ES2970797T3 - Métodos y composiciones para inducir inmunidad protectora contra infección por filovirus - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona composiciones, vacunas y métodos para inducir inmunidad protectora contra la infección por filovirus, particularmente inmunidad protectora contra la infección de uno o más subtipos de los virus del Ébola y Marburg. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para inducir inmunidad protectora contra infección por filovirus
Campo técnico
La presente explicación hace referencia a composiciones, vacunas y métodos para inducir inmunidad protectora contra la infección por filovirus, particularmente, inmunidad protectora contra la infección por uno o más subtipos del virus del Ébola y de Marburgo.
Antecedentes
Los virus del Ébola, tales como el virus del Ébola de Zaire (EBOV) y el virus del Ébola de Sudán (SUDV), y el virus de Marburgo (MARV) estrechamente relacionado se asocian a brotes de fiebre hemorrágica del Ébola (EHF) muy letales en seres humanos y en primates en América del Norte, Europa y África. Estos virus son filovirus conocidos por infectar a seres humanos y primates no humanos con consecuencias de salud graves que incluyen la muerte. Las infecciones por filovirus han producido tasas de letalidad de hasta el 90 % en seres humanos. Las infecciones por EBOV, SUDV y MARV causan EHF y la muerte suele producirse en un plazo de 7 a 10 días desde la infección. La EHF se presenta como un síndrome febril agudo que se manifiesta como una fiebre repentina, náuseas, vómitos, diarrea, exantema maculopapuloso, malestar general, postración, indicios generales de aumento de permeabilidad vascular, anomalías en la coagulación y desregulación de la respuesta inmunitaria innata. Gran parte de la enfermedad parece estar causada por la desregulación de las respuestas inmunitarias innatas a la infección y por la replicación del virus en las células endoteliales vasculares, lo que produce la muerte de las células hospedadoras y la destrucción de la barrera endotelial. Los filovirus se pueden esparcir por aerosolización de partículas pequeñas o mediante el contacto directo con sangre, órganos y fluidos corporales infectados de origen humano o de primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés). Se informa que la infección con único virión es suficiente para provocar la fiebre hemorrágica del Ébola (EHF) en seres humanos. En la actualidad, no existe tratamiento o vacuna autorizados para el tratamiento o la prevención de la EHF. Los cuidados paliativos siguen siendo la única intervención médica autorizada en el caso de individuos infectados por filovirus.
Al ser la causa de una enfermedad humana grave, los filovirus siguen generando preocupación como fuentes de infecciones naturales y también como posibles agentes de bioterrorismo. Aún no se ha identificado de forma definitiva el reservorio de filovirus en la naturaleza. Se ha descrito que cuatro subtipos de virus del Ébola provocan la EHF, es decir, aquellos en episodios de Zaire, Sudán, Bundibugyo y Costa de Marfil (Sanchez, A. et al., 1996, PNAS USA, 93:3602-3607). Dichos subtipos de virus del Ébola tienen organizaciones genéticas similares, por ejemplo, virus de ARN monocatenario negativo que contiene siete genes dispuestos linealmente. Los productos génicos estructurales incluyen, por ejemplo, la glucoproteína de envoltura que existe en dos formas alternativas: una glucoproteínasoluble secretada (ssGP) y una glucoproteína transmembrana (GP) generada mediante la edición de ARN que media la entrada del virus (Sanchez, et al. 1996 PNAS USA 93:3602-3607).
Se ha sugerido que la inmunización puede resultar útil en la protección contra el virus del Ébola debido a que parece haber menos polimorfismo nucleotídico en los subtipos del Ébola que entre otros virus de ARN (Sanchez et al. 1996 PNAS USA 93:3602-3607). Hasta hace relativamente poco tiempo, el desarrollo de vacunas preventivas contra filovirus ha tenido resultados variables, en parte, debido a que no se comprenden bien los requisitos de respuestas inmunitarias protectoras contra infecciones por filovirus. Adicionalmente, la gran cantidad de filovirus en circulación en los reservorios naturales dificulta los esfuerzos para diseñar una vacuna que proteja contra todas las especies de filovirus.
En este momento, existen varias plataformas de suministro de antígeno en vacuna que han demostrado diversos grados de protección en primates no humanos (NHP) expuestos a dosis infecciosas elevadas de filovirus. Se encuentran en desarrollo candidatos de vacunas con base en una variedad de tecnologías de plataforma que incluyen vectores capaces de replicación (por ejemplo, virus de estomatitis vesicular, virus de la rabia, virus de parainfluenza), vectores no capaces de replicación (adenovirus, virus vaccinia Ankara modificado), subunidades proteicas que incluyen partículas tipo virus expresadas en células bacterianas, células de insectos, células de mamíferos, células vegetales, vacunas de ADN y/o filovirus atenuados vivos y muertos (Friedrich et al., 2012). La glucoproteína GP de EBOV es un componente esencial de una vacuna de protección contra las exposiciones a la misma especie de EBOV. Asimismo, la inclusión de GP de EBOV y SUDV, las dos especies más virulentas del virus del Ébola, puede proteger a los monos contra las exposiciones intramusculares al EBOV y SUDV, así como contra las exposiciones a especies del virus del Ébola de Bundibugyo (BDBV) y Tai Forest (TAFV, previamente conocida como de Costa de Marfil). Del mismo modo, la inclusión de la GP de MARV puede proteger a los monos contra las exposiciones por aire o intramusculares a MARV. El desarrollo de medidas médicas contra estos virus es una prioridad importante, en particular, el desarrollo de una vacuna de PAN-filovirus, es decir, una vacuna de protección contra todos los filovirus patógenos.
Los vectores de adenovirus incapaces de replicación (rAd) son inductores potentes de respuestas inmunitarias celulares y, por consiguiente, son vectores útiles para vacunas con base génica particularmente para lentivirus y filovirus, así como otros patógenos no víricos (Shiver, et al., (2002) Nature 415(6869): 331-5; (Hill, et al., Hum Vaccin 6(1): 78-83. ; Sullivan, et al., (2000) Nature 408(6812): 605-9; Sullivan et al., (2003) Nature 424(6949): 681-4; Sullivan, et al., (2006) PLoS Med 3(6): e177; Radosevic, et al., (2007); Santra, et al., (2009) Vaccine 27(42): 5837-45.
Las vacunas a base de adenovirus tienen varias ventajas como vacunas humanas ya que se pueden producir a títulos altos en condiciones de GMP y han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos (Asmuth, et al., J Infect Dis 201(1): 132-41; Kibuuka, et al., J Infect Dis 201(4): 600-7; Koup, et al., PLoS One 5(2): e9015. ; Catanzaro, et al., (2006) J Infect Dis 194(12): 1638-49; Harro, et al., (2009) Clin Vaccine Immunol 16(9): 1285-92. A pesar de que la mayoría del trabajo en vacunas iniciales se llevó a cabo con rAd5 debido a su potencia significativa para provocar respuestas de linfocitos T CD8+ y anticuerpos amplios, la existencia previa de inmunidad a rAd5 en seres humanos puede limitar su eficacia (Catanzaro, (2006); Cheng, et al., (2007) PLoS Pathog 3(2): e25.; McCoy, et al., (2007) J Virol 81(12): 6594-604.; Buchbinder, et al., (2008) Lancet 372(9653): 1881-93). Esta propiedad puede limitar el uso de rAd5 en aplicaciones clínicas para muchas vacunas que se están desarrollando en este momento que incluyen el virus del Ébola (EBOV) y el virus de Marburgo (MARV).
Los vectores de adenovirus con deficiencia de replicación, rAd26 y rAd35, derivados de los serotipos 26 y 35 de adenovirus, respectivamente, tienen la capacidad de evitar la inmunidad preexistente a Ad5. Es posible cultivar rAd26 a títulos elevados en estirpes celulares que complementan E1 de Ad5 adecuadas para producir dichos vectores a gran escala y de calidad médica (Abbink, et al., 2007), y se ha demostrado que dichos vectores inducen respuestas inmunitarias con mediación celular y humoral en estrategias de vacunación de sensibilización y refuerzo (Abbink, et al., 2007; Liu, et al., (2009) Nature 457(7225): 87-91). rAd35 vectors grow to high titers on cell lines suitable for production of clinical-grade vaccines (Havenga, et al., (2006) J Gen Virol 87(Pt 8): 2135-43), y se han formulado para inyección así como polvo estable inhalable (Jin, et al., Vaccine 28(27): 4369-75). Estos vectores muestran una transducción eficiente de células dendríticas humanas ( de Gruijl, et al., (2006) J Immunol 177(4): 2208-15; Lore, et al., (2007) J Immunol 179(3): 1721-9), y, por lo tanto, tienen la capacidad de mediar en el suministro y la presentación de alta concentración de antígenos.
El virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) se relaciona con el virus Vaccinia, un miembro del género Orthopoxvirus en la familia Poxviridae. Se sabe que los poxvirus son buenos inductores de respuestas de linfocitos T CD8 debido a su expresión intracitoplasmática. Sin embargo, pueden no ser buenos para generar linfocitos T restringidos de clase II de MHC CD4 (véase, por ejemplo, Haslett et al. Journal of Infectious Diseases 181 : 1264-72 (2000), page 1268). Se ha genomanipulado el MVA para usarlo como un vector vírico para expresión génica recombinante o como una vacuna recombinante.
Bavarian Nordic desarrolló cepas de MVA que tenían perfiles de seguridad potenciados para el desarrollo de productos más seguros, tales como vacunas o fármacos. Bavarian Nordic aprobó el MVA, lo designó MVA-BN y depositó una muestra representativa el 30 de agosto de 2000 en European Collection of Cell Cultures (ECACC, por sus siglas en inglés) con el número de acceso V00083008. También, el MVA-BN se describe en los documentos WO 02/42480 (US 2003/0206926) y WO 03/048184 (US 2006/0159699).
El MVA-BN se puede unir a células humanas en las que los genes codificados de forma vírica se expresan de forma eficiente e ingresar en ellas. El MVA-BN no tiene capacidad de replicación, lo que significa que el virus no se replica en células humanas. En células humanas, se expresan los genes víricos y no se producen virus infecciosos. El MVA-BN está clasificado como organismo de Nivel 1 de bioseguridad de acuerdo con los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos. Las preparaciones de MVA-BN y derivados se administraron a muchos tipos de animales y a más de 2000 sujetos humanos, que incluyen individuos inmunodeficientes. Se demostró que todas las vacunaciones son generalmente seguras y se toleran bien. A pesar de su alta atenuación y su virulencia reducida, se demostró en estudios preclínicos que el MVA-BN provoca respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares al virus vaccinia y a los productos génicos heterólogos codificados por genes clonados en el genoma de MVA [E. Harrer et al. (2005), Antivir. Ther.
10(2):285-300; A. Cosma et al. (2003), Vaccine 22(1):21-9; M. Di Nicola et al. (2003), Hum. Gene Ther. 14(14): 1347-1360; M. Di Nicola et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10(16):5381-5390].Geisbert et al., (2011) Journal of Virology 85(9): 4222-4233 se refiere a vacunas con vectores de adenovirus y su uso en la inducción de inmunidad protectora contra Ebolavirus. Específicamente, Geisbert et al. explican vectores rAd35 y rAd26 que llevan antígeno de glucoproteína de Ebolavirus y los efectos inmunoprotectores de tales vacunas administradas ya sea como una única inoculación o como una combinación de sensiblización y refuerzo.
Son necesarias vacunas mejores que provoquen respuestas inmunitarias contra filovirus, particularmente, inmunidad protectora contra los virus más letales del Ébola y de Marburgo.
Breve compendio
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y/o los ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertas por las reivindicaciones adjuntas se consideran que no son parte de la presente invención. Las referencias a los métodos de tratamiento en los subsiguientes párrafos de esta descripción se han de interpretar como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
En la presente invención, se descubre que varias combinaciones de sensibilización y refuerzo de vectores no capaces de replicación generan protección inmunitaria efectiva contra las infecciones por filovirus. En consecuencia, la presente invención hace referencia a una vacuna combinada que comprende:
(i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que tiene SEQ ID NO: 1, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; y
(ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de MVA que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos de filovirus que tienen S<e>Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,<s>E<q>ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5, junto con un portador farmacéuticamente aceptable;
para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria protectora contra al menos un subtipo de filovirus, en donde la primera composición se usa para estimular dicha respuesta inmunitaria y la segunda composición se usa para reforzar dicha respuesta inmunitaria, y en donde la segunda composición se administra 1-12 semanas después de la primera composición.
En ciertas realizaciones, la primera composición (i) también comprende un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un segundo subtipo de filovirus. En otras realizaciones, la primera composición (i) también comprende un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus.
En una realización preferida, se seleccionan el segundo y el tercer subtipo de filovirus del grupo de Zaire, Sudán, Reston, Bundibugyo, Tai Forest y Marburgo. Las proteínas antigénicas pueden ser cualquier proteína de cualquier filovirus que comprenda un determinante antigénico. En una realización preferida, las proteínas antigénicas son glucoproteínas o nucleoproteínas. En una realización preferida, el primer, el segundo y el tercer subtipo de filovirus no son iguales.
El vector de adenovirus en la primera composición (i) comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que tiene la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, la composición (i) comprende también un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que tiene una secuencia diferente seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. Preferiblemente, la composición (i) comprende también un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que aún tiene una secuencia diferente seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5.
El vector de adenovirus en la primera composición (i) comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, la composición (i) comprende también un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, la composición (i) comprende también un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO: 3.
El vector de MVA en la composición (ii) comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de al menos cuatro subtipos de filovirus. De manera específica, dicho vector de MVA comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos diferentes de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5.
En otra realización preferida más, la presente invención se refiere a una vacuna combinada para su uso como se describe en el presente documento, en donde la primera composición comprende un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una primera proteína antigénica con SEQ ID NO: 1, un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una segunda proteína antigénica con SEQ ID NO: 2, y un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una tercera proteína antigénica con SEQ ID NO: 3; y en donde el vector MVA en la composición (ii) comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro diferentes subtipos de filovirus que tienen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5.
