JP2001524822A - 修飾ｅ４領域を含むがｅ４ｏｒｆ３を保持するアデノウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、導入遺伝子発現系、導入遺伝子発現系を含む関連組成物、およびこれらの作成方法と使用方法に関する。好適な系は、発現制御配列に機能的に結合した所望の産物をコードする導入遺伝子をコードするＤＮＡ、Ｅ３領域の少なくとも一部、およびＥ４領域のいくつかの部分を含むアデノウイルス導入遺伝子発現ベクターを用いる。Ｅ４部分は、Ｅ４ＯＲＦ３として知られている読みとり枠配列とＥ４の少なくとも１つの他の部分を含む。好ましくはベクターのＥ４部分（「Ｅ４カセット」）は、Ｅ４ＯＲＦ３と、Ｅ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ６／７およびＥ４ＯＲＦ３／４から選択される少なくとも１つの他の部分とを含む。本発明は、所望の宿主細胞中での導入遺伝子発現の持続性の改良を含む多くの重要な特徴を有する。本発明の導入遺伝子発現系は、インビトロおよびインビボでの導入遺伝子の持続性の細胞発現を提供することを含む種々の応用に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾Ｅ４領域を含むがＥ４ＯＲＦ３を保持するアデノウイルスベクター緒言 本発明は、導入遺伝子発現系、関連組成物（薬剤組成物を含む）、およびこれ らの作成方法と使用方法に関する。好適な系は、Ｅ３領域の少なくとも一部とＥ ４領域のいくつかの部分を含有するアデノウイルスベクター内に発現できるよう に含有された、所望の生成物をコードする配列を有するＤＮＡ分子（導入遺伝子 ）を含むアデノウイルス導入遺伝子発現ベクターを用いる。Ｅ４部分は、Ｅ４Ｏ ＲＦ３として知られている読みとり枠配列とＥ４の少なくとも１つの他の部分を 含む。好ましくはベクターのＥ４部分（「Ｅ４カセット」）は、Ｅ４ＯＲＦ３と 、Ｅ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ６／７およびＥ４ＯＲＦ３／４から選択される少な くとも１つの他の部分とを含む。本発明は、所望の宿主細胞中での導入遺伝子発 現の持続性の改良を含む多くの重要な特徴を有する。本発明の導入遺伝子発現系 は、インビトロおよびインビボでの導入遺伝子の持続性な細胞発現を提供する種 々の応用に有用である。発明の背景 アデノウイルスは、約３６ｋｂのゲノムを有するエンベロープのない核ＤＮＡ ウイルスである。このウイルスゲノムは、２つの時間的に異なるクラスのウイル スタンパク質の生成について初期（Ｅ１−Ｅ４として知られている）転写単位と 後期（Ｌ１−Ｌ５として知られている）転写単位に分類される。総説については 、ホルウィッツ・エム・エス（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．）、「アデノウイルス とその複製（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａ ｔｉｏｎ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２版中、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ら編、 ラーベン・プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、１９９０）を 参照されたい。 組換えアデノウイルスは、分裂細胞または非分裂細胞の両方に対する親和性、 非常に小さい病原性、ベクターストックの調製について高力価に複製する能力、 および大きな挿入体を運搬する可能性などの、導入遺伝子発現系として使用する ための利点を有する（例えば、バークナー・ケー・エル（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ． Ｌ．）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：３９−６ ６（１９９２）；ジョリイ・ディー（Ｊｏｌｌｙ Ｄ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５１−６４（１９９４））。 アデノウイルスベクターは、異なるサイズの種々の導入遺伝子を収容すること ができる。例えば約８kbの挿入体は、増殖に必須のアデノウイルスゲノムの欠失 領域（例えば、Ｅ３）により収容される。必須ではないアデノウイルス遺伝子産 物をｔｒａｎｓで供給する細胞株（例えば、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ４）の開発により 、アデノウイルスゲノム全体への種々の導入遺伝子の挿入が可能になった（例え ば、グラハム・エフ・エル（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ ｌ．，３６：５９−７２（１９７７）；イムラー（Ｉｍｌｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：７５−８４（１９９６）を参照されたい）。例えば、ｐ５ ３、ジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）、エリスロポエチン、オルニチン トランスカルバミンラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターロイキン−２、 アランチトリプシン、トロンボポエチン、およびシトシンデアミナーゼ遺伝子は すべて、発現ベクターを作成するためにアデノウイルスゲノムに個々に挿入され ている。 呼吸器官細胞に対するアデノウイルスの天然の親和性のために、これらは嚢胞 性繊維症（ＣＦ）（白色人種の最も一般的な常染色体劣性疾患）の治療のための 魅力的なベクターとなっている。ＣＦでは、嚢胞性繊維症膜貫通誘導レギュレー ター（ＣＦＴＲ）遺伝子は、ｃＡＭＰ制御性のＣ１チャネル機能を攪乱して、肺 の機能不全を引き起こす。数種類の動物モデルやヒト患者のＣＦを治療するため に、アデノウイルスベクターにＣＦＴＲ遺伝子が導入されている。特に、アデノ ウイルスベクターはＣＦ患者の鼻上皮ならびにコトンラットと霊長類の気道上皮 にＣＦＴＲを充分供給することができることが、研究により証明されている。例 えば、ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：７ ５−８３（１９９４）；リッチ（Ｒｉｃｈ）ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ ｒａｐｙ，４：４６１−４７６（１９９３）；ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ） ら、Ｃｅｌｌ，７５：２０７−２１６（１９９３）；ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ） ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｅｉｃｓ，６：７５−８３（１９９４）；クリス タル（Ｃｒｙｓｔａｌ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：４２−５１ （１９９４）；リッチ（Ｒｉｃｈ）ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ，４：４６１−４７６（１９９３）を参照されたい。 重要なことは最近の研究は、気道上皮細胞にＣＦＴＲをコードするアデノウイ ルスベクターを供給することにより、ＣＦ患者の塩素イオンチャネルの機能を回 復することができることを証明したことである（ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）ら、 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１５０４−１５１１（１９９６））。 しかしインビトロとインビボの研究は、このようなベクターのさらなる改良の 可能性を指摘している。例えばアデノウイルスベクターからの導入遺伝子発現は しばしば一過性である。持続性のある導入遺伝子発現は、遺伝子治療の場、特に 哺乳動物の慢性または遺伝性疾患を改良することを目的とする場合に、非常に好 ましい。少なくとも一部の限界は、感染細胞に対する細胞性免疫応答の誘導によ る。特に、アデノウイルスベクターによりコードされる抗原性に発現されるウイ ルスタンパク質に対して細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が検出されている（た だし、そのようなベクターは複製欠陥性である）。ＣＴＬはまた、免疫原性導入 遺伝子産物に対しても検出されている。細胞障害性Ｔリンパ球は、アデノウイル スベクターを有する細胞を破壊または障害する可能性を有し、従って導入遺伝子 発現の喪失を引き起こす。細胞破壊はまた、関与する組織に対して有害な炎症も 引き起こす。細胞性免疫応答は、高用量を必要とする治療法に対して重大な障害 を引き起こす可能性があり、これはより強力な免疫応答を誘発し易い。ジェイ・ カプアン（Ｊ．Ｋａｐｉａｎ）ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８ ：４５−５６（１９９７）；ワイ・ヤング（Ｙ．Ｙａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．９１：４４０５−１１（１９９４）；ワイ・ヤング（ Ｙ．Ｙａｎｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７２０２（１９９６）。 アデノウイルスベクターにより引き起こされる細胞性免疫応答をできるだけ小 さくするために種々の方策が使用されている。一般的にこの方策には、宿主免疫 応答自身の調節、または免疫応答を引き起こす能力が低下したアデノウイルスベ クターの作成を含む。 例えば免疫抑制剤とアデノウイルスベクターの同時投与は、導入遺伝子発現の 持続性を延長することが報告されている（ファング（Ｆａｎｇ）ら、Ｈｕｍ．Ｇ ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：１０３９−１０４４（１９９５）：ケイ（Ｋａｙ）ら 、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：１９１−１９７（１９９５）；ゼレ ンガー（Ｚｓｅｌｌｅｎｇｅｒ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：４５ ７−４６７（１９９５））。 別のアプローチでは、免疫系によりベクターの認識を低下させるために、組換 えベクター中でアデノウイルスゲノム配列の修飾が使用されている（例えば、ヤ ング（Ｙａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：３６２−３６９（ １９９４）；リーバー（Ｌｉｅｂｅｒ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９４４ −８９６００（１９９６）；ゴルジグリア（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ）ら、Ｊ．Ｖｉ ｒｏｌ．，７０：４１７３−４１７８（１９９６）；コシャネック（Ｋｏｃｈａ ｎｅｋ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：５７３１ −５７３６（１９９６）；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ，２１７：１１−２２（１９９６）を参照されたい）。 プロモーターまたは導入遺伝子の選択もまた、アデノウイルスベクターからの 導入遺伝子発現の持続性に影響を与え得る（例えば、グオ（Ｇｕｏ）ら、Ｇｅｎ ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：８０１−８０２（１９９６）；トリパシー（Ｔｒｉｐ ａｔｈｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：５４５−５５０（１９９６）を参 照されたい）。 アデノウイルスベクターからの導入遺伝子発現の持続性は、アデノウイルスＥ ３ｇｐ１９Ｋタンパク質により影響を受けることが報告されている。このタンパ ク質は、小胞体内のＭＨＣクラス１分子と複合体を形成し、こうしてウイルス抗 原の細胞表面での提示と形質導入された細胞の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ） による死滅を防止することができる（ウォルド（Ｗｏｌｄ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐｐ．４３７−４４３（１９９４））。しかしこの情報 に基づくアプローチは、あまり成功していない。 遺伝子治療のためにウイルスベクターの使用を試みている研究者が直面する別 の問題は、修飾ウイルスゲノム中に挿入できる異種ＤＮＡのサイズである。Ｅ１ 欠損の領域に異種遺伝子を挿入する初期の研究では、継続的な臨床試験を可能に する充分量で産生することが困難なベクターが得られた。例えばディー・アーメ ンターノ（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，６： １３４３−１３４４（１９９５）を参照されたい。野生型ゲノムの長さより長い アデノウイルスＤＮＡを含有するウイルスベクターを産生することは可能である が、野生型ゲノムの長さを大幅に超えた時そのようなベクターを複製する能力は 急激に低下する。 