異なることがある。例えば、Ａｄ１６の繊維組織は、Ａｄ５に基づく組み換えウイルス上に存在するとき、ヒト及びアカゲザル由来の初代内皮細胞、平滑筋細胞及び滑膜細胞（ｃｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）に、Ａｄ３５又はＡｄ５１の繊維組織を有するＡｄ５キメラウイルスよりも良く感染する。そこで、Ａｄ３５に基づくウイルスの高い感染活性を得るために、繊維蛋白質を異なった血清型の繊維蛋白質に変えることが必要かもしれない。その様な繊維キメラの技術が、実施例３においてＡｄ５に基づくウイルスについて述べられており、下記においてＡｄ３５ウイルスについて例示されている。
最初に、構築物ｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲｎにおいて多くの繊維組織配列がＡｄ３５骨格より下記の様に除去されている。
左フランキング配列と、Ａｄ３５の繊維蛋白質の一部分である特異なＭｌｕＩ部位の上流であるｂｐ３０２２５から繊維組織の尾部のｂｐ３０８７２（図６に開示したｗｔＡｄ３５配列による番号）までの範囲を、以下のプライマーを用いて増幅した。
ＤＦ３５−１：５’−ＣＡＣ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＴＴ ＣＣ−３’及び
ＤＦ３５−２：５−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＴＡ ＣＧＧ ＧＴＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＧ−３’
このＰＣＲ増幅によって繊維組織遺伝子の尾部に特異なＢｓｉＷＩ部位が導入される。
繊維組織蛋白質の末端のｂｐ３１７９８から、特異なＮｄｅＩ部位の３’から得たｂｐ３３１９９（ｗｔＡｄ３５配列による番号、図６）までの範囲の右フランキング配列を、以下のプライマーを用いて増幅した。
ＤＦ３５−３：５’−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＴＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＴＴＴ ＡＡＧ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＣＡ Ｃ−３’及び
ＤＦ３５−４：５’−ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＣＡ ＴＴＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＴＧＧ−３’
このＰＣＲは、繊維組織配列の代わりに特異なＮｄｅＩ部位を導入する。ＰＣＲ増幅は製造者の指示に従って、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いて行われた。増幅の後、ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キットを用いて精製し、断片をＢａｍＨＩで消化してライゲートした。２ｋｂのライゲートされた断片をゲルから精製し、ＰＣＲ Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へクローン化した。増幅の正確さを配列決定によってチェックした。そしてＰＣＲ断片をＭｌｕＩ／ＮｄｅＩ断片として切り出し、同じ酵素によって消化したｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲｎへクローン化した。これによりｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲ△ｆｉｂが生成し、ｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲ△ｆｉｂは替わりの血清型の繊維組織配列を導入するのに適したシャトルベクターである。この戦略は、ＷＯ００／０３０２９に開示された、Ａｄ５に基づくウイルスのための繊維改変の戦略と類似している。その出願の表Ｉに挙げられたプライマーを、アデノウイルスの種々のサブグループの繊維組織配列を増幅するのに用いた。ｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲ△ｆｉｂにおいてクローン化された繊維組織の増幅のために、同じ（宿重した：ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー配列を使用することができるが、しかし、順方向プライマー（尾部オリゴヌクレオチドＡからＥ）のＮｄｅＩ部位はＢｓｉＷＩ部位へ変えられるべきであり、逆方向オリゴヌのＮｓｉＩ部位（ｋｎｏｂオリゴヌクレオチド１から８）はＮｈｅＩ部位へ変えられるべきである。そこで、下記の宿重プライマーを用いて１６の繊維組織配列を増幅した。
５’−ＣＣＫ ＧＴＳ ＴＡＣ ＣＣＧ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ−３’及び
５’−ＣＣＧ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＡＴ ＡＴＡ−３’
そして増幅された配列はＢｓｉＷＩとＮｈｅＩによって消化され、同じ酵素によって消化されたｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲ△ｆｉｂへクローン化され、ｐＢｒ／Ａｄ３５．ＰＲ△ｆｉｂ１６を生成した。そして後者の構築物をＰａｃＩとＳｗａＩによって消化し、挿入物をゲルから単離した。改変された繊維組織を有するＰａｃＩ／ＳｗａＩ Ａｄ３５断片を、その後ｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲの対応する部位へクローン化し、ｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｆｉｂ１６を与えた。そしてこのコスミド骨格をＡｄ３５に基づくアダプタープラスミドと共に用いて、Ａｄ１６の繊維組織を提示するＡｄ３５組み換えウイルスを生成した。他の繊維組織配列を上記で述べた（宿重した）プライマーによって増幅することができる。もし繊維組織配列の一つが内在性のＢｓｉＷＩとＮｈｅＩ部位を有することが判ったら、ＰＣＲ断片はその酵素によって部分的に消化されなければならないであろう。
３）誘導可能であってＥ１非依存性のＥ４発現を伴ったＡｄ３５に基づくウイルスの生成
