KR101211329B1 - 바이러스 정제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 숙주세포로부터 바이러스를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a)숙주세포를 배양하는 단계, b)상기 숙주세포를 바이러스로 감염시키는 단계, c)세포 배양물을 핵산으로 처리하는 단계, d)바이러스를 포함하는 용해질을 제공하도록 상기 숙주세포를 용균시키는 단계를 포함한다. 바이러스는 바람직하기는 재조합 아데노바이러스이다. 본 발명은 추가로 핵산과 결합할 수 있는 이형성 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a)숙주세포를 배양하는 단계, b)상기 숙주세포를 상기 재조합 바이러스로 감염시키는 단계, c)상기 재조합 바이러스를 포함하는 용해질을 제공하도록 상기 숙주세포를 용균시키는 단계, d)재조합 바이러스를 음이온교환 크로마토그래피 및 크기별 배제 크로마토그래피하는 것을 포함하고, 혼합물을 포함하는 바이러스는 2M 이상의 NaCl 또는 등가의 이온강도를 제공하는 다른 염을 포함하는 용액으로 적어도 한번 완충교환하는 것을 특징으로 한다.
바이러스 정제방법, 재조합 바이러스, 아데노바이러스

Description

바이러스 정제방법{VIRUS PURIFICATION METHODS}
본 발명은 숙주세포로부터의 바이러스, 특히 재조합 아데노바이러스의 정제분야에 관한 것이다.
천연적으로 발생한 또는 그들의 재조합형인 바이러스가 백신화 및 유전자 치료법 분야에서 사용된다. 많은 바이러스 또는 바이러스-유사 입자들을 숙주세포에서 안전하게 및 효율적으로 증식시키는 것이 가능하다(WO 01/38362 참조, 이것은 E1 불멸화 망막세포인 숙주세포에서 여러 바이러스들의 증식을 기재한다). 재조합 아데노바이러스는 유전자 치료법 및 백신화 목적에 사용하기에 바람직한 바이러스성 벡터의 종(class)이다. 이와 같은 재조합 아데노바이러스는 일반적으로 적어도 E1 영역에서 불완전하며, 293 세포와 같은 E1-영역을 제공하는 보체 세포, 또는 REP.C6TM 세포와 같은 E-불멸화 망막세포에서 증식한다(예를 들면, US 특허 5,994,128을 참조).
숙주세포에서 바이러스의 증식 후, 실질적으로 모든 적용에 더욱 사용하기 전에 숙주세포로부터 바이러스를 정제하는 것이 필요하다.
국제특허출원 WO 98/22588호는 아데노바이러스 벡터의 생산 및 정제에 관한 방법을 기재한다. 방법은 숙주세포를 성장시키고, 숙주세포를 아데노바이러스로 감염시키고, 숙주세포를 수확 및 용균시키고, 천연 용해질을 농축시키고, 천연 용해질의 완충액을 교환하고, 용해질을 뉴클레아제로 처리하고, 그리고 추가로 크로마토그래피를 사용하여 바이러스를 정제하는 것을 포함한다.
몇몇 다른 공보는, 숙주세포 용해질로부터 바이러스의 정제를 위한 특정 크로마토그래피 매트릭스의 사용으로 거의 집중된, 숙주세포로부터의 바이러스의 정제를 기재한다. 예를 들면, 미국특허 6,008,036, 6,586,226, 5,837,520, 6,261,823, 6,537,793 및 국제특허출원 WO 00/50573, WO 02/44348 및 WO 03/078592호를 참조.
기재된 방법들의 대부분은 DNA 불순물을 분해하기 위해 뉴클레아제 처리 단계가 적용된다. 다양한 크로마토그래피 매트릭스에 관한 여러 방법의 기재에도 불구하고, 숙주세포 배양물로부터 바이러스를 정제하기 위한 대체적인 그리고 바람직하기는 개선된 방법에 대한 요구가 남아있다. 본 발명은 이와 같은 방법을 제공한다.
본 발명은 숙주세포로부터 바이러스를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a)바이러스로 감염된 숙주세포를 배양하는 단계, b)뉴클레아제를 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및 c)바이러스를 포함하는 용해질을 제공하도록 상기 숙주세포를 용균시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로, d)용해질을 정화하는 단계를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로, e)바람직하기는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 통해 아데노바이러스를 추가로 정제하는 단계를 포함한다. 상기 방법들과의 가장 중요한 차이는, 상기 방법에서 뉴클레아제는 세포의 용균 후에만, 또는 정화공정에서 가장 나중 단계에서 적용된다는 것이다. 본 발명에 따르면, 뉴클레아제는 세포의 용균 전에 첨가된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예상외로, 이것은 뉴클레아제가 세포가 용균된 후에만 첨가되는 방법보다 우수한 결과를 가져온다는 것을 발견하였다. 본 발명에 따른 방법에서, 이 방법으로 생성된 정제된 바이러스 배치는 세포 용균이 뉴클레아제 첨가에 앞서는 방법보다 숙주세포 DNA를 덜 함유한다. 바람직한 구현예에서, 바이러스는 재조합 아데노바이러스이다. 한 구현예에서, 단계 b)에서 사용된 뉴클레아제는 벤조나제(Benzonase®)이다. 한 구현예에서, 숙주세포의 용균단계(단계 c)의 단계는 계면활성제에 의해 수행되고, 한 구현예에서 계면활성제는 Triton-X100이다. 한 구현예에서, 용해질의 정화는(단계 d)는 심층 여과 및 막 여과를 포함한다. 그들의 바람직한 구현예에서, 상기 막 여과는 SartoporeTM-2 결합 필터와 같은, 구멍 크기가 0.8 및 0.45㎛인 2개의 비대칭 폴리에테르술폰막을 포함하는 결합필터와 같이, 0.8㎛과 0.45㎛의 구멍 크기를 갖는 필터들의 조합물을 이용하여 실시된다. 한 구현예에서, (단계 d로부터 생성된) 정화된 용해질은 한외여과 및/또는 정용여과 (diafiltration)된다. 바람직한 구현예에서, 정용여과는 0.8~2.0M NaCl, 또는 등가의 이온강도를 제공하는 다른 염을 포함하는 용액에 대해 완충교환된다. 특정의 바람직한 구현예에서, 바이러스의 추가정제(단계 e)는 음이온 교환수지를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 추가의 바이러스 정제(단계 e)는 바람직하기는 그룹별 분리 모드로, 크기별 배제 크로마토그래피 단계를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 e)는 음이온 교환 크로마토그래피와 크기별 배제 크로마토그래피 모두를 포함한다. 본 발명에 따른 특정 구현예에서, 정화된 용해질과 추가로 정제된 바이러스(단계 d로부터 앞으로)는 계면활성제, 염화마그네슘 및 슈크로스가 없는 완충액 중에 존재한다.
다른 면에서, 본 발명은 에볼라바이러스 핵단백질, 에볼라바이러스 당단백질, 열대말라리아원충, 서컴스포로조이트 유전자(circumsporozoite gene), 및 홍역 바이러스 혈구응집소로 이루어진 군으로부터 선택된 트란스유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 배치를 제공하고, 상기 배치는 1E11 바이러스 입자당 0.1ng 미만의 숙주세포 DNA를 함유한다.
본 발명은 추가로, 핵산결합 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 바이러스의 생산방법을 제공하고, 상기 방법은 a)바이러스로 감염된 숙주세포를 배양하는 단계, b) 상기 바이러스를 포함하는 용해질을 제공하기 위해, 숙주세포의 배양물과 여기서 생성된 상기 바이러스를 숙주세포의 용균이 일어나도록 하는 단계, c)바이러스를 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 후, 바이러스를 함유하는 혼합물은 적어도 1M NaCl 또는 등가의 이온강도를 제공하는 다른 염을 포함하는 용액으로 완충교환되는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 용액은 적어도 1.5M NaCl, 더욱 바람직하기는 적어도 2M NaCl, 더욱 바람직하기는 약 5M NaCl, 또는 등가의 이온강도를 갖는 다른 염을 포함한다. 바람직하기는 상기 바이러스는 추가로, 바람직하기는 1.2㎛ 이하의 구멍크기를 갖는 친수성 필터 및/또는 크기별 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 바이러스는 바람직하기는 재조합 바이러스이고, 더욱 바람직하기는 재조합 아데노바이러스이다. 핵산 결합 단백질은 에볼라, 마르부르크 또는 라사 바이러스와 같은 출혈열의 핵단백질과 같은 핵단백질이고 바람직하기는 에볼라바이러스이다.
숙주 세포
본 발명에 따른 숙주세포는 원하는 바이러스가 증식될 수 있는 어느 숙주세포일 수 있다. 예를 들면, 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식은 아데노바이러스 중의 결실을 보완하는 숙주세포에서 일어난다. 이와 같은 숙주세포는 바람직하기는 그들의 게놈에서 적어도 하나의 아데노바이러스 E1 서열을 갖고, 따라서 재조합 아데노바이러스는 E1 영역에서의 결실을 보완할 수 있다. 추가로, 아데노바이러스는 E3 영역에서 결실을 가질 수 있고, 이것은 Ad 게놈으로부터 없어도 되며, 따라서 이와 같은 결실은 보충되어야만 하는 것은 아니다. 예를 들면 911(미국특허 제5,994,128 참조), E1-변형된 양막세포(EP 특허 1230354호 참조), E1-변형된 A549 세포(예를 들면, WO 98/39411, US 특허 5,891,690 참조), GH329:HeLa(Gao et al., 2000, 인간 게놈 치료법 11:213-219), 293과 같은 E1에 의해 불멸화된 성인 망막세포와 같은 E1-상보적 숙주세포가 사용될 수 있다. 바람직하기는 PER.C6TM 세포(미국 특허 5,994,128), 또는 그로부터 유래된 세포가, 이들이 여러 다양한 바이러스(예를 들면 WO 01/38362 참조)의 증식에 알맞으므로 숙주세포로 사용될 수 있고 재조합 아데노바이러스를 포함하지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다.
추가로, 세포계 및 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식방법은 예를 들면, 미국 특허 6,492,169 및 WO 03/104467호에 기재되어 있다.
바이러스의 증식을 위한 숙주세포로서 직접적으로 사용되거나 또는 복제 결핍 바이러스를 위해 상보적 숙주세포로 전환될 수 있는 다른 유용한 포유동물 세포계의 예는 본 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이, 베로 및 헤라(HeLa) 세포 및 중국 햄스터 난소, W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포의 세포계이다.
본 발명에 따른 숙주세포는 세포 및 바이러스의 갯수 및/또는 바이러스 역가를 증가시키기 위해 배양된다. 세포의 배양은 세포를 신진대사 및/또는 성장 및/또는 분할 및/또는 본 발명에 따른 관심 있는 바이러스의 생산이 가능하도록 한다. 이것은 본 분야의 당업자에게 알려진 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들면 적절한 배지에서 세포에 영양을 공급하는 것을 포함하지만 그것으로 제한되는 것은 아니다. 본 방법은 표면에 부착된 성장, 현탁물 중의 성장, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 배양은, 예를 들면, 접시, 회전병 또는 생물반응기에서, 배치, 공급-배치, 연속 시스템, 중공섬유 등을 사용하여 실시될 수 있다. 세포배양을 통한 대규모의 (연속적인) 바이러스 생산을 얻기 위해, 본 분야에서는 현탁물 중 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하고, 동물- 또는 인간-유래 혈청 또는 동물- 또는 인간-유래 혈청성분의 부재하에서 배양될 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하다. 세포를 배양하기에 알맞는 조건은 알려져 있다(예를 들면, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), 및 R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition(Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9 참조).
본 발명은 바이러스로 감염된 배양 숙주세포를 용균시키는 것을 포함한다. 숙주세포를 배양하는 것과 그들을 바이러스로 감염시키는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 숙주세포의 감염은 예를 들면, 바이러스의 수득을 허용하는 생리학적 조건하에서 바이러스를 적절한 숙주세포에 노출시킴으로써 단순히 수행될 수 있다. 특정 바이러스의 경우, 핵산서열은 배양된 세포에서 바이러스를 복원하는데 사용될 수 있으므로, 반드시 바이러스 그 자체로 출발할 필요는 없다.
아데노바이러스 생산의 여러 면 및 그것을 위해 숙주세포를 배양하기에 알맞은 시스템은 또한 WO 98/22588, p.11-28.에서 발견될 수 있다. 세포를 배양하고 숙주세포에서 바이러스를 증식시키는 방법은 예를 들면, 미국특허 6,168,944, 5,994,134, 6,342,384, 6,168,941, 5,948,410, 5,840,565, 5,789,390, 6,309,650, 6,146,873 및 국제특허출원 WO 01/38362, WO 01/77304 및 WO 03/084479에 기재되어 있다.
바이러스
본 발명의 방법은 아데노바이러스, 천연두 바이러스, 홍채 바이러스, 헤르페스 바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 오르쏘믹소바이러스(인플루엔자 등), 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 우두 바이러스, 로타바이러스 등을 포함하는 넓은 범위의 바이러스에서 다룰 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하기는 아데노바이러스이다. 바이러스는 바람직하기는 재조합 바이러스이고, 그러나 임상적 분리물, 감독된 백신 변형물 등을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 유전자 치료에 사용하거나 또는 백신화 목적을 위해 이형 트란스유전자를 운반하는 재조합 바이러스, 바람직하기는 아데노바이러스를 농축하는데 사용될 수 있다. 오직 설명의 목적으로, 본 발명은 재조합 아데노바이러스에 관하여 더욱 상세히 설명될 것이나, 그것으로 제한하려는 의도는 아니다.
