PL206267B1 - Zmutowana cząsteczka CTLA4, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, układ wektorowy gospodarza, komórka gospodarza, sposób wytwarzania zmutowanej cząsteczki CTLA4, kompozycja farmaceutyczna, sposób regulacji interakcji komórki T z komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86, zastosowania rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmutowana cząsteczka CTLA4, cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą taką cząsteczkę, wektor zawierający taką sekwencję, układ wektorowy gospodarza, komórka gospodarza, sposób wytwarzania zmutowanej cząsteczki CTLA4, kompozycja farmaceutyczna zawierająca taką zmutowaną cząsteczkę CTLA4, sposób regulacji interakcji komórki T z komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86, zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 oraz zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 i liganda reaktywnego z IL-4.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, które są zmutowane z dzikiego typu CTLA4, aby utrzymać zdolność do wiązania CD80 i/lub CD86.

Tło wynalazku

Interakcje wewnątrzkomórkowe niespecyficzne wobec antygenu między limfocytami T i komórkami prezentującymi antygen (APC) generują sygnały kostymulatorowe dla komórek T, które generują odpowiedzi komórek T na antygen (Jenkins i Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361-367). Sygnały kostymulatorowe determinują wielkość odpowiedzi komórki T na antygen oraz, czy ta odpowiedź aktywuje czy inaktywuje późniejsze odpowiedzi na antygen (Mueller i inni, (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:445-480).

Aktywacja komórek T przy braku kostymulacji powoduje nieudaną lub anergiczną odpowiedź komórek T (Schwartz, R.H. (1992) Cell 71:10-65-1068). Jeden kluczowy sygnał kostymulatorowy zapewnia interakcja receptora powierzchniowego komórki T CD28 z pokrewną cząsteczką B7 na komórkach prezentujących antygen (np. znanych także jako B7-1 i B7-2 oraz odpowiednio CD80 i CD86) (P.Linsley i J.Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11:191-212).

Cząsteczka znana obecnie jako CD80 (B7-1), była początkowo opisywana jako antygen aktywacyjny związany z ludzką komórką B (Yokochi, T. i inni (1981) J. Immunol. 128:823-827; Freeman, G.J. i inni (1989) J. Immunol. 143:2714-2722), i później identyfikowana jako receptor przeciwstawny dla pokrewnych cząsteczek komórki T CD28 oraz CTLA4 (Linsley, P., i inni (1990) Proc. Natl. Acad: Sci. USA 87:5031-5035; Linsley, P.S. i inni (1991a) J. Exp. Med. 173:721-730; Linsley, P.S. i inni (1991b) J. Exp. Med. 174:561-570).

Później zidentyfikowano inny receptor przeciwstawny dla CTLA4 na komórkach prezentujących antygen (Azuma, N. i inni (1993) Nature 366:76-79; Freeman (1993a) Science 262:909-911; Freeman, G.J. i inni (1993b) J. Exp. Med. 178:2185-2192; Hathcock, K.L.S., i inni (1994) J. Exp. Med. 180:631640; Lenschow, D.J. i inni, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11054-11058; Ravi-Wolf, Z., i inni (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11182-11186; Wu, Y. i inni (1993) J. Exp. Med. 178:178 9-17 93). Cząsteczka ta, znana obecnie jako CD86 (Caux, C, i inni (1994) J. Exp. Med. 180:1841-1848), lecz zwana także B7-0 (Azuma i inni, (1993), jak wyżej) lub B7-2 (Freeman i inni, (1993a), jak wyżej), dzieli około 25% identyczności sekwencji z CD80 w jej regionie zewnątrzkomórkowym (Azuma i inni, (1993), jak wyżej; Freeman i inni, (1993a), jak wyżej, (1993b), jak wyżej). Komórki transfekowane CD86 wywołują odpowiedzi komórki T zależne od CD28 (Azuma i inni, (1993), jak wyżej; Freeman i inni, (1993a), (1993b), jak wyż ej).

Porównania ekspresji CD80 i CD86 były przedmiotem kilku badań (Azuma i inni (1993), jak wyżej; Hathcock i inni, (1994) jak wyżej; Larsen, C.P., i inni (1994) J. Immunol. 152:5208-5219; Stack, R.M., i inni, (1994) J. Immunol. 152:5723-5733). Aktualne dane pokazują, że ekspresja CD80 i CD86 jest regulowana w różny sposób, i sugerują, że ekspresja CD86 ma tendencję do poprzedzania ekspresji CD80 podczas odpowiedzi odpornościowej.

Skonstruowano rozpuszczalne formy CD28 i CTLA4 przez fuzję podobnych do domen zmiennych (v) domen zewnątrzkomórkowych CD28 i CTLA4 ze stałymi domenami immunoglobuliny (Ig), otrzymując CD28lg i CTLA4Ig. CTLA4Ig wiąże zarówno komórki dodatnie pod względem CD80 jak i dodatnie pod wzglę dem CD86 silniej niż CD28Ig (Linsley, P. i inni (1994) Immunity 1:793-80). Wiele odpowiedzi odpornościowych zależnych od komórek T jest blokowanych przez CTLA4Ig zarówno in vitro jak i in vivo. (Linsley, i inni, (1991b), jak wyżej; Linsley, P.S. i inni, (1992a) Science 257:792795; Linsley, P. S. i inni, (1992b) J. Exp. Med. 176:1595-1604; Lenschow, DJ. i inni (1992), Science, 257: 789-792: Tan, P. i inni, (1992) J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, LA., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105).

PL 206 267 B1

Peach i inni, (J. Exp. Med. (1994) 180:2049-2058) zidentyfikowali regiony w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4 istotne dla silnego wiązania z CD80. Konkretnie, zidentyfikowano ugrupowanie heksapeptydowe (MYPPPY) w regionie podobnym do regionu 3 determinującego dopasowanie (CDR3), jako w pełni konserwowane u wszystkich członków rodziny CD28 i CTLA4. Mutageneza z wyszukiwaniem alaniny przez motyw MYPPPY w CTLA4 i przy wybranych resztach w CD28lg zmniejszyła lub zniosła wiązanie z CD80.

Skonstruowano także cząsteczki chimeryczne wymieniające regiony homologiczne CTLA4 i CD28. Czą steczki HS4, HS4-A i HS4-B skonstruowano przez przeszczepienie regionów podobnych do CDR3 CTLA4, które także obejmowały część karboksy-terminalną, wydłużoną tak, aby zawierała pewne niekonserwatywne reszty aminokwasowe, do CD28Ig. Te mutanty homologowe wykazywały wyższą zachłanność wiązania z CD80 niż CD28lg.

W innej grupie chimerycznych mutantów homologowych przeszczepiono region podobny do CDR1 CTLA4, który nie jest konserwatywny w CD28 i przewiduje się, że przestrzennie przylega do regionu podobnego do CDR3, do HS4 i HS4-A. Te cząsteczki chimerycznego mutanta homologowego (oznaczonego HS7 i HS8) prezentowały nawet większą zachłanność wiązania dla CD80 niż CD28Ig.

Wytworzono także chimeryczne cząsteczki mutanta homologowego przez przeszczepienie HS7 i HS8 do regionu podobnego do CDR2 CTLA4, lecz ta kombinacja nie poprawił a dodatkowo zachł anności wiązania dla CD80. Tak więc, ugrupowanie MYPPPY CTLA4 i CD28 określono jako krytyczne dla wiązania z CD80, lecz pewne niekonserwatywne reszty aminokwasowe w regionach podobnych do CDR3 i CDR1 CTLA4 były także odpowiedzialne za zwiększenie zachłanności wiązania CTLA4 z CD80.

Okazało się, że CTLA4Ig skutecznie blokuje kostymulację komórek T związaną z CD80, lecz nie blokuje tak skutecznie odpowiedzi związanej z CD86. Skonstruowano rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4, zwłaszcza te, które posiadają większą zdolność wiązania z CD86 niż dzikiego typu CTLA4, jako prawdopodobnie lepiej blokujące aktywację aktywowanych komórek specyficznych wobec antygenu niż CTLA4Ig.

Istnieje zapotrzebowanie na ulepszone cząsteczki CTLA4 w celu zapewnienia lepszych kompozycji farmaceutycznych do supresji immunologicznej i leczenia nowotworów niż znane wcześniej rozpuszczalne formy CTLA4.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmutowana cząsteczka CTLA4, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 a kończącą się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na Fig. 7, lub rozpoczynającą się alaniną w pozycji -1 a kończąc ą się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na Fig. 7.

Korzystnie zawiera ona dodatkowo sekwencję aminokwasową, która zmienia rozpuszczalność, powinowactwo lub wartościowość zmutowanej cząsteczki CTLA4.

Korzystniej sekwencja aminokwasowa, która zmienia rozpuszczalność lub powinowactwo obejmuje ugrupowanie immunoglobuliny.

Jeszcze korzystniej ugrupowanie immunoglobuliny zawiera region stały immunoglobuliny lub jego część.

Najkorzystniej region stały immunoglobuliny zawiera zawias, regiony CH2 i CH3 cząsteczki immunoglobuliny.

Korzystniej region stały immunoglouliny lub jego część stanowi region stały immunoglobuliny człowieka lub małpy.

Korzystniej ugrupowanie immunoglobuliny zawiera jedną lub więcej mutacji do zmniejszania funkcji efektorowej.

Korzystniej ugrupowanie immunoglobuliny zawiera zawias a dowolna lub wszystkie reszty cysteiny w obrębie zawiasu są podstawione seryną.

Jeszcze korzystniej cysteina w pozycji +130 jest podstawiona seryną, cysteina w pozycji +136 jest podstawiona seryną, cysteina w pozycji +139 jest F podstawiona seryną, jak pokazano na Fig. 7.

Korzystniej region stały ludzkiej immunoglobuliny jest zmutowany tak, że zawiera cysteinę w pozycji +130 podstawioną seryną, cysteinę w pozycji +136 podstawioną seryną , cysteinę w pozycji +139 podstawioną seryną, i prolinę w pozycji +148 podstawioną seryną, jak pokazano na Fig. 7.

Korzystniej ugrupowanie immunoglobuliny zawiera sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się kwasem glutaminowym w pozycji +126 a kończącą się lizyną w pozycji +357, jak pokazano na Fig. 7.

PL 206 267 B1

Korzystniej zawiera ponadto resztę aminokwasu łącznikowego zlokalizowaną pomiędzy sekwencją aminokwasową kończącą się kwasem asparaginowym w pozycji +124 a ugrupowaniem immunoglobuliny.

Jeszcze korzystniej resztę aminokwasu łącznikowego stanowi glutamina.

Korzystnie cząsteczka zawiera sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 a kończącą się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 7, lub rozpoczynającą się alaniną w pozycji -1 a koń czą c ą się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 7.

Korzystnie cząsteczka zawiera ponadto sekwencję aminokwasową, która umożliwia wydzielanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4.

Korzystniej sekwencja aminokwasowa zawiera peptyd sygnałowy onkostatyny M.

Korzystnie cząsteczka wykazuje niższą szybkość dysocjacji z wiązania CD86 niż CTLA4 dzikiego typu.

Korzystnie cząsteczka jest rozpuszczalna.

Korzystnie kodowana jest przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zdeponowaną pod numerem dostępu ATCC: PTA-2104.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową odpowiadającą zmutowanej cząsteczce CTLA4 określonej powyżej.

Korzystnie zawiera ona sekwencję nukleotydową rozpoczynającą się guanidyną w pozycji -3 i kończącą się adeniną w pozycji +1071 jak pokazano na Fig. 7 albo 8, albo zawiera sekwencję nukleotydową rozpoczynającą się adeniną w pozycji nukleotydowej +1 i kończącą się adeniną w pozycji +1071 jak pokazano na Fig. 7.

Korzystnie zdeponowana jest ona pod numerem dostępu ATCC: PTA-2104.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego określonego powyżej.

Korzystnie zdeponowany jest on pod numerem dostępu ATCC: PTA-2104.

Przedmiotem wynalazku jest też układ wektorowy gospodarza, charakteryzujący się tym, że zawiera wektor określony powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza.

Korzystnie odpowiednią komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna lub komórka eukariotyczna.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera wektor określony powyżej.

Korzystnie komórkę stanowi komórka eukariotyczna.

Korzystniej komórkę eukariotyczną stanowi komórka COS.

Korzystniej komórkę eukariotyczną stanowi komórka jajnika chomika chińskiego (CHO).

Jeszcze korzystniej komórka CHO jest wybrana z grupy składającej się z linii komórkowej DG44, CHO-K1, CHO-K1 Tet-On, CHO oznaczonej ECACC 85050302, klonu 13 CHO, klonu B CHO, CHO-K1/SF i RR-CHOK1.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania zmutowanej cząsteczki CTLA4, polegający na tym, że hoduje się układ wektorowy gospodarza określony powyżej z wytworzeniem zmutowanego białka CTLA4 w komórce gospodarza i odzyskuje się tak wytworzone białko.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i zmutowaną cząsteczkę CTLA4 określoną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób regulacji interakcji komórki T z komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86, polegający na tym, że kontaktuje się komórkę dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86 z rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4 określoną powyżej z utworzeniem kompleksu zmutowanej cząsteczki CTLA4/CD80 lub zmutowanej cząsteczki CTLA4/CD86, przy czym kompleks zakłóca interakcję między komórką T a komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86, pod warunkiem, że kompleks nie zakłóca oddziaływania pomiędzy komórką T a komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86 in vivo.

Korzystnie jako komórkę dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86 stosuje się komórkę prezentującą antygen.

Korzystnie hamuje się oddziaływanie komórek dodatnich T pod względem CTLA4 z komórkami dodatnimi pod względem CD80 i CD86.

PL 206 267 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 określonej powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby układu immunologicznego.

