KR20240015743A - 합성 나노담체에 커플링된 면역억제제의 패턴화된 투여 - Google Patents

합성 나노담체에 커플링된 면역억제제의 패턴화된 투여 Download PDF

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KR20240015743A
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KR
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dose
administration
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rapamycin
aav
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KR1020247002920A
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페트르 일린스키
다카시 게이 기시모토
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셀렉타 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

바이러스 벡터 및 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체를 투여하는 방법 및 이를 투여하기 위한 관련 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 개선된 트랜스진 발현 및/또는 면역 반응 감소, 예컨대 하향조절된 IgM 및/또는 IgG 면역 반응을 달성한다.

Description

합성 나노담체에 커플링된 면역억제제의 패턴화된 투여{PATTERNED DOSING OF IMMUNOSUPPRESSANTS COUPLED TO SYNTHETIC NANOCARRIERS}
배경 기술
- US 2016/067228 A1 (공개일: 2016. 3. 10.)
- US 2014/356361 A1 (공개일: 2014. 12. 4.)
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119 하에 2017년 1월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 62/443,658, 2017년 1월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/445,637, 및 2017년 8월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 62/545,412의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은, 적어도 부분적으로, 바이러스 벡터 및 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체를 투여하는 방법, 및 이를 투여하기 위한 관련 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 증가된 트랜스진 발현 및/또는 감소된 면역 반응, 예컨대 바이러스 벡터에 대한 하향조절된 IgM 및/또는 IgG 면역 반응을 달성한다.
한 측면에서, 방법은 제1 라운드의 바이러스 벡터 및 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체를 대상체에게 공투여하는 단계, 및 제1 라운드의 공투여 전 및/또는 후의 1회 이상의 시점에 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 이전 및/또는 후속 투여는 각각 제1 라운드의 공투여가 제공되기 전 또는 후 1개월, 2주, 1주, 1일, 12시간, 6시간, 1시간, 30분, 또는 15분 내에 이루어진다.
본원에 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 방법은 제2 라운드의 바이러스 벡터 및 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체를 대상체에게 공투여하는 단계, 및 제2 라운드의 공투여 전 및/또는 후의 1회 이상의 시점에 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체를 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 이전 및/또는 후속 투여는 각각 제2 라운드의 공투여 전 또는 후 1개월, 2주, 1주, 1일, 12시간, 6시간, 1시간, 30분, 또는 15분 내에 이루어진다.
한 측면에서, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 및 바이러스 벡터를 대상체에게 공투여하는 단계, 및 바이러스 벡터 없이 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 적어도 1회의 사전-용량 및/또는 적어도 1회의 사후-용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 적어도 1회의 사전-용량 및 적어도 1회의 사후-용량이 대상체에게 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 적어도 2회의 사전-용량이 대상체에게 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 적어도 2회의 사후-용량이 대상체에게 투여된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 공투여하는 단계는 대상체에서 반복된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 없이 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 적어도 1회의 사전-용량 및/또는 적어도 1회의 사후-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 적어도 1회의 사전-용량 및 적어도 1회의 사후-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 적어도 2회의 사전-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 적어도 2회의 사후-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1개월 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 2주 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1주 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 3일 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 2일 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1일 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 12시간 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 6시간 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1시간 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 30분 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 15분 내에 이루어진다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량은 공투여 단계의 3일 내에 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량은 공투여 단계의 2일 내에 투여된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사후-용량은 공투여 단계 후 격주로 투여된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사전-용량의 면역억제제의 양은 각각의 공투여 단계의 면역억제제의 양과 동일하다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사후-용량의 면역억제제의 양은 각각의 공투여 단계의 면역억제제의 양과 동일하다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사전-용량, 사후-용량 및/또는 공투여 단계는 정맥내 투여에 의한다.
한 측면에서, 제1 대상체에게, (1) (a) 합성 나노담체에 포함된 면역억제제의 용량 및 (b) 바이러스 벡터의 용량을 공투여하는 단계, 및 (2) 바이러스 벡터의 용량 없이, (c) 합성 나노담체에 포함된 면역억제제의 사전-용량 및/또는 사후-용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 (a) 및 (c) 모두의 면역억제제의 양은, (d) 합성 나노담체에 커플링된 면역억제제의 사전-용량 또는 사후-용량 없이, 바이러스 벡터와 함께 공투여된 경우에, 제2 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 감소시키거나 바이러스 벡터의 트랜스진 발현을 증가시키는 합성 나노담체에 포함된 면역억제제의 용량의 면역억제제의 양과 동등하다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, (c)의 사전-용량 또는 사후-용량의 면역억제제의 양은 (d)의 양의 절반 이하이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, (c)의 사전-용량 또는 사후-용량의 면역억제제의 양은 (d)의 양의 절반이다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량 및 사후-용량은 (c)에서 제1 대상체에게 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, (c)의 사전-용량 및 사후-용량의 면역억제제의 양은 동일하다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, (a)의 면역억제제의 양은 (c)의 사전-용량 또는 사후-용량의 양과 동일하다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, (c)에서 적어도 2회의 사전-용량이 제1 대상체에게 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, (c)에서 적어도 2회의 사후-용량이 제1 대상체에게 투여된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, (1) 및 (2)는 반복된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1개월 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 2주 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1주 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 3일 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 2일 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1일 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 12시간 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 6시간 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 1시간 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 30분 내에 이루어진다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여는, 각각 공투여 전 또는 후 15분 내에 이루어진다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량은 공투여 단계의 3일 내에 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량은 공투여 단계의 2일 내에 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사후-용량은 공투여 단계 후 격주로 투여된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 각각의 사전-용량, 사후-용량 및/또는 공투여 단계는 정맥내 투여에 의한다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 1개 이상의 발현 제어 서열을 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 1개 이상의 발현 제어 서열은 간-특이적 프로모터를 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 1개 이상의 발현 제어 서열은 구성적 프로모터를 포함한다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 방법은 1회 이상의 시점에 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 IgM 및/또는 IgG 반응을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, IgM 및/또는 IgG 반응을 평가하는 시점 중 적어도 1회는 공투여 후이다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터 및 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는 각각의 공투여를 위해 혼합된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터이다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 아데노-연관 바이러스 벡터이다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 공투여 및/또는 사전-용량 및/또는 사후-용량의 면역억제제는 NF-kB 경로의 억제제이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 공투여 및/또는 사전-용량 및/또는 사후-용량의 면역억제제는 mTOR 억제제이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 라파마이신이다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 면역억제제는 합성 나노담체에 커플링된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 면역억제제는 합성 나노담체 내에 캡슐화된다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 공투여 및/또는 사전-용량 및/또는 사후-용량의 합성 나노담체는 지질 나노입자, 중합체 나노입자, 금속성 나노입자, 계면활성제-기반 에멀젼, 덴드리머, 버키볼, 나노와이어, 바이러스-유사 입자 또는 펩티드 또는 단백질 입자를 포함한다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 합성 나노담체는 중합체 나노입자를 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 중합체 나노입자는 폴리에스테르, 폴리에테르에 부착된 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리카르보네이트, 폴리아세탈, 폴리케탈, 폴리사카라이드, 폴리에틸옥사졸린 또는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 중합체 나노입자는 폴리에스테르 또는 폴리에테르에 부착된 폴리에스테르를 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 폴리에스테르는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 폴리카프로락톤을 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 중합체 나노입자는 폴리에스테르 및 폴리에테르에 부착된 폴리에스테르를 포함한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 합성 나노담체의 집단의 동적 광 산란을 사용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 110nm 초과의 직경이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 150nm 초과이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 200nm 초과이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 250nm 초과이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 5μm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 4μm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 3μm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 2μm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 1μm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 750nm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 500nm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 450nm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 400nm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 350nm 미만이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 직경은 300nm 미만이다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 합성 나노담체에 포함된 면역억제제의 로드는, 합성 나노담체 전반에 걸쳐 평균, 0.1% 내지 50% (중량/중량)이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 로드는 0.1% 내지 25%이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 로드는 1% 내지 25%이다. 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 로드는 2% 내지 25%이다.
제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 합성 나노담체의 집단의 종횡비는 1:1, 1:1.2, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 또는 1:10 초과이다.
한 측면에서, 각각, 예를 들어 청구항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은, 본원에 제공된 사전-용량 중 어느 하나의 1회 이상의 용량 또는 본원에 제공된 사후-용량 중 어느 하나의 1회 이상의 용량, 및 바이러스 벡터와의 공투여를 위한 본원에 제공된 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 중 어느 하나의 용량을 포함하는 키트가 제공된다.
제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 키트는 본원에 제공된 바이러스 벡터 중 어느 하나의 용량을 추가로 포함한다.
제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 키트는 본원에 제공된 사전-용량 중 어느 하나의 1회 이상의 용량 및 본원에 제공된 사후-용량 중 어느 하나의 1회 이상의 용량을 포함한다.
제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 키트는 사용에 대한 지침서를 추가로 포함한다. 제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 사용에 대한 지침서는 본원에 제공된 방법 중 어느 하나를 수행하는 것에 대한 지침서를 포함한다.
제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터와 함께 투여하기 위한 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는, 예를 들어 청구항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은, 본원에 제공된 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 중 어느 하나이다.
제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어 청구항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은, 본원에 제공된 바이러스 벡터 중 어느 하나이다.
본원에 제공된 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 이전 및/또는 후속 투여는 바이러스 벡터의 투여를 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 방법 중 어느 하나의 합성 나노담체 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함하는 키트가 제공된다. 제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 키트는 추가로 본원에 제공된 방법 중 어느 하나의 바이러스 벡터를 포함한다. 제공된 키트 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 키트는 추가로 본원에 제공된 방법 중 어느 하나의 1회 이상의 사전-용량 및/또는 사후-용량을 포함한다.
도 1a 및 1b는 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체의 존재 및 부재 하의 SEAP 활성 및 AAV IgG 항체 수준을 보여준다.
도 2a 및 2b는 각각 d19 및 d75의 SEAP 활성을 보여준다. 도 2c는 d19 및 d75 둘 다의 AAV IgG 항체 수준을 보여준다.
도 3a는 SEAP 발현 역학을 보여준다. 도 3b는 d12 및 d19의 AAV IgG 항체 수준을 보여준다.
도 4a 및 4b는 AAV 및 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체의 부피 기준 크기 분포를 보여준다.
도 5a는 AAV 투여 후 d5 및 d10의 혈청 AAV IgM을 보여준다. 도 5b는 d7, d12, d19 및 d89의 혈청 AAV IgM을 보여준다.
도 6은 d7의 AAV IgM 대 종축 AAV-구동 SEAP 발현을 보여준다.
도 7은 d7, d12, d19 및 d33의 AAV IgG 항체 수준을 보여준다.
도 8은 SEAP 발현 역학을 보여준다 (d7-d47).
도 9는 d5 및 d13의 AAV IgM 항체 수준을 보여준다.
도 10은 d9, d13 및 d20의 AAV IgG 항체 수준을 보여준다.
도 11a는 AAV-SEAP ± 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체 (SVP[Rapa])에 의한 초기 AAV 접종 후 특정 시점에서의 SEAP 발현 역학을 보여주는 그래프이다. 도 11b는 AAV-SEAP ± 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체 (SVP[Rapa])에 의한 초기 AAV 접종 후 상이한 시점에서의 AAV IgG 형성을 보여주는 그래프이다.
도 12는 AAV-SEAP ± 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체 (SVP[Rapa])에 의한 주사 후 특정 시점에서의 SEAP 발현 역학을 보여주는 그래프이다.
도 13a는 AAV8-사전-면역화된 마우스에서의 특정 시점에서의 AAV-구동 SEAP 발현 역학을 보여주는 그래프이다. 도 13b는 상이한 조합물 및 SVP[Rapa] 투여 요법에 의한 상이한 시점에서의 AAV IgG 형성을 보여주는 그래프이다.
도 14a는 낮은 AAV IgG 및 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체 (SVP[Rapa])의 후속 2회 용량에 의한 마우스에서의 SEAP 발현 역학을 보여주는 그래프이다. 도 14b는 AAV 부스팅시 (d92) 0 또는 1회 용량의 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체 (SVP[Rapa])를 제공받은 군과, AAV 부스팅시 (d92) 2회 용량의 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체 (SVP[Rapa])를 제공받은 군을 비교한, d139의 SEAP 발현을 보여주는 그래프이다. 도 14c는 명시된 시점에서의 AAV-(RFP/SEAP) 투여 후 AAV IgG 역학을 보여주는 그래프이다. 도 14d는 d153의 AAV IgG 및 SEAP 활성 사이의 음의 상관관계를 보여주는 그래프이다.
도 15a는 상이한 SVP[Rapa] 투여 요법 하에 제1 AAV 주사 후 혈청 SEAP 역학을 보여주는 그래프이다. 도 15b는 AAV 벡터 및 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체 (SVP[Rapa]) 공동-주사에 이어 상이한 요법의 SVP[Rapa] 투여 후 AAV IgG를 보여주는 그래프이다.
도 16은 AAV 및 SVP[Rapa]로 공동-주사된 후 상이한 SVP[Rapa] 요법으로 처리된 군에서의 d116의 AAV IgG 측정을 보여준다.
도 17a는 상이한 시점 (AAV 프라이밍 용량-후의 일)에서의 SEAP 역학 (AAV-SEAP, 1 x 1010 VG; d0/125)을 보여주는 그래프이다. 도 17b는 ELISA의 결과를 도시한 그래프이다. 그래프는 상이한 처리 요법 후 AAV IgG의 수준을 보여준다 (d7, d12, d19, d47 및 d75).
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특별히 예시된 물질 또는 공정 파라미터로 제한되지 않으며, 물론 변경될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특별한 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 설명하기 위한 대체 용어의 사용을 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다.
본원 전체에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이와 같이 참조로 포함되는 것은, 본원에 인용된 통합된 공보, 특허 및 특허 출원 중 임의의 것이 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, "중합체"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 분자의 혼합물 또는 상이한 분자량의 단일 중합체 종의 혼합물을 포함하고, "합성 나노담체"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 합성 나노담체의 혼합물 또는 복수 개의 상기 합성 나노담체를 포함하며, "DNA 분자"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 DNA 분자의 혼합물 또는 복수 개의 상기 DNA 분자를 포함하고, "면역억제제"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 면역억제제 분자의 혼합물 또는 복수 개의 상기 면역억제제 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하다" 또는 그의 변형, 예컨대 "포함하는"은 임의의 나열된 정수 (예를 들어, 특정 특색, 요소, 특징, 특성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 정수들 군 (예를 들어, 특색들, 요소들, 특징들, 특성들, 방법/공정 단계들 또는 제한들)을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들 군을 배제하지 않는다는 것을 표시하는 것으로 판독되어야 한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 포괄적이며 추가의 나열되지 않은 정수 또는 방법/공정 단계를 배제하지 않는다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 것의 실시양태에서, "포함하는"은 "로 본질적으로 이루어진" 또는 "로 이루어진"으로 대체될 수 있다. "로 본질적으로 이루어진"이라는 문구는 명시된 정수(들) 또는 단계뿐만 아니라 청구된 발명의 특징 또는 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는 것을 요구하기 위해 본원에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "로 이루어진"은 나열된 정수 (예를 들어, 특정 특색, 요소, 특징, 특성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 정수들 군 (예를 들어, 특색들, 요소들, 특징들, 특성들, 방법/공정 단계들 또는 제한들) 단독의 존재를 표시하기 위해 사용된다.
A. 서론
바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 기반으로 하는 것은, 치료 용도, 예컨대 유전자 요법에서 큰 잠재력을 제시하여 왔다. 그러나, 유전자 요법 및 다른 용도에서의 바이러스 벡터의 사용은 바이러스 항원 노출의 결과로서 면역원성으로 인해 제한되었다. 바이러스 벡터에 노출된 대상체는 종종 면역 반응을 나타내고, 궁극적으로 바이러스 벡터에 대한 저항성을 획득하는 것으로 종결되고/거나 유의한 염증 반응에 직면한다. 바이러스 벡터에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 다는 효능을 감소시킬 수 있고/거나 예컨대 반복 투여 상황에서 이러한 치료제를 사용하는 능력을 감소시킨다. 이들 면역 반응은 항체, B 세포 및 T 세포 반응을 포함하고, 바이러스 벡터의 바이러스 항원, 예컨대 바이러스 캡시드 또는 외피 단백질 또는 그의 펩티드에 대해 특이적일 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 공투여와 조합된, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 사전-용량 및/또는 사후-용량을 포함하는 투여 요법이, 개선된 면역 반응 감소 및/또는 개선된 트랜스진 발현을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 개선은 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 공투여 단독 (사전-용량 또는 사후-용량 없음)과 비교하여 유의하다. 예를 들어, 실시예에 제시된 바와 같이, 라파마이신-포함 합성 나노담체와 공투여된 간-향성 AAV8 벡터의 주사 전 및/또는 후 라파마이신-포함 합성 나노담체의 추가의 투여는 나이브 및 AAV-면역 동물에서 초기 및 후속 주사 둘 다 이후에 가장 높고 가장 안정한 수준의 트랜스진 발현을 유지시키는 것으로 입증되었다. 이는 가장 낮은 AAV 항체 반응과 조합되었다.
또한, 합성 나노담체에 포함된 경우, 공투여 단계의 면역억제제의 양은 공투여 단계 단독 (사전-용량 또는 사후-용량 없음)과 비교하여 사전-용량 또는 사후-용량에 의해 감소될 수 있다는 것이 놀랍게도 또한 발견되었다. 따라서, 합성 나노담체에 포함된 경우, 면역억제제의 양은 본원에 제공된 치료 요법 중 어느 하나에서 사전-용량 및/또는 사후-용량 및 공투여 용량으로 "분할"될 수 있다. 예를 들어, 실시예는 합성 나노담체에 포함된 경우의 면역억제제의 용량을 2개의 부분으로 분할하고, 제2 절반 용량과 함께 AAV 벡터를 공동-주사하기 전에 제1 절반 용량을 투여하는 것이, 합성 나노담체에 포함된 경우의 면역억제제의 동일한 총 용량을 단순히 AAV 벡터와 함께 공동-주사하는 경우에 비해, 트랜스진 발현의 관점에서 및 또한 항바이러스 IgG에 대한 억제 효과를 위해 유익하다는 것을 입증한다.
추가적으로, 바이러스 벡터 투여가 바이러스 벡터 투여 직후에 강건한 IgM 면역 반응을 발생시킬 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 또한, 바이러스 벡터 투여에 비해 자주 투여되는 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체가 일부 예에서 IgM-의존성 방식으로 상승된 트랜스진 발현을 유도한다는 것이 발견되었다. 구체적으로, 합성 나노담체는 아데노-연관 바이러스 벡터에 대한 IgM 면역 반응의 유도를 하향조절하는 것으로 발견되었고, 그러한 초기 IgM 수준은 트랜스진 발현과 역으로 상관되며, 바이러스 벡터 투여 후 높은 IgM 항체 수준은 트랜스진 발현의 낮은 수준과 상관되고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 추가로, 이러한 상관관계는 바이러스 벡터의 추가의 투여 후 지속되는 것으로 발견되었다. 이들 발견 전에, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는 가용성 단백질 및 바이러스 입자를 포함한 수많은 항원에 대한 IgG 항체 반응을 하향조절하는 것으로 제시되었다. 그러나, 바이러스 벡터 투여의 경우, 다른 면역 반응, 예컨대 IgM 항체 반응은 특정 상황, 예컨대, 예를 들어, 트랜스진 발현에서 중요할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 놀랍고도 예상치 못하게, 상기 언급된 문제점 및 제한이 본원에 개시된 발명을 실시함으로써 극복될 수 있다는 것을 발견하였다. 치료를 위해 바이러스 벡터를 효과적으로 사용하는 것에 대한 상기 언급된 장애에 대한 해결책을 제공하는 방법 및 조성물이 제공된다.
무수한 상이한 투여 요법으로 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체와 조합된, 특히 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 사전-용량 및/또는 사후-용량과 조합된, 본원에 제공된 바이러스 벡터 구축물 중 어느 하나를 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 대상체를 치료하는 방법 및 이를 위한 조성물이 본원에 제공된다. 제공된 방법 및 관련 조성물은 바이러스 벡터의 개선된 사용을 가능하게 할 수 있고, 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 IgM 및/또는 IgG 면역 반응의 감소를 발생시킬 수 있고/거나 예컨대 증가된 트랜스진 발현을 통해 개선된 효능을 발생시킬 수 있다.
본 발명은 지금부터 하기에서 보다 상세하게 기재될 것이다.
B. 정의
"투여하는 것" 또는 "투여" 또는 "투여하다"는 약리학상 유용한 방식으로 대상체에게 물질을 제공하거나 분배하는 것을 의미한다. 상기 용어는 "투여되도록 하는 것"을 포함하는 것으로 의도된다. "투여되도록 하는 것"은 직접적으로 또는 간접적으로 또 다른 관여자가 물질을 투여하게 하거나, 이를 재촉하거나, 격려하거나, 돕거나, 유도하거나, 안내하는 것을 의미한다. 투여 사이에 시간 주기가 언급되는 경우에, 시간 주기는 달리 기재된 경우를 제외하고 투여의 개시 사이의 시간이다.
본원에 사용된 "공투여"는 동일한 시간에의 투여, 또는 임상의가 투여 사이의 임의의 시간을 목적하는 치료 결과에 대한 영향이 사실상 없거나 무시할만한 것으로서 간주할 실질적으로 동일한 시간에의 투여를 지칭한다. 본원에 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 공투여는 동시 투여이다. "동시"는 투여가 서로 5, 4, 3, 2, 1분 또는 그 미만 내에 시작되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 5, 4, 3, 2, 1분 이하 또는 그 미만은 하나의 조성물의 투여의 종료 및 또 다른 조성물의 투여의 시작 사이의 경과이다. 다른 실시양태에서, 5, 4, 3, 2, 1분 이하 또는 그 미만은 하나의 조성물의 투여의 시작 및 또 다른 조성물의 투여의 시작 사이의 경과이다 (예를 들어, 예컨대 2개의 조성물이 상이한 위치에서 및/또는 상이한 방식을 통해 주어지는 경우). 일부 실시양태에서, 동시는 투여가 동일한 시간에 시작되는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 혼합되어 대상체에게 주어진다. 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는 바이러스 벡터와 반복적으로, 예를 들어 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과로 공투여될 수 있다.
제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 및 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 공투여는 바이러스 벡터 없이 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 투여가 선행하고/거나 후속한다 (각각, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 사전-용량 또는 사후-용량). 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 사전-용량은 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 공투여의 1, 2 또는 3일 전에 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 사후-용량은 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 공투여의 1, 2 또는 3일 후에 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 1회 초과의 사전-용량 및/또는 사후-용량은 각각의 공투여와 함께 투여된다. 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 공투여가 반복되는 경우에, 각각의 반복 용량은 1 또는 2회 또는 그 초과의 사전-용량이 선행한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 공투여가 반복되는 경우에, 각각의 반복 용량은 1 또는 2회 또는 그 초과의 사후-용량이 후속한다. 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 1회 초과의 사후-용량이 각각의 공투여와 함께 투여되는 경우에, 사후-용량은 각각의 공투여와 격주로 투여된다.
본원에 사용된 "혼합"은, 2종 이상의 성분이 조성물 중에 함께 존재하고 조성물의 투여가 대상체에게 2종 이상의 성분을 제공하도록, 2종 이상의 성분을 혼합하는 것을 지칭한다. 본원에 제공된 방법 중 어느 하나의 공투여 중 어느 하나는 혼합물로서 투여될 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이 대상체에게 투여하기 위한 조성물의 맥락에서 "유효량"은 이러한 대상체에게서 한 가지 이상의 목적하는 결과, 예를 들어 바이러스 벡터에 대한 면역 반응, 예컨대 IgM 및/또는 IgG 면역 반응의 저하 또는 제거 및/또는 효과적이거나 증가된 트랜스진 발현을 발생시키는 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 시험관내 또는 생체내 목적을 위한 것일 수 있다. 생체내 목적을 위한 양은 바이러스 벡터의 투여에 따른 결과로서 바람직하지 않은 면역 반응을 경험할 수 있는 대상체에 대하여 임상 이익을 가질 수 있을 것으로 임상의가 신뢰하는 양일 수 있다. 본원에 제공된 방법 중 어느 하나에서, 투여된 조성물(들)은 본원에 제공된 바와 같은 유효량 중 어느 하나로 존재할 수 있다.
유효량은, 일부 실시양태에서 바람직하지 않은 면역 반응을 전적으로 방지하는 것을 수반하기도 하지만, 바람직하지 않은 면역 반응의 수준을 감소시키는 것을 수반할 수 있다. 유효량은 또한 바람직하지 않은 면역 반응의 발생을 지연시키는 것을 수반할 수 있다. 유효량은 또한 목적하는 치료 종점 또는 목적하는 치료 결과를 발생시키는 양일 수 있다. 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 유효량은 목적하는 면역 반응, 예컨대 바이러스 벡터에 대한 면역 반응, 예컨대 IgM 및/또는 IgG 반응의 감소 또는 제거, 및/또는 효과적이고 증가된 트랜스진 발현의 생성을 대상체에서 적어도 1개월 동안 지속시키는 것이다. 이러한 감소 또는 제거 또는 효과적이거나 증가된 발현은 국부로 또는 전신으로 측정될 수 있다. 상기 중 임의의 것의 달성은 상용 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
유효량은 물론, 치료받는 특별한 대상체; 병태, 질환 또는 장애의 중증도; 연령, 신체 조건, 크기 및 체중을 포함한 개개의 환자 파라미터; 치료 지속 기간; (존재하는 경우) 공동 요법의 성질; 구체적인 투여 경로; 및 보건 종사자의 지식과 전문성 내의 다른 요인에 좌우될 것이다. 이들 요인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 일상적인 실험만으로 해결될 수 있다.
유효량은 단일 물질의 성분의 용량을 지칭할 수 있거나, 또는 다수의 물질의 성분의 용량을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역억제제의 유효량을 지칭하는 경우에, 양은 면역억제제를 포함하는 물질의 단일 용량을 지칭할 수 있거나, 또는 면역억제제를 포함하는 동일하거나 상이한 물질의 다수의 용량을 지칭할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 경우에, 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 면역억제제의 유효량은 면역억제제의 다른 투여 없이 본원에 제공된 바와 같은 공투여 단계에서의 면역억제제의 양일 수 있다. 그러나, 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 다른 실시양태에서, 면역억제제의 양은 투여 세트 동안의 면역억제제의 총량, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 사전-용량 및/또는 사후-용량의 면역억제제의 양과 조합된 본원에 제공된 바와 같은 공투여의 면역억제제의 총량이다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 면역억제제의 양은 투여 세트 사이에 "분할"되고, 총량은 또 다른 요법, 예컨대 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체를 공투여하였지만 사전-용량 또는 사후-용량의 투여는 없는 경우에 따라, 감소된 면역 반응 또는 바이러스 벡터의 효과적이거나 증가된 트랜스진 발현을 달성하는 것으로 결정된 양에 기초할 수 있다. 이러한 면역억제제의 총량은 사전-용량 및/또는 사후-용량으로서 주어진 면역억제제의 양 뿐만 아니라 공투여 단계로서 주어진 면역억제제의 양 사이에 분배되어 본원에 제공된 바와 같은 요법에 따라 투여될 수 있다. 따라서, 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 공투여 용량과 조합된 사전-용량 및/또는 사후-용량의 면역억제제의 양은 이러한 총량과 동등하다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 사전-용량 또는 사후-용량의 면역억제제의 양은 이러한 총량의 절반 이하이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 사전-용량 또는 사후-용량의 면역억제제의 양은 이러한 총량의 절반이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 사전-용량 또는 사후-용량의 면역억제제의 양은 공투여 단계의 면역억제제의 양과 동일할 수 있다.
"면역 반응을 평가하는 것"은 시험관내 또는 생체내에서 면역 반응의 수준, 존재 또는 부재, 저하, 증가 등의 임의의 측정 또는 결정을 지칭한다. 이러한 측정 또는 결정은 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플 상에서 수행될 수 있다. 이러한 평가는 ELISA-기반 검정을 포함한, 본원에 제공되거나 또는 관련 기술분야에 달리 공지된 방법 중 어느 하나를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 평가는, 예컨대 대상체로부터의 샘플 중에서 항체, 예컨대 IgM 및/또는 IgG 항체, 예컨대 바이러스 벡터에 특이적인 것의 수 또는 백분율을 평가하는 것일 수 있다. 상기 평가는 또한, 면역 반응과 관련된 임의의 효과를 평가하는 것, 예컨대 시토카인, 세포 표현형 등의 존재 또는 부재를 측정하는 것일 수 있다. 본원에 제공된 방법 중 어느 하나는 바이러스 벡터 또는 그의 항원에 대한 면역 반응을 평가하는 단계를 포함할 수 있거나 또는 추가로 포함할 수 있다. 이러한 평가 단계는 직접 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 상기 용어는 또 다른 당사자가 면역 반응을 평가하도록 유발, 촉구, 장려, 조장, 유도 또는 지시되는 행동들을 포함하고자 한다.
본원에 사용된 "평균"은 달리 나타내지 않는 한 산술 평균을 지칭한다.
"커플링" 또는 "커플링된" (등)은 하나의 실체 (예를 들어, 모이어티)를 또 다른 실체와 화학적으로 회합시키는 것을 의미한다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 커플링은 공유적이고, 이는 부착이 두 실체 사이의 공유 결합의 존재의 맥락에서 일어난다는 것을 의미한다. 비-공유 실시양태에서, 비-공유 커플링은 전하 상호작용, 친화 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착, 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, TT 스태킹 상호작용, 수소 결합 상호작용, 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용, 자기적 상호작용, 정전기 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및/또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 비-공유 상호작용에 의해 매개된다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 실시양태에서, 캡슐화는 커플링의 형태이다.
"용량"은 주어진 시간 동안 대상체에게 투여하기 위한 약리학적 및/또는 면역학적 활성 물질의 구체적 양을 지칭한다. 일반적으로, 본 발명의, 키트를 포함한, 방법 및 조성물 중 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 및/또는 바이러스 벡터의 용량은 달리 제공되지 않는 한 합성 나노담체에 포함된 면역억제제의 양 및/또는 바이러스 벡터의 양을 지칭한다. 대안적으로, 용량은 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 용량을 지칭하는 경우에, 목적하는 양의 면역억제제를 제공하는 합성 나노담체의 수에 기초하여 투여될 수 있다. 용량이 반복 투여의 상황에서 사용되는 경우에, 용량은 동일하거나 상이할 수 있는 반복 용량 각각의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 "사전-용량"은 또 다른 물질 또는 물질의 세트의 투여 전에 투여된 물질 또는 물질의 세트를 지칭한다. 본원에 사용된 "사후-용량"은 또 다른 물질 또는 물질의 세트의 투여 후에 투여된 물질 또는 물질의 세트를 지칭한다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 사전-용량 또는 사후-용량 물질(들)은 다른 투여 물질(들)과 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 제공된 바와 같이, 사전-용량 또는 사후-용량 물질은 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는 포함하지만, 바이러스 벡터는 포함하지 않는다.
"캡슐화하다"는 물질의 적어도 일부를 합성 나노담체 내에 봉입하는 것을 의미한다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 물질은 합성 나노담체 내에 완전히 봉입된다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 다른 실시양태에서, 캡슐화되는 물질의 대부분 또는 모두는, 합성 나노담체 외부의 국부 환경에 노출되지 않는다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 다른 실시양태에서, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% (중량/중량) 이하가 국부 환경에 노출된다. 캡슐화는, 물질의 대부분 또는 모두를 합성 나노담체의 표면 상에 두고, 물질이 합성 나노담체 외부의 국부 환경에 노출된 채로 두는 흡수와 구분된다.
"발현 제어 서열"은 발현에 영향을 미칠 수 있는 임의의 서열이며, 프로모터, 인핸서, 및 오퍼레이터를 포함할 수 있다. 벡터 내의 발현 제어 서열 또는 제어 요소는 적절한 핵산 전사, 번역, 바이러스 패키징 등을 용이하게 할 수 있다. 일반적으로, 제어 요소는 시스로 작용하지만, 이는 또한 트랜스로 작동할 수도 있다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터이다. 편재성 또는 혼재성 프로모터로도 불리는 "구성적 프로모터"는 일반적으로 활성이고 특정 세포에 대해 독점적이거나 우선적이지 않은 것으로 여겨지는 것이다. "조직-특이적 프로모터"는 특정한 세포 유형 또는 조직에서 활성인 것으로, 이러한 활성은 특정한 세포 유형 또는 조직에 대해 독점적일 수 있다. 본원에 제공된 핵산 또는 바이러스 벡터 중 어느 하나에서 프로모터는 본원에 제공된 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.
"바이러스 벡터에 대한 면역 반응" 등은 바이러스 벡터에 대한 임의의 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체 (예를 들어, IgM 또는 IgG) 또는 세포성 반응을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 않은 면역 반응은 바이러스 벡터 또는 그의 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 바이러스 벡터의 바이러스 항원에 특이적이다. 다른 실시양태에서, 면역 반응은 바이러스 벡터의 트랜스진에 의해 코딩된 단백질 또는 펩티드에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 바이러스 벡터의 바이러스 항원에 특이적이고, 바이러스 벡터의 트랜스진에 의해 코딩된 단백질 또는 펩티드에는 특이적이지 않다.
일부 실시양태에서, 대상체에서의 감소된 항-바이러스 벡터 반응은, 본원에 제공된 바와 같은 투여 없이 또 다른 대상체, 예컨대 시험 대상체에게의 바이러스 벡터의 투여 후 이러한 다른 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정된 항-바이러스 벡터 면역과 비교하여, 본원에 제공된 바와 같은 투여 후 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정된 감소된 항-바이러스 벡터 면역 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-바이러스 벡터 면역 반응은, 본원에 제공된 바와 같은 투여 없이 또 다른 대상체, 예컨대 시험 대상체에게의 바이러스 벡터의 투여 후 상기 다른 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에 대해 수행된 바이러스 벡터 시험관내 챌린지 시 검출된 항-바이러스 벡터 면역 반응과 비교하여, 본원에 제공된 바와 같은 투여 후 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서의, 대상체의 생물학적 샘플에 대해 수행된 후속 바이러스 벡터 시험관내 챌린지 시 감소된 항-바이러스 벡터 면역 반응이다. 다른 실시양태에서, 면역 반응은 또 다른 대상체에서, 예컨대 시험 대상체로부터의 샘플에서 평가될 수 있으며, 여기서 다른 대상체에 대한 결과는, 척도화와 관계 없이, 이슈가 되는 대상체에서 그것이 발생하고 있는지 또는 발생하였는지를 나타낼 것으로 예상될 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 감소된 항-바이러스 벡터 반응은, 상이한 시점에, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 투여가 없는 시간에, 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 투여 전에 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정된 항-바이러스 벡터 면역 반응과 비교하여, 본원에 제공된 바와 같은 투여 후 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 측정된 감소된 항-바이러스 벡터 면역 반응을 포함한다.
"면역억제제"는 바람직하게 APC에 대한 그의 효과를 통해 면역관용성 효과를 유발할 수 있는 화합물을 의미한다. 면역관용성 효과는 일반적으로, 항원에 대한 바람직하지 않은 면역 반응을 지속적인 방식으로 저하, 억제 또는 방지하는, APC 또는 다른 면역 세포에 의하여 전신적으로 및/또는 국소적으로 조정되는 것을 지칭한다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 면역억제제는 하나 이상의 면역 이펙터 세포 내의 조절성 표현형을 증진시키도록 APC를 유발하는 것이다. 예를 들어, 이러한 조절성 표현형은 항원-특이적 CD4+ T 세포 또는 B 세포의 생성, 유도, 자극 또는 동원의 억제; 항원-특이적 항체의 생성의 억제; Treg 세포 (예를 들어, CD4+CD25고FoxP3+ Treg 세포)의 생성, 유도, 자극 또는 동원 등으로 특징화될 수 있다. 이는 CD4+ T 세포 또는 B 세포가 조절성 표현형으로 전환된 것의 결과일 수 있다. 이는 또한, FoxP3이 다른 면역 세포, 예컨대 CD8+ T 세포, 대식세포 및 iNKT 세포에서 유도된 것의 결과일 수 있다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 면역억제제는 특정 항원을 프로세싱한 후에 APC의 반응에 영향을 미치는 것이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 또 다른 실시양태에서, 면역억제제는 이러한 항원의 프로세싱을 간섭하는 것이 아니다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 추가 실시양태에서, 면역억제제는 아폽토시스-신호전달 분자가 아니다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 또 다른 실시양태에서, 면역억제제는 인지질이 아니다.
면역억제제는 스타틴; mTOR 억제제, 예컨대 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (즉, 라파로그); TGF-β 신호전달 작용제; TGF-β 수용체 효능제; 히스톤 데아세틸라제 억제제, 예컨대 트리코스타틴 A; 코르티코스테로이드; 미토콘드리아 기능 억제제, 예컨대 로테논; P38 억제제; NF-κβ 억제제, 예컨대 6Bio, 덱사메타손, TCPA-1, IKK VII; 아데노신 수용체 효능제; 프로스타글란딘 E2 효능제 (PGE2), 예컨대 미소프로스톨; 포스포디에스테라제 억제제, 예컨대 포스포디에스테라제 4 억제제 (PDE4), 예컨대 롤리프람; 프로테아솜 억제제; 키나제 억제제; G-단백질 커플링된 수용체 효능제; G-단백질 커플링된 수용체 길항제; 글루코코르티코이드; 레티노이드; 시토카인 억제제; 시토카인 수용체 억제제; 시토카인 수용체 활성화제; 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 길항제; 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 효능제; 히스톤 데아세틸라제 억제제; 칼시뉴린 억제제; 포스파타제 억제제; PI3KB 억제제, 예컨대 TGX-221; 자가포식 억제제, 예컨대 3-메틸아데닌; 아릴 탄화수소 수용체 억제제; 프로테아솜 억제제 I (PSI); 및 산화된 ATP, 예컨대 P2X 수용체 차단제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역억제제는 또한, IDO, 비타민 D3, 레티노산, 시클로스포린, 예컨대 시클로스포린 A, 아릴 탄화수소 수용체 억제제, 레스베라트롤, 아자티오퓨린 (Aza), 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 6-티오구아닌 (6-TG), FK506, 상글리페린 A, 살메테롤, 미코페놀레이트 모페틸 (MMF), 아스피린 및 다른 COX 억제제, 니플룸산, 에스트리올 및 트리프톨리드를 포함한다. 다른 예시적인 면역억제제는 소분자 약물, 천연 생성물, 항체 (예를 들어, CD20, CD3, CD4에 대한 항체), 생물제제-기반 약물, 탄수화물-기반 약물, RNAi, 안티센스 핵산, 압타머, 메토트렉세이트, NSAID; 핑골리모드; 나탈리주맙; 알렘투주맙; 항-CD3; 타크롤리무스 (FK506), 아바타셉트, 벨라타셉트 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "라파로그"는 라파마이신과 구조상 관련된 (유사체) 분자 (시롤리무스)를 지칭한다. 라파로그의 예는 템시롤리무스 (CCI-779), 에베롤리무스 (RAD001), 리다포롤리무스 (AP-23573), 및 조타롤리무스 (ABT-578)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 라파로그의 추가의 예는, 예를 들어 WO 공개 번호 WO 1998/002441 및 미국 특허 번호 8,455,510에서 확인할 수 있고, 그의 라파로그는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가의 면역억제제가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 본 발명은 이러한 측면으로 제한되지 않는다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 실시양태에서, 면역억제제는 본원에 제공된 작용제 중 어느 하나, 예컨대 상기 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
"트랜스진 발현을 증가시키는 것"은 대상체에서 바이러스 벡터의 트랜스진 발현의 수준을 증가시키는 것을 지칭하며, 트랜스진은 바이러스 벡터에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 트랜스진 발현의 수준은 대상체의 다양한 관심 조직 또는 시스템에서 트랜스진 단백질 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 트랜스진 발현 생성물이 핵산인 경우, 트랜스진 발현 수준은 트랜스진 핵산 생성물에 의해 측정될 수 있다. 트랜스진 발현을 증가시키는 것은, 예를 들어 대상체로부터 수득된 샘플 중의 트랜스진 발현의 양을 측정하고, 이를 이전 샘플과 비교함으로써 결정될 수 있다. 샘플은 조직 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스진 발현은 유동 세포측정법을 사용하여 측정될 수 있다. 다른 실시양태에서, 증가된 트랜스진 발현은 또 다른 대상체에서, 예컨대 시험 대상체로부터의 샘플에서 평가될 수 있으며, 여기서 다른 대상체에 대한 결과는, 척도화와 관계 없이, 이슈가 되는 대상체에서 그것이 발생하고 있는지 또는 발생하였는지를 나타낼 것으로 예상될 것이다. 본원에 제공된 방법 중 어느 하나는 증가된 트랜스진 발현을 발생시킬 수 있다.
면역억제제가 합성 나노담체에 포함된 경우, 예컨대 그에 커플링된 경우, "로드"는 전체 합성 나노담체 중의 물질의 총 건조 레시피 중량에 기초한, 합성 나노담체 중의 면역억제제의 양이다 (중량/중량). 일반적으로, 이러한 로드는 합성 나노담체의 집단 전반에 걸친 평균으로서 계산된다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 합성 나노담체 전반에 걸친 평균 로드는 0.1% 내지 99%이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 또 다른 실시양태에서, 로드는 0.1% 내지 50%이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 또 다른 실시양태에서, 로드는 0.1% 내지 20%이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 추가 실시양태에서, 로드는 0.1% 내지 10%이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 추가 실시양태에서, 로드는 1% 내지 10%이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 추가 실시양태에서, 로드는 7% 내지 20%이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 또 다른 실시양태에서, 로드는 합성 나노담체의 집단 전반에 걸쳐 평균적으로 적어도 0.1%, 적어도 0.2%, 적어도 0.3%, 적어도 0.4%, 적어도 0.5%, 적어도 0.6%, 적어도 0.7%, 적어도 0.8%, 적어도 0.9%, 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 추가 실시양태에서, 로드는 합성 나노담체의 집단 전반에 걸쳐 평균적으로 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%이다. 상기 실시양태 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 로드는 합성 나노담체의 집단 전반에 걸쳐 평균적으로 25% 이하이다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 실시양태에서, 로드는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 계산된다.
"합성 나노담체의 최대 치수"는 이러한 합성 나노담체의 임의의 축을 따라 측정된 나노담체의 가장 큰 치수를 의미한다. "합성 나노담체의 최소 치수"는 이러한 합성 나노담체의 임의의 축을 따라 측정된 합성 나노담체의 가장 작은 치수를 의미한다. 예를 들어, 타원형 합성 나노담체의 경우에는, 합성 나노담체의 최대 및 최소 치수가 실질적으로 동일할 것이고, 그의 직경의 크기일 것이다. 유사하게, 입방형 합성 나노담체의 경우에는, 합성 나노담체의 최소 치수가 그의 높이, 폭 또는 길이 중 가장 작은 것인 반면, 합성 나노담체의 최대 치수는 그의 높이, 폭 또는 길이 중 가장 큰 것일 것이다. 특정 실시양태에서, 특정 샘플 중에서의 합성 나노담체의 총수에 기초하여, 이러한 샘플 중의 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%의 최소 치수는 100 nm 이상이다. 특정 실시양태에서, 특정 샘플 중에서의 합성 나노담체의 총수에 기초하여, 이러한 샘플 중의 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%의 최대 치수는 5 μm 이하이다. 바람직하게, 특정 샘플 중에서의 합성 나노담체의 총수에 기초하여, 이러한 샘플 중의 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%의 최소 치수는 110 nm 초과, 보다 바람직하게 120 nm 초과, 보다 바람직하게 130 nm 초과, 및 더욱 더 바람직하게 150 nm 초과이다. 합성 나노담체의 최대 치수와 최소 치수의 종횡비는 그 실시양태에 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어, 합성 나노담체의 최대 치수 대 최소 치수의 종횡비는 1:1 내지 1,000,000:1, 바람직하게 1:1 내지 100,000:1, 보다 바람직하게 1:1 내지 10,000:1, 보다 바람직하게 1:1 내지 1000:1, 더욱 더 바람직하게 1:1 내지 100:1, 및 더욱 더 바람직하게 1:1 내지 10:1로 다양할 수 있다. 바람직하게, 특정 샘플 중에서의 합성 나노담체의 총수에 기초하여, 이러한 샘플 중의 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%의 최대 치수는 3 μm 이하, 보다 바람직하게 2 μm 이하, 보다 바람직하게 1 μm 이하, 보다 바람직하게 800 nm 이하, 보다 바람직하게 600 nm 이하, 및 더욱 더 바람직하게 500 nm 이하이다. 바람직한 실시양태에서, 특정 샘플 중에서의 합성 나노담체의 총수에 기초하여, 이러한 샘플 중의 합성 나노담체의 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%의 최소 치수는 100 nm 이상, 보다 바람직하게 120 nm 이상, 보다 바람직하게 130 nm 이상, 보다 바람직하게 140 nm 이상, 및 더욱 더 바람직하게 150 nm 이상이다. 합성 나노담체 치수 (예를 들어, 유효 직경)의 측정은 일부 실시양태에서, 합성 나노담체를 액체 (통상적으로 수성) 매질에 현탁시키고 동적 광 산란 (DLS) (예를 들어, 브룩헤븐 제타팔스(Brookhaven ZetaPALS) 기기를 사용함)을 사용함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, 합성 나노담체의 현탁액을 수성 완충제로부터 정제수 내로 희석시켜 대략 0.01 내지 0.1 mg/mL의 최종 합성 나노담체 현탁액 농도를 달성할 수 있다. 이와 같이 희석된 현탁액을, DLS 분석에 적합한 큐벳 내부에서 직접 제조하거나 또는 이러한 큐벳에 옮길 수 있다. 이어서, 상기 큐벳을 DLS 내에 놓아두고, 제어 온도로 평형시켜 둔 다음, 매질의 점도 및 샘플의 굴절률에 대한 적절한 입력에 기초한 안정하면서도 재현 가능한 분포를 획득하기에 충분한 시간 동안 스캐닝할 수 있다. 이어서, 이러한 분포의 유효 직경, 또는 평균을 기록한다. 높은 종횡비, 또는 비-타원형의 합성 나노담체의 유효 크기를 결정하기 위해서는, 증강 기술, 예컨대 전자 현미경검사가 필요하며, 이로써 보다 정확한 측정치를 수득할 수 있다. 합성 나노담체의 "치수" 또는 "크기" 또는 "직경"은, 예를 들어 동적 광 산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균을 의미한다.
"제약상 허용되는 부형제" 또는 "제약상 허용되는 담체"는 조성물을 제제화하기 위하여 약리학상 활성 물질과 함께 사용되는 약리학상 불활성 물질을 의미한다. 제약상 허용되는 부형제는 관련 기술분야에 공지된 다양한 물질을 포함하는데, 이는 사카라이드 (예컨대, 글루코스, 락토스 등), 보존제, 예컨대 항미생물제, 재구성 보조제, 착색제, 염수 (예컨대, 포스페이트 완충 염수), 및 완충제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"반복 용량" 또는 "반복 투여" 등은 동일한 물질(들)의 이전 용량 또는 투여에 후속하여 대상체에게 투여되는 물질 또는 물질의 세트의 적어도 1회의 추가의 용량 또는 투여를 의미한다. 물질이 동일할 수는 있지만, 반복된 용량 또는 투여에서 물질의 양은 상이할 수 있다.
"대상체"는 온혈 포유동물 예컨대 인간 및 영장류; 조류; 가정용 또는 농장용 가축 예컨대 고양이, 개, 양, 염소, 소, 말 및 돼지; 실험 동물 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그; 어류; 파충류; 동물원 및 야생 동물 등을 포함한 동물을 의미한다. 본원에 사용된 대상체는 본원에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나를 필요로 하는 것일 수 있다. 본원에 제공된 "제2 대상체" 또는 "또 다른 대상체"는 투여가 제공된 대상체와 상이한 또 다른 대상체를 지칭한다. 이러한 대상체는 임의의 다른 대상체, 예컨대 시험 대상체일 수 있고, 대상체는 동일하거나 상이한 종일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 제2 대상체는 합성 나노담체에 포함된 면역억제제의 사전-용량 또는 사후-용량의 제공 없이, 합성 나노담체에 포함된 면역억제제 및 바이러스 벡터의 공투여에 의해 바이러스 벡터에 대한 감소된 면역 반응 또는 바이러스 벡터의 효과적이거나 증가된 트랜스진 발현이 달성되는 것이다. 따라서, 제공된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 제2 대상체 또는 또 다른 대상체는 감소된 면역 반응 또는 증가된 트랜스진 발현을 달성하기 위해 오직 공투여만을 제공받는다. 이러한 공투여의 면역억제제의 양은 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 또는 본원에 제공된 조성물 중 어느 하나에서 사용하기 위한 본원에 제공된 바와 같은 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 양은 유사하거나 더 큰 효과를 달성하기 위해 사전-용량 및/또는 사후-용량 및 공투여 용량 사이에 분배될 수 있다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 제2 또는 다른 대상체가 상이한 종인 경우에 투여를 제공하기 위해 양은 대상체의 종에 대해 적절하게 척도화될 수 있고, 척도화된 양은 본원에 제공된 바와 같은 총량으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 알로메트릭 척도화 또는 다른 척도화 방법이 사용될 수 있다. 제2 대상체 또는 다른 대상체에서의 면역 반응 뿐만 아니라 트랜스진 발현은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 상용 방법을 사용하거나 또는 달리 본원에 제공된 바와 같이 평가될 수 있다. 본원에 제공된 방법 중 임의의 것은 본원에 기재된 바와 같이 제2 또는 다른 대상체에서 이들 양 중 하나 이상을 결정하는 것을 포함하거나 추가로 포함할 수 있다.
"합성 나노담체(들)"는 자연에서 발견되지 않고, 크기가 5 마이크로미터 이하인 적어도 하나의 치수를 보유하는 개별 대상을 의미한다. 알부민 나노입자가 일반적으로 합성 나노담체로서 포함되지만, 특정 실시양태에서 합성 나노담체는 알부민 나노입자를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 합성 나노담체는 키토산을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 합성 나노담체는 지질-기반 나노입자가 아니다. 추가 실시양태에서, 합성 나노담체는 인지질을 포함하지 않는다.
합성 나노담체는 지질-기반 나노입자 (본원에서 지질 나노입자, 즉 그들의 구조를 구성하는 대다수의 물질이 지질인 나노입자로서 지칭되기도 함), 중합체 나노입자, 금속성 나노입자, 계면활성제-기반 에멀젼, 덴드리머, 버키볼, 나노와이어, 바이러스-유사 입자 (즉, 주로 바이러스 구조 단백질로 구성되지만, 감염성이 아니거나 또는 낮은 감염성을 갖는 입자), 펩티드 또는 단백질-기반 입자 (본원에서 단백질 입자, 즉 그들의 구조를 구성하는 대다수의 물질이 펩티드 또는 단백질인 입자로서 지칭되기도 함) (예컨대, 알부민 나노입자) 및/또는 나노물질의 조합을 사용하여 개발된 나노입자, 예컨대 지질-중합체 나노입자 중 1개 또는 복수개일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 합성 나노담체는 타원형, 입방형, 피라미드형, 직사각형, 원통형, 토로이드형 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 상이한 형상일 수 있다. 본 발명에 따른 합성 나노담체는 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 발명의 실시에 사용하기 위해 적합화될 수 있는 예시적인 합성 나노담체는 (1) 미국 특허 5,543,158 (Gref et al.)에 개시된 생분해성 나노입자, (2) 공개된 미국 특허 출원 20060002852 (Saltzman et al.)의 중합체 나노입자, (3) 공개된 미국 특허 출원 20090028910 (DeSimone et al.)의 리소그래픽적으로 구축된 나노입자, (4) WO 2009/051837 (von Andrian et al.)의 개시내용, (5) 공개된 미국 특허 출원 2008/0145441 (Penades et al.)에 개시된 나노입자, (6) 공개된 미국 특허 출원 20090226525 (de los Rios et al.)에 개시된 단백질 나노입자, (7) 공개된 미국 특허 출원 20060222652 (Sebbel et al.)에 개시된 바이러스-유사 입자, (8) 공개된 미국 특허 출원 20060251677 (Bachmann et al.)에 개시된 핵산 부착된 바이러스-유사 입자, (9) WO2010047839A1 또는 WO2009106999A2에 개시된 바이러스-유사 입자, (10) 문헌 [P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)]에 개시된 나노침전된 나노입자, (11) 미국 공개 번호 2002/0086049에 개시된 아폽토시스 세포, 아폽토시스체 또는 합성 또는 반합성 모방체, 또는 (12) 문헌 [Look et al., "Nanogel-based delivery of mycophenolic acid ameliorates systemic lupus erythematosus in mice" J. Clinical Investigation 123(4):1741-1749(2013)]의 것을 포함한다.
약 100 nm 이하, 바람직하게 100 nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체를 활성화하는 히드록실 기를 갖는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 활성화하는 히드록실 기가 아닌 모이어티로 본질적으로 이루어진 표면을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 약 100 nm 이하, 바람직하게 100 nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체를 실질적으로 활성화하는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 실질적으로 활성화하지 않는 모이어티로 본질적으로 이루어진 표면을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 약 100 nm 이하, 바람직하게 100 nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노담체는 보체를 활성화하는 표면을 포함하지 않거나 또는 대안적으로 보체를 활성화하지 않는 모이어티로 본질적으로 이루어진 표면을 포함한다. 실시양태에서, 합성 나노담체는 바이러스-유사 입자를 배제한다. 실시양태에서, 합성 나노담체는 1:1, 1:1.2, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, 또는 1:10 초과의 종횡비를 보유할 수 있다.
"바이러스 벡터의 트랜스진" 또는 "트랜스진" 등은 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 수송되고, 일단 세포 내에 있으면 발현되어, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 치료 용도를 위한 각각 단백질 또는 핵산 분자를 생산하는 핵산 물질을 지칭한다. "발현된" 또는 "발현" 등은 트랜스진으로 세포가 형질도입되고 형질도입된 세포에 의해 프로세싱된 후의 기능적 (즉, 원하는 목적을 위한 생리학상 활성인) 유전자 생성물의 합성을 지칭한다. 이러한 유전자 생성물은 또한 본원에서 "트랜스진 발현 생성물"로 지칭된다. 따라서, 발현된 생성물은 트랜스진에 의해 코딩된, 결과적인 단백질 또는 핵산, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 치료 RNA이다.
"바이러스 벡터"는 세포에 페이로드, 예컨대 핵산(들)을 전달할 수 있거나 또는 전달하는 바이러스-기반 전달 시스템을 의미한다. 일반적으로, 상기 용어는 바이러스 성분, 예컨대 캡시드 및/또는 코트 단백질을 갖는 바이러스 벡터 구축물을 지칭하며, 이는 또한 페이로드를 포함할 수 있거나 또는 포함한다 (및 그렇게 적합화됨). 일부 실시양태에서, 페이로드는 트랜스진을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 본원에 제공된 단백질, 예컨대 치료 단백질, DNA-결합 단백질 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 것이다. 다른 실시양태에서, 트랜스진은 가이드 RNA, 안티센스 핵산, snRNA, RNAi 분자 (예를 들어, dsRNA 또는 ssRNA), miRNA 또는 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드 (TFO) 등을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 페이로드는 그 자체가 치료제(들)인 핵산(들)이고, 전달된 핵산(들)의 발현은 필요하지 않다. 예를 들어, 핵산은 siRNA, 예컨대 합성 siRNA일 수 있다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 또한 다른 성분 예컨대 역전된 말단 반복부 (ITR), 마커 등을 코딩할 수 있다. 페이로드는 또한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 DNA 서열은 프로모터, 인핸서, 및 오퍼레이터를 포함하고, 이는 일반적으로, 발현 구축물이 활용될 발현 시스템에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로모터 및 인핸서 서열은 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 능력에 대해 선택되는 반면, 오퍼레이터 서열은 유전자 발현을 조절할 수 있는 능력에 대해 선택될 수 있다. 페이로드는 또한, 일부 실시양태에서, 숙주 세포에서 상동 재조합을 용이하게 하고, 바람직하게는 촉진하는 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 발현 제어 서열은 프로모터 서열, 예를 들어 시토메갈로바이러스 프로모터; 라우스 육종 바이러스 프로모터; 및 원숭이 바이러스 40 프로모터; 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 개시되거나 또는 관련 기술분야에 달리 공지되어 있는 임의의 다른 유형의 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 프로모터는 목적하는 발현 생성물을 코딩하는 서열의 상류 (즉, 5')에 작동가능하게 연결된다. 페이로드는 또한, 코딩 서열의 하류 (즉, 3')에 작동가능하게 연결된 적합한 폴리아데닐화 서열 (예를 들어, SV40 또는 인간 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다.
일반적으로, 바이러스 벡터는 1개 이상의 목적하는 핵산을 세포 내로 형질도입할 수 있도록 조작된다. 또한, 본원에 제공된 치료 용도를 위해, 바이러스 벡터는 복제-결함인 것이 바람직하다는 것이 이해될 것이다. 바이러스 벡터는, 제한 없이, 레트로바이러스 (예를 들어, 뮤린 레트로바이러스, 조류 레트로바이러스, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하비 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스 (MuMTV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GaLV) 및 라우스 육종 바이러스 (RSV)), 렌티바이러스, 포진 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 알파바이러스 등에 기초할 수 있다. 다른 예가 본원의 다른 곳에 제공되거나 또는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바이러스 벡터는 바이러스의 천연 변이체, 균주, 또는 혈청형, 예컨대 본원에 제공된 것 중 어느 하나에 기초할 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 분자적 진화를 통해 선택된 바이러스에 기초할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J.T. Koerber et al., Mol. Ther. 17(12):2088-2095] 및 미국 특허 번호 6,09,548 참조). 바이러스 벡터는, 제한 없이, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 예컨대 AAV8 또는 AAV2에 기초할 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 Anc80에 기초할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 AAV 벡터 또는 Anc80 벡터는 각각 AAV 또는 Anc80에 기초한 바이러스 벡터이고, 핵산 물질 전달을 위해 포장할 수 있는 바이러스 성분, 예컨대 캡시드 및/또는 코트 단백질을 갖는다. AAV 벡터의 다른 예는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, 또는 AAV-2i8 또는 그의 변이체에 기초한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 벡터는 또한 조작된 벡터, 재조합 벡터, 돌연변이체 벡터, 또는 혼성체 벡터일 수 있다. 이러한 벡터를 조작하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 "키메라 바이러스 벡터"이다. 이러한 실시양태에서, 이는 바이러스 벡터가 1종 초과의 바이러스 또는 바이러스 벡터로부터 유래된 바이러스 성분으로 구성된 것을 의미한다. 예를 들어, PCT 공개 WO01/091802 및 WO14/168953, 및 미국 특허 번호 6,468,771을 참조한다. 이러한 바이러스 벡터는, 예를 들어, AAV8/Anc80 또는 AAV2/Anc80 바이러스 벡터일 수 있다.
추가의 바이러스 벡터 요소는 시스 또는 트랜스로 기능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 표적 (공여자) 서열의 5' 또는 3' 말단에 플랭킹된 1개 이상의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열(들), 전사를 촉진하는 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서), 인트론 서열, 스터퍼/필러 폴리뉴클레오티드 서열 (일반적으로, 불활성 서열), 및/또는 표적 (공여자) 서열의 3' 말단에 위치한 폴리(A) 서열을 또한 포함하는 벡터 게놈을 포함한다.
C. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물
중요하게는, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 바이러스 벡터의 투여에 의해 개선된 효과를 제공한다. 따라서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 바이러스 벡터를 사용하여 대상체를 치료하는데 유용하다. 이러한 바이러스 벡터는 유전자 요법 등을 포함한 다양한 목적을 위해 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 바이러스 벡터에 대한 면역 반응은 그의 효능에 유해한 영향을 미칠 수 있고, 또한 그의 재투여를 방해할 수 있다. 중요하게는, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 트랜스진의 개선된 발현을 달성하고/거나 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 감소시킴으로써 상기 언급된 장애를 극복하는 것으로 발견되었다. 본 발명자들은 놀랍게도, 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 공투여와 조합된, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 사전-용량 및/또는 사후-용량을 포함하는 투여 요법이 개선된 면역 반응 감소 및/또는 트랜스진 발현을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 놀랍게도 합성 나노담체에 포함된 경우, 공투여 단계의 면역억제제의 양은, 공투여 단계 단독과 비교하여, 사전-용량 또는 사후-용량에 의해 감소될 수 있다는 것을 또한 발견하였다. 따라서, 합성 나노담체에 포함된 경우, 면역억제제의 양은, 본원에 제공된 치료 요법 중 어느 하나에서, 사전-용량 및/또는 사후-용량 및 공투여 용량으로 "분할"될 수 있다.
또한 상기 언급된 바와 같이, 바이러스 벡터 투여는 바이러스 벡터 투여 직후에 IgM 면역 반응을 발생시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 또한 바이러스 벡터에 비해 자주 투여되는 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는 IgM-의존성 방식으로 상승된 트랜스진 발현을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다.
트랜스진
바이러스 벡터의 페이로드는 트랜스진일 수 있다. 예를 들어, 트랜스진은 목적하는 발현 생성물, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 단백질 혼합물, DNA, cDNA, 기능적 RNA 분자 (예를 들어, RNAi, miRNA), mRNA, RNA 레플리콘, 또는 다른 관심 생성물을 코딩할 수 있다.
예를 들어, 트랜스진의 발현 생성물은 대상체, 예컨대 질환 또는 장애를 갖는 것에게 유익한 단백질 또는 그의 부분일 수 있다. 단백질은 세포외, 세포내 또는 막-결합 단백질일 수 있다. 트랜스진은, 예를 들어, 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인, 예컨대 인터류킨 및 인터페론, 응고제, 성장 인자, 신경전달물질, 종양 억제자, 아포지단백질, 항원, 및 항체를 코딩할 수 있다. 대상체는 단백질의 대상체의 내인성 버전에 결합이 있거나 제한된 양으로 생산되는, 또는 전혀 생산되지 않는 질환 또는 장애를 가질 수 있거나, 또는 그를 갖는 것으로 의심될 수 있다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 다른 실시양태에서, 트랜스진의 발현 생성물은 대상체에게 유익한 유전자 또는 그의 부분일 수 있다.
치료 단백질의 예는 주입가능하거나 주사가능한 치료 단백질, 효소, 효소 보조인자, 호르몬, 혈액 또는 혈액 응고 인자, 시토카인 및 인터페론, 성장 인자, 아디포카인 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
주입가능하거나 주사가능한 치료 단백질의 예는, 예를 들어 토실리주맙 (로슈(Roche)/악템라(Actemra)®), 알파-1 항트립신 (카마다(Kamada)/AAT), 헤마티드(Hematide)® (아피맥스(Affymax) 및 다케다(Takeda), 합성 펩티드), 알빈테르페론 알파-2b (노파르티스(Novartis)/잘빈(Zalbin)™), 루신(Rhucin)® (파밍 그룹(Pharming Group), C1 억제제 대체 요법), 테사모렐린 (테라테크놀로지스(Theratechnologies)/에그리프타(Egrifta), 합성 성장 호르몬-방출 인자), 오크렐리주맙 (제넨테크(Genentech), 로슈 및 바이오젠(Biogen)), 벨리무맙 (글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)/벤리스타(Benlysta)®), 페글로티카제 (사비엔트 파마슈티칼스(Savient Pharmaceuticals)/크리스텍사(Krystexxa)™), 탈리글루세라제 알파 (프로탈릭스(Protalix)/유플리소(Uplyso)), 아갈시다제 알파 (샤이어(Shire)/레플라갈(Replagal)®), 및 벨라글루세라제 알파 (샤이어)를 포함한다.
효소의 예는 리소자임, 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 히드롤라제, 리아제, 이소머라제, 아스파라기나제, 우리카제, 글리코시다제, 프로테아제, 뉴클레아제, 콜라게나제, 히알루로니다제, 헤파리나제, 헤파라나제, 키나제, 포스파타제, 리신 및 리가제를 포함한다. 효소의 다른 예는 이미글루세라제 (예를 들어, 세레자임(CEREZYME)™), a-갈락토시다제 A (a-gal A) (예를 들어, 아갈시다제 베타, 파브리자임(FABRYZYME)™), 산 a-글루코시다제 (GAA) (예를 들어, 알글루코시다제 알파, 루미자임(LUMIZYME)™, 미오자임(MYOZYME)™), 및 아릴술파타제 B (예를 들어, 라로니다제, 알두라자임(ALDURAZYME)™, 이두르술파제, 엘라프라제(ELAPRASE)™, 아릴술파타제 B, 나글라자임(NAGLAZYME)™)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 효소 대체 요법에 사용되는 것을 포함한다.
호르몬의 예는 멜라토닌 (N-아세틸-5-메톡시트립타민), 세로토닌, 티록신 (또는 테트라아이오도티로닌) (갑상선 호르몬), 트리아이오도티로닌 (갑상선 호르몬), 에피네프린 (또는 아드레날린), 노르에피네프린 (또는 노르아드레날린), 도파민 (또는 프로락틴 억제 호르몬), 항뮐러관 호르몬 (또는 뮐러관 억제 인자 또는 호르몬), 아디포넥틴, 부신피질자극 호르몬 (또는 코르티코트로핀), 안지오텐시노겐 및 안지오텐신, 항이뇨 호르몬 (또는 바소프레신, 아르기닌 바소프레신), 심방-나트륨이뇨 펩티드 (또는 아트리오펩틴), 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 에리트로포이에틴, 여포-자극 호르몬, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 (GLP-1), GIP, 고나도트로핀-방출 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 인간 융모성 고나도트로핀, 인간 태반 락토겐, 성장 호르몬, 인히빈, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (또는 소마토메딘), 렙틴, 황체형성 호르몬, 멜라닌세포 자극 호르몬, 오렉신, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, 프로락틴, 렐락신, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선-자극 호르몬 (또는 티로트로핀), 티로트로핀-방출 호르몬, 코르티솔, 알도스테론, 테스토스테론, 데히드로에피안드로스테론, 안드로스텐디온, 디히드로테스토스테론, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 프로게스테론, 칼시트리올 (1,25-디히드록시비타민 D3), 칼시디올 (25-히드록시비타민 D3), 프로스타글란딘, 류코트리엔, 프로스타시클린, 트롬복산, 프로락틴 방출 호르몬, 리포트로핀, 뇌 나트륨이뇨 펩티드, 뉴로펩티드 Y, 히스타민, 엔도텔린, 췌장 폴리펩티드, 레닌, 및 엔케팔린을 포함한다.
혈액 또는 혈액 응고 인자의 예는 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 조직 인자, 인자 V (프로악셀레린, 불안정성 인자), 인자 VII (안정한 인자, 프로콘버틴), 인자 VIII (항혈우병 글로불린), 인자 IX (크리스마스 인자 또는 혈장 트롬보플라스틴 성분), 인자 X (스튜어트-프라워(Stuart-Prower) 인자), 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XII (하게만(Hageman) 인자), 인자 XIII (피브린-안정화 인자), 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자, 폰 헬데브란트(von Heldebrant) 인자, 프레칼리크레인 (플레처(Fletcher) 인자), 고분자량 키니노겐 (HMWK) (피츠제랄드(Fitzgerald) 인자), 피브로넥틴, 피브린, 트롬빈, 항트롬빈, 예컨대 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제 (ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI1), 플라스미노겐 활성화제 억제제-2 (PAI2), 암 응고촉진제, 및 에포에틴 알파 (에포젠, 프로크리트)를 포함한다.
시토카인의 예는 림포카인, 인터류킨, 및 케모카인, 유형 1 시토카인, 예컨대 IFN-γ, TGF-β, 및 유형 2 시토카인, 예컨대 IL-4, IL-10, 및 IL-13을 포함한다.
성장 인자의 예는 아드레노메둘린 (AM), 안지오포이에틴 (Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형태발생 단백질 (BMP), 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 표피 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 성장 분화 인자-9 (GDF9), 간세포 성장 인자 (HGF), 간세포암-유래 성장 인자 (HDGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 이동-촉진 인자, 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF) 및 다른 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), Wnt 신호전달 경로, 태반 성장 인자 (PlGF), [(소 태아 소마토트로핀)] (FBS), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-7을 포함한다.
아디포카인의 예는 렙틴 및 아디포넥틴을 포함한다.
치료 단백질의 추가의 예는 수용체, 신호전달 단백질, 세포골격 단백질, 스캐폴드 단백질, 전사 인자, 구조 단백질, 막 단백질, 시토졸 단백질, 결합 단백질, 핵 단백질, 분비된 단백질, 골지 단백질, 내형질 세망 단백질, 미토콘드리아 단백질, 및 소포성 단백질 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 발현 생성물은 표적 유전자 또는 표적 유전자의 부분을 파괴하거나, 교정/복구하거나, 또는 대체하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부/Cas (CRISPR/Cas) 시스템은 정확한 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. 상기 시스템에서, 단일 CRISPR-회합된 뉴클레아제 (Cas 뉴클레아제)는 염기 서열의 짧은 반복을 함유하는 DNA 유전자좌를 포함하는 특이적 DNA 표적을 인식하도록 가이드 RNA (짧은 RNA)에 의해 프로그래밍될 수 있다. 각각의 CRISPR 유전자좌는 바이러스 게놈 물질로부터 유래된 스페이서 DNA의 짧은 절편에 플랭킹된다. 가장 통상적인 시스템인 유형 II CRISPR 시스템에서, 스페이서 DNA는 트랜스-활성화 RNA (tracRNA)와 혼성화하고, 이는 CRISPR-RNA (crRNA)로 프로세싱된 다음 Cas 뉴클레아제와 회합하여 복합체를 형성하고, 이는 RNAse III 프로세싱을 개시하여 외래 DNA의 분해를 발생시킨다. 표적 서열은 바람직하게는 그의 3' 말단 상에 인식되도록 하기 위한 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열을 함유한다. 시스템은 수많은 방식으로 변형될 수 있고, 예를 들어 합성 가이드 RNA는 CRISPR 벡터에 융합될 수 있고, 다양한 상이한 가이드 RNA 구조 및 요소가 가능하다 (헤어핀 및 스캐폴드 서열 포함).
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 트랜스진 서열은 CRISPR/Cas 시스템 중 어느 하나 이상의 성분, 예컨대 발현되었을 때 검출가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 코딩할 수 있다. 이러한 리포터 서열의 예는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시페라제, 예를 들어 CD2, CD4, CD8, 및 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 포함한 막 결합 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 리포터가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 또 다른 예에서, 트랜스진은 RNA 생성물, 예컨대 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA, siRNA, RNAi, miRNA, 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 트랜스-스플라이싱 RNA, 및 안티센스 RNA를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 대상체에서 표적화된 핵산 서열의 발현을 억제하거나 소멸시키기 위해 특이적 RNA 서열이 생성될 수 있다. 적합한 표적 서열은, 예를 들어, 종양성 표적 및 바이러스성 질환을 포함한다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 트랜스진 서열은 발현되었을 때 검출가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 코딩할 수 있거나, 또는 트랜스진 서열은 질환의 동물 모델을 생성하는데 사용될 수 있는 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩할 수 있다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 또 다른 예에서, 트랜스진은 연구 목적으로 사용하기 위해, 예를 들어 트랜스진 생성물의 기능을 연구하기 위해, 예를 들어 트랜스진을 보유하는 체성 트랜스제닉 동물 모델을 생성하기 위해, 의도되는 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩할 수 있다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 다른 실시양태에서, 이러한 발현 생성물의 의도는 치료를 위한 것이다. 트랜스진의 다른 용도는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
트랜스진의 서열은 또한, 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 및 오퍼레이터를 포함하고, 이는 일반적으로, 발현 구축물이 활용될 발현 시스템에 기초하여 선택된다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 프로모터 및 인핸서 서열은 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 능력에 대해 선택되는 반면, 오퍼레이터 서열은 유전자 발현을 조절할 수 있는 능력에 대해 선택될 수 있다. 전형적으로, 프로모터 서열은 목적하는 발현 생성물을 코딩하는 핵산 서열의 상류 (즉, 5')에 위치하고, 인접 서열에 작동가능하게 연결되어, 그에 의해 발현되는 목적하는 생성물의 양이 프로모터의 부재 하에 발현된 양과 비교하여 증가된다. 일반적으로 프로모터 서열의 상류에 위치하는 인핸서 서열은 목적하는 생성물의 발현을 추가로 증가시킬 수 있다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 인핸서 서열(들)은 프로모터의 하류 및/또는 트랜스진 내에 위치할 수 있다. 트랜스진은 또한 숙주 세포 내에서의 상동 재조합 및/또는 포장을 용이하게 하고, 바람직하게는 촉진하는 서열을 포함할 수 있다. 트랜스진은 또한 숙주 세포에서의 복제에 필요한 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 발현 제어 서열은 간-특이적 프로모터 서열 및 구성적 프로모터 서열, 예컨대 본원에서 제공될 수 있는 어느 하나를 포함한다. 다른 조직-특이적 프로모터는, 특히, 눈, 망막, 중추 신경계, 척수 프로모터를 포함한다. 편재성 또는 혼재성 프로모터 및 인핸서의 예는 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터/인핸서 서열, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터/인핸서 서열 및 다양한 포유동물 세포 유형에서 활성인 다른 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 자연에 존재하지 않는 합성 요소 (예를 들어, 문헌 [Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
오퍼레이터 또는 조절가능한 요소는 신호 또는 자극에 반응하며, 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 유도성 요소는 신호 또는 자극에 반응하여 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 증가시키는 것, 예를 들어, 호르몬 유도성 프로모터이다. 억제성 요소는 신호 또는 자극에 반응하여 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 감소시키는 것이다. 전형적으로, 억제성 및 유도성 요소는 존재하는 신호 또는 자극의 양에 비례하여 반응한다. 트랜스진은 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나에서 이러한 서열을 포함할 수 있다.
트랜스진은 또한 코딩 서열의 하류 (즉, 3')에 작동가능하게 연결된 적합한 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어 유전자 요법을 위한, 트랜스진을 전달하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Smith. Int. J. Med. Sci. 1(2): 76-91 (2004); Phillips. Methods in Enzymology: Gene Therapy Methods. Vol. 346. Academic Press (2002)] 참조). 본원에 기재된 트랜스진 중 임의의 것이 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 임의의 것 내로 혼입될 수 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 7,629,153을 참조한다.
바이러스 벡터
바이러스는 이들이 감염시킨 세포 내부에서 자신의 게놈을 수송하기 위한 전문화된 메카니즘을 진화시켜 왔고; 이러한 바이러스에 기초한 바이러스 벡터는 세포를 형질도입하기 위해 특정한 적용에 맞출 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 기재되어 있다. 적합한 바이러스 벡터는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 (HSV)-기반 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV)-기반 벡터, 및 AAV-아데노바이러스 키메라 벡터를 포함한다.
본원에 제공된 바이러스 벡터는 레트로바이러스에 기초할 수 있다. 레트로바이러스는 단일 가닥 양성 센스 RNA 바이러스이다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 복제-부적격하도록 조작할 수 있다. 따라서, 레트로바이러스 벡터는 생체내 안정한 유전자 전달에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 레트로바이러스 벡터의 예는, 예를 들어 미국 공개 번호 20120009161, 20090118212, 및 20090017543에서 확인할 수 있고, 이러한 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
렌티바이러스 벡터는 본원에 제공된 바와 같은 바이러스 벡터의 생성을 위해 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예이다. 렌티바이러스의 예는 HIV (인간), 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV) 및 비스나 바이러스 (양 렌티바이러스)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터의 예는, 예를 들어 미국 공개 번호20150224209, 20150203870, 20140335607, 20140248306, 20090148936, 및 20080254008에서 찾을 수 있는데, 상기 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
단순 포진 바이러스 (HSV)-기반 바이러스 벡터가 또한, 본원에 제공된 바와 같이 사용하기에 적합하다. 많은 복제-결핍 HSV 벡터는 복제를 방지하기 위해 하나 이상의 중간-초기 유전자를 제거하는 결실을 함유한다. HSV-기반 벡터의 설명에 관해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,837,532, 5,846,782, 5,849,572, 및 5,804,413, 및 국제 특허 출원 WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, 및 WO 99/06583을 참조할 수 있고, 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법에 관한 설명은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
바이러스 벡터는 아데노바이러스에 기초할 수 있다. 바이러스 벡터의 기초가 될 수 있는 아데노바이러스는 임의의 기원, 임의의 하위군, 임의의 하위유형, 하위유형의 혼합물, 또는 임의의 혈청형으로부터 비롯될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 하위군 A (예를 들어, 혈청형 12, 18, 및 31), 하위군 B (예를 들어, 혈청형 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 및 50), 하위군 C (예를 들어, 혈청형 1, 2, 5, 및 6), 하위군 D (예를 들어, 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 및 42-48), 하위군 E (예를 들어, 혈청형 4), 하위군 F (예를 들어, 혈청형 40 및 41), 분류되지 않은 혈청군 (예를 들어, 혈청형 49 및 51), 또는 임의의 다른 아데노바이러스 혈청형의 것일 수 있다. 아데노바이러스 혈청형 1 내지 51은 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능하다. 비-그룹 C 아데노바이러스, 및 심지어 비-인간 아데노바이러스를 이용하여, 복제-결핍 아데노바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 비-그룹 C 아데노바이러스 벡터, 비-그룹 C 아데노바이러스 벡터의 생성 방법, 및 비-그룹 C 아데노바이러스 벡터의 사용 방법이, 예를 들어 미국 특허 번호 5,801,030, 5,837,511, 및 5,849,561, 및 국제 특허 출원 WO 97/12986 및 WO 98/53087에 개시된다. 임의의 아데노바이러스, 심지어 키메라 아데노바이러스가 아데노바이러스 벡터에 대한 바이러스 게놈의 공급원으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 아데노바이러스가 복제-결핍 아데노바이러스 벡터에 대한 바이러스 게놈의 공급원으로서 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터의 추가의 예는 미국 공개 번호 20150093831, 20140248305, 20120283318, 20100008889, 20090175897 및 20090088398에서 확인할 수 있고, 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법에 관한 설명은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 제공된 바이러스 벡터는 또한 아데노-연관 바이러스 (AAV)에 기초할 수 있다. AAV 벡터는 본원에 기재된 것과 같은 치료 용도에서 사용하기 위한 것으로 특히 관심 대상이다. AAV-기반 벡터의 설명에 관해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 8,679,837, 8,637,255, 8,409,842, 7,803,622, 및 7,790,449, 및 미국 공개 번호 20150065562, 20140155469, 20140037585, 20130096182, 20120100606, 및 20070036757을 참조한다. AAV 벡터는 재조합 AAV 벡터일 수 있다. AAV 벡터는 또한, 자기 상보성 (sc) AAV 벡터일 수 있는데, 이는 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2007/01110724 및 2004/0029106, 및 미국 특허 번호 7,465,583 및 7,186,699에 기재되어 있고, 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
바이러스 벡터의 기초가 될 수 있는 아데노-연관 바이러스는 임의의 혈청형 또는 혈청형의 혼합물의 것일 수 있다. AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11을 포함한다. 예를 들어, 바이러스 벡터가 혈청형의 혼합물을 기초로 하는 경우, 바이러스 벡터는 하나의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11 중 어느 하나로부터 선택됨)으로부터 취한 캡시드 신호 서열 및 상이한 혈청형 (예를 들어, AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및 11 중 어느 하나로부터 선택됨)으로부터의 패키징 서열을 함유할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV 2/8-기반 벡터이다. 본원에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 다른 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV 2/5-기반 벡터이다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터의 기초가 되는 바이러스는 합성 바이러스, 예컨대 Anc80일 수 있다.
제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV/Anc80 벡터, 예컨대 AAV8/Anc80 벡터 또는 AAV2/Anc80 벡터이다.
벡터의 기초가 될 수 있는 다른 바이러스는 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11, rhl0, rh74 또는 AAV-2i8, 및 그의 변이체를 포함한다.
본원에 제공된 바이러스 벡터는 또한 알파바이러스에 기초할 수 있다. 알파바이러스는 신드비스(Sindbis) (및 VEEV) 바이러스, 아우라(Aura) 바이러스, 바반키(Babanki) 바이러스, 바마 포레스트(Barmah Forest) 바이러스, 베바루(Bebaru) 바이러스, 카바소우(Cabassou) 바이러스, 치쿤군야(Chikungunya) 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitis) 바이러스, 에버글레이즈(Everglades) 바이러스, 포트 모건(Fort Morgan) 바이러스, 게타(Getah) 바이러스, 하이랜즈 J(Highlands J) 바이러스, 키지라가흐(Kyzylagach) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 메 트리(Me Tri) 바이러스, 미델뷔르흐(Middelburg) 바이러스, 모쏘 다스 페드라스(Mosso das Pedras) 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 엔두무(Ndumu) 바이러스, 오니옹니옹(O'nyong-nyong) 바이러스, 픽수나(Pixuna) 바이러스, 리오 네그로(Rio Negro) 바이러스, 로스강(Ross River) 바이러스, 연어 췌장 질환(Salmon pancreas disease) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 남방 코끼리 물범(Southern elephant seal) 바이러스, 토나테(Tonate) 바이러스, 트로카라(Trocara) 바이러스, 우나(Una) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스, 서부 말 뇌염(Western equine encephalitis) 바이러스, 및 화타로아(Whataroa) 바이러스를 포함한다. 알파바이러스 벡터의 예는 미국 공개 번호 20150050243, 20090305344, 및 20060177819에서 확인할 수 있고; 벡터 및 그의 제조 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 제공된 바이러스 벡터 중 어느 하나는 본원에 제공된 방법 중 어느 하나에서 사용될 수 있다.
면역억제제
면역억제제는 스타틴; mTOR 억제제, 예컨대 라파마이신 또는 라파마이신 유사체; TGF-β 신호전달 작용제; TGF-β 수용체 효능제; 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제; 코르티코스테로이드; 미토콘드리아 기능의 억제제, 예컨대 로테논; P38 억제제; NF-κβ 억제제; 아데노신 수용체 효능제; 프로스타글란딘 E2 효능제; 포스포디에스테라제 억제제, 예컨대 포스포디에스테라제 4 억제제; 프로테아솜 억제제; 키나제 억제제; G-단백질 커플링된 수용체 효능제; G-단백질 커플링된 수용체 길항제; 글루코코르티코이드; 레티노이드; 시토카인 억제제; 시토카인 수용체 억제제; 시토카인 수용체 활성화제; 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 길항제; 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 효능제; 히스톤 데아세틸라제 억제제; 칼시뉴린 억제제; 포스파타제 억제제 및 산화된 ATP를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 면역억제제는 또한, IDO, 비타민 D3, 시클로스포린 A, 아릴 탄화수소 수용체 억제제, 레스베라트롤, 아자티오퓨린, 6-메르캅토퓨린, 아스피린, 니플룸산, 에스트리올, 트리폴리드, 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-10), 시클로스포린 A, siRNA 표적화 시토카인 또는 시토카인 수용체 등을 포함한다.
스타틴의 예는 아토르바스타틴 (리피토르(LIPITOR)®, 토르바스트(TORVAST)®), 세리바스타틴, 플루바스타틴 (레스콜(LESCOL)®, 레스콜® XL), 로바스타틴 (메바코르(MEVACOR)®, 알토코르(ALTOCOR)®, 알토프레브(ALTOPREV)®), 메바스타틴 (콤팩틴(COMPACTIN)®), 피타바스타틴 (리발로(LIVALO)®, 피아바(PIAVA)®), 로수바스타틴 (프라바콜(PRAVACHOL)®, 셀렉틴(SELEKTINE)®, 리포스타트(LIPOSTAT)®), 로수바스타틴 (크레스토르(CRESTOR)®), 및 심바스타틴 (조코르(ZOCOR)®, 리펙스(LIPEX)®)을 포함한다.
mTOR 억제제의 예는 라파마이신 및 그의 유사체 (예를 들어, CCL-779, RAD001, AP23573, C20-메트알릴라파마이신 (C20-Marap), C16-(S)-부틸술폰아미도라파마이신 (C16-BSrap), C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신 (C16-iRap) (문헌 [Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107])), AZD8055, BEZ235 (NVP-BEZ235), 크리소판산 (크리소판올), 데포롤리무스 (MK-8669), 에베롤리무스 (RAD0001), KU-0063794, PI-103, PP242, 템시롤리무스, 및 WYE-354 (미국 텍사스주 휴스톤 소재의 셀렉(Selleck)으로부터 입수 가능함)를 포함한다.
TGF-β 신호전달 작용제의 예는 TGF-β 리간드 (예를 들어, 액티빈 A, GDF1, GDF11, 골 형태발생 단백질, 결절성, TGF-β) 및 그의 수용체 (예를 들어, ACVR1B, ACVR1C, ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, BMPR1A, BMPR1B, TGFβRI, TGFβRII), R-SMADS/co-SMADS (예를 들어, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD8), 및 리간드 억제제 (예를 들어, 폴리스타틴, 노긴, 코르딘, DAN, 레프티, LTBP1, THBS1, 데코린)를 포함한다.
미토콘드리아 기능의 억제제의 예는 아트락틸로시드 (이칼륨 염), 봉크렉산 (트리암모늄 염), 카르보닐 시아나이드 m-클로로페닐히드라존, 카르복시아트락틸로시드 (예를 들어, 아트락틸리스 구미페라(Atractylis gummifera)로부터 유래됨), CGP-37157, (-)-데구엘린 (예를 들어, 문둘레아 세리세아(Mundulea sericea)로부터 유래됨), F16, 헥소키나제 II VDAC 결합 도메인 펩티드, 올리고마이신, 로테논, Ru360, SFK1, 및 발리노마이신 (예를 들어, 스트렙토미세스 풀비시무스(Streptomyces fulvissimus)로부터 유래됨) (이엠디4바이오사이언시스(EMD4Biosciences), 미국)을 포함한다.
P38 억제제의 예는 SB-203580 (4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술피닐페닐)-5-(4-피리딜)1H-이미다졸), SB-239063 (트랜스-1-(4-히드록시시클로헥실)-4-(플루오로페닐)-5-(2-메톡시-피리미딘-4-일)이미다졸), SB-220025 (5-(2-아미노-4-피리미디닐)-4-(4-플루오로페닐)-1-(4-피페리디닐)이미다졸)), 및 ARRY-797을 포함한다.
NF (예를 들어, NF-κβ) 억제제의 예는 IFRD1, 2-(1,8-나프티리딘-2-일)-페놀, 5-아미노살리실산, BAY 11-7082, BAY 11-7085, CAPE (카페인산 페네틸에스테르), 디에틸말레에이트, IKK-2 억제제 IV, IMD 0354, 락타시스틴, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], NFκB 활성화 억제제 III, NF-κB 활성화 억제제 II, JSH-23, 파르테놀리드, 페닐아르신 옥시드 (PAO), PPM-18, 피롤리딘디티오카르밤산 암모늄 염, QNZ, RO 106-9920, 로카글라미드, 로카글라미드 AL, 로카글라미드 C, 로카글라미드 I, 로카글라미드 J, 로카글라올, (R)-MG-132, 살리실산나트륨, 트리프톨리드 (PG490), 및 웨델로락톤을 포함한다.
아데노신 수용체 효능제의 예는 CGS-21680 및 ATL-146e를 포함한다.
프로스타글란딘 E2 효능제의 예는 E-프로스타노이드 2 및 E-프로스타노이드 4를 포함한다.
포스포디에스테라제 억제제 (비-선택적 및 선택적 억제제)의 예는 카페인, 아미노필린, IBMX (3-이소부틸-1-메틸크산틴), 파라크산틴, 펜톡시필린, 테오브로민, 테오필린, 메틸화 크산틴, 빈포세틴, EHNA (에리트로-9-(2-히드록시-3-노닐)아데닌), 아나그렐리드, 에녹시몬 (페르판(PERFAN)™), 밀리논, 레보시멘돈, 메셈브린, 이부딜라스트, 피클라밀라스트, 루테올린, 드로타베린, 로플루밀라스트 (닥사스(DAXAS)™, 달리레스프(DALIRESP)™), 실데나필 (레바티온(REVATION)®, 비아그라(VIAGRA)®), 타달라필 (애드서카(ADCIRCA)®, 시알리스(CIALIS)®), 바르데나필 (레비트라(LEVITRA)®, 스탁신(STAXYN)®), 우데나필, 아바나필, 이카리인, 4-메틸피페라진, 및 피라졸로 피리미딘-7-1을 포함한다.
프로테아솜 억제제의 예는 보르테조밉, 디술피람, 에피갈로카테킨-3-갈레이트, 및 살리노스포라미드 A를 포함한다.
키나제 억제제의 예는 베바시주맙, BIBW 2992, 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®), 이마티닙 (글리벡(GLEEVEC)®), 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)®), 게피티닙 (이레사(IRESSA)®), 라니비주맙 (루센티스(LUCENTIS)®), 페갑타닙, 소라페닙, 다사티닙, 수니티닙, 에를로티닙, 닐로티닙, 라파티닙, 파니투무맙, 반데타닙, E7080, 파조파닙, 및 무브리티닙을 포함한다.
글루코코르티코이드의 예는 히드로코르티손 (코르티솔), 코르티손 아세테이트, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 트리암시놀론, 베클로메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론 아세테이트 (DOCA), 및 알도스테론을 포함한다.
레티노이드의 예는 레티놀, 레티날, 트레티노인 (레티노산, 레틴-A(RETIN-A)®), 이소트레티노인 (아큐탄(ACCUTANE)®, 암네스팀(AMNESTEEM)®, 클라라비스(CLARAVIS)®, 소트레트(SOTRET)®), 알리트레티노인 (판레틴(PANRETIN)®), 에트레티네이트 (테기손(TEGISON)™) 및 그의 대사물 아시트레틴 (소리아탄(SORIATANE)®), 타자로텐 (타조락(TAZORAC)®, 아바게(AVAGE)®, 조락(ZORAC)®), 벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®), 및 아다팔렌 (디페린(DIFFERIN)®)을 포함한다.
시토카인 억제제의 예는 IL1ra, IL1 수용체 길항제, IGFBP, TNF-BF, 우로모듈린, 알파-2-마크로글로불린, 시클로스포린 A, 펜타미딘, 및 펜톡시필린 (펜토팍(PENTOPAK)®, 펜톡실(PENTOXIL)®, 트렌탈(TRENTAL)®)을 포함한다.
퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 길항제의 예는 GW9662, PPARγ 길항제 III, G335, 및 T0070907 (이엠디4바이오사이언시스, 미국)을 포함한다.
퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 효능제의 예는 피오글리타존, 시글리타존, 클로피브레이트, GW1929, GW7647, L-165,041, LY 171883, PPARγ 활성화제, Fmoc-Leu, 트로글리타존, 및 WY-14643 (이엠디4바이오사이언시스, 미국)을 포함한다.
히스톤 데아세틸라제 억제제의 예는 히드록삼산 (또는 히드록사메이트), 예컨대 트리코스타틴 A, 시클릭 테트라펩티드 (예컨대 트라폭신 B) 및 뎁시펩티드, 벤자미드, 친전자성 케톤, 지방족 산 화합물, 예컨대 페닐부티레이트 및 발프로산, 히드록삼산, 예컨대 보리노스타트 (SAHA), 벨리노스타트 (PXD101), LAQ824, 및 파노비노스타트 (LBH589), 벤즈아미드, 예컨대 엔티노스타트 (MS-275), CI994, 및 모세티노스타트 (MGCD0103), 니코틴아미드, NAD의 유도체, 디히드로쿠마린, 나프토피라논, 및 2-히드록시나프알데히드를 포함한다.
칼시뉴린 억제제의 예는 시클로스포린, 피메크롤리무스, 보클로스포린, 및 타크롤리무스를 포함한다.
포스파타제 억제제의 예는 BN82002 히드로클로라이드, CP-91149, 칼리쿨린 A, 칸타리드산, 칸타리딘, 시페르메트린, 에틸-3,4-데포스타틴, 포스트리에신 소듐 염, MAZ51, 메틸-3,4-데포스타틴, NSC 95397, 노르칸타리딘, 프로로센트룸 콘카붐(prorocentrum concavum)으로부터의 오카다산 암모늄 염, 오카다산, 오카다산 칼륨 염, 오카다산 나트륨 염, 페닐아르신 옥시드, 다양한 포스파타제 억제제 칵테일, 단백질 포스파타제 1C, 단백질 포스파타제 2A 억제제 단백질, 단백질 포스파타제 2A1, 단백질 포스파타제 2A2, 및 오르토바나듐산나트륨을 포함한다.
합성 나노담체
본원에 제공된 방법은 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 투여를 포함한다. 일반적으로, 면역억제제는 합성 나노담체의 구조를 구성하는 물질에 부가적인 요소이다. 예를 들어, 합성 나노담체가 1종 이상의 중합체로 구성된, 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 면역억제제는 1종 이상의 중합체에 부가적이고, 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서는, 그에 부착되는 화합물이다. 합성 나노담체의 물질이 또한 면역관용성 효과를 발생시키는 것인 실시양태에서, 면역억제제는 면역관용성 효과를 발생시키는 합성 나노담체의 물질에 추가적으로 존재하는 요소이다.
매우 다양한 합성 나노담체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 구형 또는 타원형이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 편평하거나 또는 플레이트 모양이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 정육면체 또는 입방체이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 계란형 또는 타원이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 원통형, 원뿔형 또는 피라미드형이다.
일부 실시양태에서, 각각의 합성 나노담체가 유사한 특성을 갖도록 크기 또는 형상 면에서 비교적 균일한 합성 나노담체의 집단을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 합성 나노담체의 총수에 기초하여, 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 합성 나노담체의 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는, 이러한 합성 나노담체의 평균 직경 또는 평균 치수의 5%, 10%, 또는 20% 이내에 속하는 최소 치수 또는 최대 치수를 가질 수 있다.
합성 나노담체는 고체 또는 중공일 수 있고, 1개 이상의 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 층은 다른 층(들)과 비교해서 고유한 조성 및 고유한 특성을 갖는다. 하나의 예로, 합성 나노담체는 코어/쉘 구조를 가질 수 있고, 여기서 코어는 1개의 층이고 (예를 들어, 중합체 코어), 쉘은 제2의 층 (예를 들어, 지질 이중층 또는 단층)이다. 합성 나노담체는 복수의 상이한 층을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 하나 이상의 지질을 임의로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 리포솜을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 지질 단층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 미셀을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 지질 층 (예를 들어, 지질 이중층, 지질 단층 등)에 의해 둘러싸인 중합체 매트릭스를 포함하는 코어를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 지질 층 (예를 들어, 지질 이중층, 지질 단층 등)에 의해 둘러싸인 비-중합체 코어 (예를 들어, 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자, 골 입자, 바이러스 입자, 단백질, 핵산, 탄수화물 등)를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 합성 나노담체는 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-중합체 합성 나노담체는 비-중합체 성분의 응집체, 예컨대 금속 원자 (예를 들어, 금 원자)의 응집체이다.
