JP4198148B2 - 霊長類におけるフィロウイルス感染に対する予防ワクチンの開発 - Google Patents
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Description
Peters, C.J. et al. in : Fields Virology, eds. Fields, B.N. et al. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996 Peters, C.J. et al. 1994 Semin Virol 5: 147-154 Sanchez, A. et al. 1996 PNAS USA 93: 3602-3607 Clegg, J.C.S. et al. 1997 New Generation Vaccines, eds. : Levine, M.M. et al. 749-765, New York, NY. Marcel Dekker, Inc. Jahrling, P.B. et al. 1996 Arch Virol Suppl 11: 135-140
nga)株を用いた攻撃誘発(challenge)は、対照において均一感染を引き起こし、それらのカニクイマカクザルは1週間未満で瀕死状態および死に至った。対照的に、予防接種された動物は全て、6ヶ月より長い間無症候性であり、最初の攻撃誘発後、検出可能なウイルスは認められなかった。これらの知見は、霊長類におけるエボラウイルス感染に対する予防ワクチンを開発することができることを実証している。
薬学的に許容可能な賦形剤中で、対照配列に作動可能的に連結された、フィロウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子を含むフィロウイルスワクチンが提供される。一実施形態では、核酸分子は膜貫通形態のウイルス糖タンパク質(GP)をコードする。別の実施形態では、核酸分子は分泌形態のウイルス糖タンパク質(SGP)をコードする。さ
らに別の実施形態では、核酸分子はウイルス核タンパク質(NP)をコードする。
エボラ(EBO)ウイルスは、フィロウイルス(Filoviridae)の成員であり、ヒトおよび/または非ヒト霊長類において重篤な、しばしば致命的な形態の出血熱疾患を引き起こす。フィロウイルスの糖タンパク質(GP)遺伝子は、マイナス鎖RNAゲノムの3’末端から(7つのうちの)4番目の遺伝子である。ある程度まで特性化されたEBOウイルスは全て、構造GPよりむしろ分泌非構造糖タンパク質(SGP)の発現を生じる、同一の非従来型のGP遺伝子構成を有する。SGPは単一フレーム(0フレーム)でコードされるが、一方、GPは2つのフレーム(0および−1フレーム)でコードされる。GPの発現は、単一の追加のアデノシンの挿入(一連の7つのアデノシンに付加される)を生じる転写エディティング事象を介して2つのフレームが連結される場合に起こる。
)で起こると予測される。SGPの役割はほとんど定義されていないが、しかしSGPは好中球と結合し、一方GPは内皮細胞と結合することが近年の研究により示された。SGPとGPの異なる結合パターンは、同一のN末端アミノ酸配列(〜280残基)を有するにもかかわらず、これらの糖タンパク質は構造的に互いに全く異なることを示唆する。
本明細書中に示されているように、本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるかまたは合成的に生産されるRNAまたはDNAの形態であり得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、センス鎖としても既知であるコード鎖であり得るし、あるいはアンチセンス鎖としても言及される非コード鎖であり得る。
vivoまたはin vitroRNA転写体が挙げられる。本発明の単離核酸分子としてはさらに、合成的に生産されたこのような分子が挙げられる。
ンリーディングフレーム(ORF)を含むDNA分子、ならびに上記のものとは実質的に異なる配列であるが、遺伝コードの縮重のために、依然として野生型フィロウイルス構造遺伝子産物のORFをコードする配列を含むDNA分子が挙げられる。もちろん遺伝コードは、当該技術分野で既知である。
も起こり得る。
al. 1990 Science 247: 1306-1310に記載されており、その記載では、タンパク質は意外にもアミノ酸置換に寛容であると著者等は示している。
本発明はさらに、野生型フィロウィルス構造遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)によりコードされるアミノ酸配列を有するフィロウイルスポリペプチド、あるいはその一部分を含むペプチドまたはポリペプチド(例えばSGP)を提供する。