En una realización preferida, los vectores de adenovirus comprendidos en la vacuna combinada para generar una respuesta inmunitaria protectora contra al menos uno de los subtipos de filovirus son vectores de rAd26 o rAd35. La composición de refuerzo se administra 1-12 semanas luego de la composición de sensibilización. En otra realización preferida, la vacunación de sensibilización, es decir, la etapa (a) se lleva a cabo en la semana 0, seguida de una vacunación de refuerzo, es decir, la etapa (b) en la semana 1-10, más preferiblemente en la semana 6-10 e incluso más preferiblemente en la semana 8. En otra realización preferida, la vacunación de sensibilización, es decir, la etapa (a) se lleva a cabo en la semana 0, seguida de una vacunación de refuerzo, es decir, la etapa (b) en la semana 1-4, preferiblemente en la semana 1,2 o 4. En realizaciones preferidas de la presente invención, el o los filovirus son virus del Ébola o virus de Marburgo. Los virus del Ébola pueden ser de cualquier especie, por ejemplo, Ébola de Zaire (EBOV) y de Sudán (SUDV), Reston, Bundibugyo y Tai Forest. El virus de Marburgo (Ma Rv ) puede ser de cualquier especie. Se ilustran ejemplos de secuencias de aminoácidos de proteínas antigénicas de filovirus adecuadas en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5.
Breve descripción de los dibujos
El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada, se comprenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Se debe entender que la invención no se limita a las realizaciones precisas mostradas en los dibujos.
El expediente de Patente o de Solicitud contiene al menos una figura en color. Si se solicitara, y luego de efectuado el pago de la tasa necesaria, la oficina entregará copias de esta Publicación de Patente o Solicitud de Patente con la o las figuras en color.
En los dibujos:
La Figura 1 resume los grupos en un estudio en animales.
La Figura 2 ilustra el diseño experimental del estudio.
La Figura 3 muestra el resultado de la exposición a la cepa de exposición de Ébola de Zaire Kikwit 1995. La Figura 4 muestra la respuesta inmunitaria humoral específica a la glucoproteína de subtipo de Ébola de Zaire (evaluada mediante ELISA) que se observa en el estudio en animales. Se obtuvieron títulos muy elevados de anticuerpos independientemente de los programas de vacunación. (ND = punto del tiempo no analizado.) La Figura 5 muestra la respuesta inmunitaria humoral específica a la glucoproteína de cepa Gulu de Sudán (evaluada mediante ELISA) que se observa en el estudio en animales. Se obtuvieron títulos muy elevados de anticuerpos independientemente de los programas de vacunación (ND = punto del tiempo no analizado). La Figura 6 muestra la respuesta inmunitaria humoral específica a la glucoproteína de cepa de Angola de Marburgo (evaluada mediante ELISA) que se observa en el estudio en animales. Se obtuvieron títulos muy elevados de anticuerpos independientemente de los programas de vacunación (ND = punto del tiempo no analizado).
La Figura 7 muestra la respuesta inmunitaria celular específica a GP de MARVA, ZEBOV y SEBOV analizada mediante ELISPOT de IFN-y.
La Figura 8 muestra la respuesta inmunitaria específica a GP de ZEBOV analizada mediante un ELISA de GP anti-EBOV, en donde se observa una respuesta inmunitaria humoral mayor el día 50 luego de la inmunización de refuerzo en sujetos inmunizados con MVA como sensibilizante y Ad26 como refuerzo que con las vacunas en orden inverso.
La Figura 9 muestra la respuesta de linfocitos T específica a GP de ZEBOV en seres humanos analizados mediante ensayo ELISpot.
La Figura 10 muestra la respuesta inmunitaria de linfocitos CD8+ específica a GP de ZEBOV en seres humanos analizados mediante ensayo ICS.
La Figura 11 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD8+ específica a GP de EBOV en seres humanos mediante ensayo ICS cuando se usa un intervalo de sensibilización y refuerzo de 28 días.
La Figura 12 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD8+ específica a GP de EBOV en seres humanos mediante ensayo ICS cuando se usa un intervalo de sensibilización y refuerzo de 56 días.
La Figura 13 muestra la respuesta inmunitaria de linfocitos CD4+ específica a GP de ZEBOV en seres humanos analizados mediante ensayo ICS.
La Figura 14 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD4+ específica a GP de EBOV en seres humanos mediante ensayo ICS cuando se usa un intervalo de sensibilización y refuerzo de 28 días.
La Figura 15 muestra la función de las respuestas de linfocitos T CD4+ específica a GP de EBOV en seres humanos mediante ensayo ICS cuando se usa un intervalo de sensibilización y refuerzo de 56 días.
La Figura 16 muestra la respuesta inmunitaria inducida por una inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV seguida por un refuerzo de MVA-BN-Filo 14 días después evaluado mediante ELISA (A), ELIspot (B) e ICS (C y D).
La Figura 17 muestra la respuesta inmunitaria específica a GP de ZEBOV analizada mediante ELISA de GP anti-EBOV.
La Figura 18 muestra la respuesta de linfocitos T específica a GP de ZEBOV en seres humanos analizados mediante ensayo ELISpot.
La Figura 19 muestra la respuesta inmunitaria celular de CD4+ (A) y CD8+ (B) específica a GP de ZEBOV en seres humanos analizada mediante ensayo ICS y la función de las respuestas de linfocitos T CD8+ (C) y CD4+ (D) específicas a GP de EBOV en seres humanos mediante ensayo ICS cuando se usan MVA como sensibilizante y Ad26 como refuerzo 14 días después.
La Figura 20 muestra que los anticuerpos de unión a GP de Mayinga de EBOV generados mediante la vacunación con programas de Ad26.ZEBOV/ MVA BN Filo y<m>V<a>BN Filo/Ad26.ZEBOV determinados mediante ELISA de GP. Se indican los programas de vacunación debajo del eje de x. IM elevado e IM estándar hacen referencia a la dosis y la vía de MVA BN Filo. La línea punteada horizontal indica LOD.
Descripción detallada
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Se citan o se describen varias publicaciones, artículos y patentes en los antecedentes y a lo largo de la memoria descriptiva. Cualquier mención de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se haya incluido en la presente memoria descriptiva tiene únicamente el fin de dar contexto a la presente invención. Dicha mención no implica una admisión de que cualquiera de estas materias, o todas estas materias, formen parte de la técnica anterior respecto a cualesquiera invenciones explicadas o reivindicadas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Por el contrario, ciertos términos usados en la presente memoria tienen los significados establecidos en la memoria descriptiva. Se debe observar que, tal como se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares «uno», «una», «el» y «la» incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se indique lo contrario, se entenderá que la expresión "al menos" antes de una serie de elementos hace referencia a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar solamente mediante el uso de experimentos de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria. Tales equivalentes están abarcados por la presente invención.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que el término "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o una etapa o un grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualesquiera otros números enteros o etapas o grupos de números enteros o etapas. Cuando se usa en la presente memoria, el término "que comprende" se puede sustituir por los términos "que contiene" o "que incluye" o, a menudo, cuando se usa en la presente memoria, por el término "que tiene". Cuando se usan en la presente memoria en el contexto de un aspecto o una realización de la presente invención, se puede sustituir cualquiera de los términos y expresiones mencionados anteriormente (que comprende, que contiene, que incluye, que tiene) con la expresión «que consiste en», aunque se prefiere menos.
Cuando se usa en la presente memoria, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento reivindicado. Cuando se usa en la presente memoria, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación.
Tal y como se usa en la presente memoria, se entiende que la conjunción "y/o" entre elementos múltiples mencionados comprende tanto las opciones individuales como las combinadas. Por poner un ejemplo, cuando dos elementos están unidos por "y/o", una primera opción hace referencia a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opción hace referencia a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opción hace referencia a la aplicabilidad del primer y el segundo elementos juntos. Se entiende que una cualquiera de estas opciones está comprendida en el significado y que, por lo tanto, satisface el requerimiento del término "y/o" tal como se usa en la presente memoria. También se entiende que el significado comprende la aplicabilidad simultánea de más de una de las opciones y, por consiguiente, satisface el requerimiento del término "y/o".
Tal como se usa en la presente memoria, «sujeto» significa cualquier animal, preferiblemente, un mamífero, lo más preferiblemente, un ser humano, al que se tratará o se trató mediante un método de acuerdo con una realización de la invención. El término "mamífero" como se usa en la presente memoria, abarca cualquier mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen, entre otros, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, cobayas, monos, seres humanos, etc., y más preferiblemente, un ser humano.
Como se usa en la presente memoria, el término "inmunidad protectora" o "respuesta inmunitaria protectora" significa que el sujeto vacunado es capaz de controlar una infección con el agente patógeno contra el que se dio la vacuna. Usualmente, el sujeto que ha desarrollado una "respuesta inmunitaria protectora" desarrolla síntomas clínicos únicamente leves o moderados o no desarrolla síntomas. Usualmente, un sujeto que tiene una "respuesta inmunitaria protectora" o "inmunidad protectora" contra cierto agente no fallecerá como resultado de la infección con dicho agente.
Una «proteína de la cápside de adenovirus» hace referencia a una proteína en la cápside de un adenovirus (por ejemplo, Ad 26 o Ad 35) involucrada en la determinación del serotipo y/o el tropismo de un adenovirus particular. Las proteínas de la cápside de adenovirus suelen incluir las fibras, las proteínas pentones y/o hexones. Tal como se usan en la presente memoria, «proteína de la cápside de Ad26» o «proteína de la cápside de Ad35» pueden ser, por ejemplo, una proteína de la cápside quimérica que incluye al menos una parte de una proteína de la cápside de Ad26 o Ad35. En ciertas realizaciones, la proteína de la cápside es una proteína de la cápside completa de Ad26 o Ad35. En ciertas realizaciones, el hexón, el pentón y la fibra son de Ad26 o de Ad35.
En la presente memoria, los términos "adyuvante" y "estimulador inmunitario" se usan de forma intercambiable y se definen como una o más sustancias que causan la estimulación del sistema inmunitario. En este contexto, se usa un adyuvante para mejorar la respuesta inmunitaria a los vectores de MVA y/o adenovirus de la invención.
Cuando se aplica a posiciones de los residuos aminoácidos en secuencias, la expresión «que corresponde a» significa que corresponden a posiciones en múltiples secuencias cuando se alinean de manera óptima.
En el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas o de ácidos nucleicos (por ejemplo, glucoproteínas de filovirus y polinucleótidos que las codifican), los términos «idéntico» o «identidad» porcentual hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales cuando se comparan y se alinean con correspondencia máxima, tal como se mide mediante uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual.
En el caso de comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias luego calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa designados.
El alineamiento óptimo de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr, Madison, WI), o mediante inspección visual (véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)).
Otro ejemplo preferido de algoritmos adecuados para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 que se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215: 403-410 y Altschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El software para la realización del análisis con BLAST se encuentra disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencias con valor alto (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que corresponde o satisface algún valor de umbral T valorado de forma positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. La T hace referencia al puntaje umbral de la palabra más próxima (Altschul et al, supra). Estos resultados iniciales de la palabra más próxima actúan como punto de partida para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largos que las contienen. Se extienden los resultados de palabras en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, todo lo que se pueda aumentar el puntaje de alineamiento acumulado.
En el caso de secuencias de nucleótidos, los puntajes acumulados se calculan con los parámetros M (puntaje de compensación por un par de residuos apareados, siempre >0) y N (puntaje de penalización por residuos no apareados, siempre <0). En el caso de secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulado. La extensión de los resultados de la palabra en cada dirección se detiene cuando: el puntaje de alineamiento acumulado desciende por la cantidad X del valor máximo logrado; el puntaje acumulado disminuye a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de valor negativo; o se alcanza el final de alguna secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. En el caso de secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntajes de BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
Además del cálculo del porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), la que es una indicación de la probabilidad de que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurra por casualidad. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma al comparar el ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente, menor que aproximadamente 0,001.
Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tenga reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido es, de manera típica, sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren únicamente en sustituciones conservadoras. Otro indicio de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, tal como se describe a continuación.
En el contexto de proteínas antigénicas de filovirus descritas en la presente memoria, la expresión «sustancialmente similar» indica que un polipéptido comprende una secuencia con al menos el 90 %, preferiblemente, al menos el 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana de comparación de 10-20 aminoácidos. Se determina el porcentaje de identidad de secuencia mediante la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (la que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje mediante la determinación del número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido aparece en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y la multiplicación del resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.
Se descubrió en la presente invención que las combinaciones de sensibilización y refuerzo heterólogas, en particular, de sensibilización con Ad26 seguida de refuerzo con MVA, son sorprendentemente efectivas para generar respuestas inmunitarias protectoras contra uno o más subtipos de filovirus.
Proteínas antigénicas de filovirus
Los virus del Ébola y el virus de Marburgo genéticamente relacionado son filovirus asociados con brotes de fiebre hemorrágica muy letales en seres humanos y primates en América del Norte, Europa y África (Peters, C.J. et al. in: Fields Virology, eds. Fields, B.N. et al. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996; Peters, C.J. et al. 1994 Semin Virol 5:147-154). Aunque se han definido varios subtipos, la organización genética de dichos virus es similar, y cada uno contiene siete genes dispuestos linealmente. Entre las proteínas víricas, la glucoproteína de envoltura existe en dos formas alternativas: una proteína secretada (sGP) de 50 kilodalton a 70 kilodalton (kDa) y una glucoproteína transmembrana (GP) de 130 kDa generada mediante la edición de ARN que media la entrada vírica (Peters, C.J. et al. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. et al. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996; Sanchez, A. et al. 1996 PNAS USA 93:3602-3607). Otros productos génicos estructurales incluyen la nucleoproteína (NP), las proteínas de matriz VP24 y VP40, las proteínas no estructurales asumidas VP30 y VP35, y la polimerasa vírica (reseñada en Peters, C.J. et al. en: Fields Virology, eds. Fields, B.N. et al. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996).
Las moléculas de ácido nucleico comprendidas en los vectores de MVA y adenovirus pueden codificar productos génicos estructurales de cualquier especie de filovirus, tal como subtipos de Zaire (a los que también se hace referencia en la presente memoria como ZEBOV), de Sudán (a los que también se hace referencia en la presente memoria como SEBOV), de Reston, de Bundibugyo y de Costa de Marfil. Se encuentra una única especie de virus de Marburgo (a la que también se hace referencia en la presente memoria como MARV).
Es posible usar vectores adenovíricos y vectores de MVA como se explica en la presente memoria para expresar proteínas antigénicas, que son proteínas que comprenden un determinante antigénico de una amplia variedad de antígenos de filovirus. En una realización preferida y típica, los vectores explicados en la presente memoria incluyen ácido nucleico que codifica la forma transmembrana de la glucoproteína vírica (GP). En otras realizaciones, los vectores explicados en la presente memoria pueden codificar la forma secretada de la glucoproteína vírica (ssGP) o la nucleoproteína vírica (NP).