일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 하나 이상의 친양쪽성 실체를 임의로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친양쪽성 실체는 증가된 안정성, 개선된 균일성, 또는 증가된 점도를 갖는 합성 나노담체의 생성을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친양쪽성 실체는 지질 막 (예를 들어, 지질 이중층, 지질 단층 등)의 내부 표면과 회합될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 많은 친양쪽성 실체가 본 발명에 따라 합성 나노담체를 제조하는데 사용하기에 적합하다. 이러한 친양쪽성 실체는 포스포글리세리드; 포스파티딜콜린; 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC); 디올레일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE); 디올레일옥시프로필트리에틸암모늄 (DOTMA); 디올레오일포스파티딜콜린; 콜레스테롤; 콜레스테롤 에스테르; 디아실글리세롤; 디아실글리세롤숙시네이트; 디포스파티딜 글리세롤 (DPPG); 헥산데칸올; 지방 알콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 표면 활성 지방산, 예컨대 팔미트산 또는 올레산; 지방산; 지방산 모노글리세리드; 지방산 디글리세리드; 지방산 아미드; 소르비탄 트리올레에이트 (스판(Span)®85) 글리코콜레이트; 소르비탄 모노라우레이트 (스판®20); 폴리소르베이트 20 (트윈(Tween)®20); 폴리소르베이트 60 (트윈®60); 폴리소르베이트 65 (트윈®65); 폴리소르베이트 80 (트윈®80); 폴리소르베이트 85 (트윈®85); 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트; 서팩틴; 폴록사머; 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 소르비탄 트리올레에이트; 레시틴; 리소레시틴; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 스핑고미엘린; 포스파티딜에탄올아민 (세팔린); 카르디올리핀; 포스파티드산; 세레브로시드; 디세틸포스페이트; 디팔미토일포스파티딜글리세롤; 스테아릴아민; 도데실아민; 헥사데실-아민; 아세틸 팔미테이트; 글리세롤 리시놀레에이트; 헥사데실 스테아레이트; 이소프로필 미리스테이트; 틸록사폴; 폴리(에틸렌 글리콜)5000-포스파티딜에탄올아민; 폴리(에틸렌 글리콜)400-모노스테아레이트; 인지질; 높은 계면활성제 특성을 갖는 합성 및/또는 천연 세제; 데옥시콜레이트; 시클로덱스트린; 카오트로픽 염; 이온 쌍형성 작용제; 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 친양쪽성 실체 성분은 상이한 친양쪽성 실체의 혼합물일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이것이 계면활성제 활성을 갖는 물질의 포괄적인 목록이 아니라 예시적인 목록이라는 것을 인식할 것이다. 임의의 친양쪽성 실체가 본 발명에 따라 사용될 합성 나노담체의 생성에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 하나 이상의 탄수화물을 임의로 포함할 수 있다. 탄수화물은 천연 또는 합성일 수 있다. 탄수화물은 유도된 천연 탄수화물일 수 있다. 특정 실시양태에서, 탄수화물은 모노사카라이드 또는 디사카라이드를 포함하며, 이는 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 리보스, 락토스, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 만노스, 크실로스, 아라비노스, 글루쿠론산, 갈락토론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴람산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 탄수화물은 폴리사카라이드이며, 이는 풀루란, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시셀룰로스 (HC), 메틸셀룰로스 (MC), 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 히드록시에틸전분, 카라기난, 글리콘, 아밀로스, 키토산, N,O-카르복실메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 전분, 키틴, 이눌린, 곤약, 글루코만난, 푸스툴란, 헤파린, 히알루론산, 커들란 및 크산탄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 실시양태에서, 합성 나노담체는 탄수화물, 예컨대 폴리사카라이드를 포함하지 않는다 (또는 구체적으로 배제한다). 특정 실시양태에서, 탄수화물은 탄수화물 유도체, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 에리트리톨, 말티톨 및 락티톨을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당 알콜을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 비-메톡시-종결, 플루로닉 중합체인 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체를 구성하는 중합체의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% (중량/중량)가 비-메톡시-종결, 플루로닉 중합체이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체를 구성하는 모든 중합체가 비-메톡시-종결, 플루로닉 중합체이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 비-메톡시-종결 중합체인 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체를 구성하는 중합체의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% (중량/중량)가 비-메톡시-종결 중합체이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체를 구성하는 모든 중합체가 비-메톡시-종결 중합체이다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 플루로닉 중합체를 포함하지 않는 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체를 구성하는 중합체의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% (중량/중량)가 플루로닉 중합체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체를 구성하는 모든 중합체가 플루로닉 중합체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 중합체는 코팅 층 (예를 들어, 리포솜, 지질 단층, 미셀 등)에 의해 둘러싸일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체의 요소가 상기 중합체에 부착될 수 있다.
면역억제제는 수많은 방법 중 임의의 것에 의해 합성 나노담체와 커플링될 수 있다. 일반적으로, 부착은 면역억제제와 합성 나노담체 사이의 결합에 따른 결과일 수 있다. 이러한 결합으로 인해, 면역억제제가 합성 나노담체의 표면에 부착되게 하고/거나 합성 나노담체 내에 함유 (캡슐화)될 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 면역억제제는 합성 나노담체에 대한 결합보다는 오히려 합성 나노담체의 구조에 따른 결과로서 합성 나노담체에 의해 캡슐화된다. 바람직한 실시양태에서, 합성 나노담체는 본원에 제공된 바와 같은 중합체를 포함하고, 면역억제제는 중합체에 부착된다.
면역억제제와 합성 나노담체 사이의 결합에 따른 결과로서 부착이 일어나는 경우, 이러한 부착은 커플링 모이어티를 통해 일어날 수 있다. 커플링 모이어티는, 이를 통해 면역억제제가 합성 나노담체와 결합되는 임의의 모이어티일 수 있다. 이러한 모이어티는 공유 결합, 예컨대 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 포함할 뿐만 아니라 면역억제제를 합성 나노담체와 (공유 또는 비공유) 결합시켜 주는 별개의 분자를 포함한다. 이러한 분자는 링커 또는 중합체 또는 그의 유닛을 포함한다. 예를 들어, 커플링 모이어티는 면역억제제와 정전기적으로 결합하는, 하전된 중합체를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 커플링 모이어티는 그와 공유적으로 결합되는 중합체 또는 그의 유닛을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 합성 나노담체는 본원에 제공된 바와 같은 중합체를 포함한다. 이들 합성 나노담체는 완전하게 중합체성일 수 있거나 또는 중합체와 다른 물질의 혼합물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 나노담체의 중합체들이 회합하여 중합체 매트릭스를 형성한다. 이들 실시양태 중 일부에서, 성분, 예컨대 면역억제제는 이러한 중합체 매트릭스의 하나 이상의 중합체와 공유 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공유 회합은 링커에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 성분은 중합체 매트릭스의 하나 이상의 중합체와 비공유 회합될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 성분은 중합체 매트릭스 내에 캡슐화될 수 있고/거나, 이러한 매트릭스에 의해 둘러싸일 수 있고/거나 상기 매트릭스 전반에 걸쳐 분산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 성분은 소수성 상호작용, 전하 상호작용, 반 데르 발스 힘 등에 의해 중합체 매트릭스의 하나 이상의 중합체와 회합될 수 있다. 광범위한 중합체 및 그로부터 중합체 매트릭스를 형성하는 방법은 통상적으로 공지되어 있다.
중합체는 천연 또는 비천연 (합성) 중합체일 수 있다. 중합체는 단독중합체이거나 또는 2개 이상의 단량체를 포함하는 공중합체일 수 있다. 순서의 면에서, 공중합체는 무작위 또는 블록일 수 있거나 또는 무작위 및 블록 순서의 조합을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 중합체는 유기 중합체이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리아미드, 또는 폴리에테르, 또는 그의 유닛을 포함한다. 다른 실시양태에서, 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 또는 폴리카프로락톤, 또는 그의 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체가 생분해성인 것이 바람직하다. 따라서, 이들 실시양태에서, 중합체가 폴리에테르, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리프로필렌 글리콜 또는 그의 유닛을 포함하는 경우, 중합체는 폴리에테르와 생분해성 중합체의 블록 공중합체를 포함하여, 중합체가 생분해성이 되도록 하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 중합체는 폴리에테르 또는 그의 유닛, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리프로필렌 글리콜 또는 그의 유닛을 단독으로 포함하지 않는다.
본 발명에 사용하기 적합한 중합체의 다른 예는 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트 (예를 들어, 폴리(1,3-디옥산-2온)), 폴리무수물 (예를 들어, 폴리(세바스산 무수물)), 폴리프로필푸마레이트, 폴리아미드 (예를 들어, 폴리카프로락탐), 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르 (예를 들어, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리락티드-코-글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리히드록시산 (예를 들어, 폴리(β-히드록시알카노에이트))), 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 및 폴리아민, 폴리리신, 폴리리신-PEG 공중합체, 및 폴리(에틸렌이민), 폴리(에틸렌 이민)-PEG 공중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 21 C.F.R. § 177.2600 하에 미국 식품 의약품국 (FDA)에 의해 인간에게 사용하도록 승인된 중합체를 포함하며, 이는 폴리에스테르 (예를 들어, 폴리락트산, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리발레롤락톤, 폴리(1,3-디옥산-2온)); 폴리무수물 (예를 들어, 폴리(세바스산 무수물)); 폴리에테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜); 폴리우레탄; 폴리메타크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 및 폴리시아노아크릴레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 중합체는 친수성일 수 있다. 예를 들어, 중합체는 음이온성 기 (예를 들어, 포스페이트 기, 술페이트 기, 카르복실레이트 기); 양이온성 기 (예를 들어, 4급 아민 기); 또는 극성 기 (예를 들어, 히드록실 기, 티올 기, 아민 기)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친수성 중합체 매트릭스를 포함하는 합성 나노담체는 이러한 합성 나노담체 내에 친수성 환경을 생성한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 소수성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체 매트릭스를 포함하는 합성 나노담체는 이러한 합성 나노담체 내에 소수성 환경을 생성한다. 중합체의 친수성 또는 소수성의 선택은 합성 나노담체 내에 혼입되는 물질의 성질에 강력한 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 하나 이상의 모이어티 및/또는 관능기에 의해 변형될 수 있다. 다양한 모이어티 또는 관능기가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 탄수화물; 및/또는 폴리사카라이드로부터 유래된 비-시클릭 폴리아세탈에 의해 변형될 수 있다 (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). 특정 실시양태는 미국 특허 번호 5543158 (Gref et al.), 또는 WO 공개 번호 WO2009/051837 (Von Andrian et al.)의 일반적 교시를 이용하여 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 지질 또는 지방산 기에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 또는 리그노세르산 중 하나 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 팔미톨레산, 올레산, 바센산, 리놀레산, 알파-리놀레산, 감마-리놀레산, 아라키돈산, 가돌레산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 또는 에루스산 중 하나 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 폴리에스테르일 수 있고, 이는 락트산과 글리콜산 유닛을 포함하는 공중합체, 예컨대 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드) (본원에서 집합적으로 "PLGA"로서 지칭됨); 및 글리콜산 유닛을 포함하는 단독중합체 (본원에서 "PGA"로서 지칭됨); 및 락트산 유닛을 포함하는 단독중합체, 예컨대 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락티드, 폴리-D-락티드, 및 폴리-D,L-락티드 (본원에서 집합적으로 "PLA"로서 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 예시적인 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리히드록시산; 락티드와 글리콜리드의 공중합체 및 PEG 공중합체 (예를 들어, PLA-PEG 공중합체, PGA-PEG 공중합체, PLGA-PEG 공중합체), 및 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리에스테르는, 예를 들어 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-PEG 공중합체, 폴리(L-락티드-코-L-리신), 폴리(세린 에스테르), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 및 그의 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 PLGA일 수 있다. PLGA는 락트산과 글리콜산의 생체적합성 및 생분해성 공중합체이고, 다양한 형태의 PLGA는 락트산:글리콜산의 비를 특징으로 한다. 락트산은 L-락트산, D-락트산, 또는 D,L-락트산일 수 있다. PLGA의 분해 속도는 락트산:글리콜산 비를 변경시킴으로써 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용될 PLGA는 대략 85:15, 대략 75:25, 대략 60:40, 대략 50:50, 대략 40:60, 대략 25:75, 또는 대략 15:85의 락트산:글리콜산 비를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 하나 이상의 아크릴 중합체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 아크릴 중합체는, 예를 들어 아크릴산과 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(메타크릴산 무수물), 메틸 메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 글리시딜 메타크릴레이트 공중합체, 폴리시아노아크릴레이트, 및 상기 중합체 중 하나 이상을 포함하는 조합물을 포함한다. 아크릴 중합체는 4급 암모늄 기의 함량이 낮은 아크릴산과 메타크릴산 에스테르의 완전 중합된 공중합체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 양이온성 중합체일 수 있다. 일반적으로, 양이온성 중합체는 핵산의 음으로 하전된 가닥을 응축 및/또는 보호할 수 있다. 아민-함유 중합체, 예컨대 폴리(리신) (문헌 [Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; and Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7]), 폴리(에틸렌 이민) (PEI; 문헌 [Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297]), 및 폴리(아미도아민) 덴드리머 (문헌 [Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; and Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372])가 생리학상 pH에서 양으로-하전되어, 핵산과 이온 쌍을 형성한다. 실시양태에서, 합성 나노담체는 양이온성 중합체를 포함하지 않을 수 있다 (또는 이를 배제할 수 있다).
일부 실시양태에서, 중합체는 양이온성 측쇄를 보유하는 분해성 폴리에스테르일 수 있다 (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; and Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). 이들 폴리에스테르의 예는 폴리(L-락티드-코-L-리신) (문헌 [Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010]), 폴리(세린 에스테르) (문헌 [Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399]), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) (문헌 [Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; and Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633]), 및 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) (문헌 [Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; and Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633])를 포함한다.
이들 및 다른 중합체의 특성, 및 이들의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,123,727; 5,804,178; 5,770,417; 5,736,372; 5,716,404; 6,095,148; 5,837,752; 5,902,599; 5,696,175; 5,514,378; 5,512,600; 5,399,665; 5,019,379; 5,010,167; 4,806,621; 4,638,045; 및 4,946,929; 문헌 [Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; and Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181] 참조). 보다 일반적으로, 특정의 적합한 중합체를 합성하는 다양한 방법이 문헌 ([Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386]; 및 미국 특허 번호 6,506,577, 6,632,922, 6,686,446, 및 6,818,732)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 덴드리머일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 서로 실질적으로 가교될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 실질적으로 가교가 없을 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 가교 단계를 거치지 않으면서 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 합성 나노담체는 상기 및 다른 중합체 중 임의의 것의 블록 공중합체, 그라프트 공중합체, 블렌드, 혼합물 및/또는 부가물을 포함할 수 있는 것으로 추가로 이해되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 열거된 중합체가 본 발명에 따라 사용될 수 있는 중합체의 포괄적인 목록이 아니라 예시적인 목록을 나타낸다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 중합체 성분을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 합성 나노담체는 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-중합체 합성 나노담체는 비-중합체 성분의 응집체, 예컨대 금속 원자 (예를 들어, 금 원자)의 응집체이다.
본 발명에 따른 조성물은 제약상 허용되는 부형제, 예컨대 보존제, 완충제, 염수, 또는 포스페이트 완충 염수를 포함할 수 있다. 조성물은 유용한 투여 형태에 도달하기 위한 통상적인 제약 제작 및 배합 기술을 이용하여 만들 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 보존제와 함께 주사하기 위해 멸균 염수 용액 중에 현탁된다.
D. 조성물의 사용 및 제조 방법
바이러스 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 또는 본원에 달리 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,797,368 및 문헌 [Laughlin et al., Gene, 23, 65-73 (1983)]에 제시된 방법을 이용하여 구축 및/또는 정제할 수 있다.
예로서, 복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 높은 역가의 바이러스 벡터 스톡을 생성하기 위해 적절한 수준에서, 복제-결핍 아데노바이러스 벡터에 존재하지 않지만, 바이러스 전파를 위해 필요한 유전자 기능을 제공하는 상보성 세포주에서 생성될 수 있다. 이러한 상보성 세포주는 모든 아데노바이러스 기능 (예를 들어, 아데노바이러스 앰플리콘의 전파를 가능하게 하는 것)을 포함한, 초기 영역, 후기 영역, 바이러스 패키징 영역, 바이러스-연관 RNA 영역, 또는 그의 조합에 의해 코딩된 적어도 한 가지의 복제-필수 유전자 기능에 있어서의 결핍을 보완시켜 줄 수 있다. 상보성 세포주의 구축은 표준 분자 생물학 및 세포 배양 기술, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)]에 기재된 것을 포함한다.
아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 상보성 세포주는 HEK 293 세포 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72 (1977)]에 기재됨), PER.C6 세포 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 97/00326, 및 미국 특허 번호 5,994,128 및 6,033,908에 기재됨), 및 293-ORF6 세포 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 95/34671 및 문헌 [Brough et al., J. Virol., 71, 9206-9213 (1997)]에 기재됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 상보성 세포는 필요한 모든 아데노바이러스 유전자 기능을 보완하지 않을 것이다. 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스 벡터의 복제를 가능하게 하는 세포성 또는 아데노바이러스 게놈에 의해 코딩되지 않은 트랜스에서의 유전자 기능을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,965,358, 5,994,128, 6,033,908, 6,168,941, 6,329,200, 6,383,795, 6,440,728, 6,447,995, 및 6,475,757, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0034735 A1, 및 국제 특허 출원 WO 98/53087, WO 98/56937, WO 99/15686, WO 99/54441, WO 00/12765, WO 01/77304, 및 WO 02/29388 뿐만 아니라 본원에서 확인된 다른 참고문헌에 제시된 물질 및 방법을 이용하여 구축, 전파 및/또는 정제할 수 있다. 아데노바이러스 혈청형 35 벡터를 포함한, 비-그룹 C 아데노바이러스 벡터는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,837,511 및 5,849,561, 및 국제 특허 출원 WO 97/12986 및 WO 98/53087에 제시된 방법을 이용하여 생성할 수 있다.
바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 재조합 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 방법은 AAV 캡시드 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 및 트랜스진으로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 재조합 AAV 벡터를 AAV 캡시드 단백질 내로 패키징하는 것을 가능하게 하는데 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 혈청형의 역전된 말단 반복부 (ITR)를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터를 캡시드 내에 패키지하기 위해 숙주 세포에서 배양하고자 하는 성분은 이러한 숙주 세포에 트랜스로 제공될 수 있다. 대안적으로, 필요한 성분들 (예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열, 및/또는 헬퍼 기능) 중 임의의 하나 이상은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 상기 필요한 성분들 중 하나 이상을 함유하도록 조작한 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게, 상기 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에 상기 필요한 성분(들)을 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 필요한 성분(들)은 구성적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 바이러스 벡터를 생산하는데 필요한 재조합 바이러스 벡터, rep 서열, cap 서열, 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전 요소를 이용하여 패키징되는 숙주 세포에 전달할 수 있다. 선택된 유전 요소는 본원에 기재된 방법을 포함한, 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 다른 방법은 핵산 조작에 있어서의 기술자에게 공지되어 있고, 이는 유전 공학, 재조합 공학, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조한다. 유사하게, rAAV 비리온을 생성하는 방법은 널리 공지되어 있고, 적합한 방법의 선택은 본 발명에 대해 제한적이지 않다. 예를 들어, 문헌 [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 번호 5,478,745를 참조한다.
일부 실시양태에서, 재조합 AAV 전달 벡터는 삼중 형질감염 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,001,650, 미국 특허 번호 6,593,123, 뿐만 아니라 문헌 [X. Xiao et al., J. Virol. 72:2224-2232 (1998), 및 T. Matsushita et al., Gene Ther. 5(7): 938-945 (1998)]에 상세히 기재된 바와 같고, 삼중 형질감염 방법에 관한 그의 내용은 본원에 참조로 포함됨)을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV는 숙주 세포를 AAV 입자 내로 패키지될 재조합 AAV 전달 벡터 (트랜스진을 포함함), AAV 헬퍼 기능 벡터, 및 보조 기능 벡터로 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, AAV 헬퍼 기능 벡터는 생산적 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 트랜스로 기능하는 AAV 헬퍼 기능 서열 (rep 및 cap)을 코딩한다. 바람직하게, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출 가능한 야생형 AAV 비리온 (즉, 기능적 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하지 않으면서도 효율적인 AAV 벡터 생성을 뒷받침한다. 보조 기능 벡터는 AAV가 복제에 대해 의존적인 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포성 기능에 대한 뉴클레오티드 서열을 코딩할 수 있다. 보조 기능은 AAV 복제에 필요한 기능을 포함하며, 이는 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성, 및 AAV 캡시드 어셈블리에 관여한 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스-기반 보조 기능은 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (단순 포진 바이러스 유형-1 이외의 바이러스), 및 백시니아 바이러스 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
바이러스 벡터를 생산하는 다른 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 바이러스 벡터는 상업적으로 입수가능하다.
면역억제제에 커플링된 합성 나노담체와 관련하여, 성분을 합성 나노담체에 부착시키는 방법이 유용할 수 있다.
실시양태에서, 성분을, 예를 들어 합성 나노담체에 부착시키는 방법이 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 부착시키는 것은 공유 링커일 수 있다. 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역억제제는 알킨 기를 함유하는 면역억제제와 아지도 기와의 1,3-양극성 고리화첨가 반응에 의해 형성되거나 또는 아지도 기를 함유하는 면역억제제와 알킨과의 1,3-양극성 고리화첨가 반응에 의해 형성된 1,2,3-트리아졸 링커를 통해 외부 표면에 공유적으로 부착될 수 있다. 이러한 고리화첨가 반응은 바람직하게, Cu(II) 화합물을 촉매적 활성 Cu(I) 화합물로 환원시키는 환원제 및 적합한 Cu(I)-리간드와 함께 Cu(I) 촉매의 존재 하에 수행된다. 이러한 Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 고리화첨가 (CuAAC)는 클릭 반응으로서 지칭될 수도 있다.
추가적으로, 공유 커플링은 아미드 링커, 디술피드 링커, 티오에테르 링커, 히드라존 링커, 히드라지드 링커, 이민 또는 옥심 링커, 우레아 또는 티오우레아 링커, 아미딘 링커, 아민 링커, 및 술폰아미드 링커를 포함하는 공유 링커를 포함할 수 있다.
아미드 링커는 하나의 성분, 예컨대 면역억제제 상의 아민과 제2의 성분, 예컨대 나노담체의 카르복실산 기 사이의 아미드 결합을 통해 형성된다. 이러한 링커 내의 아미드 결합은 적합하게 보호된 아미노산과 활성화 카르복실산, 예컨대 N-히드록시숙신이미드-활성화된 에스테르의 통상적인 아미드 결합 형성 반응 중 임의의 것을 이용하여 제조될 수 있다.
디술피드 링커는, 예를 들어 R1-S-S-R2의 형태의 2개의 황 원자 사이의 디술피드 (S-S) 결합의 형성을 통해 제조된다. 디술피드 결합은 티올/메르캅탄 기 (-SH)를 함유하는 성분을 또 다른 활성화 티올 기로 티올 교환하거나, 또는 티올/메르캅탄 기를 함유하는 특정 성분을 활성화 티올 기를 함유하는 특정 성분으로 티올 교환함으로써 형성될 수 있다.
트리아졸 링커, 구체적으로 형태
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의 1,2,3-트리아졸 (여기서, R1 및 R2는 임의의 화학적 실체일 수 있음)은 제1 성분에 부착된 아지드와 제2 성분, 예컨대 면역억제제에 부착된 말단 알킨의 1,3-양극성 고리화첨가 반응에 의해 제조된다. 이러한 1,3-양극성 고리화첨가 반응은 1,2,3-트리아졸 관능기를 통해 상기 2개의 성분을 연결하는 촉매의 존재 또는 부재 하에, 바람직하게는 Cu(I)-촉매의 존재 하에 수행된다. 이러한 화학은 문헌 [Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002) 및 Meldal, et al., Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015]에 상세히 기재되어 있고, 종종 "클릭" 반응 또는 CuAAC로서 지칭된다.
티오에테르 링커는, 예를 들어 R1-S-R2의 형태의 황-탄소 (티오에테르) 결합의 형성에 의해 제조된다. 티오에테르는 하나의 성분 상의 티올/메르캅탄 (-SH) 기를 제2 성분 상의 알킬화 기, 예컨대 할라이드 또는 에폭시드로 알킬화시킴으로써 제조될 수 있다. 티오에테르 링커는 또한, 하나의 성분 상의 티올/메르캅탄 기를, 마이클 수용체로서 말레이미드 기 또는 비닐 술폰 기를 함유하는 제2 성분 상의 전자-결핍 알켄 기에 마이클 첨가함으로써 형성될 수 있다. 또 다른 방식으로, 티오에테르 링커는 하나의 성분 상의 티올/메르캅탄 기를 제2 성분 상의 알켄 기와 라디칼 티올-엔 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
히드라존 링커는 하나의 성분 상의 히드라지드 기를 제2 성분 상의 알데히드/케톤 기와 반응시킴으로써 제조된다.
히드라지드 링커는 하나의 성분 상의 히드라진 기를 제2 성분 상의 카르복실산 기와 반응시킴으로써 형성된다. 이러한 반응은 일반적으로, 카르복실산을 활성화 시약으로 활성화시키는 아미드 결합의 형성과 유사한 화학을 이용하여 수행된다.