アデノウイルスＥ４プロモーターはＥ１蛋白質の発現によって活性化される。Ａｄ５のＥ１蛋白質が、Ａｄ３５のＥ４プロモーターの活性化を仲介することが可能であるかどうかは未知である。そこで、ＰＣＲ．Ｃ６細胞においてＡｄ３５組み換えウイルスの作製を可能とするために、Ｅ１に依存しないＥ４の発現を作製することは有利であろう。これは、Ａｄ３５−Ｅ４プロモーターを異種のプロモーター、それに限定するものではないが例えば７ｘＴｅｔＯプロモーター、により、によって置き換えることにより達成できる。Ｅ１を欠損したＡｄ５に基づく組み換えベクターは、Ｅ１が発現しないにも関わらず、標的細胞でベクター骨格に由来するウイルス遺伝子の発現が残ることを示している。ウイルス遺伝子の発現は毒性を増加し、感染された細胞に宿主免疫反応を引き起こすかもしれない。遺伝子治療とワクチン接種の分野における、多くのアデノウイルスベクター適用において、骨格に由来するウイルス遺伝子の発現を減少又は消滅させることが望まれている。これを達成する道の一つは、ウイルス骨格に由来する配列を全て、又はできるだけ多く除くことである。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ又はＥ４遺伝子及び／又は後期遺伝子の機能を除くことにより、作製する間にこれらの機能を補わなければならない。
ヘルパーウイルスの手段によって、又はこれらの機能を安定的に付加することのいづれかにより、誘導可能な転写調節を伴い又は伴わず、産生細胞へこの補足を行うことができる。これを達成するための方法はＡｄ５について述べられていて本分野で知られている。一つの特異的な方法は、標的細胞においては活性を有さないプロモーター配列によってＥ４プロモーターを置換することである。Ｅ４蛋白質は、例えばＥ２プロモーターの活性化を介しアデノウイルスの複製において、またスプライシングの調節と後期遺伝子の転写産物の核輸送を介し後期遺伝子の発現において、役割を果たす。加えて、Ｅ４蛋白質の少なくともいくつかは細胞に毒性を有する。そこで、標的細胞においてＥ４の発現を減少させること又は除くことにより、Ａｄ３５に基づくベクターは更に改善されるであろう。これを達成する道の一つは、標的細胞においては不活性である異種プロモーターによってＥ４プロモーターを置換することである。標的細胞において不活性な異種プロモーター／アクチベーターシステムの一例は、テトラサイクリン誘導性ＴｅｔＯシステムである（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ，１９９２）。
他の原核又は合成プロモーター／アクチベーターシステムを使用することもできる。この例において、ウイルスベクターの骨格のＥ４プロモーターは、ｔｅｔオペロン（７ｘＴｅｔＯ）由来のテトラサイクリン反応性因子の７回繰り返しを含んでいるＤＮＡ断片によって置換されている。このプロモーターに対する強いトランスアクチベーターは、ｔｅｔリプレッサーのＤＮＡ結合領域及びＶＰ１６の活性化領域（Ｔｅｔトランスアクチベーター蛋白質、Ｔｔａ）を含んでいる融合蛋白質である。Ｅ１発現に依存しない強力なＥ４発現を、Ｔｔａを発現しているＰＥＲ．Ｃ６細胞において達成することができる。Ｔｔａを発現しているＰＥＲ．Ｃ６細胞は作製されて記載されている（実施例１５を見よ）。７ｘＴｅｔＯの制御下であるＥ４を有するＡｄ５由来のＥ１欠損ウイルスを産生することは可能であり、これらの細胞において殖やされている。ヒト又は動物起源の細胞（Ｔｔａトランスアクチベーターを発現しない）における感染に続いて、通常のＥ４プロモーターを有するＥ１欠損ウイルスと比較して、Ｅ４発現が大きく減少していることが見出された。
以下に、E4プロモーター置換を有するウイルスを産生するためのコスミドヘルパーベクターであるpWE/Ad35.pIX-rITR.TetO-E4の構築を説明する。
まず、pBr/Ad35.PRn DNAを次のプライマーを用いてPCR増幅することによりフラグメントを作製した。
355ITR: 5'-GAT CCG GAG CTC ACA ACG TCA TTT TCC CAC G-3'および
353ITR: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT C-3'
である。このフラグメントは、bp34656（wtAd35に従った番号）とpBr/Ad35.PRnの右ITRのNoti部位3'との間の配列を含み、かつ右ITR配列のSstI部位5'を導入する。
第２のPCRフラグメントを次のプライマーを用いてpBr/Ad35.PRn DNA上に作製した。
35DE4: 5'-CCC AAG CTT GCT TGT GTA TAT ATA TTG TGG-3'および
35F7である。実施例７を参照のこと。このPCRはbp33098と34500（wtAd35に従った番号）との間のAd35配列を増幅し、かつE4 TATAボックスの上流にHindIII部位を導入する。これら２つのPCR反応により、E4プロモーターの右および左フランキング配列を増幅する。増幅には、製造元の説明書に従ってPwo DNAポリメラーゼを用いた。
SstIおよびHindIIIで消化して、7xTetOプロモーターを含む第３のフラグメントを構築物pAAO-E-TATA-7xTetOから単離した。pAAO-E-TATA-7xTetOの作製法を以下に説明する。第1のPCRフラグメント（355/353）をSstIおよびNotIで消化し、7xTetOフラグメントにライゲートした。次に、ライゲーション混合物をHindIIIおよびNotIで消化し、0.5 kbのフラグメントをゲルから単離する。第２のPCRフラグメント（35DE4/35F7）をNdeIおよびHindIIIで消化し、ゲルを精製した。次に、これら２つのフラグメントをNdeIおよびNotIで消化した pBr/Ad35.PRn中にライゲートしてpBr/Ad35.PR.TetOE4を得た。次いで、E4プロモーターの修飾をAd35ヘルパーコスミドクローンのPacI/SwaIフラグメントをpBr/Ad35.PR.TetOE4から得たPacI/SwaIフラグメントで交換することによりAd35ヘルパーコスミドクローンに転写して、pWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4を得る。
pAAO-E-TATA.7xTetOを次のようにして作製した。２つのオリゴヌクレオチド
TATAplus: 5'-AGC TTT CTT ATA AAT TTT CAG TGT TAG ACT AGT AAA TTG CTT AAG-3'および
TATAmin: 5'-AGC TCT TAA GCA ATT TAC TAG TCT AAC ACT GAA AAT TTA TAA GAA-3'（下線部の配列は修飾TATAボックスを形成する）
を合成した。このオリゴヌクレオチドをアニールして、HindIIIで消化したDNAと適合する5'オーバーハングを有する２本鎖DNAフラグメントを得た。アリーリング反応の生成物を、HindIIIで消化したpGL3エンハンサーベクター（Promega）にライゲートして、pAAO-E-TATAを得た。さらにクローニングするために、修復した挿入フラグメントの5'末端にHindIII部位を有するクローンを選択した。
次に、７量体化tetオペレーター配列を、拡張PCRシステム（Roche）を用い、製造元の手順に従い、PRC反応内でプラスミドpUHC-13-3(GossenおよびBujard, 1992年)から増幅した。次のプライマーを用いた。