Korzystnie choroba układu immunologicznego zależna jest od oddziaływania komórek T z komórkami dodatnimi pod względem CD80 i/lub CD86.

Korzystniej hamowane są oddziaływania komórek T.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 określonej powyżej i liganda reaktywnego z IL-4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi.

W zwią zku z tym zgodnie z wynalazkiem opisano rozpuszczalne zmutowane czą steczki CTLA4, które wiążą CD80 i/lub CD86. Zmutowane cząsteczki tu opisane obejmują te, które mogą rozpoznawać i wiązać CD80 albo CD86 albo oba. W niektórych postaciach zmutowane cząsteczki wiążą CD80 i/lub CD86 z większą zachłannością niż CTLA4.

Przykładem zmutowanej cząsteczki CTLA4 jest opisana tu L104EA29YIg (Fig. 7). Innym przykładem zmutowanej cząsteczki CTLA4 jest opisana tu L104EIg (Fig. 8). L104EA29YIg i L104EIg wiążą CD80 i CD86 bardziej zachłannie niż CTLA4Ig.

Krótki opis figur

Fig. 1 ukazuje analizę równowagi wiązania L104EA29YIg, L104EIg i dzikiego typu CTLA4Ig z CD86Ig.

Fig. 2A i 2B ilustrują dane z testów FACS ukazujące wiązanie L104EA29YIg, L104EIg i CTLA4Ig z komórkami CHO transfekowanymi ludzkimi CD80 lub CD86, jak opisano w przykł adzie 2, poniżej.

Fig. 3A i 3B opisują inhibicję proliferacji komórek CHO dodatnich pod względem CD80 i dodatnich pod względem CD86, jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 4A i 4B ukazuje, że L104EA29YIg skuteczniej niż CTLA4Ig hamuje proliferację pierwotnie i wtórnie allostymulowanych komórek T, jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 5A-C ilustrują, że L104EA29YIg skuteczniej niż CTLA4Ig hamuje wytwarzanie cytokin IL-2 (Fig. 5A), IL-4 (Fig. 5B) i γ-interferonu (Fig. 5C) przez allostymulowane ludzkie komórki T, jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 6 ukazuje, że L104EA29YIg skuteczniej niż CTLA4Ig hamuje proliferację małpich komórek T stymulowanych fitohemaglutyniną (PHA) jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 7 opisuje sekwencję nukleotydową i aminokwasową zmutowanej cząsteczki CTLA4 (L104EA29YIg), zawierającą peptyd sygnałowy; zmutowaną domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 zaczynającą się od metioniny w pozycji +1 i kończącą na kwasie asparaginowym w pozycji +124, lub zaczynającą się od alaniny w pozycji -1 i kończącą na kwasie asparaginowym w pozycji +124; oraz region Ig, jak opisano w przykładzie 1, poniżej.

Fig. 8 opisuje sekwencję nukleotydową i aminokwasową zmutowanej cząsteczki CTLA4 (L104EIg), obejmującą peptyd sygnałowy; zmutowaną domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 zaczynającą się od metioniny w pozycji +1 i kończącą się na kwasie asparaginowym w pozycji +124, lub zaczynającą się od alaniny w pozycji -1 i kończącą się na kwasie asparaginowym w pozycji +124; oraz region Ig, jak opisano w przykładzie 1, poniżej.

Fig. 9 opisuje sekwencję nukleotydową i aminokwasową CTLA4Ig, posiadającą peptyd sygnałowy; sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 dzikiego typu, zaczynającą się od metioniny w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, lub zaczynającą się od alaniny w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; oraz region Ig.

Fig. 10A-C oznaczają żel SDS (fig. 10A) dla CTLA4Ig (tor 1), L104EIg (tor 2), i L104EA29YIg (tor 3A); oraz chromatografy wielkościowe CTLA4Ig (fig. 10B) i L104EA29YIg (fig. 10C).

Fig. 11 (lewa strona) ilustruje diagram wstęgowy zewnątrzkomórkowego zwinięcia podobnego do V Ig CTLA4, wytworzonego ze struktury w roztworze określonej przez spektroskopię NMR. Prawa strona Fig. 11 ukazuje powiększony widok regionu S25-R33 i regionu MYPPPY pokazując położenie i orientację łańcucha bocznego mutacji wzmacniających zachłanność, L104 i A29.

Fig. 12 opisuje schematyczny diagram wektora, piLNLEA29Y, posiadającego insert L104EA29YIg.

Szczegółowy opis wynalazku

Definicje

Stosowane tu następujące słowa lub wyrażenia mają wymienione znaczenia.

PL 206 267 B1

Stosowane tu wyrażenie „dzikiego typu CTLA4 oznacza sekwencję aminokwasową naturalnie występującej, pełnej długości CTLA4 (opisy patentowe U.S. nr. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), lub jej domenę zewnątrzkomórkową, która wiąże CD80 i/lub CD86, i/lub zakłóca wiązanie CD80 i/lub CD86 z ich ligandami. W szczególnych postaciach domena zewnątrzkomórkowa dzikiego typu CTLA4 rozpoczyna się metioniną w pozycji +1 i kończy na kwasie asparaginowym w pozycji +124 lub domena zewnątrzkomórkowa dzikiego typu CTLA4 rozpoczyna się alaniną w pozycji -1 i kończy na kwasie asparaginowym w pozycji +124. Dzikiego typu CTLA4 jest białkiem powierzchniowokomórkowym, mającym N-terminalną domenę zewnątrzkomórkową, domenę transbłonową i C-terminalną domenę cytoplazmatyczną. Domena zewnątrzkomórkowa wiąże się z docelowymi antygenami, takimi jak CD80 i CD86. W komórce, naturalnie wystę pują ce, białko CTLA4 dzikiego typu ulega translacji jako niedojrzały polipeptyd, który zawiera peptyd sygnałowy na N-końcu. Niedojrzały polipeptyd przechodzi obróbkę potranslacyjną, która obejmuje wycięcie i usunięcie peptydu sygnałowego z wytworzeniem produktu cięcia CTLA4 posiadającego nowo utworzony N-koniec, który różni się od N-końca postaci niedojrzałej. Fachowiec oceni, że może nastąpić dodatkowa obróbka potranslacyjna, która usuwa jeden lub więcej aminokwasów z nowo utworzonego N-końca produktu cięcia CTLA4. Forma dojrzała cząsteczki CTLA4 obejmuje domenę zewnątrzkomórkową CTLA4, lub każdą jej część, która wiąże się z CD80 i/lub CD86.

„CTLA4Ig jest rozpuszczalnym białkiem fuzyjnym zawierającym domenę zewnątrzkomórkową dzikiego typu CTLA4, lub jej część, która wiąże CD80 i/lub CD86, połączoną z ogonkiem Ig. Szczególna postać obejmuje domenę zewnątrzkomórkową dzikiego typu CTLA4 zaczynającą się od metioniny w pozycji +1 i kończącą się na kwasie asparaginowym w pozycji +124; lub zaczynającą się od alaniny w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; łącznikową resztę aminokwasową glutaminy w pozycji +125; i część immunoglobuliny obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357 (Fig. 9).

Stosowane tu wyrażenie „białko fuzyjne jest określone jako jedna lub więcej sekwencji aminokwasowych połączonych ze sobą przy użyciu metod dobrze znanych w dziedzinie i jakie opisano w opisach patentowych U.S. nr 5,434,131 lub 5,637,481. Połączone sekwencje aminokwasowe tworzą przez to jedno białko fuzyjne.

Stosowane tu wyrażenie „zmutowana cząsteczka CTLA4 oznacza cząsteczkę, która może być pełnej długości CTLA4 lub jej częścią (pochodne lub fragmenty), posiadającą mutację lub wiele mutacji w CTLA4 (zwłaszcza w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4) tak, że jest ona podobna, lecz już nie identyczna z cząsteczką CTLA4 dzikiego typu. Zmutowane cząsteczki CTLA4 wiążą albo CD80 albo CD86 lub oba. Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą zawierać biologicznie lub chemicznie aktywne cząsteczki nie będące CTLA4, zawarte w nich lub dołączone do nich. Zmutowane cząsteczki mogą być rozpuszczalne (czyli krążące) lub związane z powierzchnią. Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą obejmować całą domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 lub jej część, np. fragmenty lub pochodne. Zmutowane cząsteczki CTLA4 można otrzymać syntetycznie lub rekombinacyjnie.

Stosowane tu określenie „mutacja oznacza zmianę w sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej dzikiego typu polipeptydu. W tym przypadku, jest to zmiana w domenie zewnątrzkomórkowej dzikiego typu CTLA4. Zmianą może być zmiana aminokwasowa, która obejmuje substytucje, delecje, addycje lub skrócenia. Zmutowana cząsteczka może posiadać jedną lub więcej mutacji. Mutacje w sekwencji nukleotydowej mogą lub nie, powodować mutację w sekwencji aminokwasowej, co jest wiadome w dziedzinie. Pod tym względem, pewne kodony nukleotydowe kodują taki sam aminokwas. Przykłady wskazują kodony nukleotydowe CGU, CGG, CGC, i CGA kodujące aminokwas argininę (R); lub kodony GAU, i GAC kodujące aminokwas kwas asparaginowy (D). Tak więc, białko może być kodowane przez jedną lub więcej cząsteczek kwasu nukleinowego, które różnią się specyficzną sekwencją nukleotydową, lecz wciąż kodują cząsteczki białka mające identyczne sekwencje. Sekwencje kodujące aminokwas są następujące:

Aminokwas	Symbol	Symbol jednoliterowy	Kodony
1	2	3	4
Alanina	Ala	A	GCU, GCC, GCA, GCG
Cysteina	Cys	C	UGU, UGC
Kwas asparaginowy	Asp	D	GAU, GAC

PL 206 267 B1 ciąg dalszy

1	2	3	4
Kwas glutaminowy	Glu	E	GAA, GAG
Fenyloalanina	Phe	F	UUU, UUC
Glicyna	Gly	G	GGU, GGC, GGA, GGG
Histydyna	His	H	CAU, CAC
Izoleucyna	De	I	AUU, AUC, AUA
Lizyna	Lys	K	AAA, AAG
Leucyna	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
Metionina	Met	M	AUG
Asparagina	Asn	N	AAU, AAC
Prolina	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamina	Gin	Q	CAA, CAG
Arginina	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Seryna	Ser	S	UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
Treonina	Thr	T	ACU, ACC, ACA, ACG
Walina	Val	V	GUU, GUC, GUA, GUG
T ryptofan	Trp	W	UGG
Tyrozyna	Tyr	Y	U AU, U AC

Stosowane tu wyrażenie „domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 oznacza część CTLA4, która rozpoznaje i wiąże CD80 i/lub CD86. Przykładowo, domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 obejmuje metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (Fig. 9). Alternatywnie, domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 obejmuje alaninę w pozycji -1 d oF kwasu asparaginowego w pozycji +124 (Fig. 9). Domena zewnątrzkomórkowa obejmuje fragmenty lub pochodne CTLA4, które wiążą CD80 i/lub CD86.

Stosowane tu wyrażenie „sekwencja białkowa nie będąca CTLA4 lub „cząsteczka nie będąca CTLA4 jest określona jako każda cząsteczka, która nie wiąże CD80 i/lub CD86 i nie zakłóca wiązania CTLA4 z jej cząsteczką docelową. Przykład obejmuje, lecz bez ograniczania, region stały immunoglobuliny (Ig) lub jego część. Region stały Ig oznacza zwłaszcza ludzki lub małpi region stały Ig, np. ludzki C(gamma)1, włączając zawias, regiony CH2 i CH3. Region stały Ig może być zmutowany w celu zredukowania jego funkcji efektorowych (opisy patentowe U.S. nr: 5,637,481; i 6,132,992).

Stosowane tu wyrażenie „fragment zmutowanej cząsteczki CTLA4 oznacza część zmutowanej cząsteczki CTLA4, zwłaszcza domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 lub jej część, która rozpoznaje i wiąże jej element docelowy, np. CD80 i/lub CD86.

Stosowane tu wyrażenie „pochodna zmutowanej cząsteczki CTLA4 oznacza cząsteczkę, która wykazuje przynajmniej 70% podobieństwa sekwencji i funkcjonuje jak domena zewnątrzkomórkowa CTLA4, czyli rozpoznaje i wiąże CD80 i/lub CD86.

Stosowane tu wyrażenie „część cząsteczki CTLA4 obejmuje fragmenty i pochodne cząsteczki CTLA4, które wiążą CD80 i/lub CD86.

Aby opisany tu wynalazek mógł być pełniej zrozumiany, przedkłada się następujący opis.

Kompozycje według wynalazku

Zgodnie z wynalazkiem opisano rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4, które rozpoznają i wiążą CD80 i/lub CD86. W niektórych postaciach, rozpuszczalne mutanty CTLA4 mają wię kszą zachłanność w stosunku do CD80 i/lub CD86 niż CTLA4Ig.

PL 206 267 B1

Przykłady zmutowanych cząsteczek CTLA4 obejmują L104EA29YIg (Fig. 7). Sekwencja aminokwasową L104EA29YIg może się rozpoczynać od alaniny w pozycji aminokwasowej -1 i kończyć na lizynie w pozycji aminokwasowej +357. Alternatywnie, sekwencja aminokwasowa L104EA29YIg może się zaczynać od metioniny w pozycji aminokwasowej +1 i kończyć na lizynie w pozycji aminokwasowej +357. Część CTLA4 L104EA29YIg zawiera metioninę w pozycji aminokwasowej +1 do kwasu asparaginowego w pozycji aminokwasowej +124. L104EA29YIg obejmuje łącznikową resztę aminokwasową glutaminę w pozycji +125 i część immunoglobuliny obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357 (fig. 7). L104EA29YIg wiąże się z CD80 w przybliżeniu 2-krotnie bardziej zachłannie niż CTLA4Ig dzikiego typu (przytaczana tu dalej jako CTLA4Ig) i w przybliżeniu 4-krotnie bardziej zachłannie z CD86. To silniejsze wiązanie powoduje, że L104EA29YIg jest bardziej efektywne przy blokowaniu odpowiedzi odpornościowych niż CTLA4Ig.