Un experto reconocerá que es posible modificar las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína antigénica de filovirus, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico establecidas en la presente memoria pueden mutar, siempre que la proteína expresada modificada provoque una respuesta inmunitaria contra un patógeno o una enfermedad. Por lo tanto, tal como se usan en la presente memoria, «proteína antigénica» o «proteína de filovirus» hacen referencia a una proteína que comprende al menos un determinante antigénico de una proteína de filovirus anteriormente descrita. Las expresiones comprenden glucoproteínas de filovirus (es decir, productos génicos de un filovirus) o una nucleoproteína de filovirus, así como proteínas recombinantes que comprenden uno o más determinantes de glucoproteínas de filovirus. El término proteínas antigénicas comprende también proteínas antigénicas que son sustancialmente similares.
En algunas realizaciones de la presente explicación, la proteína puede mutar de forma que sea menos tóxica para las células (véase, por ejemplo, el documento WO/2006/037038) o se puede expresar en un grado mayor o menor en las células. También se explican en la presente memoria vacunas que comprenden una combinación de moléculas de ácido nucleico. Por ejemplo, y de modo no taxativo, es posible combinar moléculas de ácido nucleico que codifiquen GP, ssGP y NP de las cepas de Ébola de Zaire, Sudán, Marburgo y Costa de Marfil/Taí Forest en cualquier combinación en una composición de vacuna.
Adenovirus
Un adenovirus de acuerdo con la presente explicación pertenece a la familia Adenoviridae y, preferiblemente, es un adenovirus que pertenece al género Mastadenovirus. Puede ser un adenovirus humano, pero también puede ser un adenovirus que infecte otras especies, lo que incluye, de modo no taxativo, un adenovirus bovino (por ejemplo, adenovirus bovino 3, BAdV3), un adenovirus canino (por ejemplo, CAdV2), un adenovirus porcino (por ejemplo, PAdV3 o 5) o un adenovirus de simio (que incluye un adenovirus de mono y un adenovirus de simio, tal como un adenovirus de chimpancé o un adenovirus de gorila). Preferiblemente, el adenovirus es un adenovirus humano (HAdV o AdHu, en la presente invención se hace referencia a un adenovirus humano como Ad sin indicación de especie, por ejemplo, la notación «Ad5» significa lo mismo que HAdV5, que es un adenovirus humano de serotipo 5) o un adenovirus de simio, como de chimpancé o de gorila (ChAd, AdCh o SAdV).
Se han puesto en práctica los estudios más avanzados con adenovirus humanos y se prefieren adenovirus humanos de acuerdo con ciertos aspectos de la presente explicación. En ciertas realizaciones preferidas, el adenovirus recombinante de acuerdo con la presente explicación se basa en un adenovirus humano. En realizaciones preferidas de la presente explicación, el adenovirus recombinante se basa en un adenovirus humano de serotipo 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 o 50. De acuerdo con una realización particularmente preferida de la invención, un adenovirus es un adenovirus humano de uno de los serotipos 26 o 35.
Una ventaja de estos serotipos es la baja seroprevalencia y/o pocos títulos de anticuerpo neutralizante preexistente en la población humana. Se describe la preparación de vectores de rAd26, por ejemplo, en WO 2007/104792 y en Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Se encuentran ejemplos de secuencias de genoma de Ad26 en el acceso a GenBank EF 153474 y en la SEQ ID NO:1 del documento WO 2007/104792. Se describe la preparación de vectores de rAd35, por ejemplo, en la Patente Estadounidense n.° 7,270,811, en el documento<w>O 00/70071, y en Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71. Se encuentran ejemplos de secuencias de genoma de Ad35 en el acceso a GenBank AC_000019 y en la Figura 6 del documento WO 00/70071.
En general, los adenovirus de simio también tienen una baja seroprevalencia y/o pocos títulos de anticuerpo neutralizante preexistentes en la población humana, y se ha informado sobre una cantidad significativa de trabajo con vectores de adenovirus de chimpancé (por ejemplo, US6083716; WO 2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17; véase también reseñada por Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62; y reseñada por Lasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39). Por tanto, en otras realizaciones preferidas, el adenovirus recombinante como se describe en la presente memoria se basa en un adenovirus de simio, por ejemplo, un adenovirus de chimpancé. En ciertas realizaciones, el adenovirus recombinante se basa en adenovirus de simio de tipo 1; 7; 8; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27,1; 28,1; 29; 30; 31,1; 32; 33; 34; 35,1; 36; 37,2; 39; 40,1; 41,1; 42,1; 43; 44; 45; 46; 48; 49; 50 o SA7P.
Vectores adenovíricos rAd26 y rAd35
En una realización preferida de acuerdo con la presente explicación, los vectores adenovíricos comprenden proteínas de la cápside de dos serotipos raros: Ad26 y Ad35. En la realización típica, el vector es un virus rAd26 o rAd35.
Por lo tanto, los vectores que se pueden usar en la presente explicación comprenden una proteína de la cápside de Ad26 o Ad35 (por ejemplo, una fibra, una proteína pentón o hexón). Un experto reconocerá que no es necesario usar una proteína de la cápside de Ad26 o Ad35 entera en los vectores de la invención. Por lo tanto, es posible usar las proteínas de la cápside quiméricas que incluyen al menos una parte de una proteína de la cápside de Ad26 o Ad35 en los vectores de la presente explicación. Los vectores como se describen en la presente memoria también pueden comprender proteínas de la cápside en las que cada una de las fibras, proteínas pentones y hexones deriva de un serotipo diferente, siempre que al menos una proteína de la cápside derive de Ad26 o Ad35. En realizaciones preferidas de la presente explicación, cada una de las fibras, las proteínas pentones y hexones deriva de Ad26 o de Ad35.
Un experto reconocerá que es posible combinar los elementos derivados de múltiples serotipos en un único vector de adenovirus recombinante. Por lo tanto, se puede producir un adenovirus quimérico que combine propiedades deseables de diferentes serotipos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un adenovirus quimérico explicado en la presente memoria podría combinar la ausencia de inmunidad preexistente de los serotipos Ad26 y Ad35 con características tales como estabilidad de temperatura, arreglo, anclaje, rendimiento de la producción, infección redirigida o mejorada, estabilidad del ADN en la célula diana y similares.
En ciertas realizaciones, el vector de adenovirus recombinante útil en la presente explicación deriva principalmente o en su totalidad de Ad35 o de Ad26 (es decir, el vector es rAd35 o rAd26). En algunas realizaciones, el adenovirus no es capaz de replicación, por ejemplo, debido a que contiene una eliminación en la región E1 del genoma. En el caso de los adenovirus como se explica en la presente memoria, que se derivan de Ad26 o Ad35, se suele intercambiar la secuencia codificante E4-orf6 del adenovirus con el E4-orf6 de un adenovirus del subgrupo C humano, tal como Ad5. Esto hace posible la propagación de dichos adenovirus en estirpes celulares complementarias conocidas que expresan los genes E1 de Ad5, tal como, por ejemplo, células 293, células PER.C6 y similares (véase, por ejemplo, Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467). En ciertas realizaciones de la presente explicación, el adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 35 con una eliminación en la región E1, en la que se clonó el ácido nucleico que codifica el antígeno, y con una región E4 orf6 de Ad5. En ciertas realizaciones de la presente explicación, el adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 26 con una eliminación en la región E1, en la que se clonó el ácido nucleico que codifica el antígeno, y con una región E4 orf6 de Ad5. En el caso del adenovirus Ad35, se suele retener el extremo 3' del marco abierto de lectura E1B 55K en el adenovirus, por ejemplo, los 166 pb directamente anteriores al marco de lectura de pIX o un fragmento que lo comprende, tal como un fragmento de 243 pb directamente anteriores al codón de inicio de pIX, marcado en el extremo 5' por un sitio de restricción Bsu36I, debido a que esto aumenta la estabilidad del adenovirus porque el promotor del gen de pIX reside parcialmente en dicha área (véase, por ejemplo, Havenga et al, 2006, supra; WO 2004/001032).
Se conoce en la técnica la preparación de vectores adenovíricos recombinantes.
Se describe la preparación de vectores de rAd26, por ejemplo, en WO 2007/104792 y en Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Se encuentran ejemplos de secuencias de genoma de Ad26 en el acceso a GenBank EF 153474 y en la SEQ ID NO:1 del documento WO 2007/104792. Se describe la preparación de vectores de rAd35, por ejemplo, en la Patente estadounidense n.° 7,270,811 y en Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263 71. Se encuentra un ejemplo de secuencia de genoma de Ad35 en el n.o de acceso en GenBank AC_000019.
En una realización de la presente explicación, los vectores útiles para la presente invención incluyen los descritos en el documento WO2012/082918.
Típicamente, se produce un vector útil en la invención con un ácido nucleico que comprende todo el genoma adenovírico recombinante (por ejemplo, un vector de baculovirus, plásmido o cósmido). Por lo tanto, también se explican moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los vectores adenovíricos de la invención. Las moléculas de ácido nucleico se pueden encontrar en forma de ARN o en forma de ADN obtenido mediante clonación o producido de forma sintética. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena simple.
Los vectores de adenovirus útiles en la invención suelen no ser capaces de replicación. En dichas realizaciones, la eliminación o inactivación de regiones críticas para la replicación del virus, tales como la región E1, puede hacer que el virus no sea capaz de replicarse. Las regiones se pueden eliminar o inactivar de manera sustancial, por ejemplo, mediante la inserción del gen de interés (usualmente enlazado a un promotor). En algunas realizaciones, los vectores explicados en la presente memoria pueden contener eliminaciones de otras regiones, tales como las regiones E2, E3 o E4, o inserciones de genes heterólogos enlazados a un promotor. En el caso de adenovirus con mutaciones de E2 y/o E4, generalmente se usan estirpes celulares complementarias E2 y/o E4 para generar adenovirus recombinantes. No es necesario que la estirpe celular sea complementaria a las mutaciones en la región E3 del adenovirus, dado que se necesita E3 para la replicación.
Típicamente, se usa una estirpe celular de empaque para producir una cantidad suficiente de vectores de adenovirus como se explica en la presente memoria. Una célula empaquetadora es una célula que comprende los genes eliminados o inactivados en un vector que no es capaz de replicarse, lo que hace posible que el virus se replique en la célula. Las estirpes celulares adecuadas incluyen, por ejemplo,<p>E<r>.C6, 911,293, y E1 A549.
Tal como se indicó anteriormente, una amplia variedad de glucoproteínas de filovirus se puede expresar en los vectores. Si fuera necesario, se puede optimizar por codones el gen heterólogo que codifica las glucoproteínas de filovirus para garantizar la expresión adecuada en el hospedador tratado (por ejemplo, ser humano). La optimización por codones es una tecnología ampliamente aplicada en la técnica. Típicamente, se clona el gen heterólogo en la región E1 y/o E3 del genoma adenovírico.
Un promotor derivado de adenovirus (por ejemplo, el promotor MLP (promotor tardío principal)) o un promotor heterólogo pueden controlar (es decir, enlazar de manera operativa) el gen de filovirus heterólogo. Ejemplos de promotores heterólogos adecuados incluyen el promotor de CMV y el promotor de RSV. Preferiblemente, el promotor se encuentra antes del gen heterólogo de interés en un casete de expresión.
Tal como se indicó anteriormente, los vectores de adenovirus útiles para la invención pueden comprender una amplia variedad de glucoproteínas de filovirus conocidas por los expertos en la técnica.
En una realización preferida de la presente explicación, el vector o los vectores de rAd comprenden una o más GP seleccionadas del grupo que consiste en GP del virus del Ébola de Zaire (EBOV), GP del virus del Ébola de Sudán (SUDV), GP del virus de Marburgo (MARV) y GP sustancialmente similares a estos.
Vectores de MVA
Los vectores de MVA de la presente invención utilizan virus atenuado derivado del virus Vaccinia Ankara modificado, que se caracteriza por la pérdida de su capacidad para replicarse de manera reproductiva en estirpes celulares humanas. Los vectores de MVA expresan una amplia variedad de glucoproteínas de filovirus, así como otras proteínas de filovirus estructurales, tales como VP40 y nucleoproteína (NP).
En la presente memoria se explica un virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un determinante antigénico de una glucoproteína (GP) de filovirus, en particular, una glucoproteína de envoltura. También se explica en la presente memoria un vector de MVA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un determinante antigénico de una glucoproteína de filovirus, en particular, una glucoproteína de envoltura, y una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un determinante antigénico de otra proteína de filovirus.
Más de 570 pases en serie en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa dérmica de vaccinia Ankara [virus Vaccinia Ankara corioalantoide, CVA; véase una reseña en Mayr et al. (1975), Infection 3, 6-14], que se mantuvo en el Instituto de Vacunación, Ankara, Turquía, durante muchos años y se usó como la base para la vacunación de seres humanos, han generado MVA. Sin embargo, debido a las frecuentes complicaciones graves luego de la vacunación asociadas con los virus vaccinia, hubo varios intentos de generar una vacuna segura, más atenuada, contra la viruela.
Durante el período de 1960 a 1974, el Prof. Anton Mayr logró atenuar la CVA por más de 570 pases continuos en células CEF [Mayr et al. (1975)]. Se demostró en una variedad de modelos animales que el MVA resultante no era virulento [Mayr, A. & Danner, K. (1978), Dev. Biol. Stand. 41: 225-234]. Como parte del desarrollo previo del MVA como una vacuna previa contra la viruela, se realizaron ensayos clínicos en que se usaron MVA-517 junto con Lister Elstree [Stickl (1974), Prev. Med. 3: 97-101; Stickl and Hochstein-Mintzel (1971), Munch. Med. Wochenschr. 113: 1149-1153] en sujetos con riesgo de reacciones adversas generadas por vaccinia. En 1976, se registró el MVA derivado del lote madre de MVA-571 (que corresponde al pase 571) en Alemania como la vacuna de sensibilización en un programa de vacunación de viruela parenteral de dos fases. Posteriormente, se usó el MVA-572 en alrededor de 120000 individuos caucásicos, quienes eran en su mayoría niños de entre 1 y 3 años, que no presentaron efectos secundarios graves informados, aunque muchos de los sujetos pertenecían a la población con alto riesgo de complicaciones asociadas con vaccinia (Mayr et al. (1978), Zentralbl. Bacteriol. (B) 167:375-390). El MVA-572 se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales como ECACC V94012707.