tet3: 5'-CCG GAG CTC CAT GGC CTA ACT CGA GTT TAC CAC TCC C-3'および
tet5: 5'-CCC AAG CTT AGC TCG ACT TTC ACT TTT CTC-3'
である。増幅したフラグメントをSstIおよびHindIII（これらの部位は、それぞれtet3およびtet5に存在する）で消化し、SstI/HindIIIで消化したpAAO-E-TATAにクローンして、pAAO-E-TATA-7xtetOを得た。
作製したpWE/Ad35.pIXrITR.TetOE4コスミドクローンの機能性を調べるために、このDNAをNotIで消化した。次いで、wtAd35 DNAの左末端をプライマー35F1および35R4を用いて増幅した。（実施例７参照）。増幅の後、PCR混合物を精製し、SalIで消化して完全なウイルスDNAを取り出した。次に、消化したpWE/Ad35.pIX-rITR.TetOE4およびPCRフラグメントの両方の4grを、前日にT25フラスコに播種したPER.C6-tTA細胞に同時トランスフェクションした。２日後、トランスフェクションした細胞をT80フラスコに移し、その２日後にCPEを得た。この結果、コスミドのバックボーンが機能的であることが分かった。
実施例１４
E1欠損Ad35ウイルスを補完することのできる細胞株の産生pIG135およびpIG270の産生
構築物pIG.ElA.ElBは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（PGK）およびB型肝炎ウイルスのpolyA配列と作用的に連結された459〜3510のwt Ad5配列（Genbank寄託番号M72360）に対応するAd5のE1領域配列を含む。この構築物の産生についてはWO97/00326に記載されている。Ad5のE1配列をAd35の対応する配列で次のように置換する。pRSV.Ad35-E1（実施例８において説明）をEcoRIおよびSse8387Iで消化し、Ad35 E1配列に対応する3 kbのフラグメントをゲルから単離した。構築物pIG.ElA.ElBをSse8387Iで完全に消化し、EcoRIで部分的に消化した。Ad5 E1領域を有しないが、PGKプロモーターを有するベクター配列に対応する4.2 kbのフラグメントをLMPアガロースゲル上の他のフラグメントから分離し、ゲルからコレクトバンド（correct band）を励起する。得られたフラグメントの両者をライゲートし、pIG.Ad35-Elを得た。このベクターを更に修飾して、pUC119ベクターのバックボーンに存在するLacZ配列を取り出す。ここで、ベクターをBsaAIおよびBstXIで消化し、ゲルから巨大フラグメントを単離する。２本鎖オリゴを次の２つのオリゴをアニールして調製する。
BB1: 5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3'および
BB2: 5'-GTG GCC TAG GCA C-3'
である。
このオリゴおよびベクターフラグメントのライゲーションにより、構築物pIG135を生じた。オリゴの適正な挿入によりBsaAIおよびBstXI部位を修復し、かつ固有のAvrII部位を導入する。次に、pIG135のAd35-E1発現カセットの3'末端に固有部位を導入した。ここで、構築物をSapIで消化し、3'突出末端をT4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端化した。このように処理した線状プラスミドをBsrGIでさらに消化し、巨大ベクターを含有するフラグメントをゲルから単離した。HBVpolyA配列の3'末端を修復するため、および 固有部位を導入するためにPCRフラグメントを次のプライマーを用いて作製した。
270F: 5'-CAC CTC TGC CTA ATC ATC TC -3'および
270R: 5'-GCT CTA GAA ATT CCA CTG CCT TCC ACC -3'
である。
Pwoポリメラーゼ（Roche）を用い、製造元の説明書に従ってpIG.Ad35.E1 DNAに対してPCRを行った。得られたPCR産物をBsrGIで消化し、かつTsap酵素（LTI）を用いて脱リン酸した。後者はBsrGI部位における挿入二量体化を防ぐためである。PCRフラグメントおよびベクターフラグメントをライゲーションして、構築物pIG270を得た。
ラットのプライマリー細胞の形質転換が可能なAd35 E1配列
新生WAG/RIJラットを妊娠1週で屠殺し、腎臓を取り出した。被膜を慎重に取り除いた後、３７℃のトリプシン／EDTA（LTI）中で複数回インキュベーションし、１％FBSを含有する冷PBS中で浮遊細胞を収集することにより腎臓を単細胞懸濁液に分解した。腎臓のほとんどがトリプシン処理されると、10%FBSを補ったDMEM中に全細胞を再懸濁し、滅菌チーズクロスで濾過した。１つの腎臓から得た胚ラット腎臓（BRK）細胞を５つの皿（Greiner、6cm）に入れた。細胞密度が70〜80%に達すると、製造元の説明書に従い、CaPO4を用いて細胞を１または５μｇＤＮＡ／皿でトランスフェクトした。次の構築物を別々のトランスフェクションに用いた。pIG.E1A.E1B （Ad5-E1部位を発現）、pRSV.Ad35-E1、pIG.Ad35-E1およびpIG270（後者はAd35-E1を発現）である。病巣がトランスフェクトした細胞に現れるまで、細胞を37℃、5%CO2でインキュベートした。表４は環状または線状DNAを用いた幾つかのトランスフェクション実験から得られた病巣の数を示している。予想通り、Ad5-E1部位は効率的にBRK細胞に転換した。効率は低いが、病巣はAd35-E1トランスフェクト細胞層にも発現した。Ad35に転換した病巣はより遅い時期に現れた。Ad5-E1では７〜１０日であったのに対し、Ad35ではトランスフェクト後約2週間であった。これらの実験は、BグループウイルスAd35のE1遺伝子がげっ歯類プライマリー細胞を転換することができることを明白に示している。これによりAd35-E1発現構築物の機能性が証明され、かつBグループウイルスAd3およびAd7の転換能力に関する初期の発見（Dijkema、1979年）が追認された。病巣内の細胞が実際に転換されたものであるか否かを調査するために、幾つかの病巣を取り出して増大した。７つの病巣中少なくとも５つが確立した細胞株として増殖することが分かった。
プライマリーヒト羊膜由来の新たなパッケージング細胞の作製