Zmutowane cząsteczki CTLA4 obejmują co najmniej domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 lub jej część, która wiąże CD80 i/lub CD86. Zewnątrzkomórkowa część zmutowanej cząsteczki CTLA4 obejmuje sekwencję aminokwasową zaczynającą się metioniną w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (Fig. 7). Alternatywnie, zewnątrzkomórkowa część CTLA4 może obejmować sekwencję aminokwasową zaczynającą się alaniną w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (Fig. 7).

Zgodnie z wynalazkiem rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 jest białkiem fuzyjnym zawierającym domenę zewnątrzkomórkową CTLA4, w której alanina w pozycji +29 dzikiego typu CTLA4 jest podstawiona tyrozyną; a leucyna w pozycji 104 dzikiego typu CTLA4 jest podstawiona kwasem glutaminowym. Zmutowana cząsteczka CTLA4 mająca te substytucje jest tu przytaczana jako L104EA29YIg (Fig. 7).

Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje L104EA29YIg jest zawarta w pD16 L104EA29YIg i została zdeponowana 19 czerwca 2000 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (Nr ATCC PTA-2104). Wektor pD16 L104EA29YIg jest pochodną wektora pcDNA3 (INVITROGEN).

Zgodnie z wynalazkiem opisano rozpuszczalną zmutowaną cząsteczkę CTLA4 zawierającą domenę zewnątrzkomórkową mutanta CTLA4, jak zdefiniowano powyżej, lub jego część (części) oraz cząstkę, która zmienia rozpuszczalność, powinowactwo i/lub wartościowość zmutowanej cząsteczki CTLA4.

Zgodnie z praktyką wynalazku, cząstką może być region stały immunoglobuliny lub jego część. Do stosowania in vivo, zaleca się, aby region stały immunoglobuliny nie wywoływał szkodliwej odpowiedzi odpornościowej u podmiotu. Przykładowo, w protokołach klinicznych, może być zalecane, aby cząsteczki mutanta obejmowały regiony stałe immunoglobulin ludzkich lub małpich. Przykładem odpowiedniego regionu immunoglobuliny jest ludzki C(gamma)1, obejmujący zawias, regiony CH2, i CH3. Moż liwe są inne izotypy. Dodatkowo możliwe są inne regiony stałe immunoglobuliny (zwłaszcza inne słabe lub nieimmunogenne regiony stałe immunoglobuliny).

Inne cząstki obejmują znaczniki polipeptydowe.

Przykłady odpowiednich znaczników obejmują, lecz bez ograniczenia cząsteczkę p97, cząsteczkę env gpl20, cząsteczkę E7 i cząsteczkę ova (Dash,B., i inni (1994) J. Gen. Virol. 75:1389-97; Dceda, T., i inni (1994) Gene 138:193-6; Falk, K. i inni (1993) Cell. Immunol. 150:447-52; Fujisaka, K. i inni (1994) Virology 204:789-93). Moż liwe są inne czą steczki do stosowania jako znaczniki (Gerard, C. i inni (1994) Neuroscience 62:721-739; Bym, R. i inni J. Virol. (1989) 63:4370-4375; Smith, D. i inni, (1987) Science 238:1704-1707: Lasky, L. (1996) Science 233:209-212).

Zgodnie z wynalazkiem opisano dodatkowe rozpuszczalne zmutowane białka fuzyjne CTLA4Ig preferencyjnie bardziej reaktywne z antygenem CD80 i/lub CD86 w porównaniu z dzikiego typu CTLA4. Przykładem jest L104EA29YIg, jaką 1= pokazano w Fig. 7.

W innej postaci rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 obejmuje łącznikową resztę aminokwasową, która leży pomiędzy częścią CTLA4, a częścią immunoglobuliny. Aminokwasem łącznikowym może być każdy aminokwas, włączając glutaminę. Aminokwas łącznikowy można wprowadzić znanymi w dziedzinie metodami molekularnymi lub syntezy chemicznej.

W innej postaci realizacji, rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 obejmuje część immunoglobuliny (np. zawias, domeny CH2 i CH3), w której dowolna lub wszystkie reszty cysteinowe, w domenie zawiasowej części immunoglobuliny, są podstawione seryną , np. cysteiny w pozycjach +130, +136, lub +139 (Fig. 7). Zmutowana cząsteczka może także obejmować prolinę w pozycji +148 podstawioną seryną, jak pokazano w Fig. 7.

PL 206 267 B1

Rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 może obejmować sekwencję peptydu sygnałowego połączoną z N-końcem domeny zewnątrzkomórkowej części CTLA4 zmutowanej cząsteczki. Peptydem sygnałowym może być każda sekwencja, która pozwoli na sekrecję zmutowanej cząsteczki, w tym peptyd sygnał owy onkostatyny M (Malik, i inni, (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), lub CD5 (Jones, N. H. i inni, (1986) Nature 323:346-349), lub peptyd sygnałowy z dowolnego białka zewnątrzkomórkowego.

Zmutowana cząsteczka może obejmować peptyd sygnałowy onkostatyny M dołączony na N-końcu domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 oraz cząsteczkę ludzkiej immunoglobuliny (np. zawias, CH2 i CH3) dołączoną do C-końca domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4. Ta cząsteczka obejmuje peptyd sygnałowy onkostatyny M obejmujący sekwencję aminokwasową posiadającą metioninę w pozycji -26 do alaniny w pozycji -1, część CTLA4 obejmującą sekwencję aminokwasową posiadającą metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową - glutaminę w pozycji +125 i część immunoglobuliny obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357.

Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku można otrzymać metodami molekularnymi lub syntezy chemicznej. Metody molekularne mogą obejmować następujące etapy: wprowadzenia odpowiedniej komórki gospodarza z cząsteczką kwasu nukleinowego, która powoduje ekspresję i koduje rozpuszczalną zmutowaną cząsteczkę CTLA4; hodowlę tak wprowadzonej komórki gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję zmutowanych cząsteczek w komórce gospodarza; i izolację zmutowanych cząsteczek, które uległy ekspresji. Część peptydu sygnałowego zmutowanej cząsteczki pozwala na ekspresję cząsteczek białka na powierzchni komórki i na wydzielenie ich przez komórkę gospodarza. Cząsteczki mutanta, które ulegały translacji mogą przejść potranslacyjne modyfikacje, obejmujące cięcie peptydu sygnałowego w celu wytworzenia dojrzałego białka mającego CTLA4 i części immunoglobuliny. Cięcie może zajść za alaniną w pozycji -1, dając dojrzałą zmutowaną cząsteczkę posiadającą metioninę w pozycji +1 jako pierwszy aminokwas (fig. 7). Alternatywnie, do cięcia może dojść za metioniną w pozycji -2, dając dojrzałą zmutowaną cząsteczkę mającą alaninę w pozycji -1 jako pierwszy aminokwas.

Korzystną postacią realizacji jest rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 mająca domenę zewnątrzkomórkową ludzkiej CTLA4 połączoną z całością lub częścią cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny (np. zawiasem, CH2 i CH3). Ta korzystna cząsteczka obejmuje część CTLA4 rozpuszczalnej cząsteczki, zawierającej sekwencję aminokwasową posiadającą metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową glutaminę w pozycji +125 i część immunoglobuliny obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część mająca domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 jest zmutowana tak, że alanina w pozycji +29 jest podstawiona tyrozyną i leucyna w pozycji +104 jest podstawiona kwasem glutaminowym. Część immunoglobulinowa zmutowanej cząsteczki może być zmutowana tak, że cysteiny w pozycjach +130, +136, i +139 są podstawione seryną, a prolina w pozycji +148 jest podstawiona seryną. Ta zmutowana cząsteczka jest tu oznaczona jako L104EA29YIg (Fig. 7).

Inną postacią L104EA29YIg jest zmutowana cząsteczka mająca sekwencję aminokwasową z alaniną w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową glutaminę w pozycji +125 i część immunoglobuliny obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 (np. +126 do lizyny w pozycji +357). Część mająca domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 jest zmutowana tak, że alanina w pozycji +29 jest zastąpiona tyrozyną; i leucyna w pozycji +104 jest zastąpiona kwasem glutaminowym. Część immunoglobulinowa zmutowanej cząsteczki jest zmutowana tak, że cysteiny w pozycjach +130, +136, i +139 są zastąpione seryną, a prolina w pozycji +148 jest zastąpiona seryną. Ta zmutowana cząsteczka jest tu oznaczona jako L104EA29YIg (Fig. 7). Po odcięciu sekwencji sygnałowej, L104EA29YIg może się rozpoczynać albo metioniną w pozycji +1, albo rozpoczynać alaniną w pozycji -1.

Wynalazek dodatkowo opisuje cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje aminokwasowe odpowiadające rozpuszczalnym zmutowanym cząsteczkom CTLA4 według wynalazku. W jednej postaci cząsteczką kwasu nukleinowego jest DNA (np. cDNA) lub jego hybryda. Alternatywnie, cząsteczki kwasu nukleinowego to RNA lub jego hybrydy.

Dodatkowo, wynalazek opisuje wektor, który obejmuje sekwencje nukleotydowe według wynalazku. Opisuje się także układ wektorowy gospodarza. Układ wektorowy gospodarza obejmuje wektor według wynalazku w odpowiedniej komórce gospodarza. Przykłady odpowiednich komórek gospodarza obejmują, lecz bez ograniczenia, komórki prokariotyczne i eukariotyczne.

PL 206 267 B1

Wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu chorób układu odpornościowego, obejmujące farmaceutycznie skuteczne ilości rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4. W pewnych postaciach choroby układu odpornościowego zależne są od interakcji komórek dodatnich pod względem CD28 i/lub CTLA4 z komórkami dodatnimi pod względem CD80 i/lub CD86. Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 są dogodnie cząsteczkami CTLA4 mającymi jedną lub więcej mutacji w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4. Kompozycja farmaceutyczna może obejmować rozpuszczalne zmutowane cząsteczki białka CTLA4 i/lub cząsteczki kwasu nukleinowego, i/lub wektory kodujące te cząsteczki. W zalecanych postaciach realizacji, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 mają sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4, jaką pokazano w Fig. 7 (L104EA29Y). Nawet dogodniej, rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 oznacza opisaną tu L104EA29YIg. Kompozycje mogą dodatkowo obejmować inne środki terapeutyczne, włączając, lecz bez ograniczenia, toksyny lekowe, enzymy, przeciwciała lub koniugaty.

Kompozycje farmaceutyczne dogodnie obejmują także odpowiednie nośniki i adiuwanty, obejmujące dowolny materiał, który po połączeniu z cząsteczką według wynalazku (np. rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4, taką jak L104EA29Y) zachowuje aktywność cząsteczki i nie jest reaktywna z układem odpornościowym podmiotu. Przykłady odpowiednich nośników i adiuwantów obejmują, lecz bez ograniczenia, ludzką albuminę surowicy; wymieniacze jonowe; tlenek cynku; lecytynę; substancje buforujące, takie jak fosforany; glicyna; kwas sorbowy; sorbinian potasu; oraz sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy. Inne przykłady obejmują jakiekolwiek ze standardowych nośników farmaceutycznych, takich jak roztwór soli buforowany fosforanem; woda; emulsje, takie jak emulsja olej/woda; i różne rodzaje środków nawilżających. Inne nośniki mogą także obejmować jałowe roztwory; tabletki, łącznie z tabletkami powlekanymi i kapsułkami. Zwykle, takie nośniki zawierają zaróbki, takie jak skrobia, mleko, cukier, pewne rodzaje gliny, żelatyna, kwas stearynowy lub jego sole, stearynian wapnia lub magnezu, talk, tłuszcze roślinne lub oleje, gumy, glikole lub inne znane zaróbki. Takie nośniki mogą także obejmować dodatki zapachowe lub barwniki lub inne składniki. Kompozycje obejmujące takie nośniki opracowuje się dobrze znanymi, konwencjonalnymi metodami. Takie kompozycje można także opracowywać w różnych kompozycjach tłuszczowych, takich jak, np. liposomach, jak również w różnych kompozycjach polimerowych, takich jak mikrosfery polimerowe.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać z zastosowaniem konwencjonalnych sposobów podawania włączając, lecz bez ograniczenia, podawanie dożylne (i.v.), podawanie dootrzewnowe (i.p.), podawanie domięśniowe (i.m.), podawanie podskórne, podawanie doustne, podawanie w postaci czopków lub w postaci kontaktu miejscowego, lub wszczepienia podmiotowi urządzenia do powolnego uwalniania, takiego jak pompa miniosmotyczna.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą występować w rozmaitych postaciach dawkowania, które obejmują, lecz bez ograniczenia, płynne roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, mikrokapsułki polimerowe lub mikropęcherzyki, liposomy i roztwory do wstrzyknięć lub wlewów. Zalecana postać zależy do sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.

Najskuteczniejszy sposób podawania i tryb dawkowania dla kompozycji według wynalazku zależą od ciężkości i przebiegu choroby, zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie oraz oceny lekarza prowadzącego. W związku z tym, dawkowanie kompozycji powinno być dostosowane do konkretnego pacjenta.

Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą być podawane podmiotowi w ilości i przez czas (np. długość e czasu i/lub wielokrotność czasu) wystarczające do zablokowania u podmiotu wiązania endogennych cząsteczek B7 (np. CD80 i/lub CD86) z ich odpowiednimi ligandami. Zablokowanie endogennego wiązania B7/ligand hamuje przez to interakcje między komórkami dodatnimi pod względem B7 (np. CD80- i/lub komórkami dodatnimi pod względem CD86), a komórkami dodatnimi pod względem CD28 i/lub CTLA4. Dawkowanie środka terapeutycznego zależy od wielu czynników włączając, lecz bez ograniczenia, rodzaj chorej tkanki, rodzaj leczonej choroby autoimmunologicznej, ciężkość choroby, zdrowie podmiotu i odpowiedź podmiotu na leczenie tymi środkami. W związku z tym, dawki środków mogą się zmieniać w zależności od podmiotu i sposobu podawania. Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą być podawane w ilości wynoszącej między 0,1 do 20,0 mg/kg masy pacjenta/dzień, zwłaszcza między 0,5 do 10 mg/kg/dzień. Podawanie kompozycji farmaceutycznych według wynalazku można przeprowadzać w różnym czasie. W jednej postaci kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można podawać przez jedną lub więcej godzin. Poza tym, podawanie można powtarzać w zależności od ciężkości choroby, jak również innych czynników, o jakich wiadomo w dziedzinie.

PL 206 267 B1

Wynalazek dodatkowo opisuje sposoby wytwarzania białka obejmujące hodowlę układu wektorowego gospodarza według wynalazku tak, aby wytworzyć białko w gospodarzu, i odzyskanie tak wytworzonego białka.

Dodatkowo, wynalazek opisuje sposoby regulacji funkcjonalnej interakcji komórki T dodatniej pod względem CTLA4 i CD28 z komórkami dodatnimi pod względem CD80 i/lub CD86. Sposoby obejmują zetknięcie komórek dodatnich pod względem CD80- i/lub CD86 z rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4 według wynalazku tak, aby utworzyć kompleksy zmutowanej CTLA4/CD80 i/lub zmutowanej CTLA4/CD86, przy czym kompleksy zakłócają reakcję endogennego antygenu CTLA4 z CD80 i/lub CD86, i/lub kompleksy zakłócają reakcję endogennego antygenu CD28 z CD80 i/lub CD86. W jednej postaci rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 zawiera: pierwszą sekwencję aminokwasową obejmującą domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 od sekwencji aminokwasowej posiadającej metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, jak zdefiniowano powyżej; i drugą sekwencję aminokwasową zawierającą zawias, regiony CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki immunoglobuliny gamma 1 (Fig. 7).

Oczekuje się, że rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 wykazują właściwości inhibitorowe in vivo. W warunkach w jakich następują interakcje komórka T/komórka APC, np. interakcje komórka T/komórka B, w wyniku kontaktu między komórkami T i komórkami APC, wiązanie wprowadzonej zmutowanej cząsteczki CTLA4, aby zaszła reakcja komórek dodatnich pod względem CD80 i/lub CD86, np. komórek B, może zakłócać, czyli hamować, interakcje komórka T/komórka APC, powodując regulację odpowiedzi odpornościowych.

Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby hamowania odpowiedzi odpornościowych. Hamowanie (ang. down regulation) odpowiedzi odpornościowej przez rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 może zachodzić za pomocą inhibicji lub blokowania odpowiedzi odpornościowej już postępującej lub może obejmować zapobieganie indukcji odpowiedzi odpornościowej. Rozpuszczalne CTLA4 cząsteczki według wynalazku mogą hamować funkcje aktywowanych komórek T, takich jak proliferacja limfocytów T i wydzielanie cytokin, przez supresję odpowiedzi komórek T lub indukcję specyficznej tolerancji w komórkach T, albo obie.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposoby leczenia chorób układu odpornościowego i indukcji tolerancji. W szczególnych postaciach choroby uk ł adu odpornoś ciowego zależ ne są od interakcji komórek dodatnich pod względem CD28 i/lub CTLA4 z komórkami dodatnimi pod względem CD80/CD86. W kolejnej postaci interakcje komórek T są hamowane. Choroby układu odpornościowego obejmują, lecz bez ograniczenia, choroby autoimmunologiczne, choroby immunoproliferacyjne i zaburzenia zwią zane z przeszczepem. Te sposoby obejmują podawanie podmiotowi rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4 według wynalazku, w celu regulacji interakcji komórek T z komórkami dodatnimi pod względem CD80 i/lub CD86. Alternatywnie, można podawać zmutowaną hybrydę CTLA4 mającą glikoproteinę błonową połączoną ze zmutowaną cząsteczką CTLA4. Przykłady zaburzeń związanych z przeszczepem obejmują chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) (np. takie, jakie mogą być wynikiem przeszczepu szpiku kostnego lub z indukcji tolerancji), zaburzenia immunologiczne związane z odrzuceniem przeszczepu, chronicznym odrzucaniem i własnymi lub obcymi przeszczepami tkankowymi lub komórkowymi, włączając narządy lite, skórę, wysepki, mięśnie, hepatocyty, neurony. Przykłady chorób immunoproliferacyjnych obejmują, lecz bez ograniczenia, łuszczycę; chłoniaka z komórek T; ostrą białaczkę limfoblastyczną z komórek T; angiocentrycznego chłoniaka jąder z komórek T; łagodne limfocytowe zapalenie naczyń; i choroby autoimmunologiczne, takie jak toczeń (np. układowy toczeń rumieniowaty, zapalenie nerek w toczniu układowym), zapalenie tarczycy typu Hashimoto, pierwotny obrzęk śluzowaty, choroba Gravesa, anemia złośliwa, autoimmunologiczne atroficzne zapalenie żołądka, choroba Addisona, cukrzyca (np. cukrzyca insulinozależna, cukrzyca typu I), zespół Good pasture'a, miastenia gravis, pęcherzyca, choroba Crohne'a, współczulne zapalenie naczyniówki, autoimmunologiczne zapalenie naczyniówki oka, stwardnienie rozsiane, autoimmunologiczna anemia hemolityczna, małopłytkowość samoistna, pierwotna żółciowa marskość wątroby, zapalenie wątroby z przewlekłym działaniem, wrzodziejące zapalenie jelita, zespół Sjogrena, choroby reumatyczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów), zapalenie wielomięśniowe, twardzina i choroba mieszanej tkanki łącznej.

Zgodnie z wynalazkiem opisano dodatkowo sposób hamowania odrzucania przeszczepów narządów litych i/lub tkanek przez podmiot, przy czym podmiot jest biorcą przeszczepianej tkanki. Zwykle, przy przeszczepach tkankowych, odrzucenie przeszczepu jest zapoczątkowywane przez rozpoznanie go jako obcego przez komórki T, po czym następuje odpowiedź odpornościowa, która niszczy

PL 206 267 B1 przeszczep. Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku, poprzez hamowanie proliferacji limfocytów T i/lub wydzielanie cytokin, może spowodować zmniejszenie niszczenia tkanki, a indukcja braku odpowiedzi komórek T specyficznych wobec antygenu moż e spowodować długookresowe przyswojenie przeszczepu bez potrzeby ogólnej immunosupresji. Ponadto, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku można podawać z innymi środkami farmaceutycznymi włączając, lecz bez ograniczenia, krotykosteroidy, cyklosporynę, rapamycynę, mykofenolan mofetylu, azatioprinę, takrolizmus, bazyliksimab i/lub inne środki biologiczne.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposoby hamowania u podmiotu choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Sposób ten obejmuje podawanie podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 według wynalazku, pojedynczo lub razem z dodatkowymi ligandami, reagującym z IL-2, IL-4 lub γ -interferonem. Przykładowo, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA według wynalazku mogą być podawane biorcom szpiku kostnego, w celu inhibicji alloreaktywności komórek T dawcy. Alternatywnie, można sprawić, że komórki T dawcy w przeszczepie szpiku kostnego mogą tolerować alloantygeny biorcy ex vivo przed przeszczepem.

Hamowanie odpowiedzi komórek T przez rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 może być także użyteczne w leczeniu zaburzeń autoimmunologicznych. Wiele zaburzeń autoimmunologicznych wynika z nieodpowiedniej aktywacji komórek T, które reagują na autoantygeny, i które pobudzają wytwarzanie cytokin i autoprzeciwciał związanych z patologią choroby. Podawanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 podmiotowi cierpiącemu, lub podatnemu, na chorobę autoimmunologiczna, może zapobiec aktywacji autoreaktywnych komórek T i może zmniejszyć lub wyeliminować objawy choroby. Sposób ten może także obejmować podawanie podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 według wynalazku, osobno lub razem z dodatkowymi ligandami, reaktywnymi z IL-2, IL-4 lub γ-interferonem.

Zgodnie z wynalazkiem opisano dodatkowo zastosowanie rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4 razem z innymi środkami immunosupresyjnymi, np. cyklosporyną (patrz Mathiesen, w: „Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Cells w Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats (1989) Cancer Lett., 44:151-156), prednizonem, azatiopriną, i metotreksatem (R. Handschumacher „rozdział 53: Drugs Used for Immunosuppression strony 1264-1276). Możliwe są inne środki immunosupresyjne. Przykładowo, w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 można podawać ze środkami farmaceutycznymi, włączając, lecz bez ograniczenia, kortykosteroidy, niesteroidowe leki przeciwzapalne/inhibitory Cox-2, metotreksat, hydroksychlorochinę, sulfasalazopryinę, sole złota, etanercept, infliksimab, anakinrę, azatioprinę, i/lub inne środki biologiczne, takie jak anty-TNF. W leczeniu tocznia rumieniowatego układowego, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 można podawać ze środkami farmaceutycznymi włączając, lecz bez ograniczenia, kortykosteroidy, cytoksan, azatioprinę, hydroksychlorochin, mykofenolan mofetylu, i/lub inne środki biologiczne. Dodatkowo, w leczeniu stwardnienia rozsianego, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 można podawać ze środkami farmaceutycznymi, włączając, lecz bez ograniczenia, kortykosteroidy, interferon beta-1a, interferon beta-1b, octan glatirameru, chlorowodorek mitoksantronu, i/lub inne środki biologiczne.

Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 (zwłaszcza L104EA29YIg) można także stosować w połączeniu z jednym lub więcej następujących środków, w celu regulacji odpowiedzi odpornościowej: rozpuszczalna gp39 (znana także jako ligand CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), rozpuszczalny CD29, rozpuszczalny CD40, rozpuszczalny CD80, rozpuszczalny CD86, rozpuszczalny CD28, rozpuszczalny CD56, rozpuszczalny Thy-1, rozpuszczalny CD3, rozpuszczalny TCR, rozpuszczalny VLA-4, rozpuszczalny VCAM-1, rozpuszczalny LECAM-1, rozpuszczalny ELAM-1, rozpuszczalny CD44, przeciwciała reaktywne wobec gp39, przeciwciała reaktywne wobec CD40, przeciwciała reaktywne wobec B7, przeciwciała reaktywne wobec CD28, przeciwciała reaktywne wobec LFA-1, przeciwciała reaktywne wobec LFA-2, przeciwciała reaktywne wobec IL-2, przeciwciała reaktywne wobec IL-12, przeciwciała reaktywne wobec IFN-gamma, przeciwciała reaktywne wobec CD2, przeciwciała reaktywne wobec CD48, przeciwciała reaktywne wobec dowolnej ICAM (np. ICAM-2), przeciwciała reaktywne wobec CTLA4, przeciwciała reaktywne wobec Thy-1, przeciwciała reaktywne wobec CD56, przeciwciała reaktywne wobec CD3, przeciwciała reaktywne wobec CD29, przeciwciała reaktywne wobec TCR, przeciwciała reaktywne wobec VLA-4, przeciwciała reaktywne wobec VCAM-1, przeciwciała reaktywne wobec LECAM-1, przeciwciała reaktywne wobec ELAM-1, przeciwciała reaktywne wobec CD44. W pewnych postaciach zaleca się przeciwciała monoklonalne. W innych postaciach zaleca się fragmenty przeciwciał. Jak fachowcy łatwo pojmą, połączenia mogą obejmować rozpuszPL 206 267 B1 czalne zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku i jeden inny środek immunosupresyjny, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 i dwa inne środki immunosupresyjne, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 i trzy inne środki immunosupresyjne, itd. Optymalne połączenie i dawkowanie można określić i optymalizować stosując metody dobrze znane w dziedzinie.

Niektóre specyficzne połączenia obejmują następujące: L104EA29YIg i mAb CD80; L104EA29YIg i mAb CD86; L104EA29YIg, mAb CD80, i mAb CD86; L104EA29YIg i mAb gp39; L104EA29YIg i mAb CD40; L104EA29YIg i mAb CD28; L104EA29YIg, mAb CD80 i CD86, i mAb gp39; L104EA29YIg, CD80 i mAb CD86 i mAb CD40; i L104EA29YIg, mAb anty-LFAl, i mAb antygp39. Specyficznym przykładem mAb gp39 jest MR1. Inne połączenia będą łatwo ocenione i zrozumiane przez fachowców.

Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku, np. L104EA29Y, mogą być podawane jako jedyny składnik aktywny lub razem z innymi lekami w układzie immunomodulacyjnym lub innymi środkami przeciwzapalnymi np. w leczeniu lub profilaktyce ostrego lub przewlekłego odrzucania allogenicznego lub ksenogenicznego przeszczepu albo zaburzeń zapalnych lub autoimmunologicznych, lub aby indukować tolerancję. Przykładowo, można je stosować w połączeniu z inhibitorem kalcyneuryny, np. cyklosporyną A lub FK.506; makrolidem immunosupresyjnym, np. rapamycyną lub jej pochodną; np. 40-O-(2-hydroksy)etylorapamycyną, środkiem zawracającym limfocyty, np. FTY720 lub jego analogiem; kortykosteroidami; cyklofosfamidem; azatioprenem; metotreksatem; leflunomidem lub jego analogiem; mizoribiną; kwasem mykofenolowym; mykofenolanem mofetylu; 15-deoksyspergualiną lub jej analogiem; immunosupresyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi, np. przeciwciałami monoklonalnymi wobec receptorów leukocytów np. MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (S LAM) , OX40,4-1BB lub ich ligandów; lub innymi związkami immunomodulatorowymi np. CTLA4/CD28-Ig, lub innymi inhibitorami cząsteczek adhezyjnych np. mAb lub inhibitorami o niskiej masie cząsteczkowej, włączając antagonistów LFA-1, antagonistów selektyny i antagonistów VLA-4. Związek jest szczególnie użyteczny w połączeniu ze związkiem, który zakłóca CD40 i jego ligand, np. przeciwciał ami wobec CD40 i przeciwciałami wobec CD40-L, np. w wyżej wymienionych wskazaniach, np. indukcji tolerancji.

Jeśli rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku podaje się w połączeniu z inną terapią immunosupresyjną/immunomodulatorową lub przeciwzapalną, np. jak wymieniono tu powyżej, dawkowanie równocześnie podawanego związku immunosupresyjnego, immunomodulatorowego lub przeciwzapalnego będzie się oczywiście zmieniać w zależności od rodzaju leku równocześnie wykorzystywanego np. czy jest to steroid czy cyklosporyna, od konkretnego wykorzystywanego leku, od leczonego stanu i tak dalej.

W związku z powyższym zgodnie z niniejszym wynalazkiem opisano w jeszcze dodatkowym aspekcie sposoby, jakie wymieniono powyżej, obejmujące wspólne podawanie, np. równocześnie lub w kolejnoś ci, terapeutycznie skutecznej ilości rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4 według wynalazku, L104EA29YIg, w postaci wolnej lub w postaci soli farmaceutycznie dopuszczalnej, oraz drugiej substancji lekowej, przy czym wymieniona druga substancja lekowa jest lekiem immunosupresyjnym, immunomodulatorowym lub przeciwzapalnym, np. jak zaznaczono powyżej. Dodatkowo zapewnia się połączenia terapeutyczne, np. zestaw, np. do zastosowania w dowolnym sposobie, jaki określono powyżej, obejmujący L104EA29YIg, w postaci wolnej lub w postaci soli farmaceutycznie dopuszczalnej, do zastosowania równocześnie lub kolejno, z co najmniej jedną kompozycją farmaceutyczną obejmującą lek immunosupresyjny, immunomodulatorowy lub przeciwzapalny. Zestaw może zawierać instrukcję podawania leku.

Sposoby otrzymywania cząsteczek według wynalazku

Ekspresja zmutowanych cząsteczek CTLA4 może następować w komórkach prokariotycznych. Organizmy prokariotyczne są najczęściej reprezentowane przez różne szczepy bakterii. Bakterie mogą być gram dodatnie lub gram ujemne. Zwykle, zaleca się gram ujemne bakterie, takie jak E. coli. Można także stosować inne szczepy drobnoustrojów.

Sekwencje kodujące zmutowane cząsteczki CTLA4 można wprowadzić do wektora zaplanowanego do ekspresji obcych sekwencji w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli. Te wektory mogą obejmować zwykle wykorzystywane prokariotyczne sekwencje kontrolne, które są tu określone, jako obejmujące promotory inicjacji transkrypcji, ewentualnie z operatorem, razem z sekwencjami miejsca wiązania rybosomu, obejmują takie powszechnie stosowane promotory jak układy promotorowe beta laktamazy (penicylinazy) i laktozy (lac) (Chang, i inni, (1977) Nature 198:1056), tryptofanowy (trp) układ promotorowy (Goeddel, i inni, (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) oraz pochodzący od

PL 206 267 B1 lambda promotor PL i N-genowe miejsce wiązania rybosomu (Shimatake, i inni, (1981) Nature 292:128).

Takie wektory ekspresyjne będą także obejmować miejsca inicjacji replikacji i markery selekcji, takie jak gen beta-laktamazy lub fosfotransferazy neomycynowej, nadający oporność na antybiotyki pod warunkiem, że wektory te mogą replikować w bakteriach a komórki zawierające plazmidy można selekcjonować w czasie hodowli w obecności antybiotyków, takich jak ampicylina lub kanamycyna.

Plazmid ekspresyjny można wprowadzić do komórek prokariotycznych różnymi standardowymi metodami, włączając, lecz bez ograniczenia szok CaCl2 (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110. i Sambrook i inni (wydawcy) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-gie wydanie, Cold Spring Harbor Press, (1989)) i elektroporację.

Zgodnie z praktyką wynalazku, komórki eukariotyczne są także odpowiednimi komórkami gospodarza. Przykłady komórek eukariotycznych obejmują każdą komórkę zwierzęcą, czy to pierwotną czy unieśmiertelnioną, drożdżową (np. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe i Pichia pastoris) oraz komórki roś linne. Szpiczak, COS i komórki CHO są przykładami komórek zwierzęcych, które mogą być wykorzystane jako gospodarze. Poszczególne komórki CHO obejmują, lecz bez ograniczenia, DG44 (Chasin, i inni 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC Nr. CCL-61), linia komórkowa CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO oznaczone ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), klon CHO 13 (GEIMG, Genova, IT) , CHO klon B (GEIMG, Genova, IT) , CHO-K1/SF oznaczone ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) i RR-CHOK1 oznaczone ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Przykładowe komórki roślinne obejmują tytoń (całe rośliny, hodowle komórkowe lub kalus), komórki kukurydzy, soi i ryżu. Dopuszczalne są także nasiona kukurydzy, soi i ryżu.

Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące zmutowane cząsteczki CTLA4 można także wprowadzić do wektora zaplanowanego do ekspresji obcych sekwencji w gospodarzu eukariotycznym. Elementy regulatorowe wektora mogą się zmieniać zgodnie z poszczególnym gospodarzem eukariotycznym.

Powszechnie stosowane eukariotyczne sekwencje kontrolne do stosowania w wektorach ekspresyjnych obejmują promotory i sekwencje kontrolne zgodne z komórkami ssaków, takie jak np. promotor CMV (wektor CDM8) i wirus mięsaka ptaków (ASV) (wektor nLN). Inne powszechnie wykorzystywane promotory obejmują wczesny i późny promotor z Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, i inni, (1973)

Nature 273:113), lub inne promotory wirusowe, takie jak te pochodzące od poliomy, adenowirusa 2 i bydlęcego wirusa brodawczaka. Można także stosować promotor indukowalny, taki jak hMTII (Karin, i inni, (1982) Nature 299:797-802).

Wektory do ekspresji zmutowanych cząsteczek CTLA4 u eukariotów mogą także nieść sekwencje zwane regionami wzmacniającymi. Są one istotne przy optymalizacji ekspresji genu i znajdują się albo w górę lub w dół od regionu promotora.

Przykłady wektorów ekspresyjnych dla eukariotycznych komórek gospodarzy obejmują, lecz bez ograniczenia, wektory dla ssaczych komórek gospodarza (np. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); wektory pVPakc, wektory pCMV, wektory pSG5 (Stratagene)), wektory retrowirusowe (np. pFB wektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) lub jego postacie modyfikowane, wektory adenowirusowe; wektory wirusowe związane z adenowirusem, wektory bakulowirusowe, wektory drożdżowe (np. wektory pESC (Stratagene)).

Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą integrować się z genomem eukariotycznej komórki gospodarza i replikować wraz z replikacją genomu gospodarza. Alternatywnie, wektor niosący zmutowane cząsteczki CTLA4 może zawierać miejsca inicjacji replikacji pozwalające na replikację pozachromosomową.

Dla ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego w Saccharomyces cerevisiae, można użyć miejsce inicjacji replikacji endogennego plazmidu drożdżowego, koło 2μ (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternatywnie, można wykorzystać sekwencje z genomu drożdżowego zdolne do pobudzania replikacji autonomicznej (patrz np. Stinchcomb i inni, (1979) Nature 282:39); Tschemper i inni, (1980) Gene 10:157; i Clarke i inni, (1983) Meth.Enz. 101:300).

Transkrypcyjne sekwencje kontrolne dla wektorów drożdżowych obejmują promotory syntezy enzymów glikolitycznych (Hess i inni, (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland i inni, (1978) Biochemistry 17:4900). Inne promotory znane w dziedzinie obejmują promotor CMV zawarty w wektorze CDM8 (Toyama i Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promotor kinazy 3-fosfoglicerynianowej (Hitzeman i inni, (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) oraz te dla innych enzymów glikolitycznych.

PL 206 267 B1

Inne promotory można indukować, ponieważ mogą one być regulowane przez bodźce środowiskowe lub pożywkę wzrostową dla komórek. Te indukowalne promotory obejmują te pochodzące z genów białek szoku termicznego, dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów związanych z katabolizmem azotu i enzymów odpowiedzialnych za utylizację maltozy i galaktozy.

Sekwencje regulatorowe mogą być także umieszczone na końcu 3' sekwencji kodującej. Te sekwencje mogą działać w celu stabilizacji informacyjnego RNA. Takie terminatory znajdują się w regionie nie podlegającym translacji 3' za sekwencjami kodującymi w kilku genach pochodzących z drożdży i ssaków.

Przykładowe wektory dla roślin i komórek roślinnych obejmują, lecz bez ograniczenia, plazmidy Ti Agrobacterium, wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i wirusa złotej mozaiki pomidora (TGMV).

Ogólne aspekty transformacji układu ssaczych komórek gospodarza zostały opisane przez Aksel (opis patentowy U.S. Nr. 4,399,216 opublikowany 16 sierpnia 1983). Komórki ssaków można transformować metodami obejmującymi, lecz bez ograniczenia, transfekcje w obecności fosforanu wapnia, mikroiniekcję, elektroporację lub przez transdukcję wektorami wirusowymi.

Metody wprowadzania obcych sekwencji DNA do genomów roślinnych i drożdżowych obejmują (1) metody mechaniczne, takie jak mikroiniekcja DNA do pojedynczych komórek lub protoplastów, wirowanie komórek ze szklanymi paciorkami w obecności DNA, lub wstrzeliwanie kulek wolframowych lub złotych powlekanych DNA do komórek lub protoplastów; (2) wprowadzanie DNA przez błonę komórkową, która stała się przenikalną dla makrocząsteczek, na skutek traktowania glikolem polietylenowym lub poddania impulsom elektrycznym o wysokim napięciu (elektroporacji); lub (3) stosowanie liposomów (zawierających cDNA), które łączą się z błonami komórkowymi.

Ekspresję cząsteczek mutanta CTLA4 można wykrywać metodami znanymi w dziedznie. Przykładowo, zmutowane cząsteczki można wykrywać przez barwienie Coomassie żeli SDS-PAGE i odcisk immunologiczny z użyciem przeciwciał, które wiążą CTLA4. Odzyskiwanie białka można przeprowadzić wykorzystując standardowe środki oczyszczania białka np. chromatografię powinowactwa lub chromatografię jonowymienną, z uzyskaniem zasadniczo czystego produktu (R. Scopes w: „Protein Purification. Principles and Practice. trzecie wydanie, Springer-Verlag (1994)).

Mutageneza CTLA4Ig na podstawie kodonu

W jednej postaci realizacji, wykorzystano mutagenezę ukierunkowaną i nową procedur ę przesiewową, w celu identyfikacji kilku mutacji w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, które poprawiają zachłanność wiązania CD86. W tej postaci mutacje przeprowadzono w resztach w regionach domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 od seryny 25 do argininy 33, nici C' (alanina 49 i treonina 51), nici F (lizyna 93, kwas glutaminowy 95 i leucyna 96) i w regionie od metioniny 97 do tyrozyny 102, tyrozyna 103 do glicyny 107 i w nici G w pozycjach glutaminy 111, tyrozyny 113 oraz izoleucyny 115. Te miejsca wybrano na podstawie badań chimerycznych białek fuzyjnych CD28/CTLA4 (Peach i inni, J. Eksp. Med., 1994, 180:2049-2058) i na modelu przewidującym, które łańcuchy boczne reszt aminokwasowych byłyby wystawione na działanie rozpuszczalnika oraz na braku identyczności lub homologii reszt aminokwasowych w pewnych pozycjach między CD28 i CTLA4. Również, każda reszta, która znajduje się w ścisłej bliskości przestrzennej (5 do 20 jednostek angstromowych) w stosunku do identyfikowanych reszt, jest uważana za część niniejszego wynalazku.

Aby syntetyzować i poddać skriningowi (przesiać) rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 o zmienionym powinowactwie do CD80 i/lub CD86, zastosowano strategię dwuetapową. Doświadczenia obejmowały najpierw utworzenie biblioteki mutacji przy konkretnym kodonie zewnątrzkomórkowej części CTLA4, a potem ich skrining (przesiew) przez analizę BIAcore w celu identyfikacji mutantów o zmienionej reaktywności wobec CD80 lub CD86. Układ testowy BIAcore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) wykorzystuje układ detektorów powierzchniowego rezonansu plazmonowego, który zasadniczo obejmuje wiązanie kowalencyjne albo CD80Ig albo CD86Ig z płytką czujnika powlekanego dekstranem, umieszczonego w detektorze. Testową cząsteczkę można potem wstrzyknąć do komory zawierającej płytkę (chip) czujnika i można oszacować ilość związanego białka komplementarnego, na podstawie zmian masy cząsteczkowej, która jest fizycznie związana ze stroną płytki czujnika powleczoną dekstranem; zmianę masy cząsteczkowej można mierzyć za pomocą układu detektorowego.