下記のタンパク質部分のようなフィロウイルスタンパク質の領域を含む、フィロウイルスポリペプチドの変異を包含する。このような突然変異体としては、欠失、挿入、逆位、反復および型置換が挙げられる。上記のように、アミノ酸変化が表現型性サイレントであるかどうかを考えるに関する指針は、Bowie, J.U. et al. 1990 Science 247: 1306-1310に見出され得る。
既知の方法により、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発により同定され得る(Cunningham & Wells 1989 Science 244: 1081-1085)。後者の手法は、分子中の全ての残基に単一アラニン突然変異を導入する。その結果生じた突然変異体分子は次に、生物学的活性、例えば免疫学的特質の変化に関して試験される。
該組み合わせとは、例えば膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカル
ボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質;七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質;融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質;フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質;ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質である。別の例は、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインまたは細胞内ドメインを欠失するための、アミノ、内部またはカルボキシ欠失を有するフィロウイルスの糖タンパク質である。
の両方の投与は、筋肉内免疫感作である。
遺伝子免疫感作は、体液性および細胞性免疫活性化経路の両方に影響を及ぼし、ヒト病原体による感染に対して防御することが示されている(Tang, D.C. et al. 1992 Nature 356: 152-154; Ulmer, J.B. et al. 1993 Science 259: 1745-1749; Wang, B. et al. 1993 PNAS USA 90: 4156-4160;Sedegah, M. et al. 1994 PNAS USA 91: 9866-9870)。プラスミドワクチンの有効性は、宿主細胞タンパク質合成および免疫原の内因性提示に起因し、おそらくはプラスミドDNA自体の免疫刺激作用によるものと考えられる(Kreig, A.M. et al. 1995 Nature 374: 546-549; Sato, Y. et al. 1996 Science 273: 352-354)。DNAワクチンは、エボラウイルス抗原に対する特異的免疫応答を誘発し、齧歯類において致死的感染するエボラウイルスによる攻撃誘発(Connolly, B.M. et al. 1999 J Infect Dis 179: S203-S217; Bray, M. et al. 1998 J Infect Dis 178: 651-661)に対してモルモット(Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 7-42)およびマウス(Vanderzanden, L. et al. 1998 Virology 246: 134-144)を防御することが示されている。細胞媒介性および体液性免疫応答の両方が誘発されたが、抗体力価は、エボラウイルスのザイールサブタイプからのタンパク質をコードするプラスミドで免疫感作された動物における防御の程度と関連付けられた。
、スーダンおよび象牙海岸)に対する免疫を提供する必要があるが、多価ワクチンは、単一サブタイプワクチンに関して実証された特異的免疫応答を弱め得る。この問題に対処するために、オリジナルのエボラ・ザイールDNAワクチン単独の効力を、エボラウイルスのスーダンおよび象牙海岸サブタイプからのDNAと組合せて使用した場合の効力とを比較して分析した。従来の研究(Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 7-42)の場合と同様に、ザイールサブタイプビリオン糖タンパク質GP(Z)をコードする単一プラスミドによる免疫感作は、モルモットにおいて実質的なウイルス特異的抗体応答を発生し、防御免疫を付与した(表1)。エボラ核タンパク質NPを発現するプラスミドの封入は、エボラGP(Z)に対する抗体力価に影響を及ぼさず、その防御効力を低減することもなかった。NP、ならびにエボラ糖タンパク質の3つのサブタイプ(ザイール、象牙海岸およびスーダンGP(Z、IC、S)+NP)を含むワクチン構成成分のさらなる拡大は、単一プラスミドワクチンに匹敵する前攻撃誘発免疫応答を生じた。さらに、エボラザイール型ウイルスによる感染からの完全防御が、多価ワクチンを投与されたモルモットにおいて達成された(表I、被験体13〜16)。既往抗体はウイルス攻撃誘発によっては誘導されなかったが、これはワクチンそれ自体が、ウイルスを効率的に除去するのに十分な免疫応答を提供したことを示す。これらの知見により、齧歯類モデルにおける多価プラスミド免疫感作は、糖タンパク質(GP)特異的抗体産生およびその防御的効力を実質的に低減しないことが示された。