羊膜穿刺後に得た羊水を遠心分離し、細胞をAminoMax培地（LTI）中に再懸濁し、組織培養フラスコ内で37℃、10%CO2で培養した。細胞が順調に増殖した時点（およそ1細胞分裂／24時間）で、AminoMax完全培地とGlutamax I（最終濃度４ｍM、LTI）、グルコース（最終濃度4.5g/L、LTI）および10%FBS（LTI）を補ったDMEM低グルコース培地（LTI）との１：１混合液に培地を交換した。トランスフェクションのために、約５×１０５細胞を10cm細胞培養皿に入れた。翌日、CaPO4トランスフェクションキット（LTI）を用い、製造元の説明書に従って細胞を皿当たり20マイクログラムの環状PIG270でトランスフェクトし、DNAを沈降させながら細胞を一晩インキュベートした。その翌日、細胞をPBSで４回洗浄して沈殿物を除去し、転換細胞の病巣が現れるまで３週間以上さらにインキュベートした。1週間に1回、培地を新しい培地に交換した。他のトランスフェクション剤、例えばLipofectAmine（LTI）またはPEI （ポリエチレンイミン、高分子量、水フリー、Aldrich）を用いたが、これに限定されるものではない。これら３つの薬剤のうち、一次ヒト羊膜に対してPEIが最も高いトランスフェクション効率を達成する。すなわちpAdApt35.LacZのトランスフェクション後48時間で約１％の青色細胞である。
病巣を次のようにして分離する。培地を取り除き、PBSに交換した後、ディスポーザブルフィルターのチップを取り付けた50〜200μｌギルソンピペットを用いて、細胞をそっと擦り取って病巣を分離する。10μｌPBSに収容した細胞を15μｌトリプシン／EDTA（LTI）を入れた９６ウエル皿に移し、ピペットで上下し、室温で短時間インキュベーションすることによって単細胞懸濁液を得た。AminoMax完全培地と補助剤および10%FBSを含んだDMEMとの前記１：１混合液を200μｌ加えた後、細胞をさらにインキュベートした。増殖を続けるクローンを増大し、異なるサブグループのE1欠失アデノウイルスベクター、具体的にはBグループウイルス、特にはAd35またはAd11から誘導されたものの補体増殖に対する能力を分析した。
ヒト胚網膜芽細胞からの新たなパッケージング細胞株の作製
ヒト網膜細胞を流産した胎児の目から分離し、10%FBS（LTI）を補ったDMEM培地（LTI）中で培養する。トランスフェクションの前日に、約５×１０５細胞を６ｃｍ皿に入れ、37℃、10%CO2で一晩培養する。製造元の説明書に従い、CaPO4沈殿キットを用いてトランスフェクションを行う。環状プラスミドまたは精製フラグメントのいずれかとして、各皿を８〜１０μｇのpIG270 DNAでトランスフェクトする。精製フラグメントを得るために、pIG270をAvrIIおよびXbaIで消化しAd35 E1発現カセットに対応する4kbのフラグメントをアガラーゼ処理（Roche）によりゲルから単離した。翌日、滅菌PBSで４回洗浄して、沈殿物を慎重に洗い流す。次いで、新しい培地を加え、転換細胞の病巣が現れるまでトランスフェクトした細胞を更に培養する。十分に大きくなると（＞100細胞）、病巣を取り出し、前記したようにして96ウエルに入れる。増殖を続けるトランスフォームしたヒト胚網膜芽細胞のクローンを増大し、異なるサブグループのE1欠失アデノウイルスベクター、具体的にはBグループウイルス、特にはAd35またはAd11から誘導されたものの補体増殖に対する能力を分析した。
PER.C6由来の新しいパッケージング細胞株
実施例８で説明したとおり、Ad35-E1発現構築物、例えばpRSV.Ad35.E1の同時トランスフェクションと共に、Ad35 E1欠失ウイルスをPER.C6細胞上に作製および増殖させることができる。しかし、この方法を用いた組換えアデノウイルスの大規模生産は煩雑である。なぜなら、各増幅ステップに対して、Ad35-E1構築物のトランスフェクションが必要だからである。さらに、この方法では、プラスミドとウイルスゲノムとの間での非相同的組換えの危険性が増すと同時に、E1配列を組み込んだ組換えウイルスを作製する可能性が高くなり、複製コンピテントウイルスを生じる。これを避けるために、PER.C6におけるAd35-E1タンパク質の発現を、ゲノム中の発現プラスミドの完全複製により媒介する必要がある。PER.C6細胞は既に形質転換されており、かつAd5-E1タンパク質を発現しているので、さらにAd35-E1発現を加えることは細胞に対して有毒となり得る。しかし、Ad5-E1を発現するA549細胞が作られているので、E1タンパク質を有する転換細胞を安定にトランスフェクトすることも不可能ではない。
サブグループBウイルスAd7由来の組換えアデノウイルスを作製する試みにおいて、Abrahamsenら（1997年）はwt Ad7に汚染されずにE1欠失ウイルスを293細胞に作製することはできなかった。293-ORF6細胞のプラーク精製後に取り出したウイルス（Broughら、1996年）は、非相同的組換えによりAd7 E1B配列が組み込まれたことを示していた。したがって、Ad7組換えウイルスの効率的増殖によりAd7-E1B発現およびAd5-E4-ORF6発現の存在の可能性のみが証明された。E1Bタンパク質はウイルスタンパク質と同様に細胞タンパク質と相互作用することが知られている（Bridgeら、1993年；White、1995年）。おそらく、E1B 55Kタンパク質と、ウイルスタンパク質のｍRNA放出の増大および細胞ｍRNAの大半の放出の阻害に必要なE4-ORF6との間で形成された複合体は、臨界的かつある程度血清型に特異である。Ad5のE1Aタンパク質はAd7-E1A欠失を補完することが可能であり、またアデノウイルスパッケージング細胞自体でのAd7-E1B発現は安定な補完細胞株を作製するには十分でないということを前記の実験は示唆している。Ad35-E1Bタンパク質の一方または両方がPER.C6細胞上でのAd35ベクターの効率的増殖の制限因子であるか否かを調査するために、E1BプロモーターおよびE1B配列を含むが、E1Aに対するプロモーターおよびコード領域を持たないAd35アダプタープラスミドを作製した。ここで、製造元の説明書に従い、wtAd35 DNAの左末端を35F1および35R4（いずれも実施例７で説明した）を用いてPwo DNAポリメラーゼ（Roche）で増幅した。4.6kbのPCR産物をPCR精製キット（LTI）を用いて精製し、SnaBIおよびApaI酵素で消化した。続いて、QIAExIIキット（Qiagen）を用いて、得られた4.2kbフラグメントをゲルから精製した。次に、pAdApt35IP1（実施例７）をSnaBIおよびApaIで消化し、GeneCleanキット（BIO 101社）を用いて2.6kbのベクターを含むフラグメントをゲルから単離した。単離したフラグメントの両方をライゲートしてpBr/Ad35.leftITR-pIXを得た。PCR中の適正な増幅を次の機能性テストにより確認した。DNAをBstBIで消化して、ベクター配列から挿入したAd35を遊離させ、このDNA４μｇをNotI消化pWE/Ad35.pIX-rITR（実施例７）と共にPER.C6細胞に同時トランスフェクトした。２日後にトランスフェクトした細胞をT80フラスコに移し、さらに２日後CPEが形成された。これは機能的E1配列を含む新しいpBr/Ad35.leftITR-pIX構築物を示している。次いで、pBr/Ad35.leftITR-pIX構築物を次のように修飾した。SnaBIおよびHindIII でDNAを消化し、クレノー酵素を用いて5'HindIIオーバーハングを補った。消化したDNAの再ライゲートおよびコンピテント細胞（LTI）への転換により構築物pBr/Ad35leftITR-pIXElAを得た。この後者の構築物は、bp450と1341との間のE1A配列を除いて左末端4.6kbのAd35を有しており、したがってE1AプロモーターおよびE1Aコード配列のほとんどを有していない。次いで、pBr/Ad35.leftITR-pIXE1AをBstBIで消化し、この構築物２μｇをNotI消化したpWE/Ad35.pIX-rITR（実施例７）と共にPER.C6細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクト後１週間でトランスフェクトしたフラスコ内に完全CPEを形成した。