Zalety wynalazku

Ponieważ wiązanie CTLA4 z CD80 i CD86 charakteryzuje się szybkimi współczynnikami „on i szybkimi współczynnikami dysocjacji („off) i ponieważ kompleksy CTLA4Ig-CD86 dysocjują w przybliżeniu 5- do 8-krotnie szybciej niż kompleksy CTLA4Ig-CD80, uznano, że w wyniku spowolnienia

PL 206 267 B1 tempa dysocjacji CTLA4Ig z CD80 i/lub CD86 uzyskanoby cząsteczki o silniejszych właściwościach immunosupresyjnych. Tak więc, uważa się, że rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 mające wyższą zachłanność wiązania wobec komórek dodatnich pod względem CD80 lub CD86 w porównaniu z dzikiego typu CTLA4, lub nie zmutowanymi formami CTLA4Ig, skuteczniej blokują aktywację aktywowanych komórek specyficznych wobec antygenu, niż dzikiego typu CTLA4 lub nie zmutowane formy CTLA4Ig.

Dodatkowo, koszty produkcji CTLA4Ig są bardzo wysokie. Zmutowane cząsteczki CTLA4Ig o wysokiej zachłanności wiązania, mające silniejsze właściwości immunosupresyjne można wykorzystać w klinice w znacznie niższych dawkach niż niezmutowane CTLA4Ig, uzyskując podobny poziom immunosupresji. Tak więc, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4, np. L104EA29YIg, mogą być bardzo dogodne ze względu na koszty.

Następujące przykłady przedstawiono w celu ilustracji niniejszego wynalazku i aby pomóc fachowcowi przy realizacji i wykorzystywaniu go. Przykłady w zamierzeniu w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

W przykładzie tym opisano metody stosowane w celu wytworzenia sekwencji nukleotydowych kodujących rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku. Utworzono mutanta w jednym miejscu L104EIg i testowano pod względem kinetyki wiązania dla CD80 i/lub CD86. Sekwencję nukleotydową L104EIg wykorzystano jako matrycę do wytworzenia sekwencji CTLA4 zmutowanej w dwóch miejscach, L104EA29YIg, którą testowano pod względem kinetyki wiązania dla CD80 i/lub CD86.

Mutageneza CTLA4Ig na podstawie kodonu:

Strategię mutagenezy i przesiewu wykorzystano do zidentyfikowania zmutowanych cząsteczek CTLA4Ig, które odznaczały się niższym tempem dysocjacji (wskaźnika „off) od cząsteczek CD80 i/lub CD86. Utworzono sekwencje nukleotydowe zmutowane w jednym miejscu, stosując CTLA4Ig jako matrycę (opisy patentowe U.S. nr: 5,844,095; 5,851,795; i 5,885,796; Numer dostępu ATCC 68629). Zaprojektowano mutagenne startery oligonukleotydowe PCR do losowej mutagenezy specyficznego kodonu cDNA pozostawiając dowolne zasady w pozycjach 1 i 2 kodonu, lecz tylko guaninę lub tyminę w pozycji 3 (XXG/T); znany także jako NNG/T). Specyficzny kodon kodujący aminokwas mógł być losowo zmutowany tak, żeby kodować każdy z 20 aminokwasów. W ten sposób, mutageneza XXG/T dała 32 potencjalne kodony kodujące każdy z 20 aminokwasów. Produkty PCR kodujące mutacje w ścisłej bliskości -M97-G107 CTLA4Ig (patrz Fig. 7 lub 8), poddano trawieniu Sacl/Xbal i subklonowano do podobnie pociętego wektora ekspresyjnego nLN CTLA4Ig (znanego również jako piLN). Metodę tę wykorzystano do wytworzenia cząsteczki CTLA4 L104EIg zmutowanej w pojedynczym miejscu (fig. 8).

W celu wprowadzenia mutacji w pobliżu S25-R33 CTLA4Ig, wprowadzono najpierw ciche miejsce restrykcji Nhel 5' w stosunku do tej pętli, przez mutagenezę ukierunkowaną przez starter PCR. Produkty PCR poddano trawieniu Nhel/Xbal i subklonowano do podobnie pociętych wektorów ekspresyjnych CTLA4Ig lub L104EIg. Metodę tę wykorzystano do wytworzenia cząsteczki CTLA4 L104EA29YIg zmutowanej w dwóch miejscach (fig. 7). W szczególności, wykorzystano cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego cząsteczkę CTLA4 zmutowaną w jednym miejscu, L104EIg, jako matrycę do wytworzenia cząsteczki CTLA4 zmutowanej w dwóch miejscach, L104EA29YIg. Wektor nLN posiadający L104EA29YIg jest pokazany w Fig. 12.

P r z y k ł a d 2

W niniejszym przykładzie opisano metody przesiewowe (skriningu) stosowane do identyfikacji polipeptydów CTLA4 zmutowanych w jednym i dwóch miejscach, które uległy ekspresji z konstrukcji opisanych w przykładzie 1, które wykazywały wyższą zachłanność wiązania antygenów CD80 i CD86, w porównaniu z niezmutowanymi cząsteczkami CTLA4Ig.

Aktualne badania in vitro i in vivo pokazują, że sama CTLA4Ig jest niezdolna do pełnego zablokowania aktywacji specyficznych wobec antygenu aktywowanych komórek T. Badania in vitro z CTLA4Ig i przeciwciałem monoklonalnym specyficznym albo dla CD80 albo CD86 oceniające stopień inhibicji proliferacji komórek T pokazują, że przeciwciało monoklonalne anty-CD80 nie zwiększało inhibicji CTLA4Ig. Jednak przeciwciało monoklonalne anty-CD86 zwiększyło inhibicję, pokazując, że CTLA4Ig nie blokowało tak skutecznie interakcji CD86. Dane te podtrzymują wcześniejsze odkrycia Linsley i inni (Immunity. (1994), 1:793-801) ukazujące, że inhibicja odpowiedzi komórkowych za pośrednictwem CD80 wymagała w przybliżeniu 100 krotnie niższego stężenia CTLA4Ig niż dla odpowiePL 206 267 B1 dzi za pośrednictwem CD86. Na podstawie tych odkryć przypuszczano, że rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 o wyższej zachłanności dla CD86 niż dzikiego typu CTLA4 powinny lepiej blokować aktywację komórek aktywowanych specyficznych wobec antygenu niż CTLA4Ig.

W tym celu, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 opisane w przykładzie 1 powyżej przesiano przy użyciu nowej procedury przesiewowej w celu identyfikacji kilku mutacji w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, która poprawia zachłanność wiązania CD80 i CD86. Ta strategia przesiewowa zapewniała skuteczną metodę bezpośredniej identyfikacji mutantów o wyraźnie niższych wskaźnikach „off bez potrzeby oczyszczania białka lub oceny ilościowej, ponieważ określenie współczynnika „off jest niezależne od stężenia (O'Shannessy i inni, (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

Komórki COS transfekowano poszczególnym plazmidowym DNA oczyszczonym metodą miniprep i namnażano przez kilka dni. Trzydniowe kondycjonowane pożywki hodowlane nałożono na płytki bioczujnika BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja) powleczone rozpuszczalnym CD80lg lub CD86lg. Specyficzne wiązanie i dysocjację zmutowanych białek mierzono metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (O'Shannessy, D. J., i inni, (1993) Anal. Biochem. 212:457-468). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na bioczujnikach (chipach) BIAcore™ lub BIAcore™ 2000 w temperaturze 25°C. Ligandy unieruchomiono na p ł ytkach czujników badawczych NCM5 (Pharmacia) przy użyciu standardowego sprzęgania N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodiimido-N-hydroksysukcynoimidowego (Johnsson, B., i inni (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko, S.N, i inni (1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434).

Metoda skriningu

Komórki COS hodowane w 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej transfekowano przejściowo DNA kodującym zmutowane CTLA4Ig. Pożywki hodowlane zawierające wydzielone rozpuszczalne zmutowane CTLA4Ig zebrano 3 dni później.

Kondycjonowane pożywki hodowlane komórek COS pozostawiono do przepływu przez płytki bioczujników BIAcore derywatyzowane CD86lg lub CD80lg (jak opisano u Greene i inni, 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771) i cząsteczki mutanta zidentyfikowano za pomocą wskaźnika „off wolniejszego niż obserwowany dla dzikiego typu CTLA4Ig. cDNA odpowiadające wybranym próbkom pożywek poddano sekwencjonowaniu i spreparowano tak, aby przeprowadzić przejściową transfekcję komórek COS na większą skalę, z której sporządzono zmutowane CTLA4Ig białko w następstwie oczyszczania z białkiem A pożywek hodowlanych.

Warunki analizy BIAcore i analizę danych równowagi wiązania przeprowadzono jak opisano u J. Greene i inni 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771, i jaką tu opisano.

Analiza danych BIAcore

Linie podstawowe zapisu odczytu czujników znormalizowano do zerowych jednostek odpowiedzi (RU) przed analizą. Próbki przepuszczono przez pozornie derywatyzowane płynące komórki w celu ustalenia wartoś ci jednostki odpowiedzi tł a (RU) z powodu różnic zbiorczego wskaźnika refrakcji między roztworami. Stałe równowagi dysocjacji (Kd) obliczono z wykresów Req w zależności od C, gdzie Req oznacza odpowiedź w stanie ustalonym minus odpowiedź na pozornie derywatyzowanym chipie, a C oznacza stężenie molowe analitu. Krzywe wiązania analizowano przy użyciu komercyjnego programu komputerowego nieliniowego dopasowania krzywej (Prism, GraphPAD Software).

Dane doświadczalne dopasowano najpierw do modelu dla wiązania pojedynczego liganda z pojedynczym receptorem (model 1-miejscowy, czyli prosty układ Langmuir, A+B< >AB), a stałe równowagi asocjacji (K_d=[A]^[B]\[AB]) obliczono z równania R=R_max/C/ (Kd+C). Następnie, dane dopasowano do najprostszego dwumiejscowego modelu wiązania liganda (czyli z receptorem mającym dwa nie oddziałujące niezależne miejsca wiązania, jakie opisano przez równanie ^R=Rmax1 •C\ (Kd1 + C) +Rmax2<\ (K_d2 + C)).

Zgodność dopasowania tych dwóch modeli analizowano wizualnie przez porównanie z danymi doświadczalnymi i statystycznie testem F sumy kwadratów. Prostszy, jednomiejscowy model wybrano jako najlepsze dopasowanie, o ile model dwumiejscowy nie pasował istotnie lepiej (p<0,1).

Analizy asocjacji i dysocjacji przeprowadzono z użyciem oceny BIA 2.1 Software (Pharmacia). Stałe szybkości asocjacji kon obliczono dwoma sposobami, zakładając zarówno jednorodne interakcje jednomiejscowe jak i równoległe interakcje dwumiejscowe. Dla interakcji jednomiejscowych, wartości kon obliczono zgodnie z równaniem Rt=Req (1-exp^-ks(t-t0), gdzie Rt oznacza odpowiedź w danym czasie t; Req oznacza odpowiedź w stanie ustalonym; t₀ oznacza czas początku wstrzyku; i k_s=dR/dt=k_on^Ck_off, i gdzie C oznacza stężenie analitu, obliczone pod względem miejsc wiązania monomerowego. Dla interakcji dwumiejscowych wartości kon obliczono zgodnie z równaniem

PL 206 267 B1

R_t=R_eq(1-exp^-ks1(t-t0) + R_eq2(1-exp^-ks1(t-t0).

Dla każdego modelu, wartości kon określono z obliczonego spadku (do około 70% maksymalnej asocjacji) wykresów ks w zależności od C.

Dane dysocjacji analizowano zgodnie z modelem jednomiejscowym (AB=A+B) lub dwumiejscowym (AiBj=Ai+Bj) a stałe szybkości (koff) obliczono z najlepszych dopasowań do krzywych. Stosowano model miejsca wiązania z wyjątkiem, kiedy resztki były większe niż tło urządzenia (2-10 RU, według maszyny), w którym to przypadku wykorzystano model wiązania dwumiejscowego. Połowiczny czas zajętości receptora obliczono z zależności t1/2=0,693/koff.

Cytometria przepływowa:

Mysie mAb L307.4 (anty-CD80) nabyto od Becton Dickinson (San Jose, California) a IT2.2 (anty-B7-0 [znane także jako CD86]) od Pharmingen (San Diego, California). Do barwienia immunologicznego komórki CHO dodatnie pod względem CD80 i/lub dodatnie pod względem CD86 usunięto z ich naczyń hodowlanych przez inkubację w roztworze buforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 10 mM EDTA. Komórki CHO (1-10 x 10⁵) inkubowano najpierw z mAb lub białkami fuzyjnymi immunogobulin w DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), następnie przemyto i inkubowano z odczynnikami drugiego etapu: kozią anty-mysią lub anty-ludzką immunoglobuliną sprzężoną z izotiocyjanianem fluoresceiny (Tago, Burlingame, California). Komórki poddano ko ń cowemu pł ukaniu i analizowano na FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE i chromatografia ekskluzyjna

SDS-PAGE przeprowadzono na 4-20% żelach akrylamidowych z Tris/glicyną (Novex, San Diego, CA). Żele analityczne barwiono Coomassie Blue, i obrazy wilgotnych żeli otrzymano przez skanowanie cyfrowe. CTLA4Ig (25 μο) i L104EA29YIg (25 (μθ) analizowano przez chromatografię ekskluzyjna (ang. size exclusion chromatography) stosując kolumnę TSK-GEL G300 SWXL (7,8 x 300mm,

Tosohaas, Montgomeryville, PA) zrównoważoną w roztworze soli buforowanej fosforanem zawierającym 0,02% NAN3 przy prędkości przepływu wynoszącej 1,0 ml/minutę.