al. 1998 Vaccine 16: 439-445; Robinson, H.L. et al. 1999 Nat Med 5: 526-534; Schneider, J. et al. 1998 Nat Med 4: 397-402)。組換え複製欠陥アデノウイルスは高力価になり、抗原提示細胞に感染し、強力な免疫応答を誘導し得る(Davis, A.R. et al. 1985 PNAS USA 82: 7560-7564; Natuk, R.J. et al. 1992 PNAS USA 89: 7777-7781; Xiang, Z.Q. et al. 1996 Virology 219: 220-227)。アデノウイルスはマウスにおける追加免疫作用を示した(Xiang, Z.Q. et al. 1999 J Immunol 162: 6716-6723)が、DNAおよびアデノウイルスの組合せは、感染性攻撃誘発モデルにおける効力に関して試験されておらず、霊長類におけるこの手法の成功は未だ報告されていない。したがって、本発明者らは、高レベルGP発現を指示する組換えアデノウイルスベクターADV−GP(Z)を開発し、修飾初期免疫−追加免疫戦略が、裸DNA単独を用いて得られたエボラウイルスに対する抗体応答を増大するか否かを試験するために、このベクターを用いた。マウスにDNAおよびアデノウイルスベクターを、単独でまたは組合せて注射し、細胞媒介性応答および体液性免疫応答を評価した。DNA免疫感作単独の場合と比較して、DNAおよびその後のアデノウイルス追加免疫を注射したマウスにおいて、抗体力価が10倍〜100倍増加することが見出された(図47)。同様に細胞傷害性T細胞応答の増大がこの組合せを用いて観察された。ADV−GP(Z)単独による免疫感作は、DNA初回免疫、アデノウイルス追加免疫感作した場合と、抗体力価が有意に異ならなかった。これらのデータは、マウスにおけるエボラGP DNAワクチンの免疫原性が組換えアデノウイルスによる追加免疫によって改良されたこと、及びこの戦略が非ヒト霊長類における免疫応答を増大するための有用なアプローチを提示し得ることを示唆する。
VRC6000
VRC6000(pVR1012−GP(Z))。ザイールサブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖pVR1012(#450)。配向は、BamHI/EcoRI/EcoRV/EcoRI/BglIIである。
VRC6001
VRC6001(pVR1012x/s−GP(Z))。その他の説明なし。これは6000と同一であるが、pVR1012主鎖へのSfi制限部位の付加を伴う。
VRC6002
VRC6002(pVR1012−GP(Z)デルタMUC)。GP(Z)のムチン様ドメインが欠失された。主鎖pVR1012GP(Z)中の530bpがEarI(2844)からBfaI(3374)まで欠失された。この突然変異体は、エボラ受容体と結合し得る。
VRC6003
VRC6003(pVR1012−GP(Z)デルタMUCデルタFUR)。GP(Z)のムチン様ドメインおよびフリン切断部位が欠失された。主鎖pVR1012GP(Z)中の593bpがEarI(2844)からEarI(3437)まで欠失された。本タンパク質は、pVR1012−GP(Z)デルタMUCと同様の特性を有する。
VRC6004
VRC6004(pVR1012−GP(Z)デルタGP2)。GP(Z)中のGP2領域の大多数が欠失された。主鎖pVR1012−GP(Z)からの430bpがBclI(3414)からBspEI(3844)まで欠失された。TM(膜貫通)領域が保持された。
VRC6005
VRC6005(pVR1012−GP(Z)デルタGP2デルタC末端A)。これは、GP2のC末端欠失である。267bpがpVR1012−GP(Z)主鎖のMscI(3623)からBspMI(3890)まで欠失された。
VRC6006
VRC6006(pVR1012−GP(Z)デルタGP2デルタC末端B)。これは、GP2のC末端のより小さな欠失である。主鎖pVR1012−GP(Z)の110bpがBstXI(3780)からBspMI(3890)まで欠失された。
VRC6007
VRC6007(pVR1012−GP(Z)デルタGP2デルタFUS)。GP(Z)のGP2中の融合ペプチドが、PCRを用いて、この突然変異で欠失された。主鎖pVR1012−GP(Z)からの47bpが、3508から3555まで欠失された。