この実験から、PER.C6細胞内のAd5-E1A発現によりAd35-E1Aタンパク質が機能的に補完されること、およびPER.C6内のAd5-E1発現によりAd35-E1Bタンパク質の少なくとも１つは補完できないということが示された。さらに、PER.C6内のAd35-E1Bタンパク質を発現することによりAd35 E1欠失ウイルスに対する補完細胞株を作ることができることも示された。PER.C6細胞のゲノムの完全複製からのAd35-E1B配列の安定的な発現は、E1Bプロモーターによって始まり、例えばHBVpAであるが、これに限定されない非相同的ポリアデニル化シグナルにより終了する。非相同pAシグナルはE1B挿入と組換えベクターとの間の重複を避けるために必要である。天然E1B終結はアデノウイルスベクター上に存在すべきpIX転写単位に位置するからである。あるいは、E1B配列は、例えばヒトPGKプロモーターであるが、これに限定されない非相同プロモーターによって始まり、例えば7xtetOプロモーターであるが、これに限定されない誘導プロモーターにより終了する（GossenおよびBujard、1992年）。また、これらの場合において、転写終結を非相同pA配列、例えばHBV pA等により仲介する。Ad35-E1B配列は、wt Ad35配列のヌクレオチド1611と3400との間に位置する、E1B 21KおよびE1B 55Kタンパク質のコード領域の１つを少なくとも含む。また、 挿入断片はwt Ad35配列のヌクレオチド1550と1611との間にAd35-E1B配列（の一部）を含んでもよい。
実施例１５
初期領域１および初期領域２Aを欠失した組換えアデノウイルスベクターの生産のための産生細胞株の作製
PER.C6-ｔTA細胞の作製
ここで、初期領域１（E1）および初期領域２A（E2A）を欠失した組換えアデノウイルスベクター産生用の細胞株の作製について説明する。産生細胞株は、それぞれE1およびE2A遺伝子の構成性発現によるトランスでの組換えアデノウイルスベクター由来のE1およびE2A欠失を補完する。予め確立されたAd5-E1形質転換ヒト胚網膜芽細胞株PER.C6（WO 97/00326）にE2A発現カセットをさらに付与した。
アデノウイルスE2A遺伝子は、一本鎖DNAと高親和性を有する72kDa DNA結合タンパク質をコードする。この特徴のために、DBPの構成性発現は、細胞毒性を示す。ts125E2A変異体は、アミノ酸413でPro→Ser置換するDBPをコードする。この変異により、DBPをコードするts125E2Aは、32℃の許容温度で完全に活性であるが、39℃の非許容温度ではssDNAに結合しない。これにより、39℃の非許容温度で機能的でなくかつ毒性を示さないが、32℃の許容温度への温度の変更後機能的になるE2Aを構成性発現する細胞株の作製が可能である。温度が下降するにつれて、温度感受性E2Aは次第に機能的になり、許容温度である32℃の温度において完全に機能的になる。
Ａ．野生型E2Aまたは温度感受性ts125E2A遺伝子を発現するプラスミドの作製
pcDNA3wtE2A：完全な野生型初期領域2A（E2A）コード領域を、供給元（Boehringer Mannheim）の標準的な手順にしたがって、ExpandTM Long Template PCRシステムを用い、プライマーDBPpcr1およびDBPpcr2を用いて、プラスミドpBR/Ad.Bam-rITR（ECACC寄託番号Ｐ97082122）から増幅した。PCRを、次の増幅プログラムを用いてBiometra Trio Thermoblockに行った。９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で１０秒間＋５１℃で３０秒間＋６８℃で２分間を１サイクル、９４℃で１０秒間＋５８℃で３０秒間、６８℃で２分間を１０サイクル、９４℃で１０秒間＋５８℃で３０秒間＋６８℃で２分間およびサイクルごとに１０秒間の伸長を２０サイクル、６８℃で５分間を１サイクルである。プライマーDBPpcr1：CGG GAT CCG CCA CCA TGG CCA GTC GGG AAG AGG AG（5'から3'へ）は、固有のBamHI制限部位(下線部)、Kozaｋ配列（斜体部）の5'およびE2Aコード配列の開始コドンを含む。プライマーDBPpcr2：CGG AAT TCT TAA AAA TCA AAG GGG TTC TGC CGC（5'から3'へ）は、固有のEcoRI制限部位（下線部）、E2Aコード配列の終止コドンの3'を含む。太字は、E2Aコード領域由来の配列をいう。PCRフラグメントを、BamHI/EcoRIで消化し、BamHI/EcoRI消化pcDNA3（Invitrogen）にクローン化し、pcDNA3wtE2Aを得た。
pcDNA3tsE2A：完全なts125E2Aコード領域を、温度感受性アデノウイルス変異体H5ts125から単離したDNAから増幅した。PCR増幅の手順は、wtE2Aの増幅の手順と同じである。PCRフラグメントをBamHI/EcoRIで消化し、BamHI/EcoRIで消化したpcDNA3（Invitrogen）にクローン化して、pcDNA3tsE2Aを得た。wtE2AおよびtsE2Aのコード配列を、配列決定によって確認した。
Ｂ．３２℃、３７℃および３９℃で培養した組換えアデノウイルスベクター産生用の産生細胞の増殖特性
PER.C6細胞を、10%CO2雰囲気内、３２℃、３７℃または３９℃のいずれかの温度で、１０％ウシ胎児血清（FBS、Gibco BRL）および10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco BRL）で培養した。０日目、全体で１×１０６のPER.C6細胞を25cm2組織培養フラスコ（Nunc）に播種し、細胞を３２℃、３７℃または３９℃のいずれかで培養した。１〜８日目に細胞を計数した。図３０は３９℃におけるPER.C6細胞培養の増殖率および最終細胞密度を３７℃の場合と比較して示す。３２℃におけるPER.C6培養の増殖率および最終密度は３７℃または３９℃のものと比較して僅かに減少した。顕著な細胞死は、いずれのインキュベーション温度でも観察されなかった。したがって、PER.C6細胞は、それぞれts125E2Aに対する許容温度および非許容温度である３９℃と３２℃の両方で非常に良好に機能する。