Como resultado del pase usado para atenuar el MVA, existe una serie de cepas o aislados diferentes, dependiendo del número de pases en células CEF. Por ejemplo, se usó MVA-572 en Alemania en dosis pequeñas como una prevacuna durante el programa de erradicación de la viruela y se usó MVA-575 extensamente como una vacuna veterinaria. Tanto el MVA como el MVA-BN carecen de alrededor del 15 % (31 kb de seis regiones) del genoma, en comparación con el virus CVA ancestral. Las eliminaciones afectan a una serie de genes hospedadores y de virulencia, así como también el gen para cuerpos de inclusión tipo A. El MVA-575 se depositó el 7 de diciembre de 2000 en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC) con el número de acceso V00120707. El MVA del virus CVA atenuado (virus Vaccinia Ankara modificado) se obtuvo por propagación en serie (más de 570 pases) del CVA en fibroblastos primarios de embrión de pollo.
A pesar de que Mayr et al. demostraron durante la década de los 70 que el MVA se encuentra altamente atenuado y no es virulento en seres humanos y mamíferos, ciertos investigadores han informado de que el MVA no se encuentra completamente atenuado en estirpes celulares de mamíferos y seres humanos, ya que puede existir replicación residual en estas células [Blanchard et al. (1998), J. Gen. Virol. 79:1159-1167; Carroll & Moss (1997), Virology 238:198-211; Patente de EE. UU. n.° 5,185,146; Ambrosini et al. (1999), J. Neurosci. Res. 55: 569]. Se asume que los resultados indicados en dichas publicaciones se obtuvieron con varias cepas conocidas de MVA, dado que los virus usados difieren esencialmente en sus propiedades y, en particular, en su comportamiento de crecimiento en varias estirpes celulares. Dicha replicación residual no es deseada por varias razones, que incluyen preocupaciones de seguridad en relación con el uso en seres humanos.
Bavarian Nordic desarrolló cepas de MVA con perfiles de seguridad potenciados para el desarrollo de productos más seguros, tales como vacunas o fármacos. Bavarian Nordic aprobó el MVA, lo designó MVA-BN y depositó una muestra representativa el 30 de agosto de 2000 en European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número de acceso V00083008. También se describe el Mv A-BN en los documentos WO 02/42480 (US 2003/0206926) y WO 03/048184 (US 2006/0159699).
El MVA-BN se puede unir a células humanas en las que los genes codificados de manera vírica se expresan de manera muy eficiente e ingresar en ellas. El MVA-BN se adapta en gran medida al fibroblasto de embrión de pollo (CEF, por sus siglas en inglés) primario y no se replica en células humanas. En células humanas, se expresan los genes víricos y no se producen virus infecciosos. El MVA-BN está clasificado como organismo de Nivel 1 de bioseguridad de acuerdo con los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos. Las preparaciones de MVA-BN y derivados se administraron a muchos tipos de animales y a más de 2000 sujetos humanos, que incluyen individuos inmunodeficientes. Se demostró que todas las vacunaciones son generalmente seguras y se toleran bien. A pesar de su alta atenuación y su virulencia reducida, se demostró en estudios preclínicos que el MVA-BN provoca respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares al virus vaccinia y a los productos génicos heterólogos codificados por genes clonados en el genoma de MVA [E. Harrer et al. (2005), Antivir. Ther. 10(2):285-300; A. Cosma et al. (2003), Vaccine 22(1 ):21 -9; M. Di Nicola et al. (2003), Hum. Gene Ther. 14(14):1347-1360; M. Di Nicola et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10(16):5381-5390].
«Derivados» o «variantes» del MVA hacen referencia a virus que exhiben esencialmente las mismas características de replicación que el MVA tal como se describió en la presente memoria, pero que exhiben diferencias en una o más partes de sus genomas. El MVA-BN, así como también un derivado o variante de MVA-BN, no puede replicarse de manera reproductiva in vivo en seres humanos y ratones, incluso en ratones gravemente inmunodeprimidos. Más específicamente, el MVA-BN o un derivado o variante del MVA-BN también tiene, preferiblemente, la capacidad de replicación reproductiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero no tiene la capacidad de replicación reproductiva en la estirpe celular del queratinocito humano HaCat [Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106: 761-771], the human bone osteosarcoma cell line 143B (n.° de depósito ECACC 91112502), the human embryo kidney cell line 293 (n.° de depósito ECACC 85120602), and the human cervix adenocarcinoma cell line HeLa (n.° de depósito ATCC CCL-2). Adicionalmente, un derivado o variante de MVA-BN tiene una relación de multiplicación de virus de al menos 2 veces menos y más preferiblemente, de tres veces menos que el MVA-575 en células Hela y estirpes celulares HaCaT. Se describen las pruebas y el ensayo para determinar estas propiedades de las variantes del MVA en los documentos WO 02/42480 (US 2003/0206926) y WO 03/048184 (US 2006/0159699).
Se describen las expresiones «no capaz de replicación reproductiva» o «sin capacidad de replicación reproductiva», por ejemplo, en el documento WO 02/42480, en que también se indica cómo obtener MVA con las propiedades deseadas tal como se mencionó anteriormente. Las expresiones se aplican a un virus con una relación de multiplicación de virus 4 días después de la infección menor que 1 mediante los ensayos descritos en los documentos WO 02/42480 o en la Patente de EE. UU. n.° 6,761,893.
El término "falla en replicarse reproductivamente" se refiere a un virus que tiene una relación de multiplicación de virus a los 4 días después de la infección menor que 1. Los ensayos descritos en el documento WO 02/42480 o en la Patente de EE. UU. n.° 6,761,893 son aplicables para la determinación de la relación de multiplicación vírica.
Normalmente, la multiplicación o replicación de un virus se expresa como la relación del virus producido a partir de una célula infectada (salida) con respecto a la cantidad usada originalmente para infectar la célula en primer lugar (entrada) y a la que se hace referencia como «relación de multiplicación». Una relación de multiplicación de "1" define un estado de multiplicación en el que la cantidad de virus producida a partir de células infectadas es la misma que la cantidad usada inicialmente para infectar las células, lo que significa que las células infectadas permiten la infección por el virus y la reproducción del virus. Por el contrario, una relación de multiplicación menor que 1, es decir, una disminución en la salida en comparación con la entrada, indica una falta de replicación reproductiva y, por consiguiente, atenuación del virus.
Las ventajas de la vacuna a base de MVA incluyen su perfil de seguridad, así como la disponibilidad para la producción de vacunas a gran escala. Las pruebas preclínicas revelaron que el MVA-BN demuestra una atenuación y eficacia superiores en comparación con otras cepas del MVA WO 02/42480). Una propiedad adicional de las cepas del MVA-BN es la capacidad de inducir sustancialmente el mismo grado de inmunidad en programas de sensibilización del virus vaccinia y de refuerzo del virus vaccinia en comparación con los programas de sensibilización con ADN y refuerzo del virus vaccinia.
Los virus MVA-BN recombinantes, la realización más preferida en la presente memoria, se consideran seguros debido a su distinta deficiencia de replicación en células de mamífero y su avirulencia bien establecida. Asimismo, además de su eficacia, la viabilidad de la producción a escala industrial puede ser beneficiosa. Adicionalmente, las vacunas a base de MVA pueden suministrar múltiples antígenos heterólogos y permiten la inducción simultánea de inmunidad humoral y celular.
Es posible preparar vectores de MVA para la presente invención mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en los documentos WO/2002/042480 y WO/2002/24224.
En otro aspecto, las cepas víricas de MVA incapaces de replicación también pueden ser adecuadas, tales como la cepa MVA-572,<m>VA-575 o cualquier cepa de MVA atenuada de manera similar. También puede ser adecuado un MVA mutante, tal como el virus de Vaccinia Ankara de corioalantoide (dCVA). Un dCVA comprende sitios de eliminación del I, del II, del III, del IV, del V y del VI del genoma del MVA. Los sitios son particularmente útiles para la inserción de múltiples secuencias heterólogas. El dCVA se puede replicar de manera reproductiva (con una relación de multiplicación mayor que 10) en una estirpe celular humana (tal como las estirpes celulares humanas 293, 143B y MRC-5), lo que hace posible la optimización mediante mutación adicional que es útil para una estrategia de vacunación a base de virus (véase, el documento WO 2011/092029).
En la presente memoria se explican vectores de MVA que comprenden un ácido nucleico que codifica una o más proteínas antigénicas seleccionadas del grupo que consiste en GP del virus del Ébola de Zaire (EBOV), GP del virus del Ébola de Sudán (SUDV), GP del virus de Marburgo (MARV), NP del virus del Ébola de Tai Forest y GP o NP sustancialmente similares a estos.
Es posible insertar la proteína de filovirus en una o más regiones intergénicas (IGR) del MVA. En ciertas realizaciones, la IGR se selecciona de IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 y IGR 148/149. En ciertas realizaciones, menos de 5, 4, 3 o 2 IGR del MVA recombinante comprenden secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican determinantes antigénicos de una glucoproteína de envoltura de filovirus y/o una proteína de filovirus adicional. Las secuencias de nucleótidos heterólogas pueden, de manera adicional o alternativa, insertarse en uno o más de los sitios de eliminación de origen natural, en particular, en los sitios de eliminación principales I, II, II, IV, V o VI del genoma de MVA. En ciertas realizaciones, menos de 5, 4, 3 o 2 de los sitios de eliminación de origen natural del MVA recombinante comprenden secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican determinantes antigénicos de una glucoproteína de envoltura de filovirus y/o una proteína de filovirus adicional.
El número de sitios de eliminación de MVA que comprenden secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican determinantes antigénicos de una proteína de filovirus puede ser de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o más. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleótidos heterólogas se insertan en 4, 3, 2 o menos sitios de inserción. Preferiblemente, se usan dos sitios de inserción. En ciertas realizaciones, se usan tres sitios de inserción. Preferiblemente, el MVA recombinante comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes insertados en 2 o 3 sitios de inserción.
Los virus MVA recombinantes explicados en la presente memoria pueden generarse mediante métodos de rutina conocidos en la técnica. Los métodos para obtener poxvirus recombinantes o para insertar secuencias de codificación exógenas en un genoma poxvírico son bien conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, los métodos para técnicas de biología molecular estándar tales como clonación de ADN, aislamiento de ADN y ARN, análisis de transferencia Western, técnicas de multiplicación de RT-PCR y PCR se describen en Molecular Cloning, A laboratory Manual (2.a Ed.) [J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], y se describen técnicas para el manejo y la manipulación de virus en Virology Methods Manual [B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996)]. De manera similar, las técnicas y los conocimientos para el manejo, la manipulación y la ingeniería genética del MVA se describen en Molecular Virology: A Practical Approach [A. J. Davison & R. M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Reino Unido (1993) (véase, por ejemplo, capítulo 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors)] y Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley & Son, Inc. (1998) (véase, por ejemplo, capítulo 16, sección IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)].
Para la generación de los diversos MVA recombinantes explicados en la presente memoria, pueden ser aplicables diferentes métodos. Es posible colocar la secuencia de ADN para insertar en el virus en una construcción de plásmido de E. coli en el que se ha insertado ADN homólogo a una sección de ADN del MVA. Por separado, la secuencia de ADN que se va a insertar puede ligarse a un promotor. El enlace promotor-gen se puede colocar en la construcción de plásmido de forma que el enlace promotor-gen quede flanqueado en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquea una región de ADN de MVA que contiene un locus no esencial. Es posible multiplicar la construcción de plásmido resultante mediante propagación con bacteria E. coli y aislarla. Se puede transfectar el plásmido aislado que contiene la secuencia de gen de ADN que se insertará en un cultivo celular, por ejemplo, de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), al tiempo que se infecta el cultivo con MVA. La recombinación entre el ADN de MVA homólogo en el plásmido y el genoma vírico, respectivamente, puede generar un MVA modificado por la presencia de secuencias de ADN exógenas.
De acuerdo con una realización preferida de la presente explicación, se puede infectar una célula de un cultivo celular adecuado, por ejemplo, tal como células de CEF, con un poxvirus. Posteriormente, es posible transfectar la célula infectada con un primer vector plásmido que comprenda un gen o genes exógenos o heterólogos, preferiblemente, conforme al control transcripcional de un elemento de control de expresión de poxvirus. Como se ha explicado anteriormente, el vector plasmídico también comprende secuencias capaces de dirigir la inserción de la secuencia exógena en una parte seleccionada del genoma poxvírico. Opcionalmente, el vector plasmídico también contiene un casete que comprende un gen de selección y/o marcador enlazado de manera operativa al promotor de poxvirus.
Los genes de selección o marcadores adecuados son, por ejemplo, los genes que codifican la proteína verde fluorescente, p-galactosidasa, neomicin-fosforribosiltransferasa u otros marcadores. El uso de casetes de selección o marcador simplifica la identificación y el aislamiento del poxvirus recombinante generado. Sin embargo, un poxvirus recombinante también puede identificarse mediante tecnología de PCR. Posteriormente, se puede infectar una célula adicional con el poxvirus recombinante obtenido tal como se describió anteriormente y se puede transfectar con un segundo vector que comprenda un segundo gen o genes exógenos o heterólogos. En este caso, se puede introducir este gen en un sitio de inserción diferente del genoma del poxvirus, el segundo vector también difiere en las secuencias homólogas al poxvirus que dirigen la integración del segundo gen o genes exógenos en el genoma del poxvirus. Luego de que ocurre la recombinación homóloga, se puede aislar el virus recombinante que comprende dos o más genes exógenos o heterólogos. Se pueden repetir las etapas de infección y transfección con el virus recombinante aislado en etapas previas para infección y mediante el uso de un vector adicional que comprenda un gen o genes exógenos adicionales para la transfección con el fin de introducir genes exógenos adicionales en el virus recombinante.
De manera alternativa, las etapas de infección y transfección tal como se describieron anteriormente son intercambiables, es decir, se puede transfectar primero una célula adecuada mediante el vector plasmídico que comprende el gen exógeno y, luego, se puede infectar con el poxvirus. Como alternativa adicional, es posible también introducir cada gen exógeno en diferentes virus, coinfectar una célula con todos los virus recombinantes obtenidos y analizar para determinar un virus recombinante que incluya todos los genes exógenos. Una tercera alternativa es la ligadura del genoma de ADN y las secuencias exógenas in vitro y la reconstitución del genoma de ADN del virus vaccinia recombinante con un virus auxiliar. Una cuarta alternativa es la recombinación homóloga en E. coli u otra especie bacteriana entre un genoma del virus vaccinia, tal como MVA, clonado como un cromosoma bacteriano artificial (BAC, por sus siglas en inglés) y una secuencia exógena lineal flanqueada con secuencias de ADN homólogas a secuencias que flanquean el sitio deseado de integración en el genoma del virus vaccinia.