VRC6008
VRC6008(pVR1012−GP(Z)デルタTM)。この突然変異体においては、GP(Z)のTM領域がトランケートされた。停止コドン(TGA)がBspMI部位(3889)の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
VRC6052
VRC6052(pVR1012−GP(Z)デルタsGP)。SGP/GP相同領域の大多数が欠失された。主鎖pVR1012−GP(Z)からの687bpが、HincII(2083)からHincII(2270)まで欠失された。
VRC6101
VRC6101(pVR1012x/sエボラGP(R)(dTM))。本ベクターは、その膜貫通および細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質(レストンサブタイプ)を発現する。PCRを用いて、停止コドンがGP(R)のa.a.650の下流に生成され、その後にXbaI部位が続いた。このタンパク質は分泌されることができ、GP
(R)(dTM)と称される。
VRC6110
VRC6110(pAdAptエボラGP(R)(dTM))。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質(レストンサブタイプ)を発現するアデノウイルスシャトルベクター。PCRを用いることで、停止コドンがGP(レストン)のa.a.651の下流に生成され、その後にXbaI部位が続いた。結果として得られる組換えアデノウイルスは、GP(R)(dTM)と呼ばれる651a.a.分泌糖タンパク質を発現する。
VRC6200
VRC6200(pVR1012−GP(S))。スーダンサブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖pVR1012(#450)。配向は、EcoRI/EcoRV/BamHI/BamHI/BamHI/XbaIである。
VRC6201
VRC6201(pVR1012x/sエボラGP(S))。1012主鎖へのSfi部位の付加を伴う以外は6200と同一であり、その他の説明はない。
VRC6202
VRC6202(pVR1012−GP(S)デルタTM)。この突然変異体においては、GP(S)のTM領域がトランケートされた。停止コドン(TGA)がBspMI部位(xxx)の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
VRC6300
VRC6300(pVR1012−GP(IC))。象牙海岸サブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖pVR1012(#450)。配向は、EcoRI/EcoRV/BamHI/BamHI/BamHI/XbaIである。
VRC6301
VRC6301(pVR1012x/s−GP(IC))。1012主鎖へのSfi部位の付加を伴う以外は6300と同一であるが、その他の説明はない。
VRC6302
VRC6302(pVR1012−GP(IC)デルタTM)。この突然変異体においては、GP(IC)のTM領域がトランケートされた。停止コドン(TGA)がBspMI部位の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
VRC6303
VRC6303(pVR1012x/sエボラGP(IC)(dTM))。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質(象牙海岸サブタイプ)を発現するpVR2000ベースのベクター。PCRを用いることで、停止コドンがGP(R)のa.a.650の下流に生成され、その後にBglII部位が続いた。本ベクターは、650a.a.分泌糖タンパク質(a.a.1〜a.a.650)を発現する。
VRC6310
VRC6310(pAdAptエボラGP(IC)(dTM))。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質(サブタイプ象牙海岸)を発現するアデノウイルスシャトルベクター。PCRを用いることで、停止コドンがGP(IC)のa.a.651の下流に生成された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、GP(IC)(dTM)と呼ばれる651a.a.分泌糖タンパク質を発現する。
VRC6351
VRC6351(pVR1012x/s−sGP(IC))。その他の説明なし。
VRC6400
VRC6400(pVR1012−NP)。象牙海岸サブタイプのエボラ核タンパク質を発現する主鎖pVR1012(#450)。
VRC6401
VRC6401(pVR1012x/s−NP)。1012主鎖へのSfi部位の付加を伴う以外は6400と同一であり、その他の説明はない。