Ｃ．E2A発現ベクターによるPER.C6および293のトランスフェクション、コロニー形成および細胞株の産生
トランスフェクション前日に、2×106PER.C6細胞を10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを収容した６ｃｍ組織培養皿（Greiner）に播種し、10%CO2雰囲気中、３７℃でインキュベートした。翌日、10%CO2雰囲気中、３９℃で細胞をトランスフェクトする以外は供給元（Gibco BRL）の標準手順に従って、LipofectAMINE PLUSTM試薬キットを用いて組織培養皿あたり３、５または８μｇのpcDNA3、pcDNA3wtE2AまたはpcDNA3tsE2AプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をts125E2Aの非許容温度である３９℃に一定して保った。３日後、10%FBS、10mMのMgCl2、および0.25mg/mlのG418（Gibco BRL）を補ったDMEMに細胞を入れ、トランスフェクション１０日後に最初のG418耐性コロニーが出現した。表１に示すように、pcDNA3のトランスフェクション後に得られたコロニー全数（約２００コロニー）またはpcDNA3tsE2Aのトランスフェクション後に得られたコロニー全数（約１００コロニー）とpcDNA3wtE2Aのトランスフェクション後に得られたコロニー全数（わずか４コロニー）との間には著しい差があった。これらの結果は、構成的に発現されたE2Aの毒性がE2A（ts125E2A）の温度感受性突然変異株を用い、かつ細胞を非許容温度である３９℃で培養することによって克服することができることを示している。
各トランスフェクションから、いくつかのコロニーをピペットで組織培養皿から細胞を擦り取ることにより採取した。続いて、剥がした細胞を２４ウェル組織培養皿（Greiner）に入れ、10%FBS、10mMのMgCl2、および0.25mg/mlのG418を補ったDMEM中で、10%CO2雰囲気中、３９℃で培養した。表１に示すように、pcDNA3トランスフェクションコロニーの100%（4/4）およびpcDNA3tsE2Aトランスフェクションコロニーの82%（37/45）が安定な細胞株を確立した(残りの8個のpcDNA3tsE2Aトランスフェクションコロニーは徐々に増殖し、破棄された)。対照的に、１個のpcDNA3wtE2Aトランスフェクションコロニーのみが確立することができた。他の3つは採取直後に死滅した。
次に、異なる細胞株のE2A発現レベルをウェスタンブロッティングによって決定した。細胞株を６ウェル組織培養皿に播種し、準集密的な培養株をPBS（NPBI）で２回洗浄し、RIPA（1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、および0.1%SDSを含むPBSであって、さらに1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび0.1mg/mlトリプシン阻害剤を補充したPBS）中に溶解し、こすり取った。氷上で１５分間インキュベーションした後、ライセートを遠心分離によって取り除いた。タンパク質濃度は、供給元（BioRad）の標準手順に従い、Bio-Radタンパク質アッセイによって測定した。等量の全細胞抽出物を１０％ゲル上でSDS-PAGEによって分画化した。タンパク質をImmobilon-Pメンブラン（ミリポア）に移し、αDBPモノクローナル抗体B6と共にインキュベートした。２次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（BioRad）であった。ウェスタンブロッティング法および抗体のインキュベーションは、ミリポアによって提供された手順に従って実施した。抗体複合体を、製造元（Amersham）の手順に従ってECL検出システムによって可視化した。図３１は、pcDNA3tsE2Aトランスフェクション由来の細胞株全てが72kDaのE2Aタンパク質を発現することを示す（左段のパネル、レーン４〜１４；中段のパネル、レーン１〜１３；右段のパネル、レーン１〜１２）。対照的に、pcDNAwtE2Aトランスフェクション由来の細胞株のみがE2Aタンパク質を発現することができなかった（左段のパネル、レーン２）。pcDNA3トランスフェクション由来の細胞株からの抽出物ではE2Aタンパク質が検出されず（左段のパネル、レーン１）、負のコントロールとして用いた。PER.C6細胞の抽出物はpcDNAts125によって過渡的にトランスフェクションされ（左段のパネル、レーン３）、ウェスタンブロット法の正のコントロールとして用いた。これらのデータは、wtE2Aの構成的発現が細胞毒性を有し、またこの毒性がE2Aのts125突然変異株を用いることによって回避することができることを確証している。
Ｄ．全長ts125E2Aを構成的に発現するPER.C6細胞上のアデノウイルスE2A欠失の補完
アデノウイルスAd5.dl802は、E2Aコード領域の主要部分が欠失したAd5由来ベクターであり、機能的DBPを産生しない。Ad5.dl802を、ts125E2Aを構成的に発現するPER.C6細胞のE2Aトランス補完活性を試験するために用いた。親PER.C6細胞またはPER.C6tsE2Aクローン3-9を、10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEM中で、３９℃、10%CO2で25cm2フラスコ内で培養し、m.o.i.５でAd5.dl802による擬似感染または感染のいずれかを行った。続いて、感染細胞を３２℃で培養し、細胞を、細胞の形態およびフラスコからの細胞の剥離における変化を測定することで細胞変性効果（CPE）の発現によってスクリーニングした。２日以内にAd5.dl802に感染したPER.C6tsE2Aクローン3-9に完全なCPE発現が行われた。Ad5.dl802に感染したPER.C6細胞または擬似感染細胞には、CPEは発現しなかった。これらのデータは、ts125E2Aを構成的に発現しているPER.C6細胞が許容温度３２℃でAd5.dl802ベクターのE2A欠失に対してトランスで補完することを示している。
Ｅ．PER.C6tsE2A細胞株の無血清懸濁培養