Uno o más promotores de poxvirus pueden controlar el gen de filovirus heterólogo (es decir, pueden estar enlazados de manera operativa). En ciertas realizaciones de la presente explicación, el promotor de poxvirus es un promotor Pr7.5, un promotor híbrido temprano/tardío o un promotor PrS, un promotor PrS5E, un promotor temprano o tardío natural o sintético, o un promotor ATI de virus de viruela vacuna.
Composiciones inmunogénicas
Las composiciones inmunogénicas son composiciones que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de adenovirus o vectores de MVA purificados o parcialmente purificados para su uso como se describe en la presente memoria. Dichas composiciones pueden formularse como una vacuna (también denominada una "composición inmunogénica") de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Dichas composiciones pueden incluir adyuvantes para potenciar las respuestas inmunitarias. Las relaciones óptimas de cada componente en la formulación se pueden determinar mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica en vista de la presente explicación.
La preparación y el uso de composiciones inmunogénicas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Las composiciones explicadas en la presente memoria pueden comprender otros antígenos de filovirus o las inoculaciones de sensibilización o refuerzo pueden comprender otros antígenos. Los otros antígenos usados en combinación con los vectores de adenovirus explicados en la presente memoria no son críticos y pueden ser, por ejemplo, antígenos de filovirus y ácidos nucleicos que los expresan.
Las composiciones inmunogénicas útiles en la presente explicación pueden comprender adyuvantes.
Los adyuvantes adecuados para la administración conjunta de acuerdo con la presente explicación deben ser aquellos que sean potencialmente seguros, bien tolerados y efectivos en personas que incluyen QS-21, Detox-PC, MPL- SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026,GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, Alum y MF59.
Otros adyuvantes que se pueden administrar incluyen lectinas, factores de crecimiento, citocinas y linfocinas tales como alfa-interferón, interferón gamma, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (gCSF), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (gMCSF), factor de necrosis tumoral (TNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-IO e IL-12 o que codifican, por consiguiente, ácidos nucleicos.
Las composiciones explicadas en la presente memoria pueden comprender un excipiente, portador, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material puede depender de la vía de administración, p. Ej., vías intramuscular, subcutánea, oral, intravenosa, cutánea, intramucosal (p. Ej., intestino), intranasal o intraperitoneal.
Inducir inmunidad protectora contra infección por filovirus
La presente invención proporciona una combinación de vacuna, que comprende:
(i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica con SEQ ID NO: 1, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; y
(ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector de MVA que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos de filovirus con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID n O:4, y SEQ iD NO:5, junto con un portador farmacéuticamente aceptable;
para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria protectora contra al menos un subtipo de filovirus, en donde la primera composición se usa para estimular dicha respuesta inmunitaria y la segunda composición se usa para reforzar dicha respuesta inmunitaria, y en donde la segunda composición se administra 1-12 semanas después de la primera composición.
En ciertos aspectos adicionales de la invención, la primera composición comprende además uno o más vectores de adenovirus adicionales que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un segundo subtipo de filovirus. En otras realizaciones, la primera composición comprende adicionalmente uno o más vectores de adenovirus suplementarios que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus.
De acuerdo con la presente invención, se usa un vector de adenovirus para estimular la respuesta inmunitaria, y se usa un vector de MVA para reforzar la respuesta inmunitaria 1-12 semanas después de la vacunación de sensibilización. Las composiciones de refuerzo se administran generalmente semanas o meses después de la administración de la composición de sensibilización, por ejemplo, aproximadamente 1 o 2 semanas o 3 semanas, o 4 semanas, o 6 semanas, u 8 semanas, o 12 semanas, o 16 semanas, o 20 semanas, o 24 semanas, o 28 semanas, o 32 semanas o uno a dos años después de la administración de la composición de sensibilización.
En una realización preferida de la presente invención, el vector de adenovirus explicado en la presente memoria incluye un vector de rAd26 o rAd35. En una realización ejemplar, se usa un vector de rAd26 o rAd35 para estimular la respuesta inmunitaria, y se usa un vector MVA para reforzar la respuesta inmunitaria.
En una realización más preferida, se usa un vector de rAd26 para la sensibilización seguida de un refuerzo con un vector MVA. La composición de refuerzo se administra 1-12 semanas después de la sensibilización, más preferiblemente 1,2, 4 u 8 semanas después de la sensibilización. En una realización preferida, la composición de refuerzo se administra 8 semanas después de la sensibilización. En otra realización preferida, la composición de refuerzo se administra 1 semana después de la sensibilización. En otra realización preferida, la composición de refuerzo se administra 2 semanas después de la sensibilización. En otra realización preferida, la composición de refuerzo se administra 4 semanas después de la sensibilización.
Los antígenos en las respectivas composiciones de sensibilización y refuerzo (sin embargo, se emplean muchas composiciones de refuerzo) no tienen que ser idénticos, sino que deben compartir determinantes antigénicos o ser sustancialmente similares entre sí.
La administración de las composiciones inmunogénicas que comprenden los vectores es típicamente intramuscular o subcutánea. Sin embargo, pueden contemplarse igualmente otros modos de administración tales como administración intravenosa, cutánea, intradérmica o nasal. La administración intramuscular de las composiciones inmunogénicas se puede lograr usando una aguja para inyectar una suspensión del vector de adenovirus. Una alternativa es el uso de un dispositivo de inyección sin aguja para administrar la composición (usando, por ejemplo, Biojector(TM)) o un polvo liofilizado que contenga la vacuna.
Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de afección, el vector estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está exenta de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica son bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactada. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. También se puede emplear una formulación de liberación lenta.
Típicamente, la administración tendrá un objetivo profiláctico para generar una respuesta inmunitaria contra un antígeno de filovirus antes de la infección o el desarrollo de síntomas. Las enfermedades y los trastornos que se pueden tratar o prevenir de acuerdo con la presente invención incluyen aquellos en los que una respuesta inmunitaria puede desempeñar una función protectora o terapéutica. En otras realizaciones, los vectores de adenovirus y MVA se pueden administrar para profilácticos postexposición.
Las composiciones inmunogénicas que contienen los vectores de adenovirus se administran a un sujeto, dando lugar a una respuesta inmunitaria antifilovirus en el sujeto. Una cantidad de una composición suficiente para inducir una respuesta inmunitaria detectable se define como una "dosis inmunológicamente efectiva". Como se muestra a continuación, las composiciones inmunogénicas de la invención inducen una respuesta inmunitaria humoral así como mediada por células. En una realización típica, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.
La cantidad real administrada y la tasa y el período de tiempo de administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo tratado. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosis, etc., es responsabilidad de los médicos generales y de especialistas, o un veterinario en un contexto veterinario, y típicamente tiene en cuenta el trastorno que se tenga que tratar, la afección del paciente concreto, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los profesionales. Ejemplos de las técnicas y los protocolos mencionados anteriormente se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. ed., 1980.
Después de la producción de vectores de adenovirus y MVA y la formulación opcional de tales partículas en composiciones, los vectores se pueden administrar a un individuo, particularmente ser humano u otro primate. La administración puede ser a seres humanos, u otro mamífero, por ejemplo, ratón, rata, hámster, cobaya, conejo, oveja, cabra, cerdo, caballo, vaca, burro, mono, perro o gato. No es necesario que el suministro a un mamífero no humano sea para un fin terapéutico, sino que puede ser para uso en un contexto experimental, por ejemplo, en la investigación de mecanismos de respuestas inmunitarias a los vectores de adenovirus o MVA.
En un programa ejemplar, el vector de adenovirus se administra (por ejemplo, intramuscularmente) en un volumen entre aproximadamente 100 j l y aproximadamente 10 ml que contiene concentraciones de aproximadamente 104 a 1012 partículas de virus por mililitro. Preferiblemente, el vector de adenovirus se administra en un volumen entre 0,25 ml y 1,0 ml. Más preferiblemente, el vector de adenovirus se administra en un volumen de 0,5 ml.
Típicamente, el adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 109 a aproximadamente 1012 partículas víricas (pv) a un sujeto humano durante una administración, más típicamente en una cantidad de aproximadamente 1010 a aproximadamente 1012 pv. En una realización preferida, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 5*101° pv. En otra realización preferida, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 0,8x1010 pv. En otra realización preferida, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 2^1010 pv. En otra realización preferida, el vector de adenovirus se administra en una cantidad de aproximadamente 4^1010 pv. En ciertas realizaciones, los adenovirus se formulan como una composición trivalente, en donde tres adenovirus con cada uno un inserto diferente, se mezclan juntos. En una composición trivalente, cada adenovirus distinto está presente preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 4 x1010 pv. En dicha composición trivalente, el número total de partículas de adenovirus por dosis asciende a aproximadamente 1,2*1011 pv. En otra realización preferida, cada adenovirus distinto en la composición trivalente está presente en una cantidad de aproximadamente<1 ^ 1 0>11 pv. En dicha composición trivalente, el número total de partículas de adenovirus por dosis asciende a aproximadamente 3*1011 pv. La vacunación inicial va seguida de un refuerzo como se ha descrito anteriormente.
En otro programa ejemplar, el vector de MVA se administra (por ejemplo, intramuscularmente) en un volumen entre aproximadamente 100 j l y aproximadamente 10 ml de solución salina que contiene una dosis de aproximadamente 1*107 TCID<50>to 1*109 TCID<50>(dosis infecciosa en cultivo de tejidos al 50 %) o u. inf. (unidad infecciosa). Preferiblemente, el vector de MVA se administra en un volumen entre 0,25 ml y 1,0 ml. Más preferiblemente, el vector de MVA se administra en un volumen de 0,5 ml.
Típicamente, el vector de MVA se administra en una dosis de aproximadamente 1*107 TCID<50>a 1*109 TCID<50>(o u. inf.) a un sujeto humano durante una administración. En una realización preferida, el vector de MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 5*107 TCID<50>a 5*108 TCID<50>(o u. inf.). En una realización preferida más, el vector de MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 5*107 TCID<50>(o u. inf.). En una realización preferida más, el vector de MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 1*108 TCID<50>(o u. inf.). En otra realización preferida, el vector de MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 1,9*108 TCID<50>(o u. inf.). En otra realización preferida más, el vector de MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 4,4*108 TCID<50>(o u. inf.). En una realización preferida más, el vector de MVA se administra en una cantidad de aproximadamente 5*108 TCID<50>(o u. inf.).
La composición, si se desea, puede presentarse en un kit, envase o dispensador, que puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que contengan el ingrediente activo. El kit puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o plástica, tal como un envase de ampollas. El kit, envase o dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración.
Las combinaciones de vacuna como se describe en la presente memoria se pueden administrar solas o en combinación con otros tratamientos, ya sea de manera simultánea o secuencial, dependiendo de la afección que se tenga que tratar.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar la invención.
Ejemplo 1
Se llevó a cabo un estudio en animales con el objetivo de identificar una vacuna de filovirus multivalente con eficacia real >80 % contra filovirus múltiples [por ejemplo, Marburgo, Ébola (aka Zaire) y Sudán] para el desarrollo avanzado continuo. En el estudio se probó un calendario de vacunación extendido usando dos o tres vacunaciones y el impacto del uso de combinaciones de vacunas heterólogas (en oposición a homólogas) en respuestas inmunitarias de NHP posteriores a los filovirus diana. El NHP vacunado se expuso al virus del Ébola Kikwit para probar la eficacia de las vacunas aplicadas.
Manipulaciones de animales
Estos estudios cumplieron con todas las secciones aplicables de las Reglas finales de las regulaciones de la Ley de Bienestar Animal (9 CFR Partes 1, 2 y 3) y Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio -National Academy Press, Washington D.C., octava edición (laGuía).
Un total de 16 macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) (NHP) (12 machos y 4 hembras), macacos cynomolgus de origen mauriciano, de 4 a 5 años de edad, aprox. Se compraron 4-8 kg cada uno de PrimGen (Hines, IL). Los animales fueron experimentalmente sin tratamiento previo al virus Reston (RESTV) por ELISA antes de la vacunación. Se excluyeron los animales con exposición previa a Tuberculosis micobacteriana, el virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV), el virus linfotrópico T de los simios-1 (STLV-1), el herpesvirus de la macacina 1 (virus del herpes B) y el retrovirus de los simios (SRV1 y SRV2). Se probaron infecciones con Salmonella y Shigella y se confirmaron negativas paraTuberculosis micobacteriana.
Los filovirus son patógenos del grupo de riesgo 4 (alta contención); por lo tanto, todas las manipulaciones relacionadas con el virus del ebolavirus del Zaire, el virus del ébola del Sudán o los virus de Marburg se llevaron a cabo en la instalación de contención del Nivel de Bioseguridad (BSL)-4/Nivel de Bioseguridad Animal (ABSL-4) acreditado por CDC.
Materiales de la vacuna
Los vectores rAd fueron fabricados por Crucell Holland BV Son vectores purificados de vacuna de Adenovirus recombinante de replicación deficiente con deleción en E1/E3 de tipo 26 o 35 (Ad26 y Ad35, respectivamente) que contienen los genes de la glicoproteína de Filovirus (GP) insertados en la posición E1. Estos vectores se rescataron en células PER.C6®, se purificaron en placa, se escalaron y a continuación se purificaron mediante un procedimiento de bandas de CsCl de dos pasos y posteriormente se formularon en un tampón de formulación basado en TRIS y se almacenaron por debajo de -65 °C. La liberación para el uso in vivo de estos vectores incluye prueba de carga biológica, bajo nivel de endotoxina (<5EU/ml) y confirmación de la expresión e integridad del transgen.
En particular, los vectores rAd expresaron EBOV Mayinga GP (SEQ ID NO:1), SUDV Gulu GP (SEQ ID NO:2) y MARV Angola GP (SEQ ID NO:3). Cada vector de rAd expresó una única proteína antigénica (GP).
Los vectores MVA fueron fabricados por Bavarian Nordic. En particular, el vector múltiple MVA (MVA-BN-Filo) expresó 4 proteínas antigénicas diferentes: EBOV Mayinga GP (SEQ ID NO:1); SUDV Gulu GP (S<e>Q ID NO:2); MARV Musoke GP (SEQ ID NO: 4); y el virus del bosque de Tai (TAFV) NP (SEQ ID NO:5).
Los materiales de la vacuna se almacenaron a -80 °C en un congelador de temperatura controlada.
Vacunación y diseño experimental.
Vea las Figuras 1 y 2 para la agrupación de estudio y el diseño experimental.