従ってそのサイズが、持続性の導入遺伝子発現を提供するパッケージングを可 能にし、かつそのベクターを含有する細胞に対する細胞性免疫応答を最小にする ゲノムを有する導入遺伝子発現ベクターを開発し産生するニーズがある。そのよ うなベクターは、遺伝子治療における遺伝子輸送ベクターとしての使用を含む、 細胞への遺伝子の供給において種々の用途を有するであろう。発明の概要 本発明は、導入遺伝子発現系および関連組成物（薬剤組成物を含む）、および これらの作成方法と使用方法に関する。例えば１つの面において本発明は、Ｅ３ 領域の少なくとも一部と修飾Ｅ４領域を含有するアデノウイルスベクター内で発 現できるように含有された、異種ＤＮＡ分子（導入遺伝子）を含むアデノウイル ス導入遺伝子発現ベクターに関する。修飾Ｅ４部分は、Ｅ４ＯＲＦ４のみ、また は好ましくは修飾Ｅ４領域は少なくともＥ４ＯＲＦ３とＥ４領域の少なくとも１ つの他の部分を含む。本明細書において使用される用語「修飾ＥＶ」は、少なく とも１つの欠失を有するＥ４領域を意味する。ウイルスゲノム中の別のところお よび任意の他の付加ＤＮＡ（例えば、異種ＤＮＡ（導入遺伝子）および関連プロ モーター、エンハンサーおよび他の転写制御成分）中の任意の欠失を考慮して、 好ましくは欠失のサイズは充分であり、得られるウイルスベクターのサイズは、 典型的には野生型ウイルスゲノムのサイズの約１１０％未満、より好ましくは約 １０５％未満、最も好ましくは約１０１％未満である。好ましくは欠失は少なく とも１つのＥ４読みとり枠を含むが、Ｅ４領域の非ＯＲＦ部分の欠失を利用する こともできる。上記したように本発明のベクターのいくつかのＥ４領域は、Ｅ４ ＯＲＦ３およびＥ４領域の少なくとも１つの追加の部分からの発現を必要とする 。さらに好ましくはＥ４欠失は、複数の読みとり枠を含む。Ｅ４ＯＲＦ６は随時 欠失してもよい。 例えば欠失は、別のＯＲＦの読みとり枠に影響を与えないフレームシフト突然 変異またはノックアウトによるＯＲＦの除去を含む。 別の面において本発明は、Ｅ３領域の少なくとも１部とＥ４ＯＲＦ４、または 少なくともＥ４ＯＲＦ４を含む修飾Ｅ４領域を含有するアデノウイルス内に含有 される、導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含むアデノウイルス導入遺伝子発 現ベクターに関する。 本発明のベクター内に含有される修飾Ｅ４部分（または「Ｅ４カセット」）は 、Ｅ４ＯＲＦ３と、Ｅ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ６／７およびＥ４ＯＲＦ３／４か ら選択される少なくとも１つの他の部分とを含む。Ｅ４カセットの好適な部分は 、Ｅ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ６／７、およびＥ４ ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ３／４である。修飾Ｅ４部分はまたＥ４ＯＲＦ６を含んで もよい。これまで本発明のベクターで形質転換した哺乳動物細胞からの持続性の 導入遺伝子発現についての最も好ましい組合せは、Ｅ３とＥ４ＯＲＦ３およびＥ ４ＯＲＦ４との組合せである。導入遺伝子発現系は、細胞中の導入遺伝子の持続 性発現を促進し、細胞性免疫応答から細胞を防御する。本発明はまた、導入遺伝 子発現系を含む薬剤組成物、および所望の細胞に治療用導入遺伝子を供給するた めのそのような組成物の使用方法も特徴とする。本発明はさらに、導入遺伝子発 現系の産生方法、ならびに細胞、組織および哺乳動物中で導入遺伝子を発現する ための導入遺伝子発現系の使用方法、および細胞性免疫応答から導入遺伝子を発 現する細胞を防御する方法を特徴とする。 細胞または細胞群（例えば、組織）中の導入遺伝子の持続性発現を促進する導 入遺伝子発現系が開発されている。一般に導入遺伝子発現系は、アデノウイルス Ｅ３領域の少なくとも一部（「Ｅ３カセット」）と修飾Ｅ４領域、好ましくはＥ ４ＯＲＦ３とＥ４の少なくとも１つの他の部分の発現の存在下で、所望の導入遺 伝子を持続的に発現する。この導入遺伝子発現系は、持続性の導入遺伝子発現を 達成し、導入遺伝子を発現する細胞を細胞性免疫応答から防御し、こうして細胞 内でより安定な導入遺伝子発現を提供する。従って本発明の導入遺伝子発現系は 、インビトロまたはインビボで所望の導入遺伝子を提供するための遺伝子輸送シ ステムとしての使用を含む種々の用途を有する。 すなわち本発明の１つの面において、（ａ）発現制御配列に機能的に結合した 導入遺伝子を含む転写単位をコードするＤＮＡ分子、（ｂ）アデノウイルスＥ３ 領域の少なくとも一部、および（ｃ）Ｅ４ＯＲＦ３と、Ｅ４の少なくとも１つの 他の部分を含む、導入遺伝子発現系が提供される。この面において導入遺伝子発 現系は、細胞中の導入遺伝子の持続性発現を促進し、導入遺伝子発現系を有する 細胞（すなわち、形質導入した細胞）を障害または破壊する可能性のある細胞性 免疫応答から、導入遺伝子を発現する細胞を防御する。従って、導入遺伝子発現 系の使用は、例えば導入遺伝子を発現する細胞の生存を延長し、かつそのような 細胞の破壊により引き起こされる炎症を低下させることにより、導入遺伝子の発 現を改良する。 一般に本発明の導入遺伝子発現系は大きな利点を提供する。例えば先行技術の 導入遺伝子発現系の使用は典型的には、所望の導入遺伝子を発現する形質導入細 胞を障害または破壊する宿主免疫応答（例えば、ＣＴＬ、炎症）を刺激する。こ れに対して本発明の導入遺伝子発現系は、細胞性免疫応答により引き起こされる 発現の損失を最小にしながら、持続性の導入遺伝子発現を提供する。高用量の先 行技術の導入遺伝子発現系の使用は、典型的には形質導入細胞に対する顕著な細 胞性免疫応答を誘発する。これに対して本発明の導入遺伝子発現系は、細胞性免 疫（ＣＭＩ）応答に対する形質導入細胞の感受性を最小にし、こうして導入遺伝 子の繰り返し投与が必要な場合（例えば、高用量または複数回投与プロトコール を必要とする遺伝子治療での使用）について、本発明を魅力的なものとしている 。 さらに、組換えアデノウイルスを使用する先行技術の導入遺伝子発現系は典型 的には、効率的な使用のために高感染多重度（ＭＯＩ）を必要とした。高投入量 のウイルスのために、例えば細胞障害性量のウイルスタンパク質が導入されるこ とによりしばしば形質導入細胞が死滅した。これに対して本発明の導入遺伝子発 現系は、投入ウイルスの好ましくない量に依存せず持続性の導入遺伝子発現を達 成する機会を提供する。すなわち本発明の導入遺伝子発現系の使用は、導入遺伝 子を発現する細胞の生存活性を改良する。 一般に本発明の導入遺伝子発現系は、少なくとも一部はアデノウイルスＥ３領 域（特に限定されないが、少なくともアデノウイルスＥ３領域のｇｐ１９Ｋ遺伝 子産物をコードするその部分）により、形質導入した哺乳動物細胞中での持続性 の導入遺伝子発現を提供する。持続性はまた、１４．７ｋタンパク質、１０．４ ｋタンパク質および１４．５ｋタンパク質の１つまたはそれ以上を提供するＥ３ 領域の部分をベクター内に含めることにより改良される。 持続性はまた、アデノウイルスＥ４領域のＥ４ＯＲＦ３およびＥ４ＯＲＦ４ま たは他の部分を含めることによっても改良される。ベクター内のこれらのＤＮＡ セグメントの存在は、導入遺伝子を発現する細胞に対する細胞性免疫応答による 破壊を最小にするかまたは排除しながら、細胞内の導入遺伝子の持続性発現を促 進する。 好適な実施態様において、本発明の導入遺伝子発現系は複製欠陥アデノウイル スベクターとして提供される。すなわち複製欠陥ベクターは、野生型アデノウイ ルス（例えば、Ａｄ２、Ａｄ５）または複製能のあるアデノウイルスベースのベ クターが通常達成するレベルで、宿主細胞中で増殖することができない。すなわ ち好適な実施態様において、転写単位をコードするＤＮＡ配列、アデノウイルス Ｅ３領域の少なくとも一部であるＥ４ＯＲＦ３、およびＥ４の少なくとも１つの 他の部分（好ましくは、Ｅ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ６／７および／またはＥ４Ｏ ＲＦ３／４）が、単一の複製欠陥アデノウイルスベクター上で一緒に（すなわち 、ｃｉｓで）提供される。Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域が欠如したアデノウイルスベ クターのようなＥ１領域機能の欠陥のあるベクターを含む多くの複製欠陥アデノ ウイルスベクターが、当該分野で公知である。 本発明の導入遺伝子発現系の成分は、単一の複製欠陥アデノウイルスベクター 上に多くの方法で配置させることができる。例えばＰＣＴ出願ＷＯ９６−３０５ ３４号（参照することにより本明細書の一部とする）に報告されているように、 導入遺伝子を含む転写単位（すなわち、発現カセット）がアデノウイルスベクタ ーのＥ１ａとＥ１ｂ領域に位置し、Ｅ４領域カセットがＥ４領域に位置する種々 のアデノウイルスベクターを作製することが可能である。しかし他のアデノウイ ルスベクターでは、発現カセットはＥ４領域に位置し、Ｅ４カセットはＥ１ａ、 Ｅ１ｂ領域に位置している。 すなわち本発明において、導入遺伝子を含む転写単位が作製され、従来の組換 えＤＮＡ法に従ってアデノウイルスベクター中に挿入される。特に好適な挿入部 位はアデノウイルスベクターのＥ１ａ／Ｅ１ｂ領域である。同じベクターにおい てアデノウイルスＥ３領域部分とＥ４カセットは好ましくは、アデノウイルスベ クターのそれぞれＥ３領域とＥ４領域に位置している。 あるいは導入遺伝子を含む転写単位は、アデノウイルスベクターのＥ４領域に 挿入されてもよく、Ｅ４カセットはアデノウイルスベクターのＥ１ａ／Ｅ１ｂ領 域に挿入することが有利である。このような場合Ｅ３カセットは、好ましくはア デノウイルスベクターの例えばＥ３領域に位置する。 本発明の好適な実施態様において、導入遺伝子を含む転写単位は、アデノウイ ルスベクターのＥ１ａ／Ｅ１ｂ領域に挿入される。この実施態様において転写単 位とアデノウイルスＥ３領域部分は、Ｅ２領域を含むアデノウイルスゲノムによ り分離された単一のアデノウイルスベクター上で提供される。アデノウイルスベ クターはさらに、アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一部、Ｅ４ＯＲＦ３、お よびアデノウイルス主要後期転写部分の方向に対してベクターのアデノウイルス Ｅ３領域の遠くに位置するＥ４の少なくとも１つの他の部分、好ましくはＥ４Ｏ ＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ６／７および／またはＥ４ＯＲＦ３／４ととともに、提供さ れる。アデノウイルスベクターは、持続性の導入遺伝子発現を提供することと、 アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一部と少なくともＥ４ＯＲＦ３およびＥ４ ＯＲＦ４および／またはアデノウイルスＥ４領域の他の部分からの発現の存在下 で導入遺伝子を発現することにより、障害性または破壊性の細胞性免疫応答から 形質導入細胞を防御することとが可能である。 導入遺伝子の発現は、アデノウイルスベクターとの使用に適したプロモーター 、エンハンサー、および他の制御成分のような、機能的に結合した真核生物性ま たはウイルス性転写制御成分により増強される。好ましくは、強いプロモーター は、種々の型の細胞で導入遺伝子発現を指令できるように、導入遺伝子に対して ５’で結合する。例えば導入遺伝子発現を増強できるように、Ｅ４ＯＲＦ３遺伝 子産 物との使用に特に適した強いプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（Ｃ ＭＶ）またはポリグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター）を含有しても よい。この実施態様において、導入遺伝子はまた、１つまたはそれ以上のＲＮＡ プロセシングシグナル（好ましくはポリアデニル化セグメント）をコードするＤ ＮＡも含有する。 さらに好適な実施態様において転写単位は、アデノウイルスベクターの実験室 での増殖中に複製能のあるアデノウイルスの産生を低下させる配列修飾をさらに 含み、その臨床的グレード調製物の作成をさらに提供する（例えば、グオ（Ｇｕ ｏ）らを参照されたい、前述）。 アデノウイルスベクター中のＥ３カセットは完全長Ｅ３領域を含有してもよい 。あるいはＥ３カセットはＥ３領域の一部、好ましくは導入遺伝子発現系を発現 する細胞中の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）の作用に悪 影響を与え得る部分から構成されてもよい。例えばＥ３領域のｇｐ１９Ｋ遺伝子 産物は、ＭＨＣ提示をダウンレギュレーションすることが証明されている。本発 明の導入遺伝子発現系を含有する細胞中のＭＨＣ提示の低下または排除は、その ような細胞に対する細胞性免疫応答に対する感受性を低下または排除することに より導入遺伝子の持続性を増強する。ｇｐ１９Ｋ領域を含むＥ３カセットの例は 、１９９７年４月１４日に出願された標題「導入遺伝子発現の持続性の上昇を促 進することができる新規アデノウイルスベクター」の同時係属米国出願第０８／ ８３９，５５３号に開示されている（これは参照することにより本明細書の一部 とする）。また１９９７年４月１４日に出願された標題「持続性の上昇のための 新規導入遺伝子発現系」の同時係属米国出願第０８／８３９，５５２号も参照さ れたい（これは参照することにより本明細書の一部とする）。さらに、ＴＮＦ− αによる溶解に対するさらなる防御を提供するために、Ｅ３の１４．７、１０． ４および１４．５ｋタンパク質もまた含有してもよい（ウォルド（Ｗｏｌｄ）ら 、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８４：１−８（１９９１）を参照されたい）。 