ヒト遺伝子治療のために組換えアデノウイルスベクターを大規模で産生することは、任意のヒトまたは動物構成物質を欠いている培地で、産生細胞株、好ましくは懸濁培養の容易かつ拡張可能な培養方法を必要とする。このために、細胞株PER.C6tsE2A c5-9（c5-9と表す）を３９℃、１０％ＣＯ２中で10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを収容した175cm2フラスコ（Nunc）で培養した。準集密性（７０〜８０％集密）で、細胞をPBS（NPBI）で洗浄し、培地を１倍Ｌ−グルタミン（Ｇibco BRL）を補った25mlの無血清懸濁培地Ex-cellTM 525（JRH）（以下SFMと示す）と交換した。２日後、軽く叩くことで細胞をフラスコから剥離し、この細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、５ｍｌのSFM中に再懸濁し、0.5ml細胞懸濁液を12mlの新しいSFMとともに、80cm2組織培養フラスコ（Nunc）に移した。２日後、細胞を収穫し（全ての細胞が懸濁状態にある）、Burker細胞計数器で計数した。次に、20mlのSFMの全容量において3×105細胞／ｍｌの細胞密度で、細胞を１２５ｍｌ組織培養エルレンマイヤー（Corning）に播種した。細胞を、３９℃、10%CO2雰囲気内において、１２５ｒｐｍのオービタルシェーカー（GFL）でさらに培養した。１〜６日目に細胞をBurker細胞計数器で計数した。図４では、８つの培養から得た平均増殖曲線を示す。PER.C6tsE2A c5-9は、無血清懸濁培養で良好に機能する。培養5日以内に１ｍｌあたり約2×106細胞の最大細胞密度が達成された。
Ｆ．３７℃および３９℃におけるPER.C6およびPER.C6/E2Aの増殖特性
PER.C6細胞またはPER.C6ts125E2A（c8-4）細胞を３７℃（PER.C6）または３９℃（PER.C6ts125E2A c8-4）のいずれかの10%CO2雰囲気内において、１０％ウシ胎児血清（FBS、Gibco BRL）および10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、GibcO BRL）で培養した。０日目、全体で1×106の細胞を25cm2組織培養フラスコ（Nunc）に播種し、細胞をそれぞれの温度で培養した。示した時期において、細胞を計数した。３７℃におけるPER.C6細胞の増殖は３９℃におけるPER.C6ts125E2A c8-4の増殖に匹敵した（図３３）。これは、ts125E2AをコードしたDBPの構成的発現は、非許容温度である３９℃において細胞の増殖に対して逆効果を有していないことを示している。
Ｇ．PER.C6ts125E2Aの安定性
幾つかの継代に対し、PER.C6ts125E2A細胞株クローン8-4を、３９℃、10%CO2で、10%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを含む25cm2細胞培養フラスコ（Nunc）で、選択圧（G418）無しで培養した。準集密性（７０〜８０％集密）で、細胞をPBS（NPBI）で洗浄し、RIPA（1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、および0.1%SDSを含むPBSであって、さらに1mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび0.1mg/mlトリプシン阻害剤を補充したPBS）中に溶解し、こすり取った。氷上で１５分間インキュベーションした後、ライセートを遠心分離によって取り除いた。タンパク質濃度は、供給元（BioRad）の標準手順に従い、Bio-Radタンパク質アッセイによって測定した。等量の全細胞抽出物を１０％ゲル上でSDS-PAGEによって分画化した。タンパク質をImmobilon-Pメンブラン（ミリポア）に移し、αDBPモノクローナル抗体B6と共にインキュベートした。２次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（BioRad）であった。ウェスタンブロッティング法および抗体のインキュベーションは、ミリポアによって提供された手順に従って実施した。抗体複合体を、製造元（Amersham）の手順に従ってECL検出システムによって可視化した。少なくとも１６継代にわたり、ts125E2AをコードしたDBPの発現は安定であった。これはおよそ４０細胞倍加に相当する（図３４）。この培養期間においてDBPレベルの減少は観察されず、G418選択圧が無い場合においてさえもts125E2Aの発現が安定であることが示された。
実施例１６
ｔTA発現パッケージング細胞株の作製
Ａ．tTA遺伝子を発現するプラスミドの作製
pcDNA3.1-tTa：tTA遺伝子、tetRおよびVP16遺伝子の融合体を、制限酵素BamHIおよびEcoRIを用いた消化により、プラスミドpUHD15-1から取り除いた（GossenとBujard、1992年）。まず、pUHD15-1をEcoRIで消化した。dNTPsの存在下で線状プラスミドをクレノー酵素で処理し、EcoRI付着末端を塞いだ。次に、プラスミドをBamHIで消化した。得られた長さ1025bpのフラグメントをアガロースから精製した。続いて、このフラグメントをBamHI/EcoRVで消化したpcDNA 3.1HYGRO(-)（Invitrogen）とのライゲーション反応に用いて、pcDNA3.1-tTAを得た。コンピテントなE.Coli DH5α（Life Tech.）への転換、およびアンピシリン耐性コロニーの分析の後、pcDNA3.1-tTAに期待される消化パターンを示す一つのクローンを選択した。
Ｂ．tTA発現ベクターによるPER.C6およびPER.C6/E2Aのトランスフェクション、コロニー形成および細胞株の作製
トランスフェクション前日に、2×106のPER.C6細胞またはPER.C6/E2A細胞を10%FBS（JRH）および10mMのMgCl2を補ったダルベッコ改変基本培地（DMEM、Gibco BRL）を収容した６０ｍｍ組織培養皿（Greiner）に播種し、10%CO2雰囲気中、３７℃でインキュベートした。翌日、供給元（Gibco BRL）の標準手順に従って、LipofectAMINE PLUSTMを用いて４〜８μｇのpcDNA3.1-tTAプラスミドDNAを細胞にトランスフェクトした。この細胞をLipofectAMINE PLUSTMTM−DNA混合物とともに３７℃、10%CO2で４時間インキュベートした。次いで、20%FBSおよび10mMのMgCl2を補ったDMEMを２ｍｌ加え、３７℃、10%CO2で細胞をさらにインキュベートした。翌日、細胞をPBSで洗浄し、10%FBSおよび10mMのMgCl2を補った新しいDMEMで、10%CO2雰囲気中３７℃（PER.C6）または３９℃（PER.C6/E2A）のいずれかで3日間インキュベートした。その後、培地を選択培地に交換した。PER.C6細胞は10%FBS、10mMのMgCl2および50μg/mlのハイグロマイシンB（GIBCO）を補ったDMEMでインキュベートし、一方、PER.C6/E2A細胞は10%FBS、10mMのMgCl2および100μg/mlのハイグロマイシンBを補ったDMEM中に維持した。選択耐性のある細胞のコロニーは３週間以内に現れたが、非耐性細胞はこの期間内に死滅した。
各トランスフェクションから、ピペットで皿から細胞を擦り取ることによりいくつかの独立のハイグロマイシン耐性細胞のコロニーを採取し、2.5cm2の皿（Greiner）に入れ、10%FBS、10mMのMgCl2を含み、かつ50μg/ml（PER.C6細胞）または100μg/ml（PER.C6/E2A細胞）のハイグロマイシンを補ったDMEM中で、それぞれ３７℃または３９℃、10%CO2雰囲気で培養した。