CTLA4XC120S i L104EA29YXC120S.

Wytworzono pojedynczy łańcuch CTLA4KSC120S jak opisano poprzednio (Linsley i inni, (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). W skrócie, plazmid ekspresyjny onkostatyny M CTLA4 (OMCTLA4) wykorzystano jako matrycę, starter zgodny

GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG wybrano tak, aby był dopasowany do sekwencji w wektorze; a starter odwrotny, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC odpowiadał ostatnim siedmiu aminokwasom (czyli aminokwasom 118-124) w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, i zawierał miejsce dla enzymu restrykcyjnego oraz kodon stopu (TGA). Starter odwrotny wykazywał mutację C120S (cysteiny na serynę w pozycji 120). W szczególności, sekwencja nukleotydową GCA (nukleotydy 34-36) startera odwrotnego ukazanego powyżej, jest zastąpiona jedną z następujących sekwencji nukleotydowych: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, lub GCT. Jak specjaliści łatwo pojmą, sekwencja nukleotydową GCA jest odwrotną sekwencją kompelmentarną dla kodonu TGC dla cysteiny. Podobnie, sekwencje nukleotydowe AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, lub GCT są odwrotnymi sekwencjami komplementarnymi kodonów dla seryny. Produkty reakcji łańcuchowej polimerazy poddano trawieniu HindIII/XbaI i bezpośrednio subklonowano do wektora ekspresyjnego nLN (BristolMyers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXC120S wytworzono w identyczny sposób. Każdy konstrukt weryfikowano przez sekwencjonowanie DNA.

Identyfikacja i charakteryzacja biochemiczna mutantów o wysokiej zachłanności wiązania

Do mutagenezy wybrano dwadzieścia cztery aminokwasy i uzyskane -2300 zmutowanych białek testowano pod względem wiązania CD86lg przez powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR; jak opisano wyżej). Dominujące efekty mutagenezy w każdym miejscu są podsumowane w tabeli II. Losowa mutageneza niektórych aminokwasów w S25-R33 najwyraźniej nie zmieniła wiązania liganda. Mutageneza E31 i R33 i reszt M97-Y102 najwyraźniej spowodowała osłabienie wiązania liganda. Mutageneza reszt S25, A29 i T30, K93, L96, Y103, L104 i G105, spowodowała otrzymanie białek o wolnym wskaźniku „on i/lub wolnym „off. Te wyniki potwierdzają wcześniejsze odkrycia, że reszty w regionie S25-R33, i reszty w M97-Y102 lub obok, mają wpływ na wiązanie liganda (Peach i inni, (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058.

Mutageneza miejsc S25, T30, K93, L96, Y103 i G105 spowodowała identyfikację niektórych zmutowanych białek, które miały wolniejsze wskaźniki „off z CD86lg. Jednakże, w tych przypadkach, wolny wskaźnik „off był zakłócany przez wolny wskaźnik „on, w wyniku czego uzyskano zmutowane białka o całkowitej zachłanności wiązania CD86Ig, widocznie podobnej do obserwowanej przy dzikiePL 206 267 B1 go typu CTLA4Ig. Poza tym, mutageneza K93 powodowała znaczącą agregację, która mogła być odpowiedzialna za obserwowane zmiany kinetyki.

Losowa mutageneza L104 i następująca po niej transfekcja komórek COS oraz przesiew przez SPR próbek pożywek hodowlanych przez unieruchomioną CD86Ig dały sześć próbek pożywek zawierających zmutowane białka o około 2-krotnie wolniejszym wskaźniku „off niż dzikiego typu CTLA4Ig. Po sekwencjonowaniu odpowiadającego tym mutantom cDNA, okazało się, że każdy koduje mutacje leucyny do kwasu glutaminowego (L104E). Najwyraźniej, substytucja leucyny 104 do kwasu asparaginowego (L104D) nie wpływała na wiązanie CD86lg.

Mutagenezę powtórzono następnie w każdym miejscu wymienionym w tabeli II, tym razem stosując L104E jako matrycę PCR zamiast dzikiego typu CTLA4Ig, jak opisano powyżej. Analiza SPR, ponownie z użyciem unieruchomionej CD86Ig, zidentyfikowała sześć próbek pożywki hodowlanej z mutageneza alaniny 29 z białkami mającymi w przybliżeniu 4-krotnie wolniejsze wskaźniki „off niż dzikiego typu CTLA4Ig. Dwie najwolniejsze były sybstytucjami tyrozyny (L104EA29Y), dwie były leucynami (L104EA29L), jedną był tryptofan (L104EA29W), i jedną była treonina (L104EA29T). Najwyraźniej, nie zidentyfikowano mutantów o wolnych wskaźnikach „off dla losowej mutacji samej alaniny 29 w dzikiego typu CTLA4Ig.

Względne masy cząsteczkowe i stan agregacji oczyszczonych L104E i L104EA29YIg szacowano przez SDS-PAGE i chromatografię ekskluzyjna. L104EA29YIg (~1 μg; tor 3) i L104EIg (~1 μg; tor 2) najwyraźniej miały taką samą ruchliwość elektroforetyczną jak CTLA4Ig (~1 μg; tor 1) w warunkach redukujących (~50 kDa; +eME; plus 2-merkaptoetanol) i nieredukujących (~100 kDa; -eME) (fig. 10A). Chromatografia ekskluzyjna pokazała, że L104EA29YIg (fig. 10C) najwyraźniej miał taką samą ruchliwość jak dimeryczny CTLA4Ig (fig. 10B). Główne piki przedstawiają białka dimeryczne, podczas gdy szybciej wymywający się pomniejszy pik w fig. 10B przedstawia agregaty o wyższej masie cząsteczkowej. W przybliżeniu 5,0% CTLA4Ig występowało w postaci agregatów o wyższej masie cząsteczkowej, lecz nie było dowodów agregacji L104EA29YIg lub L104EIg. 0) Zatem, silniejsze wiązanie z CD86Ig widoczne dla L104EIg i L104EA29YIg nie mogło być przypisane agregacji indukowanej przez mutagenezę.

Analiza równowagi i kinetyki wiązania

Przeprowadzono analizę równowagi i kinetyki wiązania oczyszczonych na białku A CTLA4Ig, L104EIg, i L104EA29YIg przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Wyniki są ukazane w tabeli I. Obserwowane stałe równowagi dysocjacji (Kd; tabela I) obliczono z krzywych wiązania wygenerowanych w zakresie stężeń (5,0-200 nM). L104EA29YIg wiąże silniej CD86Ig niż L104EIg lub CTLA4Ig. Niższa Kd L104EA29YIg (3,21 nM) niż L104EIg (6,06 nM) lub CTLA4Ig (13,9 nM) wskazuje na wyższą zachłanność wiązania L104EA29YIg z CD86Ig. Niższa Kd L104EA29YIg (3,66 nM) niż L104EIg (4,47 nM) lub CTLA4Ig (6,51 nM) wskazuje na wyższą zachłanność wiązania L104EA29YIg z CD80Ig.

Analiza kinetyki wiązania ujawniła, że porównywalne wskaźniki„on dla wiązania CTLA4Ig, Ll04EIg i L104EA29YIg z CD80 były podobne, jak wskaźniki„on dla CD86lg (tabela I). Jednakże, wskaźniki „off dla tych cząsteczek nie były równoważne (tabela I). W porównaniu z CTLA4Ig, L104EA29YIg miał wskaźnik „off w przybliżeniu 2-krotnie wolniejszy od CD80Ig, i w przybliżeniu 4-krotnie wolniejszy wskaźnik „off od CD86lg. L104E miał wskaźniki „off pośrednie między Ll04EA29YIg i CTLA4Ig. Ponieważ wprowadzenie tych mutacji nie wpływało znacząco na wskaźniki „on, wzrost zachłanności wiązania CD80Ig i CD86lg obserwowanej dla L104EA29YIg był prawdopodobnie przede wszystkim spowodowany zmniejszeniem szybkości „off.

Aby określić czy wzrost zachłanności wiązania L104EA29YIg z CD86Ig i CD80lg był spowodowany mutacjami wpływającymi na sposób asocjacji każdego monomeru do dimeru lub czy były wprowadzone do każdego monomeru zmiany strukturalne zwiększające zachłanność wiązania, wytworzono konstrukcje o pojedynczym łańcuchu domen zewnątrzkomórkowych CTLA4 oraz L104EA29Y po mutagenezie cysteiny 120 do seryny, jak opisano wyżej, i przez Linsley i inni, (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424. W wyniku chromatografii żelowo-permeacyjnej okazało się, że oczyszczone białka CTLA4XC120S i L104EA29YXC120S są monomerami (Linsley i inni,. (1995), jak wyżej), przed analizą ich właściwości wiązania liganda przez SPR. Wyniki pokazały, że powinowactwo wiązania obu białek monomerycznych wobec CD86lg było w przybliżeniu 35-80-krotnie mniejsze niż obserwowane dla odpowiadających im dimerów (tabela I). Potwierdza to wcześniej opublikowane dane stanowiące, że dimeryzacja CTLA4 jest wymagana dla wysokiej zachłanności wiązania liganda (Greene i inni, (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).

PL 206 267 B1

L104EA2 9YXC120S wiązał się z około 2-krotnie wyższym powinowactwem niż CTLA4XC120S zarówno z CD80Ig jak i CD86Ig. Zwiększone powinowactwo było spowodowane około 3-krotnie wolniejszą szybkością dysocjacji od obu ligandów. Zatem, silniejsze wiązanie liganda przez L104EA29Y było najprawdopodobniej spowodowane raczej zmianami strukturalnymi wzmacniającymi zachłanność wiązania, które zostały wprowadzone do każdego łańcucha monomerowego, niż zmianami, w których dimeryzowała cząsteczka.

Położenie i analiza strukturalna mutacji wzmacniających zachłanność wiązania

Strukturę w roztworze zewnątrzkomórkowej domeny podobnej do IgV CTLA4 określa się ostatnio przez spektroskopię NMR (Metzler i inni, (1997) Naturę Struct. Biol., 4:527-531. Pozwoliło to na dokładne umiejscowienie leucyny 104 i alaniny 29 w zwinięciu trójwymiarowym (fig. 11). Leucyna 104 jest umiejscowiona obok wysoko zakonserwowanej sekwencji aminokwasowej MYPPPY. Alanina 29 jest umiejscowiona obok C-końca regionu S25-R33, który przestrzennie sąsiaduje z regionem MYPPPY. Mimo, że istnieje znacząca interakcja między resztami u podstawy tych dwóch regionów, najwyraźniej nie ma bezpośredniej interakcji między L104 i A29 choć obie obejmują część przyległą rdzenia hydrofobowego w białku. Konsekwencje strukturalne dwóch mutantów wzmacniających zachłanność wiązania oszacowano przez modelowanie. Mutację A29Y można łatwo dostosować do szczeliny między regionem S25-R33 i regionem MYPPPY, i może to służyć stabilizacji konformacji regionu MYPPPY. W dzikiego typu CTLA4, L104 tworzy rozległe interakcje hydrofobowe z L96 i V94 obok regionu MYPPPY. Jest wysoce nieprawdopodobne, że mutacja kwasu glutaminowego dostosowuje konformację podobnie jak L104, z dwóch powodów. Po pierwsze, nie ma wystarczającej przestrzeni, aby dostosować dłuższy łańcuch boczny kwasu glutaminowego do struktury bez znacznego zakłócania regionu S25-R33. Po drugie, koszty energetyczne ukrywania ujemnego ładunku łańcucha bocznego kwasu glutaminowego w regionie hydrofobowym byłyby duże. Zamiast tego, badania modelowania przewidują, że łańcuch boczny kwasu glutaminowego zostanie wyrzucony na powierzchnię gdzie jego ładunek może być stabilizowany przez solwatację. Taka zmiana konformacyjna może być dostosowana przez G105, przy minimalnym zaburzeniu w stosunku do innych reszt w regionach.

Wiązanie mutantów o wysokiej zachłanności wiązania z komórkami CHO wykazującymi ekspresję CD80 lub CD86

Przeprowadzono analizę FACS (Fig. 2) wiązania CTLA4Ig i zmutowanych cząsteczek ze stabilnie transfekowanymi komórkami CHO CD80+ i CD86+, jak tu opisano. Komórki CHO dodatnie pod względem CD80 i dodatnie pod względem CD86 inkubowano ze wzrastającymi stężeniami CTLA4Ig, L104EA29YIg lub L104EIg, a następnie przemywano. Związane immunoglobulinowe białko fuzyjne wykrywano przy użyciu koziej immunoglobuliny anty-ludzkiej sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny.

Jak ukazano w Fig. 2, komórki CHO dodatnie pod względem CD80 lub dodatnie pod względem CD86 (1,5x10⁵) inkubowano z określonymi stężeniami CTLA4Ig (pełne kwadraty), L104EA29YIg (kółka) lub L104EIg (trójkąty) przez 2 godziny w temperaturze 23°C, przemywano i inkubowano ze sprzężonym z izotiocyjanianem fluoresceiny kozim anty-ludzkim przeciwciałem immunoglobulinowym. Wiązanie analizowano na całkowitej ilości 5,000 żywych komórek (pojedyncze określenie) na FACScan, a średnią intensywność fluorescencji (MFI) okreś lono z histogramów danych przy użyciu PC-LYSYS. Dane korygowane pod względem fluorescencji tła mierzono na komórkach inkubowanych jedynie z odczynnikami drugiego etapu (MFI = 7). Kontrolne mAb L6 (80 μ g/ml) dał o MFI < 30. Te wyniki są reprezentatywne dla czterech niezależnych doświadczeń.