前記したようにＥ３領域またはその一部以外に、本ベクターは、Ｅ４ＯＲＦ３ 、およびＥ４の少なくとも１つの他の部分（好ましくはＥ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲ Ｆ６／７および／またはＥ４ＯＲＦ３／４）を含有する。Ｅ４カセットの好適な 部 分は、Ｅ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ６／７、および Ｅ４ＯＲＦ３／４である。最も好適な実施態様は、Ｅ３、Ｅ４ＯＲＦ３、および Ｅ４ＯＲＦ４を含む。次に最も好適な実施態様は、Ｅ３、Ｅ４ＯＲＦ３、および Ｅ４ＯＲＦ６／７を含む。 本発明の導入遺伝子発現系は、２つ以上のＤＮＡ作製体を含有するように作成 することができる。例えば転写単位をコードするＤＮＡ配列、アデノウイルスＥ ３領域の少なくとも一部、Ｅ４ＯＲＦ３セグメントまたはその一部、およびＥ４ ＯＲＦ４および／またはアデノウイルスＥ４領域の他の部分が、好ましくは同じ ＤＮＡ作製体（例えば、複製欠陥アデノウイルスベクター）中で提供されてよい 。この実施態様において本発明のユーザーは、導入遺伝子発現系の成分を容易に 扱い、これを細胞に同時に導入することができる。すなわち転写単位をコードす るＤＮＡ配列およびアデノウイルスの必要な領域は、単一のアデノウイルスベク ター上に含有される。 しかし本発明の目的はまた、別々のＤＮＡ作製体上で導入遺伝子発現系の成分 、例えばプラスミド、アデノウイルスベクター、アデノウイルスベクター由来の 組換えアデノウイルス、およびこれらの組合せを提供し、こうして導入遺伝子発 現系の管理に対してユーザーがコントロールできるようにすることである。特に このアプローチはいくつかの場（例えば、導入遺伝子発現系の成分を異なる時期 に細胞に導入することが好ましい場合）で有利である。 例えば転写単位をコードするＤＮＡ配列はあるいは、単一のプラスミド上に含 有され、アデノウイルスＥ３カセットとＥ４カセットは別々のアデノウイルスベ クター中に含有されてよい。他の実施態様において転写単位とＥ３カセット領域 を含有するＤＮＡ配列はプラスミド中に含有される。あるいは、転写単位とアデ ノウイルスＥ４カセットをコードするＤＮＡ配列はプラスミド中に含有され、ア デノウイルスＥ３領域はアデノウイルスベクター中に含有されてよい。プラスミ ド以外に導入遺伝子発現系の成分を、ファージミド、コスミド、エピソームなど のような細菌宿主中で、自律的複製が可能な環状ＤＮＡ上に提供することができ る。 さらに導入遺伝子発現系の成分は、１つまたはそれ以上の適当なプラスミド、 ファージミド、コスミド、またはエピソーム上に位置することができる。 本発明のある実施態様において、前記した導入遺伝子発現系は、標的細胞への 導入遺伝子発現系の供給と侵入を促進する少なくとも１つの陽イオン性両親媒性 化合物を含む複合体として提供される。好適な実施態様において導入遺伝子発現 系は、導入遺伝子発現系を含む組成物として、好ましくは導入遺伝子発現系と少 なくとも１つの陽イオン性両親媒性化合物を含む複合体として提供され、組成物 は、特定の所望の作用を達成するために細胞に導入遺伝子を供給し発現すること ができる。例えば導入遺伝子は、気道上皮細胞に供給される機能性の野生型ＣＦ ＴＲ遺伝子であり、表現型作用は、そのような細胞に機能性塩素イオンチャネル を提供することである。好ましくは組成物は、慢性または遺伝性疾患（哺乳動物 呼吸組織に影響を与える障害または疾患例えば嚢胞性繊維症を含む）を緩和する ことができる。 本発明の他の実施態様において、組成物はＥ３領域の少なくとも一部、Ｅ４Ｏ ＲＦ３、およびＥ４の少なくとも１つの他の部分（好ましくは、Ｅ４ＯＲＦ４、 Ｅ４ＯＲＦ６／７および／またはＥ４ＯＲＦ３／４）とを含む導入遺伝子発現系 を、担体と一緒に含む。この組成物は、この系を含む細胞中のＭＨＣクラスＩ受 容体の発現を低下させることができる導入遺伝子発現系を含み、こうして導入遺 伝子発現の持続性を改良する。この組成物は、導入遺伝子発現系のＥ３領域が、 ｇｐ１９Ｋタンパク質をコードする少なくともＤＮＡ配列を含む導入遺伝子発現 系を含んでよい。別の実施態様において本組成物は、Ｅ３領域が、ｇｐ１９Ｋ、 １４．７ｋ、１０．４ｋおよび１４．５ｋタンパク質をコードするＤＮＡからな り、Ｅ４カセットがＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４からなる導入遺伝子発現系を含 む。好ましくは導入遺伝子は、真核生物プロモーター、例えばＣＭＶまたはＰＧ Ｋプロモーター、より好ましくはＣＭＶプロモーターに機能的に結合している。 導入遺伝子は好ましくは、発現されて、哺乳動物呼吸組織中に存在するような疾 患または障害を緩和することができる遺伝子産物を提供することができる遺伝子 を含む。好適な実施態様において本組成物は、導入遺伝子が野生型嚢胞性繊維症 膜貫通レギュレーター（ＣＦＴＲ）遺伝子である導入遺伝子発現系を含む。 本発明において前述の組成物の作成方法が提供され、ここで本方法は、導入遺 伝子発現系を組成物を形成するのに充分な陽イオン性両親媒性化合物と組合せる 。本組成物はさらに随時担体を含有してもよい。 本発明はまた、下記に詳述する導入遺伝子発現系の産生方法に関する。 本発明はさらに、細胞、組織または哺乳動物中で導入遺伝子を発現する方法、 および導入遺伝子を発現する細胞に対する細胞性免疫応答に対する感受性を低下 または排除する方法を提供し、ここで本方法は、本発明の導入遺伝子発現系を１ つまたはそれ以上の適当な陽イオン性両親媒性化合物と組合せて複合体を形成さ せ、細胞を形質転換し細胞中で導入遺伝子を発現するのに充分な条件下でその複 合体を哺乳動物の細胞に投与するかまたは細胞を複合体に接触させて所望の表現 型を達成し、そして本発明の発現されたＥ３カセットおよび、修飾Ｅ４カセット の存在下で導入遺伝子を発現することにより、細胞性免疫応答に対する感受性を 低下させるかまたは排除することを含んでなる。図面の簡単な説明 図１Ａと１Ｂは、アデノウイルスのゲノム構造の略図である。図１Ａは、完全 なアデノウイルスゲノムの構造を示す。図１Ｂは、Ｅ４＋（Ａ）、Ｅ４ＯＲＦ３ （Ｂ），およびＥ４ＯＲＦ３、ＯＲＦ４（Ｃ）領域の構造を含むアデノウイルス Ｅ４領域のゲノム構造の展開図である。 図２Ａと２Ｂは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子とＥ４領域または種々のＥ４領 域欠失を含むアデノウイルスベクター（Ａｄ２血清型）の構造を示す略図である 。アデノウイルスゲノムの略図は、各図に示すベクターの上に示す。図２Ｂの「 β−ｇａｌ」の下の数字は、具体的なＡｄ２／β−ｇａｌ作製体を意味する。例 えば作製体２、４〜８および１１はＥ３＋であり、作製体９、１０、１２および １３はＥ３−である。 図３は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子とＥ４領域または種々のＥ４領域欠失を含むアデ ノウイルスベクター（Ａｄ２血清型）の構造を示す略図である。アデノウイルス ；ゲノムの略図は、アデノウイルスベクターの上に示してある。 図４は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、アデノウイルスＥ３領域、およびアデ ノウイルスＥ４領域またはＥ４ＯＲＦ４を含むアデノウイルスベクターで形質導 入した細胞は、アデノウイルス特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による溶 解から防御されることを示すグラフである。Ｅ３領域とＥ４ＯＲＦ６／７を含む アデノウイルスベクターは、中間的な防御を与えた。 図５は、ＣＦＴＲ遺伝子、アデノウイルスＥ３領域、およびアデノウイルスＥ ４領域を含むアデノウイルスベクターで形質導入した細胞は、アデノウイルス特 異的ＣＴＬによる溶解から防御されることを示すグラフである。 図６は、Ａｄ２／ＣＦＴＲ−２／Ｅ３Δ２−８ベクターの構造を示す。 図７は、Ａｄ２／β−Ｇａｌ−４／Ｅ３Δ２−９ベクターの構造を示す。発明の詳細な説明 本発明は、アデノウイルス導入遺伝子発現系、導入遺伝子発現系を含む関連組 成物、およびこれらの作成方法と使用方法を特徴とする。ある実施態様において アデノウイルス導入遺伝子発現系は、発現制御配列に機能的に結合した導入遺伝 子を含む転写単位をコードするＤＮＡ、アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一 部（「Ｅ３カセット」）、およびＥ４ＯＲＦ３、およびＥ４の少なくとも１つの 他の部分（「Ｅ４カセット」）とからなる導入遺伝子発現系を特徴とする。導入 遺伝子発現系は、インビトロおよびインビボで細胞中の導入遺伝子を持続性に発 現し、導入遺伝子を発現する細胞に対する細胞性免疫応答に対する感受性を低下 または排除することができる。 好ましくはアデノウイルス導入遺伝子発現系の成分（すなわち、転写単位、Ｅ ３カセット、Ｅ４カセット）は、単一のアデノウイルスベクター中で形成される 。好ましくはアデノウイルスベクターは複製欠陥である。成分は目的の使用を満 足するように種々の方法で形成することができるため、これは導入遺伝子発現系 を限定するものではない。例えばある好適な実施態様において、アデノウイルス ベクターは、アデノウイルスのＥ１ａ／Ｅ１ｂ領域中に挿入された導入遺伝子を 含む転写単位を含む。この実施態様においてアデノウイルスベクターは、アデノ ウイルスのそれぞれＥ３領域とＥ４領域に対応する位置に形成されたＥ３カセッ トとＥ４カセットを含む。 アデノウイルスベクターは主に、アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一部と Ｅ４ＯＲＦ３およびＥ４の少なくとも１つの他の部分を含む、アデノウイルスゲ ノム配列を含んでなる。好ましくはアデノウイルスベクターは、アデノウイルス ヘルパーウイルスと同時感染するか、またはｔｒａｎｓで１つまたはそれ以上の アデノウィルス遺伝子産物を与える適当な細胞株（例えば、２９３細胞）中に導 入されなければ、宿主細胞中で生産的に複製することができない。 本発明のアデノウイルスベクターは、既知の６つのヒトサブグループ（例えば 、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ）のいずれか１つに属し、ここで血清型の好適な シリーズ（すべてサブグループＤから）は、Ａｄ９、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ １９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ２６、Ａｄ２７、Ａｄ２８、Ａｄ３０、または Ａｄ３９を含む。好適な血清型はＡｄ２とＡｄ５血清型を含む。さらに異なる血 清型のＡｄ ＤＮＡの組合せを含むキメラアデノウイルスベクターは、本発明の 範囲内にある。例えばＡｄ１７からのＤＮＡをコードするファイバーとＡｄ２骨 格をコードするＤＮＡを有するキメラＡｄ２ベクターを作製することが可能であ る。 体液性免疫応答は、ある状況、例えばベクターの繰り返し投与を必要とする治 療プロトコールで、アデノウイルスベクターの有効性を低下させるのにある役割 を果たすことが知られている。従って、異なる血清型（または血清型の組合せ） のＡｄベクターの「パネル」に所望の導入遺伝子を挿入することが好ましい場合 がある。Ａｄベクター（各ベクター血清型は同じ導入遺伝子を含む）のパネルを 連続的に投与することにより、有害な体液性免疫応答を最小にするかまたは好ま しくは排除することが可能である。Ａｄベクターの好適なパネルは、Ａｄ２、Ａ ｄ５、Ａｄ１７、およびＡｄ３９血清型またはこれらのキメラ組合せから得られ るものを含む。パネルは必要に応じて、かつ例えば必要な投与の回数および遭遇 する免疫応答の重症度に応じ、追加の血清型を含むように拡張される。 本明細書で使用される用語「導入遺伝子」は、アデノウイルスゲノムに対して 部分的にまたは完全に異種（すなわち外来）であるタンパク質をコードするＤＮ Ａを意味する。導入遺伝子は、目的の哺乳動物細胞または組織から完全にまたは 部分的に欠失している必要な遺伝子産物を（完全にまたは部分的に）供給する導 入遺伝子でもよい。アデノウイルスベクターの転写単位によりコードされる導入 遺伝子は、特に限定されないが、酵素、血液由来物質、ホルモン、リンホカイン （インターロイキンやインターフェロン）、凝固物質、増殖因子、神経伝達物質 、腫瘍抑制物質、アポリポタンパク質、抗原、および抗体をコードする導入遺伝 子 を含む。さらに詳しくは導入遺伝子は、ＣＦＴＲ、ジストロフィン、グルコセレ ブロシダーゼ、腫瘍壊死因子、ｐ５３、網膜芽腫（Ｒｂ）、またはアデノシンデ アミナーゼ（Ａｄ）をコードしてもよい。アンチセンス分子またはリボザイムを コードする導入遺伝子は、本発明の範囲内にある。 特に、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡが塩素チャネルとして機能する能力に実質的に影響 を与えない修飾である既知のＣＴＦＲ ｃＤＮＡ配列（例えば、ＰＣＴ出願第Ｗ Ｏ９６／３０５３４号を参照されたい、これは参照することにより本明細書の一 部とする）のアミノ酸配列変化および／または非配列修飾は、本発明の範囲内に ある。すなわちアミノ酸配列変化および／または非配列変化（例えば、それぞれ アミノ酸欠失、付加、置換、または炭水化物の付加）は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ遺 伝子産物が細胞中で機能性塩素イオンチャネルを形成する能力に影響を与えない 。 好ましくはアデノウイルスベクターは、細胞または組織への効率的な侵入を促 進するために；導入遺伝子の持続性発現を達成するために；および導入遺伝子発 現系を含む細胞または組織に対する細胞性および体液性免疫応答の破壊的影響を 低減するために、必要な導入遺伝子発現系の成分を含む。