次に、これらのハイグロマイシン耐性細胞のコロニーが機能的tTAタンパク質を発現するか否かを調べた。すなわち、PER.C6/tTA細胞またはPER/E2A/tTA細胞の培養液を7xtetOプロモーターの制御下でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを含有するプラスミドpUHC13-3でトランスフェクトした（GossensとBujard、1992年）。ルシフェラーゼの発現がtTAにより媒介されることを示すため、培養液の半分をドキシサイクリンの入っていない培地中に維持した。残りの半分を８μg/mlのドキシサイクリン（Sigma）を入れた培地中に維持した。後者の薬剤はテトラサイクリンの類似物であり、tTAと結合し、その活性を阻害する。PER.C6/tTAおよびPER/E2A/tTAの全ての細胞株が高いルシフェラーゼレベルを生じた。これは、全ての細胞株がtTAタンパク質を発現したことを示している（図３５）。さらに、ドキシサイクリンで細胞を処理した場合、ルシフェラーゼの発現は大幅に抑制された。まとめると、単離され確立されたハイグロマイシン耐性PER.C6およびPER/E2A細胞クローンは全て機能的tTAを発現したことをデータは示している。
Figure 2011224014
実施例１で記載したとおり、中和化実験に用いた全てのヒトアデノウイルスをPER.C6細胞（ECACC寄託番号96022940）に産生し（Fallauxら、1998年）、CsClで精製した。HPLCカラムから異なる血清型が溶出するNaCl濃度を示した。ウイルス粒／ｍｌ（VP/ml）をAd5水準から計算した。実施例１で記載したとおり、中和化実験と並行して滴定を行って、実験の力価（CCID50）をPER.C6細胞（ECACC寄託番号96022940）上で測定した。本実験に用いた４４のウイルスに対するCCID50を示した。これは5日後に５０％のウエルにおいてCPEを得るのに必要なウイルスの希釈率を示している。VP/CCID50の比をlog10で示した。これはPER.C6細胞（ECACC寄託番号96022940）の異なるバッチの感染力の測定値である。
ヒト血清により中和化を免れたAdApt35.LacZウイルスである。
Figure 2011224014
異なる血清型のwtアデノウイルスに対する中和活性（NA）を有する滑液サンプルの割合である。
Figure 2011224014
BRK形質転換実験における異なるE1発現構築物で得られた病巣の数である。
Figure 2011224014
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Claims (23)

  1. アデノウイルス因子に対して遺伝子が運搬されるべき宿主による中和活性を回避するか、あるいは消滅させる能力を有する、アデノウイルス血清型３５因子又はその機能的同等物の少なくとも１つと、興味ある遺伝子とを含有する遺伝子運搬担体。
  2. 薬剤として使用するためのアデノウイルス血清型３５若しくはその機能的相同物又はそれら由来のキメラウイルス、又は、前記ウイルス、その相同物若しくはそのキメラに基づく遺伝子運搬担体。
  3. 前記因子がアデノウイルス３５ Ｅ３ 発現産物又はそれらをコードする遺伝子を含む請求項１記載の遺伝子運搬担体。
  4. 前記因子がアデノウイルス３５繊維、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質、又はいずれかをコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項１又は３項に記載の遺伝子運搬担体。
  5. 少なくとも１つの他のアデノウイルスを有するアデノウイルス３５のキメラである請求項１，３、又は４のいずれか１項に記載の遺伝子運搬担体。
  6. アデノウイルス３５と異なるトロピズム（向性）を有する請求項１、３，４又は５のいずれか１項に記載の遺伝子運搬担体。
  7. 請求項１又は３〜６項のいずれか１項による遺伝子運搬担体、又は請求項２によるウイルス、相同物、又はそのキメラの少なくとも機能的部分をコードする核酸。
  8. 遺伝子が運搬されるべき宿主によるアデノウイルス因子に対する中和活性を回避するか、あるいは消滅させる能力を有する、アデノウイルス血清型３５因子又はその機能的同等物の少なくとも１つをコードし、かつ、その中に興味ある遺伝子を導入するための部位を有する核酸。
  9. さらに少なくとも１つのＩＴＲを含む請求項７又は８記載の核酸。
  10. さらに、相同性組み換え用に設計されるか、または使用可能なヌクレオチドの領域を含む請求項７，８又は９に記載の核酸。
  11. 核酸の一組が、互いに単一相同組み換え可能であり、機能的遺伝子運搬担体をコードする核酸を誘導することを特徴とする請求項７〜１０に記載の核酸を含む２つの核酸の少なくとも一組。
  12. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１１に記載の１組の核酸を含有する細胞。
  13. 請求項７〜１０のいずれか１つによる核酸又は請求項１１による核酸の一組を欠くアデノウイルス複製用の必須因子を補足する請求項１２記載の細胞。
  14. ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号 ９６０２２９４０）由来であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の細胞。
  15. 請求項１２又は１３に記載の細胞を培養し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することを含む請求項１、又は３〜６項に記載の遺伝子運搬担体を生産する方法。
  16. 適当な培地において請求項１２又は１３に記載の細胞を培養し、生じた遺伝子運搬担体を収穫することを含む請求項１、又は３〜６項に記載の遺伝子運搬担体を生産する方法。
  17. 請求項１５又は１６に記載の方法によって得ることが可能な遺伝子運搬担体。
  18. アデノウイルス及び組込みウイルスのキメラ由来であることを特徴とする請求項１、３〜６、又は１７のいずれか１項に記載の遺伝子運搬担体。
  19. 前記組込みウイルスが、アデノ随伴ウイルスであることを特徴とする遺伝子運搬担体。
  20. アデノウイルス１６又はその機能的同等物の部分を決定するトロピズム（向性）を有する請求項１、３〜６、又は１７〜１９のいずれか１項に記載の遺伝子運搬担体。
  21. 薬剤として使用するための請求項１、３〜６、又は１７〜２０のいずれか１項に記載の遺伝子運搬担体。
  22. 請求項１、３〜６、又は１７〜２０のいずれか１項に記載の遺伝子運搬担体、及び適当な賦形剤を含む薬剤配合物。
  23. 請求項２に記載のアデノウイルス、そのキメラ、又はその機能的相同物、及び適当な賦形剤を含む薬剤配合物。
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