VRC6500
VRC6500(pVR1012−VP35)。主鎖はpVR1012(#450)である。挿入物は、pGEM 3Zf(+)VP35(#1213)からクローン化されたエボラからのVP35である。
VRC6600
VRC6600(pAD/CMV−GP(dTM)(Z−CITE−S))。その他の説明なし。
VRC6601
VRC6601(pAdAptエボラGP(S))。その他の説明なし。
VRC6602
VRC6602(pAdAptエボラGP(S)(dTM))。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質(スーダンサブタイプ)を発現するアデノウイルスシャトルベクター。停止コドンがGP(S)のa.a.650の下流に融合された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、GP(S)(dTM)と呼ばれる654a.a.分泌糖タンパク質を発現する。
VRC6603
VRC6603(pAdAptエボラGP(Z))。その他の説明なし。
VRC6604
VRC6604(pAdAptエボラGP(Z)(dTM))。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質(サブタイプザイール)を発現するアデノウイルスシャトルベクター。停止コドンがGP(Z)のa.a.651の下流に融合された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、GP(Z)(dTM)と呼ばれる655a.a.分泌糖タンパク質を発現する。
VRC6701
VRC6701(pVR1012−マールブルグ)。マールブルグ糖タンパク質(GP)オープンリーディングフレーム、Musoke株。マールブルグをVRC6700(Xba/PvuII)からの主鎖#450(Bam(blunt)/XbaI)中にクローン化した。
VRC6702
VRC6702(pVR1012x/sマールブルグGP(dTM))。本ベクターは、その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにマールブルグウイルス糖タンパク質を発現する。PCRを用いることで、停止コドンがGP(マールブルグ)のa.a.650の下流に生成され、その後にBglII部位が続いた。このタンパク質は分泌され、GP(マールブルグ)(dTM)と呼ばれる。
VRC6710
VRC6710(pAdAptマールブルグGP(dTM))。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにマールブルグウイルス糖タンパク質を発現するアデノウイルスシャトルベクター(pVRC1290)。PCRを用いることで、ターミネーターコドンがa.a.650の下流に生成され、その後にBglII部位が続いた。結果として得られる組換えアデノウイルスは650a.a.分泌タンパク質(a.a.1〜a.a.650)を発現する。
VRC6800
VRC6800(pVR1012x/sラッサGP)。その他の説明なし。
VRC6801
VRC6801(pVR1012x/sラッサGP(dTM))。その他の説明なし。
VRC6810
VRC6810(pAdAptラッサGP)。その他の説明なし。
VRC6811
VRC6811(pAdAptラッサGP(dTM))。その他の説明なし。
エボラ・ザイール糖タンパク質(GP)、分泌GP(SGP)および核タンパク質(NP)を発現するDNAベクターの構築は、Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42に記載されている。GPスーダンおよび象牙海岸発現ベクターを同様に構築した。要するに、以下のプライマー:5’ATC TTC AGG ATC TCG CCA TGG A3’(スーダンGP遺伝子;NcoI>ATG;配列番号44)、5’GAT ATT CAA CAA AGC AGC TTG CAG3’(スーダンGP遺伝子;C末端GP停止;配列番号45)、5’CTA ATC ACA GTC ACC ATG GGA3’(象牙海岸GP遺伝子;NcoI>ATG;配列番号46)、5’AAA GTA TGA TGC TAT ATT AGT TCA3’(象牙海岸GP遺伝子;C末端GP停止;配列番号47)を用いて、感染細胞RNAの、RNAの逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)産物から、GPオープンリーディングフレームを生成し、TAクローンPCR2.1スーダンおよびPCR2.1象牙海岸を得た。XbaI/HindIIIを用いて、スーダン糖タンパク質をプラスミドPC2.1から消化し、クレノウ(Klenow)処理して、p1012のXbaI部位にクローン化した(Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42)。EcoRIを用いて、象牙海岸GPをプラスミドPC2.1から消化し、クレノウ処理して、p1012のXbaI部位にクローン化した(Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42)。
Covance (Princeton, NJ)から入手した3歳、体重2〜3kgの8匹のカニクイマカクザル(cynomolgus macaques)(Macaca fascicularis)を、免疫感作および攻撃誘発実験のために用いた。血液検体を得るため、そしてワクチンを投与するために、ケタマインでサルを麻酔した。「実験室動物の管理および使用のための指針(Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals (DHEW No. NIH 86-23)」に従って、動物を1匹ずつ収容し、定期的エンリッチメントを施した。エボラウイルス攻撃誘発直前から実験終了まで、動物を最大閉じ込め実験室(BSL−4)中に保持し、給餌し、毎日検査した。瀕死状態と思われた一動物を安楽死させ、その後、病理検査のために剖検した。さらに、単一無症候性予防接種動物を、病理学的およびウイルス学的分析のために安楽死させた。
エボラザイールGPまたはNPを発現するDNAおよびアデノウイルスベクターを、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびプロモーターの制御下で、遺伝子発現を用いて、前記と同様に構築した(Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42; Ohno, T. et al. 1994 Science 265: 781-784)。0、14および28日目に、100μgのDNA(pGPまたはp1012プラスミド対照)または108PFUのアデノウイルス(ADV−GPまたはADV−ΔE1対照ウイルス)を用いて、マウスを筋肉内免疫感作し、28日目に血液を採取した。42日目に、DNAまたはアデノウイルスを用いてマウスに筋肉内追加免疫を施して、力価を56日目に再び測定した。精製ビリオン由来のエボラウイルス抗原の調製物を被覆し、膜関連タンパク質(GP、VP40およびVP24)を濃化した96ウエルプレートを用いて、ELISA IgG力価を確定した(Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950)。ヤギ抗ヒトIgG(H+L)−ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体およびABTS/ペルオキシド(基質/指示薬)を用いて、特異的抗原結合を検出した。
DNA免疫感作のために、GP(ザイール)[GP(Z)]、GP(象牙海岸)[pGP(IC)]、GP(スーダン)[pGP(S)]、ならびに混合物[pGP/NP]として投与されるNP(ザイール)[GP(Z)]を発現するそれぞれのDNA(1mg)を、あるいは空[pGP(Z)]対照プラスミド4mgを、動物の三角筋に両側投与した(2mg/一側)。0および4週目の免疫感作はIM注射により、8週目はBiojectorにより行った。アデノウイルス追加免疫のために、動物に1010PFUのADV−GP(ザイールサブタイプ)またはADV−ΔE1(空ベクター)を、2用量に分けて三角筋に両側投与した。32週目に、ハンクス緩衝化塩溶液1ml中の約6PFUのエボラウイルス(ザイール1976年単離物;マインガ株)を全動物に腹腔内注射した(Kiley,
M.P. et al. 1980 J Gen Virol 49: 333-341)。ウイルスを患者血液から直接単離し、ベロ細胞中での1回継代後に用いた。
サル血漿の連続希釈液からVP40タンパク質を捕捉することにより、記載どおりに(Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950)、循環エボラウイルス抗原の存在を検出した。抗VP40mAbを被覆した96ウエルプレートを用いて、抗原を捕捉し、検出はウサギ抗エボラウイルス血清を用いた。
GP(ザイール)、GenBank寄託番号P87666;NP(ザイール)、GenBank寄託番号NC_002549から入手し、一方、GP(スーダン/Gulu)は、CDCから入手した。次に、哺乳類の好ましいコドンを用いて、アミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳した。25bp重複を有する連続75bpオリゴ体を調製して、全遺伝子を網羅した。次にPCRを用いて、好ましいコドンを含有する無傷哺乳類遺伝子中にオリゴ体をアセンブルした。設計において、GP(ザイール)(a.a.648〜676)およびGP(スーダン/Gulu)(a.a.648〜676)の予測膜貫通ドメインの前に、この領域がこれらの合成的作製遺伝子から排除されるよう、停止コドンを導入した。欠失も、両構築物中の4a.a.細胞質領域の損失をもたらした。エボラGP(ザイール)配列の最終シーケンシングは、実験室GP配列からの10の多岐アミノ酸を明示した。これを本発明者らの動物試験に用い、部位特異的突然変異誘発により、これらを補正した。XbaI/SalIにより、p1012x/s中にこれらの挿入物をクローン化した。
エボラGP(スーダン/Gulu)遺伝子から欠失されたコドン修飾膜貫通ドメインを、SalI/KpnIを用いてp1012(x/s)−GP(S/G)(ΔTM)/hから切り出し、SalI/KpnI消化CMV/R/MCSプラスミド中に挿入した。
エボラGP(ザイール)遺伝子から欠失されたコドン修飾膜貫通ドメインを、p1012x/s−GP(Z)(dTM)/h SalI/BglII部位から切り出し、CMV/RプラスミドのSalI/BglII部位にクローン化した。
ザイールサブタイプのエボラ核タンパク質を発現するVRC6400(pVR1012−NP)からのNotI−KpnI断片を切り出し、CMV/RプラスミドのNotI/KpnI部位にクローン化した。
本発明は、現在使用されているベクターよりも高レベルのタンパク質発現を発生させる改良型哺乳類発現ベクターを提供する。
ースのワクチンにも同様に、または真核生物発現ベクターからの組換えタンパク質の生産のためにも用いられ得る。本発明は、広範な種々の疾患(例えばHIVおよびその他のウイルス疾患および癌)のための遺伝子ワクチンの製造および遺伝子療法に有用である。
リン酸カルシウムを用いて、0.5ugの対応するプラスミドを有する6ウエル組織培養皿中で、
(A)ベクター単独(レーン1)、CMVint−gp−145(dCFI)(レーン2)、CMV/R−gp145(dCFI)(レーン3)、または
(B)mUBB−gp145(dCFI)(レーン4)、mUBB/R−gp145(dCFI)(レーン5)
を用いて、マウス線維芽細胞3T3細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を収穫し、溶解緩衝液(50mMのHEPES、150mMのNaCl、1%NP−40、ミニ完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche))中で溶解した。各試料の総タンパク質10μgを、SDS−PAGEを用いて4〜15%勾配ゲル上で分離し、その後、タンパク質を移して、ウエスタンブロット分析した。ヒトHIV−IgG(1:5000)を一次抗体として用いて、HRP−接合ヤギ抗ヒトIgG(1:5000)を二次抗体として用いた。ECLウエスタンブロット現像系を用いて、膜を現像した。矢印は、HIV Env gp145(ΔCFI)ポリタンパク質に関する特異的帯域を示す。
各群のマウス5匹を、0、2および6週目に、50μgの指定プラスミドDNAで免疫感作した。最後の注射後10日目に、各マウスから脾臓細胞を収穫し、対照ペプチドのプール(15mer)またはHIV Envペプチドのプール(15mer)を用いて6時間刺激した。PE−抗マウスCD3、PerCP−抗マウスCD4、APC−抗マウスCD8、FITC−抗マウスIFN−γおよびFITC−抗マウスTNF−αを含有する抗体のカクテルを用いて、刺激脾臓細胞を染色した。フローサイトメトリーにより試料を分析した。CD3/CD4/IFN−γ/TNF−αおよびCD3/CD8/IFN−γ/TNF−α陽性細胞数を、FloJoソフトウエア(Treestar)を用いて測定した。
742〜972:HTLV−1 R領域
973〜1095:CMV/IEスプライシング受容体
Claims (7)
- 配列番号52の塩基配列、又は該塩基配列と少なくとも95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有する塩基配列であって発現を指示する塩基配列を含む、発現ベクター。
- 前記同一性が少なくとも95%である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記同一性が少なくとも96%である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記同一性が少なくとも97%である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記同一性が少なくとも98%である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記同一性が少なくとも99%である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記同一性が100%である、請求項1に記載の発現ベクター。
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