Los macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) (NHP) se vacunaron utilizando dos plataformas de vacuna diferentes, 2 animales por grupo, además de un grupo de control que consiste en dos controles de exposición sin tratamiento previo (vector vacío). Los animales se vacunaron primero con los vectores recombinantes en los grupos que se muestran en la Figura 1. Cada macaco fue anestesiado y recibió una inyección intramuscular (IM) de la vacuna en el muslo posterior izquierdo. Las dosis de sensibilización y refuerzo se administraron con 4 u 8 semanas de diferencia (Fig.1) Cada dosis de adenovirus consistió en una única inyección IM en el muslo posterior izquierdo. Los vectores de MVA se administraron por vía subcutánea.
EDTA o sangre completa con heparina se envió durante la noche a temperatura ambiente a Texas Biomed en D28, D56 y D63. Además, se recogió sangre completa con heparina o EDTA en D77 mientras que los animales se alojaron en Texas Biomed. En todos estos puntos de tiempo, la sangre entera de EDTA se procesará para PBMC y plasma en Texas Biomed.
Se utilizaron PBMC en un ensayo ELISPOT de IFN-g usando los grupos de péptidos Ebola Zaire 1 y 2, los grupos de péptidos Sudán Gulu 1 y 2, un grupo de péptidos consenso de Ebolavirus, el grupo de péptidos Marburg Angola 1 y 2 y un grupo de péptidos de consenso Marburgvirus, junto con un control negativo DMSO único y un control positivo de estimulación anti-CD3. Todas las estimulaciones se realizaron por duplicado, para un total de 20 pocillos por NHP.
Además, se procesó sangre entera sin anticoagulante para suero en Bioqual en D0, D28, D56 y D68, y en D77 en Texas Biomed. Alícuotas del suero recolectado en Bioqual se enviarán congeladas a Texas Biomed en D68. Cada suero se analizó en un ELISA específico para ZEBOV GP. Además, el suero de D0, D56 y D77 se analizó en un SEBOV GP y un ELISA específico de MARVA GP (dos ensayos diferentes).
Tabla 1: Parámetros medidos antes de la exposición al virus Ébola
Inóculo de Filovirus para exposiciones animales
Como se muestra en la Fig. 2, aproximadamente 4 semanas después de la vacunación de refuerzo, los animales fueron expuestos a EBOV. En particular, EBOV kikwit-9510621 se usó para exposiciones animales y fue suministrado por Texas Biomed. Se obtuvo un segundo pasaje de cultivo celular (P2) de EBOV kikwit-9510621 del Dr. Tom Ksiazek (en WRCEVA del NIAID en el Laboratorio Nacional Health Galveston de UTMB) en 2012 y se propagó en Texas Biomed por tercera vez en células Vero E6 y tuvo un título de 2,1 x 105 PFU/ml. EBOV kikwit-9510621. LOT No. 2012099171.
Título en la cosecha: 2,1 x 105 PFU/ml se utilizó para el estudio.
Se confirmó que el stock de exposición era el EBOV kikwit 9510621 de tipo salvaje mediante una secuenciación profunda con solo 1 diferencia de SNP de la secuencia consenso Genbank P2. El stock de exposición se almacenó en fase de vapor de nitrógeno líquido como alícuotas de 500 ± 50 pl que contenían medios (MEM) que contenían 10% de FBS. Para un desafío de 100 PFU, el agente de exposición de filovirus se diluyó a una dosis diana de 200 PFU/ml en solución salina tamponada con fosfato. Brevemente, el virus stock se diluyó mediante tres diluciones consecutivas 1:10 en PBS para lograr una concentración de material de desafío de 200 PFU/ml. Se administró un total de 0,5 ml de material de exposición a cada animal.
Antes de la inyección del virus, los monos se sedaron mediante inyección intramuscular con Telazol (2 a 6 mg/kg; 5 a 8 mg/kg de ketamina IM prn para anestesia suplementaria). En el día de estudio 0, se recogió sangre y cada mono se expuso posteriormente a una dosis específica de 100 UFP de EBOV en un volumen de 0,5 ml mediante inyección intramuscular en el músculo deltoides derecho del brazo. El sitio de exposición fue grabado.
Después de la administración del virus, cada mono fue devuelto a su jaula y observado hasta que se recuperó de la anestesia (reclinación esternal/capacidad de mantener una postura erguida). Los criterios de valoración en este estudio fueron supervivencia/no supervivencia. La no supervivencia se define por un animal que tiene una enfermedad terminal o está moribundo. La salud de los animales se evaluó en una hoja de puntuación de observación clínica diaria.
Anti-EBOV GP IgG ELISA
La respuesta humoral específica de Filovirus se determinó en los puntos temporales descritos en la tabla 1 mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas modificado (ELISA), como se describió previamente en Sulivan y col. (2006) (Protección inmune de primates no humanos contra el virus del Ébola con vectores únicos de adenovirus de dosis baja que codifican GP modificados. PLoS Medicine 3, e177), que se incorpora íntegramente por referencia al presente documento. Brevemente, las placas ELISA se revistieron durante la noche con Galanthus Nivalis Lectin a 10 pg/ml. A continuación, después del bloqueo, las placas se revistieron con un sobrenadante GP específico de la cepa Ebola o Marburg. Estos sobrenadantes se produjeron por transfección transitoria de Hek293T con plásmidos de expresión que codifican la glicoproteína de filovirus eliminada del dominio transmembrana y la cola citoplasmática. Las muestras de suero de mono se analizaron en una serie de dilución de 4 veces a partir de 1:50. La IgG unida se detectó por colorimetría a 492 nm. Los títulos de suero relativos se calcularon frente a un suero de referencia específico de cepa de glicoproteína de filovirus. Los resultados del ensayo de Elisa se muestran en las Figuras 4-6.
Ensayo ELISPOT IFN-g
La respuesta inmune celular específica de Filovirus se determinó en los puntos de tiempo descritos en la tabla 1 mediante el ensayo de inmunospot unido a la enzima interferón gamma (ELISPOT) como se describió anteriormente en Ophorst y col. 2007 (Aumento de la inmunogenicidad de la vacuna recombinante contra la malaria basada en Ad35 a través de la formulación con adyuvante de fosfato de aluminio. Vaccine 25, 6501 6510). Los grupos de péptidos utilizados para la estimulación de cada glicoproteína de la cepa de Ébola y Marburg consisten en 15 mers superpuestos por 11 aminoácidos. Para minimizar los efectos no deseados de un número demasiado elevado de péptidos en un grupo, cada grupo de péptidos de glicoproteína se dividió en dos, una mitad N-terminal y una mitad C-terminal. Los péptidos que se superponen con más de nueve aminoácidos consecutivos dentro de tres Ebolavirus (Zaire, Sudán y Tai Forest) o dos virus de Marburg (virus de Marburg y Ravn) se combinaron en un grupo de consenso. Los grupos de péptidos y péptidos individuales se usaron a una concentración final de 1 pg/ml para cada péptido individual. Los resultados del ensayo ELISPOT se muestran en la Figura 7.
Como se muestra en los resultados resumidos en las Figs. 3-7, el estudio en animales de este documento demostró la utilidad de los vectores rAd y MVA en combinaciones de sensibilización y refuerzo para prevenir infecciones por filovirus en primates. En particular, la administración de uno o más vectores rAd26 que expresan GP(s) de uno o más tipos de filovirus o vectores MVA que expresan múltiples antígenos de filovirus dio como resultado una sensibilización efectiva de la respuesta humoral a uno o más tipos de filovirus. Después de aumentar la inmunización en la semana 8 con el vector heterólogo, todos los regímenes de vacunas indujeron una respuesta inmune humoral y celular similar a uno o más tipos de filovirus y proporcionaron una protección del 100% contra una exposición altamente patógena del ébola de Zaire.
Ejemplo 2
Se realizó un segundo estudio de NHP para confirmar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de 2 regímenes de sensibilización y refuerzo a las semanas 0-4 y a intervalos de 0-8 semanas. Uno que comprende una vacuna monovalente Ad26.ZEBOV como sensibilizante y un MVA-BN-Filo como refuerzo; el otro comprende un MVA-BN-Filo como sensibilizante y un Ad26.ZEBOV como refuerzo. Todas las inmunizaciones fueron intramusculares. Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) se utilizó como sensibilizador para el régimen de 0-8 semanas, y se combinó con un refuerzo de 1x108 TCID<50>de MVA-BN-Filo (4 NHP) y 5x108 TCID<50>MVA-BN-Filo (4 NHP) para evaluar el impacto de un estándar y una dosis alta de MVA en este régimen. Dos grupos adicionales de 4 NHP fueron sensibilizados con 1x108 TCID<50>de MVA-BN-Filo y 5x108 TCID<50>MVA-BN-Filo, respectivamente; en ambos casos seguido de un refuerzo con Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) después de 4 semanas, para evaluar el impacto de la dosis de MVA-BN-Filo como sensibilizador en un régimen de 4 semanas. Además, se sensibilizaron 2 NHP con Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) seguido de 1x108 TCID<50>de MVA-BN-Filo. Finalmente, se inmunizaron 2 NHP con el vector Ad26 vacío (sin expresar ningún antígeno de Filovirus, 5x1010 vp IM) y TBS como control de inmunización negativo para el estudio. Todos los animales fueron expuestos a 4 semanas después de la última inmunización con 100 pfu de virus de exposición P3 de tipo salvaje EBOV KBOwit 1995. La agrupación de este estudio se resume en 2.
Tabla 2: Estudio experimental de agrupación de protección en primates no humanos expuestos a EBOV
Grupo Inmunización 1 Inmunización 2 Programa de Exposición Relación de (Dosis 1) (Dosis 2) inmunización después de 4 supervivencia (semanas) semanas (%) 1/A Ad26.empty Control negativo 0-8 EBOV (Kikwit) 0/2 (0%) (5x1010 vp) de MVA (TBS)
2/B Ad26.ZEBOV MVA-BN-Filo 0-8 EBOV (Kikwit) 4/4 (100%) (5*1010 vp) (5*108 TCID<50>)
3/C MVA-BN-Filo Ad26.ZEBOV 4-8 EBOV (Kikwit) 2/4 (50%) (5*108 TCID<50>) (5*1010 vp)
4/D Ad26.ZEBOV MVA-BN-Filo 0-8 EBOV (Kikwit) 4/4 (100%) (5*1010 vp) (1*108 TCID<50>)
5/E MVA-BN-Filo Ad26.ZEBOV 4-8 EBOV (Kikwit) 2/4 (50%) (1*108 TCID<50>) (5*1010 vp)
6/F Ad26.ZEBOV MVA-BN-Filo 4-8 EBOV (Kikwit) 2/2 (100%) (5*1010 vp) (1*108 TCID<50>)
Abreviaturas: TBS: Solución salina tamponada con tris; TCID<50>: Dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50%; vp: partículas virales. 100% de supervivencia están en negrita._____________________________
Inmunogenicidad
La respuesta inmune en NHP se caracteriza con respecto a los anticuerpos neutralizantes y de unión a Filovirus GP (ELISA), así como a las células T productoras de citocinas (ELISpot).
ELISA:
Los anticuerpos reactivos EBOV Mayinga GP se analizaron mediante ELISA específico de GP para todos los puntos de tiempo (véase la Figura 20).
El ELISA anti-EBOV GP IgG se realizó como se describe en el experimento 1. No se observaron títulos de ELISA en animales vacunados con control. Los regímenes de vacuna fueron inmunogénicos en todos los animales. Los títulos más altos se observaron en el Grupo B, recibiendo Ad26.ZEBOV y una dosis alta de MVA-BN-Filo con un intervalo de 8 semanas.
Eficacia protectora
Ambos regímenes de sensibilización y refuerzo Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo de 8 semanas resultaron en una supervivencia completa después de la exposición a EBOV, independientemente de la dosis de MVA-BN-Filo (1 x io 8 TCID<50>o 5*108 TCID<50>). Además, un régimen de 4 semanas de Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo dio protección en 2 de los 2 NHP. Ambos regímenes de 4 semanas de MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV brindaron protección en 2 de los 4 NHP.
Ejemplo 3
Se realiza un estudio clínico en humanos para evaluar la seguridad, tolerabilidad e inmunogenicidad de los regímenes que utilizan MVA-BN-Filo a una dosis de 1x108 TCID<50>y Ad26.ZEBOV a una dosis de 5x1010 vp. El estudio consiste en dos partes.
El estudio principal es un estudio aleatorizado, controlado con placebo, ciego observador que se realiza en 72 sujetos adultos sanos que nunca antes recibieron una vacuna experimental contra el Ébola y que no tienen una exposición conocida al virus del Ébola o el diagnóstico de la enfermedad del Ébola. En este estudio se prueban 4 regímenes: 2 regímenes tienen MVA-BN-Filo como sensibilizador y Ad26.ZEBOV como refuerzo en un intervalo de 28 o 56 días, y 2 regímenes tienen Ad26.ZEBOV como sensibilizador y MVA-BN-Filo como refuerzo en un intervalo de 28 o 56 días.
El subestudio consiste en un brazo de tratamiento abierto, no controlado, no aleatorio que evalúa la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de un régimen con Ad26.ZEBOV a una dosis de 5x1010 vp como sensibilizador y MVA-BN-Filo en una dosis de 1x108 TCID<50>como refuerzo 14 días después, y se realiza en 15 sujetos adultos sanos.
El estudio consiste en un período de vacunación en el que los sujetos se vacunan al inicio del estudio (día 1) seguido de un refuerzo el día 15, 29 o 57, y un seguimiento posterior al refuerzo hasta que todos los sujetos hayan tenido su visita de refuerzo posterior de 21 días (día 36, 50 o 78) o interrumpido antes.
Los sujetos en el estudio principal se inscribieron en 4 grupos diferentes de 18 sujetos sanos cada uno. En general, los sujetos se asignan al azar dentro de un grupo en una proporción de 5:1 para recibir la vacuna activa o placebo (solución salina al 0,9%) a través de inyecciones IM (0,5 ml) de la siguiente manera:
• MVA-BN-Filo (1x108 TCID<50>) en el día 1, seguido por un refuerzo de Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) en el día 29 (Grupo 1) o día 57 (Grupo 2), o
• Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) en el día 1, seguido por un refuerzo de MVA-BN-Filo (1x108 TCID<50>) en el día 29 (Grupo 3) o día 57 (Grupo 4).
Los 15 sujetos en el subestudio reciben la vacuna activa a través de inyecciones IM (0,5 ml) de la siguiente manera:
• Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) en el día 1, seguido por un refuerzo de MVA-BN-Filo (1x108 TCID<50>) en el día 15 (Grupo 5).
Los ejemplos de programas de vacunación del estudio se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3: Programas de vacunación del estudio
La seguridad se evalúa mediante la recopilación de eventos adversos locales y sistémicos solicitados, eventos adversos no solicitados y eventos adversos graves, y mediante un examen físico. Además, la química estándar, los parámetros hematológicos (incluidos los parámetros de coagulación) y el análisis de orina se evalúan en múltiples puntos de tiempo.
La inmunogenicidad se evalúa utilizando los ensayos inmunológicos resumidos en las Tablas 4 y 5. El paquete de ensayos exploratorios puede incluir, entre otros, los ensayos enumerados.
Tabla 4: Resumen de ensayos inmunológicos (Serología)
Ensayo Propósito
Criterios de valoración secundarios
Ensayo de neutralización de virus Análisis de anticuerpos neutralizantes para EBOV GP ELISA Análisis de anticuerpos que se unen a EBOV GPCriterios de valoración exploratorios
Ensayo de neutralización de adenovirus/MVA Anticuerpos neutralizantes contra adenovirus/MVA Caracterización de anticuerpos moleculares. Análisis de las características de anticuerpos anti-EBOV GP, SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP, incluida la subtipificación de IgG
ELISA exploratorio Análisis de anticuerpos de unión a una fuente diferente de _________________________________________ GP EBOV___________________________________________ EBOV: Virus del Ébola; ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; GP: glicoproteína; IgG: inmunoglobulina G; MARV: Virus de Marburg; MVA: Vaccinia Ankara modificada; NP: nucleoproteína; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque Tai
Tabla 5: Resumen de ensayos inmunológicos (celular)
Ensayo Propósito
Criterios de valoración secundarios
ELISpot Respuestas de IFN-y de células T a EBOV GPCriterios de valoración exploratorios
ICS de PBMC congelados Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP,
SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP (incluidos CD4/8, IL-2, IFN-y, TNF-a y/o marcadores de activación)
ICS y/o ELISpot de PBMC fresco Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP, incluidas las respuestas de células T positivas para CD4 y de baja magnitud
EBOV: Virus del Ébola; ELISpot: inmunospot ligado a enzimas; GP: glicoproteína; ICS: tinción intracelular de citocinas; IFN: interferón; IL: interleucina; MARV: Virus de Marburg; NP: nucleoproteína; PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque de Tai; TNF: factor de necrosis tumoral
El estudio clínico está en curso. Algunos de los resultados iniciales se describen a continuación.
Evaluación de seguridad
La seguridad se evaluó mediante la recopilación de eventos adversos locales y sistémicos solicitados, eventos adversos no solicitados y eventos adversos graves, y mediante un examen físico. Además, la química estándar, los parámetros hematológicos (incluidos los parámetros de coagulación) y el análisis de orina se evaluaron en múltiples puntos de tiempo.
Los datos de seguridad de este primero en humanos mostraron que ambas vacunas parecen ser bien toleradas en esta etapa con reacciones transitorias que normalmente se esperan de la vacunación. No se asociaron eventos adversos significativos con el régimen de vacuna. La mayoría de los eventos fueron leves, ocurrieron uno o dos días después de la vacunación y duraron uno o dos días en promedio. Se observaron muy pocos casos de fiebre.
Evaluación de la respuesta inmune.
La inmunogenicidad se evaluó hasta 21 días después de la inmunización de refuerzo utilizando un ensayo ELISA para analizar los anticuerpos que se unen a EBOV GP, un ensayo ELISpot para analizar una respuesta de células T específicas de EBOv GP y ensayos ICS para detectar respuestas de células T CD4+ y CD8+ a EBOV GP. Se recogieron muestras para el análisis de la respuesta inmune humoral y celular inducida por las vacunas del estudio los días 1, 8, 29, 36 y 50 en los grupos 1 y 3 y en los días 1, 8, 29, 57, 64 y 78 para los grupos 2 y 4.
Evaluación de la respuesta inmune humoral
Las respuestas de anticuerpos de unión inducidas por las vacunas del estudio se evaluaron mediante un ensayo ELISA de GP anti-EBOV (Fig. 8). Es importante destacar que todos los sujetos que recibieron un régimen de vacuna mostraron seroconversión a los 21 días después de la inmunización de refuerzo. Se ha observado una respuesta inmunogénica robusta en todos los sujetos inmunizados.
Mientras que la respuesta inmune específica de EBOV GP posterior a la sensibilización con MVA-BN-Filo solo se observó a niveles bajos en 7 a 40% de los sujetos, se observó una fuerte respuesta específica de antígeno después del refuerzo con Ad26.ZEBOV administrado a los 28 días o 56 días después del refuerzo. Sorpresivamente, esta respuesta es de mayor magnitud que la inducida por el régimen de vacunación inversa en el mismo intervalo de tiempo de sensibilización y refuerzo (Grupo 3 y Grupo 4, sensibilización Ad26.ZEBOV seguido de refuerzo MVA-BN-Filo 28 o 56 días después) respectivamente) a los 21 días después de la inmunización de refuerzo [Título medio geométrico con un intervalo de confianza del 95% de EU/mL 10573 (6452; 17327) y 4274 (2350; 7775) para los grupos 1 y 3 respectivamente, y 18729 (12200; 28751) y 7553 (511; 1115) para los grupos 2 y 4, respectivamente].
Cabe señalar que en los primates no humanos (NHP), reforzar una sensibilización de MVA con Ad26 había resultado en una respuesta inmune específica de GP de EBOV que era similar en magnitud a la inducida por el régimen de vacuna inversa (Ad/MVA), al mismo intervalo de tiempo de sensibilización y refuerzo (ver Fig. 4) o que fue inferior en magnitud (Fig. 20). Por lo tanto, las respuestas inmunes observadas para un régimen específico de sensibilización y refuerzo en NHP no fueron predictivas para las respuestas inmunes observadas siguiendo ese mismo régimen de sensibilización y refuerzo en humanos.
Evaluación de la respuesta inmune celular.
La respuesta inmune celular específica de GP de EBOV se midió por interferón gamma (IFN-y) ELISpot e ICS. Para evaluar la respuesta inmune celular, las PBMC almacenadas (células mononucleares de sangre periférica) se descongelaron y se estimularon con péptidos organizados en 2 grupos (Grupos 1 y 2). La suma de las respuestas de células T estimuladas por grupo se muestra en la Figura 9.
Mediante el análisis ELISpot (Fig. 9), se pudo detectar fácilmente una respuesta de IFN-y en el 50 al 60% de los sujetos en el día 29 después de la inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV (respuesta media de IFN-y 103 y 58 puntos formando unidades por millón PBMC para el Grupo 3 y 4, respectivamente) y en el 86% de los sujetos en el día 57 después de la inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV (Grupo 4, respuesta media de IFN-y 283 puntos formando unidades por millón (SFU/106) PBMC). Estas respuestas aumentaron aún más mediante la inmunización el día 29 o el día 57 con MVA-BN-Filo (87% de respondedores, respuesta media de IFN-<y>463 SFU/106 PBMC para el Grupo 3, 86% de respondedores, 648 S<f>U/106 PBMC para el Grupo 4) y se mantuvo en ese nivel hasta el día 21 después del refuerzo (79% de respondedores, respuesta media IFN-y 390 SFU/106 PBMC para el Grupo 3 y 100% de respondedores, 464 SFU/106 PBMC para el Grupo 4).
Los resultados para los ensayos celulares que miden las respuestas específicas de células T CD4+ y CD8+ por ICS se muestran en las Figuras 10-15.
Como se esperaba, no se observó respuesta de células T CD8+ o CD4+ específicas a GP de EBOV en individuos inmunizados con placebo (Figs. 10 y 13). No se observaron respuestas de citocinas CD8+ el día 29 o el día 57 después de la inmunización de sensibilización con MVA-BN-Filo (Grupo 1 y 2). Sin embargo, se observó una respuesta de células T CD8+ inducida por la vacuna en el 53% de los sujetos 7 días después del refuerzo con Ad26.ZEBOV (mediana de respuesta total de citocinas: 0,08% y 0,07%, cuando Ad26 aumenta la inmunización administrada el día 29 o el día 57, respectivamente; Fig.10). Esta respuesta se mantuvo el día 21 después de la vacunación de refuerzo (mediana de respuesta total de citocina: 0,1% y 0,06%, cuando Ad26 aumenta la inmunización administrada el día 29 o el día 57, respectivamente; Fig.10). En comparación, el 57% de los sujetos que recibieron una inmunización primaria con Ad26.ZEBOV (Grupo 3 y Grupo 4) mostraron en el día 29 una respuesta de células T CD8+ (mediana de respuesta total de citocina: 0,12 y 0,05%, respectivamente), el 86% de los sujetos en el día 57 después de la inmunización de sensibilización Ad26.ZEBOV (Grupo 4) mostró una respuesta de células T CD8+ (respuesta media total de citocina: 0,19%). Esta respuesta se mejoró aún más después de la inmunización de refuerzo con MVA-BN-Filo en el día 29, con un 67% y un 73% de sujetos que respondieron 7 y 21 días después del refuerzo, respectivamente (respuesta media: 0,27% en ambos días).
Sorpresivamente, aunque se observó un porcentaje menor de respondedores en el Grupo 1 (programa de 0 28 días de sensibilización y refuerzo MVA-Ad26) en comparación con el Grupo 3 (programa de 0-28 días de sensibilización y refuerzo Ad26-MVA), la proporción de células T CD8+ polifuncionales (células T CD8+ que expresan más de una citocina) inducida por el régimen de sensibilización y refuerzo MVA-Ad26 en estos respondedores fue mayor después del refuerzo que la inducida por el régimen de sensibilización y refuerzo Ad26-MVA (Fig. 11) Esta diferencia no se observó cuando el sensibilizador y el refuerzo se administraron en el día 57. Usando este programa, tanto los regímenes de sensibilización MVA refuerzo Ad26 (Grupo 2) sensibilización Ad26 refuerzo MVA (Grupo 4) indujeron una proporción similar alta de células T CD8+ polifuncionales (Fig. 12).
Sorpresivamente, la inmunización de sensibilización con MVA-BN-Filo seguida de un refuerzo con Ad26.ZEBOV administrado en un intervalo de 28 días (Grupo 1) indujo una respuesta muy fuerte de células T CD4+ que alcanzó un máximo a los 7 días después de la inmunización de refuerzo (93% de respondedores, mediana de respuesta total de citocina 0,37%; Fig. 13). En el pico, esta respuesta de células T CD4+ fue de una magnitud mayor que la observada en el Grupo 3 después de la inmunización de sensibilización con Ad26.ZEBOV seguido de un refuerzo de MVA-BN-Filo en un intervalo de 28 días (67% de respondedores, mediana de respuesta total de citocinas 0,11 %) 21 días después del refuerzo, las respuestas de células T CD4+ inducidas por ambos regímenes fueron similares. Extender el intervalo del régimen MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV a 56 días dio como resultado respuestas de células T CD4+ más bajas. El régimen Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo indujo respuestas de células T CD4+ ligeramente más bajas en un intervalo de 28 días y respuestas similares en un intervalo de 56 días. Las células T CD4+ inducidas por ambas combinaciones de vacunas fueron predominantemente polifuncionales (Fig. 14 y 15).
A continuación, se resumen los resultados del subestudio que evalúa la inmunogenicidad de una sensibilización con Ad26.ZEBOV a 5x1010 vp seguido de un refuerzo 14 días después usando 1x108 TCID<50>de MVA-BN-Filo.
En general, se ha demostrado que este régimen relativamente corto que utiliza un intervalo de 14 días entre el sensibilizador y el refuerzo es inmunogénico. La respuesta inmune humoral a las vacunas se evaluó mediante ELISA. Como se observó durante intervalos más largos, todos los sujetos seroconvirtieron 21 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 16A). Además, ELISpot observó una respuesta inmune celular en el 92% de los sujetos 21 días después de la inmunización de refuerzo (Figura 16B). Esta respuesta inmune celular consistió en células T CD4+ (67% de respondedores, respuesta media 0,08% en el día 21 después del refuerzo) y CD8+ (64% de respondedores, respuesta media 0,15% en el día 7 después del refuerzo). La respuesta inmune inducida usando un intervalo de 2 semanas pareció algo menor que la respuesta inducida cuando se usaron intervalos más largos entre sensibilización y refuerzo (consulte la sección anterior).
Ejemplo 4
Se realiza un estudio aleatorizado, controlado con placebo, observador ciego (precedido por una vacunación inicial abierta de un total de 6 sujetos de estudio centinela) para evaluar la seguridad, tolerabilidad e inmunogenicidad de un régimen heterólogo de (a) una dosis única de MVA-BN-Filo (1x108 TCID<50>) o placebo (solución salina al 0,9%) como sensibilizador seguido de una dosis única de Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) o placebo como refuerzo en diferentes momentos (14, 28 o 56 días después de la sensibilización; Grupos 1 a 3) y (b) una dosis única de Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) o placebo como sensibilizador seguido de una dosis única de MVA-BN-Filo (1x108 TCID<50>) o placebo como refuerzo a los 28 días después del sensibilizador (Grupo 4).
Con el fin de evaluar la seguridad de las 2 vacunas de forma independiente, se incluyen los grupos 5 y 6 donde los regímenes homólogos de 2 dosis únicas de MVA-BN-Filo (1x108 TCID<50>) o placebo, o 2 dosis únicas de Ad26.ZEBOV (5x1010 vp) o placebo se administran con el programa de sensibilización y refuerzo más corto de 1 y 15 días. Este estudio se lleva a cabo en un objetivo de aproximadamente 92 sujetos sanos, con edades comprendidas entre 18 y 50 años (inclusive) que nunca antes habían recibido una vacuna experimental contra el Ébola y que no tienen una exposición o diagnóstico conocidos de la enfermedad del Ébola.
El estudio consiste en un período de vacunación en el que los sujetos se vacunan en su visita inicial (Día 1) seguido de un refuerzo el día 15, 29 o 57, y un período de seguimiento posterior al refuerzo hasta que todos los sujetos hayan tenido su visita de refuerzo posterior de 21 días, o interrumpido antes. En ese momento, el estudio no será ciego.
Los sujetos se inscriben en 6 grupos diferentes, que comprenden 18 (Grupos 1 a 4) o 10 (Grupos 5 y 6) sujetos sanos cada uno. Dentro de los Grupos 1 a 4, los sujetos se asignan al azar en una proporción de 5:1 para recibir la vacuna activa o placebo durante todo el estudio. Los grupos 5 y 6 comienzan cada uno con una cohorte Sentinel de 3 sujetos que reciben la vacuna activa de forma abierta, seguidos de una cohorte ciega de 7 sujetos, que se asignan al azar en una proporción de 6:1 para recibir la vacuna activa o placebo. Los programas de vacunación del estudio en los diferentes grupos se resumen en la Tabla 6.
La seguridad se evalúa mediante la recopilación de eventos adversos locales y sistémicos solicitados, eventos adversos no solicitados y eventos adversos graves, y mediante un examen físico. Además, la química estándar, los parámetros hematológicos (incluidos los parámetros de coagulación) y el análisis de orina se evalúan en múltiples puntos de tiempo.
La inmunogenicidad se evalúa utilizando los ensayos inmunológicos resumidos en las Tablas 7 y 8. El paquete de ensayos exploratorios puede incluir, entre otros, los ensayos enumerados.
Tabla 6: Programas de vacunación del estudio
Grupo N n Día 1 Día 15 Día 29 Día 57
1 18<15 MVA-BN-Filo Ad26.ZEBOV>
3 Placebo Placebo
2 18<15 MVA-BN-Filo Ad26.ZEBOV>
3 Placebo Placebo
3 18<15 MVA-BN-Filo Ad26.ZEBOV>3 Placebo Placebo
4 18<15 Ad26.ZEBOV MVA-BN-Filo>
3 Placebo Placebo
3MVA-BN-Filo MVA-BN-Filo
(centinela) (centinela)
5 10
6 MVA-BN-Filo MVA-BN-Filo
1 Placebo Placebo
3Ad26.ZEBOV Ad26.ZEBOV
(centinela) (centinela)
6 10
6 Ad26.ZEBOV Ad26.ZEBOV
1 Placebo Placebo
N: número de sujetos que recibirán la vacuna del estudio
El nivel de dosis de MVA-BN-Filo es 1x108 TCID<50>(Dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50%) en todos los grupos; El nivel de dosis de Ad26.ZEBOV es 5x1010 vp (partículas virales) en todos los grupos; el placebo es solución salina al 0,9%_____________________________________________________________________
Tabla 7: Resumen de ensayos inmunológicos (serología) ____________________________________________________________________________________________ Ensayo__________________________________Propósito__________________________________________Criterios de valoración secundarios
Ensayo de neutralización de virus Análisis de anticuerpos neutralizantes para EBOV GP ELISA__________________________________ Análisis de anticuerpos que se unen a EBOV GP_________Criterios de valoración exploratorios
Ensayo de neutralización de Anticuerpos neutralizantes contra adenovirus/MVA adenovirus/MVA
Caracterización de anticuerpos moleculares. Análisis de las características de anticuerpos anti-EBOV GP, SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP, incluida la subtipificación de IgG
ELISA exploratorio Análisis de anticuerpos de unión a una fuente diferente de _________________________________________ GP EBOV__________________________________________ EBOV: Virus del Ébola; ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; GP: glicoproteína; IgG: inmunoglobulina G; MARV: Virus de Marburg; MVA: Vaccinia Ankara modificada; NP: nucleoproteína; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque Tai_______________________________________________
Tabla 8: Resumen de ensayos inmunológicos (celular)
Ensayo__________________________________Propósito__________________________________________Criterios de valoración secundarios
ELISpot Respuestas de IFN-y de células T a EBOV GPCriterios de valoración exploratorios
ICS de PBMC congelados Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP,
SUDV GP, MARV GP y/o TAFV NP (incluidos CD4/8, IL-2, IFN-y, TNF-a y/o marcadores de activación)
ICS y/o ELISpot de PBMC fresco Análisis de las respuestas de las células T a EBOV GP, ________________________________________ incluidas las respuestas de células T positivas para CD4 y Ensayo__________________________________Propósito___________________________________________ ________________________________________ de baja magnitud____________________________________ EBOV: Virus del Ebola; ELISpot: inmunospot ligado a enzimas; GP: glicoproteína; ICS: tinción intracelular de citocinas; IFN: interferón; IL: interleucina; MARV: Virus de Marburg; NP: nucleoproteína; PBMC: células mononucleares de sangre periférica; SUDV: Virus de Sudán; TAFV: Virus del bosque de Tai; TNF: factor de necrosis tumoral
El estudio clínico está en curso. Algunos de los resultados iniciales se describen a continuación.
Evaluación de la respuesta inmune humoral
Los resultados iniciales confirman la inmunogenicidad de la combinación de Ad26.ZEBOV a 5x1010 vp y MVA-BN-Filo a 1x108 TCID<50>cuando cualquiera de las vacunas se usa como sensibilizador y la otra como refuerzo.
Como se muestra en la Figura 17, todos los sujetos seroconvirtieron 21 días después de la inmunización de refuerzo cuando se evaluaron mediante ELISA. Similar a los experimentos anteriores, se observó una mayor respuesta inmune a los 21 días después de la inmunización de refuerzo cuando se usó MVA como sensibilizador y se administró Ad26 como refuerzo 28 días después (Grupo 2, Concentración media geométrica de EU/mL 6987) en comparación con el orden inverso de la inmunización de la vacuna (Grupo 4, Concentración media geométrica de EU/mL 2976).
La fuerza de la respuesta inmune humoral se correlacionó con el intervalo entre la sensibilización y el refuerzo, con mayores concentraciones de anticuerpos observadas cuando se usa un intervalo de 56 días entre la sensibilización MVA y el refuerzo Ad26 (grupo 3, Concentración media geométrica de EU/mL 14048) en comparación con un programa más corto (grupo 1, intervalo de 14 días, concentración media geométrica de EU/mL 4418 y grupo 2, intervalo de 28 días, concentración media geométrica de EU/mL 6987).
Sorpresivamente, se observó una respuesta inmune humoral robusta según lo evaluado por ELISA cuando se usó MVA-BN-Filo como sensibilizador y seguido de una inmunización de refuerzo con Ad26.ZEBOV 14 días después. Todos los sujetos que recibieron el régimen de vacuna seroconvirtieron 21 días después de la inmunización de refuerzo, y la concentración de anticuerpos en este punto de tiempo alcanzó niveles similares o más altos que cuando se usó la combinación de sensibilización Ad26 y refuerzo MVA a intervalos de 28 días (Título medio geométrico de EU/mL 4418 y 2976, respectivamente). Sorpresivamente, las concentraciones de anticuerpos inducidas por esta combinación de sensibilización y refuerzo MVA/Ad26 a intervalos de 14 días fueron sorprendentemente más altas que la respuesta inducida por el régimen de vacuna inversa en el mismo intervalo de tiempo de sensibilización y refuerzo (consulte el ejemplo 2, figura 16A, Concentración media geométrica de EU/mL 915). Esto confirma la inducción de una respuesta inmune robusta por parte de una combinación de una sensibilización MVA y refuerzo Ad26 y la ventaja de dicha combinación cuando se usa un intervalo de sensibilización y refuerzo corto (14 días).
Evaluación de la respuesta inmune celular.
La respuesta inmune celular específica de GP de EBOV se midió por interferón gamma (IFN-y) ELISpot e ICS. Para evaluar la respuesta inmune celular, las PBMC almacenadas (células mononucleares de sangre periférica) se descongelaron y se estimularon con péptidos organizados en 2 grupos (Grupos 1 y 2). La suma de las respuestas de células T estimuladas por grupo se muestra en las Figuras 18-19.
El análisis ELISpot (Fig. 18) confirmó la inducción de una respuesta IFN-<y>utilizando tanto sensibilización Ad26.ZEBOV seguido de refuerzo MVA-BN-Filo o el régimen de vacuna inversa. Para todos los estudios de intervalo de sensibilización y refuerzo, la respuesta celular mejoró después de la inmunización de refuerzo. La respuesta de IFN-y fue más alta cuando se usó Ad26 como sensibilizador seguido de MVA como refuerzo 28 días después (87% de respondedores, respuesta mediana de IFN-<y>687 y 600 SFU/106 PBMC para el Grupo 4 en el día 7 y el día 21 después del refuerzo, respectivamente). Sorpresivamente, cuando se usa MVA-BN-Filo como sensibilizador seguido de Ad26.ZEBOV como refuerzo, se observó una respuesta IFN-<y>más fuerte cuando se usa un intervalo más corto de 14 días entre sensibilización y refuerzo (87 y 93% de respondedores, 395 y 577 SFU/106 PBMC para el Grupo 1 en el día 7 y 21 después del refuerzo, respectivamente) en comparación con la respuesta inducida por un intervalo de 28 días (Grupo 2, 73 y 67% de respondedores, respuesta mediana de IFN-<y>427 y 375 SFU/106 PBMC para el día 7 y el día 21 después del refuerzo) o 56 días (Grupo 3, 47% respondedores, respuesta mediana de IFN-y 118 y 153 SFU/106 PBMC para el día 7 y el día 21 después del refuerzo).
Digno de mencionarse, la respuesta inmune celular inducida por el sensibilizador MVA-BN-Filo y refuerzo Ad26.ZEBOV en un intervalo de 14 días estuvo bien equilibrada con la respuesta de células T CD8+ y CD4+ específicas a GP EBOV (73% de respondedores para células T CD4+ y CD8+, mediana de respuesta total a citocinas CD4+ 0,15 y 0,19% en el día 7 y 21 después del refuerzo, respectivamente; mediana de respuesta total a citocina CD8+ 0,19 y 0,34% en el día 7 y 21 después del refuerzo, respectivamente; Fig. 19A y B). Las células T CD8+ y CD4+ inducidas por esta combinación de vacunas fueron predominantemente polifuncionales (Fig. 19C y D).
Las siguientes tablas 9-12 se presentan como resúmenes de los estudios clínicos presentados en la presente invención. Los estudios presentados en los ejemplos 3 y 4 son estudios numerados 1001 y 1002 respectivamente.
La Tabla 9 es un resumen de las respuestas inmunes humorales según lo determinado en los ensayos ELISA durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.
Tabla 9: Resumen de títulos de ELISA en estudios clínicos
Día del Ad26MIVA MVAAd26 MVAAd26 MVAAd26 MVAAd26 estudio 0,14 0,14 0, 28 0, 28 0, 56
Estudio 1001 1001 1002 1001 1002 1001 1002 1001
d8 22 (13) 18 (0) 20 (7) 22 (0) 19 (7) 18 (0) 22 (0) 21(0)
dl5 164 (79)* 22 (13)* - -
d22 298 (83) 293 (87) - -
d29 - 533 (93)* 477 (100)* 582 (100) - 36 (40)* 55 (47)* 22 (7)
d36 915 (100)<4418>
(100)269 (80) 1025 (93) -
d50 - -<10573>
(100)6987 (100) -
d57 - - - 854 (100)* - - - 21 (7)*
d64 - 568 (100)
d78- - -7553 (100)- - -<1>
M<8>n<7>n<29>\
Los datos se presentan como concentración media geométrica (GMC) en ELISA por mL. El porcentaje de respondedores en cada momento se indica entre paréntesis; Ad26: Inmunización con Ad.26.ZEBOV; MVA: Inmunización con MVA-BN-Filo; El programa de sensibilización y refuerzo se indica en los encabezados. 0,14: intervalo de 14 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 28: intervalo de 28 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 56: intervalo de 56 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; *: día de refuerzo; GMC: Concentración media geométrica. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4.
La Tabla 10 es un resumen de las respuestas inmunes celulares como se determina en los ensayos ELISpot durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.
Tabla 10: Descripción general de las respuestas inmunes celulares en estudios clínicos según lo determinado por ELISpot
Día del Ad26MVA 0, MVAAd26 0, 28 estudio 56
Estudio 1001 1001
d8 25 (13) 25 (7) 25 (7) 25 (13) 25 (0) 25 (0)
d15 113 (79)* - - 52 (20)* - -
d22 - -
d29 58 (50) 25 (7)*
d36 203 (92) 463 (87) - 552 (100) 882 (93) -
d50 - 390 (79) - - 455 (73) -
d57 243 (86)* -d64 648 (86) -
d78 464 (100)
Los datos se representan como mediana SFU / 106 PBMC. El porcentaje de respondedores en cada momento se indica entre paréntesis; Ad26: Inmunización con Ad.26.ZEBOV; m VA: Inmunización con MVA-BN-Filo; El programa de sensibilización y refuerzo se indica en los encabezados. 0, 14: intervalo de 14 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 28: intervalo de 28 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; 0, 56: intervalo de 56 días entre las inmunizaciones de sensibilización y refuerzo; *: día de refuerzo; SFU: Unidades formadoras de puntos; PBMC: Células mononucleares de sangre periférica. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4. El estudio 1001 se describió en el ejemplo 3 y el estudio 1002 se describió en el ejemplo 4.
La Tabla 11 es un resumen de las respuestas de células T CD4+ según lo determinado por la tinción intracelular de citocinas (ICS) durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.
Tabla 11: Descripción general de la respuesta inmune de células T CD4+ medida por ICS en estudios clínicos
La Tabla 12 es un resumen de las respuestas de células T CD8+ según lo determinado por la tinción intracelular de citocinas (ICS) durante los estudios como se describe en los ejemplos 3 y 4.
Tabla 12: Descripción general de la respuesta inmune de células T CD8+ medida por ICS en estudios clínicos
Claims (7)
1. Una combinación de vacuna que comprende
(i) una primera composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que tiene SEQ ID NO:1, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; y
(ii) una segunda composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un vector de MVA que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas antigénicas de cuatro subtipos de filovirus que tienen S<e>Q ID N<o>:1, SEQ ID NO:2, SEQ<i>D NO:4, y<s>E<q>ID NO:5, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; para generar una respuesta inmunitaria protectora contra al menos un subtipo de filovirus, en donde la primera composición se utiliza para cebar dicha respuesta inmunitaria y la segunda composición se utiliza para reforzar dicha respuesta inmunitaria, y en donde la segunda composición se administra entre 1-12 semanas después de la primera composición.
2. Una combinación de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en donde la primera composición (i) comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un segundo subtipo de filovirus.
3. Una combinación de vacuna para su uso según la reivindicación 2, en donde la primera composición (i) comprende además un vector de adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica de un tercer subtipo de filovirus.
4. Una combinación de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en donde el vector de adenovirus en la primera composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que tiene SEQ ID NO:2.
5. La combinación de vacuna para su uso según la reivindicación 4, en donde la composición (i) comprende además un adenovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que tiene SEQ ID NO:3.
6. La combinación de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en donde los vectores de adenovirus son vectores rAd26 o rAd35.
7. La combinación de vacunas para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la segunda composición se administra 8 semanas después de la primera composición.
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