好ましくはアデノウイ ルスベクターは、１つまたはそれ以上の適当な発現制御配列、例えば強い真核生 物プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＰＧＫ）、エンハンサー、ポリアデニル化成 分、および導入遺伝子発現を上昇させることができる他の真核生物性制御成分（ これらはすべて、導入遺伝子の最適な発現を提供できるように機能的に結合して いる）の制御下で導入遺伝子をコードするＤＮＡである転写単位中に導入遺伝子 を含む。好適な実施態様において転写単位は、転写単位の一部として導入遺伝子 の５’に共有結合した強い真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＰＧＫ プロモーター）を含む。用語「ＣＭＶプロモーター」は、ＣＭＶの前早期（ＩＥ ）遺伝子の転写を制御するＤＮＡ配列を有するＣＭＶ株中に天然に存在するプロ モーターを意味する。あるいは他の強い真核生物プロモーターはそのような使用 に適したものであり、ＰＧＫプロモーターまたはハイブリッドプロモーター（例 えば、ＣＭＶ／Ｅ１ａハイブリッドプロモーター）を含む。さらにアデノウイル スベクターは、アデノウイルスベクターの複製または組換え能力をさらに低下さ せるような他の適当な遺伝子的修飾（例えば、米国特許第５，７０７，６１ ８号（これは参照することにより本明細書の一部とする）に記載のように、タン パク質IX遺伝子をウイルスゲノム中の他の位置に移す）を含んでよい。 本発明の好適な実施態様において導入遺伝子はまた、１つまたはそれ以上の真 核生物ＲＮＡプロセシングシグナル（好ましくは、ヒトでの使用が許容されるＲ ＮＡプロセシングシグナル）をコードするＤＮＡも含有する。例えばＳＶ４０ス モールｔイントロン配列またはＳＶ４０もしくはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポ リアデニル化シグナルを、ＲＮＡプロセシングシグナルとして使用することがで きる。好適なポリアデニル化シグナルはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである 。このシグナルは必要に応じて、導入遺伝子をコードするＤＮＡの近傍および／ または遠くに位置してもよい。転写単位はさらに、複製能のあるアデノウイルス の産生を低下させ、かつさらに臨床的グレードの調製物の作成を提供する配列修 飾を含有してもよい。例えば欠失したアデノウイルスタンパク質IX配列は、導入 遺伝子をコードするベクターのファイバー領域とＳＶ４０および／またはＢＧＨ ポリアデニル化シグナルとの間に位置してもよく、これは複製能のあるウイルス を生み出す対応する細胞株（例えば、２９３細胞）中の組換えイベントの可能性 を低下させる。 従って代表的な実施態様において、導入遺伝子の転写単位は、ＣＭＶプロモー ター／導入遺伝子／ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル／pIX配列／ＢＧＨポリア デニル化シグナルの順序で機能的に結合して含む。アデノウイルスベクター中で 提供される転写単位の例は、図２Ａ、２Ｂおよび３に示すが、ＷＯ９６／３０５ ０４号に記載のようなＡｄ２／ＣＦＴＲ−５、およびカプラン・ジェイ・エム（ Ｋａｐｌａｎ，ＪＭ）ら、（１９９７）（前述）に記載のようなＡｄ２−βｇａ ｌ−７、Ａｄ２−βｇａｌ−４、ならびに当業者に公知他の関連する構造も参照 されたい。 例えば本発明の範囲内にあるＡｄ２ベクターは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子 を除去してＥ４ＯＲＦ４ Ｅ４領域を有するＡｄ２ベクターを形成した後のＡｄ ２−βｇａｌ−７ベクター中に導入遺伝子が挿入されているものである。 導入遺伝子発現系のさらなる成分はＥ４カセットである。Ｅ４カセットは、必 要であれば導入遺伝子の持続性をさらに上昇させるために他のＥ４ＯＲＦ（例え ば、Ｅ４ＯＲＦ１、Ｅ４ＯＲＦ２、またはＥ４ＯＲＦ６）を含有してもよい。Ｅ ４カセットは、好ましくは単一のベクター上で提供されるが、Ｅ４カセットの個 々のＯＲＦは必要に応じて別のベクター上で提供されてもよい。Ｅ４カセットは 未変性のＥ４プロモーターの制御下に置かれるか、あるいは異種プロモーター（ 例えば、ＣＭＶ）の制御下に置かれてよい。好ましくはＥ４カセットは、導入遺 伝子の持続性発現を促進するためにＥ４カセットの充分な発現を提供するプロモ ーターの制御下に置かれる。例えばある実施態様においてＣＭＶプロモーターは 、Ｅ４カセット中の１つまたはそれ以上のＯＲＦの発現を制御するために使用さ れる。 特に好適な実施態様において導入遺伝子発現系は、少なくともＥ３のＭＨＣク ラスＩダウンレギュレーション部分と組合せたＥ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４とと もに提供される。 好適な実施態様において導入遺伝子発現は、Ｅ４ＯＲＦ３領域の存在により活 性化され非組織特異的に転写単位によりコードされる導入遺伝子の転写を指令す る強いプロモーター（好ましくは、ＣＭＶプロモーター）により制御される。例 えば導入遺伝子がＣＦＴＲである時、ＣＭＶプロモーターは、Ｅ４ＯＲＦ３の非 存在下より長くその存在下にあって、細胞または組織中の導入遺伝子の転写を指 令する。完全長ＣＭＶプロモーターが使用できるか、または導入遺伝子発現を駆 動しＥ４ＯＲＦ３領域からの発現によりアップレギュレーションされることがで きるその断片を使用することができる。ＣＭＶプロモーター断片は、下記の測定 法を使用して導入遺伝子の持続性発現を増強する能力について試験することがで きる。他の実施態様において、ＰＧＫまたは他の選択されたプロモーターは、導 入遺伝子の転写を指令するために使用される。 本発明の導入遺伝子発現系のさらなる成分は、Ｅ３カセットである。Ｅ３カセ ットは、ｇｐ１９Ｋ遺伝子産物を含むいくつかのコードされた遺伝子産物を含有 し、これはＭＨＣクラスＩ発現をダウンレギュレーションすると考えられている 。これは例えば転写単位と同時に、持続性の上昇を促進するために細胞に提供さ れる。本発明によれば、Ｅ３カセットにより与えられるＭＨＣクラスＩ発現をダ ウンレギュレーションすることにより、少なくとも部分的に導入遺伝子発現の持 続 性が改良される。Ｅ３カセット中の個々の読みとり枠は、未変性のＥ３プロモー ターの制御下に置かれるか、または本明細書に開示されたもののように異種プロ モーターの制御下に置かれてもよい。本発明のある実施態様においてｇｐ１９Ｋ タンパク質をコードするＥ３読みとり枠は、ＭＨＣクラスＩ発現をダウンレギュ レーションするのに充分なタンパク質が入手できるようにＥ３カセットの充分な 発現を引き起こすプロモーターの制御下に置かれる。例えばＣＭＶプロモーター は別々に使用されてよい。本発明での使用に適した強いプロモーターの他の例は 、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）である。 転写単位（特に導入遺伝子）によりコードされる「遺伝子産物」は、転写単位 の転写の結果として産生される分子を意味する。遺伝子産物は、遺伝子から転写 されるＲＮＡ分子、ならびに導入遺伝子から転写されるＲＮＡによりコードされ るタンパク質を含む。ＲＮＡとタンパク質遺伝子産物は、合成後に修飾されても されなくてもよい。「野生型」遺伝子産物またはタンパク質は、その生物活性が 正常な個人に存在する天然の遺伝子産物と区別できない遺伝子産物によりコード される。 導入遺伝子発現系の成分（すなわち、転写単位；Ｅ３カセット；Ｅ４カセット ）は、１つまたはそれ以上のプラスミド、アデノウイルスベクター、またはこれ らの組合せ中で細胞に供給される。例えば好適な実施態様において転写単位は、 ＣＭＶプロモーターがそこからの効率的な転写を提供するように導入遺伝子の５ ’（上流）に位置するアデノウイルスベクター中で提供される。導入遺伝子発現 系のアデノウイルスＥ３カセットは、アデノウイルスベクター上の転写単位に対 してｃｉｓで提供される。Ｅ４カセットは好ましくは、転写単位とＥ３カセット に対してｃｉｓで提供される。この実施態様は、単一の組換えアデノウイルスが 細胞に導入遺伝子発現系を供給できるという点で有利である。 導入遺伝子発現系の成分はまた、ハイブリッドプラスミド／アデノウイルスデ リバリーシステムを使用して細胞に供給することができ、ここで成分の一部はプ ラスミドにより供給され、他の成分はアデノウイルスベクター中で供給される。 あるいはすべての成分をプラスミド中でまたはすべてをアデノウイルスベクター 中で供給することができる。供給は異なる時間でもよいが、多くの場合、細胞中 の最適な導入遺伝子発現を提供しかつ導入遺伝子発現系を含む細胞に対する細胞 性免疫応答の影響を小さくするために、同時に供給される。例えばそのようなハ イブリッドデリバリーシステムは、プラスミド上に転写単位を含有し、アデノウ イルスベクター中に導入遺伝子発現系の他の成分を含有してもよい。そのような 実施態様において、所望の細胞にプラスミドと組換えアデノウイルスベクターの 両方を供給するために、両親媒性または他の陽イオン性分子ベースのデリバリー システムを利用することができる。別の実施態様において、まずアデノウイルス ベクターを細胞に導入した後、細胞にプラスミドを供給するために陽イオン性分 子ベースの供給が使用できる。本発明の好適な実施態様において、導入遺伝子発 現系成分の化学量論を制御するために、同じ輸送経路（例えば、陽イオン分子ベ ースの供給）により、プラスミドとアデノウイルスベクターの両方が同時供給さ れる。 本発明のアデノウイルスベクターは、標準的組換えＤＮＡ技術により作成する ことができる。一般にベクターは、適当なアデノウイルスゲノム断片中に挿入さ れた所望の転写単位を含むプラスミドを作成することにより作成される。次にプ ラスミドは、目的のアデノウイルスベクターから得られる線状化したウイルスゲ ノムで同時トランスフェクションされ、ゲノム断片とアデノウイルスベクターと の相同的組換えを促進する条件下で受容体中に導入される。好ましくは転写単位 は、アデノウイルスＥ１欠失の部位に作成される。従って転写単位は、あらかじ め決められた部位でアデノウイルスゲノムに挿入され、組換えアデノウイルスベ クターが作成される。組換えアデノウイルスベクターはさらに、所望のＥ３およ び／またはＥ４カセットを含む追加のベクターで組換えされて、アデノウイルス ベクターを生成する。標準的ウイルスプラーク測定法でプラークの形成により証 明されるように、組換えアデノウイルスベクターはアデノウイルス粒子中にキャ プシド化される。複製欠陥アデノウイルスストックの調製は、ベクターから削除 されたウイルス遺伝子を保管する細胞株を使用して達成される。（例えば、欠失 したアデノウイルスＥ１ゲノム配列を含有する２９３細胞またはＡ５４９細胞） 。適当な相補性細胞株中でプラークを増幅した後、凍結−融解によりウイルスを 回収し、次に塩化セシウム遠心分離を使用して精製することができる。あるいは 、 クロマトグラフィー法を使用してウイルス精製を行うことができる。そのような 技術の例は、例えばＰＣＴ出願ＷＯ９６／３０５３４中、およびアーメンターノ ・ディー（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ Ｄ．）ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ ｐｙ ６：１３４３（１９９５））（各文献は参照することにより本明細書の一 部とする）に記載されている。 複製欠陥アデノウイルスベクターストックの力価は、相補性細胞株（例えば、 ２９３細胞）中のプラーク形成により決定することができる。例えばアデノウイ ルスヘキソンタンパク質に対する抗体を使用する終点希釈を使用して、ウイルス 産生を定量することができる（アーメンターノ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ）ら、Ｈｕ ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３４３−１３５３（１９９５））。 線状化したウイルスゲノムに転写単位を供給するための適当なプラスミドには ｐＣＭＶβのようなベクター（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリホルニア州）があり、ここで導入遺伝子はＣＭＶプ ロモーターの制御下に置くことができる。Ｅ３および／またはＥ４カセットを供 給するための種々のアデノウイルスベクターが開示されている（例えば、フアン グ・エム・エム（Ｈｕａｎｇ，Ｍ−Ｍ）とピー・ヒアリング（Ｐ．Ｈｅａｒｉｎ ｇ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２６０５（１９８９））。あるいはさらに、プラ スミドは導入遺伝子発現系の他の成分を供給するのに使用することができる。 導入遺伝子発現系の成分を含有するプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ技術を 使用して作製することができる。大規模生産と精製は、当業者に公知の技術を使 用して行うことができる（例えば、「分子生物学の現代のプロトコール」（Ｃｕ ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社 （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州、１ ９９５；サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「モレキュラークローニング： 実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）を参照されたい）。 導入遺伝子発現系の成分は好ましくは、細胞への供給のためにプラスミド、ア デノウイルスベクター、組換えアデノウイルスおよびこれらの組合せ上に含有さ れる。しかし、電気穿孔法、バイオリスティック輸送（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔ ｒａｎｓｆｅｒ）、微量注入法、カルシウム塩、陽イオン性脂質もしくはポリブ レンが介在する供給、ならびに他の既知のＤＮＡ輸送法を使用して、このような 成分を裸のＤＮＡの形で細胞へ供給することは、本発明の範囲内にある。 マーカーまたはレポーター遺伝子は、導入遺伝子を組合せて、形質導入細胞中 のその持続性を検出するために使用される。マーカーを含むプラスミドの例は、 ＣＭＶプロモーターの制御下にあるクロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含むｐＣＦ １−ＣＡＴのようなプラスミド、および 例えばβ−ガラクトシダーゼをコードする他のプラスミドを含む。 特に好適な実施態様において、アデノウイルスベクターは、陽イオン性両親媒 性化合物を使用するような、介在供給を使用して供給される。さらに詳しくは陽 イオン性両親媒性化合物は、極性または非極性ドメインの両方を包含し、その結 果分子は、非極性ドメインを有する脂質膜を介しての侵入を同時に促進すること ができ、一方陽イオン性極性ドメインは、標的細胞の膜を介して輸送される生理 学的に有用な分子（典型的には核酸またはタンパク質）に結合する。 この実施態様に従う陽イオン性両親媒性化合物は、アデノウイルスベクターと 複合体を形成するために使用され、特に限定されないが、ＤＯＴＭＡ（フェルグ ナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８４：７４１３−７４１７（１９８７））（Ｎ−［１−（２，３−ジオレトルオ キシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）；ＤＯＧＳ （ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）（ベアー（Ｂｅｈｒ）ら、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：６９８２−５９８６（１９８ ９））；ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒ ドロキシエチルアンモニウムブロミド）（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１（１９９４））；および ＤＣ−コル（３Ｂ（Ｎ−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエ タン）−カルバモイル］コレステロール）（エスパンド（Ｅｓｐａｎｄ）らの米 国特許第５，２８３，１８５号）。 本発明のアデノウイルスベクター（ならびに、本明細書に記載の他のプラスミ ドまたはウイルス）との複合体形成かつ輸送促進に使用されるさらに好適な陽イ オン性両親媒性化合物（例えばＧＬ−６７、ＧＬ−５３、およびＧＬ−１２０） は、米国特許第５，６５０，０９６号（１９９７年７月２２日）およびＰＣＴ出 願ＷＯ９６／１８３７２号（１９９６年６月２０日出願）（これらの開示内容は 参照することにより本明細書の一部とする）に記載されている。さらに好ましく は、アデノウイルスベクターを供給するのに使用される陽イオン性両親媒性化合 物は、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）またはＧＬ−１２０ を含むアデノウイルスベクターを供給するのに使用される。 １つまたはそれ以上の陽イオン性両親媒性化合物で調製される本発明の化合物 は、細胞への導入遺伝子発現系の供給を促進するためにジレオイルホスファチジ ルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような中性コリピッド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄｓ ）を随時含有してもよい。本発明の好適な実施態様において、陽イオン性両親媒 性化合物ＧＬ−６７と中性の中性コリピッド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）ＤＯＰＥはそ れぞれ約１：２の比で組合わされ、次に細胞への供給のためにプラスミドおよび ／またはアデノウイルスと複合体を形成する。多くの例において、１００％ＧＬ −６７および追加の組成物、例えば前記ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１８３７２号およ び米国特許第５，６５０，０９６号に記載の追加の組成物を使用することが好ま しい。 導入遺伝子を含む転写単位が１つのプラスミドに含有され、アデノウイルスＥ ３カセットとＥ４カセットが単一のアデノウイルスベクター中に含有される本発 明の実施態様において、プラスミドとウイルスが、例えば細胞に供給するために 陽イオン性両親媒性化合物と同時に複合体を形成してもよい。例えばプラスミド はＧＬ−６７：ＤＯＰＥ（１：２比）で組合わされ、アデノウイルスベクターは １００％ＧＬ−６７と組合わされ、等量を一緒にして、導入遺伝子発現系のすべ ての成分を含むプラスミド／ウイルス複合体を形成させる。 特にＧＬ−６７：ＤＯＰＥとプラスミドは、それぞれ約０．６mM〜３．６mM比 で組合わされる。さらにＧＬ−６７はアデノウイルスベクターと、１０⁸〜１０^{1 0} i.u.のＡｄ粒子当たり約５〜１０×１０⁵分子で組合わされる。 一般に導入遺伝子持続性は、いくつかの試験フォーマットを使用してインビボ またはインビトロで評価することができる。例えば細胞株はプラスミド、アデノ ウイルスベクターでトランスフェクションするか、または本発明の組換えアデノ ウイルスで感染することができる。これらの測定法は一般に、含有された導入遺 伝子の発現のレベルと持続期間を測定する。このような測定法の例は、ディー・ アーメンターノ（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０ ８（１９９７）に報告されている。 さらに導入遺伝子発現の持続性はまた、適当なモデルを使用して測定してもよ い。動物モデルは特に、可能性のある宿主免疫応答のバックグランドに対して導 入遺伝子持続性の評価に関係する。このようなモデルは、供給の容易さ、導入遺 伝子の本体、関連する分子測定法、および臨床的状態の評価のようなパラメータ に関して選択してもよい。導入遺伝子が生物活性のあるタンパク質をコードする 場合、疾患状態の代表である動物モデル（ここでタンパク質は欠如しているか、 または生物活性が大幅に低下している）を、臨床的改良を評価するために使用し てもよい。 導入遺伝子発現系が測定される関連する動物には、マウス、ラットおよびサル がある。導入遺伝子発現系が試験される適当なマウス株には、Ｃ５７Ｂｌ／６お よびＢａｌｂ／ｃ（野生型とヌード）（タコニック・ファームズ（Ｔａｃｏｎｉ ｃ Ｆａｒｍｓ）、ジャーマンタウン（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ）、ニューヨーク 州）がある。 宿主の免疫応答をベクター投与と関係付けることが好ましい場合、免疫能のあ る動物と免疫不全動物での試験が比較される。この例においては、ベクター投与 に対する有害な応答（特に、宿主免疫系が有するもの）を評価することができる 。免疫不全動物（例えばヌードマウス）の使用は、ベクターの性能と、獲得した 宿主応答に依存しない導入遺伝子発現を性状解析し、導入遺伝子持続性の他の決 定基を同定するために使用することができる。 導入遺伝子は、生物学的に有用なタンパク質をコードするか、および／または 導入遺伝子発現系を試験するために使用されるマーカータンパク質をコードして もよい。導入遺伝子発現の持続性の測定に使用するのに適した測定法には、導入 遺伝子ｍＲＩＮＡの測定（例えば、ノーザンブロット、Ｓ１解析、逆転写−ポリ メラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ））、または検出可能に標識したヌクレオ チド前駆体の取り込み（例えば、放射能標識または蛍光標識したヌクレオチド前 駆体）、または、例えば非許容性細胞株中の基本的なウイルス遺伝子産物をコー ドする導入遺伝子についてのプラーク測定法のような生物測定法を含む。さらに 、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の存在は、ウェ スタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、 または当業者に公知の他の方法により検出してもよい。 試験システムの１つの例においてアデノウイルスベクターはＣＦＴＲ導入遺伝 子を含有し、試験動物の呼吸器官特に肺でのＣＦＴＲ発現の持続性を評価するた めに、試験動物の呼吸系上皮に投与される。目的の特定の試験動物には、Ｃ５７ Ｂ１／６またはＢａｌｂ／ｃマウス、コトンラット、またはアカゲザルがある。 発現の持続性を測定するために使用される分子マーカーには、例えばノーザンブ ロット、Ｓ１解析またはＲＴ−ＰＣＲならびに他の前記したマーカーによるＣＦ ＴＲ ｍＲＮＡの測定がある。あるいは試験動物中のＣＦＴＲタンパク質の存在 は、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学，または当業者に公知の他の 技術により検出される。また機能性ＣＦＴＲの存在は、細胞中の機能性塩素イオ ンチャネルの存在により追跡することができる。 陽イオン性両親媒性化合物−プラスミド複合体または陽イオン性両親媒性化合 物−ウイルス複合体は、細胞、組織および哺乳動物への導入遺伝子の投与のため の組成物に調製してもよい。 典型的には組成物は、前記したように導入遺伝子発現系を、組成物を形成する のに充分な１つまたはそれ以上の適当な陽イオン性両親媒性化合物と組合せるこ とにより調製される。 組成物は、許容される担体（任意の関連する生理的溶液を含む）を含有しても よい。本明細書において「許容される担体」とは、任意の許容される溶液、分散 媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張物質および吸収遅延物質な どを含む。任意の従来の媒体、担体または物質が活性成分と適合性がない場合を 除いて、組成物中でのその使用が企図される。 導入遺伝子発現系を含有する組成物のインビボ投与のために、鼻内、静脈内、 筋肉内、皮下、皮内、経口および他の非経口投与経路を含む従来の許容される経 路が企図される。 本発明はさらに、インビボまたはエクスビボ応用で本発明の組成物を使用する ための方法に関し、ここで１つまたはそれ以上の導入遺伝子を細胞内に供給する ことが好ましい。インビボ応用は、組成物に調製した導入遺伝子発現系が個々の 細胞へ直接投与される。エクスビボ応用は、インビトロで維持される自己細胞に 直接導入遺伝子発現系を輸送し、次に形質導入した細胞を患者に投与する。 生物学的または表現型作用を作り出すための持続性発現を達成するために投与 される導入遺伝子発現系の投与量は、治療される状態、個体の年齢、体重および 臨床的状態、および補正または緩和を必要とする特定の分子的欠陥を含む種々の パラメータについて決定される。投与量は好ましくは、分子的測定法または臨床 的マーカーにより測定した時、投与が生物学的または表現型的に有効な結果を引 き起こすように選択される。例えば、目的の導入遺伝子産物の発現レベルの測定 、ならびに個体の細胞に投与されるＣＦＴＲ導入遺伝子を含む導入遺伝子発現系 の経時的なこのような発現の持続性の測定は、産生されたＣＦＴＲタンパク質を ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、または当業者に公知の他の技術 により検出測定して行われる。ＣＦＴＲ導入遺伝子の供給の治療的利点を評価す るために使用できる関連する臨床的研究には、肺機能のＰＦＴ評価および肺の放 射能による評価がある。ＣＦＴＲをコードする導入遺伝子の供給は、導入遺伝子 を含むベクターが投与される嚢胞性繊維症患者の細胞中の機能性塩素チャネルの 存在を検出することにより証明される（ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｌ ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５０４−１５１１（１９９６））。他の疾患状態 での導入遺伝子発現の持続性は、その症状に最も関係のある特定の臨床的パラメ ータを使用して同様に測定することができる。 ＣＦＴＲ遺伝子を含むアデノウイルスベクターを投与するための投与量範囲の 例は報告されている（例えば、ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）ら（前述）を参照され たい）。従って導入遺伝子発現系のすべての成分を含有する本発明のアデノウイ ルスベクターの投与量は、一般に報告されている範囲内であろう。 投与の簡便性と投与量の均一性のために単位投与型の非経口投与用途の組成物 を調製することが特に好ましい。本明細書において単位投与型とは、投与量が提 供される被験体の単位投与量として適した物理的に分離した単位を意味し、各単 位は、必要な担体とともに所望の生物学的または表現型作用を示すように計算さ れたあらかじめ決められた量の活性成分を含有する。本発明の新規の単位投与型 の規格は、導入遺伝子発現系のユニークな特性と混合技術に本質的な限界により 規定されかつ直接依存する。主要な活性成分（導入遺伝子発現系）は、便利で有 効な投与のために有効量で、前述したように単位投与型で薬剤学的に許容される 担体とともに混合される。 例えば形質転換細胞は死滅するかまたは目的の因子を発現する能力を失うため 、本発明の導入遺伝子発現系の投与から最大の生物学的または表現型結果を得る には、繰り返し投与が必要である。 本発明はまた、哺乳動物で導入遺伝子を発現させる方法、および細胞性免疫応 答から導入遺伝子を発現する細胞を防御する方法を含み、本方法は導入遺伝子発 現系を１つまたはそれ以上の陽イオン性両親媒性化合物と組合せて複合体を形成 させ、複合体を形成した細胞の治療上有効量を投与することを含んでなる。 本発明の実施は特に明記しない場合は、タンパク質化学、ウイルス学、微生物 学、組換えＤＮＡ技術、および薬学の常法を使用し、これらは当該分野の技術内 にある。このような技術は文献に記載されている。例えば、「分子生物学の現代 のプロトコール」（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、ジョン・ワイ リー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ． ）、ニューヨーク州（１９９５）、および「レミントンの薬剤科学」（Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７ 版、マックパブリシングカンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍ ｐａｎｙ）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルバニア州（１９８５）で詳 細に説明されている。 本発明はさらに以下の具体例により例示されるが、これらは決して本発明の範 囲を限定するものではない。 アデノウイルスゲノムはさらに図１で例示され、全配列が例えば、ロバーツ・ アール・ジェイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．）ら（１９８６）、ダブリュー・ド エルフラー（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ）編、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｍｏ ｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：（アデノウイルスＤＮＡ）、Ａｄ２についてはｐｐ １−５１（この開示内容は参照することにより本明細書の一部とする）に公表さ れている。 以下の例は、アデノウイルスＥ１領域中に挿入された所望の導入遺伝子を含む 本発明のＡｄ２ベクターの調製と使用を概説する。Ａｄ２ベクターは、Ｅ３領域 の欠失および／またはＥ４領域の欠失をさらに含む。導入遺伝子挿入部位として Ｅ１領域を使用する技術は公知である（例えば、リッチ・ディー・ピー（Ｒｉｃ ｈ，Ｄ．Ｐ．）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４６１（１９９３）およ びそこに記載の文献を参照されたい）。すべてのウイルス（完全なＥ４欠失を有 するものを除く）を２９３細胞中で増殖させ、精製し、既に記載されているよう に（アーメンターノ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ． ６：１５７５−１５８６（１９９５））ＦＩＴＣ結合抗ヘキソン抗体（ケミコン （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を使用して終点希釈により力価測定した。２９３細胞と ＶＫ２−２０細胞を、マックマスター大学（ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ）（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、オンタリオ、カナダ）のフランク ・グラハム（Ｆｒａｎｋ Ｇｒａｈａｍ）博士から得た。２９３細胞株は、アメ リカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル（Rockville）、メリーラン ド州（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）からも入手できる。Ａｄ２ Ｅ４欠失ベクタ ーは、ＶＫ２−２０細胞株中で増殖させた。 Ｅ４欠失ベクターの増殖を含む本発明の実施に有用な追加のパッケージング細 胞株は、ＡＴＣＣ（受け入れ番号ＣＲＬ１２１８２およびＣＲＬ１２１８３）に 寄託されている。 一般にＡｄ２ベクターは、種々の方法で作成することができる。例えば本明細 書に記載のＡｄ２ベクターを作成するために、標準的組換えＤＮＡ技術および相 同的組換えを使用することができる。例えばＥ４領域からの１つまたはそれ以上 のＥ４ＯＲＦを含むＡｄ２ベクターは、組換えＤＮＡ法により作成することがで き、ここで所望のＥ４ＯＲＦ（または２つ以上のＥ４ＯＲＦ）は、所望のＥ４Ｏ ＲＦの両側に位置するＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ増 幅される。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ産物は次に、適当な制限酵素部位で修飾され 、次にＥ４領域が欠如した制限酵素切断したＡｄ２ベクター中に連結される。以 下の例１は、導入遺伝子と種々のＥ４修飾を含むＥ１−、Ｅ３＋Ａｄ２ベクター の作製体のアプローチを例示する。アーメンターノ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ）ら（ １９９５）（前述）も参照されたい。関連アプローチを使用して、Ｅ３修飾を有 するＥ１−Ａｄ２ベクターを作成することができる。関連するＰＣＲプロトコー ルの考察については、イネス（Ｉｎｎｅｓ）ら（ＰＣＲプロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ Ｉｎｃ．）、ハーコートストックトンプレス（Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｓｔｏｃ ｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。 修飾Ｅ４ＯＲＦを含む追加のＡｄ２ベクターが報告されている。例えばフアン グ・エム・エム（Ｈｕａｎｇ，Ｍ−Ｍ）とヒアリング・ピー（Ｈｅａｒｉｎｇ， Ｐ）（前述）は、特定のＥ４ＯＲＦ欠失と挿入を含むＡｄ２ベクターの作成方法 を開示している。特にこの文献は、Ｅ４−領域へのＥ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４ 、またはＥ４ＯＲＦ６挿入を有するＡｄ２ベクターの作成方法を開示している。 例えば以下の例１は、Ａｄ２ベクター中にＥ４ＯＲＦ欠失を取り込む関連技術の 使用を開示している。 以下の例３と４は、Ｅ４ＯＲＦ４とＥ４ＯＲＦ６／７がＥ３領域と一緒に存在 する時、インビトロでアデノウイルス特異的ＣＴＬに対して防御を与えることを 証明する。他のＯＲＦが関連活性を有するかどうかを決定するために、これらの ＯＲＦを有するＡｄ２ベクターは容易に作成でき、アデノウイルス特異的ＣＴＬ 測定法で試験して抗細胞溶解活性を評価することができる。 インビトロでアデノウイルスＣＴＬに対して細胞を防御することができるＡｄ ２ベクターを次に、インビボで試験して宿主免疫応答の非存在下または存在下で 導入遺伝子発現の持続性を評価する。例えば本明細書に記載のＡｄ２ベクターは 、 標準的方法（例えば、カプラン・ジェイ・エム（Ｋａｐｌａｎ，ＪＭ）ら、Ｇｅ ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９６）３，１１７（前述）；ディー・アーメンター ノ（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏ）ら（１９９５）（前述）；カプラン・ジェイ・エ ム（Ｋａｐｌａｎ，ＪＭ）ら（１９９７）（前述））に従って被験げっ歯類また は霊長類（例えば、野生型またはヌードマウス；コトンラット；サル）の呼吸系 上皮に投与することができる。次に感染した被験動物を、逆ＰＣＲによるおよび ／またはβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子の発現後の感染動物の 肺中の導入遺伝子発現レベルの測定を含む多くのアプローチにより導入遺伝子発 現の持続性について追跡することができる。本発明のベクターを使用して導入遺 伝子発現の実質的な増強が達成されると考えられる。本発明の実施に従う性能レ ベルは、少なくとも約２〜３週間、そして好ましくは約３〜４ヶ月まで特異的タ ンパク質産生について評価される。適当な測定法の例は以下の通りである。例え ば、下記例５で説明するげっ歯類の肺測定法は、性能を評価するための１つの方 法である。参考例１ 本発明の以下のベクター、プラスミド、カセット、または他の成分の作製は、 アーメンターノ・ディー（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．）ら（１９９５）（前述） ；カプラン・ジェイ・エム（Ｋａｐｌａｎ，ＪＭ）ら（１９９７）（前述）；カ プラン・ジェイ・エム（Ｋａｐｌａｎ，ＪＭ）ら（１９９６）（前述）；アーメ ンターノ・ディー（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．）ら（１９９７）（前述）；およ びＰＣＴ出願ＷＯ９６／３０５３５号の開示内容（これらの開示内容は参照する ことにより本明細書の一部とする）に従う。 種々のＡｄ２／β−ｇａｌ作製体を含むアデノウイルスベクターは、図２Ａと ２Ｂに例示する。一般にベクターは以下のように作成した。 ＣＭＶβ−ｇａｌ発現カセットは、ヌクレオチド３５７〜３３２８が欠失した Ａｄ２ヌクレオチド１〜１０，６８０を含有するｐＢＲ３２２ベースのプラスミ ド中で作製した。欠失した配列は、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ ｐＲＣ／ＣＭＶから得られる、インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））、核 局在化シグナルを有するβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子、 およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２５３３〜２７２９）で 置換した。ｌａｃＺ遺伝子は、ｐＣＭＶβ（クロンテク（Clontech）、パロアル ト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリホルニア州）からのＮｏｔＩ断片として得られ た。Ａｄ２／β−ｇａｌベクターシリーズ中のＣＭＶプロモーター断片は、−５ ２３〜−１４のＣＭＶプロモーター配列を含有する。これは、インビトロゲン（ ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＭＶβ中にある断片（６１９塩基対ＴｈａＩ 断片）より小さい。 Ａｄ２／β−ｇａｌ−２ベクターは一般に既に記載されているように（アーメ ンターノ・ディー（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．）ら（１９９５）、前述）作 成した。簡単に説明するとＣＭＶβ−ｇａｌ発現カセットを制限消化し、線状化 し脱リン酸化したＡｄ２Ｅ４ＯＲＦ６に連結した。次に、連結したベクターを２ ９３細胞にトランスフェクションしてウイルスのストックを作成した。 Ａｄ２Ｅ４ＯＲＦ６ベクターの作製は既に記載されている（アーメンターノ・ ディー（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．）ら（１９９５）（前述）と米国特許第 ５，６７０，４８８号を参照されたい）。 簡単に説明すると、ヌクレオチド３２，８１５と３５，５７７の間のＡｄ２配 列を削除し、Ｅ４のすべての読みとり枠を除去したが、Ｅ４プロモーター、Ｅ４ キャップサイト、およびＥ４ ｍＲＮＡの最初の３２〜３７ヌクレオチドならび にファイバーｍＲＮＡのポリアデニル化シグナルと切断部位は残した。Ｅ４ＯＲ Ｆ６コード領域（ヌクレオチド３３，１９５〜３４，０７７）を包含するＤＮＡ 断片（ヌクレオチド３３，１７８〜３４，０８２）がＰＣＲにより得られ、削除 した配列を置換するのに使用した。ＰＣＲプライマー中の追加の配列は、ＯＲＦ ６の５’末端と３’末端に制限部位（それぞれＣｌａＩとＢａｍＨＩ）を含有し 、ｍＲＮＡプロセシングのための合成ポリアデニル化配列を含有した。Ａｄ２Ｏ ＲＦ６の作製は、標準的クローニングプロトコールを使用して以下のように行な った（例えば、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（前述）とサムブルーク（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９を参照されたい）。ＯＲＦ６ ＰＣＲ断片と、逆方 向末端反復配列（ＩＴＲ）とＥ４プロモーター領域（ヌクレオチド３５，５９７ 〜３５，９３７）を含有するＤＮＡ断片を、 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｓｋ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 中にクローン化してｐＯＲＦ６を作成した。ＩＴＲとＯＲＦ６を含有するｐＯＲ Ｆ６からの断片を、Ａｄ２ヌクレオチド２８，５６２〜３２，８１５を含有する プラスミドｐＡＤΔＥ４中の配列に連結して、ｐＡＤＯＲＦ６を作成した。ｐＡ ＤＯＲＦ６をＰａｃＩで消化（Ａｄ２ヌクレオチド２８，６１２）し、ＰａｃＩ とＡｓｅＩで消化したＡｄ２ ＤＮＡに連結した。２９３細胞を結合混合物でト ランスフェクションし、Ｅ４領域でのみ修飾された得られたウイルスを適当な制 限酵素で解析してゲノム構造を確認した。 完全なＥ４欠失（ΔＥ４）の作製は既に記載されている（アーメンターノ・デ ィー（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ Ｄ．）ら、（１９９７）前述）。 簡単に説明するとｐＡｄＯＲＦ６ベクターを、ＩＴＲとＥ４ＯＲＦ６を除去す るＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断した。このセグメントを、ＳＶ４０ポリアデニル 化シグナルを含有するＢＡＭＨＩ−ＢｇｌＩ断片と、Ａｄヌクレオチド３５６４ ２〜３５９３７を含有するＰＣＲで作成したＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（Ｅ４エ ンハンサー領域とＩＴＲ）で置換した。 Ａｄ２／β−ｇａｌ−５ベクターは、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３０５３４号に記 載の欠失したＥ４領域を含む。Ａｄ２／β−ｇａｌ−４ベクターは、Ｅ４領域が 欠失していない（Ｅ４＋）ことを除いてＡｄ２／β−ｇａｌ−２と同一である。例１：Ａｄ２／β−ｇａｌ作製体の作製 図２Ｂに示す追加のＡｄ２／β−ｇａｌ作製体は以下のように作成した。 Ａｄ２／β−ｇａｌ−２の大きいＰａｃＩ断片（ウイルスの左の末端に対応） をｄｌ３６６＋ＯＲＦ４のＰｍｅＩ断片（右の末端に対応）で組換えて、ＶＫ２ −２０細胞中でＡｄ２／β−ｇａｌ−７を作成した。組換えについてＡｄ２／β −ｇａｌ−５を使用して２９３細胞中でＡｄ２／β−ｇａｌ−８〜−１３を同様 に作成した。ＯＲＦ６と６／７のみを含有するＥ４ｄｌＯＲＦ１−４で組換えて Ａｄ２／β−ｇａｌ−８を作成した。各ＯＲＦ、Ａｄ２／β−ｇａｌ−９（ＯＲ Ｆ１）、Ａｄ２／β−ｇａｌ−１０（ＯＲＦ２）、Ａｄ２／β−ｇａｌ−１１（ ＯＲＦ３）、Ａｄ２／β−ｇａｌ−１２（ＯＲＦ４）、およびＡｄ２／β−ｇａ ｌ−１３（ＯＲＦ６／７）のノックアウトを有するウイルスは、それぞれ３５ １、３５２、Ｅ４ＯＲＦ３中のＥ４、ｄ１３５８、およびｄ１３５６から得られ た。 Ａｄ２／β−ｇａｌ−４ Ｅ３Δ２．９は、完全なＥ４領域を含む。Ａｄ２／ β−ｇａｌ−２ Ｅ３Δ１．６ベクターの作製は、同時係属米国出願第０８／８ ３９，５５３号に記載されている方法（１９９７年４月１４日に出願された；こ れは参照することにより本明細書の一部とする）により調製した。 簡単に説明するとアデノウイルスＥ３領域は、１２．５Ｋ、６．７Ｋ、ｇｐ１ ９Ｋ、１１．６Ｋ、１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋ遺伝子産物をコー ドするＯＲＦを含む（例えば、トレフソン（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｖｉ ｒｏｌ．（１９９６）７０：２２９６；トレフソン（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ）ら、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）２２０：１５２、およびそこに引用されている文 献を参照されたい）。少なくともｇｐ１９Ｋ ＯＲＦを含むＡｄ２ベクターは、 いくつかの技術に従って作成することができる。例えば従来の組換えＤＮＡ技術 （例えば、制限消化と連結）を使用して、ｐＡｄ／Ｅ４＋Ｅ３Δ１．６プラスミ ドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）） 中で作成した。このプラスミドは、Ｅ３の１２．５Ｋ、６．７Ｋ、およびｇｐ１ ９Ｋ ＯＲＦを含有し、１１．６Ｋ、１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋ ＯＲＦが欠如している。プラスミドｐＡｄ／Ｅ４＋Ｅ３Δ１．６は、ヌクレオ チド２７１２３のＳｐｅＩ部位からのＡｄ２の右側の末端から、右のＩＴＲまで を含有する。すなわちこのプラスミドのＥ３領域は、Ｅ３のヌクレオチド２９２ ９２〜３０８４０までの１５４９塩基対の欠失を有する。関連方法を使用して、 少なくともｇｐ１９Ｋ領域を含む他のＥ３欠失を作成することができる。 プラスミドとＡｄ２／ＣＦＴＲ−５の間の相同的組換によりＡｄ２／ＣＭＶ− ＣＦＴＲ／Ｅ３Δ１．６ベクターを作成した。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−５の作製はＰ ＣＴ出願ＷＯ９６／３０５３４号に記載されている（この開示内容は参照するこ とにより本明細書の一部とする）。参考例２ Ａｄ２／ＣＦＴＲ２ベクター（米国特許第５，６７０，４８８号を参照された い）は、ＰＧＫプロモーター、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡおよびＢＧＨポリアデニル化 シグナルを含有するＣＦＴＲ発現カセットでＥ１領域（ヌクレオチド３５７〜３ ，３２８）のほとんどが置換されている組換えアデノウイルス２型（Ａｄ２）ベ クターである（図３を参照されたい）。ＣＦＴＲのｃＤＮＡは、公表されている 配列のヌクレオチド１２３〜４６２２である。Ａｄ２／ＣＦＴＲ２の作製は米国 特許第５，６７０，４８８号に記載されており、その開示内容は参照することに より本明細書の一部とする。Ｅ３領域は保存されており、一方Ｅ４領域は、すべ ての読みとり枠（ヌクレオチド３２，８１５と３５，５７７の間）の除去とＥ４ 読みとり枠６（ＯＲＦ６；ヌクレオチド３３，１７８〜３４，０８２）のみによ る置換により修飾されている（例えば、アーメンターノ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ） ら、１９９５）。 Ａｄ２／ＣＦＴＲ−５ベクターはＰＣＴ出願ＷＯ９６／３０５３４号に記載さ れている（これは参照することにより本明細書の一部とする）。簡単に説明する とＡｄ２／ＣＦＴＲ−５ベクターは、ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリＡシグナ ルの制御下で導入遺伝子としてヒトＣＦＴＲ ｃＤＮＡを含有し、これはＥ１領 域の欠失の部位に挿入されている。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−５のＥ２領域とＥ３領域 は野生型アデノウイルス血清型２の配列を含有し、Ｅ４ＯＲＦ６以外のすべての Ｅ４配列は欠失している。Ａｄ２／ＣＦＴＲ−５ベクターを使用して、例えば２ ９３細胞中で相同的組換えにより種々のＥ１欠失Ａｄ２ベクターを作成すること ができる。例えば例２に記載のようにＡｄ２／ＣＭＶ−ＣＦＴＲ／Ｅ３Δ１．６ ベクターはＥ２領域とＥ４領域を含有し、ｐＡｄ／Ｅ４＋／Ｅ３Δ１．６とＡｄ ２／ＣＦＴＲ−５の間の相同的組換えによりＥ３中に１５４９塩基対の欠失を作 成することができる。例２：Ａｄ２／ＣＦＴＲ作製体の作製 追加のＡｄ２／ＣＦＴＲ作製体は以下のように作成した。 図１Ｂ（Ａ）は、アデノウイルス２型のＥ４領域中の読みとり枠の構成を示す 。図１Ｂ（Ｂ）と（Ｃ）は、それぞれＥ４ＯＲＦ３またはＥ４ＯＲＦ３とＥ４Ｏ ＲＦ４を含有するウイルスの構造を示す。Ｅ４ＯＲＦ３およびＥ４ＯＲＦ３とＥ ４ＯＲＦ４発現カセットを含有するプラスミドは、 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｓｋ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） ）のＳｐｅＩとＨｉｎｄIII部位中にクローン化した２７１２３〜３５９３７ま でのＡｄ２配列を含有するｐＡｄＥ４から得られた。Ｅ４ＯＲＦ３含有プラスミ ドを作製するために、ｐＡｄＥ４中のＡｖｒＨ部位（ヌクレオチド３５４７０） とＢｃｌＩ部位（ヌクレオチド３２８９１）の間の配列を欠失させ、ＰＣＲで作 成したＡｖｒII−ＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド３４８０４〜３４３５６）で置 換した。この断片はＥ４ＯＲＦ３のコード配列と３’スプライス部位を含有した 。 ＰＣＲで作成したＡｖｒＨ−ＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド３４８０４〜３３ ９９８）で欠失Ｅ４配列を置換することにより、Ｅ４ＯＲＦ３含有およびＥ４Ｏ ＲＦ４含有プラスミドを同様に作製した。この断片はＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ ４のコード配列、ならびにＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４発現のための３’スプラ イス部位を含有した。得られるプラスミドｐＡｄＥ４ＯＲＦ３とｐＡｄＥ４ＯＲ Ｆ３＋４は次に、例えばＰａｃＩで切断したＡｄＣＦＴＲ−５で組換えするため にＥａｇＩで線状化し、それぞれＥ４ＯＲＦ３またはＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ ４を含有するようにＥ４で修飾されているウイルスを作成した。公表されたＰＣ Ｔ出願ＷＯ９６／３０５３４号は、Ａｄ２ＣＦＴＲ−５の作製を記載しており、 これは参照することにより本明細書の一部とする。例３：Ｅ３＋Ａｄ２／β−ガラクトシダーゼ作製体はＥ４、Ｅ４ＯＲＦ４または Ｅ４ＯＲＦ６／７の存在下での溶解に対して防御する 図２Ａと２Ｂに示すＡｄ２ β−ｇａｌ作製体を、カプラン・ジェイ・エム（ Ｋａｐｌａｎ，ＪＭ）ら、（１９９７）（前述）に記載のように細胞障害性Ｔ細 胞測定法で溶解に対して防御を与える能力について試験した。 簡単に説明すると細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を評価するために、Ａ ｄで処理したマウス（３〜４匹のマウス／群）からの脾臓細胞をプールし、マイ トマイシンＣで不活性化し感染させた協同作用性繊維芽細胞を用いてインビトロ で刺激した。２ml容量でウェル当たり５×１０⁶の脾臓細胞と６×１０⁴のスティ ムレーター繊維芽細胞を含有する２４ウェルプレート中で細胞を培養した。培養 培地は、１００U/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、２mMグル タミン、５×１０^-5Ｍ ２−メルカプトエタノール、２０mMヘペス緩衝液、およ び１０％熱不活性化胎児牛血清（ハイクローンラボラトリーズ社（Ｈｙｃｌｏｎ ｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｃ．）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ州） を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）、ニューヨーク州）から 構成された。細胞溶解活性は５〜７日間培養後測定した。標的繊維芽細胞を感染 多重度（ＭＯＩ）１００のベクターで４８時間感染させ、最後の２４時間は１０ ０U/mlの組換えマウスインターフェロン−γ（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ） 、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、マサチューセッツ州）で処理して、Ｍ ＨＣクラスＩ発現とエフェクターＣＴＬへの抗原提示を増強させた。繊維芽細胞 をクロム−５１（⁵¹Ｃｒ、ニューイングランドヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ ｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）で一晩標識し（５０μ Ci/１０⁵細胞）、１００μl容量（５×１０³繊維芽細胞／ウェル）で丸底９６ウ ェルプレートのウェルに加えた。エフェクター細胞を種々のエフェクター／標的 細胞比で三重測定で１００μl容量で加えた。３７℃／５％ＣＯ₂で５時間インキ ュベート後、１００μlの無細胞上清を各ウェルから集め、パッカードマルチプ リアス（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｉａｓ）ガンマカウンター（ダウナ ーズグローブ（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ）、イリノイ州）で計測した。培地 のみで標的繊維芽細胞をインキュベートすることにより自然放出された⁵¹Ｃｒの 量を得て、蒸留水中１％トリトンＸ−１００を加えて取り込まれた⁵¹Ｃｒの総量 を求めた。溶解パーセントは以下のように算出した：溶解％−［（試料cpm）− （自然cpm）］／［（総cpm）−（自然cpm）］×１００。非特異的溶解の対照（ 例えば、ナチュラルキラー細胞または腫瘍壊死因子−α）として、感染繊維芽細 胞で刺激した未変性の脾臓細胞または単独でインキュベートしたベクターでプラ イムした脾臓細胞を平行して試験し、日常的に無視できる溶解パーセントの１０ ％またはそれ以下が得られる。同じ条件下で測定したＣＴＬ活性の測定毎の変動 は、１０〜２０％以内であった。 図４に示す結果は、Ｅ４ＯＲＦ４の存在下で溶解に対して防御を与えるＥ３と 一致する。Ｅ３はまた、野生型Ｅ４と組合せると溶解に対して防御を与えた。こ れらの結果から、Ｅ３＋ＥＦＯＲＦ６／７の組合せもまた防御を与えるようであ った。これらの結果は以後の実験で確認され、これらのあるものではＥ４ＯＲＦ ６／７が図４に示すものより良好な防御を与えた。しかし前記したように、全Ｅ ４領域を含有するＥ３＋Ｅ４＋ベクターを使用すると、ゲノムの長さのためにベ クター複製が困難であった。例４：Ｅ３＋Ａｄ２／ＣＦＴＲ作製体はＥ４の存在下で溶解に対して防御を与え る 図３に示すＥ３＋Ａｄ２／ＣＦＴＲを、上記例３に記載のＣＴＬ実験で試験し た。図５は、データが野生型Ｅ４の存在下で溶解に対して防御を与えるＥ３と一 致することを示す。例５：マウス肺とラット肝細胞中のβ−ガラクトシダーゼ成長ホルモンの持続性 以下は、導入遺伝子発現の持続性を評価するために使用することができる測定 法の例である。 例えば宿主免疫応答の非存在下で導入遺伝子発現の持続性を評価するために、 β−ガラクトシダーゼを発現する一連のアデノウイルスベクター作製体を使用し てインビトロでラット肝細胞を感染させたか、またはヌードＢａｌｂ／ｃマウス の鼻内に投与した。 Ｂａｌｂ／ｃ親マウスおよびヌードマウスは、タコニック・ファームズ（Ｔａ ｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）（ジャーマンタウン（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ）、ニュ ーヨーク州）から購入した。７〜１６週令の主に雌の動物をインビボ試験で使用 した。 ラット肝細胞を、ＭＯＩ約１０のβ−ｇａｌシリーズからのベクター（図２Ａ と２Ｂを参照されたい）で感染させた。β−ガラクトシダーゼ発現は、感染後３ 日目および１４日目にＸ−ｇａｌ染色により視覚化した。β−ガラクトシダーゼ ベクター（野生型Ｅ４欠失またはＥ４ＯＲＦ１．２．４または６／７についての ノックアウトを含む）は、β−ガラクトシダーゼの持続性発現を示した。これに 対してＥ４ＯＲＦ３ノックアウトで感染させた細胞中では発現は失われた。これ らの知見は、Ｅ４領域からのＯＲＦ３はＣＭＶプロモーターの制御下で導入遺伝 子発現の持続性を増強することを示している。 このインビトロ知見は、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスに３×１０⁹i./u.のベクタ ーシリーズ（Ａｄ２／βＧａｌ１４（野生型Ｅ４）、Ａｄ２／βＧａｌ７（Ｅ４ ＯＲＦ４）、Ａｄ２／βＧａｌ−８（Ｅ４ＯＲＦ６，６／７）、Ａｄ２／βＧａ ｌ−９（Ｅ４ＯＲＦＩノックアウト）、Ａｄ２／βＧａｌ−１０（Ｅ４ＯＲＦ２ ノックアウト）、Ａｄ２／βＧａｌ−II（Ｅ４ＯＲＦ３ノックアウト）およびＡ ｄ２／βＧａｌ−１３（Ｅ４ＯＲＦ６／７ノックアウト））を鼻内に注入したイ ンビボ試験により支持される。メトフェン（メトキシフルラン）を吸入させてマ ウスを麻酔し、１００μl ＰＢＳ、３％ショ糖中の３×１０⁹i./u.（感染単位 ）の組換えウイルスを注入した。注入後３日目と１４日目にマウスを屠殺し、ガ ラクトライト（Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ）測定法（トロピックス（Ｔｒｏｐｉ ｘ））を使用して肺中のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。野生型Ｅ４また はＥ４ＯＲＦ１．２または６／７を破砕したベクターを投与したマウスでは、１ ４日まで持続性発現が観察された。Ｅ４ＯＲＦ４またはＥ４ＯＲＦ６，６／７の みを含有するアデノウイルスベクターを投与したマウス、またはＥ４ＯＲＦ３ノ ックアウトベクターを注入したマウスでは、導入遺伝子発現は失われた。従って インビトロのラット肝細胞で観察されたように、これらの知見は、インビボの発 現の持続性を達成するためにＥ４ＯＲＦ３が必要であることと一致する。 データは、宿主免疫応答の非存在下ではβ−ガラクトシダーゼ発現の持続性を 達成するのにＥ４ＯＲＦ３が必要であることを示している。しかし、形質導入細 胞に対する細胞性免疫応答は、多くのシステムで導入遺伝子発現を停止させるこ とが報告されているため、Ｅ４ＯＲＦ３領域は、免疫適合宿主中で長期の発現を 達成するのに充分である可能性は低い。Ｅ３またはその部分（例えば、ｇｐ１９ Ｋを含む）と組合せて、Ｅ４ＯＲＦ３以外にＥ４ＯＲＦ４またはＥ４ＯＲＦ６／ ７を含めると、前記（例えば例３と４を参照されたい）のアデノウイルス特異的 ＣＴＬによる溶解に対する防御を与えることが予想され、導入遺伝子発現の持続 性を改良することが予想される。 個々の動物からの肺をホモジナイズし、ＡＭＰＧＤ測定法（ガラクトライト （Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ）測定法（トロピックス（Ｔｒｏｐｉｘ）、ワルタ ム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州）を使用してβ−ガラクトシダーゼ 活性を測定した。肺ホモジネート中のタンパク質濃度をバイオラッド（ＢｉｏＲ ａｄ）ＤＣ試薬により測定し、β−ガラクトシダーゼ活性は相対的光単位（ＲＬ Ｕ／μｇタンパク質）として表される。 野生型Ｅ４領域は、マウス肺および培養初代ラット肝細胞中のＣＭＶプロモー ターからの発現の持続性を達成するのに必要である。以後の実験は、この作用の ためにＥ４のどのＯＲＦが必要であるかを確認することが目的である。１つのア プローチは、Ｅ４コード領域が個々のＥ４ＯＲＦで置換されているベクターを作 製し試験することである。別のアプローチは、個々のＥ４ＯＲＦが挿入または欠 失突然変異誘発により破壊されているベクターを作製し試験することである。 本発明を好適な実施態様を参照して説明した。しかし本開示内容を考慮すると 、本発明の精神の範囲内で修飾と改良が可能であることは当業者には理解できる であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレゴリー，リチャード，ジェイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ，ウエ ストフォード，ウィンターグリーン レー ン ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）発現制御配列に機能的に結合した導入遺伝子を含む転写単位をコー ドするＤＮＡと、（ｂ）アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一部と、そして（ ｃ）Ｅ４ＯＲＦ３とアデノウイルスＥ４領域の少なくとも１つの他の部分を含有 する修飾Ｅ４領域とを、含んでなる導入遺伝子発現系。 ２．転写単位をコードするＤＮＡ、アデノウイルスＥ３領域、およびＥ４ＯＲ Ｆ３とＥ４の少なくとも１つの他の部分は、アデノウイルスベクターに含有され る、請求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 ３．転写単位をコードするＤＮＡはプラスミド中に含有され、アデノウイルス Ｅ３領域およびＥ４ＯＲＦ３とＥ４の少なくとも１つの他の部分は、アデノウイ ルスベクターに含有される、請求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 ４．転写単位をコードするＤＮＡとアデノウイルスＥ３領域はプラスミド中に 含有され、およびＥ４ＯＲＦ３とＥ４の少なくとも１つの他の部分は、アデノウ イルスベクターに含有される、請求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 ５．転写単位をコードするＤＮＡおよびＥ４ＯＲＦ３とＥ４の少なくとも１つ の他の部分はプラスミド中に含有され、アデノウイルスＥ３領域はアデノウイル スベクターに含有される、請求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 ６．修飾Ｅ４領域は、Ｅ４ＯＲＦ３と、Ｅ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ６／７およ びＥ４ＯＲＦ３／４から選択される少なくとも１つの他の部分とを含有する、請 求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 ７．修飾Ｅ４領域はＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４を含んでなる、請求の範囲第 １項記載の導入遺伝子発現系。 ８．修飾Ｅ４領域はＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４から本質的になる、請求の範 囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 ９．修飾Ｅ４領域はＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ６／７を含んでなる、請求の範 囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 １０．修飾Ｅ４領域はＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ６／７から本質的になる、請 求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 １１．Ｅ３領域は、導入遺伝子発現系を含む細胞中で主要組織適合遺伝子複合 体クラスＩ受容体の発現を低下させることができる、請求の範囲第１項記載の導 入遺伝子発現系。 １２．導入遺伝子発現系のＥ３領域は、ｇｐ１９Ｋタンパク質をコードするＤ ＮＡを含んでなる、請求の範囲第９項記載の導入遺伝子発現系。 １３．Ｅ３領域は、ｇｐ１９Ｋタンパク質をコードするＤＮＡを含有し、修飾 Ｅ４領域はＥ４ＯＲＦ４をさらに含有する、請求の範囲第９項記載の導入遺伝子 発現系。 １４．発現制御配列はサイトメガロウイルスまたはポリグリセロールキナーゼ プロモーターを含んでなる、請求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 １５．導入遺伝子は野生型嚢胞性繊維症膜貫通レギュレーター遺伝子である、 請求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系。 １６．請求の範囲第１項記載の導入遺伝子発現系と少なくとも１つの陽イオン 性両親媒性化合物を含んでなる複合体。 １７．陽イオン性両親媒性化合物はＧＬ−６７である、請求の範囲第１６項記 載の複合体。 １８．（ａ）発現制御配列に機能的に結合した導入遺伝子を含む転写単位をコ ードするＤＮＡと、（ｂ）アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一部と、そして （ｃ）Ｅ４ＯＲＦ３とアデノウイルスＥ４領域の少なくとも１つの他の部分を含 有する修飾Ｅ４領域とを含んでなる導入遺伝子発現系と担体とを含んでなる組成 物。 １９．Ｅ３領域は、導入遺伝子発現系を含む細胞中の主要組織適合遺伝子複合 体クラスＩ受容体の機能に悪影響を与え得る、請求の範囲第１８項記載の組成物 。 ２０．Ｅ３領域はｇｐ１９Ｋタンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求の範 囲第１８項記載の組成物。 ２１．Ｅ３領域は、ｇｐ１９Ｋタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有し、 Ｅ３領域はＥ４ＯＲＦ４をさらに含有する、請求の範囲第１８項記載の組成物。 ２２．発現制御配列はサイトメガロウイルスまたはポリグリセロールキナーゼ プロモーターを含んでなる、請求の範囲第１８項記載の組成物。 ２３．導入遺伝子は野生型嚢胞性繊維症膜貫通レギュレーター遺伝子である、 請求の範囲第１８項記載の組成物。 ２４．（ａ）発現制御配列に機能的に結合した導入遺伝子を含む転写単位をコ ードするＤＮＡ配列と、（ｂ）アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一部と、そ して（ｃ）Ｅ４ＯＲＦ３とアデノウイルスＥ４領域の少なくとも１つの他の部分 を含有する修飾Ｅ４領域とを、含んでなる導入遺伝子発現系を含む組成物の作成 方法であって、導入遺伝子発現系と、組成物を形成するのに充分な少なくとも１ つの両親媒性または陽イオン性分子とを一緒にすることを含んでなる上記方法。 ２５．細胞中で持続的な導入遺伝子発現を提供する方法であって、 （ａ）発現制御配列に機能的に結合した導入遺伝子を含む転写単位をコードす るＤＮＡ配列と、（ｂ）アデノウイルスＥ３領域の少なくとも一部と、そして（ ｃ）Ｅ４ＯＲＦ３とアデノウイルスの少なくとも１つの他の部分を含有する修飾 Ｅ４領域とを、含んでなる導入遺伝子発現系を細胞に投与することを含んでなる 上記方法において、導入遺伝子発現系は、導入遺伝子産物の生物学的または表現 型の特徴により追跡する上記方法。 ２６．導入遺伝子を発現し、かつ導入遺伝子を発現する細胞を細胞性免疫応答 から防御する方法であって、 ａ）導入遺伝子発現系を少なくとも１つの両親媒性または陽イオン性分子と組合 せて複合体を形成させ、 ｂ）細胞を形質導入し細胞中で導入遺伝子を発現するのに充分な条件下で細胞を 複合体と接触させ（ここで、この発現により測定可能な生物学的または表現型作 用が発生する）；そして ｃ）アデノウイルスＥ３領域、Ｅ４ＯＲＦ３を含有する修飾Ｅ４領域、およびア デノウイルスＥ４領域の少なくとも１つの他の部分（この発現は細胞性免疫応答 を低下させる）を導入遺伝子発現系に含有させることにより、導入遺伝子発現系 を含む細胞に対する細胞性免疫応答を低下させる、 ことを含んでなる上記方法。 ２７．導入遺伝子は、野生型嚢胞性繊維症膜貫通レギュレーター遺伝子をコー ドし、細胞は肺気道上皮である、請求の範囲第２５項および２６項記載の方法。 ２８．修飾Ｅ４領域はＥ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４を含む、請求の範囲第２５ 項および２６項記載の方法。