아데노바이러스
바람직하기는, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역, 예를 들면, 바이러스 복제에 요구되는 아데노바이러스 게놈의 E1a 영역 및/또는 E1b 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능이 결핍된다. 특정 구현예에서, 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능 및 비필수 E3 영역의 적어도 일부(예를 들면, E3 영역의 Xba I 결핍)가 결핍된다. 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 2개의 영역의 각각에 하나 이상의 필수 유전자 기능의 부족을 의미하는 "다중 결핍"일 수 있다. 예를 들면, 상기 E1-결핍 또는 E1-, E3-결핍 아데노바이러스 벡터는 추가로 E4 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 및/또는 E2 영역의 적어도 하나의 필수 유전자(예를 들면, E2A 영역 및/또는 E2B 영역)에서 결핍될 수 있다. 전체 E4 영역의 결실된 아데노바이러스 벡터는 낮은 숙주 면역반응을 가져올 수 있다. 적절한 아데노바이러스 벡터의 예는 (a) E1 영역의 모두 또는 일부, (b) E1 영역의 모두 또는 일부, E2 영역의 모두 또는 일부, 및 E3 영역의 모두 또는 일부, (c)E1 영역의 모두 또는 일부, E2 영역의 모두 또는 일부, E3 영역의 모두 또는 일부 및 E4 영역의 모두 또는 일부, (d)적어도 E1a 영역의 일부, 적어도 E1b 영역의 일부, 적어도 E2a 영역의 일부 및 적어도 E3 영역의 일부, (e)적어도 E1 영역의 일부, 적어도 E3 영역의 일부, 및 적어도 E4 영역의 일부, 및 (f) 모든 필수 아데노바이러스 유전자 산물(예를 들면, ITRs 및 패키지 시그널만을 포함하는 아데노바이러스 앰플리콘)이 부족한 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 아데노바이러스 게놈에서 필수 영역의 결실의 경우, 이들 영역에 의해 암호화된 기능은 바람직하기는 숙주 세포에 의해 트란스로 제공되어야 한다. 즉, E1, E2 및/또는 E4 영역의 일부 또는 전체가 아데노바이러스로부터 결실되면, 이들은, 예를 들면 게놈에 집적된 숙주 세포에, 또는 소위 헬퍼 아데노바이러스 또는 헬퍼 플라즈미드의 형태로 존재해야 한다.
복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 벡터 DNA의 소스로서 아데노바이러스 또는 키메릭 아데노바이러스의 어느 종(species), 균주, 서브타입, 또는 종, 균주 또는 서브타입의 혼합물을 사용하여 발생될 수 있고(예를 들면 WO 96/26281, WO 00/03029), 이것은 예를 들면, 아데노바이러스 벡터에 특정의 원하는 세포 형태를 감염시킬 수 있는 능력을 제공할 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 세포에서 성장할 수 있는 어느 아데노바이러스 벡터일 수 있고, 이것은 아데노바이러스의 게놈으로부터 유래되거나 또는 근거로 하는, (반드시 필수적인 것은 아니지만) 어느 정도 중요한 부분일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 특히 혈청형 5(즉, Ad5) 또는 Ad2의 그룹 C의 야생형 아데노바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 또한 아데노바이러스 게놈 또는 그룹 B의 아데노바이러스로부터 유래된 적어도 하나의 섬유 단백질, 예를 들면, Ad11, Ad35, Ad51 등을 포함할 수 있고(예를 들면, WO 00/70071 참조), 이러한 구현예는, 이들 아데노바이러스 벡터의 굴성은 Ad5로부터 유래된 것들과 다르기 때문에, 이들 혈청형에 대해 덜 중화된 항체를 개체에서 발견하는 이점이 있고, 다른 세포형을 표적화하는 가능성을 제공한다. 물론, 당업자는 다른 어느 혈청형이 적용될 수 있다는 것을 알 것이다. 당업자는 예를 들면, 미국 특허 6,492,169 또는 WO 03/104467, 및 본 명세서의 참조에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, 특정 숙주세포에서 다양한 혈청형의 아데노바이러스 벡터를 증식시키는가능성을 인식해야 한다. 아데노바이러스 벡터, 그들의 구성방법 및 그것에 관한 증식방법은 본 분야에 잘 알려져 있고 예를 들면, 미국특허 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191 및 6,113,913 및 Thomas Shenk, "Adenovirudae and their Replication", M.S. Horwitz, "Adenoviruses", 각각 Chapter 67 및 68, Virology, B.N. Fields et al., eds., 3rd ed., Raven Press, Ltd., New York(1996) 및 본 명세에서의 다른 참조에 기재되어 있다. 아데노바이러스 벡터의 구성은 본 분야에서 잘 이해되며 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989), Watson et al., recombinant DNA, 2nd ed., Scientific American Books(1992) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY(1995) 및 본 명세서에 언급된 다른 참조에 기재된다.
트란스유전자
한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스는 야생형 바이러스, 또는 본 발명에 따른 숙주세포에서 여전히 감염성인 돌연변이 또는 그들의 일부이다.
또 다른 구현예에서, 바이러스는 이형성 정보를 포함하는 재조합 바이러스로, 이것은 유전자 치료목적을 위해 치료적으로 맞춤되거나 백신화 목적을 위한 항원으로서 사용된다. 이것은 예를 들면 아데노바이러스 벡터를 이용한 바람직한 구현예이다. 이형 정보는 '트란스유전자'로 언급된다. 본 발명에 따른 방법은 바이러스, 바람직하기는 트란스유전자를 포함하여, 아데노바이러스에 적용가능하고 따라서 트란스유전자의 특성은 그 자체로 본 발명에 중요한 점은 아니다.
몇몇 가능한 트란스유전자는 예를 들면, WO 98/22588, p.42~49에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 바이러스에 존재할 수 있는 트란스유전자는 p53, p16, APC, DCC, NF-1, WT-1, p21, BRCA1, BRCA2 등을 포함하는, 예를 들면 종양억제 유전자와 같은 치료적 유전자; 탈아미노효소, HGPRT, 글루코세레브로시다제, HSV 티미딘 키나아제 또는 인간 티미딘 키나아제 등과 같은 효소; 성장 호르몬, 프로락틴, 에리트로포이에틴, 융털막성 고나도트로핀, 갑상선 자극 호르몬, 렙틴, ACTH, 안지오텐신, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 칼시토닌, 바소프레신 등과 같은 호르몬; IL-1, IL-3, IL-12, G-CSF, GM-CSF, TNF 등과 같은 인터로이킨 및 시토킨 등; ADA, 인자 IX, CFTR 등과 같은 특정 질병에서 부족하거나 돌연변이된 대체 유전자; 맥관형성 억제제, 세포 순환 억제제 등과 같은 다른 치료적 억제제; 예를 들면, ras, myc, jun, bcl, abl 등과 같은 종양 유전자의 발현을 억제하기 위한 안티센스 구조물; 예를 들면, 피코르나바이러스, 코로나바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 라브도바이러스, 파라믹소바이러스, 오르쏘믹소바이러스, 천연두바이러스, 헤파드바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스로부터 유래된 바이러스 항원과 같은 백신용 항원뿐 아니라, 예를 들면 더욱 특별히는 (예를 들면 HA 및/또는 NA와 같은 잠재적 항원을 갖는)인플루엔자, (잠재적 항원 헤파티티스 B 표면항원을 갖는) 헤파티티스 B, 웨스트 닐(West Nile)바이러스, 라비스, SARS-CoV, 단순포진 바이러스 1과 2, 홍역, 천연두, 소아마비, (항원, 예를 들면 gag, env, nef로부터 유래된 HIV-1 항원 또는 코돈 최적화 버전을 포함하는 그들의 변형물을 갖는, 예를 들면, WO 02/22080 참조) HIV; 에볼라, 마르부르크, 라사 바이러스로부터의 항원; 또는 세균성 항원, 균성 항원, 기생동물(트리파노소마, 촌충, 회충, 기생충, 말라리아 등을 포함) 항원 등일 수 있다.
분명히, 본 분야의 당업자는 예상되는 치료적 맞춤에 유용하고, 유전자 치료 및/또는 백신화에 사용되고, 그리고 상기의 목록에 한정되지 않는 관심있는 유전자를 선택할 것이다. 트란스유전자에 대한 조절 영역은, 예를 들면 프로모터와 폴리아데닐화 신호를 포함하여, 바람직하기는 트란스유전자의 발현에서 목표된 재조합 바이러스 벡터에 존재하는 것이 바람직하다는 것이 또한 명백하다. 모든 면은 당업자에게 잘 알려져 있고, 추가의 상세한 설명은 필요하지 않다. 몇몇 조절영역은 WO 98/22588, p.49-55에 논의되었다.
본 발명에 사용된 몇몇 아데노바이러스는 실시예에서 추가로 논의된다.
숙주세포 용균
아데노바이러스의 감염 후, 바이러스는 세포 내부를 복제하고 그것에 의해 증폭된다. 아데노바이러스 감염은 최종적으로 감염된 세포의 용균을 가져온다. 그러므로, 아데노바이러스의 용해 특성은 바이러스 생산의 두가지 다른 양식을 허용한다. 첫번째 양식은 세포 용균 전에 바이러스를 수확하는 것으로 세포를 용균시키기 위해 외부 인자가 적용된다. 두번째 양식은 바이러스 생산에 의해 세포 용균을 (거의) 완성한 후 바이러스 상등액을 수확하는 것이다(예를 들면, 외부 인자에 의한 숙주세포의 용균없이 아데노바이러스를 수확하는 것을 기재한 미국특허 6,485,958 참조). 후자 양식의 경우, 더 긴 배양 시간이 완전한 세포 용균 및 그것에 의한 바이러스의 높은 수득량을 얻는데 요구된다. 더우기, 매질로의 숙주세포 성분의 점진적인 살포는 얻어진 바이러스의 완전성과 수득량에 영향을 미칠 것이다. 그러므로, 본 발명에 따라, 세포의 활성적인 용균을 위해 외부인자를 적용하는 것이 바람직하다.
활성세포 용균을 위해 사용될 수 있는 방법은 당업자들에게 알려져 있고, 예를 들면 WO 98/22588, p.28-35에 기재되어 있다. 이와 관련하여 유용한 방법은, 예를 들면, 냉동-해동, 고체 전단, 고장액 및/또는 저장액 용균, 액체 전단, 음파처리, 고압압출, 계면활성제 용균, 그들의 조합 등이다. 본 발명의 한 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 계면활성제를 이용하여 용균된다. 용균을 위한 계면활성제의 사용은 그것이 쉬운 방법이고 쉽게 측정할 수 있으므로 유리하다. 또 다른 구현예에서, 세포는 WO 03/084479에 기재된 바와 같이, 중공섬유 한외여과를 이용한 전단에 의해 용균된다.
계면활성제
본 발명에 사용될 수 있는 계면활성제 및 그들이 적용되는 방법은 본 분야의 당업자에게 일반적으로 알려져 있다. 몇몇 예는, WO 98/22588, p.29-33에 기재되어 있다. 여기서 사용되는 바와 같은 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성, 및 비이온성 계면활성제를 포함한다. 예시적인 계면활성제는 타우로콜레이트, 데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트,세틸피리디움, 벤즈알코니움 클로라이드, ZWITTERGENT-3-14®, CHAPS (3-[3-콜아미도프로필)디메틸암모니올]-1-프로판술포네이트하이드레이트, Aldrich), 빅(Big) CHAP, 데옥시 빅 CHAP, Triton X-100®, Triton X-114®, C12E8, 옥틸-B-D-글루코피라노시드, PLURONIC-F68®, TWEEN-20®, TWEEN-80®(CALBIOCHEM®Biochemiclas), Thesit®, NP-40®, Brij-58®, 옥틸 글루코시드 등을 포함한다.
본 분야의 당업자들에게 계면활성제의 농도가, 예를 들면 약 0.1%~5%(w/w)의 범위에서 변할 수 있다는 것은 명백하다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 약 1%(w/w)의 농도로 용균 용액 중에 존재한다. 본 발명자들의 몇몇 시험용 실험에서, 트리톤(Triton)의 사용은 시험된 다른 계면활성제(Tween 20, Tween 80, 데옥시클로레이트)보다 덜 점착성의 용액을 가져왔다. 본 발명의 한 구현예에서, 사용된 계면활성제는 Triton X-100이다.
뉴클레아제
본 발명은 오염물, 즉 주로 숙주세포, 핵산을 제거하기 위해 뉴클레아제를 사용한다. 본 발명에 사용하기에 알맞는 예시적인 뉴클레아제는 Benzonase®, Pulmozyme®, 또는 그밖의 DNase 및/또는 RNase을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제는 Benzonase®이고, 이것은 특정 뉴클레오티드 사이의 내부 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 핵산을 빠르게 가수분해하고, 그것에 의해 세포 용해물의 점도를 감소시킨다. Benzonase®은 Merck KGaA(코드 W214950)에 의해 시판된다.
뉴클레아제가 사용되는 농도는 바람직하기는 1~100 유니트/㎖이다.
본 발명에 따라, 뉴클레아제는 세포가 용균되기 전에 적용된다. 이것은 용균 단계의 단지 수초 전에(또는 실질적으로는 오염된) 첨가될 수 있지만, 바람직하기는 뉴클레아제는 적어도 용균 단계 1분 전에 배양물에 첨가된다. 그리고나서, 첨가된 뉴클레아제를 갖는 세포 배양물은 예를 들면, 공정 온도보다 높은 온도, 예를 들면, 약 40℃에서 또는 배양온도(예를 들면, 35℃ ~ 약 37℃) 또는 실온에서(약 20℃) 또는 그 이하(예를 들면, 약 0℃)에서 배양될 수 있고, 여기서 일반적으로 동일한 결과를 얻기 위해 온도가 낮을수록 더 긴 배양시간이 요구된다(Benzonase®, brochure Merck KGaA code W 214950 참조). 비-제한적인 예로서, 배양은 예를 들면, 약 37℃에서, 세포가 용균된 후 약 10분 동안 수행될 수 있다. 명백하기는, 뉴클레아제는 용균단계 후에 여전히 활성적으로 핵산을 분해할 수 있고 바람직하기는 분해할 것이며, 본 발명에 따른 특정 구현예에서 용균 후 엔도뉴클레아제에 의한 세포의 배양은 약 50분 동안 연장된다(그 결과 뉴클레아제 처리의 총시간은 1시간이고, 뉴클레아제는 이후의 정제 단계에서 제거될 때까지도 여전히 작용하므로 이 시간은 사실상 더욱 길어질 수 있다). 이것은 WO 98/22588에 기재된 밤샘 배양보다는 상당히 짧다. 물론, 예를 들면 2시간 또는 밤샘 또는 더 긴 배양(Benzonase ® brochure Merck KGaA code W214950, 최대 30시간의 배양 데이타가 제공된다)이 본 발명의 방법에 따라 가능하지만, 만족스러운 결과를 얻기 위해 필요한 것은 아니다. 본 구현예에서 사용되는 '용균 단계' (즉, 그 안에 생성된 바이러스 함유 세포를 용균시키는 단계)는 계면활성제와 같은 외부 인자들(상기 '숙주세포의 용균'를 참조)을 적용하는 용균 단계를 의미한다. 분명히 아데노바이러스가 증식되는 세포의 배양 중 몇몇 세포는 외부 용균인자의 부재하에 바이러스로 인해 이미 용균될 수 있다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 외부인자가 없을 때 이와 같은 용균은 뉴클레아제 처리가 시작될 때, 숙주세포의 50% 미만, 바람직하기는 40% 미만, 더욱 바람직하기는 30% 미만, 여전히 더욱 바람직하기는 20% 미만으로 발생하고, 즉 바람직하기는 뉴클레아제는 세포가 각각 적어도 50%, 60%, 70%, 80%의 생존능력을 가질 때 첨가된다.
비록 바람직하지는 않지만(상기 참조), 외부 인자 없이 숙주세포의 용균에 의존하는 방법이 사용될 수 있다. "자발적" 용균을 포함하는 방법이 기재되었고, 여기서 벤조나제는 사용되지 않는다(미국 특허 6,485,958 참조). 그러나, 본 발명에 따르면 이와 같은 시스템에서도 배양의 마지막 단계 중, 즉 바람직하기는 바이러스가 여전히 증식되는 숙주세포가 적어도 5%, 바람직하기는 적어도 10%, 더욱 바람직하기는 적어도 20%의 생존능력을 가질 때(즉, 각각 세포의 95%, 90%, 80% 미만이 용균되었을 때) 뉴클레아제를 첨가하는 것이 유리할 것이다. 이것은 이 단계가 적용될 때 얻어진 바이러스의 품질면에서 방법을 개선할 것이라고 생각된다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 면은 숙주세포로부터 숙주세포를 용균시킬 수 있는 바이러스의 정제방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은: a)상기 숙주세포를 용균할 수 있는 바이러스를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계, b)외부인자에 의한 숙주세포의 용균없이 바이러스를 배양 유체로 방출한 후 바이러스를 수확하는 단계를 포함하고, 여기서 뉴클레아제는 숙주세포의 95%가 용균되기 전에 배양물에 첨가되는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 숙주세포의 90%, 바람직하기는 80%가 용균되기 전에 배양물에 첨가된다. 본 발명의 이들 면에서 뉴클레아제를 첨가하기 위한 최적의 순간(즉, 용균된 세포의 최적 비율에 상응)은 첨가된 뉴클레아제의 양과 배양 중 뉴크레아제의 특정 활성의 감소에 의존하고, 당업자들에 의해 실험적으로 발견될 수 있으며, 현재 뉴클레아제의 배양물에 대한 첨가비율은 본 발명자들에 의해 기재되었다. 분명히, 본 발명의 이 면에 따라 얻어진 용해질은 여과 및 크로마토그래피와 같은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법 및 단계를 적용함에 의해 추가로 정제될 수 있다.
국제특허출원 WO 03/097797은 세포 용해질로부터 아데노바이러스 입자들을 정제하는 선택적인 방법을 기재하고, 이것은 불순한 DNA를 침전시키기 위해 선택적 침전제를 첨가하는 것을 포함한다. 비록 이것은 상기 방법을 사용할 때 뉴클레아제 단계가 요구되지 않는다고 언급하고 있지만, 이와 같은 단계는 견고성을 위해 과정의 마지막 단계에서 사용된다. 숙주세포의 용균 전에 뉴클레아제를 첨가하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 방법은 용균 이후 선택적 침전제의 첨가와 적절히 결합될 수 있고, 그것에 의해 방법에서 (WO 03/097797에서 바람직했던)뉴클레아제 첨가 이후의 단계를 불필요하게 만든다.
국제특허출원 WO 02/070673은 숙주세포로부터 바이러스를 분리하기 위해 연속원심분리법을 사용한다: 세포 배양물은 세포를 펠렛으로 원심분리하기에 효과적인 조건하에서 연속적으로 원심분리되고, 펠렛화된 세포는 원심분리기로부터 세포를 용균시키기에 알맞는 조건하에서 수집 저장소로 배출되고, 그것에 의해 용해질을 얻는다. 분명히, 상기 방법에 따른 세포는 본 발명에 따른 '숙주세포를 용균하는'범위 내이고, 그러므로 이와 같은 방법은 본 발명으로부터, 연속적인 원심분리법을 수행하기 전에 뉴클레아제가 세포 배양물에 첨가되는 이익을 얻어야 한다고 예상되고, 이와 같이 개선된 방법은 용해질 및 따라서 최종 정제 산물에서 핵산 오염물을 낮춘다.
정화
본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이러스를 포함하는 숙주세포 용해질이 정화된다. 정화는 세포 부스러기 및 다른 불순물이 제거되는 여과단계에 의해 행하여진다. 적당한 필터는 효율적인 제거 및 수용가능한 회수를 위해, 셀룰로스성 섬유, 재생 셀룰로스성 섬유, 무기 필터 보조제(예를 들면, 규조토, 진주암, 연무된 실리카)와 결합된 셀룰로스성 섬유, 무기 필터 보조제 및 유기 수지와 결합된 셀룰로스성 필터 또는 그들의 혼합물, 및 중합성 필터(예를 들면, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에테르술폰을 포함하지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다)를 이용한다. 일반적으로, 복수단계의 공정이 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 예시적인 2- 또는 3-단계 공정은 성긴 필터에 의한 큰 입자 및 세포 부스러기의 제거와 그 이후 0.2 미크론보다 크지만 1 미크론보다 작은 구멍 크기를 갖는 제2 단계 필터에 의한 연마로 이루어질 수 있다. 최적의 조합은 다른 변수들과 마찬가지로 침전물 크기 분포의 함수일 수 있다. 이에 더하여, 상대적으로 단단한 필름을 사용하는 단일 단계 작업 또는 원심분리가 또한 정화를 위해 사용될 수 있다. 더욱 일반적으로, 여과법, 미세여과법, 원심분리법 또는 필터 보조제(예를 들면, 규조토)의 바디-공급을 포함하는 정화법이, 이후의 단계에서 막 및/또는 수지를 오염시키지 않는 적절한 투명도의 여과액을 제공하는 대드-엔드(dead-end) 또는 심층 여과법과 결합하여 본 발명의 정화단계에 사용하도록 허용될 수 있다.
한 구현예에서, 심층 여과와 막 여과가 사용된다. 이와 관련하여 시판되는 제품들은 예를 들면, WO 03/097797, p.20-21에 언급된다. 사용될 수 있는 막은 다양한 재료들로 구성되고, 구멍크기가 다르고, 그리고 조합이 다를 수 있다. 그들은 여러 벤더(vender)로부터 얻을 수 있다.
본 발명에 의해 특정 막은 본 발명의 방법에서, 다른 막과 비교하여 훨씬 개선된 정화를 제공하는, 기대 이상의 뛰어난 결과를 가져온다는 것을 발견하였다(실시예 4 참조).
그러므로, 본 발명의 바람직한 구현예는 정화를 위해 0.8㎛ 및 0.45㎛ 필터의 조합물, 바람직하기는 Sartopore-2 필터를 사용한다.
한외여과 / 정용여과
본 발명의 특정 구현예에서, 바이러스 현탁물은 예를 들면, 바이러스의 농축 및/또는 완충교환을 위해, 및/또는 정화된 수확물의 농축 및 정용여과를 위해, 과정 중 적어도 한번 한외여과/정용여과된다. 본 발명의 방법에 따른 바이러스의 농축을 위해 사용되는 방법은 희석물이 필터를 통과함으로써 바이러스의 농도를 증가시키는 어느 여과방법(예를 들면 한외여과(UF))을 포함할 수 있고, 이와 같은 방법에서 희석물은 바이러스 제제로부터 제거되는 반면, 바이러스는 필터를 통과하지 못하고 바이러스 제제 중에 농축된 형태로 남는다. UF는 예를 들면 Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Application, L.Zeman and A. Zydney(Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1996)에 상세히 기재된다. 바람직한 여과방법은 예를 들면, MILLIPORE catalogue "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp.177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96)에 기재된 바와 같은 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration:"TFF")이다. TFF는 세포 수확, 정화 및 바이러스를 포함하는 생성물의 농축과 같은 응용생물학적 (bioprocessing) 산업에 널리 사용된다. 이 시스템은 3가지의 특징적인 공정 흐름물로 이루어진다: 공급 용액, 투과물 및 투석유물. 적용에 따라, 다른 구멍크기를 갖는 필터가 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서 투과물은 생성물이고, 필요한 경우 추가의 정제 단계에 사용될 수 있다. 이 구현예에서, 선택된 특정의 한외여과막은 바이러스를 보유하도록 충분히 작지만 불순물은 효과적으로 정제하도록 충분히 큰 구멍 크기를 가질 것이다. 제조사 및 막 형태에 따라, 아데노바이러스의 경우, 100 ~1000 kDa의 명목분자량마감(nomimal molecular weight cutoffs:NMWC), 예를 들면, 300 kD 또는 500 kDa NMWC를 갖는 막이 바람직하다. 막 조성물은 재생 셀룰로스, 폴리에테르술폰, 폴리술폰 또는 그들의 유도체일 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 막은 평평한 시트 또는 중공섬유일 수 있다. UF는 일반적으로 0.1㎛ 미만의 구멍크기를 갖는 필터를 사용하는 여과법을 말한다. 생성물은 일반적으로 유지되지만, 그 부피는 투과를 통해 감소된다. 생물약제학적 분야에서 TFF를 위해 가장 널리 사용되는 두 개의 기하구조는 플레이트 & 프레임(plate & frame) 및 중공섬유 모듈이다. 한외여과 및 미세여과용 중공섬유 단위는 1970년대 초 Amicon 및 Ramicon에 의해 개발되었고(Cheryan, M. Ultrafiltration handbook) 현재 스펙트럼과 A/G 기술을 포함하는 다수의 벤더가 있다. 중공섬유 모듈은 막에 투과선택성(permselectivity)을 제공하는 조밀한 스킨층을 갖는 자립 섬유의 배열로 구성된다. 섬유의 직경은 0.5mm~3mm 범위이다. 중공섬유 모듈의 이점은 선형 및 단순한 일정비율로의 증가를 허용하는, 작은 막 영역(ca. 16cm2)으로부터 매우 큰 막 영역(ca. 28cm2)까지의 막의 이용가능성이다. 본 발명에 따른 특정의 바람직한 구현예에서, 중공섬유가 TFF에 사용된다. 이것은 편평한 스크린 막보다 작은 전단 및 더 나은 바이러스입자/감염성 단위(VP/IU) 비를 제공한다고 알려져 있다. 특정 구현예에서, 0.05㎛의 중공섬유가 본 발명에 사용된다.
한외필터를 이용한 정용여과(DF), 또는 완충교환은 염, 당, 결합종이 없는 비-수성 용매 분리물의 제거 및 교환, 또는 이온성 및/또는 pH 환경의 신속한 변화를 위한 이상적인 방법이다. 미세용질은 UF 속력과 동일한 속력으로 용매를 한외여과되어질 용액에 첨가함에 의해 가장 효율적으로 제거된다. 이것은 일정부피로 용액으로부터 미세종을 세척하여 보유된 바이러스를 정제한다. 본 발명은 추가의 크로마토그래피 또는 다른 정제단계에 앞서서 용해질의 완충액을 교환하기 위해 DF 단계를 이용한다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, TFF에 의한 DF는 완충교환을 위해 수행되고, 여기서 완충액의 첨가는 투과물의 제거와 동일하다.
UF/DF는 다른 기(stadia)의 정제 과정에서 본 발명에 따른 바이러스 현탁물, 예를 들면 용해질 및/또는 크로마토그래피된 것과 같은 추가로 정제된 바이러스 현탁액을 농축 및/또는 완충교환하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 구현예에서, 용해질은 UF/DF에 의해 5-배 농축되고, 생성된 농축 바이러스 현탁액은 일정부피 정용여과를 사용하여, 1M NaCl을 포함하는 완충액의 6 정용여과부피(DFV)로 완충교환된다. 이 높은 염농도는, 이 단계에서 여러 원하지 않는 단백질들이 손실되므로 생성 바이러스의 품질을 상당히 향상시킨다는 것이 발견되었다(실시예 2 참조). 그러므로, 본 발명에 따른 바람직한 구현예에서 정화된 용해질은 0.8~2.0M NaCl, 예를 들면, 약 1M NaCl을 포함하는 용액 또는 등가의 이온강도를 제공하는 다른 염에 대해 교환된다. 염의 음이온과 양이온이 교환될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다.
바이러스 현탁액은 음이온 교환 크로마토그래피 되기 전에 0.4M NaCl, 또는 등가의 이온강도를 제공하는 다른 염으로 완충교환될 수 있다. 한 구현예에서, 이것은 원하는 완충액의 4 DFV를 사용하여, 일정부피 정용여과법에 의해 수행된다.
추가 정제
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해, 바람직하기는 용해질의 정화 후에 얻어진 바이러스 현탁물은 본 분야의 당업자에게 일반적으로 알려져 있는 방법으로 추가 정제된다. 이것은 예를 들면, WO 98/22588, p.59-61에 기재된 바와 같은 밀도구배 원심분리법에 의해 달성될 수 있다.
그러나, 바람직하기는 추가의 정제는 WO 98/22588, p.61-70에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 겪는다. 많은 공정이 바이러스 추가정제에 관하여 기재되어 있고, 여기서 크로마토그래피 단계가 이 공정들에 포함된다. 당업자는 이 공정들을 이해할 것이고 본 발명의 방법을 최적화하기 위해 크로마토그래피 단계를 적용하는 정확한 방법을 변화시킬 수 있다.
예를 들면, 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토그래피 단계의 결합에 의해 특정 바이러스를 정제하는 것이 가능하다. 미국특허 6,008,036 참조.
또한, 아데노바이러스를 정제하기 위해 히드록시아파타이트 매질을 적용하는 것이 역시 가능하다. WO 02/44348 참조.
역상(reverse-phase) 흡착단계가 WO 03/097797, p.26에 기재된 바와 같이 또한 사용될 수 있다.
아데노바이러스 정제를 위해, 적어도 하나의 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 사용되는 것이 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 바이러스는 충분히 순수할 것이다. 그러나, 어떤 구현예에서 크기별 배제 크로마토그래피가 본 방법의 건장함을 증가시키기 위해 추가로 실시된다. 이 단계는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전 또는 단계 후일 수 있다. 물론, 다른 정제 단계가 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 적절히 결합 될 수 있다.
아데노바이러스 정제를 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 사용은 광범위하게 기재되어 있고, 따라서 이 면은 본 분야의 당업자가 쉽게 도달할 수 있다. 여러 다양한 크로마토그래피 매트리스가 아데노바이러스의 정제에 사용되고 있고 적절하며, 본 분야의 당업자는 바이러스의 정제를 위한 최적의 음이온 교환 재료를 예를 들면 다음 문헌을 참조로 쉽게 발견할 수 있다.
미국특허 5,837,520(또한, Huyghe, et al., 1995, Human Gene Theraphy 6: 1403-1416 참조)는 아데노바이러스를 정제하는 방법을 개시하고, 여기서 숙주세포 용해질은 뉴클레아제, 이어서, 음이온 교환 및 금속이온 친화 크로마토그래피로 처리된다.
미국특허 6,485,958은 재조합 아데노바이러스의 정제를 위한 강한 음이온 교환 크로마토그래피의 사용을 개시한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 아데노바이러스 입자의 정제를 위한 유체화 베드 칼럼으로 적용된다. WO 00/50573 참조.
또한, 아데노바이러스 입자의 정제를 위한 확장 베드 음이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피용 특정 크로마토그래피 수지는 미국특허 6,586,226에 기재되어 있다.
음이온 교환 칼럼에 더하여, Pall(예를 들면, MustangTM 시리즈) 및 Sartorius(예를 들면, Sartobind 시리즈)에 의해 생성된 것과 같은 음이온 교환 막 크로마토그래피 생성물이 적절하다. 아데노바이러스 정제에 있어서 이들 필터의 용도 및 그들의 장점은 예를 들면 WO 03/078592를 참조하라. 분명히, 이와 같은 필터의 적용은 여기서 사용되는 바와 같은 '음이온 교환 크로마토그래피'의 범위 내에 속한다.
미국특허 6,537,793은 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 숙주세포로부터 아데노바이러스 입자를 정제하는 것을 기재하고, 특히 이 목적을 위한 크로마토그래피성 담체인 Q 세파로스 XL형의 바람직함을 설명한다. 본 발명의 구현예에서, 아데노바이러스는 Q 세파로스 XL 칼럼을 사용하여 추가로 정제된다.
상기와 같이, 방법은 추가로 크기별 배제 크로마토그래피 단계를 적절히 적용할 수 있다.
국제출원 WO 97/08298은 음이온 교환 및 크기별 배제 단계를 포함하여, 바이러스의 손상을 막기 위한 특정 크로마토그래피 매트릭스를 사용한 아데노바이러스의 정제를 기재한다.
미국특허 6,261,823은 아데노바이러스를 정제하는 방법으로, 여기서 아데노바이러스 제제는 음이온 교환 크로마토그래피 및 이어서 크기별 배제 크로마토그래피 된다. 크기별 배제 단계에서, 저분자량의 불순물로부터 바이러스 입자의 그룹 분리가 이루어진다. 본 발명의 특정 구현예에 따라, 칼럼 부피의 약 15~30%, 바람직하기는 약 20%가 크기별 배제 칼럼(크기별 배제 크로마토그래피의 그룹 분리모드)에 장전된다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 아데노바이러스 현탁액은 음이온 교환 크로마토그래피 단계 및 크기별 배제 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제된다.
WO 03/078592는 아데노바이러스(Ad5) 정제를 위해 고출력 음이온 교환 필터(즉, 음이온 교환 기들을 함유하는 하전된 필터)의 사용을 기재한다. 음이온 교환 칼럼에 대하여 이와 같은 하전된 필터의 장점은 다음과 같다: (ⅰ)더 빠른 유속, (ⅱ)더 높은 결합능, (ⅲ)더 높은 바이러스 회수, (ⅳ)임상적 사용에 요구되는 패킹 또는 세척 증명이 없음, 및 (ⅴ)일회용 필터 카트리지가 사용될 때 수명 및 저장 문제가 없음. 상기와 같이, 이와 같은 음이온 교환 필터의 사용은 본 발명의 구 현예이고, 본 발명에서 '음이온 교환 크로마토그래피'의 범위에 속한다고 간주되는 구현예이다. 그러나, 칼럼 크로마토그래피와 동등한 것에 더하여, 본 발명자들은 놀랍게도 음이온 교환 칼럼의 사용보다 뛰어난, 음이온 교환 필터를 사용하는 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35) 정제의 장점을 발견하였다: 아데노바이러스 입자에 병합되지 않은 특정 아데노바이러스 단백질은 음이온 교환 칼럼에 의해서가 아니라 음이온 교환 필터의 사용에 의해 아데노바이러스 입자로부터 분리된다. 이와같은 유리 아데노바이러스 단백질은 이전에는 재조합 아데노바이러스 입자의 제조에서 발견되지 않았지만, 이제는 유리 아데노바이러스 단백질을 포함하는 재조합 아데노바이러스 제제가 음이온 교환 기를 함유하는 하전 필터를 사용하는 단계를 사용하여 제거될 수 있다. 하전된 필터를 사용하는 이 효과는 WO 03/078592에 기록되어 있다. 이에 더하여, WO 03/078592는 Ad35, 또는 서브그룹 B의 다른 아데노바이러스의 정제를 위한 음이온 교환 필터의 적용을 개시하지 않는다. 그러므로, 본 발명은 프리 아데노바이러스 단백질을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 음이온 교환 기를 함유하는 하전된 필터로 처리하는 단계를 포함하는, 재조합 아데노바이러스로부터 유리 아데노바이러스 단백질을 제거하는 방법을 제공한다. 이론에 얽매임 없이, 서브그룹 B의 재조합 아데노바이러스 입자의 가능한 한 다소 낮은 안정성은(WO 2004/001032 참조) 아데노바이러스 입자에 병합되지 않는 것으로 보인다고 생각할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 이 특정한 방법은 Ad35, Ad11 등과 같은 서브그룹 B의 재조합 아데노바이러스의 정제에 특히 유용하다. 그러나, 본 방법이 더욱 안정한 Ad5 또는 Ad2 기재 아데노바이러스의 정제를 개선하는 것 역시 가능하다. 본 발명은 재조합 아데노바이러스 제제로부터 유리(즉, 바이러스 입자에 병합되지 않은) 아데노바이러스 단백질의 제거를 위한 음이온 교환 필터의 사용을 제공한다. 바람직하기는, 상기 재조합 아데노바이러스 제제는 재조합 Ad35와 같은, 재조합 서브그룹 B 아데노바이러스를 포함한다. 또한 본 발명은 Ad35 입자와 같은 재조합 서브그룹 B 아데노바이러스 입자의 정제방법을 제공하고, 상기 방법은 Ad35 입자와 같은 재조합 서브그룹 B를 음이온 교환 필터 정제되도록 하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 알맞는 음이온 교환 필터는 본 분야에 잘 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다(WO 03/078592, 문단 [40]~[41], 예를 들면, Pall(예를 들면, MustangTM 시리즈) 및 Sartorius(예를 들면, Sartobind 시리즈) 참조).
완충액
여러 완충액이 본 발명에 따른 바이러스의 정제 중 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구현예에서, UF/DF 및 음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 완충액은 일반적으로, 0.4~1.0M NaCl/50mM TRIS pH7.5를 함유하고, 여기서 NaCl의 농도는 공정 단계에 의존하였다. 바람직한 구현예에서, 정화 후 사용된 완충액은 계면활성제, 염화마그네슘 및 당을 포함하지 않는다. 이들 첨가재의 부재는 이들 완충액을 공지의 확립된 프로토콜에 사용된 것들과 구별 짓는다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 방법이 적용될 때, 정제되고 실질적으로 비-응집된 아데노바이러스가 얻어진다. 이들 첨가제가 없는 완충액의 사용의 이점은 이들이 제조하기 쉽고, 저렴하고, 첨가재의 제거에 대한 시험이 필요 없다는 것이다.
본 발명에 따른 한 구현예에서, 아데노바이러스는 그룹 분리 동안 아데노바이러스 세계표준으로 사용될 수 있는 완충액으로 완충교환되고-최종적으로 보관된다(Hoganson et al, Development of stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing March 2002, p.43-48): 20mM Tris pH 8, 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤.
당연히, 여러 다양한 완충액이 사용될 수 있고, 정제된 (아데노)바이러스의 약제학적 투약을 위한 적절한 제형의 여러 예는 예를 들면, 유럽특허 제 0853660호 및, 국제특허출원 WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763에서 발견된다.
특이적 삽입물을 갖는 벡터
본 분야에서, 트란스유전자 자체는 일반적으로 정제 공정에 관련이 없는 것으로 간주된다. 그러나, 여기서 본 바와 같이, 트란스유전자는 특정한 경우에 숙주세포에서 또는 바이러스에서 그것의 발현에 의해 바이러스의 특성에 영향을 주거나 또는 바이러스의 정제과정에 영향을 줄 수 있다.
본 발명자에게 발견된 이와 같은 비-제한적인 특이 경우는 트란스유전자가 에볼라바이러스 핵단백질인 경우이다. 표준 정제방법으로 에볼라바이러스 핵단백질 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 정제하는 것은 발현된 에볼라바이러스 핵단백질의 공동-정제를 가져온다. 몇몇 다른 트란스유전자 발현 단백질의 공동-발현은 발견되지 않았다(예를 들면, 에볼라 당단백질 dTM(수단), 에볼라 당단백질 dTM(자이레), 홍역 적혈구응집소 단백질(MV-H)을 갖지 않음). 이것은 에볼라 핵단백질과 아데노바이러스 간의 특정 상호작용을 제안하며, 이것은 에볼라 핵단백질의 특성에 의존하는 것으로 보인다. 다른 핵산 결합 단백질은 유사한 특성을 가질 것으로 예상되며 공동-정제를 가져오는 아데노바이러스와의 상호작용을 가질 것으로 예상된다. 에볼라바이러스 핵단백질 등의 핵단백질과 같은 핵산결합 단백질을 포함하는 이와 같은 트란스유전자를 갖는 아데노바이러스의 경우, 완충액을 1M NaCl보다 높은 염 농축물로 교환하고, 최종 생성물의 품질을 개선하기 위해 예를 들면, 2~5M NaCl 완충액을 사용하는 것이 유리하다(실시예3 참조). 선택적으로, 완충교환을 위한 다른 방법이 사용될 수 있고, 예를 들면, 고체 물질 또는 농축 용액의 첨가에 의한 일반적인 방법으로 염을 바이러스 현탁물에 직접 첨가할 수 있다. 본 발명의 이 면은 예를 들면, 용균 전에 뉴클레아제를 첨가함에 의해, 본 발명의 다른 면과 유리하게 결합될 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 고염류 완충액의 사용은 예상외로 응집문제를 가져오지 않고 정제된 바이러스 입자의 감염성 또는 완전성에 심각한 열화를 가져오지 않는다. 본 발명의 이 면에서, 완충교환단계는 바람직하기는 음이온 교환 크로마토그래피로부터 바이러스의 용출 후, 그리고 바람직하기는 추가 정제단계 전에 일어난다. 이와 같은 추가 정제 단계는 예를 들면, 그룹 분리 모드에서 입자별 배제 단계일 수 있다. 이 마지막 단계는 바이러스 현탁물의 광택을 위해, 즉 음이온 교환 후에 여전히 존재하는 소량의 불순물을 제거하기 위해 사용될 수 있지만, 또한 그룹 분리 칼럼에서 직접적인 완충교환을 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 추가의 정제 단계는 크기별 분리 대신에 Durapore PVDF 필터(예를 들면, Millipac from Millipore) 또는 Sartopore 2 필터와 같은 친수성 필터를 통한 고염류 농축물을 포함하는 바이러스 현탁물의 분리를 포함할 수 있다. 필터는 바람직하기는 1.2㎛의 구멍크기, 더욱 바람직하기는 더 작은, 예를 들면, 1.0㎛, 더욱 바람직하기는 더욱 작은, 예를 들면, 0.8㎛, 0.45㎛, 또는 0.22㎛의 구멍크기를 가질 수 있다. 예상외로, 약 100kD의 분자량을 갖는 핵단백질(NP)은 아데노바이러스와 함께 필터 구멍을 통과할 것으로 예상되는 반면, 에볼라바이러스의 NP는 이와 같은 조건하에서 필터에 유지됨으로써 재조합 아데노바이러스로부터 분리될 수 있다는 것이 발견되었다. 이와 같은 필터의 사용은, 이 과정에서 고염류에서의 연장된 배양을 요구하지 않고, 반면 바이러스로부터 핵단백질의 완전한 제거를 허용함으로써, 바이러스로부터 핵단백질을 분리하기 위한 신속한 용액을 제공한다(도 9 참조). 물론, 크기별 배제 크로마토그래피 단계는 다른 소량의 오염물의 제거 및/또는 완충액의 교환을 위해 여전히 이와 같은 여과 단계 후에 적용된다.
DNA 결합 단백질을 제거하기 위한 고염류의 사용은 아데노바이러스 보다 다른 바이러스에 유용할 것으로 예상되는 본 발명의 한 면이다. 아마도 또 다른 칼럼 크로마토그래피 단계가, 이 경우 음이온 교환 크로마토그래피 대신 적용될 것이다. 중요한 인자는 고염류 단계가 적용되기 전에 오염된 물질을 충분히 제거하는 것으로 보이며, 또한 재조합 아데노바이러스의 경우에도, 물론 이 제거는 음이온 교환 크로마토그래피 이외의 다른 수단에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 추가로 핵산 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스의 생산방법을 제공하고, 상기 방법은: a)바이러스로 감염된 숙주세포를 배양하는 단계, b) 숙주세포의 상기 배양물과 여기서 생산된 상기 바이러스를, 상기 바이러스를 포함하는 용해질을 제공하도록, 숙주세포의 용균이 일어나도록 하는 단계, c) 바이러스를 음이온 교환 크로마토그래피 시키는 단계를 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 후, 바이러스를 함유하는 혼합물을 적어도 1M NaCl 또는 등가의 이온강도를 제공하는 또 다른 염을 포함하는 용액으로 완충교환하는 것을 특징으로 한다.
바람직하기는, 바이러스는 친수성 필터를 통한 여과를 포함하는 적어도 하나의 단계 및/또는 크기별 배제 크로마토그래피를 포함하는 적어도 하나의 단계를 사용하여 추가로 정제된다. 이러한 구현예의 경우, 적어도 1M NaCl 또는 등가의 이온강도를 갖는 다른 염을 포함하는 용액은 '고염류' 용액으로 언급된다. 명백히, 본 방법은 DNA 결합 단백질과 정제된 바이러스 사이의 이온적 상호작용의 파괴에 의존하는 것으로 보이므로, 음이온과 양이온 모두 본 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이 침전 또는 바이러스의 불활성화와 같은 다른 바람직하지 않은 부작용 없이 충분한 이온강도가 제공되는 한 변할 수 있다. 예를 들면, NaCl은 예를 들면, KCl, 인산나트륨, CsCl, LiCl, (NH4)SO2, NH4Cl, NaBr, NaI, KBr, KI, KNO3, NaHCO3, KHSO4 등과 같은 다른 염으로 부분적으로 또는 전체적으로 대체될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 (5M NaCl을 포함하는) 완충액의 5배 희석물은 78~79 mS/cm의 전도도를 갖는다. 다른 염을 포함하고, 그리고 비슷하거나 더 높은 전도도를 갖는 완충액은 예를 들면, 본 발명에 따른 부분적으로 정제된 바이러스로부터 DNA 결합 단백질의 제거시의 안정성에 관하여 쉽게 테스트될 수 있다. 이 구현예는 NaCl 포화농도(약 6M NaCl)까지 실시될 수 있지만, 실제적인 이유로 포화되지 않은 것, 예를 들면 5M NaCl이 바람직하다. 바람직하기는, 용액은 적어도 1.5M NaCl 또는 등가의 이온강도를 제공하는 또 다른 염을 포함한다. 더욱 바람직하기는 용액은 적어도 2M NaCl, 또는 등가의 이온강도를 제공하는 또 다른 염을 포함한다. 더욱 바람직하기는 용액은 적어도 3M NaCl, 또는 등가의 이온강도를 제공하는 또 다른 염을 포함한다. 더욱 바람직하기는 용액은 적어도 4M NaCl 또는 등가의 이온강도를 제공하는 또 다른 염을 포함한다. 더욱 바람직하기는 용액은 약 5M NaCl, 또는 등가의 이온강도를 제공하는 또 다른 염을 포함한다. 바이러스를 포함하는 고염류 용액은 특정시간, 바람직하기는 적어도 1시간, 더욱 바람직하기는 적어도 2시간 동안 배양될 수 있다. 일반적으로, 실시예는 배양이 더 길어질수록, 적어도 최대 밤새도록 배양되면 바이러스로부터 DNA 결합 단백질이 더욱 정제됨을 나타낸다. 더우기, 이온강도가 높을수록 정제가 향상되는 것으로 보인다. 따라서, 1M 또는 1.5M NaCl의 이온강도 및 적어도 2일 또는 일주일의 연장된 배양에서도 바이러스로부터 DNA 결합 단백질의 정제가 가능하다고 생각된다. 이것은 여기에 기재된 실험에 의해 일상적으로 확인될 수 있다. 5M NaCl을 포함하는 완충액에서 에볼라바이러스 핵단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스의 밤샘 배양은 바이러스로부터 오염된 핵단백질을 검출한계 이하로 제거하였고, 그러므로 본 발명의 바람직한 구현예이다. 바람직한 구현예에서, 바이러스는 재조합 아데노바이러스이다. 특정 구현예에서, 상기 핵산 결합 단백질은 에볼라바이러스 핵단백질이다. 바람직한 구현예에서, 완충교환은 음이온 교환 크로마토그래피 후 및 여과 및/또는 입자별 배제 크로마토그래피 단계 전에 일어난다. 용해질의 뉴클레아제 처리를 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 그것에 의해 본 발명의 다른 면에 따라, 바람직하기는 용균이 완전해지기 전에 뉴클레아제가 세포 배양물에 첨가된다. 고염류 대신 또는 그것에 더하여, 계면활성제가 오염된 DAN 결합 단백질로부터 바이러스를 정제하기 위해 첨가될 수 있다. 한 실험에서, 본 발명자들은 1% Tween 20의 첨가가 에볼라 핵단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스로부터 오염된 핵단백질을 상당히 감소시킨다는 것을 발견하였다. 물론, 다른 계면활성제들이 적절히 시험될 수 있고, 본 발명에 따른 재조합 바이러스 제제로부터 DNA 결합 단백질의 제거를 위한 최적 조건을 찾기 위해 농도는 약 0.2%~5%에서 변할 수 있다. 이 면에서, 바람직하기는 적어도 1% 계면활성제가 첨가된다. 그러나, 본 발명자들의 첫번째 실험은 이 목적에 대한 고염류 배양의 더 높은 재현가능성을 나타내고, 그러므로 이것이 바람직하다.
재조합 아데노바이러스의 배치(Batches)
한 면에서, 본 발명은 에볼라바이러스 핵단백질, 에볼라바이러스 당단백질,열대말라리아원충, 서컴스포로조이트 유전자, 및 홍역 바이러스 혈구응집소로 이루어진 군으로부터 선택된 트란스유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 배치를 제공하고, 상기 배치는 1E11 바이러스 입자당 숙주세포 DNA를 0.1ng 미만으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 물론, 이들 트란스유전자는 본 발명의 이 면의 범위로부터 벗어남 없이, 모든 분리물 또는 서브타입을 포함하여, 천연적으로 발견되는 야생형 서열과 비교하여 임의로 결실, 첨가 및/또는 돌연변이를 함유할 수 있다. 분명히는, 개체에 투여하기 위한, 조절 목적을 위해 이미 요구되는 것이 아니라면, 소량의 이용가능한 오염된 숙주세포 DAN를 갖는 배치를 갖는 것이 유리하다. 바람직한 면에서, 배치는 1011 바이러스 입자당 숙주세포를 0.08 ng 미만, 더욱 바람직하기는 0.06ng, 더더욱 바람직하기는 0.04ng 함유하는 것을 특징으로 한다.
도 1은 공지의 세포 수확법(T/B)과 실시예 1을 참조로 한 본 발명에 따른 방법(B/T)의 도해이다. T 트리톤, B: 벤조나제. p.i.:감염 후.
도 2는 T/B 대 B/T 후 정화법에서 숙주세포 단백질의 이동을 나타내는 도면이다(도해에 관하여 도 1을 참조). 공정 중 5개의 분리된 정제물 샘플에서의 은-오염된 SDS-PAGE(4~12% 비스-트리스 NuPAGE, Invitrogen) 분석을 나타내었다(샘플에 관하여 실시예 1 및 표 1 참조). 패널 2는 T/B 수확물로부터이며, 여기서 용균은 뉴클레아제 첨가보다 선행되었다; 패널 3~7은 B/T 수확물로부터이며, 여기서 뉴클레아제는 용균되기 전에 첨가되었다. 수확물(라인 1)은 0.5㎛ Clarigard 필터(라인 2), 그리고 0.8/0.45 ㎛ Sartopore 2 필터(라인 3)에 의해 정화되었다. M: 마커, kD 단위의 Mw를 옆에 기재하였다.
도 3은 공정 중 고염류 이동 히스톤을 갖는 정용여과를 나타낸 도면이다. 은-오염된 SDS-PAGE를 나타내었다.
A. 침투. 샘플: 1:초기 침투. 2:4x 농축 후. 3: 제1 DFV 0.3M NaCl. 4:제3 DFV 0.6M NaCl. 5:제4 DFV 0.6M NaCl. 6:제5 DFV 1.0M NaCl. 7:제6 DFV 1.0M NaCl. 8:제7 DFV 0.3M NaCl. 9:제9 DFV 0.3M NaCl. M:마커, kD 단위의 Mw를 옆에 기재하였다.
B. 투석유물. 샘플: 1:출발 샘플. 2: 4x 농축 후. 3: 제1 DFV 0.3M NaCl. 4:제2 DFV 0.6M NaCl. 5:제6 DFV 0.6M NaCl. 6: 제7 DFV 1.0M NaCl. 7:제8 DFV 1.0M NaCl. 8:제9 DFV 0.3M NaCl. 9:제9 DFV 밀렉스(샘플 8의 0.22㎛ 여과물). M:마커, kD 단위의 Mw를 옆에 기재하였다.
도 4는 본 발명에 따른 바람직한 방법의 도해이다(실시예 1 참조).
도 5는 재조합 바이러스 조제로부터 에볼라 핵단백질(NP)의 이동을 나타낸다(상세한 것은 실시예 3, 실험 3.1 참조). 은-오염된 DSD-PAGE(4~12% 비스-트리스 NuPAGE, Invitrogen)를 나타내었다. A:출발물질. B:1% Tween 20으로 배양. C: 2.5M NaCl로 배양. 화살표는 NP를 나타낸다.
도 6은 재조합 바이러스 조제물로부터 에볼라 핵단백질의 이동실험을 나타낸다(상세한 것은 실시예 3, 실험 3.3 참조).
도 7은 재조합 바이러스 조제로부터 에볼라 핵단백질의 이동에 관한 비-환원된 SDS-PAGE(패널1) 및 웨스턴 블롯(패널 2)분석을 나타낸다(상세한 것은 실시예 3, 실험 3.3 참조). 라인 A,B,C는 각각 생성물 A,B,C를 함유한다(도 6 및 실험 3.3 참조). 웨스턴 블롯 분석의 경우, 항체 인식 NP를 사용하였다. 화살표는 NP를 표시한다.
도 8은 재조합 바이러스로부터 에볼라 핵단백질(NP)의 이동에 관한 RP-HPLC 분석을 나타낸다. 생성물 A, B 및 C가 분석되었다. 상세한 것은 실시예 3, 실험 3.3을 참조, 수직축은 AU 단위(x 10-3)이다. 수평축 아래(용균시간), 화살표 1은 헥손 단백질의 피크를 나타내고 화살표 2는 NP의 피크를 나타낸다.
도 9는 고염류 및 여과를 사용한 재조합 바이러스 조제로부터 에볼라 핵단백질(NP)의 이동을 나타내는 SDS-PAGE(패널A) 및 웨스턴 블롯(패널 B)을 나타낸다. 음이온 교환 크로마토그래피 후, 샘플을 5M NaCl을 포함하는 용액으로 완충교환하였다. 샘플을 0.45㎛ 밀리팩 20 필터를 통해 직접 여과하였다(Millipore). 라인 1: 여과 전, 라인 2: 여과 후. 웨스턴 블롯의 경우, 항체인식 NP를 사용하였다. 화살표는 NP를 나타낸다.
도 10은 Q-XL 칼럼(패널 A) 및 하전된 필터(패널 B)에 장전된 Ad35 TFF 투석유물을 나타낸다(실시예 6). 패널 B의 원은 여분 피크를 나타내고, 이것은 하전된 필터를 사용한 바이러스 피크로부터만 분리된다.
도 11은 하전된 필터 크로마토그램의 두 분획의 디스크 원심분리분석을 나타낸다. 패널 A는 Ad35 바이러스 피크의 퇴적 측면도를 나타내고, 패널 B는 여분 피크(도 10의 원부분)의 퇴적 측면도를 나타낸다.
도 12는 크로마토그래피 분획 Ad35의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다(실시예6 참조). 4~12% 비스-트리스 겔은 은으로 오염되었다. 겔 A는 하전된 필터 작동 1의 부분을 나타낸다. 1: 마커, 2:출발물질, 3: 유동물, 4: 피크 1(도 10의 원부분), 5: Ad35 피크. 겔 B는 Q-XL 작동의 부분을 나타낸다: 1: 출발물질, 2: 유동물, 3: Ad 피크.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예에 의해 본 발명을 더욱 설명하기 위해 포함되고, 어느 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1. 뉴클레아제를 숙주세포 용해질 대신 세포 배양물에 첨가하는 것은 바이러스 정제방법을 개선한다.
이 실험에서, 세포의 용균 전에 세포 배양물에 뉴클레아제를 첨가하는 것은 최종 정제 부피에서 잔류 숙주세포 DNA의 양을 감소시킨다는 것으로 나타난다.
작동 1 및 2에서, 10리터 PERC.6® 세포 배양물은 1% Triton-100®(Sigma)로 아데노바이러스 벡터로 감염된 후 제 2.5일에 용균되었다. 용균 30분 후, Benzonase®(Merck KgaA, 50 unite/㎖) 및 MgCl2(2mM)을 첨가하였다. 또 다른 30분 후, Triton X-100®/Benzonase®(T/B) 수확물을 여과하여 정화하였다. 그러므로, 이것은 본 분야에 알려진 방법에 따라 작동되었다.
작동 3~8에서, Benzonase®(50 U/㎖) 및 MgCl2(2mM)을 10리터 PERC.6 세포 배양물에 첨가하였고(감염 후 제 2.5일), 그리고 감염 10분 후 세포를 1% Triton X-100®(Sigma)로 용균시켰다. 50분 동안의 추가 배양 후, Benzonase®/Triton X-100®/(B/T) 수확물을 여과하여 정화하였다.
그러므로, 본 분야에 알려진 방법과의 차이는 뉴클레아제(Bensonase®)와 계 면활성제(Triton X-100®)가 첨가된 순서이다: 관행적으로는, 우선 세포가 용균되고, 이어서 뉴클레아제가 첨가되는 반면(여기서는 T/B 수확물로 언급됨), 본 발명에 따른 방법에서는 우선 뉴클레아제가 첨가되고 이어서 세포가 용균된다(여기서는 B/T 수확물로 언급됨). 이것은 도 1에 도해적으로 나타내었다.
그리고 나서 샘플을 추가로 정제하였다. 정화는 심층 여과법(0.5㎛ Clarigard filter, Millipore)에 의해 실시되었고 이어서 0.8/0.45㎛ Sartopore 2(Sartorius) 필터로 추가 정화되었다. 정화된 재료는 0.05㎛ 중공섬유(Spectrum)를 통해 5배로 농축되었고, 이어서 1.0M NaCl/50mM TRIS pH 7.5의 6 부피 및 0.4M NaCl/50mM Tris pH 7.5의 4 부피로 정용여과되었다. 정용여과된 침투물은 세파로스 Q-XL(Amersham) 칼럼에 장전되었고 바이러스 분획은 0.55M NaCl/50mM TRIS pH 7.5로 용출되었다. 이 분획은 추가로 정제되었고 세파로스 4FF(Amersham)로 완충교환되었다. 생성된 정제물 부피는 중공섬유(0.05㎛ 구멍크기, Spectrum)로 원하는 농도까지 농축되었고, 0.22 ㎛ 여과되었고, 등분되었다. 정제된 부피 샘플을 Q-PCR에 의해 잔류 숙주세포에 대하여 분석하였다.
T/B 처리는 DNA의 감소를 가져왔고 추가의 하류방향 처리 후 채워지고 마감된 재료에 대해 요구되는 명세서에 정확히 부합될 수 있었다. 생 바이러스 형성을 위해 잔류 숙주세포 DNA에 대한 조절 요구는 투여량 당 <10 ng이다(투여량은 1E11 바이러스 입자를 갖는다고 가정).
표 1에 나타낸 바와 같이, Triton X-100®과 Benzonase® 단계를 반대로 하는 것은 정제된 부피에서 잔류 숙주세포 DNA의 양을 상당히 감소시켰다: 활성 세포 용균 전에 뉴클레아제를 첨가함에 의해 잔류 숙주세포 DNA의 양은, 0.1 ng/1E11 바이러스 입자 미만까지 10~40배 감소될 수 있었다.
추가로, SDS-PAGE 분석(도 2)으로부터, B/T 수확물이 심층 여과 및 막 여과에 의해 정화된 후, 많은 히스톤 단백질, 그들 중 상당량의 히스톤 단백질(겔 위의 약 10~20 kD의 MW, 질량 크로마토그래피에 의해 확인된 동정)이, 이들 단백질이 정화된 TB 수확물 중 분명히 여전하게 존재하는 한, 정화 중 제거되었다는 것이 분명하다.
따라서, 본 발명에 따른 공정은 선행기술로부터 알려진 것보다 상당한 이점을 가져온다. 이론에 얽매임 없이, 한 면에서의 작동 1 및 작동 2(T/B)와, 다른 면에서의 작동 3~8(B/T) 간의 차이에 대한 가능한 설명은 다음을 포함한다:
1. Benzonase®의 첨가 후, 바이러스 생산으로 인한 용균된 세포로부터 방출된 DNA는 이미 소화될 수 있다. DNA가 Triton에 의해 용균된 세포로부터 방출되자마자, Benzonase®이 DNA를 소화시키기 위해 즉시 존재하고, 그것에 의해 큰 DNA 응집물의 형성을 막는다. 비-응집된 DNA의 소화는 아마도 큰 DNA 응집물의 소화보다 더욱 효과적일 것이다.
2. Benzonase®의 전체 배양 시간은 30분으로 증가되고, 더욱 효과적인 소화를 가져온다(Benzonase® borchure Merck kGaA code W 214950 참조).
3. DNA가 방출 후 즉시 소화되면 아마도 더 큰 히스톤 복합체가 형성되고 이들 더 큰 입자들은 정화 필터에 의해 보유된다. 정화 중 히스톤-DNA 복합체의 유지 는 잔류 숙주세포 DNA의 감소에도 기여할 것이다.
예를 들면, QAE 550C 및 Super Q 650M(Tosoh사 제품), Q 세파로스 HP, ANX 세파로스 4FF, DEAE 세파로스, Q 세파로스 XL, Q 세파로스 빅 비드(Big Bead) 및 Q 세파로스 FF(Amersham 제품)과 같은 몇몇 음이온 교환수지를 시험하였다.
비록 이들 수지들이 재조합 아데노바이러스의 정제에 적합하지만, 본 발명자들은 숙주세포 단백질과 숙주세포 DNA로부터 바이러스의 분리 및 흐름특성을 기준으로 Q 세파로스 XL가 본 발명의 목적에 가장 적절하다는 것을 발견하였다.
몇몇 크기별 배제 수지, 예를 들면 세파크릴 S300, 세파크릴 S500, 세파로스 4FF 및 세파로스 6 FF를 시험하였다(모두 Amersham 제품). 비록 이들 수지 모두가 재조합 아데노바이러스의 정제에 적절하였지만, 본 발명자들은 숙주세포 단백질과 DNA로부터 바이러스를 분리하는 능력을 기준으로 세파로스 4FF가 본 발명의 목적에 가장 적절하다는 것을 발견하였다.
이들 및 다른 결과들을 기준으로(이하 참조), 본 발명에 따른 바람직한 공정을 도 4에 도시하였다.
실시예 2. 고염류 완충액과의 완충교환은 바이러스 공정을 개선한다.
PER.C6 세포를 10L 생물반응기에서 성장시키고 (WO 2004/037294에 기재된, 트란스유전자로서 홍역 바이러스 혈구응집소를 갖는) Ad5.Adapt.MV-H으로 감염시켰다. 감염 후 제 2.5일에 세포를 1% Triton®X-100으로 용균시키고, 30분 후에 Benzonase®(50 units/㎖) 및 MgCl2를 첨가하였고 또 다른 30분 동안 배양하였다. 수확물을 0.5㎛ Clarigard 필터 및 이어서 Millistak DE 30/60 필터(Micropore)로 정화시켰다. 정화된 수확물을 0.6M NaCl/50 mM HEPES pH 7.5의 등가 용량으로 희석시켜, 0.3M NaCl의 최종농도를 가져왔다. 희석된 정화된 수확물을 500 kD 평면스크린 카세트로 4배 농축시키고(Biomax 500, Pellicon 2 Module Millipore) 이어서 0.3M NaCl/50 mM HEPES pH 7.5의 2 정용여과용적(DFV); 0.6M NaCl/50mM HEPES pH 7.5의 2 DFV; 0.1M NaCl/50mM HEPES pH 7.5의 2 DFV; 0.3M NaCl/50mM HEPES pH 7.5의 3 DFV으로 정용여과시켰다. 생성된 침투물의 전도도를 측정하고 샘플을 SDS-PAGE으로 분석하였다(도 3). 데이타는 히스톤(겔 상의 약 10~20 kD Mw, 동정은 질량 스펙트럼으로 확인)이, 침투물의 염농도(및 투석유물의 염농도)가 0.55~0.85 M NaCl의 범위 또는 그 이상일 때 막 구멍을 통과한다는 것을 나타낸다.
가능한 설명은 정전기적 상호작용이 이들 염 농도에서 깨어지고 그 결과 복합체로부터 히스톤이 방출되어 500 kD 구멍을 통과한다는 것이다. 이 실험으로부터, UF/DF 단계 중 고염류 완충액의 도입은 숙주세포 단백질, 특히 히스톤 단백질의 더욱 효과적인 제거를 가져온다고 추론된다.
비록 이 실험에서 세포는 처음 용균되었고 이어서 뉴클레아제로 처리되었지만(T/B), (0.55M NaCl보다 높은, 예를 들면 1M NaCl) 고염강도를 갖는 완충액에 대한 정용여과는 세포들이 용균되기 전에 뉴클레아제가 세포에 첨가되는본 발명에 따른 공정(B/T, 실시예 1 참조)에서, 이미 히스톤 오염물이 거의 없는 B/T 공정에서 조차도 유리하다고 예상된다(도 2 참조).
그러므로, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서, 정화된 용해질은 0.8~2.0M NaCl, 바람직하기는 약 1M NaCl, 또는 등가의 이온강도를 제공하는 다른 염을 포함하는 용액에 대해 교환된다(실시예 1 및 도 4 참조).
실시예 3. 재조합 바이러스 제제로부터 오염된 핵단백질의 제거.
트란스유전자로서 에볼라 핵단백질을 갖는 재조합 아데노바이러스의 생성이 실시예 5에 기재된다. 본 실시예는 이와 같은 바이러스의 정제를 기재한다.
실험 3.1
Ad5dE3x.Adapt.Ebo.Np를 기재된 프로토콜로 정화하였다(실시예 1, 도 4 참조). 이 방법은 바이러스를 갖는 발현된 에볼라 핵단백질(NP) 트란스유전자의 공동-정제를 가져온다. 채워지고 마감처리된 생성물을 5M NaCl(최종농도 2.5M) 또는 2% Tween 20(최종농도 1%)를 함유하는 완충액과 1:2로 희석하였고 세파로스 4FF 칼럼에 장전하기 전에 실온에서 1시간동안 배양하였다. 공극과 지연분율(retarded fraction)을 SDS-PAGE로 분석하였다. 결과(도 5)는 공극 분율이 완전한 NP을 오염시킴없이 아데노바이러스 타입 5를 함유한다는 것을 나타낸다. 지금까지, 고염류를 갖는 결과는 재생가능한 반면, 계면활성제를 갖는 것은 재생불가로 나타났고, 따라서 고염류가 선호된다. 그러나 계면활성제에 대한 최적 조건은 사용된 계면활성제와 그것의 농도를 변화시켜 시험할 수 있다.
결론: Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP 벡터는 2.5M NaCl 또는 1% Tween 20, 바람직하기는 2.5M NaCl를 함유하는 완충액 중에서 배양되고, 이어서 4FF 세파로스에서 분리됨에 의해 에볼라 핵단백질로부터 정제될 수 있다.
실험 3.2
Ad5dE3x.Adapt.Ebo.Np를 기재된 프로토콜로 정화하였다(실시예 1, 도 4 참조). 채워지고 마감처리된 생성물을 1, 2, 3, 또는 5M NaCl을 함유하는 50mM TRIS 완충액 pH 7.5에 대해 10kD 막으로 삼투시켰다. Ad5.Ebo.NP를 세파로스 4FF 칼럼에 장전하기 전에 2시간 또는 밤새도록 이 완충액에서 배양하였다. 공극과 지연분율을 SDS-PAGE로 분석하였다. 결과는 공극 분율이 NP를 상당히 덜 갖는 아데노바이러스 타입 5를 함유한다는 것을 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 제거된 NP의 양은 염농도 및 배양시간과 관계된다.
결론: Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP 벡터는 2~5M NaCl을 함유하는 완충액 중에서 배양되고, 이어서 4FF 세파로스에서 분리됨에 의해 에볼라 핵단백질로부터 정제될 수 있다. 4 FF 칼럼에서 분리되기 전에 배양시간이 길어지고 염 농도가 높을수록 Ad5.Ebo.NP 벡터의 순도가 높아진다(핵단백질이 더욱 제거된다).
1M과 1.5M NaCl의 농도를 동일한 염 강도에서 더 긴 배양 시간이 정제에 적절한지를 발견하기 위해 이 동일한 방법에 따른 더 긴 배양시간(예를 들면, 2일, 1주)으로 시험하였다.
실험 3.3
이 실험은 도 6에 개략적으로 표시된다.
PERC.6 세포를 10L 생물반응기에서 성장시키고 Benzonase®(50 units/㎖) 감염 후 2.5일에 Ad5.dE3x.Adapt.Ebo.NP로 감염시키고 MgCl2를 세포 배양물에 첨가시키고, 10분 후 세포를 1% Triton®X-100으로 용균시키고, 또 다른 50분 동안 배양 하였다. 수확물을 0.5㎛ Clarigard 필터 및 이어서 Sartopore 2 필터(0.8/0.45㎛, Sartorius)로 정화시켰다.
정화된 수확물을 2개의 부분으로 나누었다. 한 부분은 5배 농축시키고 5M NaCl/50mM Tris pH 7.5를 함유하는 완충액에 대해 0.5㎛ 중공섬유(Spectrum)를 사용하여 정용여과 하였다. 이 결과 트란스 막 압력(TMP)이 증가하였고, 투석유물의 외관이 백색 및 덜 투명하게 바뀌는 동안 투과물 유동이 감소되었고, 이것은 단백질의 침전을 나타낸다.
정화된 수확물의 두번째 부분은 5배 농축되었고 0.5㎛ 중공섬유(Spectrum)를 사용하여 1.0M NaCl/50mM TRIS pH 7.5의 6DFV 및 0.4M NaCl/50 mM TRIS pH 7.5의 4 DFV로 정용여과하였다. 최종 투석유물을 세파로스 Q-XL 칼럼으로 정제하였다(Amersham).
Q-XL 용출물을 다시 2개의 부분으로 나누었다. 한 부분은 추가로 정제하고 그룹 분리모드(칼럼 용적의 20% 장전)에서 크기별 배제 칼럼(세파로스 4FF)으로 25mM NaCl/20 mM TRIS/2.5% 글리세롤(제제화 완충액)로 완충교환하였다; 이것은 도 6의 생성물 A이다. 다른 부분은 0.05㎛ 중공섬유(Spectrum)를 사용하여 5M NaCl/50mM TRIS pH 7.5의 6 DFV에 대해 정용여과시켰다; 이것은 추가로 고염류 바이러스 분획으로 불리운다.
비록 중공섬유(0.05㎛, 약 800kD)의 구멍 크기가 100kD 핵단백질의 통과를 허용하도록 충분히 크지만, 핵단백질은 침투물에서 검출될 수 없었고 투석유물에서 핵단백질 양의 감소가 나타나지 않았다. 가능하기는, 하나 이상의 TFF 계수의 개 조(예를 들면 전단의 증가)가 핵단백질의 정제를 향상시킬 것이다. 본 발명자들은 이 목적을 달성하기 위해 추가로 크기별 배제(그룹 분리)를 사용하였다.
고염류 바이러스 분획을 다시 2개의 부분으로 나누었다: 한 부분은 직접 정제되었고 크기배제(그룹 분리) 칼럼으로 제제화 완충액과 완충교환되었다(도 6의 생성물 B), 반면 두번째 부분은 추가 정제 및 크기배제(그룹 분리)칼럼으로 완충교환 전에 실온에서 밤새도록 저장하였다(도 6의 생성물 C).
3개의 정제된 대용량 롯트를 분석하여 순도, 감염성, 수득률, 응집 및 트란스유전자 발현을 측정하였다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 분석을 도 7에 나타내었고, NP 열화 생성물(질량 스펙트럼에 의해 NP 열화생성물임을 확인)뿐 아니라 순수한 핵단백질이 각각 생성물 A, B, 및 C에서 상당히 제거되었음을 나타낸다.
역상분석(RP-HPLC)(도 8)은, NP 열화 생성물(39분에 용출)뿐 아니라 순수 핵단백질의 양이 고염류 정용여과 단계를 도입함에 의해 약 50%(생성물 A)에서 <5%(생성물 B)로 감소되었고 실온에서 5M NaCl에서 밤새도록 저장한 후에는 1%의 검출한계 이하로 감소(생성물 C)되었다는 것을 나타낸다. 두 분석법을 사용함에 의한 바이러스 단백질에 대한 영항은 관찰되지 않았다.
트란스유전자 발현이 나타났고, 감염성은 영향을 받지 않았고 응집은 일어나지 않았다(3개의 생성물 A, B 및 C 모두에서). 분명히, 고염류에서 재조합 바이러스의 배양은, 밤새도록 배양한 경우에도 바이러스의 품질에서 상당한 감소를 가져오지 않았다.
고염류의 연장된 배양 및 순차적인 크기별 배제 대신 또는 그에 더하여, 5M NaCl과의 완충교환된 바이러스 현탁물은 0.45㎛ 친수성 필터(Millipac 20)을 사용하여 직접 여과되었다. 예상치 못하게, 이것은 바이러스로부터 NP의 완전한 제거를 가져왔다(도 9). 이 실험을, 가능한 구멍 크기의 범위를 결정하기 위해 다른 구멍 크기(예를 들면, 1.2, 1.0, 0.8, 0.22㎛)의 필터로 반복하였다. 0.8/0.45㎛ Sartopore-2 조합을 또한 시험하였다. 이 여과 단계는 순차 크기별 배제 크로마토그래피와 조합되는 것이 적절하고, 고염류 용액에서 더 단축된 바이러스 배양 시간을 요구할 수 있고, 그 결과 처리 시간을 줄일 수 있다.
결론: 1. 5M NaCl에 대한 정화된 수확물의 정용여과는 숙주세포 단백질의 침전으로 인해 아마도 실행할 수 없을 것이다. 2. 고도로 정제된 Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP의 5M NaCl에서의 배양 및 세파로스 4 FF에서의 분리 또는 친수성 필터를 통한 여과는 에볼라 핵단백질로부터 Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP의 정제를 가져온다. 3. 2시간 내지 밤샘배양 단계의 연장은 <5% ~ <1%로의 잔류 핵단백질의 추가 감소를 가져온다. 친수성 필터를 통한 여과는 동일한 결과를 얻기 위해 요구되는 배양시간을 줄일 수 있다.
그러므로, 이것은 단백질에 결합된 핵산, 예를 들면 에볼라바이러스의 핵단백질과 같은 핵단백질을 이와 같은 단백질을 발현하는 재조합 바이러스로부터 제거하기 위해, 이와 같은 바이러스의 배치의 정제 목적을 위해 적어도 2M NaCl, 바람직하기는 적어도 3M NaCl, 더욱 바람직하기는 5M NaCl에서 배양함으로써 실행할 수 있다.
실시예 4. 다양한 정화용 필터의 시험
PER.C6 세포를 10L 생물반응기에서 성장시키고 별개의 실험에서 다른 재조합 아데노바이러스에 의해 감염시켰다. 감염 후 2.5일에 세포를 1% Triton® X-100으로 용균시키고, 30분 후 Benzonase®(50 units/㎖) 및 MgCl2를 첨가하고 또 다른 30분 동안 배양하였다. 수확물을 정화 실험에 사용하였다.
심층필터, 예를 들면, Clarigard 및 Polygard는 높은 회수율(>90%) 및 세포 부스러기의 양호한 제거(미세현미경 분석)를 가지며, 초기 정화 필터로서 적절한 것으로 발견된다. 그러나, 여과물은 여전히 단백광을 보인다.
밀리스택(Millistak) DE 30/60 및 CE50은 바이러스의 손실(20~45%)로 인해 T/B 수확물의 여과에 덜 적절한 것으로 발견되었다. 최종 분획에서 수득률은 증가했지만 불투명물의 보유는 감소하였고, 필터 용량에 도달하였음을 나타낸다.
몇몇 막 필터를 Clarigard 여과법에 의해 생성된 여과물의 추가 정화를 위해 시험하였다; 예를 들면 Milligard 0.5㎛, 1.2㎛ 및 1.2/0.22㎛, Durapore 0.22 및 0.65㎛, Lifegard 1.0 및 2.0㎛(모두 Millipore) 및 Sartopote-2 0.8/0.45㎛(Sartorius). Sartopore 2 필터는 이들 시험된 것들 중에서 높은 바이러스 수득률(>95%) 뿐 아니라 단백광, 고용량(>20㎖/cm2)을 갖는 유일한 필터였다.
정화된 수확물을 농축시켰고 평면스크린 또는 중공섬유 모듈로 정용여과시켰다. 최종 투석유물을 크로마토그래피에 적당하도록 만들기 위해, 바람직하기는 0.45㎛ 구멍크기를 갖는 최종 투석유물을 여과하기 위해 여러 필터를 시험하였다. 예를 들면: Millipack 20, Lifegard 1.0㎛, Polygard 0.6㎛, Intercept Q, Milligard 1.2/0.5㎛. Sartopore 2 필터는 높은 바이러스 수득률(>95%) 뿐 아니라 단백광, 고용량(>20㎖/cm2)을 갖는 유일한 필터였다.
비록 이들 실험이 T/B 수확물에 대해 실시되었지만, 이후에 실험들은 본 발명에 따른 B/T 수확물에 대해 상기의 결과를 확인하며, 따라서 Sartopore 2 필터는 본 발명에 따른 방법에서 매우 양호한 결과를 제공한다.
그러므로, 본 발명에 따른 방법에서 정화를 위해 0.8㎛ 및 0.45㎛ 필터의 조합, 바람직하기는 Sartopore 2 필터가 사용된다.
실시예 5. 다양한 재조합 아데노바이러스의 생성 및 정화
여러가지 재조합 아데노바이러스를 본 발명에 따른 방법으로 정화하였다. 이와 같은 바이러스는 예를 들면 EP 0955373, WO 03/104467 및 WO 2004/001032에 기재된 바와 같이, 본 분야에 알려진 방법에 따른 게놈의 좌측-말단 부분(때때로 "어댑터-플라즈마"로 불리움, 트란스유전자의 간단한 클로닝에 유용하다) 및 우측-말단 부분의 패키징 세포에서 상동성 재조합에 의해 발생될 수 있다. 바이러스는, 예를 들면 293 세포, PER.C6TM 세포 (ECACC에 수탁번호 96022940으로 기탁된 세포로 예시됨, 미국특허 5,994,128 참조) 또는 Ad35로부터 E1B 55K 단백질을 발현하는 PER.E1B55K 세포(미국특허 6,492,169 참조)와 같은, 본 분야에 알려진 패키징 세포에서 증식될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 정제되었고 정제되는 몇몇 재조합 아데노바이러스의 구성이 본 실시예에 기재된다.
에볼라바이러스 트란스유전자를 갖는 아데노바이러스
pAdapt .Ebola NP 의 발생
pAdAptTM에서 직접적인 클로닝을 위한 최적 번역 개시(Kozak M, 1987, At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance transition in mammalian cells. J Mol Biol. 20:947~950)를 위해 제한 엔도뉴클레아제 인식부위 및 일치 서열을 도입하기 위해, 에볼라 서브타입 자이레 당단백질을 암호화하는 유전자를 다음 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응에 의해 증폭시켰다: Forward 6401 5' GCA CCG GTG CCG CCA TGG ATT CTC GTC CTC A 3')(SEQ ID. NO. 1) 및 reverse 6401 5' GCG CTA GCT CAC TGA TGA TGT TGC AG 3')(SEQ. ID.NO. 2). PCR 반응은 Biometra T1 또는 T3 열순환기에서 각 프라이머 10 μM, VRC6401의 Miniprep DNA 0.75㎕(WO 03/028632 참조), Pwo DNA 폴리머라제 1.5 유니트, 10x PCR 완충액 5㎕, 20mM dNTP 0.5㎕을 사용하여 다음 조건에서 실시되었다: 5' 94℃, 1' 50℃, 4' 72℃의 1 사이클, 1' 94℃, 1' 50℃, 4' 72℃의 5 사이클, 1' 94℃, 1' 62℃, 4' 72℃의 20 사이클, 1' 94℃, 1' 62℃, 10' 72℃의 1 사이클. 이어서, 정확한 크기의 PCR 산물을 PinA I (Age I의 Isoschizomer)를 사용하여 소화시키고 PinA I과 Hpa I으로 소화된 pAdaptTM 벡터에 결찰시켰다. 실온에서 2시간동안 단편을 결찰한 후, 혼합물의 50%를 열충격 변형법으로 E. coli DH5α T1R 세포로 변형시키고 50㎍/㎖ 암피실린으로 보충된 LB 아가 플레이트에 놓았다. 20개의 콜로니들을 가려내고 암피실린이 보충된 LB 중에서 37℃에서 밤샘 성장시켰다. Miniprep DNA를 Qiagen miniprep 스핀 키트를 제조자 지침에 따라 사용하여 추출하였다. Hind Ⅲ 및 Xba I로 제한 효소 분석 후, 정확한 클론을 선택하고 DNA 서열분석에 의해 추가로 확인하였다.
pAdapt .Ebola GP (Z)의 발생
에볼라 서브타입 자이레 전장 당단백질을 암호화하는 유전자를 다음 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다: Forward 6001 (5' CCC AAG CTT GCC GCC ATG GGC GTT ACA GG 3')(SEQ ID. NO. 3) 및 reverse 6001 (5' GGC TCT AGA TTA CTA AAA GAC AAA TTT GC 3')(SEQ. ID.NO. 4). PCR 반응은 Biometra T1 또는 T3 열순환기에서 각 프라이머 10μM, VRC6001의 DNA 100ng 및 25ng(WO 03/028632 참조), Pwo DNA 폴리머라제 1.5 유니트, 10x PCT 완충액 5㎕, 20mM dNTPs 0.5㎕ 을 사용하여 다음 조건에서 실시되었다: 5' 94℃, 1' 55℃, 4' 72℃의 1 사이클, 1' 94℃, 1' 55℃, 4' 72℃의 5 사이클, 1' 94℃, 1' 64℃, 4' 72℃의 20 사이클, 1' 94℃, 1' 64℃, 10' 72℃의 1 사이클. 이어서, 정확한 크기의 PCR 산물을 Hind Ⅲ과 Xba I로 소화시키고 소화된 pAdAptTM 벡터로 결찰하였다. 실온에서 2시간동안 단편을 결찰한 후, 혼합물의 50%를 열충격 변형법으로 E. coli DH5α T1R 세포로 변형시키고 50㎍/㎖ 암피실린으로 보충된 LB 아가 플레이트에 놓았다. 콜로니들을 가려내고 암피실린이 보충된 LB 중에서 37℃에서 밤샘 성장시켰다. Miniprep DNA를 Qiagen miniprep 스핀 키트를 제조자 지침에 따라 사용하여 추출하였다. Hind Ⅲ 및 Xba I로 제한 효소 분석 후, 정확한 클론을 선택하고 DNA 서열분석에 의해 추가로 확인하였다.
pAdapt .Ebola GPdTM (Z) 및 pAdapt .Ebola GPdTM (S)의 발생
상기와 유사하게, C-터미날 29 아미노산 긴 트란스맴브래인 영역(각각 GPdTM(Z), 및 GPdTM(S), WO 03/028632 참조)의 결실을 갖는 에볼라 서브형 자이레 및 Sudan/Gulu 당단백질 중 하나를 암호화하는 코돈 최적화 서열을 pAdapt로 복제하였다.
에볼라바이러스 트란스유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스의 발생
다양한 삽입물들 (pAdapt.Ebola NP, pAdapt.Ebola GP(Z), pAdapt.Ebola GPdTM(S), pAdapt.Ebola GPdTM(Z))을 갖는 pAdapt 플라즈미드를 사용하여, 예를 들면 EP 0955373에 기재된 바와 같은 잘 알려진 방법에 따라, 아데노바이러스 타입 5 게놈의 잔류물(플라즈미드 pWE/Ad.AflⅡ-rITRsp△E3, 이것은 E3 영역(XbaI 영역)에 1878 bp의 결실을 갖는 pWE/Ad.AflⅡ-rITRsp이다(EP 0955373 참조))을 포함하는 플라즈미드를 갖는 상동성 재조합에 의해 재조합 아데노바이러스를 형성하였고, 바이러스들은 각각, Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP, Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GP(Z), Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(S) 및 Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(Z)로 명명되었다. 물론, 트란스유전자는 Ad35와 같은 다른 혈청형의 아데노바이러스 벡터에서 유사하게 암호화되어 이들 혈청형으로부터 유도된 재조합 아데노바이러스를 발생할 수 있다(예를 들면, WO 00/70071 참조).
Plasmodium falciparum 트란스유전자를 갖는 아데노바이러스
pAdapt .CS. pFalc 및 pAdapt 535.CS. Pfalc 의 발생
말라리아병원충(Plasmodium falciparum)의 코돈 최적화된 서컴스포로자이 트(CS) 유전자를, WO 2004/055187에 기재된 바에 따라 합성하였고 pCR-스크립트(Stratagene)로 복제하여 클론 02-659를 제공하였다. CS 유전자는 pAdapt 및 pAdapt 535으로 암호화되어 각각 재조합 Ad5 및 재조합 Ad35 벡터를 발생시켰다(WO 2004/001032 참조). 클론 02-659 및 두 pAdapt 벡터를 Hind Ⅲ 및 BamH I으로 소화시키고 결찰에 의해 연결하였다. 단편을 2시간 동안 실온에서 결찰시킨 후, 혼합물의 50%를 열충격 변형법으로 E. coli DHα T1R 세포로 변형시키고 50㎍/㎖ 암피실린이 보충된 LB 아가 플레이트에 놓았다. 콜로니들을 가려내고 암피실린이 보충된 LB 중에서 37℃에서 밤샘 성장시켰다. Miniprep DNA를 Qiagen miniprep 스핀 키트를 사용하여 추출하였다. Hind Ⅲ 및 Xba I로 제한 효소 분석 후, 정확한 클론을 선택하고 DNA 서열분석에 의해 추가로 확인하였다.
P. falciparum CS 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스 혈청형 5를 다음과 같이 발생시켰다(예를 들면, EP 0955373 참조; 또는 WO 2004/055187에 기재). pAdapt.CS.Pfalc를 PacI 제한효소로 소화시켜 Ad 게놈의 좌측-말단 부분을 방출시켰다. Ad 5 게놈의 우측-말단 부분을 함유하는 플라즈미드 pWE/Ad.AflⅡ-rITRsp△E3는 E3 영역에 1878bp의 결실을 가졌고(XbaI 결실), 또한 PacI으로 소화되었다. 소화된 구조물은 PER.C6 세포로 트란스펙션되었고, ECACC에 수탁번호 96022940으로 기탁되었다. 오버래핑 서열의 상동성 재조합 후에, Ad5△E3.CS.Pfalc로 명명된 재조합 바이러스가 형성되었다.
P. falciparum CS 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스 혈청형 35를 유사하게 생성하였지만, PacI-소화된 pAdapt535.CS.Pfalc를 바이러스 게놈의 좌측-말단으 로 사용하였고, NotI-소화된 pWE.Ad35.pIX-rITR△E3(WO 2004/001032 참조)를 바이러스 게놈의 우측-말단으로 사용하였고, 둘 다 PER-E1B55K 프로듀서 세포(Ad35로부터 유래된 E1B-55K 서열을 가짐; 세포는 미국특허 6,492,169에 기재되어 있음)로 트란스펙션되었다. 오버래핑 서열의 상동성 재조합 후, Ad35△E3.CS.Pfalc로 명명된 재조합 바이러스를 형성하였다. 물론, PER.C6 또는 293 세포와 같은 Ad5의 E1B 단백질을 발현하는 패키징 세포에서 이와 같은 바이러스의 증식을 가능하게 하기 위해, Ad35 바이러스의 백본에서 E4-orf6 단백질을 Ad5의 E4-orf 6로 교환할 수 있다(WO 03/104467 참조).
Ad5△E3.CS.Pfalc 및 Ad35△E3.CS.Pfalc를 본 발명의 방법에 따라 정제하였다. 이에 더하여, Ad35 백본을 갖는 pAdapt535.CS.Pfalc를 기준으로, CS 유전자를 갖는 AD35 벡터를 구성하였고, 이것은 E에서 결실을 가지며 추가로 Ad5의 E4-orf6를 포함한다; 이 벡터는 이후 Ad35.CS로 언급된다.
몇몇 아데노바이러스 벡터를 기재된 방법으로 정제하였다(실시예 1, 도 4): 2~20L 규모의 Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(Z); Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM(S); Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP 및 Ad5dE3x.Adapt.Empty. 채워지고 마감처리된(F&F) 생성물의 순도를 역상법 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였고 (트란스유전자로서 에볼라 핵단백질을 갖는 벡터의 제제에서 에볼라 핵단백질의 존재를 제외하고) 거의 동질로 정제되었다는 것이 발견되었다.
응집은 320 및 260 nm에서 광학밀도측정법 및 디스크 원심분리법으로 측정하였다. 어느 배치에서도 응집은 관찰되지 않았다. 효능은 10 이하의 VP/IU 비율로 모든 배치에서 나타났고 트란스유전자 발현은 A549 세포에서 나타났다.
최종 수득률은 규모에 따라 20~50%의 범위였다: 2L: 24~26%(n=2), 10L: 30~37%(n=3), 20L: 46%(n=1).
실시예 6. 음이온 교환 크로마토그래피 대 하전된 필터를 사용한 Ad35 정제.
PER.C6 세포를 세포밀도가 약 1 백만 세포/㎖이 될 때까지 교반 탱크에서 성장시켰다. 세포를 40 MOI의 Ad35.CS 벡터로 감염시켰다. 바이러스 생성 4일 후, 감염된 세포 배양물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 Benzonase 및 Triton X-100(B/T 법)으로 처리하였다. B/T 수확물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정화하였다. 정화된 수확물을 TFF(0.05㎛ 중공섬유 사용)을 사용하여 5배 농축하였고, 이어서 0.1M NaCl, 0.05% PS80, 50mM Tris pH 7.5의 10 정용여과 부피에 대해 정용여과하였다. 농축되고 정용여과된 농축유물을 0.45㎛ 필터로 여과하였고, 포획 칼럼 또는 필터에 장전하였다. 포획 단계에서, Q-XL 칼럼(3㎖ 칼럼, 15cm 베드높이) 또는 Sartobind 75 필터(음이온성 기를 갖는 하전된 필터, Sartorius)를 시험하였다. 결합된 성분들을 TRIS-기재 완충액 중에서 0~ 1M NaCl의 기울기로 용출시켰다. 하전된 필터의 용출 프로파일은 구배 초반에 엑스트라 피크를 나타내었고, 이것은 Ad35 피크와 분리된다. Ad35 바이러스 피크는 Q-XL 수지, 0.39M NaCl(시작 0.19, 끝 0.53M NaCl)과 비교하여 더 높은 염 농도, 0.44M NaCl(시작 0.41, 끝 0.49M NaCl)에서 더 날카로운 피크로 하전된 필터로부터 용출된다. 용출된 분율을 SDS-PAGE, HPLC-AEX, 디스크 원심분리 및 TCID50으로 분석하였다.
HPLC-AEX 크로마토그래피 및 디스크 원심분리로 분석하였을 때, 엑스트라 피크는 순수한 Ad35 바이러스 입자들과 같이 나타나지 않았다(도 11). 크로마토그래피 분율의 SDS-PAGE 분석은 다음의 결과를 나타낸다(도 12). 두 작업 모두의 유동물에서 단백질은 보이지 않거나 매우 작은 양이 나타났다. 하전된 필터 크로마토그래피에서 몇 개의 엑스트라 피크가 나타났지만 모든 Ad35 단백질은 나타나지 않았다. 엑스트라 피크에서 바이러스성 단백질 Ⅲa, Ⅴ, Ⅵ, 및 Ⅶ는 사라진 것으로 나타난 반면, 바이러스성 단백질 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 52.55K는 존재하였다.
이들 분석 자료로부터, 하전된 필터는 Q-XL 세파로스와 달리 순수한 바이러스 입자에서 바이러스 단백질을 분리할 수 있다는 결론을 얻었다. 분리가 일어나지 않는다면, 엑스트라 피크에 존재하는 모든 단백질이 순수한 비리온에도 존재하기 때문에, 이것은 아마도 RP-HPLC 또는 SDS-PAGE와 같은 순도를 부여하는 분석에 의해 검출되지 않을 것이다.
표 1
T/B를 B/T 수확법으로 역으로 함에 의한 정제 벌크 샘플에서의 잔류 숙주세포 DNA 양의 감소. 수확물은 2~20L 규모로 정제되었다. 상세한 것은 실시예 1을 참조.
Figure 112006062762700-pct00001
표 2
다른 이온강도 및 다른 배양시간 후 NP 제거.
상세한 것은 실시예 3 참조.
Figure 112006062762700-pct00002
SEQUENCE LISTING <110> CRUCELL HOLLAND B.V. Weggeman, Miranda van Corven, Emile <120> VIRUS PURIFICATION METHODS <130> 0100 WO 00 ORD <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer forward 6401 <400> 1 gcaccggtgc cgccatggat tctcgtcctc a 31 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer reverse 6401 <400> 2 gcgctagctc actgatgatg ttgcag 26 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer forward 6001 <400> 3 cccaagcttg ccgccatggg cgttacagg 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer reverse 6001 <400> 4 ggctctagat tactaaaaga caaatttgc 29

Claims (32)

  1. 혈청형 35 (Ad35) 재조합 아데노바이러스 제제로부터 유리 아데노바이러스 단백질들을 제거하는 방법으로,
    유리 아데노바이러스 단백질들을 함유하는 Ad35 재조합 아데노바이러스 제제를 음이온 교환기를 함유하는 하전된 필터로 처리하는 단계를 포함하고,
    상기 유리 아데노바이러스 단백질들은 바이러스성 단백질 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 52.55K을 포함하는 것인 방법.
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