이민 또는 옥심 링커는 하나의 성분 상의 아민 또는 N-알콕시아민 (또는 아미노옥시) 기를 제2 성분 상의 알데히드 또는 케톤 기와 반응시킴으로써 형성된다.
우레아 또는 티오우레아 링커는 하나의 성분 상의 아민 기를 제2 성분 상의 이소시아네이트 또는 티오이소시아네이트 기와 반응시킴으로써 제조된다.
아미딘 링커는 하나의 성분 상의 아민 기를 제2 성분 상의 이미도에스테르 기와 반응시킴으로써 제조된다.
아민 링커는 하나의 성분 상의 아민 기를 제2 성분 상의 알킬화 기, 예컨대 할라이드, 에폭시드, 또는 술포네이트 에스테르 기와 알킬화 반응시킴으로써 제조된다. 대안적으로, 아민 링커는 또한, 하나의 성분 상의 아민 기를, 적합한 환원 시약, 예컨대 소듐 시아노보로히드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 이용하여 제2 성분 상의 알데히드 또는 케톤 기로 환원성 아미노화함으로써 제조될 수 있다.
술폰아미드 링커는 하나의 성분 상의 아민 기를 제2 성분 상의 술포닐 할라이드 (예컨대 술포닐 클로라이드) 기와 반응시킴으로써 제조된다.
술폰 링커는 친핵체를 비닐 술폰에 마이클 첨가함으로써 제조된다. 비닐 술폰 또는 친핵체 중 하나는 나노담체의 표면 상에 있거나 또는 특정 성분에 부착될 수 있다.
이러한 성분은 또한, 비-공유 접합 방법을 통해 접합될 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 면역억제제는 정전기 흡착을 통해 양으로 하전된 성분과 접합될 수 있다. 금속 리간드를 함유하는 성분이 또한, 금속-리간드 착물을 통해 금속 착물과 접합될 수 있다.
실시양태에서, 성분은 합성 나노담체의 어셈블리에 앞서, 중합체, 예를 들어 폴리락트산-블록-폴리에틸렌 글리콜에 부착될 수 있거나 또는 합성 나노담체는 그의 표면 상의 반응성 또는 활성화될 수 있는 기와 함께 형성될 수 있다. 후자의 경우에, 성분은 합성 나노담체의 표면에 의해 제시되는 부착 화학과 적합성인 기를 이용하여 제조할 수 있다. 다른 실시양태에서, 펩티드 성분은 적합한 링커를 이용하여 VLP 또는 리포솜에 부착시킬 수 있다. 링커는 2개의 분자를 함께 커플링할 수 있는 화합물 또는 시약이다. 특정 실시양태에서, 링커는 문헌 [Hermanson 2008]에 기재된 바와 같은 동종이관능성 또는 이종이관능성 시약일 수 있다. 예를 들어, 표면 상에 카르복실기를 함유하는 VLP 또는 리포솜 합성 나노담체는 EDC의 존재 하에 동종이관능성 링커인 아디프산 디히드라지드 (ADH)로 처리하여, 이러한 ADH 링커를 갖는 상응하는 합성 나노담체를 형성할 수 있다. 이어서, 이로써 생성되는 ADH 연결된 합성 나노담체를, 나노담체 상의 ADH 링커의 다른 말단을 통해 산 기를 함유하는 펩티드 성분과 접합시켜 상응하는 VLP 또는 리포솜 펩티드 접합체를 생성한다.
실시양태에서, 중합체 쇄에 대해 말단인 아지드 또는 알킨 기를 함유하는 중합체가 제조된다. 이어서, 이러한 중합체를 사용하여, 복수 개의 알킨 또는 아지드 기가 합성 나노담체의 표면 위에 위치하는 방식으로 합성 나노담체를 제조한다. 대안적으로, 이러한 합성 나노담체는 또 다른 경로에 의해 제조한 다음, 연속해서 알킨 또는 아지드 기로 관능화할 수 있다. 성분은 알킨 기의 존재 하에 (중합체가 아지드를 함유하는 경우) 또는 아지드 기의 존재 하에 (중합체가 알킨을 함유하는 경우) 제조된다. 이어서, 상기 성분은, 이러한 성분을 1,4-이치환된 1,2,3-트리아졸 링커를 통해 입자에 공유 부착시켜 주는 촉매의 존재 또는 부재 하에 1,3-양극성 고리화첨가 반응을 통해 상기 나노담체와 반응될 수 있다.
성분이 소분자인 경우, 합성 나노담체의 어셈블리에 앞서, 상기 성분을 중합체에 부착시키는 것이 유리할 수 있다. 실시양태에서, 성분을 중합체에 부착시킨 다음 이러한 중합체 접합체를 합성 나노담체의 구축에 사용하기 보다는 오히려 이들 표면 기의 사용을 통해 상기 성분을 합성 나노담체에 부착시키기 위해 사용되는 표면 기를 갖는 합성 나노담체를 제조하는 것이 또한 유리할 수 있다.
이용가능한 접합 방법에 관한 상세한 설명에 대해서는, 문헌 [Hermanson G T "Bioconjugate Techniques", 2nd Edition Published by Academic Press, Inc., 2008]을 참조할 수 있다. 공유 부착 외에도, 상기 성분은 미리 형성된 합성 나노담체에 흡착시킴으로써 부착시킬 수 있거나 또는 합성 나노담체의 형성 동안 캡슐화함으로써 부착시킬 수 있다.
합성 나노담체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 합성 나노담체는 나노침전, 유체 채널을 이용한 유동 포커싱, 분무 건조, 단일 및 이중 에멀젼 용매 증발, 용매 추출, 상 분리, 밀링, 마이크로에멀젼 절차, 마이크로제작, 나노제작, 희생 층, 단순 및 복잡 코아세르베이션과 같은 방법, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 방법에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단분산 반도체, 전도성, 자기성, 유기 및 다른 나노물질에 대한 수성 및 유기 용매 합성이 기재되어 있다 (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; and Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). 추가의 방법이 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; and Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755]; 미국 특허 번호 5578325 및 6007845; 문헌 [P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)] 참조).
물질은 문헌 [C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)]을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 이용하여 바람직한 바와 같이 합성 나노담체 내로 캡슐화할 수 있다. 물질을 합성 나노담체 내로 캡슐화하기에 적합한 다른 방법을 사용할 수 있고, 이는 2003년 10월 14일자로 허여된 미국 특허 번호 6,632,671 (Unger)에 개시된 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 합성 나노담체는 나노침전 과정 또는 분무 건조에 의해 제조된다. 합성 나노담체를 제조하는데 사용된 조건은 목적하는 크기 또는 특성 (예를 들어, 소수성, 친수성, 외부 형태, "점착성", 형상 등)의 입자를 생성하기 위해 변경시킬 수 있다. 합성 나노담체의 제조 방법 및 사용된 조건 (예를 들어, 용매, 온도, 농도, 공기 유량 등)은 합성 나노담체에 부착될 물질 및/또는 중합체 매트릭스의 조성에 좌우될 수 있다.
상기 방법 중 임의의 것에 의해 제조된 합성 나노담체가 목적하는 범위를 벗어난 크기 범위를 갖는 경우, 합성 나노담체는, 예를 들어 체를 이용하여 사이징될 수 있다.
합성 나노담체의 요소들은, 예를 들어 하나 이상의 공유 결합에 의해 전체 합성 나노담체에 부착될 수 있거나, 또는 하나 이상의 링커를 통해 부착될 수 있다. 합성 나노담체를 관능화하는 추가의 방법은 공개된 미국 특허 출원 2006/0002852 (Saltzman et al.), 공개된 미국 특허 출원 2009/0028910 (DeSimone et al.), 또는 공개된 국제 특허 출원 WO/2008/127532 A1 (Murthy et al.)로부터 적합화될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 합성 나노담체는 비-공유 상호작용을 통해 성분들에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 비-공유 실시양태에서, 비-공유 부착은 전하 상호작용, 친화도 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착, 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, TT 스태킹 상호작용, 수소 결합 상호작용, 반 데르 발스 상호작용, 자기적 상호작용, 정전기적 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및/또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-공유 상호작용에 의해 매개된다. 이러한 부착은 합성 나노담체의 외부 표면 또는 내부 표면 상에 있도록 배열될 수 있다. 실시양태에서, 캡슐화 및/또는 흡수가 부착의 한 형태이다.
본원에 제공된 조성물은 무기 또는 유기 완충제 (예를 들어, 포스페이트, 카르보네이트, 아세테이트 또는 시트레이트의 나트륨 또는 칼륨 염) 및 pH 조정제 (예를 들어, 염산, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 시트레이트 또는 아세테이트의 염, 아미노산 및 그의 염), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 알파-토코페롤), 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 9-10 노닐 페놀, 소듐 데스옥시콜레이트), 용액 및/또는 냉동/동결 안정화제 (예를 들어, 수크로스, 락토스, 만니톨, 트레할로스), 삼투 조정제 (예를 들어, 염 또는 당), 항박테리아제 (예를 들어, 벤조산, 페놀, 겐타미신), 소포제 (예를 들어, 폴리디메틸실로존), 보존제 (예를 들어, 티메로살, 2-페녹시에탄올, EDTA), 중합체 안정화제 및 점도-조정제 (예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 폴록사머 488, 카르복시메틸셀룰로스) 및 공-용매 (예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 조성물은 유용한 투여 형태에 도달하기 위한 통상적인 제약 제작 및 배합 기술을 이용하여 만들 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 적합한 기술은 문헌 [Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; and Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone]에서 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 보존제와 함께 주사하기 위해 멸균 염수 용액 중에 현탁된다.
본 발명의 조성물은 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있고, 본 발명은 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있는 조성물로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 적절한 제작 방법을 선택하기 위해 연관된 특정한 모어어티의 특성에 주의를 기울여야 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 멸균 조건 하에 제작되거나 또는 최종적으로 멸균된다. 이는 이로써 생성되는 조성물이 멸균이면서 비-감염성이라는 것을 보장하므로, 비-멸균 조성물과 비교해서 안전성을 개선시킬 수 있다. 이것은, 특히 조성물을 투여받는 대상체가 면역 결함이 있고/거나, 감염으로 인해 고통받고 있고/거나 감염되기 쉬운 경우에, 중요한 안전 조치를 제공한다.
본 발명에 따른 투여는 피하, 정맥내, 근육내 및 복강내 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 경로에 의할 수 있다. 본원에 언급된 조성물은 통상적인 방법을 이용하여 투여하기 위해, 일부 실시양태에서 공투여하기 위해 제작 및 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효량, 예컨대 본원의 다른 곳에 기재된 유효량으로 투여될 수 있다. 투여 형태는 다양한 빈도로 투여될 수 있다. 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터의 존재 또는 부재 하의 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 반복 투여가 이루어진다.
본 발명의 측면은 본원에 제공된 바와 같은 투여 방법을 위한 프로토콜의 결정에 관한 것이다. 프로토콜은, 예컨대 제공된 투여 요법에 따른 적어도 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 및/또는 바이러스 벡터의 빈도, 투여량을 변경하고, 바람직하거나 바람직하지 않은 면역 반응 또는 트랜스진 발현을 평가함으로써 결정될 수 있다. 본 발명의 실시를 위한 바람직한 프로토콜은 바이러스 벡터 또는 그의 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 감소시키고/거나 트랜스진 발현을 촉진한다. 프로토콜은 예컨대 본원에 제공된 투여 요법 중 어느 하나에 따른, 적어도 투여 빈도 및 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 및/또는 바이러스 벡터의 용량을 포함한다. 본원에 제공된 방법 중 어느 하나는 프로토콜을 결정하는 단계를 포함할 수 있거나, 또는 투여하는 단계는 본원에 제공된 바와 같은 목적하는 결과 중 어느 하나 이상을 달성하기 위해 결정된 프로토콜에 따라 수행된다.
개시내용의 또 다른 측면은 키트에 관한 것이다. 제공된 키트 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 제공된 조성물 중 어느 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 조성물(들)은 본원에 제공된 바와 같은 어느 하나 이상의 용량을 제공하는 양으로 존재한다. 조성물(들)은 키트에서 1개의 용기 또는 1개 초과의 용기 내에 존재할 수 있다. 제공된 키트 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 용기는 바이알 또는 앰플이다. 제공된 키트 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물(들)은 각각 별개의 용기 또는 동일한 용기 내의 동결건조 형태이고, 이에 따라 이들은 후속 시점에 재구성될 수 있다. 제공된 키트 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 키트는 재구성, 혼합, 투여 등에 대한 지침서를 추가로 포함한다. 제공된 키트 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 지침서는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 대한 설명을 포함한다. 지침서는 임의의 적합한 형태로, 예를 들어, 인쇄 삽입물 또는 라벨로서 존재할 수 있다. 본원에 제공된 키트 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 키트는 대상체에게 생체내로 조성물(들)을 전달할 수 있는 1개 이상의 시린지 또는 다른 장치(들)를 추가로 포함한다.
실시예
실시예 1: 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체
물질
라파마이신을 TSZ CHEM (미국 매사추세츠주 01702 프레이밍햄 윌슨 스트리트 185; 제품 카탈로그 # R1017)으로부터 구입하였다. 76% 락티드 및 24% 글리콜리드 함량과 0.69 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA는 서모딕스 파마슈티칼스(SurModics Pharmaceuticals) (미국 앨라배마주 35211 버밍햄 톰 마틴 드라이브 756; 제품 코드 7525 DLG 7A)로부터 구입하였다. 대략 5,000 Da의 PEG 블록 및 대략 40,000 Da의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG 블록 공중합체는 서모딕스 파마슈티칼스로부터 구입하였다 (미국 앨라배마주 35211 버밍햄 톰 마틴 드라이브 756; 제품 코드 100 DL mPEG 5000 5CE). 폴리비닐 알콜 (85-89% 가수분해된 것)은 이엠디 케미칼스(EMD Chemicals)로부터 구입하였다 (제품 번호 1.41350.1001).
방법
용액을 다음과 같이 제조하였다:
용액 1: 메틸렌 클로라이드 중의 PLGA 75 mg/mL 및 PLA-PEG 25 mg/mL. 용액은 PLGA 및 PLA-PEG를 순수한 메틸렌 클로라이드 중에 용해시킴으로써 제조하였다.
용액 2: 메틸렌 클로라이드 중의 라파마이신 100 mg/mL. 용액은 라파마이신을 순수한 메틸렌 클로라이드 중에 용해시킴으로써 제조하였다.
용액 3: 100 mM pH 8 포스페이트 완충제 중의 폴리비닐 알콜 50 mg/mL.
수중유 에멀젼을 사용하여 나노담체를 제조하였다. O/W 에멀젼은 용액 1 (1 mL), 용액 2 (0.1 mL) 및 용액 3 (3 mL)을 작은 압력 튜브에서 합하고, 브랜슨 디지털 소니파이어 250을 이용하여 30% 진폭으로 60초 동안 초음파처리하여 제조하였다. O/W 에멀젼을, 70 mM pH 8 포스페이트 완충제 용액 (30 mL)을 함유하는 비커에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하여 메틸렌 클로라이드가 증발되도록 하고 나노담체가 형성되게 하였다. 나노담체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 75,000xg 및 4℃에서 35분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 펠릿을 포스페이트 완충 염수 중에 재현탁시킴으로써 나노담체의 부분을 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복하였고, 약 10 mg/mL의 최종 나노담체 분산액을 위해 펠릿을 포스페이트 완충 염수 중에 재현탁시켰다.
나노담체 크기를 동적 광 산란에 의해 결정하였다. 나노담체 중의 라파마이신의 양은 HPLC 분석에 의해 결정하였다. 현탁액 mL당 총 건조-나노담체 질량은 중량측정 방법에 의해 결정하였다.
Figure pat00002
실시예 2: GSK1059615를 포함하는 합성 나노담체
물질
GSK1059615를 메드켐 익스프레스(MedChem Express) (미국 뉴저지주 08852 스위트 102D 몬모스 정션 디어 파크 드라이브 11)로부터, 제품 코드 HY-12036으로 구입하였다. 1:1의 락티드:글리콜리드 비와 0.24 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA는 레이크쇼어 바이오머티리얼즈(Lakeshore Biomaterials) (미국 앨라배마주 35211 버밍햄 톰 마틴 드라이브 756)로부터, 제품 코드 5050 DLG 2.5A로 구입하였다. 대략 5,000 Da의 메틸 에테르 종결 PEG 블록 및 0.26 DL/g의 전체 고유 점도를 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체는 레이크쇼어 바이오머티리얼즈로부터 구입하였다 (미국 앨라배마주 35211 버밍햄 톰 마틴 드라이브 756; 제품 코드 100 DL mPEG 5000 5K-E). 셀그로(Cellgro) 포스페이트 완충 염수 1X pH 7.4 (PBS 1X)는 코닝(Corning) (미국 버지니아주 20109 마나사스 디스커버리 불러바드 9345)으로부터, 제품 코드 21-040-CV로 구입하였다.
방법
용액을 다음과 같이 제조하였다:
용액 1: PLGA (125 mg), 및 PLA-PEG-OMe (125 mg)를 10 mL의 아세톤 중에 용해시켰다. 용액 2: GSK1059615를 1 mL의 N-메틸-2-피롤리딘온 (NMP) 중에서 10 mg으로 제조하였다.
용액 1 (4 mL)과 용액 2 (0.25 mL)를 작은 유리 압력 튜브에서 합하고, 혼합물을, 20 mL의 초순수 물을 함유하는 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 교반 하에 적가하여 나노담체를 제조하였다. 플라스크를 회전 증발 장치 상에 탑재하고, 아세톤을 감압 하에 제거하였다. 나노담체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 75,600 rcf 및 4℃에서 50분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 펠릿을 PBS 1X 중에 재현탁시킴으로써 나노담체의 부분을 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복하였고, 펠릿을 PBS 1X 중에 재현탁시켜, 중합체 기준으로 10 mg/mL의 공칭 농도를 갖는 나노담체 현탁액을 달성하였다. 이어서, 세척된 나노담체 용액을, 폴(Pall)로부터의 부품 번호 4656의 1.2μm PES 막 시린지 필터를 이용하여 여과하였다. 동일한 나노담체 용액을 상기와 같이 제조하였고, 여과 단계 후에 첫 번째 것과 함께 풀링하였다. 균질 현탁액을 -20℃에서 동결 저장하였다.
나노담체 크기를 동적 광 산란에 의해 결정하였다. 나노담체 중의 GSK1059615의 양은 351nm에서의 UV 흡수에 의해 결정하였다. 현탁액 mL당 총 건조-나노담체 질량은 중량측정 방법에 의해 결정하였다.
Figure pat00003
실시예 3: 생체내 초기 AAV-코딩된 트랜스진 발현은, AAV를 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체와 사전혼합한 경우에, 영향을 받지 않는다
표준 수컷 마우스 AAV 형질도입 모델에서, AAV를, 이 경우에는 캡슐화된 라파마이신인 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체 (SVP[Rapa])와 함께 사전혼합한 경우에, 생체내 초기 AAV-코딩된 트랜스진 발현은 영향을 받지 않았고; SVP[Rapa]를 AAV 직후에 투여한 경우에, 트랜스진 발현은 보다 낮았고; 이러한 효과는 IgG 항체 형성에 비의존적인 것으로 발견되었다.
구체적으로, 6-12마리의 수컷 C57BL/6 마우스 군에 AAV-SEAP를 SVP-캡슐화된 라파마이신 (본 실시예에서 SVP[Rapa])의 존재 또는 부재 하에 주사하였고 (i.v., 꼬리 정맥), 이를 AAV와 혼합한 다음 투여하거나, 또는 AAV-SEAP 직후 (15분 간격 내; '혼합되지 않음'으로 라벨링됨)에 주사하였다. 표시된 시점 (제19일)에 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 이어서 혈청 내 SEAP 수준을 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) (미국 매사추세츠주 월섬)의 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 혈청 샘플 및 양성 대조군을 희석 완충제 중에 희석하고, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시키고, 96-웰 포맷으로 플레이팅하고, 검정 완충제 (5분) 및 이어서 기질 (20분)을 첨가하고, 발광측정기 (477 nm) 상에서 플레이트를 판독하였다.
개별적으로, AAV에 대한 IgG 항체를 ELISA 검정에서 측정하였다: 96-웰 플레이트를 AAV로 밤새 코팅하고, 세척하고, 다음날 차단시키고, 이어서 희석된 혈청 샘플 (1:40)을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션하고; 이어서 플레이트를 세척하고, 염소 항-마우스 IgG 특이적-HRP를 첨가하고, 또 다른 인큐베이션 및 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 570 nm을 참조 파장으로 하여 450 nm의 흡광도를 측정함으로써 AAV에 대한 IgG 항체의 존재를 검출하였다 (최고 광학 밀도, OD로 제시된 신호의 강도는, 샘플 중 IgG 항체의 양과 정비례함).
혼합된 SVP[Rapa]는 이 시점에 SEAP 발현에 영향을 미치지 않았지만, AAV-SEAP에 이어 SVP[Rapa]가 순차적으로 주사된 마우스에서 SEAP 발현은 하향조절되었다 (도 1a). 이 시점에 SVP[Rapa]로 처리된 모든 마우스가 AAV에 대한 IgG 항체의 하향조절을 입증하였기 때문에 (도 1b), 이러한 효과는 AAV에 대한 IgG 항체의 유도에 비의존적이었다.
실시예 4: 비-혼합된 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체는 투여 순서와 관계 없이 AAV-구동 트랜스진 발현의 초기 하향조절을 발생시킨다.
본 실험에서 비-혼합된 SVP[Rapa]는 투여 순서와 관계 없이 AAV-구동 트랜스진 발현의 초기 하향조절을 발생시킨다는 것을 발견하였다. 트랜스진 발현 수준은 SVP[Rapa]와 조합된 AAV를 제공받은 마우스에서 시간에 따라 증가하였고; 이러한 효과는 SVP[Rapa]에 의한 IgG 항체 하향조절과 관련이 없는 것으로 발견되었다.
구체적으로, 5-6마리의 수컷 C57BL/6 마우스 군에 AAV-SEAP를 SVP[Rapa]의 존재 또는 부재 하에 i.v. 주사하였고, 이를 AAV와 혼합하거나, 또는 개별적으로 AAV-SEAP 전 또는 후에 15-분 또는 1-시간 간격으로 주사하였다. 표시된 시점 (d19 및 d75)에 마우스 혈청에서 SEAP 활성 및 AAV에 대한 IgG 항체를 측정하였다.
AAV-SEAP 및 SVP[Rapa]의 개별 투여는 제19일에 SEAP의 보다 낮은 발현으로 이어졌다 (도 2a). 1-시간 간격으로 처리된 마우스는 15-분 간격으로 주사된 것보다 다소 더 낮은 발현을 나타내었다. 혼합된 AAV-SEAP 및 SVP[Rapa]로 투여된 마우스는 AAV-SEAP 단독으로 주사된 것과 동일한 수준의 SEAP 발현을 가졌다 (도 2a). 명백하게, SEAP 발현 수준은 SVP[Rapa]를 제공받은 모든 마우스에서 시간에 따라 성장하였고, 제75일째에 혼합된 AAV-SEAP 및 SVP[Rapa]를 제공받은 그러한 마우스는 단지 AAV-SEAP 만을 제공받은 것보다 SEAP를 더 높은 수준으로 발현한 반면에, 단지 AAV-SEAP 만을 제공받은 것과 유사한 SEAP 수준을 생산하는 비-혼합된 AAV-SEAP 및 SVP[Rapa]를 제공받은 마우스 군도 존재하였다 (도 2b). 이러한 현상은 IgG 항체 하향조절에 비의존적이었고, SVP[Rapa]를 제공받은 모든 군에서 관찰되었다 (도 2c).
실시예 5: 혼합된 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체 및 AAV-SEAP는 IgG 항체 반응과 관계 없이 트랜스진 발현의 즉시 상승으로 이어진다
본 실험에서, 암컷 마우스에의 SVP[Rapa] 및 AAV-SEAP의 투여는 IgG 항체 반응과 관계 없이 트랜스진 발현의 즉시 상승으로 이어진다는 것을 발견하였다.
실시예 3 및 4로부터, 비-혼합 SVP[Rapa] 및 AAV는 단기간 하등 효과를 가질 수 있는 것으로 보인다. 그러나, 그러한 현상은 AAV에 의한 효율적인 형질도입에 의해 초기 시점 (예컨대 제19일)에 차폐될 수 있고, 이는 수컷 C57BL/6 마우스에서 통상적으로 관찰된다. 개별적으로, C57BL/6 암컷 마우스 군에 2종의 상이한 용량의 AAV-SEAP를 SVP[Rapa]의 존재 또는 부재 하에 i.v. 접종하였고, SEAP 활성 및 AAV IgG 항체를 혈청에서 제12일 및 제19일에 측정하였다. 상승된 수준의 SEAP 발현이 AAV-SEAP 및 SVP[Rapa]의 혼합물을 제공받은 모든 마우스에서 AAV 접종 직후에 평균 2-배의 개선으로 발생한다는 것이 발견되었다 (도 3a). 명백하게, 이는 매우 초기 시점 예컨대 제12일에 관찰되었고, 이때 최소 IgG 항체 유도가 관찰되었다 (도 3b). 또한, 군들 사이의 SEAP 발현의 상대 수준은 주어진 시간 간격 내 (주사 후 12일 및 19일 사이)에서 동일하게 유지된 반면에, SVP[Rapa]-비처리군에서의 IgG 항체 수준은 동일한 시간에 걸쳐 성장하였다 (도 3b).
이들 결과는, 트랜스진-운반 AAV 및 SVP[Rapa]의 투여가 생체내에서 보다 높은 수준의 트랜스진 발현으로 이어지고, 이는 특히 AAV 형질도입이 덜 적용가능한 시스템에서 두드러지며, 이러한 현상은 SVP[Rapa]에 의한 AAV IgG 항체 하향조절에 비의존적이라는 것을 확인시켜준다.
실시예 6: AAV 및 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체의 시험관내 혼합은 그의 15분 내 완전한 흡착으로 이어진다
구체적으로, PBS 1 mL 중 AAV의 2.5 x 1011개 VG 또는 SVP[Rapa] 입자를 석영 큐벳에 첨가하고, DLS에 의해 개별적으로 측정하거나 (도 4a) 또는 혼합 후 (AAV 대 SVP[Rapa] 입자 비 100:1) 즉시 또는 15-분 인큐베이션 후에 측정하였다 (도 4b).
SVP[Rapa]에의 AAV의 혼합 직후에 (도 4b) 개별적으로 측정된 AAV 및 SVP[Rapa]의 크기에 상응하는 (도 4a; 상응하여, 25 및 150 nm) 2개의 개별 피크가 관찰되었다. AAV에의 SVP[Rapa]의 혼합 15분 후 유일한 단일 피크가 관찰되었고 (도 4b), 이는 SVP[Rapa]에의 AAV의 완전한 흡착을 나타내는 나노담체의 크기에 상응하였다.
실시예 7: 초기 AAV IgM 유도는 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 투여에 의해 하향조절된다
5마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에 1 x1010개의 바이러스 게놈 (VG) AAV-SEAP를 SVP-캡슐화된 라파마이신 (본 실시예에서 SVP[Rapa]) 또는 대조군 중합체-단독 (본 실시예에서 SVP[공])의 존재 또는 부재 하에 주사하였고 (i.v., 꼬리 정맥), 이를 AAV와 혼합한 다음 투여하거나, 또는 AAV-SEAP 직전 (15분 간격 내; '혼합되지 않음'으로 라벨링됨)에 주사하였다. 표시된 시점 (a에서 제5일 및 제10일 및 b에서 제6일, 제12일, 제19일 및 제89일)에 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 개별적으로, AAV에 대한 IgM 항체를 ELISA 검정에 의해 측정하였다: 96-웰 플레이트를 AAV로 밤새 코팅하고, 세척하고, 다음날 차단시키고, 이어서 희석된 혈청 샘플 (1:40)을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션하고; 이어서 플레이트를 세척하고, 염소 항-마우스 IgM 특이적-HRP를 첨가하고, 또 다른 인큐베이션 및 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 570 nm을 참조 파장으로 하여 450 nm의 흡광도를 측정함으로써 AAV에 대한 IgM 항체의 존재를 검출하였다 (최고 광학 밀도, OD로 제시된 신호의 강도는, 샘플 중 IgM 항체의 양과 정비례함).
혼합 및 비-혼합된 AAV와 투여된 SVP[Rapa] 둘 다는 AAV 주사 후 제5일 (도 5a) 및 제7일 (도 5b)에 IgM의 초기 유도를 정상 혈청 기준선 (파선)에 근접한 수준으로 강력하게 하향조절하였다. 이러한 효과는 제10일에도 여전히 관찰되었지만 (도 5a), 제12일째 및 그 이후는 덜 현저하였고 (도 5b), 이 시점에 비처리된 마우스에서의 IgM의 수준은 점감되었다. 대조군 SVP[공] 나노담체로 처리된 군에서는 어떠한 IgM 하향조절 활성도 관찰되지 않았다.
실시예 8: AAV 캡시드에 대한 초기 IgM 수준은 AAV 투여 후 트랜스진 발현 수준과 역상관된다
4-5마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 8개 군에 AAV-SEAP (1x1010개 VG)를 SVP[Rapa]의 존재 또는 부재 하에 또는 SVP[공]의 존재 하에 i.v. 주사하였고, 이를 AAV와 혼합하거나 또는 AAV-SEAP 직전에 개별적으로 주사하였다. 표시된 시점 (d7 내지 d89)에 SEAP 활성 및 AAV IgM 수준을 측정하였다 (도 6). 제92일에 동일한 양의 AAV-SEAP로 모든 동물을 부스팅하고, 프라이밍 시와 동일한 처리에 적용하였다. 혈청 내 SEAP 수준을 써모피셔 사이언티픽 (미국 매사추세츠주 월섬)으로부터의 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 혈청 샘플 및 양성 대조군을 희석 완충제 중에 희석하고, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시키고, 96-웰 포맷으로 플레이팅하고, 검정 완충제 (5분) 및 이어서 기질 (20분)을 첨가하고, 발광측정기 (477 nm) 상에서 플레이트를 판독하였다.
혈청 중 SEAP의 전반적 수준이 일반적으로 낮은 때인 AAV 투여 후 제7일에서의 d7의 IgM 수준은 극도로 강력하고, 혈청 SEAP 수준과 통계적으로 유의한 역상관관계를 나타내었다 (p 값은 그래프 상에 표시됨). 이러한 상관관계는 초기 AAV 및 SVP[Rapa] 투여 후 거의 3개월 동안 유지되었다. 또한, 제92일의 AAV-SEAP 부스팅 후, 초기에 낮은 수준의 AAV IgM을 가졌던 그러한 동물은 보다 유익한 방식으로, 즉 트랜스진 발현을 보다 높은 수준으로 상승시킴으로써 부스팅에 반응하였고, 반면에 초기에 높은 IgM 수준을 가졌던 그러한 동물은 보다 약한 방식으로, 즉 트랜스진 발현의 보다 낮은 상승으로 반응하였다. 그 결과, 초기 (제7일) AAV IgM 수준 및 부스팅-후 혈청 SEAP 수준 사이의 역상관관계는 부스팅 후 (d99 및 d104 또는 부스팅 후 제7일 및 제12일)에 더 강해졌다.
실시예 9: 합성 나노담체 및 바이러스 벡터 전 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체의 투여 (예측)
대상체 군에 SVP[Rapa]를 i.v. 주사하고, 30일 내에 대상체에 AAV-SEAP (1 x1010개 VG) 및 SVP[Rapa]를 i.v. 주사하였고, 이를 혼합하거나 또는 혼합하지 않되 동시에 투여하였다. 표시된 시점에 SEAP 활성 및 AAV IgM 수준을 측정하였다.
실시예 10: 라파마이신에 커플링된 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 추가의 투여 (예측)
실시예 9의 대상체의 제2 투여의 30일 내에, 대상체에 다시 SVP[Rapa]를 i.v. 주사하였다. 또 다른 30일 내에, 대상체에 AAV-SEAP (1 x1010개 VG) 및 SVP[Rapa]를 i.v. 주사하였고, 이를 혼합하거나 또는 혼합하지 않되 동시에 투여하였다. 표시된 시점에 SEAP 활성 및 AAV IgM 수준을 다시 측정하였다.
실시예 11: IgG 억제
5마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에 1 x1010개의 바이러스 게놈 (VG) AAV-SEAP를 단독으로 또는 SVP-캡슐화된 라파마이신 (본 실시예에서 SVP[Rapa]), 또는 대조군 중합체-단독 (본 실시예에서 SVP[공])과 함께 주사하였고 (i.v., 꼬리 정맥), 전자는 AAV와 혼합한 다음 투여하거나, 또는 AAV-SEAP 전 (15분 내; '혼합되지 않음'으로 라벨링됨)에 주사하였다. 표시된 시점에 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다.
AAV에 대한 IgG 항체를 ELISA 검정으로 측정하였다: 96-웰 플레이트를 AAV로 밤새 코팅하고, 세척하고, 다음날 차단시키고, 이어서 희석된 혈청 샘플 (1:40)을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션하고; 이어서 플레이트를 세척하고, 염소 항-마우스 IgG 특이적-HRP를 첨가하고, 또 다른 인큐베이션 및 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 570 nm을 참조 파장으로 하여 450 nm의 흡광도를 측정함으로써 AAV에 대한 IgG 항체의 존재를 검출하였다 (최고 광학 밀도, OD로 제시된 신호의 강도는, 샘플 중 IgG 항체의 양과 정비례함). SEAP 수준을 써모피셔 사이언티픽 (미국 매사추세츠주 월섬)으로부터의 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 혈청 샘플 및 양성 대조군을 희석 완충제 중에 희석하고, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 실온으로 냉각시키고, 96-웰 포맷으로 플레이팅하고, 검정 완충제 (5분) 및 이어서 기질 (20분)을 첨가하고, 발광측정기 (477 nm) 상에서 플레이트를 판독하였다.
혼합 및 비-혼합된 SVP[Rapa] 둘 다는 AAV에 대한 IgG의 초기 유도를 억제하였다 (도 7). 이러한 효과는 SVP[Rapa]가 AAV와 혼합되었는지 또는 AAV 주사 전에 개별적으로 투여되었는지에 관계 없이 강력하였다.
AAV-혼합 및 비-혼합된 SVP[Rapa] 둘 다는 혈청에서의 SEAP 발현의 초기 상승 및 지속적 상승을 촉진하였다 (도 8). SVP[Rapa]-처리군 둘 다에서의 SEAP 발현은 비처리군에서의 것보다 2.5-3.0배만큼 더 높았고, 또한 대조군 SVP[공]으로 처리된 군에서의 것보다도 더 높았다. 이러한 차이는 제7일에 관찰되었고, 적어도 7주 동안 지속되었다.
실시예 12: IgM 및 IgG 억제
5마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에 1 x1010개의 바이러스 게놈 (VG) AAV를 단독으로 또는 SVP-캡슐화된 라파마이신 (본 실시예에서 SVP[Rapa])과 함께 주사하였고 (i.v., 꼬리 정맥), 이를 AAV와 혼합한 다음 투여하거나 (제0일), AAV 1일 전에 개별적으로 주사하거나 (제-1일), 또는 AAV 1일 전에 개별적으로 주사하고 또한 혼합하여 주사하였다 (제-1일, 제0일). 표시된 시점에 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. AAV에 대한 IgM 및 IgG 수준은 상기 기재된 바와 같이 결정하였다.
AAV와 혼합된 SVP[Rapa]는 AAV IgM (도 9) 및 IgG (도 10) 둘 다의 억제를 야기하였고, 한편 SVP[Rapa]를 AAV와 개별적으로 1일 더 일찍 투여한 경우 유사한 효과가 관찰되었다. 명백하게, 이들 2개의 군에서 AAV IgM (제13일째, 도 9) 및 IgG (제20일째, 도 10) 둘 다는 보다 늦은 시점에 상승되기 시작하였지만, 그의 수준은 비처리된 마우스에서보다 더 낮게 유지되었다. 동시에, AAV 주사 1일 전에 SVP[Rapa]로 처리되고 또한 혼합되어 처리된 (제-1일, 제0일) 마우스는 제5일에 가장 낮은 AAV IgM 수준을 나타내었고 (제13일째 한계 상승, 도 9) 제20일까지 어떠한 AAV IgG 발생도 없었다 (도 10). 따라서, AAV IgM 및 IgG 항체의 생산은 제-1일 및 제0일에 SVP[Rapa] 처리를 제공받은 마우스에서 보다 강력하게 억제되었다.
실시예 13: 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체
면역억제제를 포함하는 합성 나노담체, 예컨대 라파마이신은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는 미국 공개 번호 US 2016/0128986 A1 및 미국 공개 번호 US 2016/0128987 A1의 방법 중 어느 하나에 의해 생산되고, 기재된 이러한 생산 방법 및 생성된 합성 나노담체는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 하나에서, 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체는 이러한 포함된 합성 나노담체이다. 라파마이신을 포함하는 합성 나노담체를 이들 포함된 방법과 적어도 유사한 방법을 사용하여 생산하고, 하기 실시예에서 사용하였다.
실시예 14: 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 분할 용량
합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신의 용량을 2개의 부분으로 분할하고, 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 용량의 제2 절반과 함께 AAV 벡터를 공동-주사하기 전에 제1 절반 용량을 투여하는 것은, 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신의 동일한 누적 용량을 AAV 벡터와 함께 공동-주사하는 것에 비해, 트랜스진 발현의 관점에서 (도 11a) 및 또한 항바이러스 IgG에 대한 그의 억제 효과를 위해 (도 11b) 유익한 것으로 발견되었다.
5마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에, 제0일 및 제92일에, AAV-SEAP의 1x1010개의 바이러스 게놈 (VG)을 단독으로 (AAV-SEAP) 또는 라파마이신-포함 합성 나노담체와 함께 (AAV-SEAP + 라파마이신-포함 합성 나노담체, 100 μg, d0, 92) 또는 AAV 주사 2일 전에 전달되고 AAV 주사와 함께 전달되는 라파마이신-포함 합성 나노담체와 함께 (50 μg 라파마이신) (AAV-SEAP + 라파마이신-포함 합성 나노담체, d-2, 0, 90, 92) 주사하였다 (정맥내, i.v., 꼬리 정맥). 도 11a에 표시된 시점 (제7일, 제19일, 제75일, 제99일, 제104일 및 제111일)에, 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다.
혈청 내 SEAP 수준을 써모피셔 사이언티픽 (미국 매사추세츠주 월섬)으로부터의 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 혈청 샘플 및 양성 대조군을 희석 완충제 중에 희석하고, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시키고, 96-웰 포맷으로 플레이팅하고, 검정 완충제와 함께 인큐베이션한 (5분) 다음 기질을 첨가하고 (20분), 발광측정기 (477 nm)를 사용하여 플레이트를 판독하였다.
개별적으로, AAV에 대한 IgG 항체를 ELISA를 사용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트를 AAV로 밤새 코팅한 다음, 세척하고, 다음날 차단시켰다. 희석된 혈청 샘플 (1:40)을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고, 염소 항-마우스 IgG 특이적-HRP를 첨가하였다. 또 다른 인큐베이션 및 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 570 nm을 참조 파장으로 하여 450 nm의 흡광도를 측정함으로써 AAV에 대한 IgG 항체의 존재를 검출하였다 (최고 광학 밀도, OD로 제시된 신호의 강도는, 도 11b의 샘플 중 IgG 항체의 양과 정비례함).
AAV-SEAP와 혼합된 라파마이신-포함 합성 나노담체 (50 μg)의 공투여 2일 전 라파마이신-포함 합성 나노담체 (50 μg)의 투여는 SEAP 발현의 즉시 상승으로 이어졌고 (도 11a), 이는 특정 시점에서 SVP의 부재 하에서의 것보다 거의 2배 더 높았다. 제19일 (d19)의 비처리된 마우스에서의 것 (100%)과 비교하여 그래프 위에 각각의 군의 각 시점에 대한 상대 발현이 제시된다. 동시에, 동일한 총 100 μg의 용량 (AAV와 혼합되어 공투여된 라파마이신-포함 합성 나노담체)은 트랜스진 발현에 대해 유익한 효과를 갖지 않았다. 유사한 효과는 제92일의 부스팅 후에 관찰되었다 (화살표로 표시됨). 명백하게, 라파마이신-포함 합성 나노담체의 둘 다의 투여 요법은 프라이밍 및 부스팅 후 AAV에 대한 IgG 반응의 형성을 동등하게 억제하였다 (도 11b).
실시예 15: 적어도 2개의 부분으로의 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 투여
합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 용량을 2개의 부분으로 전달하는 것 (용량의 제2 절반과 함께 AAV를 공동-주사하기 2일 전 제1 부분을 투여하는 것)은 안정적으로 상승된 트랜스진 발현으로 이어진다는 것을 발견하였다 (도 12).
9-10마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에, 제0일에, AAV-SEAP의 1x1010개의 VG를 단독으로 (AAV-SEAP) 또는 AAV 주사 2일 전에 전달되고 AAV 주사와 함께 전달되는 50 μg의 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신과 함께 (AAV-SEAP + 라파마이신-포함 합성 나노담체, d-2, 0) 주사하였다 (i.v., 꼬리 정맥). 표시된 시점 (제7일, 제12일, 제19일, 제33일, 제48일, 및 제77일)에, 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 혈청 내 SEAP 수준을 실시예 14에 기재된 바와 같이 측정하였다.
AAV-SEAP와 혼합된 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신의 또 다른 50 μg의 공투여 2일 전, 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg의 투여는 SEAP 발현의 즉시 상승으로 이어졌고, 이는 일반적으로 합성 나노담체의 부재 하에서의 것보다 2배 더 높았다 (그리고 AAV 투여 7일 후인 초기에 3배 더 높음). 이러한 차이는 안정하였고, 모든 연속 시점에서 유지되었다 (d19의 비처리된 마우스에서의 것을 100%로 한 것과 비교하여 그래프 위에 각각의 군의 각 시점에 대한 상대 발현이 제시됨).
실시예 16: 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 추가의 용량
AAV-면역 마우스 내로의 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신과의 AAV 벡터 공동-주사 전, 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신의 추가의 용량의 전달은 상승된 트랜스진 발현으로 이어지는 것으로 발견되었다.
합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신의 50 μg의 사전-투여가 AAV 프라이밍 후 트랜스진 발현에 유익한 것으로 밝혀졌기 때문에, 이것이 또한 AAV에 사전 노출된 동물에서도 유익한지 여부를 검사하였다. 5마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에, 제0일에, AAV-RFP의 1x1010개의 VG를 단독으로 또는 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg과 혼합하여 주사한 다음 (i.v., 꼬리 정맥), 동일한 용량의 AAV-SEAP 단독으로, 또는 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신과, 또는 합성 나노담체에 포함되고, AAV-SEAP와 혼합되고, 또한 AAV-SEAP 3일 전에 사전-주사된 경우의 라파마이신과 혼합하여 부스팅하였다. 표시된 시점에, 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 혈청 내 SEAP 수준 및 AAV에 대한 IgG를 실시예 14에 기재된 바와 같이 측정하였다.
라파마이신-포함 합성 나노담체 (AAV-RFP/AAV-SEAP)로 처리되지 않은 동물은 어떠한 의미있는 SEAP 트랜스진 발현도 나타내지 않았다 (도 13a). AAV-RFP 프라이밍 시에만 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg의 투여 (AAV-RFP+라파마이신-포함 합성 나노담체/AAV-SEAP)는 낮은 수준의 트랜스진 발현을 나타내었다 (일반적으로, AAV-RFP로 사전-주사되지 않은 나이브 마우스의 것으로부터 10-13%). 트랜스진 발현의 추가의 상승은 프라이밍 및 부스팅 둘 다에서의 라파마이신-포함 합성 나노담체 투여에 의해 달성되었고 (AAV-RFP/AAV-SEAP; 라파마이신-포함 합성 나노담체, d0, 86) 이는 때때로 20%를 초과하였고, 15-24% 구간 내에서 유지되었다. 대조적으로, AAV 부스팅 3일 전 추가의 라파마이신-포함 합성 나노담체 투여는 SEAP 발현의 훨씬 더 높은 상승으로 이어졌고, 이는 때때로 나이브 마우스의 것으로부터 50%를 초과하였고 34-52% 범위 내에서 유지되었다 (매 시점에 비-프라이밍된 마우스에서의 것을 100%로 한 것과 비교하여 그래프 위에 각각의 군의 각 시점에 대한 상대 발현이 제시됨).
이러한 트랜스진 발현 순위는 AAV IgG의 존재와 밀접하게 역으로 상응하였고, 라파마이신-포함 합성 나노담체로 비처리된 마우스는 즉시 IgG 생산을 나타내었고, 이는 이어서 부스팅 (도 13b에서 화살표로 표시됨)에 의해 추가로 상승되었다. 프라이밍 시에만 라파마이신-포함 합성 나노담체로 처리된 마우스에서는 부스팅 후 바로 AAV IgG가 발생한 반면에, 프라이밍 및 부스팅 시 둘 다에 처리된 것은 부스팅-후 항체 발생이 수주만큼 지연되었음을 나타내었다. 명백하게, AAV 부스팅 전에 라파마이신-포함 합성 나노담체로 추가적으로 처리된 마우스는 연구 기간 동안 대부분 항체-음성으로 유지되었고, 유일한 단일 마우스만이 부스팅 7주 후에 검출가능한 IgG 항체를 나타내었다 (도 13b).
실시예 17: 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 추가의 용량
낮은 기존 수준의 AAV IgG를 갖는 (및 초기 프라이밍 용량에서 라파마이신-포함 합성 나노담체로 처리되지 않은) 마우스에의 AAV 벡터 및 라파마이신-포함 합성 나노담체 공동-주사 전 라파마이신-포함 합성 나노담체의 추가의 용량의 전달은 트랜스진 발현을 사후-부스팅시키는데 필수적이라는 것을 발견하였다.
합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신의 추가의 50 μg의 사전-투여가 AAV에 사전 노출되었을 뿐만 아니라 초기 프라이밍 시에 라파마이신-포함 합성 나노담체로 처리된 동물에서 AAV 부스팅 후 트랜스진 발현에 유익한 것으로 밝혀졌기 때문에, 라파마이신-포함 합성 나노담체 공투여 없이 AAV에 의해 면역화된 AAV-사전-노출된 동물에서 유사한 이익을 발견할 수 있는지 여부를 검사하였다. 5-7마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에, 제0일에, AAV-RFP의 2x109개의 VG를 주사 (i.v., 꼬리 정맥)한 다음, 낮은 수준의 AAV IgG (프라이밍-후 제75일의 최고 OD ≤ 0.3)를 갖는 그러한 마우스를 선택하고, 제92일에 AAV-SEAP의 1x1010개의 VG로 단독으로, 또는 라파마이신-포함 합성 나노담체, 또는 AAV-SEAP와 혼합되고 또한 AAV-SEAP 2일 전에 사전-주사된 라파마이신-포함 합성 나노담체와 혼합하여 부스팅하였다. 표시된 시점에, 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 혈청 내 SEAP 수준 및 AAV에 대한 IgG를 실시예 14에 기재된 바와 같이 측정하였다.
라파마이신-포함 합성 나노담체로 처리되지 않았거나 또는 부스팅 시 단일 라파마이신-포함 합성 나노담체 투여를 제공받은 동물은 (AAV-RFP/SEAP; 라파마이신-포함 합성 나노담체 ≤ 1) 매우 적은 SEAP 트랜스진 발현을 나타내었다 (도 14a). 트랜스진 발현은 통상적으로 5-9% 구간 내였고 (나이브 마우스에서 100%의 발현과 비교), 이는 의미있는 발현 수준을 입증한 5마리의 마우스 중 단일 마우스로 인한 것이었다 (도 14b의 좌측 칼럼 참조). 비교상, 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg을 AAV 부스팅 2일 전 및 또한 부스팅 시 (AAV-RFP/SEAP; 라파마이신-포함 합성 나노담체 = 2) 투여한 군으로부터의 마우스는 훨씬 더 현저한 SEAP 발현을 나타내었고, 이는 일반적으로, 나이브 마우스의 것과 비교하여 34-40% 범위 내에 머물렀다 (상대 발현은 도 14a에서 각각의 군에서 각각의 시점에 대해 표시됨). 명백하게, 이러한 군의 7마리의 마우스 중 5마리가 검출가능한 SEAP 발현을 나타내었고 (도 14b의 우측 칼럼 참조), 실험군 사이의 SEAP 발현의 통계적으로 유의하게 상이한 수준으로 이어졌다 (도 14b).
AAV-면역 마우스에서의 이러한 부스팅-후 트랜스진 발현 활성은, 라파마이신-포함 합성 나노담체에 의한 2회 미만의 처리를 제공받은 마우스에서의 AAV IgG의 상승 및 AAV 부스팅 전 및 부스팅 시 2회의 라파마이신-포함 합성 나노담체 처리를 제공받은 마우스에서의 이러한 반응의 억제에 의해 입증된 바와 같이, AAV에 대한 면역기억 반응의 발생과 밀접하게 역으로 상응하였다 (도 14c, 부스팅은 화살표로 표시됨). 2 용량 미만의 라파마이신-포함 합성 나노담체로 처리된 마우스는 부스팅 후 7일만큼 초기에 5마리의 마우스 중 1마리 마우스를 제외한 모두가 강력하게 AAV IgG-양성이 되어 강력한 AAV IgG 부스터 반응을 나타내었다 (도 14c). 동시에, 라파마이신-포함 합성 나노담체로 2회 처리된 마우스는 훨씬 더 낮은 AAV 면역기억 항체 반응을 나타내었고, 제92일 부스팅 후 7일만큼 초기에 7마리의 마우스 중 오직 2마리의 마우스만이 강력하게 AAV IgG-양성이 되어 통계적으로 상이하게 되었다 (도 14c에서 d99). 명백하게, 이러한 군에서의 항체 수준은 제92일에 처음으로 AAV에 노출된 나이브 마우스 (도 14a 및 14c에서의 참조 대조군)에서의 것보다 일관되게 더 낮았다. 놀랍지 않게, 정확하게 이들 마우스 (2회 미만의 라파마이신-포함 합성 나노담체 처리를 제공받은 군에서 1마리 및 2회의 라파마이신-포함 합성 나노담체 처리를 제공받은 군에서 5마리)는 2개의 실험 군에서 AAV IgG 및 혈청 SEAP 수준 사이에 통계적으로 유의한 역상관관계를 발생시킨, 의미있는 SEAP 발현을 일관되게 나타낸 것이었다 (도 14d).
실시예 18: 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체 및 바이러스 벡터의 투여
AAV 벡터 및 라파마이신-포함 합성 나노담체 공동-주사 후 투여된 라파마이신-포함 합성 나노담체 용량은 트랜스진 발현 및 AAV 항체 억제에 추가의 이익을 제공하는 것으로 발견되었다.
라파마이신-포함 합성 나노담체 및 AAV의 공투여가 AAV-구동 트랜스진 발현에 즉각적 이익을 제공하고 AAV에 대한 항체를 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 추가의 라파마이신-포함 합성 나노담체 주사가 추가의 이익을 제공할 것인지 여부를 검사하였다. 5마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에, 제0일 및 제88일에, AAV-SEAP의 1x1010개의 VG를 단독으로 또는 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg과 혼합하여 주사하고 (i.v., 꼬리 정맥), 하나의 군은 이어서 프라이밍 및 부스팅 둘 다 후에 2회의 추가의 격주 라파마이신-포함 합성 나노담체 주사로 처리하였다 (d14, 28, 102 및 116). 표시된 시점에, 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 혈청 내 SEAP 수준 및 AAV에 대한 IgG를 실시예 14에 기재된 바와 같이 측정하였다.
이전에 제시된 바와 같이, AAV-SEAP와 혼합된, 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg의 투여는 SEAP 발현의 즉각적 상승으로 이어졌고 (도 15a), 이는 특정 시점에 합성 나노담체가 없는 군보다 4배 더 높았다. 그러나, 추가의 라파마이신-포함 합성 나노담체 처리는 훨씬 더 현저한 이익을 제공하였고, 생성된 발현 수준은 비처리 마우스에서보다 6-7-배 더 높았다. 심지어 추가의 상승이 제88일 부스팅 후에 관찰되었다 (화살표로 표시됨; 각각의 군에서 부스팅-전 d75 SEAP 수준과 비교하여 각각의 부스팅-후 시점에 대한 상대 발현이 제시됨). 부스팅 시 라파마이신-포함 합성 나노담체 투여는 보통의 추가의 이익을 제공하여 생성된 트랜스진 발현이 비처리된 마우스와 비교하여 5-배 초과에서 안정화되었지만, 추가의 라파마이신-포함 합성 나노담체 처리의 이익은 제108일에 8-배 격차까지 계속해서 상승하였다. 이는 추가의 라파마이신-포함 합성 나노담체가 투여된 마우스에서의 보다 현저한 AAV IgG 억제와 상응하였고, 한편 AAV와만 혼합된 라파마이신-포함 합성 나노담체로 처리된 마우스에서 IgG 반응 억제는, 특히 부스팅 후에, 현저하였지만 불완전하였다 (도 15b).
실시예 19: 면역억제제를 포함하는 합성 나노담체의 추가의 용량
추가의 라파마이신-포함 합성 나노담체는 장기 AAV 항체 억제를 위한 최고의 잠재력을 제공하는 것으로 발견되었다.
AAV와 라파마이신-포함 합성 나노담체 공투여 및 그의 추가의 적용은 AAV에 대한 항체를 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 이러한 억제는 항상 100% 수준에 도달하지 못하였다. 따라서, 프라이밍 시의 추가의 라파마이신-포함 합성 나노담체 주사 및 라파마이신-포함 합성 나노담체의 후속 투여를 조합하는 것이 조합된 상승작용적 이익을 제공할 것인지 여부를 검사하였다. 6-9마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군에, 제0일 및 제83일에, AAV-SEAP의 1x1010개의 VG를 단독으로 또는 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg과 혼합하여 주사하고 (i.v., 꼬리 정맥), 하나의 군은 추가적으로 프라이밍 2일 전 및 부스팅 시 (d-2 및 d81)에 라파마이신-포함 합성 나노담체로 처리하고, 또 다른 군은 프라이밍 및 부스팅 둘 다 후에 2회의 추가의 격주 라파마이신-포함 합성 나노담체 주사로 처리하고 (d14, 28, 97 및 116), 마지막 군은 그의 조합으로 처리하였다 (d-2, 12, 28, 81, 97 및 116). AAV에 대한 IgG를 실시예 14에 기재된 바와 같이 측정하였다.
전에 제시된 바와 같이, 사전-면역화 라파마이신-포함 합성 나노담체 처리와 조합된, AAV-SEAP와 혼합된, 합성 나노담체에 포함된 경우의 라파마이신 50 μg의 투여는 (gr. 2; d-2, 0, 81, 83), 제90일 (부스팅 직후)에 9마리의 마우스 중 오직 2마리 만이 검출가능한 IgG 수준을 나타내어 (최고 OD에 의해 결정된 바와 같음), 부스팅-전 전환 없이 지대한 AAV IgG 억제로 이어졌다. 9마리 중 오직 3마리만이 (및 3마리 중 오직 1마리만이, 강력하게) 제116일 (부스팅 33일 후)에 IgG-양성이었다. 본 연구에서, 라파마이신-포함 합성 나노담체에 의한 후속 (d14 및 d28) 처리는 효율적인 부스팅-전 투여였다 (전환 없음). 그러나, 여러 마우스가 부스팅-후 전환되기 시작하였고 (9마리 중 5마리; 5마리 중 4마리는, 강력하게), 제116일째에 양성이 되었다. 따라서, 라파마이신-포함 합성 나노담체 투여 요법 둘 다의 조합은, 제116일 (부스팅 33일 후)까지 어떠한 전환도 관찰되지 않았으므로, 가장 효과적이었다 (도 16).
실시예 20: AAV-구동 트랜스진 발현
표준 암컷 마우스 AAV 형질도입 모델에서, SVP[Rapa] 및 AAV의 공투여의 이익이 존재하며, 이는 생체내에서 보다 높은 트랜스진 발현을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 효과는 추가의 SVP[Rapa] 투여에 의해 추가로 증대된다. 본 실시예에서, 프라이밍 시 및 부스팅 시 AAV와의 단일 SVP[Rapa] 공투여는 트랜스진 발현을 용량-의존성 방식으로 개선시키고, 이러한 효과는, 적어도 부분적으로, AAV 항체 발생과 역상관된다는 것이 입증되었다. 또한, AAV-구동 트랜스진 발현을 강력하게 상승시킬 수 있는 높은 용량의 SVP[Rapa]를 3개의 부분으로 균등하게 분할하고, 이 중 오직 1개만을 AAV와 공투여하고 다른 2개는 AAV 주사 전 및 후에 개별적으로 투여한 경우에, 트랜스진 발현 및 AAV 항체 발생의 SVP[Rapa]-매개된 억제에 대한 SVP[Rapa]의 유익한 효과는 손상되지 않았다.
구체적으로, 10마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 4개의 군에 AAV8-SEAP의 1x1010개의 VG를 SVP[Rapa]의 부재 또는 존재 하에 주사하였다 (정맥내로 (i.v.), 꼬리 정맥). SVP[Rapa]를 하기 용량으로 사용하였다: 단일 50 μg 용량 (AAV와 혼합되어 공투여), 단일 150 μg 용량 (AAV와 혼합되어 공투여), 및 3개의 50 μg 주사로 분할된 150 μg 용량 (1개는 AAV와 혼합되어 공투여되고, 2개는 AAV 주사 2일 전 및 AAV 주사 2일 후에 개별적으로 투여됨).
표시된 시점 (제7일, 제12일, 제19일, 제47일 및 제75일)에 마우스에서 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 분석시까지 -20 ± 5℃에서 저장하였다. 이어서, AAV에 대한 IgG 항체를 ELISA를 사용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트를 AAV로 밤새 코팅하고, 세척하고, 다음날 차단시키고, 이어서 희석된 혈청 샘플 (1:40)을 플레이트에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 염소 항-마우스 IgG 특이적-HRP를 첨가하였다. 플레이트를 다시 인큐베이션하고 세척한 다음, TMB 기질을 첨가하고 570 nm을 참조 파장으로 하여 450 nm의 흡광도에서 신호를 측정함으로써 AAV에 대한 IgG 항체의 존재를 검출하였다. 최고 광학 밀도, OD로 제시된 신호의 강도는, 샘플 중 IgG 항체의 양과 정비례한다.
개별적으로, 혈청 내 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 수준을 써모피셔 사이언티픽 (미국 매사추세츠주 월섬)으로부터의 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 혈청 샘플 및 양성 대조군을 희석 완충제 중에 희석하고, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시키고, 96-웰 포맷으로 플레이팅하고, 이어서 검정 완충제 (5분) 및 이어서 기질 (20분)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 발광측정기 상에서 477 nm에서 플레이트를 판독하였다.
초기 (프라이밍-후) AAV IgG 및 SEAP 검출 및 분석 시, 마우스를 휴식시킨 다음 제117일에 다시 채혈하고, 제125일에 프라이밍 시와 동일한 AAV 및 SVP[Rapa] 용량을 사용하여 AAV-SEAP로 부스팅하였고, 즉 처음 군에는 SVP[Rapa]를 제공하지 않고, 이후 군에 하기를 제공하였다: 부스팅 시 SVP[Rapa] 50 μg, 부스팅 시 SVP[Rapa] 150 μg, 및 부스팅 2일 전, 부스팅 시 (AAV와 혼합하여 공투여함), 및 부스팅 2일 후 SVP[Rapa] 50 μg을 3회. 이어서 마우스에서 제132일 및 제138일 (부스팅 7일 후 및 13일 후)에 채혈하고, SEAP 혈청 수준을 상기 명시된 바와 같이 결정하였다.
SVP[Rapa]로 처리된 모든 군은 비처리된 마우스에서의 것과 비교하여 프라이밍 직후에 증가된 SEAP 수준을 나타내었고 (도 17a, gr. 1 vs. gr. 2-4), 이들 차이는 통계적으로 유의하였고 (**** - p<0.0001) 수개월 지속되었다. 대부분의 초기 시점에, SVP[Rapa] 150 μg으로 처리된 군 (단일 또는 분할 용량으로서; gr. 3 및 4)에서의 SEAP 수준은 보다 낮은, 50 μg 용량으로 처리된 군 (gr. 2)에서의 것보다 더 높았지만, 결국 (d75-117) 이들 수준은 모두 동등해졌다. 어느 정도, 이는 SVP[Rapa] 150 μg으로 처리된 군의 마우스에서의 AAV IgG 발생의 초기 역학과 상관되었고, 제75일을 포함하여 그때까지 어떠한 IgG 전환도 나타내지 않은 반면에 (도 17b, gr. 3 및 4), 보다 낮은, 50 μg 용량으로 처리된 군에서의 일부 마우스 (도 17b, gr. 2)는 제19일에 검출가능한 항체를 입증하였고, 10마리 중 4마리 (40%)는 제75일에 전환되었다 (도 17b). 명백하게, SVP[Rapa] 없이 AAV가 주사된 모든 마우스는 신속하게 AAV IgG-양성이 되었다 (도 17b, gr. 1).
제125일 부스팅 (도 17a에 화살표로 표시됨) 후, SVP[Rapa]-처리군과 비처리군 사이의 차이는 훨씬 더 현저해졌다 (도 17a, 제132일 및 제138일). 명백하게, 부스팅 직후 (d132) SVP[Rapa]로 처리되지 않은 마우스에서 어떠한 SEAP 상승도 존재하지 않았지만 (d117의 부스팅-전 발현에 대한 부스팅-후 SEAP 발현의 비를 도 17a에 상부 선으로 제시함), 모든 SVP[Rapa]-처리군은 즉각적 상승을 나타내었다 (도 17a, gr. 2-4, d132). 흥미롭게도, 비처리군 및 낮은 50 μg 용량의 SVP[Rapa]로 처리된 군에서의 SEAP 수준은 제138일까지 유사한 방식으로 진행하였고, 그의 상대 발현 (도 17a에 하부 선으로 제시됨, 비처리된 gr. 1에서 숫자 '100'으로 할당된 수준)은 동일하게 유지되었다 (50 μg-처리된 군은 일관되게 ~3.5-배 더 높은 SEAP를 가짐). 동시에, 보다 높은 (150 μg) 용량의 SVP[Rapa]로 처리된 마우스의 둘 다의 군에서의 SEAP 수준은 제132일부터 제138일까지 추가로 상승된 트랜스진 발현을 가졌고, 즉 비처리된 마우스에서의 것보다 ~4-배 더 높은 수준에서 ~4.5-배 더 높은 수준이 되었고, 한 예에서 심지어 보다 낮은 (50 μg) 용량의 SVP[Rapa]로 처리된 마우스의 것과 통계적으로 상이하게 되었다 (도 17a, gr. 2 vs. gr. 4; 제138일; p<0.05).
따라서, AAV-구동 트랜스진 발현은 프라이밍 및 부스팅 둘 다에서의 혼합된 SVP[Rapa]의 공투여에 의해 용량-의존성 방식으로 상승되는 것으로 발견되었다. 이러한 효과는, 완전하지는 않지만, AAV에 대한 항체의 억제와 역으로 상관되었지만, AAV와 혼합된 단일 용량으로서, 또는 일부는 AAV와 혼합되고 일부는 개별적으로 투여되는 분할 용량으로서 전달되는 SVP[Rapa] 용량에는 의존하지 않았다.

Claims (15)

  1. 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, (i) 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체 및/또는 (ii) 바이러스 벡터를 포함하는 키트이며, 여기서 상기 방법은
    상기 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체 및 상기 바이러스 벡터를 상기 대상체에게 공투여하는 단계이며, 여기서 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체 및 바이러스 벡터는 혼합되는 것인 단계, 및
    바이러스 벡터 없이 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체의 적어도 1회의 사전-용량 및/또는 적어도 1회의 사후-용량을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것인, 키트.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 1회의 사전-용량 및 적어도 1회의 사후-용량이 대상체에게 투여되고, 임의로 여기서 적어도 2회의 사전-용량이 대상체에게 투여되고/되거나 적어도 2회의 사후-용량이 대상체에게 투여되는 것인 키트.
  3. 제1항에 있어서, 공투여하는 단계가 대상체에서 반복되는 것인 키트.
  4. 제3항에 있어서, 바이러스 벡터 없이 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체의 적어도 1회의 사전-용량 및/또는 적어도 1회의 사후-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여되고, 임의로 여기서 (a) 적어도 1회의 사전-용량 및 적어도 1회의 사후-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여되고/되거나; (b) 적어도 2회의 사전-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여되고/되거나; (c) 적어도 2회의 사후-용량이 각각의 반복되는 공투여 단계와 함께 대상체에게 투여되는 것인 키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1개월 내에 이루어지고, 임의로 여기서 (a) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 2주 내에 이루어지거나; (b) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1주 내에 이루어지거나; (c) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 3일 내에 이루어지거나; (d) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 2일 내에 이루어지거나; (e) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1일 내에 이루어지거나; (f) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 12시간 내에 이루어지거나; (g) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 6시간 내에 이루어지거나; (h) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1시간 내에 이루어지거나; (i) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 30분 내에 이루어지거나; 또는 (j) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 15분 내에 이루어지는 것인 키트.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량이 공투여 단계의 3일 내에 투여되거나; (b) 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량이 공투여 단계의 2일 내에 투여되거나; 또는 (c) 각각의 사후-용량이 공투여 단계 후 격주로 투여되는 것인 키트.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 각각의 사전-용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양이 각각의 공투여 단계의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양과 동일하고/하거나; (b) 각각의 사후-용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양이 각각의 공투여 단계의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양과 동일하고/하거나; (c) 각각의 사전-용량, 사후-용량 및/또는 공투여 단계가 정맥내 투여에 의한 것인 키트.
  8. 제1항에 있어서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및 사전-용량 및/또는 사후-용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 모두의 양은, 합성 나노담체에 커플링된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 사전-용량 또는 사후-용량 없이, 바이러스 벡터와 함께 공투여된 경우에, 제2 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 감소시키거나 바이러스 벡터의 트랜스진 발현을 증가시키는 합성 나노담체에 포함된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양과 동등한 것인, 키트.
  9. 제8항에 있어서, 사전-용량 또는 사후-용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양이, 합성 나노담체에 커플링된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 사전-용량 또는 사후-용량 없이, 바이러스 벡터와 함께 공투여된 경우에, 제2 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 감소시키거나 바이러스 벡터의 트랜스진 발현을 증가시키는 합성 나노담체에 포함된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 용량의 양의 절반 이하이고, 임의로 여기서 (i) 사전-용량 또는 사후-용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양이, 합성 나노담체에 커플링된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 사전-용량 또는 사후-용량 없이, 바이러스 벡터와 함께 공투여된 경우에, 제2 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 감소시키거나 바이러스 벡터의 트랜스진 발현을 증가시키는 합성 나노담체에 포함된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 용량의 양의 절반이고/이거나; (ii) 사전-용량 및 사후-용량이 제1 대상체에게 투여되고/되거나; (iii) 사전-용량 및 사후-용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양이 동일하고/하거나; (iv) 합성 나노담체에 포함된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 용량의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양이 사전-용량 또는 사후-용량의 양과 동일하고/하거나; (v) 적어도 2회의 사전-용량이 제1 대상체에게 투여되고/되거나; (vi) 적어도 2회의 사후-용량이 제1 대상체에게 투여되고/되거나; (vii) 투여하는 단계 및 공투여하는 단계가 반복되는 것인 키트.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1개월 내에 이루어지는 것인 키트.
  11. 제10항에 있어서, (a) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 2주 내에 이루어지거나; (b) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1주 내에 이루어지거나; (c) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 3일 내에 이루어지거나; (d) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 2일 내에 이루어지거나; (e) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1일 내에 이루어지거나; (f) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 12시간 내에 이루어지거나; (g) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 6시간 내에 이루어지거나; (h) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 1시간 내에 이루어지거나; (i) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 30분 내에 이루어지거나; (j) 사전-용량(들) 및/또는 사후-용량(들)의 투여가, 각각 공투여 전 또는 후 15분 내에 이루어지는 것인 키트.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서, 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량이 공투여 단계의 3일 내에 투여되고/되거나, 각각의 사전-용량 및/또는 사후-용량이 공투여 단계의 2일 내에 투여되는 것인 키트.
  13. 제8항 또는 제9항에 있어서, 각각의 사후-용량이 공투여 단계 후 격주로 투여되고, 임의로 여기서 각각의 사전-용량, 사후-용량 및/또는 공투여 단계가 정맥내 투여에 의한 것인 키트.
  14. 제1항 내지 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 바이러스 벡터가 1개 이상의 발현 제어 서열을 포함하고, 임의로 여기서 1개 이상의 발현 제어 서열이 간-특이적 프로모터, 임의로 구성적 프로모터를 포함하고/하거나; (b) 방법이 1회 이상의 시점에 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 IgM 반응을 평가하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 IgM 반응을 평가하는 시점 중 적어도 1회가 공투여 후이고/이거나; (c) 바이러스 벡터 및 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체가 각각의 공투여를 위해 혼합되고/되거나; (d) 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터이고/이거나; (e) 바이러스 벡터가 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11 아데노-연관 바이러스 벡터로부터 선택되고/되거나; (f) 라파마이신 또는 라파마이신 유사체가 합성 나노담체에 커플링되어 있고, 임의로 여기서 라파마이신 또는 라파마이신 유사체가 합성 나노담체 내에 캡슐화되어 있고/있거나; (g) 공투여 및/또는 사전-용량 및/또는 사후-용량의 합성 나노담체가 지질 나노입자, 중합체 나노입자, 금속성 나노입자, 계면활성제-기반 에멀젼, 덴드리머, 버키볼, 나노와이어, 바이러스-유사 입자 또는 펩티드 또는 단백질 입자를 포함하고, 임의로 여기서 합성 나노담체가 중합체 나노입자를 포함하고, 임의로 여기서 중합체 나노입자가 폴리에스테르, 폴리에테르에 부착된 폴리에스테르, 폴리에스테르 및 폴리에테르에 부착된 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리카르보네이트, 폴리아세탈, 폴리케탈, 폴리사카라이드, 폴리에틸옥사졸린 또는 폴리에틸렌이민을 포함하고, 임의로 여기서 중합체 나노입자가 폴리에스테르 또는 폴리에테르에 부착된 폴리에스테르를 포함하고, 임의로 여기서 (i) 상기 폴리에스테르가 임의로 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 폴리카프로락톤을 포함하고/하거나 (ii) 폴리에테르가 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하고/하거나; (h) 합성 나노담체의 집단의 동적 광 산란을 사용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균이 110nm 초과, 150nm 초과, 200nm 초과, 250nm 초과, 5μm 미만, 4μm 미만, 3μm 미만, 2μm 미만, 1μm 미만, 750nm 미만, 500nm 미만, 450nm 미만, 400nm 미만, 350nm 미만, 또는 300nm 미만의 직경이고/이거나; (i) 합성 나노담체에 포함된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 로드가, 합성 나노담체 전반에 걸쳐 평균, 0.1% 내지 50% (중량/중량), 0.1% 내지 25%, 1% 내지 25%, 또는 2% 내지 25%이고/이거나; (j) 합성 나노담체의 집단의 종횡비가 1:1, 1:1.2, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 또는 1:10 초과인 키트.
  15. (i) 각각 제1항 내지 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 1회 이상의 사전-용량 또는 1회 이상의 사후-용량, 및 (ii) 바이러스 벡터와의 공투여를 위한 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체의 용량을 포함하는 키트이며, 임의로 여기서 키트는
    (a) 바이러스 벡터의 용량을 추가로 포함하고/하거나;
    (b) 1회 이상의 사전-용량 및 1회 이상의 사후-용량을 포함하고/하거나;
    (c) 사용에 대한 지침서를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 사용에 대한 지침서는 제1항 내지 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 것에 대한 지침서를 포함하고/하거나;
    (d) 바이러스 벡터와 함께 투여하기 위한 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체가 제1항 내지 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 것이고/이거나;
    (e) 바이러스 벡터가 제1항 내지 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 것인, 키트.
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