Wiązanie L104EA29YIg, L104EIg i CTLA4Ig z ludzkimi komórkami CHO transfekowanymi CD80 jest w przybliżeniu równoważne (fig. 2A). L104EA29YIg i L104EIg wiążą się silniej z komórkami CHO stabilnie transfekowanymi ludzkim CD86 niż CTLA4Ig (Fig. 2B).

Testy funkcjonalne:

Ludzkie komórki T dodatnie pod względem CD4 wyizolowano przez immunomagnetyczną selekcję ujemną (Linsley i inni, (1992) J. Exp. Med. 17 6:1595-1604). Wyizolowane komórki T dodatnie pod względem CD4 stymulowano octanem mirystynianu forbolu (PMA) plus komórki CHO dodatnie pod względem CD80 lub dodatnie pod względem CD86 w obecności mianowanych stężeń inhibitora. Komórki CD4-dodatnie (8-10 x 10⁴/studzienkę) hodowano w obecności 1 nM PMA z napromieniowanymi stymulatorami komórek CHO lub bez nich. Odpowiedzi proliferacyjne mierzono przez dodanie 1 μ Ci/studzienkę [³H]tymidyny podczas koń cowych 7 godzin 72 godzinnej hodowli. Przeprowadzono inhibicję komórek T stymulowanych PMA plus CHO dodatnich pod względem CD80 lub CHO dodatnich pod względem CD86, przez L104EA29YIg i CTLA4Ig. Wyniki są ukazane w fig. 3. L104EA29YIg hamuje proliferację dodatnich pod względem CD80 komórek CHO traktowanych PMA bardziej niż

PL 206 267 B1

CTLA4Ig (Fig. 3A). L104EA29YIg jest także skuteczniejszy niż CTLA4Ig jeśli chodzi o inhibicję proliferacji dodatnich pod względem CD86 komórek CHO traktowanych PMA (fig. 3B). Zatem, L104EA29YIg jest silniejszym inhibitorem kostymulacji komórek T za pośrednictwem zarówno CD80 jak i CD86.

Fig. 4 ukazuje inhibicję przez L104EA29YIg i CTLA4Ig allostymulowanych ludzkich komórek T przygotowanych powyżej i dodatkowo allostymulowanych ludzką limfoblastyczną linią komórek B (LCL) zwaną PM, która wykazywała ekspresję CD80 i CD86 (komórek T w ilości 3,0x10⁴/studzienkę i PM w ilości 8,0x10³/studzienkę). Pierwotna allostymulacja następowała przez 6 dni, następnie komórki poddano impulsom ³H-tymidyny przez 7 godzin, przed określeniem wprowadzonego radioznacznika.

Wtórną allostymulację przeprowadzono w następujący sposób. Siedmiodniowe pierwotnie allostymulowane komórki T zebrano na limfocytową pożywkę rozdzielającą (LSM) (ICN, Aurora, OH) i pozostawiono na 24 godziny. Następnie komórki T ponownie stymulowano (wtórnie), w obecności mianowanych ilości CTLA4Ig lub L104EA29YIg, przez dodanie PM w takim samym stosunku jak powyżej. Stymulacja następowała przez 3 dni, potem komórki poddano impulsom radioznacznika i zbierano jak powyżej. Wpływ L104EA29YIg na pierwotnie allostymulowane komórki T jest ukazany w Fig. 4A. Wpływ L104EA29YIg na wtórnie allostymulowane komórki T jest ukazany w Fig. 4B. L104EA29YIg hamuje zarówno pierwotne jak i wtórne odpowiedzi proliferacyjne komórek T lepiej niż CTLA4Ig.

Aby zmierzyć wytwarzanie cytokin (Fig. 5), przygotowano podwójne płytki wtórnie allostymulowane. Po 3 dniach, pożywki hodowlane testowano przy użyciu zestawów ELISA (Biosource, Camarillo, CA) stosując warunki zalecane przez producenta. Okazało się, że L104EA29YIg jest silniejsza niż CTLA4Ig pod względem blokowania wytwarzania cytokin IL-2, IL-4, i γ-IFN przez komórki T w następstwie wtórnego bodźca allogenicznego (Fig. 5A-C).

Wpływ L104EA29YIg i CTLA4Ig na odpowiedź małpich mieszanych limfocytów (MLR) jest ukazany w Fig. 6. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC; 3,5x10⁴ komórek/studzienkę dla każdej małpy) od 2 małp oczyszczono na pożywce do rozdzielania limfocytów (LSM) i wymieszano z 2 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA). Komórki stymulowano 3 dni, następnie poddano impulsom z radioznacznikiem 16 godzin przed zbiorem. L104EA29YIg hamował proliferację małpich komórek T lepiej niż CTLA4Ig.

T a b e l a I

Stałe równowagi i widocznej kinetyki podano w następującej tabeli (wartości oznaczają wartości średnie ± odchylenie standardowe z trzech różnych doświadczeń):

Unieruchomione białko	Analit	kon (x105) M1 S-1	koff (x10-3) S-1	Kd nM
CD80Ig	CTLA4Ig	3,44 ± 0,29	2,21 ± 0,18	6,51 ± 1,08
CD80Ig	L104EIg	3,02 ± 0,05	1,35 ± 0,08	4,47 ± 0,36
CD80Ig	L104EA29YIg	2,96 ± 0,20	1,08 ± 0,05	3,66 ± 0,41
CD80Ig	CTLA4Xci20s	12,0 ± 1,0	230 ± 10	195 ± 25
CD80Ig	L104EA29YXci20s	8,3 ± 0,26	71 ± 5	85,0 ± 2,5
CD86Ig	CTLA4Ig	5,95 ± 0,57	8,16 ± 0,52	13,9 ± 2,27
CD86Ig	L104EIg	7,03 ± 0,22	4,26 ± 0,11	6,06 ± 0,05
CD86Ig	L104EA29YIg	6,42 ± 0,40	2,06 ± 0,03	3,21 ± 0,23
CD86Ig	CTLA4Xci2os	16,5 ± 0,5	840 ± 55	511 ± 17
CD86Ig	L1O4EA29YXci2os	11,4 ± 1,6	300 ± 10	267 ± 29

PL 206 267 B1

T a b e l a II

Wpływ na wiązanie CD86Ig przez mutagenezę CTLA4Ig w wymienionych miejscach był określony przez SPR, opisany jak wyżej. Przewężający wpływ jest zaznaczony znakiem „+”.

Miejsce mutagenezy	Wpływ na mutagenezę
	Brak widocznego wpływu	Powolny wskaźnik „on”/powolny wskaźnik „off”	Zmniejszone wiązanie liganda
S25		+
P26	+
G27	+
K28	+
A29		+
T30		+
E31			+
R33			+
K93		+
L96		+
M97			+
Y98			+
P99			+
P100			+
P101			+
Y102			+
Y103		+
L104		+
G105		+
I106	+
G107	+
Q111	+
Y113	+
I115	+

Zastrzeżenia patentowe

Claims (40)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zmutowana cząsteczka CTLA4, znamienna tym, że zawiera sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 a kończącą się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na Fig. 7, lub rozpoczynającą się alaniną w pozycji -1 a kończącą się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na Fig. 7.
2. 2. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo zawiera sekwencję aminokwasową, która zmienia rozpuszczalność, powinowactwo lub wartościowość zmutowanej cząsteczki CTLA4.
3. 3. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 2, znamienna tym, że sekwencja aminokwasowa, która zmienia rozpuszczalność lub powinowactwo obejmuje ugrupowanie immunoglobuliny.

   PL 206 267 B1
4. 4. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 3, znamienna tym, że ugrupowanie immunoglobuliny zawiera region stały immunoglobuliny lub jego część.
5. 5. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 4, znamienna tym, że region stały immunoglobuliny zawiera zawias, regiony CH2 i CH3 cząsteczki immunoglobuliny.
6. 6. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 4 albo 5, znamienna tym, że region stały immunoglouliny lub jego część stanowi region stały immunoglobuliny człowieka lub małpy.
7. 7. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 3 do 6, znamienna tym, że ugrupowanie immunoglobuliny zawiera jedną lub więcej mutacji do zmniejszania funkcji efektorowej.
8. 8. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 3 do 7, znamienna tym, że ugrupowanie immunoglobuliny zawiera zawias a dowolna lub wszystkie reszty cysteiny w obrębie zawiasu są podstawione seryną.
9. 9. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 8, znamienna tym, że cysteina w pozycji +130 jest podstawiona seryną, cysteina w pozycji +136 jest podstawiona seryną, cysteina w pozycji +139 jest podstawiona seryną, jak pokazano na Fig. 7.
10. 10. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 4 do 9, znamienna tym, że region stały ludzkiej immunoglobuliny jest zmutowany tak, że zawiera cysteinę w pozycji +130 podstawioną seryną, cysteinę w pozycji +136 podstawioną seryną, cysteinę w pozycji +139 podstawioną seryną, i prolinę w pozycji +148 podstawioną seryną, jak pokazano na Fig. 7.
11. 11. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 3 do 10, znamienna tym, że ugrupowanie immunoglobuliny zawiera sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się kwasem glutaminowym w pozycji +126 a kończącą się lizyną w pozycji +357, jak pokazano na Fig. 7.
12. 12. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 3 do 11, znamienna tym, że zawiera ponadto resztę aminokwasu łącznikowego zlokalizowaną pomiędzy sekwencją aminokwasową kończącą się kwasem asparaginowym w pozycji +124 a ugrupowaniem immunoglobuliny.
13. 13. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 12, znamienna tym, że resztę aminokwasu łącznikowego stanowi glutamina.
14. 14. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję aminokwasową rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 a kończącą się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 7, lub rozpoczynającą się alaniną w pozycji -1 a kończącą się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 7.
15. 15. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienna tym, że zawiera ponadto sekwencję aminokwasową, które umożliwia wydzielanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4.
16. 16. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 15, znamienna tym, że sekwencja aminokwasową zawiera peptyd sygnałowy onkostatyny M.
17. 17. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 1 do 16, znamienna tym, że wykazuje niższą szybkość dysocjacji z wiązania CD86 niż CTLA4 dzikiego typu.
18. 18. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według jednego z zastrz. 1 do 17, znamienna tym, że jest rozpuszczalna.
19. 19. Zmutowana cząsteczka CTLA4 według zastrz. 1, znamienna tym, że kodowana jest przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zdeponowaną pod numerem dostępu ATCC: PTA-2104.
20. 20. Cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową odpowiadającą zmutowanej cząsteczce CTLA4 określonej w jednym z zastrz. 1 do 19.
21. 21. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową rozpoczynającą się guanidyną w pozycji -3 i kończącą się adeniną w pozycji +1071 jak pokazano na Fig. 7 albo 8, albo zawiera sekwencję nukleotydową rozpoczynającą się adeniną w pozycji nukleotydowej +1 i kończącą się adeniną w pozycji +1071 jak pokazano na Fig. 7.
22. 22. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienna tym, że zdeponowana jest pod numerem dostępu ATCC: PTA-2104.
23. 23. Wektor, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 21 albo 22.
24. 24. Wektor według zastrz. 23, znamienny tym, że zdeponowany jest pod numerem dostępu ATCC: PTA-2104.
25. 25. Układ wektorowy gospodarza, znamienny tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 23 albo 24 w odpowiedniej komórce gospodarza.

    PL 206 267 B1
26. 26. Układ wektorowy gospodarza według zastrz. 25, znamienny tym, że odpowiednią komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna lub komórka eukariotyczna.
27. 27. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 24 albo 25.
28. 28. Komórka gospodarza według zastrz. 27, znamienna tym, że stanowi komórkę eukariotyczną.
29. 29. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że komórkę eukariotyczną stanowi komórka COS.
30. 30. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że komórkę eukariotyczną stanowi komórka jajnika chomika chińskiego (CHO).
31. 31. Komórka gospodarza według zastrz. 30, znamienna tym, że komórka CHO jest wybrana z grupy składającej się z linii komórkowej DG44, CHO-K1, CHO-K1 Tet-On, CHO oznaczonej ECACC 85050302, klonu 13 CHO, klonu B CHO, CHO-K1/SF i RRCHOK1.
32. 32. Sposób wytwarzania zmutowanej cząsteczki CTLA4, znamienny tym, że hoduje się układ wektorowy gospodarza określony w zastrz. 25 albo 26 z wytworzeniem zmutowanego białka CTLA4 w komórce gospodarza i odzyskuje się tak wytworzone białko.
33. 33. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i zmutowaną cząsteczkę CTLA4 określoną w jednym z zastrz. 1 do 19.
34. 34. Sposób regulacji interakcji komórki T z komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86, znamienny tym, że kontaktuje się komórkę dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86 z rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4 określoną w jednym z zastrz. 1 do 19 z utworzeniem kompleksu zmutowanej cząsteczki CTLA4/CD80 lub zmutowanej cząsteczki CTLA4/CD86, przy czym kompleks zakłóca interakcję między komórką T a komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86, pod warunkiem, że kompleks nie zakłóca oddziaływania pomiędzy komórką T a komórką dodatnią pod względem CD80 i/lub CD8 6 in vivo.
35. 35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że jako komórkę dodatnią pod względem CD80 i/lub CD86 stosuje się komórkę prezentującą antygen.
36. 36. Sposób według zastrz. 34 albo 35, znamienny tym, że hamuje się oddziaływanie komórek T dodatnich pod względem CTLA4 z komórkami dodatnimi pod względem CD80 i CD8 6.
37. 37. Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 określonej w jednym z zastrz. 1 do 19 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby układu immunologicznego.
38. 38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że choroba układu immunologicznego zależna jest od oddziaływania komórek T z komórkami dodatnimi pod względem CD80 i/lub CD86.
39. 39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że hamowane są oddziaływania komórek T.
40. 40. Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 określonej w jednym z zastrz. 1 do 19 i liganda reaktywnego z IL-4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi.